ES2563160T3

ES2563160T3 - Geles viscoelásticos como nuevas cargas

Info

Publication number: ES2563160T3
Application number: ES14170084.9T
Authority: ES
Inventors: Matteo D'este; Davide Renier
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2010-08-25
Publication date: 2016-03-11
Anticipated expiration: 2030-08-25
Also published as: US20120190644A1; SI2772273T1; BR112012004157B8; CA2772142A1; HRP20140981T4; US8846640B2; CN102548590A; DK2772273T3; EP2772273B1; CA2995957C; CN104623730A; CN102548590B; EP2772273B9; JP5976537B2; DK2470230T4; KR101749660B1; ITPD20090246A1; CA2772142C; BR112012004157A2; KR20120107455A

Abstract

Biomateriales que se pueden obtener mezclando - hexadecilamida del ácido hialurónico (HYADD) con - el derivado (HBC) de ácido hialurónico reticulado con 1,4-butanodiol diglicidiléter (BDDE) en una relación ponderal de entre 10:90 y 90:10 como nuevas cargas y/o como productos para el modelado del cuerpo.

Description

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DESCRIPCION

Geles viscoelasticos como nuevas cargas Campo de la invencion

El acido hialuronico (AH) es un heteropolisacarido constituido por restos alternados de acido D-glucoronico y N- acetil-D-glucosamina.

El AH es un polfmero de cadena lineal con un peso molecular que oscila entre 50.000 y 13 * 106 Dalton, dependiendo de la fuente de la que se obtenga y de los procedimientos de preparacion usados.

El AH esta presente en la naturaleza en geles pericelulares, en la sustancia basica del tejido conectivo de vertebrados (del que es uno de los componentes principales), en el humor vftreo y en el cordon umbilical.

El AH desempena un papel importante en el organismo biologico como soporte estructural y mecanico para los tejidos, y como componente activo en la fisiologfa celular de tejidos tales como la piel, los tendones, los musculos y el cartflago.

Es una de las moleculas principales de la matriz cartilaginosa, y tambien representa el principal constituyente no proteico del lfquido sinovial. Puesto que es una molecula viscoelastica muy hidrofila, dota al lfquido sinovial de propiedades lubricantes; por tanto el Ah se ha usado en artrosis durante mas de 30 anos, principalmente para el tratamiento del dolor asociado.

El AH tambien desempena un papel fundamental en los procedimientos de reparacion tisular desde el punto de vista estructural (en la organizacion de la matriz extracelular y la regulacion de su hidratacion), y como sustancia estimulante/reguladora de un amplio espectro de procedimientos fisiologicos en los que dicho polisacarido actua directa y/o indirectamente (formacion de coagulos, actividad fagodtica, proliferacion de fibroblastos, neovascularizacion, reepitelizacion, etc.) (Weigel P. y col., J Theoretical Biol, 1986:219-234; Abatangelo G. y col., J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K. y col., Drugs, 1994). Puesto que estas propiedades se conocen desde hace bastante tiempo, el AH tambien se ha usado para preparar apositos para la cicatrizacion de heridas, ulceras y lesiones cutaneas de ongenes diferentes.

El acido hialuronico tambien se usa como carga para arrugas, surcos y pequenas depresiones de la cara, e incrementar el volumen de labios y mejillas, debido a que es inmunologicamente inerte, no toxico, biodegradable y biorreabsorbible.

El tratamiento a base de acido hialuronico esta indicado para la correccion de:

el volumen y el contorno de labios,

surcos (por ejemplo, los pliegues nasolabiales)

remodelacion del contorno facial (por ejemplo, mejillas y barbilla)

arrugas (por ejemplo, lmeas glabelares y las comisuras de la boca)

arrugas periorbitales

cicatrices fibrosas post-acne

cicatrices fibrosas post-traumaticas

manchas de tejidos blandos

cicatrices de rinoplastia.

El acido hialuronico no es una carga permanente. Esto significa que, una vez inyectado, el producto se metaboliza y es reabsorbido gradualmente por el cuerpo en un tiempo que vana segun el area tratada y el tipo de preparacion usada. El efecto de relleno e incremento de volumen (o atenuacion de las arrugas) es inmediato, y solo dura unas pocas semanas. Los productos principales presentes en el mercado se pueden clasificar en las siguientes categonas, en base a sus diferentes tiempos de reabsorcion:

• cargas de reabsorcion rapida (2-3 meses)

• cargas de duracion media (5-6 meses),

• cargas de reabsorcion lenta (1 ano) tal como Restylane Sub Q (QMED, documento EP0839159).

En la dermis, el AH realiza funciones hidratantes debido a su alta capacidad para retener agua, y funciones estructurales como "andamiaje" debido a que, al unirse a otras sustancias, forma complejos macromoleculares que compactan la piel.

Por tanto, el mecanismo de accion consiste en un relleno volumetrico inmediato debido a las propiedades viscoelasticas del producto, y nueva smtesis de colageno debido a la estimulacion de los fibroblastos cutaneos.

