ES2563730T3 - Composiciones de proteína RSV F y procedimientos de fabricación de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido F del virus respiratorio sincitial (RSV F) recombinante en el cual los aminoácidos 100-150, numerados en relación a la SEC ID Nº: 1, se reemplazan con la secuencia de aminoácidos de: TPATNNRARQQQQRFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 9).

Description

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La "conformación post-fusión" de la proteína RSV F es un trímero caracterizado por la presencia de un nudo de seis hélices que comprende 3 regiones HRB y 3 HRA.
La "conformación pre-fusión" de la proteína RSV F es una conformación caracterizada por un trímero que contiene una triple hélice que comprende 3 regiones HRB.
Tal como se usa en el presente documento, el "polipéptido de ectodominio de RSV F" se refiere a un polipéptido de la proteína RSV F que contiene sustancialmente la porción extracelular de la proteína RSV F madura, con o sin el péptido de señal (por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 524, o de aproximadamente el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 524) pero carece del dominio transmembrana y de la cola citoplasmática de la proteína RSV F de origen natural.
Tal como se usa en el presente documento, "polipéptido de ectodominio de RSV F escindido" se refiere a un polipéptido de ectodominio de RSV F que se ha escindido en una o más posiciones entre aproximadamente 101/102 a aproximadamente 160/161 para producir dos subunidades, en la que una de las subunidades comprende F1 y la otra subunidad comprende F2.
Tal como se usa en el presente documento, "polipéptido de ectodominio de RSV F C-terminal no escindido" se refiere a un polipéptido de ectodominio de RSV F que está escindido en una o más posiciones entre aproximadamente 101/102 a aproximadamente 131/132, y no está escindido en una o más posiciones entre aproximadamente 132/133 a aproximadamente 160/161, para producir dos subunidades, en el que una de las subunidades comprende F1 y la otra subunidad comprende F2.
Tal como se usa en el presente documento, "polipéptido de ectodominio de RSV F no escindido" se refiere a un polipéptido de ectodominio de RSV F que no está escindido en una o más posiciones entre aproximadamente 101/102 a aproximadamente 160/161. Un polipéptido de ectodominio de RSV F no escindido puede ser, por ejemplo, un monómero o un trímero.
Tal como se usa en el presente documento, "péptido de fusión" se refiere a los aminoácidos 137-154 de la proteína RSV F.
Tal como se usa en el presente documento, "péptido de fusión alterado" se refiere a un péptido de fusión en el que se reemplazan o eliminan independientemente uno o más aminoácidos, incluyendo el reemplazo o eliminación de todos los aminoácidos entre las posiciones 137-154. Preferentemente, los polipéptidos de ectodominio de RSV F escindidos que contienen un "péptido de fusión alterado" no forman rosetas.
Tal como se usa en el presente documento, una proteína o polipéptido "purificado" es una proteína o polipéptido que se produce de manera recombinante o sintética, o se produce por su hospedador natural, y se ha aislado de otros componentes del sistema de producción recombinante o sintético o del hospedador natural de tal forma que la cantidad de la proteína en relación a otros componentes macromoleculares presentes en una composición es sustancialmente mayor que la presente en una preparación en bruto. En general, una proteína purificada será homogénea en al menos aproximadamente el 50 % y más preferentemente en al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogénea.
Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas" se refiere a composiciones, proteínas y polipéptidos que están al menos aproximadamente un 95 % libres de lípidos y lipoproteínas en proporción en masa cuando se observa la pureza de la proteína y/o polipéptido (por ejemplo, polipéptido de RSV F) en un gel de SDS PAGE y se mide el contenido total de proteína usando absorción UV280 o análisis BCA, y el contenido de lípido y lipoproteína se determina usando el ensayo de fosfolipasa C (Wako, n.º de código 433-36201).
Tal como se usa en el presente documento, un "sitio de escisión de furina alterado" se refiere a la secuencia de aminoácidos en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136 en la proteína RSV F de origen natural que se reconocen y escinden por furina o proteasas similares a furina, pero en un polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido contiene uno o más reemplazos de aminoácidos, una o más eliminaciones de aminoácidos, o una combinación de uno o más reemplazos de aminoácidos y una o más eliminaciones de aminoácidos, de tal forma que un polipéptido de ectodominio de RSV F que contiene un sitio de escisión de furina alterado se secreta de una célula que la produce no escindida en el sitio de escisión de furina alterado.
Las características de los ectodominios de proteínas RSV F adecuadas para su uso en esta invención se describen en el presente documento con referencia a aminoácidos particulares que se identifican por la posición del aminoácido en la secuencia de la proteína RSV F de la cepa A2 (SEC ID Nº: 1). Los ectodominios de la proteína RSV F pueden tener la secuencia de aminoácidos de la proteína F de la cepa A2 o de cualquier otra cepa deseada. Cuando se usa el ectodominio de la proteína F de una cepa distinta de A2, los aminoácidos de la proteína F se numerarán con referencia a la numeración de la proteína F de la cepa A2, con la inserción de huecos según se necesite. Esto puede lograrse alineando la secuencia de cualquier proteína RSV F con la proteína F de la cepa A2,
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80). Como alternativa, o además, los restos de aminoácido 133 -136 de SEC ID Nº: 1 o 2 pueden reemplazarse con RKKK (SEC ID Nº: 81), ΔΔΔR, QNQN (SEC ID Nº: 82), QQQR (SEC ID Nº: 83) o IEGR (SEC ID Nº: 80). (Δ indica que el resto de aminoácido se ha eliminado). Estas mutaciones pueden combinarse, si se desea, con otras mutaciones descritas en el presente documento, tales como mutaciones en la región p27 (aminoácidos 110-136 de las SEC ID Nº: 1 o 2), incluyendo la eliminación total o parcial de la región p27.
Estas mutaciones de escisión de furina pueden combinarse, si se desea, con otras mutaciones descritas en el presente documento, tales como mutaciones de escisión de tripsina y mutaciones de péptido de fusión. Los ejemplos de mutaciones de escisión de tripsina incluyen la eliminación de cualquier resto de lisina o arginina entre aproximadamente la posición 101 y la posición 161 de las SEC ID Nº: 1 o 2, o el reemplazo de cualquiera de estos restos de lisina o arginina con un aminoácido distinto de lisina o arginina. Por ejemplo, pueden sustituirse o eliminarse restos de lisina y/o arginina en la región p27 (aproximadamente los aminoácidos 110-136 de las SEC ID Nº: 1 o 2), incluyendo la eliminación total o parcial de la región p27.
Como alternativa o además de las mutaciones de escisión de furina, los polipéptidos o proteínas RSV F pueden contener una o más mutaciones en la región del péptido de fusión (aminoácidos 137 y 153 de las SEC ID Nº: 1 o 2). Por ejemplo, esta región puede eliminarse en su totalidad o en parte.
De acuerdo con la invención, la secuencia de restos de aminoácidos 100 -150 del polipéptido o proteína RSV F, tal como SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, o los ectodominios solubles de la misma, es
(Delp23furdel)TPATNNRARQQQQRFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 9)
En algunas realizaciones de la divulgación, la secuencia de restos de aminoácidos 100 -150 del polipéptido o proteína RSV F, tal como SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, o los ectodominios solubles de la misma, es
(Furmt) TPATNNRARKELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKKKFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 3)
(Furdel) TPATNNRARQELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKK---RFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 4)
(Furx) TPATNNQAQNELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 6)
(Furx R113Q, K123N, K124N) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 5)
(Furx R113Q, K123Q, K124Q)) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 92)
(Delp21Furx) TPATNNQAQN-----------------------QNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 7)
(Delp23Furx) TPATNNQAQN-------------------------QNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 8)
(Delp21 furdel) TPATNNRARQ-----------------------QNQQQRFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 109)
(Nterm Furin) TPATNNRARRELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 10)
(Cterm Furin) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 11)
(eliminación 1 de péptido de fusión) TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRSAIAS (SEC ID Nº: 12),
(eliminación 2 de péptido de fusión) TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR -GVGSAIAS (SEC ID Nº: 91), o
(Factor Xa) TPATNNIEGRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKIEGRFLGFLLGVGSAIAS (SEC ID Nº: 13); en las que el símbolo "-" indica que el aminoácido en esa posición se ha eliminado.
Además de las mutaciones de escisión de furina y de péptido de fusión, o como alternativa, los polipéptidos o proteínas RSV F solubles, tales como aquellos que carecen de la región transmembrana y de la cola citoplasmática, pueden contener una o más secuencias de oligomerización. Cuando está presente una secuencia de oligomerización, es preferentemente una secuencia de trimerización. Las secuencias de oligomerización adecuadas se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la hélice superenrollada de la proteína de cremallera de leucina GCN4 de levadura, la secuencia trimerizante de fibritina de bacteriófago T4 ("foldon"), y el dominio de trímero de HA de la gripe. En el presente documento se describen en más detalle estas y otras secuencias de oligomerización adecuadas.
En realizaciones particulares, la secuencia del extremo carboxilo terminal del polipéptido o proteína RSV F, comenzando desde la posición 480, es
(GCN) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE (SEC ID Nº: 14)
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células bacterianas y de mamífero y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr y col., eds., 1989) Butterworths, Londres.
Las construcciones recombinantes que codifican ectodominios de proteína RSV F pueden prepararse en vectores adecuados usando procedimientos convencionales. Se conocen bien y son convencionales en la técnica una serie de vectores adecuados para la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto o de mamífero. Los vectores adecuados pueden incluir una serie de componentes, incluyendo, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: un origen de replicación; un gen de marcador de selección; uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control transcripcional (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un terminador), y/o una o más señales de traducción; y una secuencia de señal o secuencia líder para dirigirse a la ruta secretora en una célula hospedadora adecuada (por ejemplo, de origen de mamífero o de un mamífero heterólogo o una especie no de mamífero). Por ejemplo, para la expresión en células de insecto, se usa un vector de expresión de baculovirus, tal como pFastBac (Invitrogen) para producir partículas de baculovirus recombinantes. Las partículas de baculovirus se amplifican y usan para infectar células de insectos para expresar proteína recombinante. Para la expresión en células de mamífero, se usa un vector que dirigirá la expresión de la construcción en la célula hospedadora de mamífero deseada (por ejemplo, células de ovario de hámster chino).
