ES2563321T3 - Anticuerpos solubles "solo de cadena pesada" - Google Patents

Anticuerpos solubles "solo de cadena pesada" Download PDF

Info

Publication number
ES2563321T3
ES2563321T3 ES10711069.4T ES10711069T ES2563321T3 ES 2563321 T3 ES2563321 T3 ES 2563321T3 ES 10711069 T ES10711069 T ES 10711069T ES 2563321 T3 ES2563321 T3 ES 2563321T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
heavy chain
antibodies
domain
human
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10711069.4T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2563321T5 (es
Inventor
Franklin Gerardus Grosveld
Richard Wilhelm Janssens
Dubravka Drabek
Tao Chen
Ernie De Boer
Roger Kingdon Craig
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celltech R&D Ltd
Erasmus University Medical Center
Original Assignee
Celltech R&D Ltd
Erasmus University Medical Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40640054&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2563321(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Celltech R&D Ltd, Erasmus University Medical Center filed Critical Celltech R&D Ltd
Publication of ES2563321T3 publication Critical patent/ES2563321T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2563321T5 publication Critical patent/ES2563321T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/108—Orthomyxoviridae (F), e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Micrococcaceae (F); Staphylococcaceae (F), e.g. Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Un método de producción de un anticuerpo solo de cadena pesada que se une específicamente a un antígeno que comprende: (a) inmunizar un mamífero transgénico no humano con el antígeno, en el que el mamífero expresa anticuerpos solo de cadena pesada que carecen de un dominio CH1 en el ARNm de cadena pesada transcrito y procesado, y en el que los anticuerpos solo de cadena pesada se expresan de un locus transgénico en el mamífero; (b) aislar células plasmáticas de vida larga o linfocitos B de memoria del mamífero inmunizado; (c) aislar una población de ARNm de células derivadas de la etapa (b); (d) clonar una población de ADNc derivado del ARNm aislado en la etapa (c) en un vector de expresión y que expresa el vector de expresión en una línea celular; (e) seleccionar por lo menos una línea celular que produce un anticuerpo solo de cadena pesada que se une específicamente al antígeno; en el que el mamífero es un ratón o una rata.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Anticuerpos solubles “solo de cadena pesada”
DESCRIPCION Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos mejorados para aislar a partir de mamlferos no humanos transgenicos un repertorio diverso de anticuerpos solo de cadena pesada, solubles, funcionales, y dominios de VH solubles derivados de los mismos que son estructuralmente distintos de los dominios de VH derivados de anticuerpos que comprenden cadenas pesadas y ligeras. Los anticuerpos solo de cadena pesada y dominios de VH solubles se derivan de celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria.
Antecedentes de la invencion
Los anticuerpos monoclonales o variantes de los mismos representaran una alta proporcion de medicinas nuevas lanzadas en el siglo XXI. La terapia de anticuerpos monoclonales ya es aceptada como una via preferida para el tratamiento de artritis reumatoide y enfermedad de Crohn y hay un progreso notable en el tratamiento del cancer. Los productos basados en anticuerpos tambien estan en desarrollo para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares e infecciosas. Los productos de anticuerpos monoclonales mas comercializados reconocen y se unen a un solo epitope bien definido en el ligando objetivo (por ejemplo, TNFa).
La estructura de los anticuerpos es bien conocida en la tecnica. La mayorla de los anticuerpos naturales son tetramericos y comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas se unen una a otra mediante enlaces disulfuro entre dominios bisagra localizados aproximadamente a la mitad a lo largo de cada cadena pesada. Una cadena ligera esta asociada con cada cadena pesada en el lado del extremo N del dominio bisagra. Cada cadena ligera esta normalmente unida a su cadena pesada respectiva mediante un enlace disulfuro cerca del dominio bisagra.
Cuando una molecula de anticuerpo esta correctamente plegada, cada cadena esta plegada en un numero de dominios globulares distintos unidos por una secuencia de polipeptidos mas lineal. Por ejemplo, la cadena ligera esta plegada en un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Las cadenas pesadas tienen un solo dominio variable (VH) adyacente al dominio variable (VL) de la cadena ligera, un primer dominio constante (CH1), un dominio bisagra y dos o tres dominios constantes adicionales. La interaccion de dominios variables de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) produce la formacion de una region de union a antlgeno (Fv).
La interaccion entre las cadenas pesada y ligera esta mediada por el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) y el dominio constante (CL) de la cadena ligera. Sin embargo, tambien hay una interfase entre el dominio variable de cadena pesada (VH) y el dominio variable de cadena ligera (VL) que participa en la interaccion entre la cadena pesada y la cadena ligera.
Como los dominios variables tienen secuencias de aminoacidos variables, se ha contemplado un sistema para numerar los residuos de aminoacidos en estos dominios. Este sistema de numeration se describe por Kabat et al. ((1991) US Public Health Services, publication de NIH 91-3242) y se usa en la presente memoria descriptiva. En el dominio variable de cadena pesada, la region estructural 1 (FR1) incluye los residuos 1 a 30, la region estructural 2 (FR2) incluye los residuos 36 a 49, la region estructural 3 (FR3) incluye los residuos 66 a 94 y la region estructural 4 (FR4) incluye los residuos 103 a 113. Por tanto, en el dominio variable de cadena pesada, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) incluyen los residuos 30 a 35 (CDR1), residuos 50 a 65 (CDR2) y residuos 95 a 102 (CdR3).
Los linfocitos B humanos normales contienen un solo locus de cadena pesada en el cromosoma 14 a partir del cual se produce el gen que codifica una cadena pesada por reordenamiento. En el raton, el locus de cadena pesada esta localizado en el cromosoma 12. Un locus de cadena pesada normal comprende una pluralidad de segmentos de gen V, un numero de segmentos de gen D y un numero de segmentos de gen J. La mayor parte de un dominio VH esta codificada por un segmento de gen V, pero el segmento del extremo C de cada dominio VH esta codificado por un segmento de gen D y un segmento de gen J. El reordenamiento de VDJ en linfocitos B, seguido por maduracion por afinidad, proporcionan a cada dominio VH su especificidad de union a antlgeno. El analisis de secuencia de anticuerpos tetramericos normales demuestra que la diversidad resulta principalmente de una combination de reordenamientos de VDJ e hipermutacion somatica (Xu y Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). Existen mas de 50 segmentos de gen V humano presentes en el genoma humano de los cuales solo 39 son funcionales. En linfocitos B productores de anticuerpos diploides normales, cada celula produce un anticuerpo tetramerico a partir de un solo conjunto de loci de anticuerpo de cadena pesada y ligera. El otro conjunto de loci se usa, pero no productivamente, como el resultado de un proceso llamado exclusion alelica (vease Singh et al., (2003) J. Exp. Med., 197, 743-750 e Immunology 5a edition, R. Goldsby, T. Kindt, B. Osborne, J. Kuby (2003) W. H. Freeman and Company NY, NY y referencias en los mismos).
La capacidad para “recordar” encuentros con patogenos es una caracterlstica definitoria del sistema inmunologico en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
vertebrados superiores. La contribucion de linfocitos B a la “memoria” parece ser una funcion de dos poblaciones de linfocitos B distintas, celulas plasmaticas de vida larga y linfocitos B de memoria (para revision vease Tangye y Tarlinton (2009) Eur. J. Immunol., (2009) 39, 2065-2075). Estas son generadas como resultado de la respuesta inmunitaria primaria inicial (exposicion al antlgeno) de linfocitos B intactos. Una poblacion esta representada por celulas plasmaticas de vida larga, linfocitos B que continuan secretando altos niveles de anticuerpo neutralizante durante largos periodos (meses) despues de que el antlgeno haya sido eliminado. Las celulas plasmaticas son terminalmente diferenciadas y comprenden loci de inmunoglobulina madurados por afinidad, reordenados que codifican anticuerpos especlficos de antlgeno de alta afinidad. Esto contrasta con las celulas plasmaticas de vida corta, con un ciclo de vida de algunos dlas, que mueren como resultado de estres causado por la produccion masiva de anticuerpo especifico de antlgeno (vease Radbruch et al. (2006) Nature Reviews Immunology, 6, 741-750). Por el contrario, la segunda poblacion de linfocitos B de memoria especlficos de antlgeno representan una poblacion de linfocitos B que tambien comprende loci de inmunoglobulina madurados por afinidad, reordenados, que codifican anticuerpos especlficos de antlgeno de alta afinidad, pero que no secretan anticuerpos a niveles elevados. Los linfocitos B de memoria tienen la capacidad de dividirse y diferenciarse rapidamente en celulas plasmaticas que secretan anticuerpo despues de la exposicion recurrente al antlgeno inmunizante inicial. Esto produce el enriquecimiento rapido del conjunto de inmunoglobulina especlfica de antlgeno disponible para responder a una exposicion a antlgeno dada. El trabajo sobre la vacuna de la viruela demuestra una respuesta de linfocitos B de memoria en individuos inmunizados durante un periodo de 50 anos (Crotty et al. (2003) J. Immunology, 171, 49694973).
En seres humanos, los linfocitos B de memoria sobreviven en organos linfoides secundarios, comprenden genes de inmunoglobulina somaticamente mutados reordenados y median en respuestas inmunitarias secundarias al re- exponerse (vease Bernasconi et al. (2002) Science, 298, 2199- 2202). El bazo humano en particular parece ser un sitio importante para los linfocitos de memoria (para revision, vease Tangye y Tarlinton (2009) Eur. J. Immunol. (2009), 39, 2065-2075).
Las celulas plasmaticas que secretan anticuerpo de vida larga sobreviven en organos linfoides secundarios y medula osea durante meses. Por ejemplo, las celulas que secretan inmunoglobulina seleccionadas por antlgeno persisten en el bazo y medula osea humanos (Ellyard et al. (2004) Blood, 103, 3805-3812).
En otros mamlferos, tales como el raton, la respuesta de anticuerpo de largo plazo primaria parece ser una funcion de las celulas plasmaticas de vida larga. Asl, en el raton, las celulas plasmaticas de vida larga terminalmente diferenciadas presentes en medula osea y bazo sobreviven y continuan secretando anticuerpos durante periodos de tiempo prolongados, mas de un ano (vease Slifka et al. (1998) Immunity, 8, 363-372; Maruyama et al. (2000) Nature, 407, 636-641). Aunque queda por establecer con certeza la relacion precisa entre las celulas de memoria y las celulas plasmaticas de vida larga terminalmente diferenciadas en diferentes mamlferos, dos conjuntos de linfocitos B de vida larga existen en mamlferos, comprendiendo cada uno loci de inmunoglobulina madurada por afinidad, reordenada, que codifican anticuerpos especlficos de antlgeno de alta afinidad. Uno tiene la capacidad de dividirse rapidamente. El otro no se divide, pero retiene la capacidad de secretar anticuerpo durante periodos largos.
Los anticuerpos tetramericos humanos especlficos de antlgeno producidos por pacientes proporcionan una posible fuente de anticuerpos especlficos de antlgeno cllnicamente y comercialmente relevantes. Estos tambien pueden derivarse directamente de linfocitos B humanos transformados por EBV, preferentemente de linfocitos B de memoria humanos transformados por EBV, opcionalmente transformados en presencia de activadores de linfocitos B policlonales (documento PCT/IB04/01071).
Zou et al. (2007, J. Experimental Medicine, 204(13): 3271-3283) investiga la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada en el suero de ratones deficientes en cadena ligera.
Hasta ahora, las celulas de memoria y las celulas plasmaticas de vida larga no se han utilizado como una fuente de anticuerpos de alta afinidad codificados por transgen, en particular anticuerpos humanos o anticuerpos hlbridos que comprenden dominios VH y VL humanos.
Inaenierfa de dominio VH y anticuerpos solo de cadena pesada
La capacidad de los anticuerpos solo de cadena pesada desprovistos de cadena ligera para unirse a antlgeno se establecio en la decada de los 60 (vease Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). La inmunoglobulina de cadena pesada flsicamente separada de la cadena ligera retuvo el 80 % de actividad de union a antlgeno en relacion con el anticuerpo tetramerico. Ademas, la actividad de union se asocio a un fragmento del extremo amino (Fd) de la cadena pesada. Aunque estos experimentos usaron anticuerpo policlonal de conejo, especifico de antlgeno, bien caracterizado, son representativos de cualquier poblacion policlonal que comprende un anticuerpo tetramerico de origen de mamifero, incluyendo humano. El dimero de cadena pesada retuvo el dominio de union de cadena ligera CH1.
En los 80, varias publicaciones describieron la manipulation in vitro de genes de cadena pesada para construir anticuerpos novedosos. Una gran parte de este trabajo se baso en un gen m de anticuerpo de raton reordenado
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(IgM) que codificaba un anticuerpo producido contra un antlgeno bien caracterizado. Una caracterlstica de este anticuerpo fue que se sabla que la especificidad de union a antlgeno residla en el dominio VH, ya que el ensamblaje y la secrecion con una cadena ligera irrelevante mostro retencion de la union a antlgeno (vease Neuberger y Williams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond., A317, 425-432). Usando este sistema, se mostro que un dominio de union de VH especlfico de antlgeno de raton podrla usarse para derivar un anticuerpo novedoso que comprendla una region constante e humana fusionada a un dominio VH especlfico de antlgeno de raton. La IgE quimerica resultante retuvo especificidad de antlgeno y mostro actividad efectora esperada de una IgE (vease Neuberger et al. (1985) Nature, 314, 268-270).
Otros ejemplos en la bibliografla de ingenierla de cadena pesada incluyen la produccion de un anticuerpo quimerico de raton-humano que comprende un VH de raton fusionado a regiones constantes de IgA o IgG humanas (veanse Morrison et al. (1984) PNAS, 81, 6851-6855; Sun et al. (1987) PNAS, 84, 214-218); y Heinrich et al. (1989) J. Immunol., 143, 3589- 97). Asl, a fines de la decada de los 80, el concepto de ingenierla de cadena pesada estaba bien establecido. Cualquier dominio de union VH caracterizado podia fusionarse con cualquier region constante de anticuerpo, produciendo la retencion de actividad de union especifica de antlgeno. La funcion efectora se determino por la region constante de cadena pesada seleccionada (por ejemplo, IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, etc.). El anticuerpo quimerico expresado final en todos los casos comprendio un anticuerpo tetramerico.
Para manipular por ingenieria una cadena pesada completamente humana se requiere una fuente de dominios VH humanos de especificidad de union definida. Este problema se resolvio parcialmente mediante el desarrollo de bibliotecas de matrices de dominio de union de VH humano derivadas usando combinaciones de segmentos V, D y J humanos de linea germinal intactos o dominios VH madurados por afinidad derivados de anticuerpos tetramericos obtenidos de linfocitos humanos. Los dominios de VH especificos de antlgeno con afinidades de union en el intervalo de 20 nM a 100 nM podrian entonces aislarse de bibliotecas de presentacion de dominio de union de VH derivadas del ARNm de linfocitos B de sangre periferica productores de anticuerpos humanos (vease Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546) o de matrices de VDJ aleatorias derivadas de ADN de linea germinal humana intacta (vease el documento EP-A-0 368 684). Estos enfoques proporcionaron una fuente de dominios VH de mamifero especificos de antigeno en particular dominios VH humanos.
Se propuso que:
“Los dominios variables aislados (VH) podian ofrecer una alternativa a anticuerpos monoclonales y servir como una llave para la construccion de anticuerpos humanos de alta afinidad”;
“Uniendo dominios variables a dominios constantes de cadena ligera o cadena pesada adecuados y que expresan los genes ensamblados en celulas de mamifero, podian hacerse anticuerpos completos y debian poseer funciones efectoras naturales tales como lisis de complemento”; y
“Este enfoque podria probar ser valioso para construir anticuerpos humanos de valor terapeutico” (vease Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546 y el documento EP-A-0 368 684).