No obstante, el AH es un polisacarido natural que es degradado rapidamente por las enzimas hialuronidasas presentes en el tejido conectivo; con el fin de obtener cargas cuyo efecto perdure durante varios meses, el AH se

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debe someter por tanto a procedimientos de reticulacion que mejoran sus propiedades viscoelasticas e incrementan su tiempo de residencia. Las cargas as^ formadas se reticulan, por ejemplo, mediante BDDE (1,4-butanodiol diglicidileter, Restylane®, BELOTERO®y Regenyal Idea) o DVS (divinil sulfona, Hylaform®), que crean puentes entre las moleculas de poKmero. Sin embargo, el incremento del grado de reticulacion desnaturaliza progresivamente el AH hasta el punto de modificar profundamente sus propiedades qmmicas, ffsicas y biologicas. Las matrices de AH reticuladas en exceso se presentan en forma de solidos particulados que ya no son reconocidos por las celulas (y en particular por el sistema inmunitario) como AH; por tanto, el polisacarido se percibe como un cuerpo exogeno, lo que desencadena reacciones inflamatorias con la formacion de capsulas fibroticas a su alrededor. Ademas, el AH excesivamente reticulado es incapaz de estimular la regeneracion de tejido dermico/cutaneo inducida, como es sabido por resultados cientfficos perfectamente establecidos, por fragmentos de AH (en particular aquellos con un bajo peso molecular) que tienen el efecto de estimular la smtesis de colageno por parte de los fibroblastos cutaneos.

Las cargas tambien se clasifican como reabsorbibles o permanentes. El tipo reabsorbible es el mas biocompatible; consisten en acido hialuronico o colageno, modificado o presente en su forma nativa, y en consecuencia se reabsorben en un ano como maximo. El tipo permanente consiste en polfmeros sinteticos tales como las poliacrilamidas, moleculas reticuladas particulares que forman un gel estable cuando se combinan con el agua. El tipo permanente siempre permanece in situ y son muy utiles para el relleno de los labios, pero su uso no esta recomendado debido a que se producen inflamaciones agudas cada vez con mayor frecuencia debido a su insercion cutanea, lo que da lugar a capsulas fibroticas en torno a la carga, que es percibida como un cuerpo exogeno y por tanto toxico.

El documento WO2008068297 desvela implantes inyectables/cargas cutaneas que comprenden acido hialuronico reticulado con BDDE y acido hialuronico/sales.

El documento WO2009073437 desvela geles de relleno que comprenden acido hialuronico reticulado con BDDE y acido hialuronico sulfatado.

El documento WO2006122638 desvela el tiempo de residencia de cargas que comprenden acido hialuronico o sus derivados (incluyendo, entre otros, HYADD) se incrementa cuando se estructura con/en liposomas.

El solicitante ha perfeccionado un nuevo tipo de biomaterial como nueva carga y/o como nuevo producto para modelar el cuerpo, formado al mezclar dos derivados reticulados del AH de formas diferentes pero complementarias, para obtener un sustituto de piel/tejido que permite la hidratacion inmediata (en consecuencia el relleno inmediato) de la piel/tejido tratados, mientras mantiene tiempos de degradacion in vivo muy prolongados eliminando la necesidad de inyecciones repetidas, y reduciendo asf los efectos secundarios.

Los nuevos biomateriales a los cuales se refiere la presente invencion presentan caractensticas de biocompatibilidad particulares identicas a las del acido hialuronico tal cual, pero su biodegradabilidad es diferente; cuando se implantan in vivo, su tiempo de residencia es mucho mas prolongado que el del AH sin modificar, permitiendo asf la regeneracion/reconstruccion inmediata del tejido dermico/cutaneo que haya perdido su compactibilidad original.

Descripcion detallada de la invencion

El solicitante ha perfeccionado un nuevo tipo de biomaterial como carga y/o como nuevo producto para el modelado del cuerpo basado en la mezcla de dos derivados del AH con caractensticas diferentes, pero complementarias, para obtener un nuevo producto para inyeccion en el tratamiento de manchas de la piel, en dermatologfa, en dermocosmetica y/o en cirugfa estetica, que produce:

1. hidratacion dermica/cutanea inmediata

2. relleno inmediato del tejido tratado

3. tiempos de degradacion in vivo muy prolongados

4. efectos secundarios reducidos.

Los nuevos biomateriales estan constituidos por:

• hexadecilamida del AH (HYADD) mezclada con

• acido hialuronico reticulado con BDDE (HBC).

La hexadecilamida del AH (HYADD) se prepara como se describe en los documentos EP 1095064 y EP1853279, preferentemente usando AH con un peso molecular medio (Pm) de 500-730 kDa, con un grado medio de amidacion/sustitucion final de entre el 1 y 3 % molar.

La HYADD es el derivado del AH responsable de la hidratacion inmediata (que da lugar a un relleno dermico instantaneo) provocada por la inyeccion intradermica de la carga a la cual se refiere la presente invencion.

El AH reticulado con BDDE (una molecula que contiene grupos epoxi para la formacion de eteres sobre los hidroxilos primarios del AH) contiene la molecula de reticulacion, y por tanto es mas resistente a la degradacion enzimatica puesto que posee enlaces eter que estabilicen el polisacarido, dotando al producto obtenido de un tiempo

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de residencia prolongado.

