ES2564096T3 - Concentración y liofilización de antígenos de vacuna contra la gripe - Google Patents

Abstract

Un proceso de preparación de antígeno de vacuna contra la gripe liofilizado, que comprende etapas de (i) aumentar la concentración de antígeno de hemaglutinina en una composición líquida que incluye ese antígeno usando filtración centrífuga, para proporcionar un antígeno concentrado, y (ii) liofilizar el antígeno concentrado, para proporcionar el antígeno de vacuna liofilizado; en el que la composición líquida es una vacuna a granel.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Concentracion y liofilizacion de antfgenos de vacuna contra la gripe

DESCRIPCION

CAMPO TECNICO

La presente invention esta en el campo del procesamiento de disoluciones de antlgeno para su uso en vacunas. TECNICA ANTERIOR

Durante la fabrication de vacunas es frecuente el caso que la concentracion de antlgeno en una masa de fabrication supere la concentracion en una formulation de paciente final, y entonces el proceso implica una etapa en la que la masa se diluye. En algunas situaciones, sin embargo, es necesario aumentar la concentracion de antlgeno en una masa acuosa, y la invencion se refiere a procesos para concentrar antlgenos. Procesos utiles deben aumentar la concentracion de un antlgeno sin destruir su inmunogenicidad.

Una situation en la que la concentracion de antlgeno se requiere es para las nuevas tecnicas de administration en las que solo se administra un pequeno volumen de material. Por ejemplo, pueden administrarse vacunas por microagujas [2,3] o por pellculas o tiras delgadas [1,14-17]. Estas tecnicas administran mucho menos volumen que la inyeccion intramuscular tlpica de 0,5 ml, pero pueden requerir la misma cantidad de antlgeno, que frecuentemente requerira un antlgeno de masa mas concentrada.

Un proceso de concentracion existente que puede aumentar la concentracion de una hemaglutinina individual del virus de la gripe (HA) de 125-500 pg/ml a 14 mg/ml implica la filtration de flujo tangencial (TFF) de un volumen de partida de material acuoso a una concentracion de 10 mg/ml, luego liofilizacion, luego reconstitution del liofilizado en un volumen acuoso mas pequeno que el volumen de partida. Este proceso puede realizarse en tres masas de HA monovalente diferentes, y su reconstitucion como composition acuosa trivalente unica puede proporcionar una concentracion de HA final de 42 mg/ml.

Es un objetivo de la invencion proporcionar procesos adicionales y mejorados para aumentar la concentracion de antlgeno en un material para su uso en la fabricacion de vacunas, y particularmente para la fabricacion de vacunas contra la gripe, tales como vacunas contra la gripe que no se administran mediante inyeccion intramuscular.

DIVULGACION DE LA INVENCION

A diferencia de un proceso existente en el que el antlgeno se concentra usando TFF, el procedimiento de concentracion de antlgeno de la invencion usa filtracion centrlfuga. Al igual que el proceso existente, el material concentrado puede entonces liofilizarse, y el material liofilizado puede reconstituirse para uso adicional.

Asl, la invencion proporciona un proceso de preparation de un antlgeno de vacuna liofilizado, que comprende las etapas de (i) aumentar la concentracion de un antlgeno en una composicion llquida que incluye ese antlgeno usando filtracion centrlfuga, para proporcionar un antlgeno concentrado, y (ii) liofilizar el antlgeno concentrado, para proporcionar el antlgeno de vacuna liofilizado; en el que la composicion llquida es una vacuna a granel.

En el presente documento tambien se desvela un antlgeno de vacuna liofilizado preparado por este proceso.

El antlgeno de vacuna liofilizado puede usarse para formular una vacuna, o puede reconstituirse y luego usarse para formular una vacuna. Esta reconstitucion es idealmente en un volumen mas pequeno que el volumen original de composicion llquida, es decir, el volumen al principio de la etapa (i), y mas pequeno que el volumen pre-liofilizacion del antlgeno concentrado, es decir, el volumen al principio de la etapa (ii), ya que esto aumenta de nuevo la concentracion de antlgeno. El material reconstituido puede usarse para formular una vacuna.

En el presente documento tambien se desvela una vacuna formulada por este proceso.

El proceso es particularmente util para preparar un antlgeno de vacuna contra la gripe liofilizado, y este antlgeno de vacuna contra la gripe liofilizado es util para formular vacunas contra la gripe.

El antlgeno

En el presente documento tambien se desvela un proceso de concentracion de antlgenos de diversas fuentes. El antlgeno puede ser de una bacteria, un virus, un hongo o un parasito. Asl, la vacuna puede proteger contra enfermedad producida por una bacteria, un virus, un hongo y/o un parasito.

Bacterias tlpicas para su uso con el proceso desvelado en el presente documento incluyen, pero no se limitan a:

• Bordetella, tal como B. pertussis.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Clostridia, tal como C. tetani y C. botulinum.

Corynebacteria, tal como C. diphtheriae.

Pasteurella, tal como Haemophilus influenzae.

Mycobacteria, tal como M. tuberculosis, M. bovis y el Bacillus Calmette Guerin atenuado.

Neisseria, tal como N. meningitidis y N. gonorrhoeae.

Salmonella, tal como S. typhi, S. paratyphi, S. typhinturium, S. enteritidis.

Streptococci, tal como S. pneumoniae (neumococo), S. agalactiae y S. pyogenes.

Virus tlpicos para su uso con el proceso desvelado en el presente documento incluyen, pero no se limitan a:

• Ortomixovirus, tales como un virus de la gripe A, B o C. Los virus de la gripe A o B pueden ser cepas interpandemicas (anuales/estacionales), o de cepas con el potencial de producir un brote pandemico (es decir, cepas de la gripe con hemaglutinina nueva en comparacion con una hemaglutinina en cepas actualmente en circulacion, o cepas de la gripe que son patogenas en sujetos aviares y tienen el potencial de transmitirse horizontalmente en la poblacion humana, o cepas de la gripe que son patogenas para los seres humanos). Dependiendo de la estacion particular y de la naturaleza de la cepa, un virus de la gripe A puede derivarse de uno o mas de los siguientes subtipos de hemaglutinina: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. Mas detalles se facilitan mas adelante.

• Virus paramyxoviridae, tales como neumovirus (RSV), paramixovirus (PIV) y morbilivirus (sarampion).

• Neumovirus o metapneumovirus, por ejemplo, virus respiratorio sincitial (RSV), virus respiratorio sincitial bovino, virus de la neumonla de los ratones y virus de la rinotraqueitis del pavo. Preferentemente, el neumovirus es RSV o metapneumovirus humano (HMPV).

• Paramixovirus, tales como virus paragripal (PIV) tipo 1, 2, 3 o 4, paperas, virus de Sendai, virus 5 simio, virus paragripal bovino y virus de la enfermedad de Newcastle. Preferentemente, el paramixovirus es PIV o paperas.

• Picornavirus, tales como enterovirus, rinovirus, heparnavirus, cardiovirus y aftovirus. Los enterovirus incluyen los tipos 1, 2 o 3 del virus de la polio, tipos 1 a 22 y 24 del virus de Coxsackie A, tipos 1 a 6 del virus de Coxsackie B, tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 del virus ecovirus (ECHO) y 68 a 71 de enterovirus. Preferentemente, el enterovirus es el virus de la polio, por ejemplo, una cepa de tipo 1 tal como Mahoney o Brunenders, una cepa de tipo 2 tal como MEF-I, o una cepa de tipo 3 tal como Saukett. Un ejemplo de un heparnavirus (tambien llamado hepatovirus) es el virus de la hepatitis A.

• Togavirus, tales como un rubivirus, un alfavirus o un arterivirus. Se prefieren rubivirus, tales como el virus de la rubeola. Alfavirus utiles para la inactivacion incluyen alfavirus acuaticos, tales como virus de la enfermedad del pancreas del salmon y virus de la enfermedad del sueno.

• Flavivirus, tales como encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis del Nilo occidental, encefalitis de San Luis, encefalitis rusa de primavera y verano, encefalitis de Powassan.

• Virus de la hepatitis C (VHC).

• Pestivirus, tales como diarrea viral bovina (BVDV), fiebre porcina clasica (CSFV) o enfermedad de la frontera (BDV).

• Hepadnavirus, tales como virus de la hepatitis B.

• Rhabdovirus, tales como un lissavirus (por ejemplo, un virus de la rabia) y vesiculovirus (VSV).

• Caliciviridae, tales como virus de Norwalk, y virus tipo Norwalk, tales como virus de Hawaii y virus de la montana nevada, y vesivirus, tales como exantema vesicular del virus porcino.

• Coronavirus, tales como un SARS, coronavirus respiratorio humano, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis de raton (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV).

• Retrovirus, tales como un oncovirus, un lentivirus o un spumavirus. Un oncovirus puede ser HTLV-1, HTLV- 2 o HTLV-3. Un lentivirus puede ser SIV, HIV-1 o HIV-2.

• Reovirus, tales como un ortoreovirus, un rotavirus, un orbivirus o un coltivirus.

• Parvovirus, tales como parvovirus B 19, o bocavirus.

• Virus del herpes humano, tales como los virus del herpes simple (HSV), virus de la varicela zoster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes 6 humano (HHV6), virus del herpes 7 humano (HHV7) y virus del herpes 8 humano (HHV8).

• Papovavirus, tales como virus del papiloma y virus del polioma. Los virus del papiloma incluyen los serotipos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 y 65 de HPV.

• Adenoviridae, que incluyen cualquiera de los adenovirus A, B, C, D, E, F o G humanos.

En el presente documento se desvelan procesos de preparacion de vacunas para virus, y en particular virus en los que el antlgeno de vacuna es una glicoprotelna de la superficie viral. La invention es ideal para concentrar hemaglutinina del virus de la gripe para preparar vacunas contra la gripe, como se describe mas adelante en mas detalle. Las etapas (i) y (ii), seguido de reconstitution, pueden proporcionar un antlgeno de la vacuna contra la gripe con un contenido de HA de >5 mg/ml, e incluso >10 mg/ml.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La composition liquids

Un proceso de la invencion aumenta la concentration de un antlgeno en una composition llquida, proporcionando as! un antlgeno concentrado para fines de formulation.

Una composicion llquida preferida es una que nunca ha sido liofilizada antes de la etapa (ii). Una composicion llquida preferida esta sustancialmente libre de lioprotectores al principio de la etapa (i). Asl, una composicion puede estar sustancialmente libre de alcoholes de azucar exogenos (en particular: sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol) y/o de disacaridos exogenos (en particular: sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa). La concentracion combinada de (sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol, sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa) en una composicion llquida puede asl ser inferior a 10 mg/ml (es decir, inferior al 1 %) y es idealmente inferior a 1 mg/ml, por ejemplo, inferior a 0,1 mg/ml.