Usando un enfoque alternativo, Sitia et al. ((1990) Cell, 60, 781 - 790) demostraron que la eliminacion del dominio CH1 de un gen m de raton reordenado produjo la sintesis y secrecion de anticuerpo solo de cadena pesada desprovisto de cadena ligera por celulas de mamifero en cultivo. En este caso, la cadena pesada secretada comprendia un dominio de union de VH y una region constante que consistia en un dominio bisagra flexible y dominios constantes CH2, CH3 y CH4 de IgM, proporcionando la dimerizacion y funcion efectora de cadena pesada.
Asi, por 1990, las herramientas basicas estaban disponibles para la ingenieria in vitro de homodimeros de anticuerpo solo de cadena pesada humanos (algunas veces descritos como Dabs-Fc) con especificidades de union de VH definidas y una eleccion de regiones efectoras de cadena pesada desprovistas de CH1.
El problema con el enfoque fue doble:
Dominios VH seleccionados por enfoques de matriz fueron de afinidad de union a antigeno relativamente baja (20-100 nM); y
dominios VH en ausencia de cadena ligera fueron “pegajosos”, insolubles y propensos a la agregacion, y no tan adecuados para aplicaciones farmaceuticas.
La tendencia para que los dominios VH aislados se agregaran es una consecuencia de la ausencia de cadena ligera. Cuando la cadena ligera esta ausente, ciertas cadenas laterales hidrofobas que normalmente estan enterradas dentro de la interfase cadena pesada/ligera se exponen. Ademas, se compromete la estabilidad termodinamica ya que la estabilidad de dominios VH depende de contactos en la interfase de cadena ligera (vease Worn y Pluckthun (1999) Biochemistry, 38, 8739-8750).
La descripcion por Hamers-Casterman de un anticuerpo solo de cadena pesada homodimerico de IgG que existe de forma natural desprovisto de cadena ligera que circula en camelidos, ademas de anticuerpo tetramerico de camelido normal (vease Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363, 446- 448) proporciono una perspectiva en el problema de solubilidad. Consistente con la molecula geneticamente manipulada por Sitia et al. ((1990) Cell, 60, 781- 790), la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
funcionalidad del dominio CH1 estuvo ausente en anticuerpos solo de cadena pesada de camelido debido a un sitio de corte y empalme alternativo que elimino CH1 del ARNm de cadena pesada de anticuerpo procesada.
Los dominios VH de anticuerpos solo de cadena pesada de camelido (que de aqul en adelante se refieren como dominios VHH, segun el uso comun) derivados por exposicion a antlgeno se maduran por afinidad en linfocitos B in vivo, tienen afinidades de union en el intervalo nanomolar bajo, son solubles y no son propensos a la agregacion (vease Ewert et al. (2002) Biochemistry, 41, 3628-3636). Los dominios VHH de camelido tambien muestran generalmente elevada estabilidad al calor en relacion con dominios VH derivados de llnea germinal aislados por enfoques de presentacion y algunos que tienen la actividad de union en presencia de agentes desnaturalizantes tales como detergentes y agentes blanqueantes, y despues tratamiento con calor (vease Dumoulin et al. (2002) Protein Science, 11, 500-511 y Dolk et al. (2005) Applied Environmental Microbiology, 71,442-450).
Los anticuerpos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno pueden recuperarse de ARNm de linfocitos B de camelido por tecnologla de clonacion estandar o por tecnologla de presentacion en fagos u otra tecnologla de presentacion (vease Riechmann y Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). Los anticuerpos solo de cadena pesada derivados de camelidos son de alta afinidad. El analisis de secuencia de ARNm que codifica anticuerpo solo de cadena pesada demuestra que la diversidad resulta principalmente de una combinacion de reordenamiento de VHHDJ e hipermutacion somatica, como tambien se observa en la produccion de anticuerpos tetramericos normales. Sin embargo, queda por establecer si la produccion por camelidos de anticuerpos solo de cadena pesada, a diferencia de los anticuerpos tetramericos, es por linfocitos B normales. De hecho, se sabe poco acerca del desarrollo de pre-linfocitos B en camelidos (veanse los documentos WO2004/049794 y Zou et al. (2005) J. Immunology, 175, 3769-3779). Ademas, queda por establecer si los anticuerpos solo de cadena pesada de camelido, como tetrameros de inmunoglobulina que comprenden cadena pesada y ligera, participan o no en respuestas de anticuerpo a largo plazo por celulas de memoria o celulas plasmaticas de vida larga.
Una caracterlstica particular de los anticuerpos solo de cadena pesada de camelido es que algunos residuos de aminoacidos que, en un dominio VH normal, interaccionan con el dominio VL, estan mutados en un dominio VHH. Asl, la leucina encontrada en la posicion 45 en el 98 % de las secuencias de VH humanas y murinas ha estado mutada. Se ha propuesto que estas mutaciones de camelido, que se conservan en la llnea germinal, son consistentes con el mantenimiento de la solubilidad de VHH en ausencia de cadena ligera. Tambien se han descrito otras mutaciones de aminoacido distintivas en dominios VHH de camelido, en comparacion con dominios VH normales. De estos, los cambios mas comunes e importantes ocurren en cuatro posiciones (tetrada de VHH) en la segunda region estructural y funcionan reduciendo el caracter hidrofobo de la interfase de cadena ligera anterior. Generalmente, Glu-44 y Arg-45 se encuentran en lugar de Gly-44 y Leu-45 menos hidrofilos presentes en dominios VH normales, mientras que el caracter hidrofilo en la posicion 47 aumenta por la sustitucion de Trp con residuos mas pequenos. El cuarto cambio requiere la sustitucion de Val-37 por Phe o Tyr. El analisis estructural revela que esto produce nucleacion de un nucleo hidrofobo pequeno que implica normalmente a Tyr-91, Trp-103, Arg-45 y residuos hidrofobos presentes en el bucle CDR3 del dominio VHH. Estos cambios aumentan el caracter hidrofilo de la interfase de cadena ligera anterior por sustitucion directa con cadenas laterales mas hidrofilas o por secuestro de cadenas laterales hidrofobas de disolvente por interaccion entre CDR3 y residuos de la region estructural (vease Bond et al. (2003) J. Mol. Biol., 332, 643-655).
En el dominio VHH, el bucle CDR3 esta agrandado en relacion con aquel presente en anticuerpos tetramericos de camelido y otros anticuerpos tetramericos bien caracterizados de ser humano y raton (vease Riechmann y Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). El papel de los residuos hidrofobos clave presentes en el bucle CDR3 de VHH, por ejemplo en el dominio VHH de llama, demuestra un papel estructural para CDR3 en la estabilidad y solubilidad de dominios VHH (vease Bond et al. (2003) J. Mol. Biol., 332, 643-655). En conjunto, estudios estructurales sobre dominios VHH demuestran que la estabilidad y solubilidad de estos dominios son dependientes de CDR3, ademas de residuos de la region estructural, y que el requerimiento para residuos hidrofobos clave pone restricciones significativas al tipo de bucle CDR3 compatible con las caracterlsticas bioflsicas favorables de dominios VHH en relacion con dominios VH (vease Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 36393654).
Sin embargo, a pesar de un alto grado de conservacion de secuencia entre camelidos y el hombre, los dominios VHH de camelido siguen siendo de origen camelido y, por lo tanto, son posiblemente antigenicos en el hombre. La humanizacion in vitro puede disminuir este riesgo, pero a costa de la afinidad y solubilidad potencialmente disminuidas como resultado de la manipulation por ingenierla in vitro implicada.
Dominios de union de VH humano y el problema de la solubilidad
Las malas caracterlsticas bioflsicas de dominios VH humanos y de otros mamlferos derivados de secuencias de llnea germinal o de anticuerpos tetramericos normales en relacion con dominios VHH de camelido, en particular la tendencia a agregarse, limitan actualmente su utilidad como reactivos, diagnostico y como medicinas (veanse Rosenberg (2006) The AAPS Journal, 8(3), Artlculo 59 E501-E507 y Fahrner et al. (2001) Biotechnol. Gen. Eng. Rev., 18, 301-327).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Intentos iniciales para resolver los problemas de solubilidad se basaron en la introduccion de secuencias de aminoacidos camelizantes en regiones de union de VH humanas seleccionadas en la interfase VH/VL. Este enfoque ha demostrado ser decepcionante, ya que la estabilidad y solubilidad no pueden tratarse por la “camelizacion” en la posicion 45 de la interfase VH/VL sola (veanse las presentaciones de Domantis con fecha de 18 de mayo de 2007 y 5 de junio de 2007 en oposicion al documento EP-B-0 656 946). De hecho, la introduccion de mutaciones “camelizantes” dirigidas no es suficiente para resolver problemas de “adhesion” en dominios VH humanos aislados (vease Riechmann y Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). La introduccion de mutaciones camelizantes conduce a deformaciones en la hoja b plegada de la region estructural potencialmente responsable de la estabilidad de protelna reducida observada como resultado de estos experimentos (vease Riechmann (1996) J. Mol. Biol., 259, 957-969). Ademas, el papel de CDR3, que comprende residuos hidrofobos clave, en el mantenimiento de la estabilidad y solubilidad estructural de dominios VHH en ausencia de cadena ligera se anade a la complejidad, limitando posiblemente la diversidad de secuencias de CDR3 a aquellas compatibles con la region estructural de camelido (vease Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654).
Asl, los dominios VH de mamlfero, incluyendo aquellos de humano, derivados de anticuerpos tetramericos naturales madurados por afinidad o de matrices intactas de segmentos VDJ de llnea germinal son, en ausencia de cadena ligera, relativamente insolubles y propensos a agregacion. Dichos dominios VH carecen de las caracterlsticas bioflsicas necesarias de un dominio VH soluble adecuado para usarse como medicinas.
Anticuerpos solo de cadena pesada y dominios VH humanos solubles generados in vivo por transgenesis
Para aplicaciones farmaceuticas, los dominios de union de VH solubles seran preferentemente de origen humano con caracterlsticas tales como afinidad de union a antlgeno alta y solubilidad bajo condiciones fisiologicas en ausencia de agregacion. Tales dominios de union a VH solubles tambien pueden usarse como diagnosticos y reactivos y tendran aplicaciones amplias en la industria y agricultura.
Un enfoque alternativo para generar antlgenos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno es usar ratones transgenicos que comprenden loci de cadena pesada desprovistos de funcionalidad CH1 (vease Janssens et al. (2006) PNAS, 103:15130-5 y WO02/085944).
Al principio, no se sabla si los linfocitos B murinos normales serlan activados y secretarlan anticuerpos solo de cadena pesada como resultado de la exposicion a antlgeno o si tales anticuerpos demostrarlan ser solubles. Ademas, no se sabla si IgM se requerla o, como en el camelido, si la expresion serla limitada a las clases Igg2 e Igg3 de anticuerpo, o incluso si los dominios VH potencialmente insolubles podrlan ser secretados por linfocitos B murinos normales.
Janssens et al. ((2006) PNAS, 103:15130-5) describen un locus de gen de cadena pesada quimerico que comprende dos segmentos de gen VHH de llama, codificando todos los segmentos de gen D y J y combinaciones de segmentos de gen regiones constantes Cm y Cg2 y Cg3 humanas, careciendo todas de la funcionalidad CH1. La eleccion de los segmentos de gen VHH de llama aseguraron que las mutaciones de region estructural de llnea germinal mantenidas en camelidos en la interfase VH/VL tambien estan presentes en el locus humano camelizado expresado para potenciar la posibilidad de que el dominio VH “camelizado” resultante pudiera retener las caracterlsticas de solubilidad y estabilidad mostradas por el VHH de camelido, aumentando asl la probabilidad de una respuesta funcional a la exposicion a antlgenos incluso en ausencia de un bucle CDR3 derivado de camelido.
El resultado demostro que un transgen de anticuerpo solo de cadena pesada se expresa de una manera especlfica de linfocitos B, que la expansion de linfocitos B ocurre y que, en ausencia de funcionalidad CH1, la presencia de cualquier gen de cadena ligera funcional es irrelevante. Los transgenes solo de cadena pesada experimentan reordenamiento de VDJ, seguido por activacion de linfocitos B y maduracion por afinidad en respuesta a exposicion a antlgeno. El cambio de clase entre IgM e IgG solo de cadena pesada tambien ocurre, como lo hace el cambio de isotipo Cg En ausencia de Cm del locus, Cm se usa igualmente bien. La especificidad de los anticuerpos se determina en gran medida por el reordenamiento de VDJ (CDR3), mientras que el analisis de mutaciones somaticas muestra que estos ocurren en toda la region VH, con preferencia para las regiones CDR1 y CDR2 del segmento de gen VHH de llama expresado. Del numero limitado de anticuerpos solo de cadena pesada humanos camelizados caracterizados, todos demostraron ser solubles ya sea que fueran derivados de linfocitos B del bazo por presentacion en fagos de dominios VH o por seleccion de hibridoma, a pesar del hecho de que el bucle CDR3, que se derivo completamente de secuencias humanas, fue mas pequeno que aquellos encontrados en dominios VHH de camelido.
Los mejores anticuerpos solo de cadena pesada hlbridos de llama/humano de esta serie limitada tenlan afinidades en el intervalo de 1-3 nM. El raton tambien trata el transgen como otro locus de cadena pesada porque la expansion de linfocitos B y la arquitectura del bazo es esencialmente normal incluso en ausencia de reordenamiento de cadena ligera (vease Janssens et al. (2006) PNAS, 103:15130-5). Ademas, los mecanismos de exclusion alelica determinan si el locus de cadena pesada de raton endogeno o el transgen de cadena pesada que carece de funcionalidad CH1 se expresa productivamente (vease el documento WO2007/09677).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las observaciones de Janssens et al. ((2006) PNAS, 103:15130-5) demuestran sorprendentemente que los anticuerpos solo de cadena pesada camelizados, solubles, estables, pueden derivarse usando una region estructural de camelido, incluso en ausencia de bucle CDR3 que comprende secuencias de camelido.
Como una extension de estos experimentos (vease el documento WO2006/008548), se han construido llneas de raton transgenicas adicionales que comprenden loci de gen solo de cadena pesada completamente humanos, y as! carecen de secuencia que codifica la region estructural VHH de camelido y, ademas, comprenden bucles CDR3 derivados de secuencias que no son de camelido.
En este enfoque se han introducido cuatro segmentos de gen VH de llnea germinal humana natural (locus natural V4), basandose as! completamente en la selection natural a traves de la maduracion por afinidad para la generation de especificidad de antlgeno y estabilidad estructural de los dominios VH humanos solubles resultantes. Ambos loci comprenden todos los segmentos de gen D y J, segmentos de gen de region constante Cg2 y Cg3 humanos, careciendo cada uno de CH1, los elementos reguladores del potenciador de inmunoglobulina humana y preferentemente la LCR de cadena pesada de anticuerpo.
El locus V4 humano es funcional y los anticuerpos solo de cadena pesada humanos circulan en el plasma de animales no expuestos. Tras la exposition a antlgeno, los anticuerpos humanos especlficos de antlgeno se detectan usando ensayos de ELISA rutinarios. Los loci humanos que comprenden segmentos de gen V manipulados por ingenierla (locus V17) (vease tambien el documento WO2008/035216) son tambien funcionales (vease tambien The Antibody Engineering and Antibody Therapeutics Meeting. F. Grosveld presentation, San Diego Antibody Meeting, 34 de diciembre de 2007).
Ademas, sorprendentemente, la exposicion a antlgeno de ratones transgenicos que comprenden loci V4 permite el aislamiento y la caracterizacion de dominios VH humanos de alta afinidad, especlficos de antlgeno, solubles, en ausencia de la llnea germinal de mutaciones de region estructural distintivas de camelido y el bucle CDR3 similar a camelido tlpico de dominios VHH de camelido. Ademas, los dominios VH derivados de anticuerpos solo de cadena pesada humanos especlficos de antlgeno son solubles (vease el documento WO2006/008548). Tras la exposicion a antlgeno, el reordenamiento de VDJ y la posterior expansion de linfocitos B, la arquitectura del bazo en ratones que comprenden el locus V4 humano es esencialmente similar a una respuesta de inmunoglobulina de raton no mutante a la exposicion a antlgenos. La microscopla optica muestra segregation de la agrupacion de linfocitos T en la hoja de linfocitos peri-arteriolar (PALS) rodeada por areas ricas en linfocitos B que contienen follculos y zonas marginales presentes en los limites externos de la pulpa blanca. Tambien hay estructuras similares a centros germinales en follculos de linfocitos B de tejidos linfoides secundarios comparables a ratones no mutantes durante las respuestas de anticuerpo dependientes de linfocitos T.