La mezcla de las dos especies de AH reticulado da lugar a la formacion de un nuevo biomaterial que tiene caractensticas de biocompatibilidad identicas a las del acido hialuronico nativo, pero una biodegradabilidad diferente de manera que, cuando se implanta in vivo, su tiempo de residencia es mucho mas prolongado que el del AH sin modificar, permitiendo as^ la regeneracion/reconstruccion del tejido dermico que haya perdido su compactibilidad original. El solicitante tambien ha demostrado que su asociacion da lugar, de forma bastante inesperada, a un tiempo de degradacion in vivo mucho mayor que el de las cargas de referencia comerciales formados por el mismo tipo de AH reticulado con BDDE, con el consiguiente incremento del tiempo de residencia. Por ultimo, el solicitante reivindica el uso de los nuevos biomateriales como cargas y/o como nuevos productos para el modelado del cuerpo en el tratamiento de manchas cutaneas, en dermatologfa, en dermocosmetica y/o en cirugfa estetica.

La naturaleza qmmicamente heterogenea del nuevo biomaterial permite que las propiedades del producto final se puedan modular modificando convenientemente la relacion ponderal entre los constituyentes. Los dos AH se pueden mezclar en una relacion de HYADD:HBC de 10:90 a 90:10. La relacion ponderal se seleccionara en base a la viscosidad final deseada, que dependera del sitio tratado. Si se han de tratar zonas que requieran la implantacion de grandes cantidades de biomaterial, como en el caso del relleno de los senos, las nalgas, las mejillas o la barbilla, o arrugas de expresion profundas, el biomaterial usado preferentemente presentara una buena compactibilidad, y por tanto una viscosidad adecuada para obtener un gel con una consistencia excelente y una velocidad de biodegradacion baja; en este caso la mezcla de HYADD:HBC estara entre 10:90 y 50:50, y preferentemente entre 25:75, debido a que el producto obtenido al incrementar la fraccion ponderal del HBC es mas adecuado para producir un efecto de aumento de volumen mas duradero. No obstante, si se han de tratar surcos en los labios o arrugas finas en la frente, la relacion de HYADD:HBC preferentemente estara entre 90:10 y 50:50, siendo igual la composicion de HYADD/HBC, las propiedades del biomaterial tambien se pueden modular de forma conveniente por medio de una seleccion espedfica del vehnculo en el cual se prepara. Las propiedades viscoelasticas del material en consecuencia afectan al comportamiento del producto.

La presente invencion tambien se refiere a dos procedimientos de preparacion de los biomateriales descritos anteriormente: procedimiento A y procedimiento B.

Los nuevos procedimientos A y B estan divididos en dos etapas:

1. procedimiento para la produccion del derivado de HBC, y

2. procedimiento para su mezcla con el derivado de HYADD.

Las dos etapas dan lugar a la produccion de productos con un grado de pureza muy elevado. Con los procedimientos usados normalmente para la produccion de AH reticulado con BDDE, las purificaciones se llevan a cabo lavando la masa de gel obtenida, o mediante dialisis. En ambos casos, no se puede conseguir la eficiencia optima de purificacion debido a la naturaleza de la matriz del gel que, debido a su tendencia a hincharse, incorpora grandes cantidades de disolvente. Estos geles tienen una movilidad y capacidad de transporte bajas, y tienden a precipitar en forma de gomas gelatinosas. El precipitado obtenido de esta forma, aislado como un solido, tiene propiedades de solubilidad y reologicas diferentes cuando se rehidrata, en particular la capacidad de hincharse, la elasticidad y la homogeneidad (caractensticas esenciales para una carga), respecto al gel antes de la purificacion.

No obstante, el procedimiento descrito de aqrn en adelante por el solicitante como procedimiento A precipita el producto en forma de polvo finamente dividido, que en consecuencia se puede lavar facilmente. Por otra parte, la seleccion cuidadosa de las condiciones de reaccion produce, tras el aislamiento por precipitacion y lavado, un producto con una capacidad de reconstruccion del gel por medio de rehidratacion y esterilizacion que da lugar a un biomaterial que tiene caractensticas de elasticidad y homogeneidad reproducibles y perfectamente normalizadas.

El procedimiento B no incluye la etapa de precipitacion del producto HBC en forma de polvo; la purificacion y homogenizacion del gel (obtenido despues de la mezcla de HBC con HYADD) se lleva a cabo en la etapa de trituracion, que supone su paso a traves de un filtro con un coeficiente de retencion de partfculas de entre 25 y 150 pm. Esta etapa purifica el gel final y lo hace perfectamente homogeneo.

El AH usado en la presente invencion para preparar los derivados descritos anteriormente (HBC, HYADD) puede proceder de cualquier fuente, tal como la extraccion a partir de crestas de gallo o de fermentacion, y tienen un peso molecular medio de entre 400 y 3 x 106 Da, preferentemente entre 1 x 105 Da y 1 x 106 Da, y aun mas preferentemente entre 200.000 y 1 x 106 Da.

El nuevo procedimiento A de fabricacion comprende las siguientes etapas:

Sintesis de HBC reticulado

1. Disolucion en solucion alcalina (preferentemente NaOH 0,15 M - 0,35 M) de diepoxido de BDDE en una relacion estequiometrica de entre el 2,5 y el 25 % molar, preferentemente entre el 5 y el 15 % molar (en funcion del uso previsto del producto; cuanto mayor es el porcentaje de BDDE, mas prolongado sera el tiempo de residencia) de las unidades de repeticion del acido hialuronico, seguido por

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2. Dispersion de AH en la solucion mencionada en el parrafo anterior, a temperatura ambiente. La concentracion de AH debe estar entre 80 y 300 mg/ml, y el tiempo de homogeneizacion entre 30 y 300 minutes.