Los polipéptidos de ectodominio de la proteína RSV F pueden purificarse usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, se conocen en la técnica procedimientos para purificar polipéptidos de ectodominio de RSV F mediante cromatografía de inmunoafinidad. Ruiz-Arguello y col., J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004). Los procedimientos adecuados para purificar proteínas deseadas, incluyendo precipitación y diversos tipos de cromatografía, tales como de interacción hidrófoba, de intercambio iónico, de afinidad, quelante y de exclusión por tamaño se conocen bien en la técnica. Pueden crearse esquemas de purificación adecuados usando dos o más de estos u otros procedimientos adecuados. Si se desea, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F pueden incluir un "marcador" que facilite la purificación, tal como un marcador epitópico o un marcador HIS. Dichos polipéptidos marcados pueden purificarse de manera conveniente, por ejemplo, a partir de medio condicionado, mediante cromatografía quelante o cromatografía de afinidad.
Los polipéptidos de RSV F también pueden producirse in situ mediante expresión de ácidos nucleicos que los codifican en las células de un sujeto. Por ejemplo, mediante la expresión de un ARN autorreplicante descrito en el presente documento.
Los polipéptidos pueden incluir secuencias adicionales, además de las secuencias de RSV. Por ejemplo, un polipéptido puede incluir una secuencia para facilitar la purificación (por ejemplo, una secuencia de poli-His). De igual forma, para fines diagnósticos, puede sustituirse el péptido líder natural de la proteína F por otro diferente. Por ejemplo, la referencia 6 usó un péptido líder de melitina de la abeja melífera en lugar del natural.
Forma y conformación de polipéptidos
La invención incluye composiciones inmunogénicas que incluyen cualquiera de las formas y conformaciones de los polipéptidos de RSV F y de las proteínas desveladas en el presente documento, incluyendo cualquier combinación deseada de las formas y conformaciones de los polipéptidos de RSV F y de las proteínas desveladas en el presente documento. El polipéptido de RSV F puede ser un monómero, o la proteína RSV F puede ser un trímero que comprende tres péptidos monoméricos. Los trímeros pueden ser monodispersos o pueden estar en forma de una roseta, por ejemplo, debido a interacciones entre los péptidos de fusión de trímeros individuales. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender polipéptidos que son monómeros, trímeros, una combinación de monómeros y trímeros (por ejemplo, en equilibrio dinámico), rosetas de trímeros, y cualquier combinación de los anteriores. Además, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la proteína RSV F puede estar en una conformación post-fusión, una conformación pre-fusión, o una conformación intermedia.
La proteína RSV F puede estar en una conformación pre-fusión, una conformación post-fusión o en una conformación intermedia. Se cree que la "conformación post-fusión" de la proteína RSV F es la conformación de baja energía de RSV F nativa, y es un trímero caracterizado por la presencia de un nudo de seis hélices que comprende 3 regiones HRB y 3 HRA. La conformación post-fusión tiene una forma característica de "muleta" o "tee de golf" mediante microscopía electrónica. La "conformación pre-fusión" de la proteína RSV F es una conformación caracterizada por un trímero que contiene una hélice superenrollada que comprende 3 regiones HRB. El péptido de fusión no está expuesto en la conformación pre-fusión y, por lo tanto, las conformaciones pre-fusión no forman generalmente rosetas, y tienen una forma de "chupachups" o de "bola y tallo" mediante microscopía electrónica.
En algunos aspectos, la proteína RSV F está en la conformación post-fusión. Por ejemplo, la proteína RSV F puede estar en forma de un trímero monodisperso en la conformación post-fusión, o en forma de una roseta compuesta de trímeros post-fusión.
En algunas realizaciones, el polipéptido de RSV F es un monómero. En algunas realizaciones, el polipéptido de RSV F es un trímero.
En otros aspectos, la proteína RSV F está en la conformación pre-fusión. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría concreta, se cree que la conformación pre-fusión o las formas intermedias de la proteína RSV F pueden contener
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epítopos que son los mismos que aquellos en la proteína RSV F expresada en viriones de RSV naturales, y por lo tanto proporcionan ventajas para suscitar anticuerpos neutralizantes.
Algunos aspectos de la invención usan un polipéptido que desfavorece la conformación post-fusión de la proteína F. Preferentemente, los polipéptidos (en su totalidad o en parte) mostrarán un epítopo de la proteína F pre-fusión o cualquier epítopo de una conformación intermedia en la conversión desde la conformación pre-fusión a la conformación post-fusión. Estos polipéptidos pueden ser proteínas F nativas o mutadas en un estado pre-fusión, pueden ser proteínas F nativas o mutadas en una conformación intermedia, o pueden ser una población de proteínas nativas o mutadas donde se ha desfavorecido o preferentemente excluido la conformación post-fusión. En determinados casos, la proteína nativa o mutada puede combinarse con una o más moléculas adicionales que asisten en el mantenimiento de los polipéptidos en uno de los estados anteriores, tales como un anticuerpo monoclonal que se une preferentemente a la conformación pre-fusión o a una conformación intermedia. Además, los polipéptidos pueden ser derivados de proteínas F nativas. Dichos derivados incluyen polipéptidos que comprenden uno o más fragmentos de una proteína F nativa, polipéptidos de fusión que comprenden una proteína F nativa (o un fragmento de la misma) y una secuencia heteróloga, y polipéptidos que comprenden una secuencia de proteína F nativa que tiene una o más mutaciones. Estas (u otras) modificaciones pueden desfavorecer la conformación postfusión. Las estrategias ejemplares para desfavorecer la conformación post-fusión incluyen la estabilización de la conformación pre-fusión, estabilizar una conformación intermedia, desestabilizar la conformación post-fusión o aumentar la barrera de activación de una o más etapas que den lugar a la conformación post-fusión.
En otra realización, la invención es un polipéptido que muestra al menos un epítopo que es específico de la proteína F con conformación pre-fusión o una proteína F con conformación intermedia. Un epítopo que sea específico a la proteína F en conformación pre-fusión o una proteína F en conformación intermedia es un epítopo que no se presenta en la conformación post-fusión. Se prefiere que se presente al menos un epítopo de manera estable, por ejemplo, el epítopo se presenta de manera estable en solución durante al menos doce horas, al menos un día, al menos dos días, al menos cuatro días, al menos seis días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos cuatro semanas, o al menos seis semanas.
Dichos polipéptidos pueden ser proteínas F nativas o mutadas en el estado pre-fusión, en un estado intermedio o en una población de estados donde el estado post-fusión está menos representado o en un porcentaje menor que para las proteínas F nativas aisladas, o puede ser un derivado de una proteína F nativa. Dichos derivados incluyen polipéptidos que comprenden uno o más fragmentos de una proteína F nativa, polipéptidos de fusión que comprenden una proteína F nativa (o un fragmento de la misma) y una secuencia heteróloga, y polipéptidos que comprenden una secuencia de proteína F nativa que tiene una o más mutaciones. Estas (u otras) modificaciones pueden estabilizar una secuencia de aminoácidos de proteína F en su conformación pre-fusión, estabilizar una secuencia de aminoácidos de proteína F en una conformación intermedia, desestabilizar la conformación post-fusión de una secuencia de aminoácidos de proteína F, aumentar la barrera de energía en una transición que dé lugar a la conformación post-fusión de una secuencia de aminoácidos de proteína F, o una combinación de dos o más de los anteriores.
Los dominios TM y/o CT de las proteínas F son importantes para la estabilidad de la conformación pre-fusión (8). Por lo tanto, estos dominios pueden retenerse de manera útil en los inmunógenos de la invención. Ya que puede ser deseable no incluir dominios transmembrana en los inmunógenos solubles, sin embargo, el efecto funcional de TM puede lograrse por otros medios. Por ejemplo, se ha estudiado con cierto grado de detalle el comportamiento pre y post-fusión de la proteína F del virus 5 de parainfluenza (6), y los autores estabilizaron la estructura pre-fusión de ED fusionando un dominio de trimerización heterólogo al extremo C-terminal del ED.
Dominio de oligomerización
En otra realización de la invención, la composición puede comprender un polipéptido (por ejemplo, polipéptido recombinante) que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en la que (i) el primer dominio comprende la proteína RSV F (por ejemplo, ectodominio de RSV, en su totalidad o en parte), y (ii) el segundo dominio comprende un dominio de oligomerización heterólogo. El segundo dominio permite la oligomerización del polipéptido, facilitando de este modo que el primer dominio adopte un estado pre-fusión o un estado intermedio. El polipéptido estará presente preferentemente en forma de un oligómero, y en particular en forma de un trímero.
Hay varios dominios de oligomerización disponibles para el experto en la materia. Estos son secuencias de aminoácidos que pueden formar una estructura que puede interactuar con dominios de oligomerización (ya sean los mismos o diferentes) en otros polipéptidos (ya sean iguales o diferentes) de tal forma que múltiples polipéptidos pueden asociarse (normalmente de manera no covalente) para formar oligómeros, por ejemplo, trímeros. Por ejemplo, se ha logrado la trimerización de la proteína F de VIH (por ejemplo, gp160) fusionándola a la subunidad catalítica de la aspartato transcarbamoilasa de E. coli (ATCasa), que es un trímero estable de manera natural (9). Por lo tanto, esta subunidad de ATCasa puede usarse con la presente invención. De igual forma, se ha logrado la trimerización de las proteínas F de VIH (10) y PIV5 (6) fusionando sus ectodominios a GCNt. Por lo tanto, el dominio de oligomerización usado con la presente invención puede comprender la hélice superenrollada de la proteína de cremallera de leucina GCN4 de levadura (11). La trimerización del ectodominio de la proteína HA del virus de la gripe A se ha logrado usando una secuencia trimerizante (’foldon’) de fibritina de bacteriófago T4
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El colágeno también proporciona otra clase de dominio de oligomerización. La referencia 26 describe un motivo encontrado en el dominio 1 no colagenoso (NC1) del colágeno de tipo X, y este motivo puede usarse para la formación de trímeros y multímeros de mayor orden sin una triple hélice. Esta asociación trimérica es altamente termoestable sin enlaces disulfuro intermoleculares. Por lo tanto, el dominio de oligomerización puede comprender una secuencia NCI.