Puede derivarse un enfoque de presentation alternativo a la identification y la manipulation por ingenierla de dominios VH humanos sinteticos que no depende de analisis predictivo de secuencias de dominio VHH de camelido naturales tambien demuestra que los dominios VH autonomos con propiedades estructurales mas alla del alcance de las regiones estructurales naturales usando mutaciones no naturales que difieren de aquellas encontradas en camelido (vease Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654 y la solicitud de patente de E.E.UU. numero 11/102.502). Sin embargo, los datos no demuestran si tales dominios VH retienen o no las caracterlsticas bioflsicas de solubilidad bajo condiciones fisiologicas en ausencia de agregacion en combination con afinidades de union en el intervalo nanomolar bajo.
Enfoques para la identificacion y manipulacion por ingenierla de dominios VH humanos sinteticos por presentacion, aunque son buenos, son laboriosos y estan limitados en alcance a la disponibilidad de dominios VH humanos e information estructural tridimensional de VHH de camelido. Diferencias sutiles seran evidentes dependiendo de las combinaciones de VDJ usadas, que limitaran el desarrollo de bibliotecas de VH basadas en matriz sinteticas con diversidades de CDR3 no restringidas por demandas estructurales que mantienen la union a antlgeno de alta afinidad. Aunque los resultados demuestran que, a diferencia de los dominios VHH de camelido, conformaciones estables solubles de dominios VH humanos no dependen de interacciones entre el bucle CDR3 y las sustituciones de aminoacidos distintivas de camelido en la interfase de cadena ligera anterior, los datos estan limitados a caracterlsticas bioflsicas. Por ejemplo, no se ha considerado el mantenimiento de union a antlgeno de alta afinidad en el contexto de estos cambios.
La invencion
La invencion proporciona un metodo de produccion de un anticuerpo solo de cadena pesada que se une especlficamente a un antlgeno que comprende:
(a) inmunizar un mamlfero transgenico no humano con el antlgeno, en el que el mamlfero expresa anticuerpos solo de cadena pesada que carecen de un dominio CH1 en el ARNm de cadena pesada transcrito y procesado, y en el que los anticuerpos solo de cadena pesada se expresan de un locus transgenico en el mamlfero;
(b) aislar celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria del mamlfero inmunizado;
(c) aislar una poblacion de ARNm de celulas derivadas de la etapa (b);
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(d) clonar una poblacion de ADNc derivado del ARNm aislado en la etapa (c) en un vector de expresion y que expresa el vector de expresion en una linea celular;
(e) seleccionar por lo menos una linea celular que produce un anticuerpo solo de cadena pesada que se une especificamente al antigeno;
en el que el mamifero es un raton o una rata.
La invencion tambien proporciona un metodo de produccion de un dominio VH soluble o una proteina de fusion VH que se une especificamente a un antigeno que comprende:
(a) inmunizar un mamifero transgenico no humano con el antigeno, en el que el mamifero expresa anticuerpos solo de cadena pesada que carecen de un dominio CH1 en el ARNm de cadena pesada transcrito y procesado, y en el que los anticuerpos solo de cadena pesada se expresan de un locus transgenico en el mamifero;
(b) aislar celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria del mamifero inmunizado;
(c) aislar una poblacion de ARNm de celulas derivadas de la etapa (b);
(d) clonar una poblacion de ADNc que comprende ADNc que codifican un dominio Vh derivado del ARNm de la etapa (c) en un vector de expresion de tal manera que un dominio VH o una proteina de fusion VH, que puede comprender una region efectora de cadena pesada, se exprese en la linea celular; y
(e) seleccionar por lo menos una linea celular que produce un dominio Vh o una proteina de fusion Vh que se une especificamente al antigeno,
en el que el mamifero es un raton o una rata.
Los presentes inventores han mostrado sorprendentemente que los anticuerpos solo de cadena pesada codificados por transgen tambien son expresados por celulas plasmaticas de vida larga murinas o linfocitos B de memoria, purificados de las glandulas linfaticas secundarias, medula osea y bazo de animales transgenicos expuestos al antigeno que comprenden loci de gen solo de cadena pesada. Ademas, se han desarrollado metodos mas altamente eficaces que anulan la necesidad de hibridomas o enfoques de presentacion clasicos para la recuperacion de anticuerpos especificos de antigeno solo de cadena pesada o dominios VH solubles.
ADNc ventajosamente clonado que codifica anticuerpo solo de cadena pesada o dominios VH solubles derivados de poblaciones de celulas plasmaticas o de celulas de memoria purificadas de animales transgenicos expuestos al antigeno pueden expresarse en cualquier linea celular de eleccion capaz de expresar, acumular, secretar o presentar una proteina de fusion de dominio VH o anticuerpo solo de cadena pesada sobre la superficie celular. Las elecciones preferidas son lineas celulares microbianas o lineas celulares de mamifero adecuadas para la fabricacion de material de grado quimico.
Asi, segun la invencion, los anticuerpos solo de cadena pesada y dominios VH solubles se derivan de linfocitos B de memoria huesped o celulas plasmaticas de vida larga.
La linea celular de eleccion es preferentemente de origen de mamifero, pero puede derivarse de levadura o cualquier organismo capaz de acumular o secretar anticuerpos solo de cadena pesada y proteinas de fusion de dominio VH, o presentar dichos anticuerpos solo de cadena pesada y proteinas de fusion de dominio VH sobre la superficie celular.
El metodo es adecuado para el aislamiento de anticuerpos solo de cadena pesada, ya sean producidos naturalmente en el organismo huesped, tal como la llama, o como resultado de un locus transgenico expresado en un organismo huesped no humano.
Preferentemente, la linea de celulas de mamifero de eleccion es adecuada para la produccion de material de calidad clinica, por ejemplo, celulas CHO.
El metodo es sencillo, altamente eficaz y muy adecuado para la automatizacion, ya que los anticuerpos solo de cadena pesada son homodimeros, no tetrameros complejos. No hay necesidad de buscar la cadena ligera relacionada, un problema que se ha anadido mucho a la complejidad de derivar anticuerpos tetramericos especificos de antigeno de poblaciones de celulas de memoria y de celulas plasmaticas (vease Meijer et al. (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, 525, 261-277).
Las poblaciones de linfocitos B enriquecidas en celulas plasmaticas de vida larga o celulas de memoria pueden aislarse del organismo huesped por varias tecnicas bien establecidas en la tecnica. El organismo huesped preferido es un raton. En el raton, las poblaciones de linfocitos B estan bien caracterizadas y pueden usarse marcadores de superficie celular para diferenciar entre diferentes sub-poblaciones. Por ejemplo, celulas plasmaticas de raton que expresan CD138 (sindecano-1) sobre la superficie celular. La expresion de CD138 sobre celulas del linaje de linfocitos B se correlaciona con la etapa de desarrollo, localizacion y adhesion (veanse Sanderson et al. (1989) Cell Regulation, 1, 27-35; Kim et al (1994) Mol. Biol. Cell., 5, 797-805). Las celulas plasmaticas CD 138+ se encuentran predominantemente en el bazo, nodos linfaticos y medula osea. Las celulas plasmaticas pueden distinguirse ademas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de los linfocitos B intactos murinos, linfocitos B de memoria y poblaciones de linfocitos no B en que son CD138+, CD45R (B220) bajo/negativo y CD19 bajo/negativo.
La disponibilidad de anticuerpos que reconocen marcadores de superficie celular permite la separacion de celulas plasmaticas de otras poblaciones de linfocitos B por citometrla activada por fluorescencia, o tecnologlas de separacion de celulas bien establecidas ampliamente disponibles en kits basados, por ejemplo, en procedimientos de separacion magnetica, en columna o por centrlfuga usando anticuerpos conjugados a un sustrato solido que permite la union de una poblacion de celulas de otra. Asl, por ejemplo, perlas magneticas que comprenden anti- CD45R (algunas veces conocidas como B220) eliminaran la mayorla de las celulas no plasmaticas de una poblacion de linfocitos B mixtos. Una incubacion posterior con perlas magneticas que comprenden anti-CD138 capturaran una poblacion de celulas plasmaticas altamente enriquecida (vease el kit de clasificacion magnetica para el aislamiento de celulas plasmaticas CD138+ de raton de Miltenyi Biotec). Tambien pueden usarse otros marcadores de superficie celular para aislar estas celulas (por ejemplo, Anderson et al. (2007) J. Exp. Med., 204, 2103-14). Por tanto, la poblacion de celulas de partida podrla derivarse de nodos linfaticos y/o parches de Peyer.
Si no estan disponibles mezclas de anticuerpos que se diferencian entre linajes de linfocitos B huesped dados, entonces una combinacion de aislamiento de linfocitos B de medula osea y nodos linfaticos, seguido por purificacion de linfocitos B usando un anticuerpo contra un marcador de superficie de linfocitos pan-B, tambien proporcionara una poblacion de celulas plasmaticas altamente enriquecida.
Esto es particularmente relevante para especies tales como vaca, conejo, oveja, etc., e incluso ser humano, en lo que los marcadores de superficie celular tales como CD138 pueden no estar disponibles. Los marcadores estan disponibles para seleccionar poblaciones de linfocitos B particulares de otras especies (por ejemplo,
http://www.miltenvibiotec.com/en/PG 91 625 CD138 Plasma Cell Isolation Kit.aspx: Klein et al., Human immunoglobulin (lg)M+lgD+ peripheral blood B-cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated (memory) B cells, (1998) J. Exp. Med., 188, (9), 1679-89; Denham et al., Monoclonal antibodies putatively identifying porcine B cells, (1998) Vet Immunol Immunopathol. 30;60(3-4):317-28; Boersma et al., Summary of workshop findings for porcine B-cell markers, (2001) Vet. Immunol Immunopathol., 80, (1-2), 63-78; Naessens, Surface Ig on B lymphocytes from cattle and sheep, (1991) Int. Immunol., 9, (3), 349-54; Sehgal et al., Distinct clonal Ig diversification patterns in young appendix compared to antigen-specific splenic clones, (2002) J. Immunol., 168, (11), 5424-33).
Tras el aislamiento de ARNm de poblaciones de celulas plasmaticas o de memoria, el ADNc (que representa ya sea dominios HCAb o VH solos) se clona en el vector de expresion de eleccion, y el vector se transfecta en una poblacion de celulas diana para la expresion de anticuerpos solo de cadena pesada o protelnas de fusion de VH. Las celulas que expresan anticuerpos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno pueden seleccionarse, por ejemplo, por ELISA estandar en un formato de 96 pocillos, o en un formato de micromatriz o usando citometrla activada por fluorescencia (FACS) para la derivacion de llneas celulares.
Preferentemente, con el fin de aumentar al maximo la eficiencia del proceso, el vector de expresion se transfecta primero en bacterias y las colonias que contienen el ADNc clonado en el vector de expresion se recogen en un formato de 96 pocillos (u otro formato automatizable de alto rendimiento), se hacen crecer en el formato de 96 pocillos y el aDn se alsla en el mismo formato. El ADN de plasmido se transfecta posteriormente en el mismo formato en las celulas de expresion (por ejemplo, celulas HEK o levadura, etc.) y los transformantes se hacen crecer en el mismo formato de 96 pocillos. El sobrenadante de las celulas se prueba posteriormente en el mismo formato (u otro, preferentemente formato de densidad mas alta, tal como un micromatriz, usando menos antlgeno) para union a antlgeno. Las celulas que expresan HCAb positivas para antlgeno pueden luego expandirse adicionalmente y los ADNc positivos estan inmediatamente disponibles del formato de 96 pocillos original en el que el ADN se preparo para caracterizacion posterior, tal como analisis de secuencia, o el dominio VH relevante puede clonarse inmediatamente en un esqueleto diferente, por ejemplo, una region constante diferente de la misma especie o una especie diferente. El ADN tambien puede transfectarse inmediatamente en otros tipos de celulas para establecer otras llneas celulares.
Las llneas celulares que expresan anticuerpos de alta afinidad pueden entonces expandirse, establecerse bancos de celulas y usarse como una fuente de anticuerpos solo de cadena pesada diana para fines de investigacion o estudios cllnicos o potencialmente pre-cllnicos. Asl, el metodo incluye ademas la etapa de mantener una llnea celular seleccionada que produce un anticuerpo solo de cadena pesada o protelna de fusion de VH que se une especlficamente al antlgeno diana.
Este metodo de clonacion directa tambien serla ventajoso para anticuerpos tetramericos derivados de transgen normales en los que se usan celulas CD138+ individuales por pocillo. El ARNm (abundante) que codifica las cadenas pesada y ligera se amplificarla por PCR usando por separado cebadores especlficos de cadena y cada uno se clonarla luego en el vector de expresion. La co-transfeccion de los dos producirla la expresion de un anticuerpo tetramerico que podrla identificarse de la misma manera que se describe para el anticuerpo solo de cadena pesada.
Los vectores de expresion de eleccion seran conocidos por el experto en la tecnica y se disenaran para impulsar
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
anticuerpos solo de cadena pesada eficaces o la expresion de protelna de fusion de VH en el tipo de celula de eleccion. Si se contempla secrecion, el vector incorporara un peptido senal en el extremo amino. Si se contempla expresion de la superficie celular, tambien habra una secuencia de peptido hidrofobo en el extremo carboxilo. Preferentemente, pero no esencialmente, tales peptidos de amino y carboxilo pueden derivarse de inmunoglobulinas de cadena pesada de mamlfero. Los vectores se disenaran en formato de casete de tal manera que los dominios VH solubles clonados a partir de anticuerpos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno puedan producirse como protelnas de fusion. La protelna de fusion resultante puede ser un anticuerpo solo de cadena pesada y comprendera un dominio VH soluble y el dominio efector de cadena pesada de eleccion. Si el dominio VH soluble y el dominio efector elegido son de origen humano, entonces la protelna de fusion resultante sera un anticuerpo solo de cadena pesada humano de la clase (y sub-tipo) especificado por la eleccion de la region efectora (por ejemplo, IgM, IgG, IgA, IgE o IgD). El cualquier anticuerpo solo de cadena pesada, el dominio VH soluble y las regiones efectoras constantes estaran enlazados por una region bisagra. Preferentemente, pero no esencialmente, esta sera una region bisagra de inmunoglobulina de cadena pesada natural derivada de la clase o subtipo apropiado.
La ventaja del metodo anterior sobre otros metodos tales como la presentacion en fagos o hibridomas usando materiales derivados de bazo total, es que el metodo selecciona los anticuerpos solo de cadena pesada de alta afinidad (10 nmoles o mejor) producidos en celulas plasmaticas o de memoria siguiendo procedimientos de selection in vivo todavla desconocidos. Tales poblaciones de linfocitos B dan anticuerpos solo de cadena pesada (HCAbs) que son solubles y no se acumulan en compartimientos intracelulares (tal acumulacion conducirla de otra manera a apoptosis). Dichos HCAb pueden expresarse eficazmente usando sistemas de expresion estandar, en particular en llneas de celulas de mamlfero establecidas tales como HEK o CHO. Las celulas transfectadas pueden entonces presentarse usando tecnologla establecida, normalmente formato de micropocillo automatizable (por ejemplo, 96 pocillos). Aquellas celulas que expresan ligantes de antlgeno de HCAb de alta afinidad, o alternativamente celulas que expresan HCAbs que se unen a antlgeno en un intervalo definido de afinidades, pueden entonces seleccionarse para analisis posterior. Alternativamente, los ligantes de alta afinidad pueden seleccionarse por analisis de FACS. El uso de celulas de memoria o celulas plasmaticas derivadas de uno o mas animales no humanos transgenicos expuestos al antlgeno, por ejemplo, un raton, que expresan HCAbs especlficos de antlgeno como una fuente de ARNm de HCAb proporciona una via extraordinariamente eficiente para seleccion de HCAb, permitiendo la seleccion de potencialmente millones de celulas productoras de HCAb para el posterior analisis. Las celulas seleccionadas que expresan ligantes de antlgeno de HCAb de alta afinidad pueden entonces expandirse en cultivo, proporcionando una fuente de celulas productoras de HCAb en ausencia de etapas de clonacion adicionales.