En la invencion, la composicion llquida es una vacuna a granel, por ejemplo, que contiene antlgeno suficiente para al menos 500 dosis unitarias humanas separadas de la vacuna.

La composicion llquida puede ser monovalente (es decir, que contiene antlgeno de vacuna para proteger contra solo un patogeno) o multivalente (es decir, que contiene antlgeno de vacuna para proteger contra mas de un patogeno, que incluye donde hay mas de un patogeno no protector de forma cruzada diferente, por ejemplo, multiples serogrupos meningococicos, o multiples tipos de hemaglutinina del virus de la gripe A).

La invencion puede usarse con muestras llquidas que tienen una variedad de concentraciones de antlgeno de vacuna. Normalmente, la muestra llquida incluira un antlgeno de vacuna a una concentracion de al menos 1 pg/ml.

La etapa de concentracion

Un proceso de la invencion implica una etapa en la que se aumenta la concentracion de un antlgeno usando filtration centrlfuga.

La filtracion centrlfuga implica centrifugation de un llquido a traves de un filtro. El filtro retiene el antlgeno que va a concentrarse, pero no retiene disolvente o solutos mas pequenos. A medida que aumenta el volumen del filtrado, la concentracion del antlgeno en el concentrado tambien aumenta. Esta tecnica normalmente usa un rotor de angulo fijo. Estan comercialmente disponibles diversos dispositivos de filtracion centrlfuga adecuados, por ejemplo, los productos comercializados bajo las marcas registradas Centricon™, Vivaspin™ y Spintek™. El corte del filtro se seleccionara de forma que el antlgeno de interes siga en el concentrado.

En el presente documento tambien se desvela un proceso que implica una etapa en la que la concentracion de un antlgeno se aumenta usando ultrafiltracion. La ultrafiltracion implica el uso de presion hidrostatica para forzar a un llquido contra una membrana semipermeable. El filtro retiene el antlgeno que va a concentrarse, pero no retiene disolvente o solutos mas pequenos. La aplicacion continuada de presion hidrostatica hace que aumente el volumen del filtrado, y asl tambien aumenta la concentracion del antlgeno en el concentrado. Estan comercialmente disponibles muchas membranas de ultrafiltracion. El corte de peso molecular (MWCO) de una membrana de ultrafiltracion determina que solutos pueden pasan a traves de la membrana (es decir, en el filtrado) y cuales son retenidos (es decir, en el concentrado). El MWCO del filtro usado con la invencion se seleccionara de forma que sustancialmente todo el antlgeno de interes quede en el concentrado.

La etapa de concentracion aumenta preferentemente la concentracion del antlgeno de interes al menos n veces, siendo n 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, o mas.

La etapa de liofilizacion

Despues de la concentracion de antlgeno, un proceso de la invencion liofiliza el antlgeno concentrado para proporcionar un antlgeno de vacuna liofilizado. Kim (1977), Appl. Environ. Microbiol. 34(5):495-499 describen un metodo tal, pero la etapa de concentracion se lleva a cabo por ultrafiltracion.

La liofilizacion normalmente implica tres etapas dentro de una camara: (a) congelation; (b) secado primario; y (c) secado secundario. La etapa (a) congela el agua movil del conjugado. En la etapa (b), la presion de la camara se reduce (por ejemplo, a <0,1 Torr) y se aplica calor al producto para hacer que el agua congelada sublime. En la etapa (c) se aumenta la temperatura para desorber cualquier agua unida, tal como agua de cristalizacion, hasta que el contenido de agua residual disminuya al nivel deseado.

Una etapa inicial en una liofilizacion tlpica, antes de producir la congelacion, es la adicion de un lioprotector. En algunas realizaciones, un lioprotector puede haber sido anadido antes de la concentracion en la etapa (i), pero se prefiere anadirlo mejor despues de producirse la concentracion, es decir, al final de la etapa (i) o al principio de la etapa (ii). Esto hace mas facil controlar la cantidad de lioprotector que esta presente al inicio de la congelacion por liofilizacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asl, un proceso de la invencion puede implicar una etapa de anadir uno o mas lioprotectores al antlgeno concentrado. Lioprotectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, alcoholes de azucar (tales como sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol) y disacaridos (tales como sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa, celobiosa). La sacarosa y el manitol (o una mezcla de los mismos) son lioprotectores preferidos para su uso con la invencion.

Despues de la liofilizacion, un antlgeno de vacuna liofilizado puede reconstituirse. Esta reconstitucion puede usar agua (por ejemplo, agua para inyeccion, wfi) o tampon (por ejemplo, un tampon fosfato, un tampon Tris, un tampon borato, un tampon succinato, un tampon histidina, o un tampon citrato). Los tampones se incluiran normalmente en el intervalo 5-20 mM. Se prefiere un tampon fosfato.

La etapa (i) concentro un primer volumen de llquido de antlgeno de vacuna, proporcionando una composition con la misma cantidad de antlgeno en un segundo volumen de llquido (reducido). La etapa (ii) seco este material concentrado. Este material secado puede reconstituirse en un tercer volumen de llquido. Si el tercer volumen es mayor que el primer volumen, el proceso global ha fracasado en concentrar el antlgeno. Similarmente, si el tercer volumen es mayor que el segundo volumen, la etapa de reconstitucion ha ido marcha atras en terminos de concentration. Asl, el tercer volumen es tanto igual a como, preferentemente, inferior al segundo volumen. Asl, las etapas de liofilizacion/reconstitucion pueden lograr otra concentracion de antlgeno. Las realizaciones en las que el tercer volumen es igual (o superior) al segundo volumen son todavla utiles, por ejemplo, para intercambio de tampon, etc., pero no son preferidas.

Formulacion

El antlgeno de vacuna liofilizado puede usarse para formular una vacuna, pero normalmente se reconstituira antes de hacerlo.

La invencion puede usarse para preparar diversas formulaciones de vacuna. La elevada concentracion de antlgeno significa que la invencion es ideal para tecnicas que implican la administration de pequenos volumenes de material a un paciente. Por ejemplo, la invencion es util para preparar formulaciones de vacuna llquida que tienen un volumen de dosis unitaria de 0,1 ml o menos (por ejemplo, para inyeccion intradermica). La invencion tambien es util para preparar formulaciones de vacuna solida (incluyendo solido no liofilizado), ya que estas pueden requerir altas concentraciones de antlgeno. Como se describe en mas detalle mas adelante, formulaciones solidas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, microagujas biodegradables solidas, microagujas recubiertas y pellculas orales delgadas. Asl, una etapa de formulacion en un proceso de la invencion puede comprender: preparar una forma de vacuna solida a partir del antlgeno de vacuna liofilizado.

Las vacunas formuladas de la invencion retendran lioprotector(es) de la etapa de liofilizacion. Asl, una vacuna puede comprender, por ejemplo, uno o mas de sorbitol, manitol, maltitol, eritritol, xilitol, sacarosa, trehalosa, maltosa, lactulosa, lactosa y/o celobiosa.

Las vacunas de la invencion estan idealmente libres de inulina.

Microagujas biodegradables solidas

Una formulacion solida util que puede prepararse usando la invencion es una microaguja biodegradable solida. Estas normalmente no se administran solas sino, mas bien, se administran multiples agujas simultaneamente, por ejemplo, como un parche para la piel que comprende una pluralidad de microagujas.

Las microagujas son solidas, de forma que retienen su integridad estructural durante el almacenamiento y pueden penetrar en la piel de un sujeto cuando se aplica el parche. Las caracterlsticas mecanicas que se requieren para la penetration de la piel dependen del organismo en cuestion, pero normalmente tendran suficiente fuerza para penetrar la piel humana. Materiales para formar agujas solidas adecuadas estan facilmente disponibles y estos pueden probarse para determinar concentraciones apropiadas, etc., para cualquier necesidad particular.

Las microagujas son biosolubles y biodegradables. Asl, el material solido se disuelve en la piel despues de aplicar el parche, a diferencia de las microagujas recubiertas usadas en las referencias 2 y 3 (vease mas adelante). Habiendose disuelto, el material se metabolizara entonces para dar productos finales inocuos. La escala de tiempo para disolver despues de aplicar el parche puede variar, pero la disolucion normalmente comenzara inmediatamente despues de aplicar el parche (por ejemplo, en el plazo de 10 segundos) y puede continuar durante, por ejemplo, hasta 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 5 horas, 10 horas o 24 horas, hasta que la microaguja se ha disuelto completamente. Materiales con cinetica de disolucion in vivo adecuada estan facilmente disponibles y estos pueden ser variados y probarse para determinar concentraciones apropiadas, etc., para cualquier perfil de disolucion deseado.

Materiales de matriz adecuados para formar las microagujas normalmente seran pollmeros biosolubles y biodegradables, y estos pueden comprender uno o mas hidratos de carbono. Por ejemplo, el material puede comprender una celulosa, una dextrina, un dextrano, un disacarido, un quitosano, una quitina, etc., o mezclas de los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mismos. Tambien pueden usarse otros materiales GRAS. Estos materiales pueden combinarse convenientemente con el antlgeno de vacuna incluyendolos en el llquido usado para reconstituir el antlgeno de vacuna liofilizado.

Celulosas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulosa, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. Dextrinas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, maltodextrina, ciclodextrina, amilodextrina, icodextrina, dextrina amarilla y dextrinas blancas. Disacaridos adecuados incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, turanosa y celobiosa. Un material adecuado para formar microagujas biosolubles y biodegradables es una mezcla de dextrina/trehalosa.

Las microagujas pueden penetrar en la piel. Deben ser lo suficientemente largas para penetrar a traves de la epidermis para administrar el material en la dermis (es decir, administracion intradermica), pero idealmente no son tan largas que puedan penetrar en o pasar la hipodermis. Normalmente tendran 100-2500 pm de largo, por ejemplo, entre 1250-1750 pm de largo, o aproximadamente 1500 pm. En el momento de la administracion, la punta puede penetrar en la dermis, pero la base de la aguja debe quedar en la epidermis.

Las microagujas pueden tener diversas formas y geometrlas. Normalmente seran afiladas con una punta orientada hacia la piel, por ejemplo, formada como piramides o conos. Es tlpica una microaguja afilada con un diametro mas ancho de <500 pm.

Un parche individual normalmente incluira una pluralidad de microagujas, por ejemplo, >10, >20, >30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >200, >300, >400, >50, >750, >1000 o mas por parche. Si un parche incluye una pluralidad de microagujas, puede comprender una capa de soporte a la que estan unidas todas las microagujas. Es tlpica una capa de soporte unitaria con > 20 microagujas que sobresalen. Si un parche incluye una pluralidad de microagujas, estas pueden disponerse en un patron o matriz de repeticion regular, o pueden disponerse irregularmente.