3. Iniciacion de la reaccion mediante activacion por calor, dicha solucion que se calienta a una temperatura de entre 35 y 55 °C durante entre 2 y 36 horas.

4. Extrusion de la masa obtenida a traves de un tamiz metalico, para reducirla a partteulas con un tamano de 600 pm aproximadamente.

5. La hidratacion del gel mediante su dilucion con agua en un factor de 3 a 25, durante un tiempo de entre 4 y 48 horas a una temperatura de 4 a 24 °C.

6. Correccion del pH a neutro con una solucion acuosa de HCl que tiene una concentracion de 0,5 a 5 moles/l, preferentemente de 1 a 2 moles/l.

7. Adicion de 2,5 volumenes de disolvente organico soluble en agua tal como etanol, metanol, isopropanol, n- propanol, dioxano, acetonitrilo, acetona y/o sus mezclas (preferentemente etanol y acetona), hasta que se obtiene el producto en forma de polvo precipitado.

8. Lavado con disolventes organicos tales como etanol, metanol, isopropanol, n-propanol, dioxano, acetonitrilo, acetona y/o sus mezclas (preferentemente etanol y acetona), que contienen una fraccion de agua inferior al 35 %.

9. Secado al vacte a una temperatura de entre 30 y 45 °C durante entre 2 y 7 dfas, y en cualquier caso hasta la eliminacion de los disolventes residuales por debajo de 400 ppm, para obtener un polvo blanco de HBC.

Mezcla de HYADD con HBC

10. Mezcla del polvo de HBC con el polvo de HYADD en una relacion de entre 10:90 y 90:10 (en funcion del uso elegido, como se ha descrito anteriormente).

11. Hidratacion con solucion salina o tampon fosfato, preferentemente solucion salina (que puede contener otros excipientes tales como lidocama), que da lugar a una concentracion total de AH de entre 12 y 27 mg/ml, preferentemente entre 20 y 25 mg/ml, a una temperatura de entre 0 y 26 °C.

12. Extrusion a traves de un tamiz con una malla de entre 50 y 500 pm, preferentemente entre 100 y 250 pm. Dicha filtracion se lleva a cabo a temperatura ambiente o a una temperatura de entre 25 y 65 °C, preferentemente entre 40 y 60 °C.

13. Llenado de las jeringas, fabricadas preferentemente en vidrio o material polimerico, con el producto obtenido.

14. Esterilizacion por calor con vapor saturado a una temperatura de entre 120 y 124 °C (preferentemente 121,5 ± 1 °C) durante al menos 10 min.

El nuevo procedimiento B de fabricacion comprende las siguientes etapas:

Smtesis de HBC reticulado

1. Disolucion en solucion alcalina (preferentemente NaOH 0,15 M - 0,35 M) de diepoxido de BDDE en una relacion estequiometrica del 2,5 al 25 % molar, preferentemente entre el 5 y el 15 % molar (en funcion del uso previsto del producto) de la unidades de repeticion del acido hialuronico, seguido de

2. Dispersion del AH en la solucion mencionada en el parrafo anterior, a temperatura ambiente. La concentracion de AH debe estar entre 80 y 300 mg/ml, y el tiempo de homogeneizacion entre 30 y 300 minutos.

3. Iniciacion de la reaccion mediante la activacion por calor, dicha solucion que se calienta a una temperatura de entre 35 y 55 °C durante entre 2 y 36 horas.

4. Correccion del pH a neutro con una solucion acuosa de HCl que tiene una concentracion de 0,05 a 1 moles/I, preferentemente de 0,1 moles/l.

5. Hidratacion del gel mediante su dilucion con agua en un factor de 3 a 20 durante un tiempo de entre 4 y 48 horas a una temperatura de 4 a 24 °C. Esta solucion puede contener otros excipientes, tales como NaCl, sales de sodio o potasio del acido fosforico, y lidocama, preferentemente en forma de sal de clorhidrato. Las sales de sodio (cloruro o fosfato) tienen la funcion de mantener la osmolaridad adecuada del producto, y mantener el pH a un valor compatible con los tejidos. En una realizacion preferida de la invencion, se anade NaCl en una cantidad tal que la solucion final contiene una concentracion de entre el 0,8 y 1,0 % del mismo, preferentemente el 0,9 %; el clorhidrato de lidocama, si esta presente, se anade en una cantidad tal que la formulacion final contiene una cantidad de entre 2,2 y 3,2 mg/ml del mismo, preferentemente 2,7 mg/ml.

Mezcla de HYADD con HBC

6. Mezcla del gel de HBC con polvo de HYADD en una relacion de HYADD:HBC de entre 10:90 y 90:10 (en peso del principio activo) en funcion del uso seleccionado para la nueva carga, como se ha descrito anteriormente. De forma alternativa, el HYADD se puede mezclar con HBC partiendo de ambos componentes en forma de gel, usando un sistema de agitacion adecuado (preferentemente con una pala orbital) durante un tiempo de entre 30 minutos y 24 horas a una temperatura de entre 0 y 26 °C.

7. Trituracion y homogeneizacion pasando a traves de un filtro con un coeficiente de retencion de partteulas de entre 25 y 150 pm, preferentemente entre 40 y 110 pm. Si la viscosidad es excesiva, la operacion se puede realizar en caliente, a una temperatura de entre 25 y 65 °C.