Opcionalmente, las celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria aislados pueden inmortalizarse antes del aislamiento y donation de ARNm de anticuerpos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno o dominios VH.
En el presente documento tambien se desvela un mamlfero no humano transgenico que tienen un locus de cadena pesada transgenico o locus solo de cadena pesada (que carece de funcionalidad CHl) que incluye un gen marcador selectivo dominante. Tambien se contempla la inclusion de mas de un marcador selectivo, estando cada marcador enlazado a un locus diferente o grupo de loci, permitiendo la seleccion preferencial de hibridomas que expresan uno en oposicion a otro locus o grupo de loci capaces de expresar anticuerpos solo de cadena pesada.
El uso de multiples marcadores selectivos sobre diferentes loci se basa en el descubrimiento de que, si un mamlfero no humano transgenico posee multiples loci solo de cadena pesada, estos loci estan expuestos a exclusion alelica (documento PCT/IB2007/001491). Por lo tanto, tras la exposition a antlgeno, solo un locus es elegido estocasticamente y recombinado satisfactoriamente, produciendo la production de un anticuerpo solo de cadena pesada. Por lo tanto, pueden usarse multiples loci solo de cadena pesada de VH en el mismo mamlfero no humano transgenico para aumentar al maximo el repertorio y la diversidad de anticuerpos obtenibles del mamlfero. Cuando se expone al antlgeno, el mamlfero no humano transgenico llevara a cabo recombinaciones aleatorias en un locus despues de otro, sin preferir ningun locus dado, hasta que una de las recombinaciones sea “productiva”, es decir, que produzca la generation de un anticuerpo. La recombination adicional se detiene, “excluyendo” as! otros alelos (loci). Se expandiran preferencialmente las celulas que produzcan anticuerpo de alta afinidad.
Normalmente, los genes marcadores selectivos dominantes seran de origen procariota y se seleccionaran de un grupo que o bien confiere resistencia a farmacos toxicos, tales como puromicina, higromicina y G418, o bien comprende genes que obvian ciertos requisitos nutricionales de tal manera que su expresion convierta una sustancia toxica en un aminoacido esencial, por ejemplo, la conversion de indol a triptofano o la conversion de histidinol a histidina. Un requisito necesario es que, si se usa un marcador selectivo, se co-exprese con el alelo de inmunoglobulina solo de cadena pesada, asegurando as! la expresion de linfocitos B y la expresion independiente del sitio de integration de un locus transgenico. Alternativamente, el gen de resistencia a farmacos puede insertarse en un locus de inmunoglobulina endogeno o exogeno (transgenico) usando recombinacion homologa en combination con celulas ES o enfoques de transferencia nuclear.
Por consiguiente, se proporciona un metodo para la produccion de un anticuerpo monoclonal que requiere la seleccion de un hibridoma o llnea de linfocitos B transformada preferentemente derivada de celulas de memoria o plasmaticas que expresan un locus solo de cadena pesada de inmunoglobulina definido, que comprende uno de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
multiples loci de gen solo de cadena pesada presentes en el mamlfero transgenico no humano, comprendiendo dicho locus un gen marcador selectivo dominante co-expresado insertado dentro de dicho locus.
Preferentemente, el locus es un locus solo de cadena pesada que comprende un gen marcador selectivo dominante, locus que expresa un anticuerpo solo de cadena pesada. Preferentemente, el anticuerpo solo de cadena pesada se produce a partir de un locus solo de cadena pesada endogeno manipulado por ingenierla para carecer de funcionalidad CH1, o un transgen de cadena pesada introducido que carece de funcionalidad CH1, opcionalmente en ausencia de expresion de gen de cadena ligera de inmunoglobulina. Dicho locus tambien puede comprender un marcador selectivo dominante y un locus de cadena pesada en ausencia de los loci de cadena ligera, dando lugar dicho gen de cadena pesada espontaneamente, cuando se expresa, a un trascrito de ARNm que carece de funcionalidad CH1, produciendo la expresion de anticuerpo solo de cadena pesada de una manera dependiente de linfocitos B.
Segun el tercer aspecto de la invencion, si se contemplan enfoques de trasformacion de hibridoma o de linfocitos B para la inmortalizacion de celulas plasmaticas o de memoria, entonces la inclusion de un gen marcador selectivo dominante funcional en cada locus de cadena pesada permite la posterior selection y el mantenimiento estable de hibridoma o llneas de linfocitos B trasformadas que expresan un locus de interes tras la exposition a antlgeno, mientras pierden todas las celulas de hibridoma o linfocitos B transformados que no expresan ese locus de interes. Para el fin de la invencion, puede usarse cualquier gen marcador selectivo dominante, siempre que la expresion del gen confiera un beneficio selectivo a hibridomas en presencia de una exposicion selectiva, por ejemplo, toxica (vease Vara et al. (1986) NAR, 14, 4617-4624; Santerre et al. (1984) Gene, 30, 147-156; Colbere-Garapin et al. (1981) 150, 1-14; Hartmann and Mulligan (1988) PNAS, 85, 8047-8051).
El locus solo de cadena pesada heterologo
En el contexto de la presente invencion, el termino “heterologo” significa una secuencia de nucleotidos o un locus como se describe en el presente documento no endogeno al mamlfero en el cual esta localizado o un locus endogeno que ha sido modificado por la sustitucion o eliminacion de secuencias endogenas.
Un “locus solo de cadena pesada”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un locus que codifica un dominio VH que comprende uno o mas segmentos de gen V, uno o mas segmentos de gen D y uno o mas segmentos de gen J, operacionalmente enlazados a una o mas regiones efectoras de cadena pesada (careciendo cada una de funcionalidad de dominio CH1).
La complejidad del segmento de gen V puede aumentarse aumentando el numero de segmentos de gen V presentes en el locus o usando diferentes loci, comprendiendo cada uno diferentes segmentos de gen V.
Preferentemente, el locus solo de cadena pesada comprende de cinco a veinte segmentos de gen V diferentes, derivados de cualquier especie de vertebrado.
Preferentemente, los segmentos de gen V son de origen humano, opcionalmente seleccionados o manipulados por ingenierla para solubilidad mejorada.
Preferentemente, el locus solo de cadena pesada comprende de dos a cuarenta (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30 o 40) o mas segmentos de gen D. Los segmentos de gen D pueden derivarse de cualquier especie de vertebrado pero, lo mas preferentemente, los segmentos de gen D son segmentos de gen D humanos (normalmente 25 segmentos de gen D).
Preferentemente, el locus solo de cadena pesada comprende de dos a veinte (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20) o mas segmentos de gen J. El segmento de gen J puede derivarse de cualquier especie de vertebrado pero, lo mas preferentemente, los segmentos de gen J son segmentos de gen J humanos (normalmente 6 segmentos de gen J).
Preferentemente, el locus solo de cadena pesada comprende dos o mas segmentos de gen V, veinticinco segmentos de gen D humanos funcionales y seis segmentos de gen J humanos.
El termino “segmento de gen V” engloba un segmento de gen V que existe de forma natural derivado de un vertebrado, incluyendo camelidos y humano, que opcionalmente han sido seleccionados, mutados o manipulados por ingenierla para caracterlsticas mejoradas, tales como solubilidad. Los segmentos de gen V tambien se encuentran en otras especies de vertebrados tales como tiburon (vease Kokubu et al. (1988) EMBO J., 7, 34133422) o han evolucionado para proporcionar diversas familias similares a VH de protelnas de union ejemplificadas, por ejemplo, en la evolution del repertorio de VL de cadena ligera de anticuerpo o el repertorio de VH de receptor de linfocitos T.
El segmento de gen V debe ser capaz de recombinarse con un segmento de gen D, un segmento de gen J y una region constante (efectora) de cadena pesada (que puede comprender varios exones pero excluye un exon CH1)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
segun la presente invencion para generar un anticuerpo solo de cadena pesada cuando el acido nucleico se expresa.
Un segmento de gen V segun la presente invencion tambien incluye dentro de su alcance cualquier secuencia de gen que codifica un homologo, derivado o fragmento de protelna que es capaz de recombinarse con un segmento de gen D, un segmento de gen J y una region efectora constante de cadena pesada (que comprende uno o mas exones pero no un exon CH1 funcional) segun la presente invencion para generar un anticuerpo solo de cadena pesada como se define en el presente documento. La region efectora constante de cadena pesada puede comprender un dominio CH1 bajo circunstancias en las que un locus de cadena pesada de inmunoglobulina se expresa en un contexto de animal huesped desprovisto de expresion de gen de cadena ligera de inmunoglobulina.
Asl, las secuencias codificantes de VH pueden derivarse de una fuente que existe de forma natural o pueden manipularse por ingenierla o sintetizarse usando metodos familiares para los expertos en la tecnica.
Un “dominio VH soluble” en el contexto de la presente invencion se refiere a un producto de expresion de un segmento de gen V cuando se recombina con un segmento de gen D y un segmento de gen J como se definio anteriormente. Tras la seleccion natural y la maduracion de afinidad del HCAb progenitor, el dominio VH soluble como se usa en el presente documento tras la expresion y aislamiento permanece en disolucion en ausencia de agregacion y es activo en un medio fisiologico sin la necesidad de ningun otro factor para mantener la solubilidad. El dominio VH soluble solo tambien puede manipularse por ingenierla con diversos dominios de protelna para producir protelnas de fusion para fines terapeuticos y de diagnostico dirigidos, por ejemplo, con toxinas, enzimas y agentes formadores de imagen, o con protelnas de la sangre tales como albumina para manipular la farmacocinetica de dominio VH soluble y la distribucion en tejido in vivo (veanse el documento US 5.843.440 y Smith et al. (2001) Bioconjugate Chem., 12, 750-756).
En el contexto de la presente invencion, los terminos 'un segmento de gen D' y 'un segmento de gen J' incluyen secuencias que existen de forma natural de segmentos de gen D y J. Preferentemente, los segmentos de gen D y J se derivan del mismo vertebrado del cual se derivo el segmento de gen V. Por ejemplo, si un segmento de gen V se deriva de un ser humano y despues se solubiliza o manipular por ingenierla, los segmentos de gen D y J tambien se derivan preferentemente de un ser humano. Alternativamente, los segmentos de gen V pueden derivarse, por ejemplo, de rata o raton y los segmentos de gen D y J de camello o ser humano.
Los terminos segmentos de gen D y segmentos de gen J tambien incluyen dentro de su alcance derivados, homologos y fragmentos de los mismos, siempre que el segmento resultante pueda recombinarse con los componentes restantes de un locus de anticuerpo de cadena pesada como se describe en el presente documento para generar un anticuerpo solo de cadena pesada como se describe en el presente documento. Los segmentos de gen D y J pueden derivarse de fuentes que existen de forma natural o pueden sintetizarse usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica y descritos en el presente documento. Los segmentos de gen D y J pueden incorporar residuos de aminoacidos adicionales definidos o sustituciones o deleciones de aminoacidos definidos en vista a aumentar la diversidad de CDR3.
Los segmentos de gen V, D y J son capaces de recombinarse y preferentemente experimentar mutacion somatica.
Los segmentos de gen V, D y J se derivan preferentemente de una sola especie de vertebrado. Esta puede ser cualquier especie de vertebrado, pero es preferentemente un ser humano.
Las secuencias distintivas son cuatro sustituciones de secuencia de aminoacidos codificadas por llnea germinal definida (tetrada de VHH) presentes en dominios VHH de camelido, pero no en dominios VH solubles. Todas estas estan presentes en la segunda region estructural y funcionan para reducir el caracter hidrofobo de la interfase de cadena ligera anterior. Glu-44 y Arg-45 se encuentran en lugar de Gly-44 y Leu-45 menos hidrofilos presentes en dominios VH, mientras que el caracter hidrofilo en la posicion 47 aumenta por la sustitucion de Trp con residuos mas pequenos. El cuarto cambio requiere la sustitucion de Val-37 por Phe o Tyr.
La region constante de cadena pesada
Operacionalmente, una region constante de cadena pesada esta codificada por un segmento de gen que existe de forma natural o manipulado por ingenierla que es capaz de recombinarse con un segmento de gen V, un segmento de gen D y un segmento de gen J en un linfocito B. Preferentemente, la region constante de cadena pesada se deriva de un locus de anticuerpo.
Cada region constante de cadena pesada comprende esencialmente por lo menos un gen de region constante de cadena pesada, que se expresa sin un dominio CH1 funcional, de modo que puede ocurrir la generacion de anticuerpo solo de cadena pesada. En ausencia de expresion de gen de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno, entonces la region constante de cadena pesada puede comprender funcionalidad CH1 que puede delecionarse espontaneamente a baja frecuencia durante la expresion de gen de cadena pesada. Cada region constante de cadena pesada tambien puede comprender uno o mas exones de region constante de cadena pesada
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
adicionales que se seleccionan del grupo que consiste en C8, Cg1-4, Cm, Ce y Ca1-2. Los segmentos de gen de region constante de cadena pesada se seleccionan dependiendo de la clase preferida o mezcla de clases de anticuerpo requeridas. Opcionalmente, el locus de cadena pesada heterologo es deficiente en Cm y C8.
Por ejemplo, la expresion de todo o una parte de un locus Cg de cadena pesada heterologo desprovisto de CH1 producira opcionalmente algunos o todos los isotipos de IgG, dependientes de los isotipos IgG1, lgG2, lgG3 e lgG4 presentes en el locus de IgG heterologo.
Alternativamente, pueden obtenerse mezclas seleccionadas de anticuerpos. Por ejemplo, pueden obtener IgA e IgM cuando la region constante de cadena pesada comprende un gen Ca y un gen Cm.
La region constante de cadena pesada presente en el locus transgenico puede ser de origen humano, pero puede ser el mismo que o estrechamente relacionado con el del mamlfero huesped para aumentar al maximo las respuestas a antlgeno in vivo. Asl, para la derivacion de anticuerpos solo de cadena pesada o dominios VH solubles que van a usarse para aplicaciones terapeuticas en seres humanos, los genes VDJ presentes en el locus se derivaran de las secuencias de llnea germinal humanas, opcionalmente modificadas, y las regiones constantes pueden ser de origen de roedor si el animal huesped es un roedor, por ejemplo, un raton. Los anticuerpos solo de cadena pesada seleccionados que comprenden dominios de union VH humanos solubles y regiones efectoras constantes de roedor pueden entonces clonarse, y reemplazarse las regiones efectoras de roedor por regiones efectoras constantes humanas de eleccion, o el dominio VH soluble usado para derivar protelnas de fusion de VH alternativas, complejos de anticuerpo de dominio VH y similares.
Si los anticuerpos solo de cadena pesada van a usarse para fines veterinarios o alternativos, los segmentos de gen V, D y J de derivan preferentemente del vertebrado o mamlfero mejor adecuado para el fin previsto. Por ejemplo, segmentos de gen V y segmentos de gen D y J pueden derivarse de otros mamlferos (por ejemplo, raton, rata, cerdo, vaca, cabra, oveja, camello, etc.) dependiendo del uso previsto, por ejemplo, aplicaciones veterinarias, industriales, agricolas, de diagnostico o reactivo.
Un 'exon constante de cadena pesada' ('exon CH'), como se define en el presente documento, incluye las secuencias de exones CH de vertebrado que existen de forma natural, pero especialmente de mamlfero. Esto varla de una manera especlfica de clase. Por ejemplo, IgG e IgA estan desprovistos naturalmente de un dominio CH4. El termino 'exon CH' tambien incluye dentro de su alcance derivados, homologos y fragmentos del mismo, siempre que el exon CH sea capaz de formar un anticuerpo solo de cadena pesada funcional como se define en el presente documento cuando es un componente de una region constante de cadena pesada.