Un parche normalmente tendra un area de 3 cm2 o menos, por ejemplo, <2 cm2 o <1 cm2. Es util un parche circular con un diametro de entre 0,5 cm y 1,5 cm.

La densidad de microagujas sobre un parche puede variar, pero puede ser > 10 cm-2, > 20 cm-2, > 30 cm-2, > 40 cm-2, > 50 cm-2, > 60 cm-2, > 70 cm-2, > 80 cm-2 o mas.

Un parche de la invencion tiene un cara interna orientada hacia la piel y una cara externa orientada hacia el entorno. La cara interna puede incluir un adhesivo para facilitar la adherencia a la piel de un sujeto. Si esta presente, preferentemente no esta presente sobre las propias microagujas, es decir, las microagujas estan libres de adhesivo. En vez de tener adhesivo sobre la cara interna, un parche puede tener un soporte adicional que proporciona un margen de adhesivo externo para adherir el parche a la piel, por ejemplo, como se observa en esparadrapo adhesivo o parches de nicotina.

Los parches, como se han descrito anteriormente, pueden prepararse por las siguientes las tecnicas y orientacion en las referencias 4-8. Por ejemplo, puede prepararse un molde con cavidades de microaguja de 1,5 mm de longitud. Puede combinarse un material de matriz de dextrina y trehalosa con una vacuna contra la gripe y este material acuoso puede colarse centrlfugamente en el molde para formar una matriz de microagujas solidas. Un gel de celulosa puede entonces colarse sobre la mezcla de matriz/vacuna (por ejemplo, mezcla que ha formado una pellcula) para formar una capa de soporte sobre el parche. Cuando esta capa de soporte se ha secado, puede quitarse para dar un parche del que sobresalen microagujas solidas. Asl, una etapa de formulacion en un proceso de la invencion puede comprender: (a) mezclar un material de matriz biosoluble y biodegradable con el antlgeno de vacuna, normalmente reconstituyendo un antlgeno de vacuna liofilizado; y (b) anadir la mezcla de la etapa (a) a un molde que contiene cavidades para formar microagujas. Puede comprender ademas: (c) dejar que la mezcla frague en el molde, para formar microagujas solidas; (d) opcionalmente, aplicar el material a las microagujas fraguadas para proporcionar una capa de soporte; y (e) sacar las microagujas (y opcional la capa de soporte) del molde.

Los parches pueden envasarse en bolsas individuales, por ejemplo, selladas bajo nitrogeno, luego termosellarse. Deben almacenarse cuidadosamente para evitar dano a las microagujas.

Microagujas recubiertas

Otra formulacion solida util que puede prepararse usando la invencion es una microaguja recubierta. Estas normalmente no se administran solas, sino mas bien se administran multiples agujas simultaneamente, por ejemplo, mediante una pluralidad de microagujas. Un producto adecuado se comercializa bajo el nombre comercial de Macroflux™ (Zosano).

Las microagujas son solidas, de forma que retienen su integridad estructural durante el almacenamiento y pueden penetrar en la piel de un sujeto. Las caracterlsticas mecanicas que se requieren para la penetracion de la piel dependen del organismo en cuestion, pero normalmente tendran suficiente fuerza para penetrar la piel humana. Las microagujas son solidas y siguen intactas despues de la insercion en la piel de un paciente (a diferencia de las microagujas biodegradables tratadas anteriormente). Los materiales para formar agujas solidas adecuadas estan

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

facilmente disponibles y estos pueden probarse y seleccionarse para cualquier necesidad particular, por ejemplo, metales (tales como acero inoxidable) o polimeros (tales como policarbonato, idealmente de calidad medica). Pueden fabricarse agujas metalicas usando corte por laser y electro-pulido [9]. Las agujas de polimero pueden fabricarse por micro-replicacion y/o micromoldeo (incluyendo moldeo por inyeccion). Microagujas adecuadas se desvelan en las referencias 2, 3 y 9-13.

Un antigeno de la invencion puede recubrirse sobre las microagujas. Este recubrimiento puede lograrse por un simple proceso tal como recubrimiento por inmersion, por ejemplo, que implica una etapa de inmersion, luego una etapa de secado (por ejemplo, mediante evaporacion), con repetition segun se requiera. Otras tecnicas de recubrimiento utiles se desvelan en la referencia 11. Asi, una etapa de formulation en un proceso de la invencion puede comprender: aplicar el antigeno de vacuna liofilizado, o una forma reconstituida del mismo, a la superficie de una o mas microagujas solidas para proporcionar un dispositivo de microagujas recubiertas para inyeccion de la vacuna.

Una disolucion de recubrimiento para aplicar a las agujas puede incluir uno o mas materiales de matriz biosoluble y biodegradable, y estos pueden comprender uno o mas hidratos de carbono. Por ejemplo, el material puede comprender una celulosa, una dextrina, un dextrano, un disacarido, un quitosano, una quitina, etc., o mezclas de los mismos. Tambien pueden usarse otros materiales de GRAS. Celulosas, dextrinas y disacaridos adecuados se enumeran anteriormente. Estos materiales pueden combinarse convenientemente con el antigeno de vacuna, incluyendolos en el liquido usado para reconstituir el antigeno de vacuna liofilizado.

Asi, una etapa de formulacion en un proceso de la invencion puede comprender: (a) mezclar un material de matriz biosoluble y biodegradable con el antigeno de vacuna, normalmente reconstituyendo un antigeno de vacuna liofilizado; y (b) aplicar la mezcla de la etapa (a) a la superficie de una o mas microagujas solidas para proporcionar un dispositivo de microagujas recubiertas para inyeccion de la vacuna. El recubrimiento puede potenciarse usando uno o mas “componentes potenciadores de la deposition” como se describen en la referencia 11.

Las etapas de aplicacion tratadas anteriormente pueden comprender una sub-etapa de aplicacion, seguida de una sub-etapa de secado, y este par de sub-etapas pueden realizarse una vez o mas de una vez, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces.

Las microagujas en el dispositivo pueden penetrar en la piel cuando se aplican. Deben ser lo suficientemente largas para penetrar a traves de la epidermis para administrar el material en la dermis (es decir, administration intradermica), pero idealmente no son tan largas que puedan penetrar en o pasar la hipodermis. Normalmente tendran 100-2500 pm de largo, por ejemplo, entre 1250-1750 pm de largo, o aproximadamente 1500 pm. En el momento de la administracion, la punta puede penetrar en la dermis, pero la base de la aguja debe quedar en la epidermis. Las agujas pueden aplicarse a la piel de un paciente durante entre 30 segundos y 30 minutos, y luego quitarse.

Las microagujas pueden tener diversas formas y geometrias. Normalmente seran afiladas con una punta orientada hacia la piel, por ejemplo, formada como piramides o conos. Es tipica una microaguja afilada con un diametro mas ancho de <500 pm.

Un dispositivo de microagujas normalmente incluira una pluralidad de microagujas, por ejemplo, >10, >20, >30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >200, >300, >400, >50, >750, >1000, >1500, >2000 o mas por dispositivo (por ejemplo, 300-1500 por dispositivo). Si un dispositivo incluye una pluralidad de microagujas, estas normalmente se uniran todas a una capa de soporte unitaria. Si un dispositivo incluye una pluralidad de microagujas, estas pueden disponerse en un patron o matriz de repeticion regular, o pueden disponerse irregularmente.

Un dispositivo de microagujas normalmente tendra un area de 3 cm2 o menos, por ejemplo, < 2 cm2 o < 1 cm2. Es util un dispositivo circular con un diametro de entre 0,5 cm y 1,5 cm.

La densidad de microagujas puede variar, pero puede ser >10 cm , >20 cm , >30 cm , >40 cm , >50 cm , >60 cm' 2, >70 cm-2, >80 cm-2 o mas. Es util un dispositivo con 2 mm entre cada microaguja, y una densidad de 14 microagujas/cm2.

Un dispositivo de microagujas tiene una cara interna orientada hacia la piel y una cara externa orientada hacia el entorno. La cara interna puede incluir un adhesivo para facilitar la adherencia a la piel de un sujeto. Si esta presente, preferentemente no esta presente sobre las propias microagujas, es decir, las microagujas estan libres de adhesivo. En vez de tener adhesivo sobre la cara interna, un dispositivo puede tener un soporte adicional que proporciona un margen de adhesivo externo para adherir el dispositivo a la piel.

Un dispositivo de microagujas puede envasarse en bolsas individuales, por ejemplo, selladas bajo nitrogeno, luego termosellarse. Deben almacenarse cuidadosamente para evitar dano a las microagujas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Peliculas delgadas

Otra formulacion solida util que puede prepararse usando la invencion es una pellcula delgada, tal como una pellcula oral delgada. Estas peliculas se humedecen y disuelven rapidamente en contacto con saliva y tejido bucal, liberando, por tanto, el antlgeno de vacuna en la boca. El principal componente de estas peliculas delgadas normalmente es uno o mas pollmeros hidrofilos, que pueden tener buenas propiedades mucoadhesivas para proporcionar una fuerte adhesion a tejido bucal hasta la disolucion completa. Pueden usarse peliculas similares para administration no oral, por ejemplo, para administracion transcutanea como se desvela en la referencia 14.

Peliculas delgadas adecuadas normalmente tienen 10-500 pm de espesor cuando se aplican inicialmente, por ejemplo, 75-150 pm de espesor. Sus otras dimensiones pueden ser adecuadas para adaptarse en la boca de un paciente, por ejemplo, en una boca humana adulta o en una boca humana de lactante.

Un tipo adecuado de pellcula se desvela en la referencia 15. Esta pellcula comprende una pellcula bicapa mucoadhesiva con (i) Noveon y Eudragit S-100 como capa mucoadhesiva y (ii) una cera farmaceutica como capa de soporte impermeable. Mas detalles de estas peliculas estan en la referencia 16.

Otro tipo adecuado de pellcula se desvela en la referencia 17. Esta pellcula comprende: (a) uno o mas pollmeros solubles en agua; (b) uno o mas pollmeros mucoadhesivos; (c) un antlgeno de vacuna encapsulado dentro de micropartlculas. Pollmeros solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a: pululano, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, poli(alcohol vinllico), alginato de sodio, polietilenglicol, goma xantana, goma tragacanto, goma guar, goma arabiga, goma arabiga, acido poliacrllico, copollmero de metilmetacrilato, pollmero de carboxivinilo, amilasa, almidon de alta amilasa, almidon de alta amilasa hidroxipropilado, dextrina, pectina, quitina, levano, elsinano, colageno, gelatina, zelna, gluten, aislado de protelna de soja, aislado de protelna del suero de la leche y caselna. Pollmeros mucoadhesivos adecuados incluyen, pero no se limitan a: quitosano, hialuronato, alginato, poli(acido acrllico), poli(acido metacrllico), poli(L-lisina), poli(etilenimina), poli(oxido de etileno), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), y derivados o copollmeros de los mismos. Micropartlculas utiles se preparan de un material que libera el contenido encapsulado en partlculas (es decir, el antlgeno de vacuna) mientras que todavla esta presente en la boca.