Otros dominios de oligomerización pueden proceder de los dominios transmembrana de proteínas TM oligoméricas. Ya que estas son normalmente lipófilas, los restos hidrófobos situados en el exterior de sus regiones TM pueden sustituirse por restos cargados, para proporcionar un dominio soluble. Dichos procedimientos para solubilizar dominios transmembrana por ingeniería genética de proteína se conocen en la técnica, por ejemplo, a partir de la referencia 27. Este procedimiento también se ha usado para GCN4, donde las posiciones "a" y "d" de la repetición de la héptada se reemplazaron con isoleucina (11):
KQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEC ID Nº: 20). Las secuencias de hélice superenrollada adecuadas para su uso en el dominio de oligomerización tendrán normalmente entre 20 y 35 aminoácidos de longitud, por ejemplo, de 23 a 30 restos de aminoácidos de longitud.
Los dominios de oligomerización usados con la invención pueden mantener generalmente una estructura oligomérica sin la necesidad de la formación de puentes disulfuro entre monómeros, pero no se excluyen de la invención oligómeros que contienen monómeros unidos mediante disulfuro.
Como alternativa, o además de usar un dominio de oligomerización para estabilizar la proteína F en su conformación pre-fusión, puede usarse mutación. Por ejemplo, la referencia 28 comunica que la mutación en una región conservada de la subunidad F2 de las proteínas F en el virus 5 de simio o del virus hendra puede influenciar la estabilidad de la conformación pre-fusión.
En algunas circunstancias también puede usarse un pH bajo para favorecer la conformación pre-fusión.
Estabilización del trímero de dominio HRB
En otro aspecto preferido de la presente invención, la conformación post-fusión de la proteína F puede verse desfavorecida por la estabilización del trímero de dominio HRB. El dominio HRB forma una hélice superenrollada de tres hebras en la forma de pre-fusión y probablemente en la intermedia. Tal como se ha discutido en la sección precedente, debido a su simplicidad, las hélices superenrolladas se han estudiado exhaustivamente como sistemas modelo para interacciones intermoleculares entre proteínas y como sistemas modelo para interacciones intramoleculares de espectro más amplio (es decir, interacciones de plegamiento terciario). Estos estudios son útiles para enseñar los procedimientos que pueden usarse para estabilizar el dominio HRB en la forma de hélice superenrollada trimérica. A modo de ejemplo, pueden reemplazarse uno o más restos de las posiciones a y/o d de la repetición de héptada con restos que favorecen la formación de hélices superenrolladas triméricas estables, tales como restos de Ile. Además, aunque menos preferidos, pueden eliminarse interacciones iónicas desfavorables en las posiciones e y g o pueden añadirse interacciones iónicas favorables en las posiciones e y g.
La región preferida del dominio HRB para la manipulación es la repetición de héptada entre P484-N517. Los ejemplos preferidos de restos de a y d como diana para mutaciones son F488, I492, V495, I499, S502, I506, S509, L512, y V516. Los restos de serina se prefieren especialmente ya que el reemplazo de restos hidrófilos con restos hidrófobos podría estabilizar el núcleo hidrófobo de la hélice superenrollada. Otra diana preferida podría ser la fenilalanina con un resto hidrófobo más pequeño que podría empaquetarse mejor en el núcleo, tal como una isoleucina.
Desestabilización del trímero de dominio HRA
En otro aspecto preferido de la presente invención, la conformación post-fusión de la proteína F puede verse desfavorecida por la desestabilización del trímero de dominio HRA. El dominio HRA forma una hélice superenrollada de tres hebras en la forma post-fusión y posiblemente una o más formas intermedias. A modo de ejemplo, pueden reemplazarse uno o más restos de las posiciones a y/o d de la repetición de héptada con restos que desfavorecen la formación de hélices superenrolladas triméricas estables. Además, aunque menos preferidos, pueden eliminarse interacciones iónicas favorables en las posiciones e y g o pueden añadirse interacciones iónicas desfavorables en las posiciones e y g. Preferentemente, dichas mutaciones se seleccionarán de tal modo que tengan un impacto mínimo en la estabilidad del dominio HRA en la conformación pre-fusión tal como puede modelarse basándose en las estructuras cristalinas disponibles de la proteína PIV5 F en las formas pre-fusión y post-fusión.
Otras modificaciones
Además de las modificaciones anteriores, pueden diseñarse además modificaciones basándose en el modelado molecular de las proteínas hRSV F basándose en las estructuras cristalinas disponibles de la proteína PIV5 F en las formas de pre-fusión y post-fusión. Pueden efectuarse mutaciones que desestabilicen la conformación post-fusión, tales como el plegamiento 6HB de los dominios HRA y HRB o que estabilicen la conformación pre-fusión, tal como el plegamiento HRA en la conformación pre-fusión. Además, puede aumentarse la barrera de energía de las
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transiciones que dan lugar a la conformación post-fusión. Aunque un experto en la materia apreciará que la estabilización de la conformación inicial o la desestabilización de la conformación final pueden tener el efecto de aumentar la barrera de energía, pueden introducirse otras modificaciones que afecten al estado de transición en sí mismo.
Como ejemplo adicional, los aminoácidos N-terminales del dominio HRB (aproximadamente los a.a. 449-482, preferentemente V459-F483) actúan como "anclaje" que permiten que el dominio HRB cambie de un lado del trímero de la proteína F al otro lado de tal forma que el dominio HRB pueda participar en el 6HB de la conformación postfusión.
La eliminación de uno o más de estos aminoácidos impedirá o prevendrá directamente la participación del dominio HRB en el plegamiento 6HB de la conformación post-fusión de la proteína F (véase la figura 3). Además, la interacción entre el anclaje y la proteína F en la conformación pre-fusión puede estabilizarse para prevenir que tire el anclaje para permitir que el dominio HRB participe en el plegamiento 6HB. Los ejemplos de mutaciones estabilizantes que pueden producirse son puentes de cisteína entre el anclaje y la porción de la proteína F con la que el anclaje entra en contacto en la conformación pre-fusión.
Otro ejemplo más es la estabilización del HRA en la conformación pre-fusión (restos T50-Y306). Igualmente, basándose en las estructuras cristalinas de proteínas F homólogas, el núcleo hidrófobo puede estabilizarse reemplazando restos hidrófilos o iónicos enterrados con restos hidrófobos de tamaño similar. También, pueden introducirse puentes de cisteína en la superficie o en el núcleo. Además, tal como se demostró mediante un análisis exhaustivo de la estructura cristalina de mutantes de lisozima, los núcleos hidrófobos de las proteínas son relativamente rígidos y por lo tanto la introducción de agujeros desestabilizó de manera predecible a los mutantes de lisozima. De igual forma, el reempaquetamiento del núcleo de la proteína F en la conformación pre-fusión para eliminar cualquier agujero natural estabiliza a la proteína F en las formas pre-fusión o intermedias, de este modo desfavoreciendo la conformación post-fusión.
Procedimientos para preparar composiciones
La divulgación se refiere a procedimientos para preparar composiciones y a composiciones que comprenden proteína RSV F, en particular polipéptidos de ectodominio de RSV F solubles, incluyendo composiciones inmunogénicas. Preferentemente, los polipéptidos de ectodominio de RSV F se encuentran en una sola forma, tal como monómeros no escindidos, trímeros no escindidos, trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos, o en un equilibrio dinámico entre un subconjunto de dichas formas (por ejemplo, equilibrio entre monómeros no escindidos y trímeros escindidos). La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, como se describen en este documento, la invención proporciona procedimientos para producir composiciones que contienen una forma deseada predominante de la proteína RSV F, o una sola forma deseada de la proteína RSV F, tal como monómeros no escindidos, trímeros no escindidos, trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos, un equilibrio dinámico entre un subconjunto de dichas formas (por ejemplo, equilibrio entre monómeros no escindidos y trímeros escindidos), o una mezcla de formas deseadas de la proteína RSV F. Estos tipos de composiciones pueden usarse para una diversidad de fines, tales como, en la producción de composiciones inmunogénicas que pueden usarse para producir vacunas. La presencia de una sola forma deseada de RSV F, o de un equilibrio dinámico entre formas conocidas, en una composición inmunogénica, proporciona una formulación, solubilidad y estabilidad más predecibles, y una respuesta inmunitaria más predecible cuando se administra la composición a un sujeto.
Cuando los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F se producen mediante expresión recombinante convencional en células hospedadoras, los polipéptidos se escinden en los sitios de escisión de furina aproximadamente en la posición 109/110 y aproximadamente en la posición 136/137 durante la producción en la célula hospedadora antes de que se secreten al medio de cultivo. La escisión de los polipéptidos por las células permite el replegamiento del polipéptido de ectodominio de proteína RSV F, lo que da como resultado la exposición del péptido de fusión hidrófobo. Por consiguiente, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F escindidos, debido a la presencia de un péptido de fusión expuesto, forman rosetas y se asocian con lípidos y lipoproteínas que proceden de las células hospedadoras y del medio de cultivo. De hecho, la microscopía electrónica de ectodominios de RSV F que se producen en células de insecto y se purifican mediante un marcador HIS6 mostró que los polipéptidos tenían una forma de muleta, coherente con una forma post-fusión y se unieron a lo que parecían ser restos celulares residuales. Por consiguiente, no pueden obtenerse fácilmente preparaciones de alta pureza de rosetas y otras formas y conformaciones de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F mediante expresión recombinante convencional en células hospedadoras.