8. Llenado de las jeringas, fabricadas en vidrio o en material polimerico, con el producto obtenido.

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9. Esterilizacion por calor con vapor de agua saturado a una temperatura de entre 120 y 124 °C (preferentemente 121,5 ± 1 °C) durante al menos 10 min.

Algunos ejemplos de preparacion de la nueva carga de acuerdo con la invencion se describen a continuacion, a modo de ejemplo y no de limitacion.

Ejemplo 1: Sintesis de HBC 500 (AH 500-730 kDa)

Procedimiento A

0,075 moles de AH con un peso molecular de 500-730 kDa, producido por fermentacion, se dispersan en 215 ml de una solucion de NaOH 0,25 M que contiene 1,41 ml de BDDE. A continuacion la mezcla se calienta a 42 °C y se hace reaccionar durante 3 horas. A continuacion la mezcla se hidrata durante 24 horas con 300 ml de una solucion que contiene una cantidad estequiometrica de HCl para ajustar el pH a neutro. El volumen total se lleva hasta 750 ml y se precipita con 2,5 volumenes de etanol para obtener un precipitado filtrable y decantable. La mezcla se lava con etanol al 75 % hasta su purificacion integral, verificada midiendo la conductividad espedfica de los disolventes de lavado, que debe ser inferior a 30 pS/cm, y se seca al vado a 40 °C durante 5 dfas. El producto HBC 500 se obtiene con un rendimiento en peso del 87 %.

Ejemplo 2: Sintesis de HBC 1000 (AH 1 MDa)

Procedimiento A

1,60 g de AH con un peso molecular medio de 1 MDa, producido por fermentacion, se dispersan en 20 ml de una solucion de NaOH 0,25 M que contiene 75 pl de BDDE. A continuacion la mezcla se calienta a 42 °C y se hace reaccionar durante 2 horas. A continuacion la mezcla se hidrata durante 24 horas con 20 ml de una solucion que contiene una cantidad estequiometrica de HCl para ajustar el pH a neutro. El volumen total se lleva hasta 75 ml y el HBC se precipita con 2,5 volumenes de etanol para obtener un precipitado filtrable y decantable. La mezcla se lava con etanol al 75 % hasta su purificacion integral, verificada midiendo la conductividad espedfica de los disolventes de lavado, que debe ser inferior a 30 pS/cm, y se seca al vado a 40 °C durante 5 dfas. El producto HBC 1000 se obtiene con un rendimiento en peso del 90 %.

Ejemplo 3: Sintesis de HBC 200 (AH 200 kDa)

Procedimiento A

2,55 g de AH con un peso molecular medio de 200 kDa, producido por fermentacion, se dispersan en 20 ml de una solucion de NaOH 0,25 M que contiene 63 pl de BDDE. A continuacion la mezcla se calienta a 42 °C y se hace reaccionar durante 150 minutos. A continuacion la mezcla se hidrata durante 24 horas con 20 ml de una solucion que contiene una cantidad estequiometrica de HCl. El volumen total se lleva hasta 75 ml y se precipita con 2,5 volumenes de etanol para obtener un precipitado filtrable y decantable. La mezcla se lava con etanol al 75 % hasta su purificacion integral, verificada midiendo la conductividad espedfica de los disolventes de lavado, que debe ser inferior a 30 pS/cm, y se seca al vado a 40 °C durante 5 dfas. El producto HBC 200 se obtiene con un rendimiento en peso del 85 %.

Ejemplo 4: Preparacion de gel ACP:HBC 500, en una relacion de 50:50 Procedimiento A

Procedimiento A (ejemplo comparativo, que no forma parte de la invencion)

1,00 g de HBC 500, preparado como se describe en el Ejemplo 1, se mezcla con 1,00 g de ester interno de AH ACP. El polvo se hidrata con 100 ml de solucion salina esteril al 0,9% en peso/volumen a una temperatura de 8 °C durante 16 horas. El gel obtenido se calienta a 48 °C y se filtra a traves de un tamiz metalico con una malla de 0,17 mm, y a continuacion se distribuye entre jeringas de vidrio de 1 ml, que posteriormente se someten a un ciclo de esterilizacion con vapor saturado a una temperatura de 121 °C durante 10 minutos. Se obtiene un gel homogeneo esteril adecuado para su administracion local.

Ejemplo 5: Preparacion de gel ACP:HBC 1000, en una relacion de 30:70 Procedimiento A (ejemplo comparativo, que no forma parte de la invencion)

1,40 g de HBC 1000, preparado como se describe en el Ejemplo 2, se mezclan con 0,60 g de ester interno de AH ACP. El polvo se hidrata con 100 ml de solucion salina esteril al 0,9 % en p/v a una temperatura de 8 °C durante 16 horas. El gel obtenido se calienta a 48 °C y se filtra a traves de un tamiz metalico con una malla de 0,17 mm, y a continuacion se distribuye entre jeringas de vidrio de 1 ml, que posteriormente se someten a un ciclo de esterilizacion con vapor saturado a una temperatura de 121 °C durante 10 minutos. Se obtiene un gel homogeneo esteril adecuado para su administracion local.