La pellcula en la referencia 14 comprende un poli(p-amino ester) cationico para administracion transcutanea.

Una pellcula oral util con la invencion puede incluir un aromatizante para hacer la vacuna mas apetitosa durante la administracion.

Pueden prepararse peliculas delgadas por una variedad de procesos, que incluyen, pero no se limitan a: colada del disolvente; extrusion del adhesivo termofusible; extrusion de dispersion de solido; y laminado.

Una etapa de formulacion en un proceso de la invencion puede as! comprender: (a) mezclar el antlgeno de vacuna, normalmente reconstituyendo un antlgeno de vacuna liofilizado, con uno o mas pollmeros solubles por via oral; y (b) formar una pellcula usando la mezcla de la etapa (a) para proporcionar una pellcula delgada adecuada para administracion por via oral de la vacuna.

Una etapa de formulacion en un proceso de la invencion puede comprender: (a) mezclar el antlgeno de vacuna, normalmente reconstituyendo un antlgeno de vacuna liofilizado, con uno o mas pollmeros topicamente solubles, tales como un poli(p-amino ester); y (b) formar una pellcula usando la mezcla de la etapa (a) para proporcionar una pellcula delgada adecuada para administracion transcutanea de la vacuna.

Estas peliculas pueden envasarse en bolsas de dosis unitaria individual, por ejemplo, selladas bajo nitrogeno, luego termosellarse. Las bolsas deben ser impermeables al agua para mantener las peliculas secas durante el almacenamiento.

Uso en metodos de tratamiento, y administracion de la vacuna

Las vacunas formuladas de la invencion pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, mediante su piel, mediante su tejido bucal, etc. Asl, la invencion proporciona una vacuna formulada de la invencion para su uso en un metodo de fomentar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una vacuna formulada de la invencion al sujeto. Esto podrla implicar, por ejemplo, aplicar un parche de microagujas o dispositivo a la piel del sujeto, de forma que las microagujas penetren en la dermis del sujeto, o aplicar una pellcula delgada al tejido bucal del sujeto o la lengua.

La invencion tambien proporciona un antlgeno liofilizado para su uso en un metodo de vacunacion de un sujeto. La invencion tambien proporciona el uso de antlgeno liofilizado en la fabrication de un medicamento para fomentar una respuesta inmunitaria en un sujeto.

La invencion tambien proporciona un antlgeno liofilizado reconstituido para su uso en un metodo de vacunacion de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

un sujeto. La invention tambien proporciona el uso de antlgeno liofilizado reconstituido en la fabrication de un medicamento para fomentar una respuesta inmunitaria en un sujeto.

Los productos de vacuna son adecuados para administrar vacunas a sujetos humanos o no humanos animales. La respuesta inmunitaria fomentada por estos metodos y usos generalmente incluira una respuesta de anticuerpos, preferentemente una respuesta de anticuerpos protectora.

Los parches de microagujas o dispositivos pueden aplicarse a la piel por aplicacion manual simple (por ejemplo, como con un esparadrapo adhesivo o con parches para la piel conocidos) o pueden aplicarse usando un inyector accionado por resorte.

Las vacunas preparadas segun la invencion pueden usarse para tratar tanto a ninos como a adultos.

El tratamiento puede ser por un programa de dosis unica o un programa de dosis multiples. Las dosis multiples pueden usarse en un programa de inmunizacion primaria y/o en un programa de inmunizacion de refuerzo. Las dosis multiples normalmente se administraran al menos 1 semana separadas (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Vacunacion de la gripe

Los procesos de la invencion son ideales para preparar vacunas contra la gripe. Diversas formas de la vacuna del virus de la gripe estan actualmente disponibles (por ejemplo, veanse los Capltulos 17 y 18 de la referencia 18) y las actuales vacunas se basan tanto en virus inactivados como atenuados vivos. Las vacunas inactivadas (virus completos, virion fraccionado, o antlgeno de superficie) se administran por inyeccion intramuscular o intradermica, mientras que las vacunas vivas se administran intranasalmente. La invencion puede usarse con todas estas formas de vacuna.

Algunas realizaciones de la invencion usan una vacuna de antlgeno de superficie contra la gripe (inactivada). Tales vacunas contienen menos componentes virales que una vacuna fraccionada o de virion completa. Incluyen los antlgenos de superficie hemaglutinina y, normalmente, tambien neuraminidasa. Los procesos para preparar estas protelnas en forma purificada a partir del virus de la gripe son muy conocidos en la tecnica. Los productos FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ e INFLUVAC™ son ejemplos de vacunas contra la gripe de antlgeno de superficie.

Si la invencion usa una vacuna de antlgeno de superficie contra la gripe, este virus puede haber sido cultivado en huevos o en cultivo celular (vease mas adelante). El actual metodo convencional para el crecimiento del virus de la gripe para vacunas usa huevos de gallina SPF embrionados, siendo los virus purificados a partir del contenido del huevo (llquido alantoideo). Si se usa el crecimiento viral basado en huevo, entonces uno o mas aminoacidos pueden introducirse en el llquido alantoideo del huevo, junto con el virus [24]. El virus se cultiva primero en huevos. Entonces se recoge de los huevos infectados. Pueden recogerse viriones del llquido alantoideo por diversos metodos. Por ejemplo, un proceso de purification puede implicar centrifugation zonal usando una disolucion de gradiente de sacarosa lineal que incluye detergente para romper los viriones. Los antlgenos pueden entonces purificarse, despues de dilution opcional, por diafiltracion. Medios qulmicos para inactivar un virus incluyen tratamiento con una cantidad eficaz de uno o mas de los siguientes agentes: detergentes, formaldehldo, p-propiolactona, azul de metileno, psoraleno, carboxifullereno (C60), etilamina binaria, acetiletilenimina, o combinaciones de los mismos. Metodos no qulmicos de inactivation viral son conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, luz UV o irradiation gamma.

Algunas realizaciones de la invencion pueden usar virus completos, virus fraccionados, virosomas, virus atenuados vivos, o hemaglutinina recombinante. Estas vacunas pueden distinguirse facilmente de las vacunas de antlgeno de superficie probando sus antlgenos, por ejemplo, para la presencia de protelnas del virus de la gripe adicionales.

Los virus inactivados completos pueden obtenerse recogiendo viriones de fluidos que contienen virus (por ejemplo, obtenidos de huevos o de medio de cultivo) y luego tratandolos como se ha descrito anteriormente.

Los viriones fraccionados se obtienen tratando viriones purificados con detergentes (por ejemplo, eter etllico, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, bromuro de cetiltrimetilamonio, Tergitol NP9, etc.) para producir preparaciones de subvirion, que incluyen el proceso de fraccionamiento con 'Tween-eter'. Los metodos de fraccionamiento del virus de la gripe, por ejemplo, son muy conocidos en la tecnica, por ejemplo, veanse las refs. 19-24, etc. El fraccionamiento del virus normalmente se lleva a cabo rompiendo o fragmentando el virus completo, tanto si es infeccioso como no infeccioso, con una concentration de rotura de un agente de fraccionamiento. La rotura produce una solubilization completa o parcial de las protelnas del virus, alterando la integridad del virus. Agentes de fraccionamiento preferidos son tensioactivos no ionicos e ionicos (por ejemplo, cationicos), por ejemplo, alquilglucosidos, alquiltioglucosidos, acilazucares, sulfobetalnas, betalnas, polioxietilen- alquil eteres, N,N-dialquil-glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanoles, NP9, compuestos de amonio cuaternario, sarcosilo, CTAB (bromuros de cetiltrimetilamonio), fosfato de tri-N-butilo, sales de miristiltrimetilamonio,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

lipofectina, lipofectamina y DOT-MA, los octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (por ejemplo, los tensioactivos Triton, tales como Triton X-100 o Triton N101), esteres de polioxietilensorbitano (los tensioactivos Tween), polioxietilen eteres, esteres de polioxietileno, etc. Un procedimiento de fraccionamiento util usa los efectos consecutivos del desoxicolato de sodio y formaldehldo, y el fraccionamiento puede tener lugar durante la purificacion de viriones inicial (por ejemplo, en una disolucion de gradiente de densidad de sacarosa). Asl, un proceso de fraccionamiento puede implicar la clarificacion del material que contiene viriones (para eliminar material no de virion), concentracion de los viriones recogidos (por ejemplo, usando un metodo de adsorcion, tal como adsorcion de CaHPO4), separacion de viriones completos de material no de virion, fraccionamiento de viriones usando un agente de fraccionamiento en una etapa de centrifugacion en gradiente de densidad (por ejemplo, usando un agente de fraccionamiento que contiene un gradiente de sacarosa tal como desoxicolato de sodio), y luego filtracion (por ejemplo, ultrafiltracion) para eliminar materiales no deseados. Los viriones fraccionados pueden resuspenderse utilmente en solucion isotonica de cloruro sodico tamponada con fosfato de sodio. Ejemplos de vacunas fraccionadas son los productos BEGRIVAC™, INTANZA™, FLUARIX™, FLUZONE™ y FLUSHIELD™.

Los virosomas son partlculas liposomales tipo viral libres de acido nucleico [25]. Pueden prepararse por solubilizacion de virus con un detergente, seguido de eliminacion de la nucleocapside y reconstitucion de la membrana que contiene las glicoprotelnas virales. Un metodo alternativo para preparar virosomas implica anadir glicoprotelnas de la membrana viral a las cantidades en exceso de fosfollpidos, para dar liposomas con protelnas virales en su membrana.

Se obtienen virus atenuados vivos de virus (cultivados en huevos o en cultivo celular), pero los virus no estan inactivados. Mas bien, el virus se atenua (“at”), por ejemplo, para producir enfermedad similar a la gripe en un modelo de huron de infeccion por la gripe humana. Tambien puede ser una cepa adaptada al frlo (“ca”), es decir, puede replicarse eficazmente a 25 °C, una temperatura que es restrictiva para la replicacion de muchos virus de la gripe no mutantes. Tambien puede ser sensible a la temperatura (“ts”), es decir, su replicacion esta limitada a temperaturas a las que muchos virus de la gripe no mutantes crecen eficazmente (37-39 °C). El efecto acumulado del fenotipo ca, ts y at es el del virus en el que la vacuna atenuada puede replicarse en la nasofaringe para inducir inmunidad protectora en un paciente humano tlpico, pero no produce enfermedad, es decir, es seguro para la administracion general a la poblacion humana diana. Estos virus pueden prepararse purificando viriones de fluidos que contienen virion, por ejemplo, despues de la clarificacion de los fluidos por centrifugacion, luego estabilizacion con tampon (por ejemplo, que contiene sacarosa, fosfato de potasio y glutamato de monosodio). Las vacunas vivas incluyen el producto FLUMIST™. Aunque las vacunas vivas pueden usarse con la invencion, se prefiere usar vacunas no vivas.