Procedimientos para producir polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F escindidos
En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar una composición que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F escindidos. En general, el procedimiento implica proporcionar polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos y después escindirlos para producir una subunidad F1 y una subunidad F2. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos pueden purificarse y separarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas contaminantes usando procedimientos adecuados, tal como cromatografía de exclusión por tamaño. Sin desear quedar ligado a ninguna
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teoría concreta, se cree que el péptido de fusión hidrófobo no está expuesto en los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos y, por lo tanto, los polipéptidos no escindidos no se asocian con lípidos y lipoproteínas contaminantes. Tal como se describe además en el presente documento, los ectodominios de proteína RSV F no escindidos pueden escindirse para producir subunidades F1 y F2, que pueden purificarse en forma de trímeros, rosetas de trímeros, o una mezcla de trímeros y rosetas de trímeros.
Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos pueden producirse usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, mediante producción recombinante en células hospedadoras que no contienen furina o proteasas similares a furina en el momento en que los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F se están produciendo. Puede usarse una diversidad de procedimientos para lograr este procedimiento de producción, tales como, producción en células hospedadoras recombinantes que se mutan para evitar la expresión de furina o proteasas similares a furina (de manera condicional o "knockout" completo), y diversos procedimientos que reducen o previenen la expresión de furina o proteasas similares a furina en las células hospedadoras, por ejemplo, usando interferencia de ARN u otros procedimientos similares, o inhibiendo la actividad de furina o de proteasas similares a furina en células hospedadoras usando inhibidores de las proteasas.
Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos se producen preferentemente mediante expresión recombinante de construcciones que codifican un ectodominio de proteína RSV F en el que están alteradas las secuencias de aminoácidos de los sitios de escisión de furina, de tal forma que los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F se secretan por una célula hospedadora que produce los polipéptidos no escindidos. Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos pueden producirse usando cualquier célula hospedadora adecuada, tales como células de insecto (por ejemplo, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni), células de mamífero (por ejemplo, ser humano, primate no humano, caballo, vaca, oveja, perro, gato, y roedor (por ejemplo, hámster), células de ave (por ejemplo, pollo, pato, y oca), bacterias (por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp.), células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenual polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica), células de Tetrahymena (por ejemplo, Tetrahymena thermophila) o combinaciones de las mismas. Se conocen bien en la técnica muchas células de insecto y células de mamífero adecuadas. Las células de insecto adecuadas incluyen, por ejemplo, células Sf9, células Sf21, células Tn5, células Schneider S2, y células High Five (un aislado clonal procedente de la línea celular BTI-TN-5B1-4 de Trichoplusia ni (Invitrogen)). Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (células HEK293, típicamente transformadas con ADN de adenovirus de tipo 5 cortado), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, células HeLa, células PERC.6 (número de depósito ECACC 96022940), células Hep G2, MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células de pulmón de resus fetal (ATCC CL-160), células de riñón bovino Madin-Darby ("MDBK"), células de riñón canino Madin-Darby ("MDCK") (por ejemplo, MDCK (NBL2), ATCC CCL34; o MDCK 33016, DSM ACC 2219), células de riñón de cría de hámster (BHK), tales como BHK21-F, células HKCC, y similares. Las células de ave adecuadas incluyen, por ejemplo, células madre embrionarias de pollo (por ejemplo, células EBx®), fibroblastos embrionarios de pollo, células germinales embrionarias de pollo, células de pato (por ejemplo, las líneas celulares AGE1.CR y AGE1.CR.pIX (ProBioGen) que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y en el documento WO2005/042728), células EB66, y similares.
Los sistemas de expresión en células de insecto adecuados, tales como los sistemas de baculovirus, son conocidos por los expertos en la materia y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin n.º 1555 (1987). Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión en baculovirus/células de insecto están comercialmente disponibles en forma de kit a través de, entre otras cosas, Invitrogen, San Diego CA. Los sistemas de expresión en células de ave también son conocidos por los expertos en la materia y se describe en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 5.340.740; 5.656.479; 5.830.510; 6.114.168; y 6.500.668; la Patente Europea n.º EP 0787180B; la Solicitud de Patente Europea n.º EP03291813.8; documentos WO 03/043415; y WO 03/076601. De igual forma, también se conocen en la técnica sistemas de expresión en células bacterianas y de mamífero y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr y col., eds., 1989) Butterworths, Londres.
En general, la secuencia de aminoácidos de un ectodominio de proteína RSV F no escindido se altera para prevenir la escisión en los sitios de escisión de furina aproximadamente en la posición 109/110 y aproximadamente en la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de proteasa de origen natural o introducir, que cuando se escinde produce una subunidad F1 y una subunidad F2. Por ejemplo, el polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido puede tener una secuencia de aminoácidos que esté alterada para prevenir la escisión en los sitios de escisión de furina aproximadamente en la posición 109/110 y aproximadamente en la posición 136/137, pero contener uno o más sitios de escisión de proteasas de origen natural o introducidos entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161.
Pueden diseñarse fácilmente y preverse por un experto habitual en la materia una diversidad de secuencias de aminoácidos particulares que permitirán que los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos se produzcan y expresen por células hospedadoras, incluyendo secuencias de aminoácidos que no se escinden en los sitios de escisión de furina aproximadamente en la posición 109/110 y aproximadamente en la posición 136/137. En general, se reemplazan o eliminan uno o más aminoácidos que forman parte de, o se localizan próximos a, los sitios
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que no se ha sustituido o eliminado ninguno de los aminoácidos entre las posiciones 137-154. En algunas realizaciones, se purifican los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos proporcionados. Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos proporcionados que contienen un péptido de fusión intacto se escinden, y la escisión da como resultado la formación de rosetas de trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F escindido. Si se desea, las rosetas pueden purificarse adicionalmente usando cualquier procedimiento adecuado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño.
En otro ejemplo del procedimiento, se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos que contienen un péptido de fusión alterado, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en el que los aminoácidos aproximadamente 137-152, aproximadamente los aminoácidos 137-153, aproximadamente los aminoácidos 137-145 o aproximadamente los aminoácidos 137-142 están eliminados. También se han descrito otras eliminaciones de péptido de fusión adecuadas, tales como la eliminación de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello y col., J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004).
En algunas realizaciones, se purifican los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos proporcionados. Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos se escinden, y la escisión da como resultado la formación de trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F escindidos. Si se desea, los trímeros pueden purificarse adicionalmente usando cualquier procedimiento adecuado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño.
En ejemplos particulares del procedimiento, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos proporcionados contienen al menos un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en furdel y delp23 furdel (por ejemplo, furdel homogéneo escindible por tripsina, delp23 furdel homogéneo escindible por tripsina, o una mezcla de furdel escindible por tripsina y delp23 furdel escindible por tripsina). Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos se escinden, por ejemplo con tripsina, y la escisión da como resultado la formación de trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos, o una combinación de trímeros escindidos y rosetas de trímeros escindidos de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F. Si se desea, los trímeros escindidos y/o rosetas de trímeros escindidos pueden purificarse adicionalmente usando cualquier procedimiento adecuado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño.
Procedimientos para producir polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos
En otro aspecto, la divulgación es un procedimiento para preparar una composición que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos. En general, el procedimiento implica proporcionar un material biológico que contenga los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos, tal como un lisado celular, homogenizado celular o medio condicionado de cultivo celular, y después purificar los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos. Tal como se describe en el presente documento, se ha descubierto que los monómeros de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido purificados pueden autoasociarse para formar trímeros no escindidos, y que hay una mezcla de monómeros no escindidos y de trímeros no escindidos o un equilibrio entre los monómeros no escindidos y los trímeros no escindidos. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría concreta, se cree que el equilibrio favorece al monómero, pero que el equilibrio se desplazará hacia el trímero en soluciones concentradas.
El procedimiento de este aspecto de la divulgación incluye a) proporcionar un material biológico que contenga los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos, tal como un lisado celular, homogenizado celular o medio condicionado de cultivo celular; y b) purificar los monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido a partir del material biológico. En algunas realizaciones, se purifican los monómeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos, o se purifican los trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos, o se purifican los monómeros y trímeros.
En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ectodominio de RSV F no escindidos contiene sitios de escisión de furina alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F se secretan por una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161 (incluyendo en los sitios de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 131-136). El material biológico que contiene polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido incluye delp23 furdel. El material biológico también puede contener polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos; incluyendo al menos un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en furmt, furdel, delp21 furx, delp23 furx, delp21 furdel, y la construcción de factor Xa, que puede escindirse usando factor Xa.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ectodominio de RSV F contiene sitios de escisión de furina alterados, y otros sitios de escisión de proteasas (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se alteran o eliminan para prevenir la escisión por proteasas (por ejemplo, tripsina). Por ejemplo, es bien conocido que la tripsina escinde después de restos de lisina y arginina. En determinadas realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ectodominio de RSV F no escindido contiene sitios de escisión de furina alterados, uno o más restos de lisina y/o arginina (por ejemplo, todos los restos de lisina y arginina) presentes entre aproximadamente la posición 101 y
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aproximadamente la posición 161 se eliminan o reemplazan con un aminoácido que no es lisina o arginina, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F se secretan por una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161. Preferentemente, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no se escinden por tripsina cuando se trata una solución de 1 mg/ml de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F (diluida en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM) con un volumen uno-mil de solución de tripsina (tripsina de plasma bovino diluida a una concentración de 1 mg/ml en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM; la relación final de masas en la digestión es 0,001:1 tripsina:ectodominio de RSV F; la tripsina se usa a 10-15 unidades BAEE por mg de proteína) durante 1 hora a 37 °C.