Mamlferos
El mamlfero transgenico usado en los metodos de la invencion no es un humano. El mamlfero transgenico es un raton o una rata.
Preferentemente, los animales transgenicos que comprenden loci de anticuerpo solo de cadena pesada heterologos integrados en la llnea germinal se generan usando tecnologla de inyeccion de ovocitos establecida y, si esta establecida, tecnologlas de celulas ES, tecnologla de celulas iPS o tecnologla de transferencia nuclear (clonacion). Alternativamente, los loci pueden introducirse en las celulas anteriores o directamente en ovulos fecundados usando nucleasas de dedo de zinc (Remy et al. (2009) Transgenic Res., 2009 Sep 26. [Publicado electronicamente antes de ser impreso], Kandavelou et al. (2009) Biochem. Biophys. Res. Commun., ;388, (1), 56-61) o tecnologla de enzima de recombinacion (por ejemplo, Sakurai et al. (2010) Nucleic Acids Res., Jan 13 [Publicado electronicamente antes de ser impreso] y referencias en el mismo) tales como cre, etc.
La recombinacion homologa estandar en celulas ES tambien puede usarse para eliminar funcionalidad CH1 de genes de cadena pesada endogenos y para reemplazar elementos o secuencias dentro de segmentos de genes V endogenos o segmentos de gen D y J, dando por resultado la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada de los loci de cadena pesada endogenos.
Ventajosamente, la expresion de transgen de loci de gen solo de cadena pesada se potencia, si los loci de cadena pesada de anticuerpo endogenos al mamlfero se delecionan o silencian o tienen una capacidad reducida para producir anticuerpos endogenos. Si los loci de cadena pesada de huespedes endogenos han sido manipulados por ingenierla para eliminar funcionalidad CH1, y VDJ y opcionalmente las regiones efectoras constantes reemplazadas por secuencia de otras especies, preferentemente humanas, entonces la adicion de ciertos loci de cadena pesada transgenicos adicionales es necesaria.
Este enfoque de generar anticuerpos solo de cadena pesada y dominios VH solubles como se describio antes puede ser de uso particular en la generation de anticuerpos solubles y complejos de anticuerpo libres de agregados para uso terapeutico humano. Por lo tanto, en el presente documento tambien se desvela un mamlfero transgenico que expresa un locus de cadena pesada heterologo como se desvela en la presente invencion en respuesta a exposition a antlgeno.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las celulas productoras de anticuerpo pueden derivarse de animales transgenicos segun la presente invencion y usarse para la recuperacion de celulas de memoria o celulas plasmaticas de vida larga, incluyendo para la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada de hibridomas o por enfoques de matriz como se definen en el presente documento. Ademas o alternativamente, las secuencias de acido nucleico que codifican anticuerpos solo de cadena pesada y/o dominios VH solubles pueden aislarse de celulas de memoria o celulas plasmaticas de vida larga, de mamlferos transgenicos segun la presente invencion tras la exposicion a antlgeno y usarse para producir anticuerpos solo de cadena pesada de dominio VH soluble, complejos de dominio VH bi-especlficos/bi-funcionales solubles, o poliprotelnas de dominio VH solubles (vease el documento WO 99/23221), usando tecnicas de ADN recombinante que son conocidas por los expertos en la tecnica.
Alternativamente o ademas, anticuerpos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno policlonales pueden generarse por inmunizacion de un animal transgenico segun la presente invencion.
Asl, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada de alta afinidad inmunizando un mamlfero transgenico con un antlgeno, en el que el mamlfero es un raton o una rata.
Produccion de anticuerpos solo de cadena pesada y proteinas de fusion de dominio VH soluble
Los sistemas de produccion de anticuerpos solo de cadena pesada y proteinas de fusion de dominio VH solubles incluyen celulas de mamlfero en cultivo (por ejemplo, celulas CHO), plantas (por ejemplo, maiz), cabras, conejos, ganado vacuno, ovejas, pollos y larvas de insecto transgenicos adecuados para tecnologia de crianza masiva. Otros sistemas de produccion, incluyendo infeccion por virus (por ejemplo, baculovirus en larvas de insectos y lineas celulares) son alternativas al cultivo de celulas y enfoques de linea germinal. Otros metodos de produccion tambien seran conocidos por los expertos en la tecnica. Si hay un requisito de ensamblaje de IgA o IgM solo de cadena pesada, la co-expresion de una “cadena J” puede ser beneficiosa. Metodos adecuados para la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada o dominios de union VH solubles solos, o complejos de dominio de union VH, son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los dominios de union VH y complejos de dominio de union VH se han producido en sistemas bacterianos y homodimeros solo de cadena pesada han sido producidos en hibridomas y celulas de mamlfero transfectadas (vease Reichmann y Muyldermans, (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38).
Los metodos tambien estan bien establecidos para la expresion de dominios de union VH humanos manipulados por ingenieria derivados de usar tecnologia de presentacion en fagos (Tanha et al. (2001) J. Biol. Chem., 276, 2477424789 y referencias en el mismo).
En el presente documento tambien se desvela una secuencia de polinucleotidos que consiste en el locus de cadena pesada heterologo, un polinucleotido aislado que codifica un anticuerpo solo de cadena pesada como se desvela en el presente documento y un vector que comprende un locus de cadena pesada heterologo, o fragmento del mismo, o polinucleotido aislado que codifica un anticuerpo solo de cadena pesada como se desvela en el presente documento. Tambien se desvelan en el presente documento secuencias de polinucleotidos que codifican dominios VH solubles y proteinas de fusion de dominio VH y un vector que comprende tales secuencias.
En el presente documento tambien se desvela una celula huesped transformada con un locus solo de cadena pesada heterologo, o fragmento del mismo, o polinucleotido aislado que codifica el anticuerpo solo de cadena pesada, dominio VH soluble o protelna de fusion de dominio VH segun la presente invencion.
Usos de los anticuerpos solo de cadena pesada, dominios VH solubles y complejos de polipeptido de dominio VH y poliprotelnas de la invencion
Los anticuerpos solo de cadena pesada de alta afinidad, proteinas de fusion de dominio VH, complejos de polipeptido de dominios VH y dominios VH solubles de la presente invencion son particularmente adecuados para usarse tanto como medicinas parenterales como no parenterales. Dentro del contexto de la invencion, preferentemente estos son completamente de origen humano, pero opcionalmente y menos preferentemente pueden comprender segmentos de gen V, D o J de otras especies.
La solubilidad potenciada de anticuerpos solo de cadena pesada que comprenden dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados y complejos de union de dominio VH soluble y poliprotelnas de la invencion son especialmente adecuados para usarse como reactivos y diagnosticos ademas de terapia.
Todos son adecuados para uso farmaceutico en seres humanos y asl en el presente documento se desvela una composition farmaceutica que comprende un anticuerpo solo de cadena pesada que comprende dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble o poliprotelnas de dominio VH soluble. En el presente documento tambien se desvela el uso de un anticuerpo solo de cadena pesada que comprende dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble o poliprotelnas de dominio VH soluble en la preparation de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedad.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las composiciones farmaceuticas y medicamentos se formularan normalmente antes de la administracion a los pacientes.
Por ejemplo, un anticuerpo solo de cadena pesada que comprende dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble o poliprotelnas de dominio VH soluble puede mezclarse con estabilizadores, particularmente si van a liofilizarse. La adicion de azucares (por ejemplo, manitol, sacarosa o trehalosa) es tlpica para dar estabilidad durante liofilizacion, y un estabilizador preferido es manitol. Tambien puede anadirse albumina de suero humano (preferentemente recombinante) como estabilizador. Tambien pueden usarse mezclas de azucares, por ejemplo, sacarosa y manitol, trehalosa y manitol, etc.
Tambien puede anadirse tampon a la composicion, por ejemplo, un tampon Tris, un tampon de histidina, un tampon de glicina o preferentemente un tampon de fosfato (por ejemplo, que contiene dihidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de disodio). Se prefiere la adicion de tampon para dar un pH entre 7,2 y 7,8, y en particular un pH de aproximadamente 7,5.
Para reconstitucion despues de la liofilizacion, puede usarse agua esteril para inyeccion. Tambien es posible reconstituir una torta liofilizada con una composicion acuosa que comprende albumina de suero humano (preferentemente recombinante).
Generalmente, el anticuerpo solo de cadena pesada que comprende dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble o poliprotelnas de dominio VH soluble se utilizaran en forma purificada junto con vehlculos farmacologicamente apropiados.
En el presente documento tambien se desvela un metodo de tratamiento de un paciente, que comprende administrar una composicion farmaceutica desvelada en el presente documento al paciente. El paciente es preferentemente un ser humano, y puede ser un nino (por ejemplo, un bebe mayor o un bebe), un adolescente o un adulto, pero generalmente sera un adulto.
En el presente documento tambien se desvela un anticuerpo solo de cadena pesada que comprende dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble y poliprotelnas de dominio VH solubles desvelados en el presente documento para uso como un medicamento.
En el presente documento tambien se desvela el uso de anticuerpos solo de cadena pesada que comprenden dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble y poliprotelnas de dominio VH soluble desvelados en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para tratar a un paciente.
Esos usos, metodos y medicamentos son preferentemente para el tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen, pero no se limitan a: cicatrizacion de heridas, trastornos proliferativos de celulas, incluyendo neoplasma, melanoma, tumores de pulmon, colorrectal, osteosarcoma, rectal, de ovario, sarcoma, cervical, esofagico, mama, pancreas, vejiga, cabeza y cuello y otros tumores solidos; trastornos mieloproliferativos tales como leucemia, linfoma no Hodgkin, leucopenia, trombocitopenia, trastorno de la angiogenesis, sarcoma de Kaposi; trastornos autoinmunes/inflamatorios, incluyendo alergia, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, psoriasis e inflamacion de las vlas respiratorias, asma, inmunotrastornos y rechazo de trasplante de organos; trastornos cardiovasculares y vasculares, incluyendo hipertension, edema, angina, aterosclerosis, trombosis, septicemia, choque, lesion por reperfusion e isquemia; trastornos neurologicos incluyendo enfermedad del sistema nervioso central, enfermedad de Alzheimer, lesion cerebral, esclerosis lateral amiotrofica y dolor; trastornos del desarrollo; trastornos metabolicos incluyendo diabetes mellitus, osteoporosis y obesidad, SIDA y enfermedad renal; infecciones incluyendo infeccion viral, infeccion bacteriana, infeccion fungica e infeccion parasitica, afecciones patologicas asociadas a la placenta y otras afecciones patologicas y para uso en inmunoterapia.
En el presente documento tambien se desvela el uso de un anticuerpo solo de cadena pesada que comprende dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble o poliprotelnas de dominio VH soluble desvelados en el presente documento como agente de formacion de imagen de diagnostico, pronostico o terapeutico solo o en combinacion con agentes efectores adecuados.
En el presente documento tambien se desvela el uso de un anticuerpo solo de cadena pesada que comprende dominios VH solubles, dominios VH solubles aislados, complejos de union de dominio VH soluble o poliprotelnas de dominio VH soluble como se describen en el presente documento como un reactivo de union intracelular, o una abzima. Se prefieren dominios de union a VH soluble, complejos de union de dominio VH soluble y poliprotelnas de dominio VH soluble especificos de antigeno.
En el presente documento tambien se desvela el uso de un anticuerpo solo de cadena pesada especifico de antigeno o dominio de union VH soluble desvelados en el presente documento como un inhibidor de enzima o bloqueador de receptor. Los fragmentos de anticuerpo solo de cadena pesada preferidos son dominios de union de VH soluble especificos de antigenos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En el presente documento tambien se desvela el uso de uno o mas dominios VH solubles fusionados a una molecula efectora para uso como un agente terapeutico, agente formador de imagen, agente de diagnostico, abzima o reactivo.
La invention se describe ahora, a modo de ejemplo unicamente, en la siguiente description detallada que se refiere a las siguientes figuras.
Figuras
Figura 1. Dos loci de inmunoglobulina solo de cadena pesada humanos, portando uno cuatro segmentos de gen VH, portando el otro 18 segmentos de gen VH. Los loci que comprenden 18 segmentos de gen VH comprenden regiones efectoras constantes de raton (-CH1) cubren mas del 90 % del uso de segmento de gen VH en anticuerpos tetravalentes humanos normales.
Figura 2. Protocolo de inmunizacion y de aislamiento para dominio VH humano por presentation en fagos o anticuerpos solo de cadena pesada humanos por tecnologla de hibridoma estandar.
Figura 3. ELISA (superior) y transferencia Western (inferior) del suero inmunizado por Luk-sPV (V4 comparado con ratones normales wt) y una transferencia Western de dominios VH individualmente aislados usando electroforesis en gel de la protelna Luk-soPV, transfiriendola y detection con los diversos clones positivos del cribado de presentacion en fagos.
Figura 4. Ejemplo de dos secuencias de dominio VH despues de la inmunizacion con Luks-PV, que muestra que se producen tanto lgG2 como lgG3 (cambio de clase) y que el mismo reordenamiento de VDJ produce diferentes mutaciones.
Figura 5. Secuencias de dominio VH derivadas usando el segmento de gen V3-23 despues de la inmunizacion con CR1 humano, que muestra que se producen tanto lgG2 como lgG3 (cambio de clase) y que el mismo reordenamiento de VDJ produce diferentes mutaciones, cuando se compara con la secuencia de llnea germinal del segmento V3-23 mostrado en la parte superior. Se obtuvieron partes de la secuencia mediante hibridomas, el resto mediante bibliotecas de presentacion.
Figura 6. Secuencias de dominio VH derivadas usando el segmento de gen V3-11 despues de la inmunizacion con CR1 humano, mostrando que tanto lgG2 como lgG3 se producen (cambio de clase) y que el mismo reordenamiento de VDJ produce diferentes mutaciones, cuando se compara con la secuencia de llnea germinal del segmento V3-11 mostrado en la parte superior. Se obtuvieron partes de las secuencias por hibridomas (flechas), y el resto por bibliotecas de presentacion.
Figura 7. Ejemplo de electroforesis en gel (izquierda) de dominios VH (aCR1) despues de la purification y expresion en el sistema de protelna hlbrido SUMO (Invitrogen). El ejemplo muestra tres dominios VH de longitud diferente del peso molecular correcto. El carril del marcador esta a la izquierda. El panel medio muestra el perfil de elucion de dominios VH en un sistema Sephadex 75 Smart. El panel de la derecha es el mismo, excepto por una IgG solo de cadena pesada completa en un Sephadex 200. El panel inferior muestra los perfiles de elucion de otros dos dominios VH concentrados a > 4 mg/ml.
Figura 8. A. Grafica de dispersion de la luz y B. Estabilidad termica de dominios VH.
Figura 9. Mediciones de afinidad de un numero de anticuerpo solo de cadena pesada aCR1 (izquierda) y los perfiles de union y disociacion de uno de los anticuerpos en un sistema Octet para obtener la afinidad de union.
Figura 10. Solubilidad de varios dominios VH anti-CR1.
Figura 11. Secuenciacion paralela masiva para determinar mutaciones preferidas.
Figura 12. Analisis de diagrama de caja de las regiones estructurales 1 (FR1) y CDR1 de anticuerpos solo de cadena pesada humanos (HCAb) en comparacion con las mismas regiones de cadenas pesadas de camello, llama y humanas de anticuerpos de cadena pesada/ligera tetramericos normales. La carga neta se determino por la ecuacion de Henderson-Hasselbach a pH = 7,4; el caracter hidrofobo neto se determino por el indice de Cowan-Whittaker a pH = 7,5. Los numeros debajo de los diferentes anticuerpos son el numero de secuencias de entrada unicas.