Como alternativa a usar antlgenos obtenidos de viriones, la hemaglutinina puede expresarse en un huesped recombinante (por ejemplo, en una llnea celular de insecto, tal como Sf9, usando un vector de baculovirus) y usarse en forma purificada [26-28] o en forma de partlculas tipo virus (VLPs; por ejemplo, veanse las referencias 29 y 30).

Algunas realizaciones de la invencion usan vacuna contra la gripe preparada a partir de virus que se cultivaron en cultivo celular, en vez de en huevos. Cuando se usa el cultivo celular, el sustrato de crecimiento viral normalmente sera una llnea celular de origen de mamlfero. Celulas de origen de mamlfero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas de hamster, ganado vacuno, primate (incluyendo seres humanos y monos) y de perro. Pueden usarse diversos tipos de celulas, tales como celulas de rinon, fibroblastos, celulas de la retina, celulas de pulmon, etc. Ejemplos de celulas de hamster adecuadas son las llneas celulares que tienen los nombres BHK21 o HKCC. Celulas de mono adecuadas son, por ejemplo, celulas del mono verde africano, tales como celulas de rinon como en la llnea celular Vero. Celulas de perro adecuadas son, por ejemplo, celulas de rinon, como en la llnea celular MDCK. Asl, llneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Llneas celulares de mamlfero preferidas para cultivar el virus de la gripe incluyen: celulas MDCK [31-34], derivadas de rinon canino de Madin Darby; celulas Vero [35-37], derivadas de rinon de mono verde africano (Cercopithecus aethiops); o celulas PER.C6 [38], derivadas de retinoblastos de embrion humano. Estas llneas celulares estan ampliamente disponibles, por ejemplo, de la Coleccion Americana de Cultivos de Celulas Tipo (ATCC), del Coriell Cell Repositories, o de la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Por ejemplo, la ATCC suministra diversas celulas Vero diferentes con los numeros de catalogo CCL-81, CCL-81.2, cRL-1586 y CRL-1587, y suministra celulas MDCK bajo el numero de catalogo CCL-34. PER.C6 esta disponible de la ECACC con el numero de deposito 96022940. Como una alternativa menos preferida a las llneas celulares de mamlfero, los virus pueden cultivarse sobre llneas celulares aviares [por ejemplo, refs. 39-41], que incluyen llneas celulares derivadas de patos (por ejemplo, retina de pato) o gallinas. Ejemplos de llneas celulares aviares incluyen citoblastos de embrion aviar [39,42] y celulas de retina de pato [40]. Citoblastos de embrion aviar adecuados incluyen la llnea celular EBx derivada de citoblastos de embrion de pollo, EB45, EB14 y EB14-074 [43]. Tambien pueden usarse fibroblastos de embrion de pollo (CEF).

Las llneas celulares mas preferidas para cultivar el virus de la gripe son llneas celulares MDCK. La llnea celular MDCK original esta disponible de la ATCC como CCL-34, pero tambien pueden usarse derivados de esta llnea celular. Por ejemplo, la referencia 31 desvela una llnea celular MDCK que se adapto para el crecimiento en cultivo en suspension ('MDCK 33016', depositada como DSM ACC 2219). Similarmente, la referencia 44 desvela una llnea celular derivada de MDCK que crece en suspension en cultivo libre de suero ('B-702', depositada como FERM BP-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7449). La referenda 45 desvela celulas MDCK no tumorigenicas, que incluyen 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK- SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) y 'MDCK-SF103' (PTA-6503). La referencia 46 desvela llneas celulares MDCK con alta susceptibilidad a infeccion, que incluyen celulas 'MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). Puede usarse cualquiera de estas llneas celulares MDCK.

Si el virus se ha cultivado en una llnea celular de mamlfero, entonces los productos de la invencion estaran ventajosamente libres de protelnas del huevo (por ejemplo, ovoalbumina y ovomucoide) y de ADN de pollo, reduciendo as! la posible alergenicidad.

La hemaglutinina en productos derivados de celula de la invencion puede tener un patron de glicosilacion diferente de los patrones observados en virus derivados de huevo. Asl, la HA (y otras glicoprotelnas) pueden incluir glicoformas que no se observan en huevos de pollo. HA utiles incluye glicoformas caninas.

La ausencia de materiales derivados de huevo y de glicoformas de pollo proporciona una forma en la que la vacuna preparada a partir de virus cultivados en cultivo celular puede distinguirse de productos derivados de huevo.

Si el virus se ha cultivados en una llnea celular, entonces el cultivo para el crecimiento, y tambien el inoculo viral usado para empezar el cultivo, preferentemente estaran libres de (es decir, se habran probado para y dado un resultado negativo para la contaminacion por) virus del herpes simple, virus respiratorio sincitial, virus paragripal 3, coronavirus SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, virus del polioma, birnavirus, circovirus y/o parvovirus [47]. La ausencia del virus del herpes simple es particularmente preferida.

Para el crecimiento sobre una llnea celular, tal como sobre celulas MDCK, el virus puede cultivarse en celulas en suspension [31, 48, 49] o en cultivo adherente. Una llnea celular MDCK adecuada para cultivo en suspension es MDCK 33016 (depositada como DSM ACC 2219). Como alternativa, puede usarse el cultivo de microvehlculo.

Las llneas celulares que soportan la replication del virus de la gripe se cultivan preferentemente en medios de cultivo libres de suero y/o medios libres de protelna. Un medio se denomina un medio sin suero en el contexto de la presente invencion en el que no hay aditivos de suero de origen humano o animal. Libre de protelna se entiende que significa cultivos en los que la multiplication de las celulas se produce con exclusion de protelnas, factores de crecimiento, otros aditivos de protelna y protelnas no de suero, pero pueden opcionalmente incluir protelnas tales como tripsina u otras proteasas que puedan ser necesarias para el crecimiento viral. Las celulas que crecen en tales cultivos contienen naturalmente las propias protelnas.

Las llneas celulares que soportan la replicacion del virus de la gripe se cultivan preferentemente por debajo de 37 °C [50] durante la replicacion viral, por ejemplo, 30-36 °C, a 31-35 °C, o a 33 ± 1 °C.

El metodo para propagar virus en celulas cultivadas generalmente incluye las etapas de inocular las celulas cultivadas con la cepa que va a cultivarse, cultivar las celulas infectadas durante un periodo de tiempo deseado para la propagation del virus, tal como, por ejemplo, como se ha determinado por tltulo de virus o expresion de antlgeno (por ejemplo, entre 24 y 168 horas despues de la inoculation) y recoger el virus propagado. Las celulas cultivadas se inoculan con un virus (medido por PFU o TCID50) a la relation de celulas de 1:500 a 1:1, preferentemente 1:100 a 1:5, mas preferentemente 1:50 a 1:10. El virus se anade a una suspension de las celulas o se aplica a una monocapa de las celulas, y el virus se absorbe sobre las celulas durante al menos 60 minutos, pero normalmente menos de 300 minutos, preferentemente entre 90 y 240 minutos a 25 °C a 40 °C, preferentemente 28 °C a 37 °C. El cultivo celular infectado (por ejemplo, monocapas) puede separarse tanto por congelacion-descongelacion como por la action enzimatica para aumentar el contenido viral de los sobrenadantes de cultivo recolectados. Los fluidos recolectados tanto se inactivan como se almacenan congelados. Las celulas cultivadas pueden infectarse a una multiplicidad de infeccion (“m.o.i.”) de aproximadamente 0,0001 a 10, preferentemente 0,002 a 5, mas preferentemente a 0,001 a 2. Todavla mas preferentemente, las celulas se infectan a una m.o.i. de aproximadamente 0,01. Las celulas infectadas pueden recogerse 30 a 60 horas despues de la infeccion. Preferentemente, las celulas se recogen 34 a 48 horas despues de la infeccion. Todavla mas preferentemente, las celulas se recogen 38 a 40 horas despues de la infeccion. Las proteasas (normalmente tripsina) se anaden generalmente durante el cultivo celular para permitir la liberation viral, y las proteasas pueden anadirse en cualquier etapa adecuada durante el cultivo.

Un producto de vacuna que incluye vacuna preparada de cultivo celular contiene preferentemente menos de 10 ng (preferentemente menos de 1 ng, y mas preferentemente menos de 100 pg) de ADN de celula huesped residual por dosis, aunque pueden estar presentes cantidades traza de ADN de celula huesped.

Se prefiere que la longitud promedio de cualquier ADN de celula huesped residual sea inferior a 500 pb, por ejemplo, inferior a 400 pb, inferior a 300 pb, inferior a 200 pb, inferior a 100 pb, etc.

El ADN contaminante puede eliminarse durante la preparation de vacunas usando procedimientos de purification estandar, por ejemplo, cromatografla, etc. La elimination de ADN de celula huesped residual puede potenciarse por tratamiento con nucleasa, por ejemplo, usando una DNasa. Un metodo conveniente para reducir la contaminacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

por ADN de celula huesped se desvela en las referencias 51 y 52, que implica un tratamiento de dos etapas, primero usando una DNasa (por ejemplo, benzonasa), que puede usarse durante el crecimiento viral, y luego un detergente cationico (por ejemplo, CTAB), que puede usarse durante la rotura de viriones. El tratamiento con un agente alquilante, tal como p-propiolactona, tambien puede usarse para eliminar ADN de celula huesped, y ventajosamente tambien puede usarse para inactivar viriones [53].

Algunas realizaciones de la invencion usan una vacuna contra la gripe monovalente (es decir, incluye antlgeno de hemaglutinina de un unica cepa del virus de la gripe), pero en algunas realizaciones puede ser una vacuna multivalente, tal como una vacuna bivalente, vacuna trivalente, una vacuna tetravalente, o una vacuna >4-valente (es decir, que incluye hemaglutinina de mas de cuatro cepas del virus de la gripe diferentes). La vacunas monovalentes y multivalentes se distinguen facilmente probando multiples tipos de HA, por secuenciacion de aminoacidos, etc.