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Ejemplo 6: Preparacion de gel ACP:HBC 500, en una relacion de 25:75 Procedimiento A (ejemplo comparativo, que no forma parte de la invencion)

1,875 g de HBC 500, preparado como se describe en el Ejemplo 1, se mezclan con 0,625 g de ester interno de AH ACP. El polvo se hidrata con 100 ml de solucion salina esteril al 0,9 % en p/v a una temperatura de 8 °C durante 16 horas. El gel obtenido se calienta a 48 °C y se filtra a traves de un tamiz metalico con una malla de 0,19 mm, y a continuacion se distribuye entre jeringas de vidrio de 1 ml, que posteriormente se someten a un ciclo de esterilizacion con vapor saturado a una temperatura de 121 °C durante 12 minutos. Se obtiene un gel homogeneo esteril adecuado para su administracion local.

Ejemplo 7: Preparacion de gel ACP:HBC 1000, en una relacion de 75:25 Procedimiento A (ejemplo comparativo, que no forma parte de la invencion)

0,50 g de HBC 1000, preparado como se describe en el Ejemplo 2, se mezclan con 1,50 g de ester interno de AH ACP. El polvo se hidrata con 100 ml de solucion salina esteril al 0,9 % en p/v a una temperatura de 8 °C durante 24 horas. El gel obtenido se calienta a 42 °C y se filtra a traves de un tamiz metalico con una malla de 0,17 mm, y a continuacion se distribuye entre jeringas de vidrio de 2 ml, que posteriormente se someten a un ciclo de esterilizacion con vapor saturado a una temperatura de 121 °C durante 12 minutos. Se obtiene un gel homogeneo esteril adecuado para su administracion local.

Ejemplo 8: Preparacion de gel HYADD:HBC 500, en una relacion de 60:40 Procedimiento A

1,20 g de HBC 500 preparado como se describe en el Ejemplo 1 se mezclan con 0,80 g de hexadecilamida del AH (HYADD). El polvo se hidrata con 100 ml de solucion salina esteril al 0,9 % en p/v a una temperatura de 8 °C durante 24 horas. El gel obtenido se calienta a 52 °C y se filtra a traves de un tamiz metalico con una malla de 0,17 mm, y a continuacion se distribuye entre jeringas de vidrio de 1 ml, que posteriormente se someten a un ciclo de esterilizacion con vapor saturado a una temperatura de 121 °C durante 11 minutos. Se obtiene un gel homogeneo esteril adecuado para su administracion local.

Ejemplo 9: Preparacion de gel HYADD:HBC 500, en una relacion de 40:60 Procedimiento A

8,0 g de sal sodica del AH con un peso molecular medio de 500-730 kDa, producido por fermentacion, se dispersan en 40 ml de una solucion de NaOH 0,25 M que contiene 0,44 ml de BDDE. La mezcla se calienta a 41,5 °C durante 2 horas y 40 minutos. A continuacion, se hidrata durante toda la noche con 100 ml de una solucion de HCl 0,1 M y 200 ml de agua. Se anaden 50 ml de una solucion saturada de NaCl, y la mezcla se deja hinchar durante toda la noche. Al dfa siguiente, se anaden 170 ml de acetona y 30 ml de solucion saturada de NaCl, y la mezcla se precipita por adicion lenta de un litro de etanol. El precipitado se lava con el mismo disolvente hasta que se hayan eliminado los residuos de NaCl, y a continuacion se seca con una estufa a 35 °C al vacfo hasta que se hayan eliminado los disolventes residuales. El polvo de HBC asf obtenido se mezcla en una relacion de 5:3 con HYADD, preparado como se describe en la patente EP 1853279. Los polvos mezclados se hidratan con solucion salina, dando lugar a una concentracion total de 20 mg/ml (correspondientes a 12,5 mg/ml de HBC y 7,5 mg/ml de HYADD4). El producto se deja hinchar durante toda la noche a 5 °C, y al dfa siguiente se filtra a traves de una membrana plana con una tasa nominal de retencion de partfculas de 100 pm. Jeringas de vidrio de 1 ml se llenan con el producto obtenido de este modo y se esterilizan en un ciclo con F0 = 13 a 121,5 °C.

Ejemplo 10: Relleno cutaneo y tolerabilidad del gel de HYADD:HBC en el modelo de administracion intradermica de conejo

El fin del experimento era evaluar el relleno cutaneo, la aparicion de cualquier evento adverso macroscopico, y la respuesta del tejido provocada por el gel de HYADD:HBC (preparado como se describe en el Ejemplo 9) inyectado en el tejido intradermico del conejo, en comparacion con el relleno comercial BELOTERO®.

Para dicha evaluacion, los geles probados se administraron por via intradermica a conejos machos NZW-KBL que pesan 1,8-2,3 kg.

Diseno del experimento:

Los animales fueron anestesiados por administracion intravenosa de ketamina y xilazina. Se usaron 3 animales para cada carga sometida a ensayo.

Dfa 0: T0

- Inyeccion de muestras (1 ml de hidrogel por muestra) despues de afeitar la espalda de los conejos;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

- Medicion de la hinchazon en todos los conejos y la observacion macroscopica de los eventos adversos.

D'\a 7: T7

- Medicion del volumen de hinchazon y observacion macroscopica de los eventos adversos.

El volumen de hinchazon se calculo con la formula:

(2/3 x n) x (r1)x (r2) x (r3)

en la que: (r1), (r2) y (r3) representan la anchura, longitud y altura de la hinchazon respectivamente, medidas con un calibrador.