Si se desea, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos (por ejemplo, los polipéptidos que contienen sitios de escisión de furina alterados, y el polipéptido que contiene sitios de escisión de furina alterados y sitios de escisión de tripsina alterados) pueden contener además un péptido de fusión alterado, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en el que, por ejemplo, están eliminados aproximadamente los aminoácidos 137-152, están eliminados aproximadamente los aminoácidos 137-154, están eliminados aproximadamente los aminoácidos 137-145 o están eliminados aproximadamente los aminoácidos 137
142. También se han descrito otras eliminaciones de péptido de fusión adecuadas, tales como la eliminación de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello y col., J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004).
En realizaciones particulares de la divulgación, el procedimiento incluye a) proporcionar un material biológico que contenga los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos, tal como un lisado celular, homogenizado celular o medio condicionado de cultivo celular, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ectodominio de RSV F no escindido contiene sitios de escisión de furina alterados, los restos de lisina y arginina presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se eliminan o reemplazan con un aminoácido que no es lisina o arginina, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F se secretan por una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161; y b) purificar los monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido a partir del material biológico.
En ejemplos más particulares, el material biológico que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos incluye al menos un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en Furx, Furx R113Q K123N K124N, delp21 furx y delp23 furx.
En otras realizaciones particulares de la divulgación, el procedimiento incluye a) proporcionar un material biológico que contenga los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en el que el péptido de fusión está mutado (por ejemplo, al menos una porción del péptido de fusión está eliminada), tal como un lisado celular, homogenizado celular o medio condicionado de cultivo celular; y b) purificar polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos a partir del material biológico. El polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido puede contener sitios de escisión de furina alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F se secretan por una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161 (incluyendo en los sitios de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 131136). Si se desea, el polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido con sitios de escisión de furina alterados contiene además sitios alterados o eliminados para otras proteasas (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 para evitar la escisión por proteasas (por ejemplo, tripsina). Por ejemplo, uno o más restos de lisina y/o arginina (por ejemplo, todos los restos de lisina y arginina) presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se eliminan o reemplazan con un aminoácido que no es lisina o arginina, y los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161.
Los monómeros, trímeros y combinaciones de monómeros y trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindidos pueden purificarse hasta el grado deseado. Generalmente se prefiere que se purifiquen los monómeros o trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindida, por ejemplo, para que sean al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Por consiguiente, el procedimiento puede emplearse para producir fácilmente una composición que contiene monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptido de proteína RSV F escindidos que está sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas.
En un ejemplo, el procedimiento incluye proporcionar medio condicionado de cultivo de células de insecto, medio condicionado de cultivo de células de mamífero, medio condicionado de células de ave, medio condicionado de células de levadura, medio condicionado de células de Tetrahymena, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se purifican los trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos. En otras
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contiene un sitio de escisión de proteasa de origen natural o introducir, que cuando se escinde produce una subunidad F1, en la que el extremo amino terminal es de la posición 110 a aproximadamente la posición 161, y una subunidad F2. Por ejemplo, el polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en C-terminal puede tener una secuencia de aminoácidos que esté alterada para prevenir la escisión en los sitios de escisión de furina aproximadamente en la posición 136/137, pero contener uno o más sitios de escisión de proteasas de origen natural
o introducidos entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161. En un ejemplo particular, la secuencia de aminoácidos de un ectodominio de proteína RSV F no escindido en C-terminal está alterado para prevenir la escisión en el sitio de escisión de furina aproximadamente en la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de furina de origen natural aproximadamente en la posición 109/110.
Pueden diseñarse fácilmente y preverse por un experto habitual en la materia una diversidad de secuencias de aminoácidos particulares que permitirán que los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en Cterminal se produzcan y expresen por células hospedadoras, incluyendo secuencias de aminoácidos que no se escinden en los sitios de escisión de furina aproximadamente en la posición 136/137. En general, se reemplazan o eliminan uno o más aminoácidos que forman parte de, o se localizan próximos a, los sitios de escisión de furina aproximadamente en la posición 136/137. Las sustituciones y eliminaciones de aminoácidos que previenen la escisión aproximadamente en la posición 136/137 se describen en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse la sustitución K131Q, la eliminación de los aminoácidos en las posiciones 131-134 o las sustituciones K131Q/R133Q/ R135Q/R136Q, cada una de las cuales inhibe la escisión en 136/137. En determinadas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal comprenden al menos una sustitución o eliminación de aminoácidos aproximadamente en las posiciones 133-136.
De manera similar, son posibles y pueden diseñarse y preverse fácilmente una diversidad de secuencias de aminoácidos particulares de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal que contienen un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, de origen natural o introducido) que cuando se escinden producen una primera subunidad que comprende F1 y una segunda subunidad que comprende F2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína RSV F entre aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161 contiene sitios de escisión de tripsina, y uno o más de los sitios de escisión de tripsina pueden escindirse con tripsina para generar subunidades F1 y F2. Si se desea, pueden introducirse uno o más sitios de reconocimiento de proteasas adecuados en el polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en Cterminal, por ejemplo, entre aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161. Los sitios de reconocimiento de proteasas pueden escindirse usando la proteasa adecuada para generar subunidades F1 y F2. Cuando se introduce un sitio de reconocimiento de proteasa en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en C-terminal, se prefiere que el sitio se reconozca por una proteasa que no escinda el ectodominio de la proteína RSV F de origen natural.
Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal pueden producirse usando cualquier procedimiento adecuado. Un procedimiento preferido es mediante la expresión recombinante de construcciones que codifican un ectodominio de proteína RSV F en el que está alterada la secuencia del sitio de escisión de furina aproximadamente en las posiciones 136/137, de tal forma que los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal se secretan por una célula hospedadora que produce los polipéptidos no escindidos en el sitio de escisión de furina aproximadamente en la posición 136/137. Preferentemente, el polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en C-terminal se secreta por una célula hospedadora que lo produce en forma de una subunidad F1 que se asocia con una subunidad F2, en el que el extremo amino terminal de la subunidad F1 es de la posición 132 a aproximadamente la posición 161, pero no la posición 137. Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal pueden producirse usando cualquier célula hospedadora adecuada, tal como se describe en el presente documento.
Un procedimiento de este aspecto de la divulgación incluye: a) proporcionar polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal que comprenden un sitio de escisión de furina alterado en la posición 136/137, y dichos polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal se secretan por una célula que los produce en forma de un fragmento F2 que se asocia con una subunidad que comprende F1 pero que no está escindida en la posición 136/137, y b) escindir los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal proporcionados con una proteasa que escinde el ectodominio de proteína RSV F en un sitio entre las posiciones 101 y 106, produciendo de este modo dicha composición. En realizaciones particulares, la etapa b) comprende escindir los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal con una proteasa que escinde el ectodominio de proteína RSV F en un sitio entre aproximadamente las posiciones 101 y 132, o aproximadamente las posiciones 132 y 161, o aproximadamente las posiciones 110 y 132. Como alternativa o además, en algunas realizaciones, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal comprenden un sitio de escisión de furina alterado en la posición 136/137, con la salvedad que el sitio de escisión de furina alterado no sea una eliminación de los aminoácidos 131-134. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal incluye al menos el extremo polipéptido de furina N-terminal.
Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal proporcionados pueden purificarse hasta un grado deseado. Por ejemplo, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en Cterminal proporcionados pueden proporcionarse en un lisado celular, homogenizado celular, o medio de cultivo
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condicionado que está sustancialmente sin procesar (por ejemplo, sin procesar, o solo rebajado), o en forma parcial
o sustancialmente purificada. En ejemplos particulares, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal se proporcionan en medio de condicionado de cultivo celular seleccionado entre el grupo que consiste en medio condicionado de células de insecto, medio condicionado de células de mamífero, medio condicionado de células de ave, medio condicionado de células de levadura, medio condicionado de células de Tetrahymena, y combinaciones de los mismos.
Generalmente se prefiere que los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal proporcionados estén purificados, por ejemplo, purificados hasta al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, mientras que las formas escindidas producidas de manera convencional de la proteína RSV F se purifican conjuntamente con lípidos y lipoproteínas contaminantes. Por consiguiente, cuando se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal purificados, puede usarse el procedimiento para producir fácilmente una composición que contenga ectodominios de proteína RSV F escindidos que esté sustancialmente libre de lípidos o fosfolípidos.
Los procedimientos adecuados para escindir polipéptidos usando una proteasa se conocen bien y son convencionales en la técnica. En general, los polipéptidos que van a escindirse se combinan con una cantidad suficiente de proteasa en condiciones (por ejemplo, pH, concentración de polipéptido y proteasa, temperatura) adecuadas para la escisión del polipéptido. Hay disponibles comercialmente muchas proteasas adecuadas, y las condiciones adecuadas para llevar a cabo la escisión de polipéptidos se conocen bien para muchas proteasas. Si se desea, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F pueden purificarse después de la escisión con proteasa.
En un ejemplo del procedimiento, se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal que contienen un péptido de fusión intacto, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en C-terminal en el que no se ha sustituido o eliminado ninguno de los aminoácidos entre las posiciones 137-154. En otro ejemplo del procedimiento, se proporcionan polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal que contienen un péptido de fusión alterado, tal como un polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en C-terminal en el que los aminoácidos aproximadamente 137-152, aproximadamente los aminoácidos 137-153, aproximadamente los aminoácidos 137-145 o aproximadamente los aminoácidos 137-142 están eliminados. También se han descrito otras eliminaciones de péptido de fusión adecuadas, tales como la eliminación de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello y col., J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004).
En algunas realizaciones, se purifican los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en Cterminal proporcionados. Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos se escinden, y la escisión da como resultado la formación de trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F escindidos. Si se desea, los trímeros pueden purificarse adicionalmente usando cualquier procedimiento adecuado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño.