Una vacuna monovalente es particularmente util para inmunizar contra una cepa pandemica o posiblemente pandemica, tanto durante una pandemia como en una situacion pre-pandemica. Caracterlsticas de estas cepas son: (a) contienen una nueva hemaglutinina en comparacion con las hemaglutininas en cepas humanas actualmente en circulacion, es decir, una que no ha sido evidente en la poblacion humana durante mas de una decada (por ejemplo, H2), o no se ha observado previamente en absoluto en la poblacion humana (por ejemplo, H5, H6 o H9, que generalmente solo se han encontrado en poblaciones de aves), de forma que la poblacion humana estara inmunologicamente intacta a la hemaglutinina de la cepa; (b) son capaces de ser transmitidas horizontalmente en la poblacion humana; y (c) son patogenas para los seres humanos. Estas cepas pueden tener cualquiera de los subtipos de HA H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16 de la gripe A. Se prefiere un virus con tipo de hemaglutinina H5 para inmunizar contra gripe pandemica, o un subtipo H2, H7 o H9. La invencion puede proteger contra uno o mas de los subtipos de NA del virus de la gripe A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9. Asl, posibles cepas incluyen H5N1, H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 y H7N7, y cualquier otra cepa posiblemente pandemica emergente.

Una vacuna multivalente es mas tlpica en un marco estacional, por ejemplo, es tlpica una vacuna trivalente, que incluye hemaglutininas de dos cepas del virus de la gripe A y una cepa de virus de la gripe B, tal como de una cepa H1N1 de la gripe A, una cepa H3N2 del virus de la gripe A y una cepa del virus de la gripe B. Tambien es util una vacuna tetravalente [54], por ejemplo, que incluye antlgenos de dos cepas del virus de la gripe A y dos cepas del virus de la gripe B, o tres cepas del virus de la gripe A y una cepa del virus de la gripe B. Asl, una vacuna puede ser bivalente, trivalente, tetravalente, etc. Excepto por vacunas monovalentes, es usual incluir hemaglutinina de tanto cepas del virus de la gripe A como de la gripe B. En vacunas que incluyen solo dos cepas del virus de la gripe A, estas normalmente seran una cepa H1 (por ejemplo, una cepa H1N1) y una cepa H3 (por ejemplo, una cepa H3N2). En algunas realizaciones, sin embargo, puede ser una cepa pandemica del virus de la gripe A y una cepa H1, o una cepa pandemica del virus de la gripe A y una cepa H3.

Si una vacuna incluye mas de una cepa de la gripe, las diferentes cepas normalmente se cultivan por separado y se mezclan despues de haberse recogido los virus y de haberse preparado los antlgenos. Asl, un proceso de la invencion puede incluir la etapa de mezclar antlgenos de mas de una cepa de la gripe.

Como se describe en la referencia 54, vacunas tetravalentes a modo de ejemplo pueden incluir hemaglutinina de dos cepas del virus de la gripe A y dos cepas del virus de la gripe B ('A-A-B-B'), o de tres cepas del virus de la gripe A y una cepa del virus de la gripe B ('A-A-A-B').

El virus de la gripe B actualmente no muestra subtipos de HA diferentes, pero las cepas del virus de la gripe B se clasifican en dos linajes distintos. Estos linajes emergieron a finales de los anos 80 y tienen HA que pueden distinguirse antigenicamente y/o geneticamente entre si [55]. Las actuales cepas del virus de la gripe B son tanto B/Victoria/2/similar a 87 o B/Yamagata/16/similar a 88. Si una vacuna de la invencion incluye dos cepas de la gripe B, esta sera normalmente una cepa B/Victoria/2/similar a 87 y una cepa B/Yamagata/16/similar a 88. Estas cepas se distinguen normalmente antigenicamente, pero tambien se han descrito diferencias en las secuencias de aminoacidos para distinguir los dos linajes, por ejemplo, las cepas B/Yamagata/16/similares a 88 frecuentemente (pero no siempre) tienen protelnas HA con deleciones en el residuo de aminoacido 164, numerado con respecto a la secuencia de HA 'Lee40' [56].

Vacunas A-A-B-B preferidas incluyen hemaglutininas de: (i) una cepa H1N1; (ii) una cepa H3N2; (iii) una cepa B/Victoria/2/similar a 87; y (iv) cepa B/Yamagata/16/similar a 88.

En vacunas que incluyen tres cepas del virus de la gripe A, estas normalmente seran una cepa H1 (por ejemplo, una cepa H1N1) y dos cepas H3 (por ejemplo, dos cepas H3N2). Las dos cepas H3 tendran protelnas HA antigenicamente distintas, por ejemplo, una cepa H3N2 que reacciona de forma cruzada con A/Moscu/10/99 y una cepa H3N2 que reacciona de forma cruzada con A/Fujian/411/2002. Las dos cepas H3 pueden ser de diferentes clados (clados A, B y C de cepas H3N2 se desvelan en la referencia 57). En algunas realizaciones, sin embargo, una de estas cepas (es decir, H1, o una de las dos cepas H3) puede sustituirse por una cepa pandemica.

Asl, una vacuna A-A-A-B preferida incluye hemaglutininas de: (i) una cepa H1N1: (ii) una cepa A/Moscu/10/H3N2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

similar a 99; (iii) una cepa A/Fujian/411/H3N2 similar a 2002; y (iv) una cepa del virus de la gripe B, que puede ser B/Victoria/2/similar a 87 o B/Yamagata/16/similar a 88.

Otra vacuna A-A-A-B preferida incluye hemaglutininas de: (i) una cepa H1N1, (ii) una cepa H3N2, (iii) una cepa H5 (por ejemplo, una cepa H5N1) y (iv) una cepa de la gripe B.

Otra vacuna A-A-A-B preferida incluye hemaglutininas de: (i) dos cepas H1 diferentes, (ii) una cepa H3N2, y (iii) una cepa de la gripe B.

Si estan presentes antlgenos de dos o mas cepas del virus de la gripe B, al menos dos de las cepas del virus de la gripe B pueden tener hemaglutininas distintas, pero neuraminidasas relacionadas. Por ejemplo, ambas pueden tener una B/Victoria/2/neuraminidasa similar a 87 [58] o ambas pueden tener una B/Yamagata/16/neuraminidasa similar a 88. Por ejemplo, dos B/Victoria/2/neuraminidasas similares a 87 pueden ambas tener una o mas de las siguientes caracterlsticas de secuencia: (1) no una serina en el residuo 27, sino preferentemente una leucina; (2) no un glutamato en el residuo 44, sino preferentemente una lisina; (3) no una treonina en el residuo 46, sino preferentemente una isoleucina; (4) no una prolina en el residuo 51, sino preferentemente una serina; (5) no una arginina en el residuo 65, sino preferentemente una histidina; (6) no una glicina en el residuo 70, sino preferentemente un glutamato; (7) no una leucina en el residuo 73, sino preferentemente una fenilalanina; y/o (8) no una prolina en el residuo 88, sino preferentemente una glutamina. Similarmente, en algunas realizaciones, la neuraminidasa puede tener una delecion en el residuo 43, o puede tener una treonina; una delecion en el residuo 43, que surge de una delecion de trinucleotido en el gen nA, se ha informado como una caracterlstica de cepas B/Victoria/2/similar a 87, aunque cepas recientes han recuperado Thr-43 [58]. En cambio, por supuesto, las caracterlsticas opuestas pueden ser compartidas por dos B/Yamagata/16/neuraminidasas similares a 88, por ejemplo, S27, e44, T46, P51, R65, G70, L73 y/o P88. Estos aminoacidos estan numerados con respecto a la secuencia de neuraminidasa 'Lee40' [59]. Asl, una vacuna A-A-B-B de la invencion puede usar dos cepas B que son antigenicamente distintas para HA (una B/Yamagata/16/similar a 88, una B/Victoria/2/similar a 87), pero estan relacionadas para NA (ambas B/Yamagata/16/similar a 88, o ambas B/Victoria/2/similar a 87).

En algunas realizaciones, la invencion no engloba una vacuna fraccionada trivalente que contiene hemaglutinina de cada una de las cepas A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Wyoming/03/2003 (H3N2) y B/Jiangsu/10/2003.

Las cepas cuyos antlgenos pueden incluirse utilmente en las composiciones incluyen cepas que son resistentes a terapia antiviral (por ejemplo, resistentes a oseltamivir [60] y/o zanamivir), que incluyen cepas pandemicas resistentes [61].

En algunas realizaciones de la invencion, una vacuna puede incluir una pequena cantidad de conservante basado en mercurio, tal como tiomersal o mertiolato. Cuando estan presentes, tales conservantes normalmente proporcionaran menos de 5 pg/ml de mercurio, y son posibles menores niveles, por ejemplo, <1 pg/ml, <0,5 pg/ml. Las vacunas preferidas estan libres de tiomersal, y estan mas preferentemente libres de mercurio [23,62]. Tales vacunas pueden incluir un conservante no mercurial. Las alternativas no mercuriales al tiomersal incluyen 2-fenoxietanol o succinato de a-tocoferol [23]. Lo mas preferentemente, una vacuna esta libre de conservante.

En algunas realizaciones, una vacuna puede incluir una cantidad estabilizadora de gelatina, por ejemplo, a menos del 0,1 %. En otras realizaciones, sin embargo, una vacuna esta libre de gelatina. La ausencia de gelatina puede asegurar que la vacuna sea segura en la pequena proporcion de pacientes que son sensibles a la gelatina [63,64].

En algunas realizaciones, una vacuna puede incluir uno o mas antibioticos, por ejemplo, neomicina, kanamicina, polimixina B. Sin embargo, en realizaciones preferidas, la vacuna esta libre de antibioticos.

En algunas realizaciones, una vacuna puede incluir formaldehldo. Sin embargo, en realizaciones preferidas, la vacuna esta libre de formaldehldo.

Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, una vacuna puede incluir componentes de huevo (por ejemplo, ovoalbumina y ovomucoide), pero realizaciones preferidas estan libres de componentes de huevo.

La preparacion de vacunas sin el uso de ciertos componentes y aditivos se desvela en la referencia 65, asegurando asl que estos materiales no estan presentes incluso en cantidades residuales.

La hemaglutinina (HA) es el principal inmunogen en las actuales vacunas contra la gripe inactivadas, y las dosis de vacuna estan normalizadas por referencia a los niveles de HA, normalmente medidos por SRID. Las vacunas existentes normalmente contienen aproximadamente 15 pg de HA por cepa, aunque pueden usarse dosis menores, por ejemplo, para ninos, o en situaciones pandemicas, o si se usa un adyuvante. Se han usado dosis fraccionarias tales como ^ (es decir, 7,5 pg de HA por cepa), % y A, ya que tienen mayores dosis (por ejemplo, 3x o 9x dosis [66, 67]). Estas vacunas tienen un volumen de dosificacion de 0,5 ml que es una concentracion de HA tlpica de 30 pg/ml/cepa. El producto trivalente INTANZA™ contiene 9 pg de HA por cepa en un volumen de 0,1 ml que es una concentracion de HA de 90 pg/ml/cepa, dando una concentracion de Ha total de 270 pg/ml.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los productos de la presente invencion pueden incluir entre 0,1 y 50 pg de HA por cepa de gripe por dosis, preferentemente entre 0,1 y 50 pg, por ejemplo, 1-20 pg. Idealmente, un producto tiene <16 pg de hemaglutinina por cepa, por ejemplo, 1-15 pg, 1-10 pg, 1-7,5 pg, 1-5 pg, etc. Dosis de HA particulares por cepa incluyen, por ejemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5, etc.