Resultados:

La nueva carga no provoco ningun evento inflamatorio en la dermis tratada

Los resultados obtenidos para el tiempo de residencia se muestran en la Figura 1: La cantidad de hinchazon evaluada en la primera semana de tratamiento (expresada en mm3) demuestra que el gel segun la invencion es capaz de inducir un volumen de hinchazon de la piel mas grande que el control, que sigue siendo alta incluso despues de 7 dfas, de nuevo en un grado muy superior a la carga comercial usada como comparacion. Este hallazgo confirma claramente que las nuevas cargas producen inmediatamente una dilatacion dermica significativa, y este efecto se puede atribuir a la presencia del derivado de HYADD que, debido a sus caractensticas qmmicas/reologicas, ha demostrado ser esencial para promover el relleno cutaneo inmediato que permanece estable en el tiempo.

Ejemplo 11: Sintesis de HBC 500 (AH 500-730 kDa)

Procedimiento B

18,75 g de sal sodica de AH con un peso molecular de 500-730 kDa, producido por fermentacion, se dispersan en 133 ml de una solucion de NaOH 0,25 M que contiene 885 pl de BDDE. A continuacion la mezcla se calienta a 45 °C durante 2,5 horas. La mezcla se hidrata durante toda la noche con 0,62 l de una solucion que contiene una cantidad estequiometrica de HCl, 2,65 g de NaCl y 2,7 g de clorhidrato de lidocama, con agitacion lenta.

Ejemplo 12: Preparacion de gel de ACP:HBC 500, en una relacion de 25:75

Procedimiento B (ejemplo comparativo, que no forma parte de la invencion)

6,25 g de ester interno del acido hialuronico ACP 200 se solubilizan en 250 ml de una solucion que contiene 4,4 g de NaCl con agitacion lenta. Cuando la hidratacion se ha completado, el gel se combina con el gel obtenido segun el Ejemplo 11 en un mezclador equipado con un sistema para mezclar semisolidos, hasta que sea homogeneo. El gel obtenido se extruye a traves de un filtro de membrana plana con una tasa nominal de retencion de partmulas de 70 pm. El producto asf obtenido se introduce en jeringas de vidrio y se esteriliza en un ciclo con F0 = 13 a 121,5 °C.

Ejemplo 13: Preparacion de gel de HYADD:HBC 500, en una relacion de 25:75

Procedimiento B

6,25 g de hexadecilamida de HYADD se solubilizan en 250 ml de una solucion que contiene 4,4 g de NaCl con agitacion lenta. Cuando la hidratacion se ha completado, el gel se combina con el gel obtenido segun el Ejemplo 11 en un mezclador equipado con un sistema de mezcla orbital, hasta que sea homogeneo. El gel obtenido se extruye a traves de un filtro de membrana plana con una tasa nominal de retencion de partmulas de 70 pm. El producto asf obtenido se introduce en jeringas de vidrio y se esteriliza en un ciclo con F0 = 13 a 121,5 °C.

Ejemplo 14: Sintesis de HBC 500 (AH 500-730 kDa)

Procedimiento B

125 g de sal sodica de AH con un peso molecular de 500-730 kDa, producida por fermentacion, se dispersan en 1,33 l de una solucion de NaOH 0,25 M que contiene 9,4 ml de BDDE. La mezcla se calienta a 45 °C durante 2,5 horas. La mezcla se hidrata durante toda la noche con 6,2 l de una solucion que contiene una cantidad estequiometrica de HCl, 26,5 g de NaCl y 27 g de clorhidrato de lidocama, con agitacion lenta.

Ejemplo 15: Preparacion de gel de ACP:HBC 500, en una relacion de 50:50

Procedimiento B (ejemplo comparativo, que no forma parte de la invencion)

125 g de ester interno del acido hialuronico ACP200 se solubilizan en 2,5 l de una solucion que contiene 44 g de NaCl con agitacion lenta. Cuando la hidratacion se ha completado, el gel se combina con el gel obtenido segun el

Ejemplo 14 en un mezclador equipado con un sistema de mezcla orbital con un deflector y un raspador. El gel obtenido se extruye a traves de un filtro de membrana plana con una tasa nominal de retencion de partfculas de 45 pm. El producto asf obtenido se introduce en jeringas de vidrio y se esteriliza en un ciclo con F0 = 13 a 121,5 °C.

Ejemplo 16: Relleno cutaneo y tolerabilidad del gel de ACP:HBC en el modelo de administracion intradermica en 5 conejo (ejemplo comparativo, que no forma parte de la invencion)

El experimento se realizo como se describe en el Ejemplo 10, usando gel preparado como se describe en los Ejemplos 11-12, y comparandolo con el control Belotero® y con un segundo relleno comercial, Regenyal Idea.

Para este experimento, el solicitante no solo determina el volumen de hinchazon de la piel causada por el tratamiento, sino que tambien evalua el tiempo de residencia total del gel/carga segun la invencion en comparacion 10 con dos cargas comerciales bien conocidas que representan el comparacion final porque ambos constan de AH reticulado con BDDE.

La hinchazon de la piel en los conejos tratados se midio cada dos semanas (con la observacion macroscopica de eventos adversos) para un maximo de 96 dfas.

Resultados:

15 La Figura 2 muestra los resultados obtenidos: se confirmaron los hallazgos descritos mas arriba, en concreto, la hidratacion inmediata de la dermis tratada (principalmente en los primeros 7 dfas) en un grado sorprendentemente superior al de los controles; por otra parte, el tamano de la hinchazon de la piel fue mas evidente y el tiempo de residencia mas prolongado que los de los dos comparadores comerciales. Al final del experimento, la nueva carga segun la invencion aun estaba presente, mientras que los dos controles casi habfan desaparecido.