En ejemplos particulares del procedimiento, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en Cterminal proporcionados contienen al menos el polipéptido de furina N-terminal (FIG. 1). Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal proporcionados se escinden, por ejemplo con tripsina, y la escisión da como resultado la formación de trímeros escindidos, rosetas de trímeros escindidos, o una combinación de trímeros escindidos y rosetas de trímeros escindidos de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F. Si se desea, los trímeros escindidos y/o rosetas de trímeros escindidos pueden purificarse adicionalmente usando cualquier procedimiento adecuado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño.
Otro procedimiento de este aspecto de la divulgación incluye: a) proporcionar un material biológico, tal como un lisado celular, homogenizado celular o medio condicionado de cultivo celular, que contiene polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal que comprenden un sitio de escisión de furina alterado en la posición 136/137, y dichos polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F solubles se secretan por una célula que los produce en forma de un fragmento F2 que se asocia con una subunidad que comprende F1 pero que no está escindida en la posición 136/137, con la salvedad que el sitio de escisión de furina alterado no sea una eliminación de los aminoácidos 131-134; y b) purificar los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en Cterminal a partir del material biológico, produciendo de este modo la composición. Preferentemente, el extremo amino terminal de la subunidad F1 es desde aproximadamente la posición 110 a aproximadamente la posición 132. Más preferentemente, el extremo amino terminal de la subunidad F1 está aproximadamente en la posición 110. Se prefiere particularmente que el extremo amino terminal de la subunidad F1 no se encuentre en la posición 137. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal incluye al menos el extremo polipéptido de furina N-terminal.
Si se desea, el polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindido en C-terminal contiene además sitios alterados o eliminados para otras proteasas (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 para evitar la escisión por proteasas (por ejemplo, tripsina). Por ejemplo, uno o más restos de lisina y/o arginina (por ejemplo, todos los restos de lisina y arginina) presentes entre
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aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se eliminan o reemplazan con un aminoácido que no es lisina o arginina, y los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161. Los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal pueden contener un péptido de fusión intacto o un péptido de fusión alterado, tal como se describe en el presente documento.
Los monómeros, trímeros y combinaciones de monómeros y trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal pueden purificarse hasta el grado deseado. Generalmente se prefiere que se purifiquen los monómeros o trímeros de polipéptido de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal, por ejemplo, para que sean al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogéneos. Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal pueden purificarse fácilmente de lípidos y lipoproteínas, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Por consiguiente, el procedimiento puede emplearse para producir fácilmente una composición que contiene polipéptidos de proteína RSV F no escindidos en C-terminal, por ejemplo, monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros que está sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas. En ejemplos particulares del procedimiento, los polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal contienen al menos el polipéptido de furina N-terminal (FIG. 1).
En un ejemplo, el procedimiento incluye proporcionar medio condicionado de cultivo de células de insecto, medio condicionado de cultivo de células de mamífero, medio condicionado de células de ave, medio condicionado de células de levadura, medio condicionado de células de Tetrahymena o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se purifican los trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en Cterminal. En otras realizaciones, se purifican los monómeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal. En otras realizaciones, se purifican los monómeros y trímeros de polipéptidos de ectodominio de proteína RSV F no escindidos en C-terminal.
ARN autorreplicante
Los polipéptidos de RSV F descritos en el presente documento pueden producirse mediante expresión de ácidos nucleicos recombinantes que codifican los polipéptidos en las células de un sujeto. Los ácidos nucleicos preferidos que pueden administrarse a un sujeto para provocar la producción de polipéptidos RSV F son moléculas de ARN autorreplicante. Las moléculas de ARSN autorreplicante se basan en el ARN genómico de virus de ARN, pero carecen de los genes que codifican una o más proteínas estructurales. Las moléculas de ARN autorreplicantes son capaces de traducirse para producir proteínas no estructurales del virus de ARN y proteínas heterólogas codificadas por el ARN autorreplicante.
El ARN autorreplicante contiene generalmente al menos uno o más genes seleccionados entre el grupo que consiste en replicasa vírica, proteasas víricas, helicasas víricas y otras proteínas víricas no estructurales, y también comprende secuencias de replicación activas en cis en el extremo 5' y 3', y si se desea, secuencias heterólogas que codifican secuencias de aminoácidos deseadas (por ejemplo, una proteína, un antígeno). Puede incluirse un promotor subgenómico que dirija la expresión de la secuencia heteróloga en el ARN autorreplicante. Si se desea, la secuencia heteróloga puede fusionarse en fase a otras regiones codificantes en el ARN autorreplicante y/o puede estar bajo el control de un sitio de entrada a ribosoma interno (IRES).
Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención pueden diseñarse de tal modo que la molécula de ARN autorreplicante no puede inducir la producción de partículas víricas infecciosas. Esto puede lograrse, por ejemplo, omitiendo uno o más genes víricos que codifican proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas víricas en el ARN autorreplicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN autorreplicante está basada en un alfa virus, tal como el virus Sinebis (SIN), el virus del bosque Semliki y el virus de la encefalitis equina venezolano (VEE), pueden omitirse uno o más genes que codifican proteínas estructurales víricas, tales como las glucoproteínas de la cápsida y/o envuelta. Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicantes de la invención pueden diseñarse para inducir la producción de partículas víricas infecciosas que sean atenuadas o virulentas, o para producir partículas víricas que son capaces de una sola ronda de infección posterior.
La molécula de ARN autorreplicante puede, cuando se administra a una célula de vertebrado incluso sin proteínas, dar lugar a la producción de múltiples ARN descendientes a partir de la transcripción de sí mismo (o formar una copia antisentido de sí mismo). El ARN autorreplicante puede traducirse directamente después de la administración a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que después produce transcritos a partir del ARN administrado. Por lo tanto, el ARN administrado da lugar a la producción de múltiples ARN descendientes. Estos transcritos son antisentido en relación al ARN administrado y pueden traducirse por sí mismos para proporcionar expresión in situ de un producto génico, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN administrado que se traducen para proporcionar expresión in situ del polipéptido RSV-F codificado.
Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación es usar un replicón de ARN basado en alfavirus. Estos replicones de hebra + se traducen después de la administración a una célula para proporcionar una replicasa (o
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de trímero F/alumbre (10 μg), o vacuna de RSV inactivado por formalina (5200 FI-ufp). Se recogió suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2sd1) y 35 (2sd2). Se expuso a todos los animales con 1x105 ufp de RSV por vía intranasal en el día 49 y se recogieron los pulmones en el día 54 (5dde) para la determinación de la carga vírica y la patología pulmonar.
Resultados
Tabla 7: Título de IgG en suero específica de F en los días 14 y 35
vacuna dosis
IgG específica de F IgG específica de F
2wp1 2wp2
A317 10 μg
198 1599
A317 1 μg
78 526
CNE17 1 μg
408 4918
CNE17 0,1 μg
325 2512
RV01(01) 1 μg
531 4351
RV01(01) 0,1 μg
134 1033
VRP 5x106 UI
961 5864
Trímero de F/alumbre 10 μg
3526 111893
FI-RSV 5200 FI-ufp
17 2074
Ninguno
5 5
Tabla 7. Títulos de IgG en suero específica de F de ratas del algodón (Sigmodon hispidus), 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2sd1) y 35 (2sd2), se expuso a todos los animales con 1x105 ufp de RSV por vía intranasal en el día 49. Los pulmones se recogieron en el día 54 (5dde) para la determinación de la carga vírica y de la patología pulmonar. Los datos se presentan como la media geométrica de títulos virales de 8 ratas del algodón individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.
Tabla 8: Títulos de neutralización de suero de RSV en los días 14 y 35
vacuna dosis
PRNT60 PRNT60
2wp1 2wp2
A317 10 μg
78 240
A317 1 μg
58 70
CNE17 1 μg
91 269
CNE17 0,1 μg
63 145
RV01(01) 1 μg
103 667
RV01(01) 0,1 μg
46 130
VRP 5x106 UI
149 683
Trímero de F/alumbre 10 μg
142 > 5120
FI-RSV 5200 FI-ufp
28 38
Ninguno
30 <20
Tabla 8. Títulos de neutralización de suero de RSV de ratas del algodón (Sigmodon hispidus), 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis en los días 14 (2sd1) y 35 (2sd2). Los datos se presentan como títulos de neutralización de reducción de placa al 60 %. Media geométrica del título de 2 grupos de 4 ratas del algodón por grupo. Si un animal individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.
Tabla 9: Títulos virales en pulmón 5 días después de exposición a RSV
vacuna
dosis ufp/g pulmón 5dpc
A317
10 μg 397
A317
1 μg 659
80 (continuación)
vacuna dosis
ufp/g pulmón 5dpc
CNE17 1 μg
414
CNE17 0,1 μg
572
RV01(01) 1 μg
445
RV01(01) 0,1 μg
716
VRP 5x106 UI
359
Trímero de F/alumbre 10 μg
190
FI-RSV 5200 FI-ufp
5248
ninguno (expuesta)
728618
Tabla 9: Títulos virales en pulmón 5 días después de la exposición a RSV de ratas del algodón (Sigmodon hispidus), 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se expuso a todos los animales con 1x105 ufp de RSV por vía intranasal en el día 49. Los pulmones se recogieron en el día 54 (5dde) para la determinación de la carga vírica y de la patología pulmonar. Los datos se presentan como unidades formadoras de placa por gramo de pulmón determinadas mediante ensayo de placa. Media geométrica de títulos de 8 ratas del algodón individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <200 (límite de detección) se le asignó un título de 100.