Para vacunas vivas, la dosificacion se mide por la mediana de la dosis infecciosa de cultivo de tejido (TCID50) en vez del contenido de HA, por ejemplo, una TCID50 de entre 106 y 108 (preferentemente entre 106,5-107,5) por cepa por dosis.

Las cepas de la gripe usadas con la invencion pueden tener una HA natural como se encuentra en un virus no mutante, o una HA modificada. Por ejemplo, se conoce modificar HA para eliminar determinantes (por ejemplo, regiones hiper-basicas alrededor del sitio de escision HA1/HA2) que producen un virus que es altamente patogeno en especies aviares. El uso de genetica inversa facilita tales modificaciones.

Los productos de vacuna de la invencion pueden incluir componentes, ademas de la vacuna contra los antlgenos de la gripe. Como se trata anteriormente, por ejemplo, pueden incluir un material de matriz biosoluble y biodegradable, o un pollmero de pellcula oral.

Los productos de vacuna pueden incluir un detergente. El nivel de detergente puede variar ampliamente, por ejemplo, entre 0,05-50 pg de detergente por pg de HA ('pg/pg'). Puede usarse un bajo nivel de detergente, por ejemplo, entre 0,1-1 pg/pg, o puede usarse un alto nivel, por ejemplo, entre 5-30 pg/pg. El detergente puede ser un unico detergente (por ejemplo, polisorbato 80, o CTAB) o una mezcla (por ejemplo, tanto polisorbato 80 como CTAB). Detergentes preferidos son no ionicos, tales como polisorbato 80 ('Tween 80') u etoxilato de octilfenol ('Triton X100'). El polisorbato 80 puede estar presente a entre 0,05-50 pg de polisorbato 80 por pg de HA, por ejemplo, entre 0,1-1 pg/pg, 0,1-0,8 pg/pg, 0,1-0,5 pg/pg, 5-40 pg/jg, 5-30 pg/pg, o 8-25 pg/pg.

Como se ha mencionado anteriormente, algunos productos de vacuna pueden incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol, pero las vacunas preferidas estan libres de mercurio o de conservante.

Los productos de vacuna pueden incluir una sal fisiologica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro sodico (NaCl), que puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, difosfato de sodio deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Los productos de vacuna pueden incluir uno o mas tampones. Tampones tlpicos incluyen: un tampon fosfato; un tampon Tris; un tampon borato; un tampon succinato; un tampon histidina (particularmente con un adyuvante de hidroxido de aluminio); o un tampon citrato. Los tampones normalmente se incluiran en el intervalo de 5-20 mM.

Los productos de vacuna son preferentemente esteriles. Los productos de vacuna son preferentemente no pirogenicos, por ejemplo, que contienen <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estandar) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. Los productos de vacuna estan preferentemente libres de gluten.

Los productos de vacuna pueden incluir moleculas inmunoestimulantes. Estas pueden mezclarse con antlgeno antes de preparar un parche. Clases adecuadas de molecula inmunoestimulante incluyen, pero no se limitan a: agonistas de TLR3; agonistas de TLR4; agonistas de TLR5; agonistas de TLR7; agonistas de TLR8; agonistas de TLR9; y agonistas de CD1d. Moleculas inmunoestimulantes adecuadas incluyen, pero no se limitan a: imidazoquinolinas tales como imiquimod (“R-837”) [68,69] y resiquimod (“R-848”) [70], o sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato); derivados de fosfato de aminoalquilglucosaminida, tales como RC-529 [71,72]; a-glicosilceramidas, tales como a-galactosilceramida; 'ER 804057' de la referencia 73; E5564 [74,75]; etc.

Metodos para evaluar las respuestas de anticuerpos, neutralizar la capacidad y proteccion despues de la vacunacion del virus de la gripe son muy conocidos en la tecnica. Los estudios humanos han mostrado que los tltulos de anticuerpos contra la hemaglutinina del virus de la gripe humana se correlacionan con proteccion (una muestra de tltulo de inhibicion de hemaglutinacion del suero de aproximadamente 30-40 da aproximadamente el 50 % de proteccion de la infeccion por un virus homologo) [76]. Las respuestas de anticuerpos normalmente se miden por inhibicion de la hemaglutinacion, por microneutralizacion, por inmunodifusion radial simple (SRID) y/o por hemolisis radial simple (SRH). Estas tecnicas de ensayo son muy conocidas en la tecnica. Vacunas preferidas cumplen 1, 2 o 3 de los criterios del CPMP para eficacia. En adultos (18-60 anos), estos criterios son: (1) >70 % de seroproteccion;

(2) >40 % de seroconversion; y/o (3) un aumento de GMT de >2,5 veces. En ancianos (>60 anos), estos criterios son: (1) >60 % de seroproteccion; (2) >30 % de seroconversion; y/o (3) un aumento de GMT de >2 veces. Estos criterios se basan en estudios de etiqueta abierta con al menos 50 pacientes.

Las vacunas contra la gripe se recomiendan actualmente para su uso en inmunizacion pediatrica y de adultos, a partir de la edad de 6 meses. Asl, un sujeto humano puede tener menos de 1 ano de edad, 1-5 anos de edad, 5-15 anos de edad, 15-55 anos de edad, o al menos 55 anos de edad. Los sujetos preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 anos de edad, >60 anos de edad, y preferentemente >65 anos), la juventud (por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ejemplo, <5 anos de edad), sujetos hospitalizados, trabajadores sanitarios, personal de las fuerzas armadas y militar, mujeres embarazadas, los sujetos inmunodeficientes cronicamente enfermos, sujetos que han tomado un compuesto antiviral (por ejemplo, un compuesto de oseltamivir o zanamivir; vease mas adelante) en los 7 dlas antes de recibir la vacuna, personas con alergias al huevo y personas que viajan al extranjero. Las vacunas no son unicamente adecuadas para estos grupos, sin embargo, y pueden usarse mas generalmente en una poblacion. Para cepas pandemicas se prefiere la administration a todos los grupos de edad.

La administracion de mas de una dosis (normalmente dos dosis) es particularmente util en pacientes inmunologicamente sin tratamiento previo, por ejemplo, para personas que nunca han recibido una vacuna contra la gripe antes, o para vacunacion contra un nuevo subtipo de HA (como en un brote pandemico).

Reconstitucion usando un tampon

En otro aspecto, la invention proporciona un proceso de preparation de un antlgeno de vacuna, que comprende las etapas de (i) aumentar la concentration de un antlgeno en una composition llquida que incluye ese antlgeno usando filtration centrlfuga, para proporcionar un antlgeno concentrado, (ii) liofilizar el antlgeno concentrado, para proporcionar el antlgeno de vacuna liofilizado, y (iii) reconstituir el antlgeno de vacuna liofilizado en un tampon acuoso para proporcionar un antlgeno reconstituido; en el que la composicion llquida es una vacuna a granel.

Aparte del material que se usa para reconstitucion en la etapa (iii), detalles de este aspecto adicional son los mismos que ya se han descrito en el presente documento.

En el presente documento tambien se desvela un proceso en el que la etapa (i) no esta limitada a usar filtracion centrlfuga. Pueden usarse diversas tecnicas para la etapa de concentracion (i), que incluyen, pero no se limitan a: filtracion centrlfuga; ultrafiltracion; o filtracion de flujo tangencial (tambien conocida como filtracion de flujo cruzado). Estas tres tecnicas de concentracion no son mutuamente exclusivas, por ejemplo, la invencion pueden usar ultrafiltracion de flujo tangencial.

La filtracion de flujo tangencial (TFF) implica pasar un llquido tangencialmente a traves de una membrana de filtro. El lado de muestra normalmente se mantiene a una presion positiva con respecto al lado de filtrado. A medida que el llquido circula sobre el filtro, los componentes en el pueden pasan a traves de la membrana en el filtrado. El flujo continuado hace que aumente el volumen del filtrado, y as! aumenta la concentracion del antlgeno en el concentrado. El TFF contrasta con la filtracion de extremo muerto, en la que la muestra se pasa a traves de una membrana en vez de tangencialmente a ella. Muchos sistemas de TFF estan comercialmente disponibles. El MWCO de una membrana de TFF determina que solutos pueden pasan a traves de la membrana (es decir, en el filtrado) y cuales son retenidos (es decir, en el concentrado). El MWCO de un filtro de TFF usado con la invencion se seleccionara de forma que sustancialmente todo el antlgeno de interes quede en el concentrado.

La etapa de concentracion preferentemente aumenta la concentracion del antlgeno de interes al menos n veces, en la que n es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 o mas.

En este aspecto, la reconstitucion en la etapa (iii) usa un tampon (por ejemplo, un tampon fosfato, un tampon Tris, un tampon borato, un tampon succinato, un tampon histidina, o un tampon citrato). Los tampones normalmente se incluiran en el intervalo de 5-20 mM. Se prefiere un tampon fosfato. La reconstitucion usando agua, o usando un disolvente no acuoso, no es parte de este aspecto de la invencion.

La etapa (i) concentro el un primer volumen de llquido de antlgeno de vacuna, proporcionando una composicion con la misma cantidad de antlgeno en un segundo volumen de llquido (reducido). La etapa (ii) seco este material concentrado. Este material secado se reconstituye en un tercer volumen de tampon. El segundo volumen es inferior al primer volumen. El tercer volumen es tanto igual a como, preferentemente, inferior al segundo volumen (y asl, por definition, menor que el primer volumen, es decir, el proceso global ha proporcionado una forma acuosa mas concentrada del antlgeno en la composicion llquida inicial).

El antlgeno reconstituido de este aspecto puede usarse para formular vacuna ya lista descrita en el presente documento.

Este aspecto es particularmente util para preparar vacunas contra la gripe, que incluyen: vacunas monovalentes o multivalentes; vacunas derivadas de huevo o derivadas de cultivo de celulas; vacunas inactivadas o vivas; vacunas de antlgeno de superficie o de virus fraccionado; vacunas llquidas o solidas; etc.

En una realization, el antlgeno reconstituido con tampon se usa para recubrir microagujas como se ha descrito anteriormente.

General

El termino “que comprende” engloba “que incluye”, ademas de “que consiste”, por ejemplo, una composicion “que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composicion que esta “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Si es necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definition de la invention.