Figura 13. Analisis de diagrama de caja de las regiones estructurales 2 (FR2) y CDR2 de anticuerpos solo de cadena pesada humanos (HCAb) en comparacion con las mismas regiones de cadenas pesadas de camello, llama y humanas de anticuerpos de cadena pesada/ligera tetramericos normales. La carga neta se determino por la ecuacion de Henderson-Hasselbach a pH = 7,4; el caracter hidrofobo neto se determino por el indice de Cowan-Whittaker a pH = 7,5. Los numeros debajo de los diferentes anticuerpos son el numero de secuencias
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de entrada unicas.
Figura 14. Analisis de diagrama de caja de las regiones estructurales 3 (FR3) y CDR3 de anticuerpos solo de cadena pesada humanos (HCAb) en comparacion con las mismas regiones de cadenas pesadas de camello, llama y humanas de anticuerpos de cadena pesada/ligera tetramericos normales. La carga neta se determino por la ecuacion de Henderson-Hasselbach a pH = 7,4; el caracter hidrofobo neto se determino por el Indice de Cowan-Whittaker a pH = 7,5. Los numeros debajo de los diferentes anticuerpos son el numero de secuencias de entrada unicas.
Figura 15. Estructura tridimensional de dominios VH que se unen tanto a CR1 humano como a A Luk-sPV de Staph. El sitio de union a antlgeno esta en la posicion derecha superior y el dominio de interaccion VL anterior esta de frente al lector. Los cambios de aminoacidos estan indicados por color en la estructura 3D.
Figura 16. Diferencias en el caracter hidrofobo promedio en cada posicion del dominio VH (excepto CDR3) indicando un desplazamiento hacia caracter mas hidrofobo en los anticuerpos solo de cadena pesada, en particular en el extremo N del dominio VH. Son evidentes varios puntos calientes en terminos de diferencias del caracter hidrofobo en las posiciones 49, 62 y 72 en comparacion con el VH tetramerico humano promedio.
Figura 17. Protocolo de inmunizacion y de aislamiento de HCAb humanos por distribucion de celulas CD138 positivas y clonacion de expresion directa en celulas HEK.
Figura 18. Vector para la expresion de celulas de mamlfero de HCAb. El vector tiene un esqueleto de pUC estandar (no mostrado) con un gen de resistencia a ampicilina y un gen de resistencia a mamlfero (higromicina). La parte relevante contiene un potenciador del CMV estandar y un promotor de b-actina de pollo (Invitrogen), seguido por un sitio de union al ribosoma de Kozak seguido por la secuencia senal de VH3-23. El extremo posterior del casete consiste en tanto una region constante de lgG2 o lgG3 que empieza con la bisagra como en los dominios CH2. Los ADNc de VH se clonan entre estas dos regiones despues de amplificacion, con los iniciadores indicados por las flechas.
Figura 19. Ejemplo y resumen de la clonacion de expresion directa de HCAb en celulas HEK. El panel superior a la izquierda muestra un ELISA estandar para determinar cual de los ratones inmunizados respondio positivamente a la inmunizacion con antlgeno HA (los ratones en rojo se usaron para la clonacion de expresion de celulas HEK). El panel superior a la derecha muestra dos ejemplos de un ELISA llevada a cabo sobre las celulas HEK transfectadas en el formato de 96 pocillos.
Figura 20. Analisis de secuencia del HCAb positivo por ELISA derivado de la secuencia de llnea germinal VH 3-11.
Figura 21. Analisis de secuencia de del HCAb positivo por ELISA derivado de la secuencia de llnea germinal VH 3-23.
Figura 22. Perfil de elucion de IgG solo de cadena pesada completas sobre columnas Sephadex 200 Smart. Figura 23. Mediciones de afinidad de dos de los HCAb anti-HA sobre Octet.
Figura 24. Aminoacidos a traves de las regiones VH del HCAb anti-HA en comparacion con aquellos observados en HCAb humanos anti-CR1 (vease lo anterior), HCAb tetramericos humanos y de llama.
Figura 25. Protocolo de inmunizacion y de aislamiento de HCAb humanos despues de la distribucion de celulas individuales y clonacion de expresion directa en celulas HEK.
Figura 26. Protocolo de inmunizacion y de aislamiento de anticuerpos de cadena pesada y ligera humanos tetramericos normales despues de la distribucion de celulas individuales y clonacion de expresion directa en celulas HEK.
Ejemplo 1 Generacion de anticuerpos anti-Luk-sFV
Se lleva a cabo inmunizacion con la protelna Luks-PV de Staph A en ratones transgenicos que contienen un locus de anticuerpo de cadena pesada completamente humano como se describe en el documento WO2006/008548. Estos ratones portan 4 segmentos VH humanos, todas de las regiones de cadena pesada D humanas, todas de las regiones JH humanas y las regiones Cg2 y Cg3 humanas (Figura 1).
Los dominios CH1 han sido delecionados de las regiones constantes Cg humanas para permitir la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada humanos como se ha descrito (Janssens et al (2006) PNAS, 103, 1513015135). Los ratones se inmunizan usando protocolos estandar y los anticuerpos se alslan como se muestra esquematicamente en la Figura 2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los ratones se inmunizan cuatro veces por protocolos estandar y el suero se comprueba para una respuesta positiva por ELISA estandar (Figura 3).
Despues de la inmunizacion, se recogen las celulas del bazo y el ARNm se transcribe de forma inversa y se amplifica en ADNc con cebadores especlficos de dominio VH por metodos estandar (vease, por ejemplo, Janssens et al (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Los fragmentos de VH resultantes se clonan en un vector de presentacion en fagos. Despues de 3 rondas de cribado e inmunopurificacion por protocolos de presentacion estandar, los dominios VH (VH-D-J) se clonan en un vector de expresion bacteriano. Los clones positivos se confirman por transferencia Western y el ADN clonado se secuencia posteriormente por metodos estandar, dando la definicion de secuencia de aminoacidos de las regiones de dominio Vh mostradas en la Figura 4.
Alternativamente, los anticuerpos pueden obtenerse por tecnologla de hibridoma estandar. Los dominios VH obtenidos por tecnologla de presentacion en fagos pueden manipularse por ingenierla de regreso a una region efectora constante de cadena pesada de eleccion (desprovista de funcionalidad CH1) por metodos de clonacion estandar para producir un anticuerpo solo de cadena pesada completo de eleccion en terminos de la region constante (por ejemplo, Ca en vez de Cg). De manera similar, los anticuerpos solo de cadena pesada obtenidos por tecnologla de hibridoma pueden clonarse por tecnologla de ADNc y PCR estandar. Esto permite el aislamiento de dominios VH solos.
Asl, ambos enfoques pueden usarse para derivar dominios VH especlficos de antlgeno o anticuerpos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno.
Ejemplo 2 Generacion de anticuerpos humanos anti-CR1
El Ejemplo 2 es muy similar al Ejemplo 1, excepto que la inmunizacion se lleva a cabo con CR1 como el antlgeno, una protelna que normalmente se expresa sobre la superficie de globulos rojos humanos. La inmunizacion tambien se llevo a cabo por inyeccion de globulos rojos murinos que expresan CR1 humano sobre su superficie celular. El resultado de las diferentes inmunizaciones es muy similar. La inmunizacion se lleva a cabo en ratones transgenicos que contienen un locus de anticuerpo de cadena pesada completamente humano como se describe en el documento Wo 2006/008548. Estos ratones portan 4 segmentos VH humanos, todas de las regiones de cadena pesada D humana, todas de las regiones JH y las regiones Cg2 y Cg3 humanas (Figura 1).
Las regiones CH1 se han delecionado de las regiones constantes Cg humanas para permitir la produccion de anticuerpos solo de cadena pesada humanos como se ha descrito (Janssens et al (2006) PNAS, 103, 1513015135). Los ratones se inmunizan usando protocolos estandar y los anticuerpos se alslan como se muestra esquematicamente en la Figura 2.
Despues de la inmunizacion, se recogen las celulas del bazo y el ARNm se transcribe de forma inversa y se amplifica en ADNc con cebadores especlficos de dominio VH por metodos estandar (por ejemplo, Janssens et al (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Los fragmentos de VH resultantes se clonan en un vector de presentacion en fagos. Despues de 3 rondas de cribado e inmunopurificacion por protocolos de presentacion estandar, los dominios VH (VH-D-J) se clonan en un vector de expresion bacteriano. La secuencia clonada se secuencia posteriormente por metodos estandar, dando por resultado la region de dominio VH mostrada en las Figuras 5 y 6. Alternativamente, los anticuerpos pueden obtenerse por tecnologla de hibridoma estandar (Figuras 5 y 6). Los dominios VH obtenidos por tecnologla de presentacion en fagos pueden manipularse por ingenierla de regreso a una region efectora constante de eleccion (desprovista de funcionalidad CH1) por metodos de clonacion estandar para producir un anticuerpo completo solo de cadena pesada (por ejemplo, Ca en vez de Cg). De manera similar, el anticuerpo solo de cadena pesada obtenido por tecnologla de hibridoma puede clonarse por tecnologla de ADNc y PCR estandar que permite el aislamiento de su dominio VH unicamente. Asl, ambos enfoques pueden usarse para derivar dominios VH especlficos de antlgeno o anticuerpos solo de cadena pesada especlficos de antlgeno.
Ejemplo 3 Expresion de dominios VH y anticuerpos solo de cadena pesada, afinidad y solubilidad
Los dominios VH de los Ejemplos 1 y 2 pueden expresarse en un sistema de expresion bacteriano para obtener grandes cantidades de dominios VH purificados. Por ejemplo, el dominio VH puede expresarse como protelna hlbrida en bacterias usando el sistema de expresion hlbrido SUMO (Invitrogen). Cuando se purifican, estos corren como un solo fragmento en geles de electroforesis en gel desnaturalizantes (Figura 7). Cuando corren en un sistema de cromatografla Smart Sephadex bajo condicion no desnaturalizante, estos dominios VH corren predominantemente como un unico pico principal del peso molecular correcto (Figura 7), con poca evidencia de agregados solubles.
El anticuerpo solo de cadena pesada derivado de sobrenadantes de hibridoma tambien corre predominantemente como un unico pico principal, con evidencia de un pequeno porcentaje de dlmero de anticuerpo en el borde delantero del pico.
El unico pico de los dominios VH sugiere que son monomeros solubles, que se confirmo al ejecutar graficas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dispersion (Figura 8A), debido a que el pico de la dispersion de la luz coincide con el pico de absorcion de protelna durante la ejecucion. Finalmente, cuando se calientan, los dominios VH son estables hasta 55 °C como se mide por analisis de dicrolsmo circular estandar (Figura 8B).
Finalmente, los dominios VH solubles y los HCAb se probaron para su afinidad de union usando un sistema BiaCore y un sistema Octet. Las afinidades obtenidas estuvieron en el intervalo nanomolar bajo o mejor (Figura 9).
Varios dominios VH derivados de HCAb tambien se concentraron por centrifugacion a vaclo y la materia coloidal se elimino por centrifugacion a alta velocidad. Esto dio numeros de solubilidad que son una estimacion minima debido a que las pequenas cantidades de muestra previnieron concentracion adicional. Todos los dominios VH probados mostraron solubilidad en exceso de 4 mg/ml (Figura 10).
Ejemplo 4. Secuenciacion masiva para determinar los patrones de mutacion
A partir de una inspeccion de todas las secuencias recogidas de los anticuerpos que se unen a Luk-sPV, CR1 y otros antlgenos, se hizo evidente que la recombinacion de VDJ y maduracion (hipermutacion) de dominios VH humanos solubles derivados de transgenes de HCAb expresados en linfocitos B murinos fue muy diferente de aquella observada en dominios VHH de camello y llama, o dominios VH humanos derivados de anticuerpos de cadena pesada y ligera tetramericos normales. Por lo tanto, se llevo a cabo una secuenciacion paralela masiva (secuenciacion de Roche 454) para seguir el proceso de recombinacion a hipermutacion. Esta se uso para verificar que el proceso es de hecho diferente, y para entender que parametros y parte(s) del anticuerpo son importantes para la generacion de un anticuerpo solo de cadena pesada humano soluble de alta afinidad tras la eleccion inicial de una recombinacion de VDJ particular. Los resultados proporcionan una vision general de como tiene lugar el proceso (Figura 11).
Este analisis muestra que el raton es capaz de introducir una gran variedad de sustituciones de aminoacidos a traves del dominio VH del transgen expresado. El grueso esta en la posicion de CDR1 y CDR2. Sin embargo, tambien son evidentes sustituciones dentro de FR1 y FR2 y estan distribuidas a traves de FR3. Las regiones de interfase de CDR/FR aparecieron como puntos calientes para sustituciones. A partir de este analisis, esta claro que el proceso de mutacion, en terminos de posiciones y las sustituciones de aminoacidos, es muy diferente del observado en dominios VHH de camelido y dominios VH presentes en anticuerpos humanos tetramericos normales.
Ejemplo 5. Analisis comparativo de la region estructural y region CDR individuales presentes en los dominios VH solubles, dominios VHH y dominios VH derivados de anticuerpos tetramericos
Se tabularon todas las mutaciones de los dominios VH solubles de union a antlgeno humanos y las diferentes regiones (FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3) se analizaron en comparacion con los dominios VHH de anticuerpos solo de cadena pesada de camelido, anticuerpos solo de cadena pesada de llama y dominios VH humanos obtenidos de anticuerpos tetramericos humanos normales.
Esta comparacion comprendio 10 secuencias de dominio VHH de camello conocidas, 58 secuencias de dominio VHH de llama conocidas y mas de 4000 secuencias de dominio VH humano conocidas derivadas de anticuerpos tetramericos normales, todos obtenidos de la bibliografla y bases de datos de anticuerpos publicas.
La region FR1 de los dominios VH humanos solubles (Figura 12) muestra un aumento en la carga neta cuando se compara con camello y llama y un aumento en el caracter hidrofobo cuando se compara con dominios VH de camello, llama y derivados de anticuerpos tetramericos humanos normales, mientras que el numero de aminoacidos cargados ha aumentado.
La region CDR1 (Figura 12) tiene muy poco cambio en la carga neta (alguna disminucion en comparacion con llama) y un aumento en el caracter hidrofobo en relacion con el dominio VH equivalente de anticuerpos tetramericos humanos, dominios VHH de llama y camello. El numero de aminoacidos cargados muestra poca diferencia significativa.
La region FR2 del dominio VH humano soluble (Figura 13) no muestra diferencia en la carga neta cuando se compara con dominios VHH de camello y llama y un aumento sustancial en el caracter hidrofobo cuando se compara con dominios VHH de camello y llama, mientras que el numero de aminoacidos cargados ha disminuido en comparacion con dominios VHH de camello y llama. En ambos aspectos, es similar a dominios VH humanos derivados de anticuerpos tetramericos. La region CDR2 (Figura 13) tiene una carga neta similar a la de llama, que es mayor a la de anticuerpos tetramericos de camello y humanos, y un caracter hidrofobo muy similar a los otros, mientras que el numero de aminoacidos cargados es similar a los dominios VH humanos derivados de anticuerpos tetramericos, pero un poco menor a los otros.
La region FR3 del dominio VH humano soluble (Figura 14) muestra un aumento en la carga neta cuando se compara con dominios VH humanos derivados de anticuerpos tetramericos y una disminucion en el caracter hidrofobo cuando se compara con dominios VH humanos derivados de anticuerpos tetramericos, mientras que el numero de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
aminoacidos cargados ha aumentado en comparacion con los dominios VH humanos derivados de anticuerpos tetramericos. En todos los aspectos, es similar a los dominios VHH de camello y llama. La region CDR3 de los dominios VH humanos solubles (Figura 14) tienen una carga neta reducida en relacion con los dominios VHH de llama y camelido y dominios VH humanos derivados de anticuerpos tetramericos, mientras que el numero de aminoacidos cargados es elevado cuando se compara con todos los demas. La region CDR3 de dominios VH humanos solubles tiene un caracter hidrofobo muy similar al VHH de llama, pero menor al observado en dominios VH presentes en anticuerpos tetramericos humanos normales y anticuerpos tetravalentes de camello normales.