Tabla 10: Puntuaciones de alveolitis en pulmón 5 días después de exposición a RSV
vacuna dosis
n.º de ratas del algodón con la puntuación indicada de alveolitis 0 1 2 3 4
A3171 10 μg
8
A3171 1 μg
8
CNE17 1 μg
8
CNE17 0,1 μg
7 1
RV01(01) 1 μg
6 2
RV01(01) 0,1 μg
8
VRP 5x106 UI
3 4 1
Trímero de F/alumbre 10 μg
7 1
FI-RSV 5200 FI-ufp
1 4 3
ninguno (expuesta)
5 3
Tabla 10. Alveolitis en pulmón 5 días después de la exposición a RSV de ratas del algodón (Sigmodon hispidus), 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se expuso a todos los animales con 1x105 ufp de RSV por vía intranasal en el día 49. Los pulmones se recogieron en el día 54 (5dde) para la determinación de la carga vírica y de la patología pulmonar. Las lesiones se graduaron con una escala semicuantitativa de 4 puntos. Cambio mínimo (1) contenía uno o unos pocos focos pequeños; cambio leve (2) estaba compuesto de focos de tamaño de pequeño a grande; cambio moderado (3) contenía focos frecuentes y/o de tamaño moderado; y cambio marcado (4) mostró focos de extensos a confluentes que afectaban a la mayoría/la totalidad del tejido.
Conclusiones
5 Un objetivo de este estudio era determinar la inmunogenicidad y la capacidad protectora del ARN de replicón en el modelo de RSV de rata del algodón. Otro objetivo era evaluar el efecto de las formulaciones de liposomas y de CNE17 en la inmunogenicidad y eficacia de la vacuna. El ARN de replicón no formulado indujo IgG específica de F en suero y anticuerpos neutralizantes de RSV después de una vacunación, y esta respuesta se reforzó mediante una segunda vacunación. Las formulaciones de liposomas y d CNE17 fueron eficaces de manera similar en este
10 modelo, reforzando los títulos de IgG especifica de F a 1 μg de ARN de replicon aproximadamente 8 veces y los títulos de neutralización en 4-10 veces (CNE17 y liposomas, respectivamente) después de la segunda vacunación. Todas las vacunas de ARN de replicón proporcionaron protección frente a una exposición nasal a RSV, reduciendo la carga vírica en el pulmón en más de 3 órdenes de magnitud cuando se mide 5 días después. La magnitud y capacidad protectora de la respuesta inmunitaria generada por 1 μg de ARN de replicón formulado con liposomas
15 fue de entre 2 veces la respuesta provocada por 5x106 VRP. La subunidad de trímero adyuvada con alumbre provocó los máximos títulos de ELISA de IgG anti-F totales, provocó los títulos de neutralización más altos, y provocó el mayor grado de protección frente a títulos de RSV en el pulmón tras la exposición de cualquiera de las
81
preparaciones de vacuna ensayadas en el presente estudio.
Ejemplo 7B -Estudio de inmunogenicidad de RSV F (10-1001)
El replicón A317, que expresa la glucoproteína de fusión de superficie de RSV (RSV F) se usó para este experimento. Se administró a ratones BALB/c, 10 animales por grupo, vacunaciones intramusculares bilaterales (50
5 μl por pata) en los días 0 y 221 con VRP que expresan RSV F (1x106 UI), ARN autorreplicante desnudo (A317, 1 μg), ARN autorreplicante administrado usando electroporación (A317, 10 μg), ARN autorreplicante formulado en liposomas [RV01(01), A317, 0,1 μg o 1 μg) y ARN autorreplicante formulado con CNE17 (A317, 0,1 μg o 1 μg). Se recogió suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2sd1), 35 (2sd2) y 49 (4sd2). Se recogieron los bazos de 5 ratones por grupo en el día 49 (4sd2) para el análisis de linfocitos T.
10 Resultados
Tabla 11: Título de IgG en suero específica de F en el día 14
1 μg A317
0,1 μg RV01(01) 1 μg RV01(01) 0,1 μg CNE17 1 μg CNE17 10 μg A317 + EP 1E6 UI VRP
529
14385 19299 2429 3373 5 6041
1530
10713 19170 2060 4417 88 4912
2734
12756 13860 2012 1927 964 12923
2503
11546 17352 1887 3597 7235 7075
5539
15300 22094 3174 5731 2558 6829
1033
14072 21213 3904 2852 5105 4885
5110
18274 17915 1481 3739 9806 3680
1106
7873 15659 2345 4904 2787 9813
1493
17175 6669 3084 3824 2576 8631
3456
19730 13259 2497 3004 1858 6314
GMT
1980 13731 15903 2398 3590 1180 6685
Tabla 11. (10-1001) títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 10 animales por grupo, 14 días después de vacunación intramuscular. Los datos se representan como títulos para ratones individuales y las medias geométricas de los títulos de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.

Tabla 12: Título de IgG en suero específica de F en el día 35
1 μg A317
0,1 μg RV01(01) 1 μg RV01(01) 0,1 μg CNE17 1 μg CNE17 10 μg A317 + EP 1E6 UI VRP
958
128208 227021 48079 8473 14612 813045
12518
191729 212911 17589 58556 22805 365485
4839
315786 303987 8522 12053 32156 961601
10128
218147 335071 10985 20395 24090 349215
18451
225622 155893 30801 51514 31053 297526
9805
182693 519162 13372 26348 18105 207652
19154
185342 169332 5137 80686 23918 1580066
4490
82744 489441 47173 21014 9091 900889
14674
190010 131361 78232 61076 21006 822285
15223
553164 254500 24135 25499 9835 587121
GMT
8532 201892 253687 20767 29111 19117 579033
Tabla 12. (10-1001) títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis de anticuerpos en el día 35 (2sd2). Los datos se representan como títulos para ratones individuales y las medias geométricas de los títulos de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.
82 Tabla 13: Título de IgG en suero específica de F en el día 49
1 μg A317
0,1 μg RV01(01) 1 μg RV01(01) 0,1 μg CNE17 1 μg CNE17 10 μg A317 + EP 1E6 UI VRP
1248
140407 133787 52747 34245 30388 366771
12441
155669 182995 29352 128030 20768 209400
4967
203059 211020 10857 17016 53763 360615
14536
134253 488698 28800 57250 28373 191475
31556
370726 158816 44613 76576 34318 139148
13815
184738 185184 20314 42357 35736 63839
20495
141644 103026 4546 101445 34611 192101
4800
76711 312096 27476 47285 10138 177858
19159
143275 139811 68386 55865 23958 130218
26836
479594 230331 24360 52871 13624 174378
GMT
10947 177168 194350 24891 53615 25888 180420
Tabla 13. (10-1001) títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis de anticuerpos en el día 49 (4sd2). Los datos se representan como títulos para ratones individuales y las medias geométricas de los títulos de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.

Tabla 14: Títulos de neutralización de suero de RSV en el día 35
A317, 1 μg
RV01(01) 0.1μg RV01(01) 1μg CNE17 0,1μg CNE171μg VRP 1E6 UI
2wp2
2wp2
2wp2
2wp2
2wp2
2wp2
NA
143 106 NA NA 265
NA
272 62 NA NA 73
NA
294 <40 NA NA 77
NA
814 334 NA NA 140
NA
67 86 NA NA 290
NA
420 125 NA NA 134
NA
<40 566 NA NA 466
NA
104 292 NA NA 127
NA
241 <40 NA NA 75
NA
223 44 NA NA 77
GMT
A317, 1mg RV01(01) 0,1 mg RV01(01) 1mg CNE17 0,1mg CNE171mg VRP 1E6 UI
NA
176 96 NA NA 139
Tabla 14: (10-1001) títulos de neutralización de suero de RSV, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis en el día 35 (2sd2). Los datos se representan como los títulos de neutralización de reducción de placa del 60 % de ratones individuales y la media geométrica del título de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <40 (límite de detección) se le asignó un título de 20. NA = no ensayado.
83 84

Tabla 15: Títulos de neutralización de suero de RSV en el día 49
A317, 1μg
RV01(01) 0.1μg RV01(01) 1μg CNE17 0,1μg CNE171μg VRP 1E6 UI
4wp2
4wp2
4wp2
4wp2
4wp2
4wp2
<40
194 82 <40 <40 161
<40
272 165 <40 70 64
<40
142 <40 <40 <40 126
<40
881 442 <40 76 151
<40
61 108 42 57 194
<40
426 156 52 <40 123
<40
78 814 <40 <40 1033
<40
<40
291 173 <40 174
<40
246 103 <40 <40 122
<40
574 396 <40 <40 76
GMT
<40 231 215 29 29 155
Tabla 15: (10-1001) títulos de neutralización de suero de RSV, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis en el día 49 (4sd2). Los datos se representan como los títulos de neutralización de reducción de placa del 60 % de ratones individuales y la media geométrica del título de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <40 (límite de detección) se le asignó un título de 20. NA = no ensayado.
Tabla 16: Respuestas de linfocitos T en el día 49
Respuestas de linfocitos T CD4 esplénicos 4sd2
Linfocitos T CD4+CD8-esplénicos: % de positivos a citocinas y específicos para péptido RSV F51-66
IFNg+
IL2+ IL5+ TNFa+
VRP 1E6 UI
0,07 ± 0,06 0,04 ± 0,05 0,00 ± 0,02 0,10 ± 0,04
1 μg A317
0,00 ± 0,05 0,05 ± 0,04 0,00 ± 0,01 0,03 ± 0,02
RV01(01) 1 μg
0,04 ± 0,06 0,07 ± 0,05 0,00 ± 0,01 0,09 ± 0,03
RV01(01) 0,1 μg
0,06 ± 0,05 0,08 ± 0,04 0,00 ± 0,01 0,10 ± 0,03
CNE17 1 μg
0,00 ± 0,05 0,04 ± 0,04 0,00 ± 0,01 0,05 ± 0,02
CNE17 0,1 μg
0,00 ± 0,05 0,02 ± 0,04 0,00 ± 0,01 0,02 ± 0,02
10 μg vA317 + EP
0,02 ± 0,06 0,04 ± 0,04 0,01 ± 0,01 0,05 ± 0,03
Ninguno
0,04 ± 0,06 0,00 ± 0,05 0,00 ± 0,02 0,00 ± 0,01
Tabla 16. (10-1001) Frecuencias de linfocitos T esplénicos CD4+ específicos de RSV F en el día 49 (4sd2). Se muestra la frecuencia positiva a citocinas ( %) neta (específica de antígeno) ± semi-intervalo de confianza al 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas > 0.