El termino “aproximadamente” en relation con un valor numerico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 5 %.

A menos que se establezca especlficamente, un proceso que comprende una etapa de mezclar dos o mas componentes no requiere ningun orden especlfico de mezcla. Asl, pueden mezclarse componentes en cualquier orden. Si hay tres componentes, entonces dos componentes pueden combinarse entre si, y entonces la combination puede combinarse con el tercer componente, etc.

Si se usan materiales de animal (y particularmente bovinos) en el cultivo de celulas, deben obtenerse de fuentes que estan libres de encefalopatlas espongiformes transmisibles (EET), y en particular libres de encefalopatla espongiforme bovina (EEB). En general, se prefiere cultivar las celulas en ausencia total de materiales derivados de animal.

Si un compuesto se administra al cuerpo como parte de una composicion, entonces ese compuesto puede sustituirse alternativamente por un profarmaco adecuado.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra cromatogramas de SEC de filtraciones centrlfugas. El eje x muestra el tiempo de retention (minutos) y el eje y muestra unidades de absorbancia. La Figura 1A muestra el antlgeno de partida. La Figura 1B muestra el concentrado despues de 45 minutos. La Figura 1C muestra el filtrado despues de 45 minutos.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION

Filtracion centrifuga

La filtracion centrifuga uso un dispositivo Millipore™ con un corte de 10 kDa, operada a 5000 rpm.

Se probaron tres duraciones de centrifugation: 15, 30 y 45 minutos. El retentato (concentrado) y el filtrado se comprobaron para ver la localization de una hemaglutinina del virus de la gripe. La Figura 1 muestra que el antlgeno esta todavla en el concentrado despues de 45 minutos. La concentration de antlgeno fue 3 veces despues de 15 minutos, 6 veces despues de 30 minutos y 13 veces despues de 45 minutos. La recuperation de antlgeno fue del 40 % despues de 15 minutos, 41 % despues de 30 minutos y 55 % despues de 45 minutos. Asi, se eligieron 45 minutos para trabajo adicional.

En el trabajo adicional, el antlgeno se liofilizo despues de la centrifugacion, proporcionando concentracion adicional. Se uso sacarosa como lioprotector, sola (a dos concentraciones diferentes) o con manitol. Se reconstituyo el material liofilizado. Las muestras reconstituidas contuvieron agregados visibles. Con respecto al material de partida, el contenido de HA (medido por ELISA) se concentro del siguiente modo:

Tratamiento

Concentracion (x)

Material de partida

1,0 x

Adicion de sacarosa

2,3 x

Adicion de sacarosa (mayor concentracion)

1,3 x

Adicion de sacarosa + manitol

0,8 x

Sacarosa, liofilizar, reconstituir

13,3 x

Sacarosa + manitol, liofilizar, reconstituir

8,5 x

Centrifugar, sacarosa, liofilizar, reconstituir

25,2 x

Centrifugar, sacarosa (mayor), liofilizar, reconstituir

28,4 x

Asi, la combinacion de centrifugacion y liofilizacion puede proporcionar una concentracion >25 veces en el contenido de HA del virus de la gripe. Las dos muestras centrifugadas tambien se evaluaron por SRID y mostraron un aumento de 21,1x y 35,1x en el contenido de HA, dando el mayor nivel de sacarosa de nuevo mejores resultados.

Ultrafiltracion (ejemplo proporcionado para referenda solo)

La ultrafiltracion uso un concentrador de celulas por agitation Amicon™ con una membrana de corte de 10 kDa hecha de celulosa regenerada, operada bajo nitrogeno presurizado durante 1 hora.

Si se anadio una liofilizacion, seguido de reconstitution de nuevo en el volumen de pre-liofilizacion, el material

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

reconstituido tuvo una concentracion de HA (como se mide por SRID) comparable al material de partida, que indica no perdida de antlgeno funcional. El material reconstituido fue estable durante >2 semanas.

REFERENCIAS

[1] Malke et al. (2010) The Internet Journal of Pediatrics and Neonaology. Vol 11, number 2.

[2] Koutsonanos et al. (2009) PLoS ONE 4(e): e4773.

[3] Quan et al. (2009) PLoS ONE 4(9):e7152.

[4] WO2007/030477.

[5] US-6945952.

[6] US-7211062.

[7] US-7182747.

[8] Oh et al. (2006) American Association of Pharmaceutical Scientists, 2006 Annual Meeting and Exposition. The AApS Journal. 8(S2). (Annual Meeting).

[9] Gill & Prausnitz (2007) J Control Release 117:227-37.

[10] WO2007/124393.

[11] WO2007/061964.

[12] WO2007/059289.

[13] Jin et al. (2009) Biomed Microdevices. 11 (6): 1195-203.

[14] Su et al. (2009) ACS Nano. 3(11):3719-29.

[15] Cui & Mumper (2002) Pharmaceutical Research 19:947-53.

[16] WO02/051382.

[17] WO2010/002418.

[18] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.

[19] WO02/28422.

[20] WO02/067983.

[21] WO02/074336.

[22] WO01/21151.

[23] WO02/097072.

[24] WO2005/113756.

[25] Huckriede et al. (2003) Methods Enrymol 373:74-91.

[26] WO96/37624.

[27] WO98/46262.

[28] WO95/18861.

[29] Bright et al. (2008) PLoS ONE 3:e1501.

[30] Crevar & Ross (2008) Virology Journal 5:131.

[31] WO97/37000.

[32] Brands et al. (1999) Dev Biol Strand 98:93-100.

[33] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7.

[34] Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50.

[35] Kistner et al (1998) Vaccine 16:960-8.

[36] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-1-10.

[37] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58.

[38] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21.

[39] WO03/076601.

[40] WO2005/042728.

[41] WO03/043415.

[42] WO01/85938.

[43] WO2006/108846.

[44] EP-A-1260581 (WO01/64846).

[45] WO2006/071563.

[46] WO2005/113758

[47] WO2006/027698.

[48] WO03/023021

[49] WO03/023025

[50] WO97/37001.

[51] EP-B-0870508.

[52] US 5948410.

[53] WO2007/052163.

[54] WO2008/068631.

[55] Rota et al. (1992) J Gen Virol 73:2737-42.

[56] GenBank sequence GI:325176.

[57] Holmes et al. (2005) PLoS Biol. 3(9):e300.

[58] McCullers et al. (1999) J Virol 73:7343-8.

[59] GenBank sequence 01:325237.

[60] Herlocher et al. (2004) J Infect Dis 190(9):1627-30.

10

15

[61] Le et al. (2005) Nature 437(7062): 1108.

[62] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96.

[63] Lasley (2007) Pediatric Asthma, Allergy & Immunology. 20(3): 201-5.

[64] Coop et al. (2008) Int Arch Allergy Immunol. 146(1):85-8.

[65] WO2009/001217

[66] Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173:1467-70.

[67] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[68] US 4.680.338.

[69] US 4.988.815.

[70] WO92/15582.

[71] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[72] Evans et al. (2003) Expect Rev Vaccines 2:219-229.

[73] WO03/011223.

[74] Wong et al. (2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42.

[75] US2005/0215517.

[76] Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un proceso de preparacion de antlgeno de vacuna contra la gripe liofilizado, que comprende etapas de (i) aumentar la concentracion de antlgeno de hemaglutinina en una composicion llquida que incluye ese antlgeno usando filtracion centrlfuga, para proporcionar un antlgeno concentrado, y (ii) liofilizar el antlgeno concentrado, para proporcionar el antlgeno de vacuna liofilizado;

   en el que la composicion llquida es una vacuna a granel.
2. 2. Un proceso de preparacion de un antlgeno de vacuna llquido reconstituido, que comprende etapas de: (a) liofilizar un antlgeno por el proceso de la reivindicacion 1; y (b) reconstituir el antlgeno de vacuna liofilizado en un llquido acuoso.
3. 3. El proceso de la reivindicacion 2, en el que el volumen del llquido acuoso usado en la etapa (b) es inferior al volumen de la composicion llquida usada al principio de la etapa (a).
4. 4. El proceso de la reivindicacion 2, en el que el volumen del llquido acuoso usado en la etapa (b) es inferior al volumen del antlgeno concentrado preparado durante la etapa (a).
5. 5. El proceso de la reivindicacion 2, la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4, en el que el antlgeno de vacuna llquido reconstituido se usa para formular una vacuna.
6. 6. El proceso de cualquier reivindicacion precedente, en el que la vacuna contra la gripe es una vacuna contra la gripe inactivada.
7. 7. El proceso de cualquier reivindicacion precedente, en el que la etapa (i) aumenta la concentracion de antlgeno al menos 10 veces.
8. 8. El proceso de cualquier reivindicacion precedente, en el que el antlgeno de vacuna liofilizado o el antlgeno de vacuna llquido reconstituido se usa para preparar una vacuna solida.
9. 9. El proceso de la reivindicacion 8, en el que la vacuna solida comprende microagujas biodegradables.
10. 10. El proceso de la reivindicacion 8, en el que la vacuna solida comprende una microaguja recubierta.
11. 11. El proceso de la reivindicacion 10, que comprende aplicar el antlgeno de vacuna llquido reconstituido a la superficie de una o mas microagujas solidas para proporcionar un dispositivo de microagujas recubiertas para inyeccion de la vacuna.
12. 12. El proceso de la reivindicacion 8, en el que la vacuna solida comprende una pellcula delgada.
13. 13. El proceso de la reivindicacion 12, que comprende mezclar el antlgeno llquido reconstituido con uno o mas pollmeros solubles por via oral, luego formar una pellcula usando la mezcla para proporcionar una pellcula delgada adecuada para administracion por via oral de la vacuna.
14. 14. El proceso de la reivindicacion 12, que comprende mezclar el antlgeno llquido reconstituido con uno o mas pollmeros topicamente solubles, luego formar una pellcula usando la mezcla para proporcionar una pellcula delgada adecuada para la administracion transcutanea de la vacuna.
15. 15. Un proceso de preparacion de una vacuna envasada, que comprende: (i) preparar una vacuna solida por el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14; luego (ii) envasar una vacuna solida en una bolsa de dosis unitaria individual.
16. 16. Un proceso de preparacion de una vacuna contra el antlgeno de la gripe, que comprende las etapas de (i) aumentar la concentracion de antlgeno de hemaglutinina en una composicion llquida que incluye ese antlgeno usando filtracion centrlfuga, para proporcionar un antlgeno concentrado, (ii) liofilizar el antlgeno concentrado, para proporcionar el antlgeno de vacuna liofilizado, y (iii) reconstituir el antlgeno de vacuna liofilizado en un tampon acuoso para proporcionar un antlgeno reconstituido;

    en el que la composicion llquida es una vacuna a granel.