Los resultados muestran que, de la recombinacion de VDJ inicial, hay seleccion de eventos de recombinacion con un numero mayor de aminoacidos cargados cuando se compara con anticuerpos tetramericos humanos (CDR3). Esto es seguido por maduracion por afinidad en las regiones CDR1 y CDR2 y en las tres regiones estructurales (FR1, FR2, FR3). Esto produce anticuerpos solo de cadena pesada humanos con dominios VH solubles que tienen un aumento en el caracter hidrofobo en FR1, pero una disminucion en FR3 cuando se compara con dominios VH derivados de anticuerpos tetramericos humanos. Hay muy poca diferencia en regiones FR2 o CDR1 y CDR2. Por lo tanto, el patron global muestra que el caracter hidrofobo se extiende de manera diferente a traves del dominio VH soluble (desplazado hacia FR1 y alejado de FR3 y CDR3) en relacion con los dominios VH derivados de anticuerpos tetramericos que son menos solubles y tienen una tendencia a agregarse. Este analisis no muestra si se hacen o no mutaciones particulares en posiciones particulares o regiones del dominio VH (vease el Ejemplo 6), pero hay caracterlsticas relacionadas con la distribucion de carga y el caracter hidrofobo a traves de los dominios VH humanos solubles que las distingue de los dominios VHH de llama y de camelido y dominios VH humanos derivados de anticuerpos tetramericos.
Ejemplo 6. Estructuras 3D
El analisis del Ejemplo 4 indico que los cambios en las regiones estructurales (FR1, FR2, FR3) del dominio VH humano soluble despues de un reordenamiento de VDJ inicial se centraron en gran medida en posiciones particulares cuando se colocaron en la estructura tridimensional de un dominio VH humano derivado de un anticuerpo tetramerico (Figura 15).
En el dominio VH humano soluble se observaron mutaciones de FR1 de los aminoacidos 13-18, con predominancia para un cambio en la posicion 13, produciendo elevado caracter hidrofobo, aun cuando el numero de aminoacidos cargados, pero no la carga neta, es elevado. De manera importante, los cambios alrededor de la posicion 13 se localizan en un bucle pequeno que tiene elevado caracter hidrofilo, supuestamente solubilidad cada vez mayor.
En FR2 de los dominios VH humanos solubles, hay un foco de atencion claro alrededor de la posicion 35 y uno alrededor de la posicion 50, sin un cambio global en el caracter hidrofobo cuando se compara con los dominios VH derivados de anticuerpos tetramericos humanos.
Los cambios en FR3 de los dominios VH solubles en relacion con los dominios VH derivados de anticuerpos tetramericos humanos coinciden con el extremo de la region CDR2 y la region alrededor del extremo de FR3 (inmediatamente proximo a CDR3).
Cuando estos cambios observados en los dominios VH humanos solubles derivados de HCAbs se superponen a la estructura 3D del dominio VH, es inmediatamente evidente que las mutaciones de FR2 ocurren en las hojas plegadas en b que normalmente constituyen la superficie de interaccion del dominio VH con el VL en anticuerpos tetramericos. En FR1, los cambios tambien producen un dominio mas hidrofobo. Los resultados sugieren que la mitad del extremo N del dominio VH tiene un caracter hidrofobo elevado para aumentar la estabilidad/solubilidad del dominio VH y compensar la ausencia de cadena ligera. Por el contrario, la mitad del extremo C es menos hidrofoba. Los cambios mas importantes son una “redistribution” del patron de caracter hidrofobo (extremo N mas hidrofobo, extremo C menos hidrofobo, Figura 16) y mutaciones de la region estructural que afectan la interfase de cadena ligera anterior.
El desplazamiento global en el caracter hidrofobo y cambios en motivos especlficos llevados a cabo por el sistema inmunitario de raton permiten la generation de anticuerpos solo de cadena pesada solubles de alta afinidad y dominios VH solubles con caracterlsticas estructurales que los distinguen de los dominios VH propensos a la agregacion derivada de anticuerpos tetramericos humanos.
Ejemplo 7. Generacion y clonacion de expresion de anticuerpos humanos anti-HA
Los procedimientos de inmunizacion usados en el Ejemplo 7 son como se describen en los Ejemplos 1 y 2, excepto que la inmunizacion se lleva a cabo con HA de gripe (H3N2) como el antlgeno. La inmunizacion se lleva a cabo por inyeccion de la protelna en ratones transgenicos que comprenden un locus de anticuerpo de cadena pesada completamente humano como se ha descrito en Janssens et al (2006) PNAS, 103, 15130-15135. Estos ratones portan 4 segmentos de VH humanos, todas de las regiones de cadena pesada D humanas, todas de las regiones JH y las regiones Cg2 y Cg3 humanas (Figura 1).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las regiones CH1 han sido delecionadas de las regiones constantes Cg humanas para permitir la production de anticuerpos solo de cadena pesada humanos como se ha descrito (Janssens et al (2006) PNAS, 103,15130-15135). Los ratones se inmunizan usando protocolos estandar y los anticuerpos se alslan como se muestra esquematicamente en la Figura 17.
Despues de la inmunizacion, las celulas plasmaticas se recogen y se distribuyen (FACS) para la presencia del antlgeno CD138 y la ausencia de marcadores de linaje por metodos estandar (veanse Sanderson et al (1989) Cell Regulation 1, 27-35; Kim et al (1994) Mol. Biol. Cell, 5, 797-805 y vease Kit de distribution magnetica para el aislamiento de celulas plasmaticas CD138+ de raton de Miltenyi Biotec). Se recogen las celulas y el ARNm se transcribe de forma inversa y se amplifica en ADNc con cebadores especlficos de dominio VH por metodos estandar (por ejemplo, Janssens et al (2006) PNAS, 103, 15130-15135). Los cebadores usados estan en el extremo 5' y son disenados para introducir un sitio Pvull para fines de donation (Figura 18). Los cebadores en el extremo 3' son de la region bisagra CH2 de lgG2 o lgG3 y son disenados para tener un sitio BstEII. Si esto no es posible, el cebador para la lgG3 contiene un sitio Sacl para fines de clonacion (Figura 18). Los fragmentos de VH resultantes se clonan en dos vectores de expresion de mamlfero que contienen un potenciador del CMV y un promotor de b-actina de pollo, seguido por una secuencia de Kozak y senal de VH3-23 que termina en su sitio Pvull en el segmento VH apropiado. En el primer vector (Figura 18), esto va seguido por lgG2 humana empezando en la region bisagra (del sitio BstEII) de CH2 con CH2, CH3, un codon de termination y secuencia de poIiA. En el segundo vector, todas las secuencias de lgG2 son reemplazadas por las secuencias de lgG3 humanas equivalentes. Las ultimas permiten la clonacion de HCAbs que no contienen un sitio BstEII usando el sitio Sacl como alternativa. El resto del plasmido tiene un marcador de selection de celulas de mamlfero tal como un casete de resistencia a la higromicina en un plasmido basado en pUC. Obviamente, la lgG2 o 3 humana podrla ser reemplazada por cualquier otra region constante deficiente en CH1 de humano o cualquier otra especie. Igualmente obvio, lo mismo es cierto para la parte VH del vector. El ADNc se clona entonces entre los sitios Pvull y BstEII (o Pvull y Sacl) y el vector se transfecta en E. coli por tecnicas estandar. Las colonias se recogen en placas de microtitulacion de 96 (o 384) pocillos que contienen medio de crecimiento bacteriano. Las placas (normalmente >10) se incuban para permitir que las bacterias crezcan y se prepara ADN en cada pocillo. El ADN de cada pocillo, es decir, cada placa completa, se anade posteriormente a una placa de 96 pocillos nueva que contiene celulas HEK de mamlfero (u otras celulas para fines de expresion) para la transformation por reactivos y metodos de transfection estandar. Las celulas transformadas se hacen crecer bajo seleccion basandose en el marcador de seleccion presente en el plasmido de expresion (por ejemplo, higromicina). El medio que contiene el anticuerpo expresado se analiza posteriormente para la presencia de HCAb especlfico de antlgeno por ensayos de ELISA estandar. Esto se puede llevar a cabo en el mismo formato de 96 pocillos, pero tambien podrla hacerse en otros formatos, por ejemplo, por micromatrices, para ahorrar en la cantidad de antlgeno que tiene que usarse. Los pocillos positivos identifican inmediatamente los plasmidos que contienen un HCAb humano que codifica un HCAb especlfico de antlgeno. La Figura 19 muestra el ELISA de los sueros de los ratones que se inmunizaron y ejemplos del ELISA de las celulas HEK transfectadas en el formato de 96 pocillos. Tambien resume el experimento de clonacion de HA, menor que una millonesima del ADNc se uso en el experimento usando 960 pocillos en total. Esto produjo 28 anticuerpos especlficos de antlgeno diferentes que se clasifican en 13 grupos por analisis de secuencia derivados de dos de las regiones de VH, VH3-11 (Figura 21) y VH3-23 (Figura 22). Se usan tanto lgG2 (SSERKCCVE) como lgG3 (SSELKTPLG), las regiones de VH han sufrido hipermutacion y, similar a humanos, la region J4 se usa con mas frecuencia, aunque tambien se usan otras. Los HCAb secretados son solubles y son monomeros, como se determina por sus perfiles de elucion en una columna SMART estandar (Figura 23). Las afinidades de los anticuerpos oscilan de afinidad nanomolar a subnanomolar como se determina por perfiles de union y de disociacion estandar en un analisis Octet (Figura 24) o BiaCore. El analisis de las mutaciones y la comparacion con otras secuencias de inmunoglobulina (Figura 25) produce las mismas propiedades de las regiones diferentes como se muestra en las Figuras 11-13.
Como se describio antes, los dominios VH solubles pueden aislarse de HCAb soluble derivado de celulas plasmaticas.
Ejemplo 8 Generacion y clonacion de expresion de HCAb humano a partir de celulas individuales
Una variante del esquema descrito anteriormente por clonacion directamente en celulas HEK serla distribuir las celulas negativas de linaje CD138+ y derivar el ADNc de celulas individuales que pudieran ser clonadas directamente en HEK u otras celulas de mamlfero (Figura 26). Estas serlan analizadas por metodos muy similares como se describio antes.
Ejemplo 9 Generacion y clonacion de expresion de anticuerpos (tetramericos) de cadena pesada y ligera humanos normales a partir de celulas individuales
Tambien puede usarse una variante del metodo mostrado en el Ejemplo 8 para clonar anticuerpos tetramericos normales expresados por transgen directamente por clonacion de expresion en HEK u otras celulas de mamlfero. En la variante, las celulas individuales se alslan de nuevo por distribucion. El ARN se alsla de celulas individuales y tanto los dominios VH como VL se clonan por amplification por PCR en un vector de expresion de cadena pesada y ligera analogo al que se describio anteriormente. La combination individual de los plasmidos de expresion de cadena pesada y ligera clonados se transfecta en conjunto en celulas HEK u otras de mamlfero. Los formatos, el
cribado y el analisis son completamente analogos a los anteriormente descritos para el formato de 96 pocillos de HCAb (Ejemplos 8 y 9).

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de production de un anticuerpo solo de cadena pesada que se une especlficamente a un antlgeno que comprende:
    (a) inmunizar un mamlfero transgenico no humano con el antlgeno, en el que el mamlfero expresa anticuerpos solo de cadena pesada que carecen de un dominio CH1 en el ARNm de cadena pesada transcrito y procesado, y en el que los anticuerpos solo de cadena pesada se expresan de un locus transgenico en el mamlfero;
    (b) aislar celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria del mamlfero inmunizado;
    (c) aislar una poblacion de ARNm de celulas derivadas de la etapa (b);
    (d) clonar una poblacion de ADNc derivado del ARNm aislado en la etapa (c) en un vector de expresion y que expresa el vector de expresion en una llnea celular;
    (e) seleccionar por lo menos una llnea celular que produce un anticuerpo solo de cadena pesada que se une especlficamente al antlgeno;
    en el que el mamlfero es un raton o una rata.
  2. 2. Un metodo de produccion de un dominio VH soluble o una protelna de fusion VH que se une especlficamente a un antlgeno que comprende:
    (a) inmunizar un mamlfero transgenico no humano con el antlgeno, en el que el mamlfero expresa anticuerpos solo de cadena pesada que carecen de un dominio CH1 en el ARNm de cadena pesada transcrito y procesado, y en el que los anticuerpos solo de cadena pesada se expresan de un locus transgenico en el mamlfero;
    (b) aislar celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria del mamlfero inmunizado;
    (c) aislar una poblacion de ARNm de celulas derivadas de la etapa (b);
    (d) clonar una poblacion de ADNc que comprende ADNc que codifican un dominio Vh derivado del ARNm de la etapa (c) en un vector de expresion de tal manera que un dominio Vh o una protelna de fusion Vh, que puede comprender una region efectora de cadena pesada, se exprese en la llnea celular; y
    (e) seleccionar por lo menos una llnea celular que produce un dominio Vh o una protelna de fusion Vh que se une especlficamente al antlgeno,
    en el que el mamlfero es un raton o una rata.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el mamlfero transgenico no humano expuesto al antlgeno es un raton, y las celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria se purifican de las glandulas linfaticas secundarias, medula osea o bazo del raton.
  4. 4. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en el que las celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria se purifican usando marcadores de superficie celular sobre las celulas.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el mamlfero transgenico no humano expuesto al antlgeno es un raton y el marcador de superficie celular es el marcador CD138.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la llnea celular es una llnea celular microbiana o una llnea celular de mamlfero.
  7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa (d) comprende transfectar dicho vector de expresion en bacterias en un formato automatizable de alto rendimiento, amplificar dichas bacterias, aislar el vector de expresion y transfectar el vector de expresion en celulas de expresion.
  8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las celulas plasmaticas de vida larga o linfocitos B de memoria se inmortalizan antes del aislamiento de ARNm.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que las celulas se inmortalizan por fusion con una celula de mieloma, o por transformation con un virus, tal como el eBv.
  10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que cualquier locus de anticuerpo solo de cadena pesada incluye al menos un gen marcador selectivo dominante.
  11. 11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que incluye ademas la etapa de aislar tanto el dominio VH soluble como un acido nucleico que codifica el dominio VH soluble de un linfocito B o una llnea celular inmortalizada que produce un anticuerpo solo de cadena pesada o protelna de fusion VH de la especificidad de antlgeno deseada.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que incluye ademas la etapa de aislar tanto un dominio Vh soluble como un acido nucleico que codifica un dominio Vh soluble de una celula productora de anticuerpos solo de cadena pesada producida por el mamlfero o de una celula inmortalizada productora de anticuerpos solo de cadena pesada o protelna de fusion Vh producida por el mamlfero por un enfoque de presentacion.