Tabla 17: Respuestas de linfocitos T en el día 49
Respuestas de linfocitos T CD8 esplénicos 4sd2
Linfocitos T CD8+CD4-esplénicos: % de positivas a citocinas y específicas para los péptidos F85-93 y F249-258 de RSV F
IFNg+
IL2+ IL5+ TNFa+
VRP 1E6 UI
3,48 ± 0,29 1,21 ± 0,18 -0,03 ± 0,05 3,31 ± 0,28
1 μg A317
0,74 ± 0,15 0,46 ± 0,11 -0,03 ± 0,04 0,70 ± 0,14
RV01(01) 1 μg
3,69 ± 0,28 1,43 ± 0,18 -0,01 ± 0,04 3,44 ± 0,27
RV01(01) 0,1 μg
2,52 ± 0,23 1,10 ± 0,15 0,03 ± 0,03 2,31 ± 0,22
CNE17 1 μg
1,25 ± 0,17 0,60 ± 0,12 0,01 ± 0,03 1,15 ± 0,16
CNE17 0,1 μg
0,89 ± 0,15 0,49 ± 0,11 -0,03 ± 0,04 0,83 ± 0,14
10 μg A317 + ep
0,85 ± 0,15 0,53 ± 0,11 0,01 ± 0,04 0,72 ± 0,15
Ninguno
0,01 ± 0,07 0,00 ± 0,05 -0,02 ± 0,05 0,02 ± 0,06
Tabla 17. (10-1001) Frecuencias de linfocitos T esplénicos CD8+ específicos de RSV F en el día 49 (4sd2). Se muestra la frecuencia positiva a citocinas ( %) neta (específica de antígeno) ± semi-intervalo de confianza al 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas > 0.
Conclusiones
La formulación de liposomas potenció significativamente la inmunogenicidad, según se determina por los títulos de IgG específica de F aumentados (aumento de 8-30 veces), títulos de neutralización, y respuestas de linfocitos T CD4 y CD8, en relación al control de ARN desnudo. Sorprendentemente, los títulos de IgG específicos de F y los títulos 5 de neutralización para RV01(01) a las dosis tanto de 0,1 como de 1,0 μg fueron equivalentes al VRP (1x106 UI). Las respuestas de linfocitos T para la formulación de LNP fueron equivalentes a la dosis mayor con las de VRP (1x106 UI). La formulación del ARN autorreplicante con CNE17 potenció significativamente la inmunogenicidad, según se determina por los títulos de IgG específica de F aumentados (aumento de 2-5 veces), títulos de neutralización, y respuestas de linfocitos T CD4 y CD8, en relación al control de ARN desnudo. La electroporación del ARN potenció
10 la inmunogenicidad en relación al control de ARN desnudo, pero fue significativamente menor que la administración de liposoma.
Ejemplo 7C -Estudio de inmunogenicidad de RSV F (10-1018)
El replicón A317, que expresa la glucoproteína de fusión de superficie de RSV (RSV F) se usó para este experimento. Se administró a ratones BALB/c, 8 animales por grupo, vacunaciones intramusculares bilaterales (50 μl
15 por pata) en los días 0 y 221 con VRP que expresan RSV F (1x106 UI), ARN autorreplicante desnudo (A306, 1, 0,1, 0,01 μg) y ARN autorreplicante formulado en liposomas (RV01(01) usando el procedimiento 1 (A317, 10,0, 1,0, 0,1, 0,01 μg). Se recogió suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2sd1) y 35 (2sd2). Se recogieron los bazos de 5 ratones por grupo en el día 49 (4sd2) para el análisis de linfocitos T.
Resultados
20 La formulación de liposomas RSV01(01) tenía un tamaño medio Z de diámetro de partícula de 158 nm, con un índice de polidispersión de 0,14, siendo la eficacia de encapsulación del 96 %. Los títulos de IgG en suero específica de F en los días 14 y 35 se muestran e las tablas 18 y 19 y las respuestas de linfocitos T en el día 49 se muestran en las tablas 20 y 21.
Tabla 18: Título de IgG en suero específica de F en los días 14 y 35
VRP 1E6 UI
A317
1 μg
0,1 μg 0,01 μg
2wp1
2wp2 2wp1 2wp2 2wp1 2wp2 2wp1 2wp2
6334
39539 772 4687 5 2334 143 1377
1500
14895 5 142 5 161 5 333
5450
38252 109 2972 5 145 5 5
1835
12831 5 3674 5 97 5 5
2277
30326 5 5003 5 1077 5 175
2818
33437 663 8258 221 457 5 5
2405
22551 257 845 5 1558 5 456
2137
19179 5 1765 5 5 5 180
GMT
2735 24427 41 2144 8 259 8 73
Tabla 18: (10-1018) títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2sd1) y 35 (2sd2). Los datos se representan como ratones individuales y la media geométrica de los títulos de 8 ratas del algodón individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.

Tabla 19: Título de IgG en suero específica de F en los días 14 y 35
RV01(01)
10 μg
1 μg 0,1 μg 0,01 μg
2wp1
2wp2 2wp1 2wp2 2wp2 2wp2 2wp1 2wp2
5880
82689 7255 45018 4072 22174 619 2872
6126
42529 3009 22288 3974 27730 474 3603
8069
76263 5385 23561 3272 15328 914 2692
5966
108234 4148 53675 3968 24456 2011 11542
8590
57912 4210 37004 4950 13014 903 4684
7172
74162 2179 24179 2856 13694 1575 6720
85 (continuación)
RV01(01)
10 μg
1 μg 0,1 μg 0,01 μg
8072
122796 1640 5994 4073 17849 438 16514
8706
83601 5725 28760 3797 17342 1058 13665
GMT
7235 77338 3783 25790 3826 18325 879 6235
Tabla 19: Continuación desde 23A. (10-1018) títulos de IgG en suero específica de F de ratones, 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recogió suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2sd1) y 35 (2sd2). Los datos se representan como animales individuales y la media geométrica de los títulos (GMT) de 8 ratas del algodón individuales por grupo. Si un animal individual tenía un título de <25 (límite de detección) se le asignó un título de 5.

Tabla 20: Respuestas de linfocitos T en el día 49
Respuestas de linfocitos T esplénicos 4sd2
Linfocitos T CD4+CD8-esplénicos: % de positivos a citocinas y específicos para péptido RSV F51-66
IFNg+
IL2+ IL5+ TNFa+
VRP 1E6 UI
0,00 ± 0,02 0,07 ± 0,02 0,00 ± 0,01 0,07 ± 0,03
1 mg A317
0,01 ± 0,01 0,03 ± 0,02 0,00 ± 0,01 0,03 ± 0,02
0,1 μg A317
0,00 ± 0,01 0,01 ± 0,01 0,00 ± 0,00 0,01 ± 0,01
0,01 μg A317
0,00 ± 0,00 0,01 ± 0,01 0,01 ± 0,01 0,00 ± 0,01
RV01(01), 10 μg
0,02 ± 0,01 0,05 ± 0,02 0,00 ± 0,00 0,06 ± 0,02
RV01(01), 1 μg
0,03 ± 0,02 0,08 ± 0,02 0,00 ± 0,01 0,09 ± 0,02
RV01(01), 0,1 μg
0,02 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,00 ± 0,01 0,03 ± 0,02
RV01(01), 0,01 μg
0,00 ± 0,00 0,02 ± 0,02 0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,02
Ninguno
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,01 0,00 ± 0,01 0,01 ± 0,01
Tabla 20. Frecuencias de linfocitos T esplénicos CD4+ específicos de RSV F en el día 49 (experimento 10-1018, 4wp2). Se muestra la frecuencia positiva a citocinas ( %) neta (específica de antígeno) ± semi-intervalo de confianza al 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas > 0.

Tabla 21: Respuestas de linfocitos T en el día 49
Respuestas de linfocitos T esplénicos 4sd2
Linfocitos T CD8+CD4-esplénicos: % de positivas a citocinas y específicas para los péptidos F85-93 y F249-258 de RSV F
IFNg+
IL2+ IL5+ TNFa+
VRP 1E6 UI
2,45 ± 0,21 0,58 ± 0,10 0,00 ± 0,01 2,64 ± 0,21
1 μg A317
1,68 ± 0,17 0,45 ± 0,09 0,00 ± 0,02 1,75 ± 0,18
0,1 μg A317
0,21 ± 0,07 0,08 ± 0,04 0,01 ± 0,02 0,30 ± 0,08
0,01 μg A317
0,06 ± 0,05 0,05 ± 0,03 0,01 ± 0,02 0,16 ± 0,06
RV01(01), 10 μg
3,32 ± 0,23 0,69 ± 0,11 0,00 ± 0,02 3,90 ± 0,25
RV01(01), 1 μg
1,81 ± 0,17 0,59 ± 0,10 0,00 ± 0,02 2,04 ± 0,20
RV01(01), 0,1 μg
0,91 ± 0,12 0,32 ± 0,07 0,00 ± 0,01 1,06 ± 0,14
RV01(01), 0,01 μg
0,58 ± 0,10 0,33 ± 0,08 0,00 ± 0,01 0,64 ± 0,11
Ninguno
0,01 ± 0,02 0,01 ± 0,01 0,00 ± 0,01 0,00 ± 0,05
Tabla 21. Frecuencias de linfocitos T CD8+ esplénicos específicos de F en el día 49 (experimento 10-1018, 4wp2). Se muestra la frecuencia positiva a citocinas ( %) neta (específica de antígeno) ± semi-intervalo de confianza al 95 %. Las frecuencias netas mostradas en negrita indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas > 0.
Conclusiones
86
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