20

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Biomateriales que se pueden obtener mezclando

- hexadecilamida del acido hialuronico (HYADD) con

- el derivado (HBC) de acido hialuronico reticulado con 1,4-butanodiol diglicidileter (BDDE)

en una relacion ponderal de entre 10:90 y 90:10 como nuevas cargas y/o como productos para el modelado del cuerpo.
2. Biomateriales segun la reivindicacion 1, en los que la relacion ponderal es de 90:10 a 50:50, como cargas biorrevitalizantes.
3. Biomateriales segun la reivindicacion 1, en los que la relacion ponderal es de 10:90 a 50:50 con un efecto de aumento del volumen.
4. Biomateriales segun la reivindicacion 3, en los que la relacion ponderal es de 25:75.
5. Procedimiento de mezcla de HYADD con HBC preparado mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a. disolucion en solucion alcalina de diepoxido de BDDE en una relacion estequiometrica del 2,5 al 25 % molar de las unidades de repeticion del acido hialuronico, seguido por

b. dispersion de acido hialuronico (AH) en la solucion mencionada en la etapa a), a temperatura ambiente;

c. iniciacion de la reaccion mediante la activacion por calor, con la solucion mencionada en la etapa b) calentada a una temperatura de entre 35 y 55 °C durante entre 2 y 36 horas;

d. extrusion de la masa obtenida a traves de un tamiz metalico, para reducirla a partfculas con un tamano de 600 pm aproximadamente;

e. hidratacion del gel obtenido diluyendolo con agua en un factor de 3 a 20;

f. correccion del pH a neutro con una solucion acuosa de HCl;

g. precipitacion con un disolvente organico soluble en agua hasta que el producto se obtiene en forma de polvo;

h. lavado con disolventes organicos que contienen agua;

i. secado al vacfo hasta que se hayan eliminado los disolventes residuales por debajo de 400 ppm y se obtenga un polvo de HBC;

en el que el procedimiento de mezcla comprende las siguientes etapas:

j. mezcla de polvo de HYADD con polvo de HBC en una relacion de HYADD:HBC de entre 90:10 y 10:90;

k. hidratacion con solucion salina o tampon fosfato, que da lugar a una concentracion total de AH de entre 12 y 27 mg/ml;

l. extrusion a una temperatura de entre 25 y 65 °C a traves de un tamiz con una malla de entre 50 y 500 pm;

m. llenado de la jeringa;

n. esterilizacion por calor con vapor de agua saturado a una temperatura de entre 120 y 124 °C durante al menos 10 min.
6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que el disolvente organico soluble en agua de la etapa g) se selecciona del grupo que consiste en etanol, metanol, isopropanol, n-propanol, dioxano, acetonitrilo, acetona y/o sus mezclas.
7. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que los disolventes organicos de la etapa h) se seleccionan del grupo que consiste en etanol, metanol, isopropanol, n-propanol, dioxano, acetonitrilo, acetona y/o sus mezclas.
8. Procedimiento de mezclado de HYADD con HBC preparado mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a. disolucion en solucion alcalina de diepoxido de BDDE en una relacion estequiometrica del 2,5 al 25 % molar de las unidades de repeticion del acido hialuronico, seguido por

b. dispersion de AH en la solucion mencionada en la etapa a), a temperatura ambiente;

c. iniciacion de la reaccion mediante la activacion por calor, con la solucion mencionada en la etapa b) que se calienta a una temperatura de entre 35 y 55 °C durante entre 2 y 36 horas;

d. correccion del pH a neutro con una solucion acuosa de HCl;

e. hidratacion del gel obtenido diluyendolo con agua en un factor de 3 a 20;

en el que el procedimiento de mezcla comprende las siguientes etapas:

f. mezcla de gel o polvo de HYADD con HBC en forma de gel en una relacion de HYADD:HBC de entre 90:10 y 10:90;

g. trituracion y homogeneizacion mediante el paso a traves de un filtro con un coeficiente de retencion de

partmulas de entre 25 y 150 pm;

h. llenado de la jeringa;

i. esterilizacion por calor con vapor saturado a una temperatura de entre 120 y 124 °C durante al menos 10 min.

5 9. Procedimiento segun la reivindicacion 5 o 6, en el que el AH usado para la preparacion de los derivados de HBC y

HYADD tiene un peso molecular medio de entre 400 y 3 x 106 Da.
10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que el AH tiene un peso molecular medio entre 1 x 105 Da y 1 x 106 Da.
11. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que el AH tiene un peso molecular medio entre 200.000 y

10 1 x 106 Da.
12. Biomateriales segun las reivindicaciones anteriores, en los que el vehmulo es solucion salina.
13. Biomateriales segun las reivindicaciones anteriores, que contienen lidocama.
14. Biomateriales segun las reivindicaciones 12 y 13, que contienen lidocama, en los que el vehmulo consiste en solucion salina.

15 15. Biomateriales segun las reivindicaciones anteriores para su uso como nuevas cargas y/o como nuevos productos

para el modelado del cuerpo en el tratamiento de manchas de la piel, en dermatologfa, en dermocosmetica y/o en cirugfa estetica.