ES10711069T 2009-03-24 2010-03-19 Anticuerpos solubles “solo de cadena pesada” Active ES2563321T5 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0905023.8A GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-03-24 Binding molecules
GB0905023 2009-03-24
PCT/GB2010/000500 WO2010109165A2 (en) 2009-03-24 2010-03-19 Binding molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2563321T3 true ES2563321T3 (es) 2016-03-14
ES2563321T5 ES2563321T5 (es) 2023-06-26

Family

ID=40640054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10711069T Active ES2563321T5 (es) 2009-03-24 2010-03-19 Anticuerpos solubles “solo de cadena pesada”

Country Status (24)

Country Link
US (2) US8883150B2 (es)
EP (1) EP2411408B2 (es)
JP (1) JP5836927B2 (es)
KR (1) KR20120068757A (es)
CN (1) CN102482342B (es)
BR (1) BRPI1012694A2 (es)
CA (1) CA2756171C (es)
CY (1) CY1117203T1 (es)
DK (1) DK2411408T4 (es)
ES (1) ES2563321T5 (es)
FI (1) FI2411408T4 (es)
GB (1) GB0905023D0 (es)
HR (1) HRP20160158T4 (es)
HU (1) HUE026473T2 (es)
MX (1) MX2011010027A (es)
PL (1) PL2411408T5 (es)
PT (1) PT2411408E (es)
RU (1) RU2528737C2 (es)
SG (1) SG174510A1 (es)
SI (1) SI2411408T2 (es)
SM (1) SMT201600044B (es)
TW (1) TW201040264A (es)
WO (1) WO2010109165A2 (es)
ZA (1) ZA201106983B (es)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101151957B1 (ko) 2004-07-22 2012-06-01 로저 킹돈 크레이그 결합 분자
AU2007219159B8 (en) * 2006-01-25 2012-06-28 Roger Kingdon Craig Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
AU2009298458B2 (en) 2008-09-30 2015-10-08 Ablexis, Llc Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
JP5827127B2 (ja) 2008-12-18 2015-12-02 エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物及びその使用
DK3622815T3 (da) 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ES2724975T3 (es) 2009-12-10 2019-09-18 Regeneron Pharma Ratones que producen anticuerpos de cadena pesada
ES2984483T3 (es) 2010-03-31 2024-10-29 Ablexis Llc Ingeniería genética de ratones para la producción de anticuerpos quiméricos
SMT201700023T1 (it) 2010-08-02 2017-03-08 Regeneron Pharma Topi che producono proteine leganti vl
JP2014505698A (ja) * 2011-02-02 2014-03-06 グラクソ グループ リミテッド 新規抗原結合タンパク質
ME02106B (me) 2011-02-25 2015-10-20 Regeneron Pharma Miševi sa adam6
HUE047278T2 (hu) 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
BR112014006394A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
EP2758534B1 (en) 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
SG11201401181YA (en) 2011-10-17 2014-04-28 Regeneron Pharma Restricted immunoglobulin heavy chain mice
GB2496375A (en) 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
SG10201605675WA (en) 2011-12-20 2016-09-29 Regeneron Pharma Humanized light chain mice
SG11201405059XA (en) 2012-03-28 2014-09-26 Kymab Ltd Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
ME03551B (me) * 2012-06-12 2020-07-20 Regeneron Pharma Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca
MY178882A (en) 2013-02-20 2020-10-21 Regeneron Pharma Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
EP3841876A1 (en) 2013-03-14 2021-06-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgenic mouse for antibody production
WO2014141192A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Erasmus University Medical Center Generation of heavy chain-only antibodies
GB2525568B (en) 2013-03-15 2020-10-14 Abvitro Llc Single cell barcoding for antibody discovery
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
GB201316644D0 (en) 2013-09-19 2013-11-06 Kymab Ltd Expression vector production & High-Throughput cell screening
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
JP2017512831A (ja) * 2014-03-20 2017-05-25 大塚製薬株式会社 置換フェニル−（１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−メタノンを含んでなる医薬処方物
CA3124228C (en) 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
AU2015231025A1 (en) 2014-03-21 2016-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
EP3950944A1 (en) 2014-09-15 2022-02-09 AbVitro LLC High-throughput nucleotide library sequencing
EP3209776A1 (en) * 2014-10-22 2017-08-30 Crescendo Biologics Limited Human vh domain scaffolds
EP3209699A1 (en) * 2014-10-22 2017-08-30 Crescendo Biologics Limited Vh scaffold
CN104710528B (zh) * 2015-03-13 2019-02-15 西北农林科技大学 一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
EP3271391A1 (en) * 2015-03-20 2018-01-24 Ablynx N.V. Glycosylated immunoglobulin single variable domains
CA2981077A1 (en) * 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
CA2992660A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Allergan, Inc. Heavy chain only antibodies to ang-2
EP3334762A1 (en) 2015-08-14 2018-06-20 Allergan, Inc. Heavy chain only antibodies to pdgf
EP3356415B1 (en) 2015-09-29 2024-05-01 Amgen Inc. Asgr inhibitors for reduzing cholesterol levels
CN105777894A (zh) * 2016-03-12 2016-07-20 长春力太生物技术有限公司 通过转基因啮齿类动物制备人源化驼类单域抗体的方法
JP2019513415A (ja) * 2016-04-04 2019-05-30 イーティーエッチ チューリッヒ タンパク質産生及びライブラリー生成のための哺乳類細胞株
KR20250175345A (ko) 2016-06-21 2025-12-16 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
IL322083A (en) * 2016-08-24 2025-09-01 Teneobio Inc Non-human transgenic animals that produce modified heavy chain antibodies only
PE20241349A1 (es) 2016-09-14 2024-07-03 Teneobio Inc Anticuerpos de union a cd3
WO2018069480A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Institut Curie New anti-lsp1 antibody
CN109906030B (zh) * 2016-11-04 2022-03-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
IL317134A (en) * 2016-12-21 2025-01-01 Teneobio Inc An antibody containing only heavy chains that binds a human B-cell maturation antigen, a pharmaceutical composition containing the same, its use in the treatment of B-cell disorders and a method for its preparation
US11267904B2 (en) * 2016-12-28 2022-03-08 Sysmex Corporation Method for controlling affinity of antibody for antigen, antibody whose affinity for antigen has been altered, and its production method
IL268049B2 (en) 2017-01-19 2025-08-01 Omniab Inc Transgenic rodent human antibodies with multiple immunoglobulin heavy chain loci
CN110945026B (zh) * 2017-06-20 2024-03-19 特纳奥尼股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
KR20250007003A (ko) * 2017-06-20 2025-01-13 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
EP3681908A1 (en) 2017-09-13 2020-07-22 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes
SG11202005692WA (en) * 2017-12-20 2020-07-29 Harbour Biomed Shanghai Co Ltd Antibodies binding ctla-4 and uses thereof
CN111683966B (zh) 2017-12-22 2023-07-11 特尼奥生物股份有限公司 与cd22结合的重链抗体
CN117050184A (zh) 2017-12-28 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 针对tigit的单域抗体和其变体
CN112004411B (zh) * 2018-03-21 2023-05-26 晶体生物科学股份有限公司 产生人抗体的转基因鸡
TW202003567A (zh) 2018-03-30 2020-01-16 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對lag-3之單一結構域抗體及其用途
WO2019241002A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 Crystal Bioscience Inc. Transgenic chicken that makes antibodies with long cdr-h3s stabilized by multiple disulfide bridges and diversified by gene conversion
WO2019240998A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 Crystal Bioscience Inc. Production of antibodies by modification of an autonomous heavy chain variable domain by gene conversion
BR112020024074A2 (pt) 2018-07-20 2021-02-17 Teneobio, Inc. anticorpos de cadeia pesada com ligação a cd19
GB2576914A (en) 2018-09-06 2020-03-11 Kymab Ltd Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals
KR20210086651A (ko) 2018-10-26 2021-07-08 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd38에 결합하는 중쇄 항체
US12599668B2 (en) 2019-02-20 2026-04-14 Harbour Antibodies Bv Antibodies
WO2020206330A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to psma
MA56110A (fr) 2019-06-07 2022-04-13 Amgen Inc Constructions de liaison bispécifiques à lieurs clivables de manière sélective
CR20210622A (es) 2019-06-14 2022-06-27 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
CN115023441A (zh) 2019-12-18 2022-09-06 特诺福尔股份有限公司 与cd38结合的重链抗体
GB202003632D0 (en) 2020-03-12 2020-04-29 Harbour Antibodies Bv SARS-Cov-2 (SARS2, COVID-19) antibodies
TW202330622A (zh) 2020-04-29 2023-08-01 美商泰尼歐生物公司 具有經修飾重鏈恆定區之多特異性重鏈抗體
IL297601A (en) 2020-04-29 2022-12-01 Teneobio Inc Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
EP4161969A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
JP7620780B2 (ja) 2020-06-30 2025-01-24 ノナ・バイオサイエンシーズ・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド Ｈ２Ｌ２とＨＣＡｂ構造を有する結合タンパク質
CN116472049A (zh) 2020-06-30 2023-07-21 特尼奥生物股份有限公司 与bcma结合的多特异性抗体
US20230235090A1 (en) 2020-06-30 2023-07-27 Harbour Biomed US, Inc. Bispecific antibody and use thereof
US20220090060A1 (en) 2020-09-11 2022-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
GB202017555D0 (en) 2020-11-06 2020-12-23 Harbour Antibodies Bv Antibody-conjugated nanoparticles
TW202233684A (zh) 2020-11-18 2022-09-01 美商泰尼歐生物公司 結合於葉酸受體α之重鏈抗體
US20250277024A1 (en) 2020-12-03 2025-09-04 Amgen Inc. Molecules with multiple binding domains
WO2021115497A2 (zh) 2020-12-08 2021-06-17 和铂医药(上海)有限责任公司 蛋白-药物偶联物和定点偶联方法
JP7822400B2 (ja) * 2020-12-09 2026-03-02 トリアンニ，インコーポレーテッド 重鎖のみ抗体
CN116848254B (zh) 2020-12-16 2026-03-17 瑞泽恩制药公司 表达人源化Fcα受体的小鼠
KR20230148828A (ko) 2021-02-25 2023-10-25 테네오바이오, 인코포레이티드 항-psma 항체 및 car-t 구조
US20240182597A1 (en) 2021-02-26 2024-06-06 Teneobio, Inc. Anti-muc1-c antibodies and car-t structures
TW202304994A (zh) 2021-04-02 2023-02-01 美商泰尼歐生物公司 促效性抗ｉｌ－２ｒ抗體及使用方法
KR20230166090A (ko) 2021-04-06 2023-12-06 테네오바이오, 인코포레이티드 항-cd19 항체 및 car-t 구조체
CN117337303A (zh) 2021-04-16 2024-01-02 特尼奥生物股份有限公司 抗cd20抗体及car-t结构
WO2022271987A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 TeneoFour, Inc. Anti-cd38 antibodies and epitopes of same
WO2023004197A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Teneoten, Inc. Heavy chain antibodies binding to hepatitis b surface antigen
WO2023036982A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Harbour Antibodies Bv Anti-sars2-s antibodies
GB202112935D0 (en) 2021-09-10 2021-10-27 Harbour Antibodies Bv Sars-cov-2 (sars2, covid-19) heavy chain only antibodies
WO2023186113A1 (zh) 2022-04-02 2023-10-05 和铂医药(上海)有限责任公司 靶向pd-l1和cd40的抗原结合蛋白及其制备和应用
CN119365212A (zh) * 2022-06-24 2025-01-24 四川科伦药物研究院有限公司 特异性结合gpc3的嵌合抗原受体及其应用
EP4598958A1 (en) 2022-10-05 2025-08-13 Amgen Inc. Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof
WO2024186634A2 (en) * 2023-03-03 2024-09-12 Binacea Pharma, Inc. Anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof
EP4512243A1 (en) 2023-08-21 2025-02-26 Kymab Limited Binding molecules
WO2025042968A1 (en) * 2023-08-22 2025-02-27 Integral Molecular, Inc. Compositions and methods related to chicken recombinant heavy-chain only antibodies
GB202406483D0 (en) 2024-05-09 2024-06-26 Harbour Antibodies Bv Crossing the blood brain barrier to treat diseases of the brain
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3333941A1 (de) 1983-09-20 1985-04-04 Karl Kässbohrer Fahrzeugwerke GmbH, 7900 Ulm Fraese
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5843440A (en) 1990-10-03 1998-12-01 Redcell Canada, Inc. Cellular and serum protein anchors for modulating pharmacokinetics
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
DK1027439T3 (da) 1997-10-27 2010-05-10 Bac Ip Bv Multivalente antigenbindende proteiner
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20030022240A1 (en) * 2001-04-17 2003-01-30 Peizhi Luo Generation and affinity maturation of antibody library in silico
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
CA2450285C (en) * 2001-06-13 2016-08-02 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (egfr)
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
AU2004215125B2 (en) * 2003-02-26 2011-01-06 Institute For Research In Biomedicine Monoclonal antibody production by EBV transformation of B cells
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
KR101151957B1 (ko) * 2004-07-22 2012-06-01 로저 킹돈 크레이그 결합 분자
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
ES2694247T3 (es) * 2005-05-20 2018-12-19 Ablynx N.V. NanobodiesTM mejorados para el tratamiento de trastornos mediados por agregación
DE202005011297U1 (de) 2005-07-18 2005-11-03 Trw Automotive Electronics & Components Gmbh & Co. Kg Fahrzeug-Haltegriff
GB0618345D0 (en) † 2006-09-18 2006-10-25 Univ Erasmus Binding molecules
AU2007219159B8 (en) 2006-01-25 2012-06-28 Roger Kingdon Craig Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP5307708B2 (ja) † 2006-06-02 2013-10-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
US7731969B1 (en) * 2006-12-06 2010-06-08 Neoclone Biotechnology International, Llc Methods for developing and producing antigen-specific antibody-producing cells
PL2602323T3 (pl) * 2007-06-01 2018-06-29 Open Monoclonal Technology, Inc. Kompozycje i sposoby hamowania endogennych genów immunoglobin i wytwarzania transgenicznych ludzkich przeciwciał typu idiotypowego
WO2009013620A2 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Homologous recombination
CA2695309A1 (en) † 2007-09-07 2009-03-12 Symphogen A/S Methods for recombinant manufacturing of anti-rsv antibodies
ES2724975T3 (es) 2009-12-10 2019-09-18 Regeneron Pharma Ratones que producen anticuerpos de cadena pesada
ME02106B (me) 2011-02-25 2015-10-20 Regeneron Pharma Miševi sa adam6
WO2012122512A1 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Hco Antibody, Inc. Recombinant production of mixtures of single chain antibodies
JP6282000B6 (ja) 2015-06-22 2018-06-27 株式会社日立国際電気 電力増幅装置

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011142759A (ru) 2013-04-27
JP5836927B2 (ja) 2015-12-24
FI2411408T4 (fi) 2023-05-08
EP2411408B1 (en) 2015-11-25
CN102482342A (zh) 2012-05-30
GB0905023D0 (en) 2009-05-06
PT2411408E (pt) 2016-03-03
US9365655B2 (en) 2016-06-14
DK2411408T4 (da) 2023-04-24
EP2411408B2 (en) 2023-03-22
KR20120068757A (ko) 2012-06-27
DK2411408T3 (en) 2016-01-11
PL2411408T5 (pl) 2023-07-10
SI2411408T1 (sl) 2016-03-31
CA2756171A1 (en) 2010-09-30
CN102482342B (zh) 2014-11-12
HRP20160158T4 (hr) 2023-04-28
JP2012521211A (ja) 2012-09-13
RU2528737C2 (ru) 2014-09-20
ZA201106983B (en) 2014-12-23
EP2411408A2 (en) 2012-02-01
MX2011010027A (es) 2011-12-14
AU2010227291A1 (en) 2011-10-27
WO2010109165A8 (en) 2011-12-29
PL2411408T3 (pl) 2016-05-31
SI2411408T2 (sl) 2023-06-30
TW201040264A (en) 2010-11-16
CY1117203T1 (el) 2017-04-05
US8883150B2 (en) 2014-11-11
BRPI1012694A2 (en) 2018-01-16
HUE026473T2 (en) 2016-06-28
SG174510A1 (en) 2011-10-28
SMT201600044B (it) 2016-02-25
ES2563321T5 (es) 2023-06-26
US20120151610A1 (en) 2012-06-14
CA2756171C (en) 2020-04-28
WO2010109165A2 (en) 2010-09-30
WO2010109165A3 (en) 2011-02-24
HRP20160158T1 (hr) 2016-03-11
AU2010227291A8 (en) 2011-11-17
US20130323235A1 (en) 2013-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2563321T3 (es) Anticuerpos solubles "solo de cadena pesada"
US20260090529A1 (en) Transgenic non-human animals producing modified heavy chain-only antibodies
US10993420B2 (en) Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals
JP5184374B2 (ja) 対立遺伝子排除
ES2440990T5 (es) Moléculas de unión
WO2008122886A2 (en) Transgenic non-human mammal with homodimeric vh binding complex
CN101410412B (zh) 在转基因动物中产生仅有重链之抗体
AU2010227291B2 (en) Soluble "heavy-chain only " antibodies