JPH09511381A - インフルエンザワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ノイラミニダーゼ発現ベクターベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している）；該発現産物ノイラミニダーゼを培養培地から単離することによって得られる組換えノイラミニダーゼに関する。さらに本発明は、該組換えノイラミニダーゼを適用したワクチンおよびその製造方法ならびに精製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 インフルエンザワクチン 本発明は、組換えインフルエンザノイラミニダーゼ、組換えノイラミニダーゼ を宿主細胞中で発現しうる発現ベクター、組換えノイラミニダーゼの産生および 精製方法、インフルエンザに対するワクチンおよび本発明の組換えノイラミニダ ーゼの用途に関する。 インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスによる流行性感冒(インフルエンザ)は 、感染者に相当な被害を与え、社会生活および経済生活に大きな影響を及ぼす。 インフルエンザは高齢者および慢性疾患の患者において死亡率が高い。１９４０ 年代における流行の際に、鶏卵中で培養されたウイルス物質に基づく不活性ワク チンがインフルエンザ感染に対して明らかに効果があることがわかり、その結果 、危険率の高い集団の死亡率が大きく低下した。 インフルエンザウイルスは、その２つの表面抗原、すなわち血球凝集素ヘマグ ルチニン(ＨＡ)とノイラミニダーゼ(ＮＡ)において有意な抗原変異(いわゆる“ 抗原ドリフト”)を起こすため、咽喉管に生存するウイルスのなかでもユニーク である。 その上、特にインフルエンザＡ型ウイルスは、“抗原シフト”という現象によ って効果のある免疫を回避することができる。ヒトのウイルスにおいてこのよう な現象が出現するのは、インフルエンザ遺伝子の動物保菌者由来のＮＡ遺伝子に 起因するものである。かくして、１９５７年に、それまで流行していたＮＡ１型 のウイルスは新しいＮＡ２型のウイルスと置き換えられた。１９７７年以来、Ｎ Ａ１型のウイルスがヒト集団に再び戻って来ている。したがって、本発明ワクチ ンは好ましくはＮＡ１およびＮＡ２型ウイルスの両方に対応しうるものを目指さ ねばならない。 ＮＡはグリコシル基の末端シアル酸残基の除去に触媒作用を及ぼし、それによ ってＨＡの可能な受容体が破壊される(ゴッチャルク，１９５７；バーネットお よびストーン，１９４７)。ウイルスの集合の阻止および細胞間におけるウイル スの充分な拡散においてＮＡが本質的に関与していると考えられる(コールマン お よびワード，１９８５)。 それぞれのＮＡ分子(Ｍｒ＝２４０，０００)は、ジスルフィド架橋に結合し、 非共有結合によって共に交互に保持しあう２組のダイマーで築き上げられた４個 の同一のポリペプチド鎖からなるキノコ様構造をしている(ブッチャーおよびキ ルボーン，１９７２；レイバーおよびバレンタイン，１９６９；バルゲーゼら， １９８３；ワードら，１９８３)。ＨＡとは異なって、ＮＡは、非スプライス、 ＮＡ末端、親油性配列、いわゆる膜アンカーによって脂質膜につながれている( フィールズら，１９８３；ブロックら，１９８２)。構造全体のうち最も大きな 部分が膜の上に突き出ており、そこで伸長した“柄”領域の頂部に位置する末端 ・箱形状の“頭部”領域を形成する(リグレイら，１９７３)。該頭部の内側に、 各モノマーはそれ自身の触媒部位をもち、少なくとも４個のＮＡ結合グリコシル 基が含まれる(コールマンら，１９８３；ワードら，１９８２)。Ｏ−グリコシル 化の存在は、現在のところまだ説明されていない。 外部に局在しているために、ＨＡおよびＮＡ抗原は、宿主の免疫系にとって最 も重要なウイルス標的構造となっている。ＨＡに特異的に結合する抗体はウイル スの感染性を中和すると考えられ、それはおそらく早期段階の感染を遮断するこ とによるものであろう（ハースト，１９４２；キダら，１９８３)。ＮＡ特異的 抗体は通常、標的細胞の初期感染を阻止するのではなく(ジャヒエルおよびキル ボーン，１９６６；キルボーンら，１９６８；ヨハンセンら，１９８８)、ウイ ルスの拡散を阻止する。さらに、競合メカニズムにより、より頻繁に発生するＨ Ａ抗原のために、ＮＡに対する免疫応答が部分的に抑制されるように思われる( ヨハンセンら，１９８７；キルボーン，１９７６)。実際のところ、ＮＡ免疫の 効果は、ほとんどが中和性のＨＡ抗体によって覆い隠されている。このために、 ワクチン設計者たちの注意は、長い期間にわたってもっぱらＨＡに焦点を向けら れている。 しかし、多くの実験的観察結果から、インフルエンザに対する防御免疫の構築 において、ＮＡが実際に重要なパートを演じることが可能であることが示されて いる(シュルマンら，１９６８；ヨハンセンおよびキルボーン，１９９０；ヨハ ンセンら，１９９３)。ＮＡの免疫原能力に向けた基礎的な研究には、十分な量 の非常に純粋な抗原を、正確な三次元コンホメーションで利用できることが必要 である。現在のところ、ＮＡはウイルスのエンベロープを界面活性剤で処理する こと(ギャラガーら，１９８４；キルボーンら，１９６８)またはプロナーゼを用 いることが多いが、タンパク質頭部のタンパク質分解切断(セトら，１９６６； ロットら，１９７４)によって製造され、次いで精製されている。ある程度まで は利用可能であるけれども、これらの方法には収率および純度に関して無視でき ない限界がある。 したがって、本発明の目的は、天然のノイラミニダーゼに対応する抗原特性を もち、正確な作法で折り畳まれる組換えインフルエンザノイラミニダーゼを提供 することである。 このような実質的単離体である組換えノイラミニダーゼを、本発明にしたがっ て、 ａ)ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラ ミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当 な培養培地中で培養し(ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領 域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領 域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立 ち、シグナル配列が相内で連結している)；次いで ｂ)培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離する ことによって得ることができる。 培養培地に分泌される本発明の組換えノイラミニダーゼは、たとえば基礎的研 究に用いることができ、そこでは、ワクチン中でのＮＡの役割を決定するために 、ＮＡの単独のワクチン接種が行われる。しかし実際問題として、ワクチンによ る防御の度合(感染に対して効果的に防御される接種集団のパーセンテージ)およ び防御の持続性(後期流行性株に対する防御)を増強するために、組換えＮＡをＨ Ａと組み合わせて使用することはまだないであろう。 さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、培養培地 から発現産物であるノイラミニダーゼを単離することによって得られる組換えイ ンフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを提供する。これには実際問題として、た とえば、ｐＡｃ２ＩＶＡｓからの組換え発現モジュールを、野生型バキュロウイ ルスまたはその誘導体に乗り換えさせる操作が必然的に伴う。次いで宿主細胞を この組換えバキュロウイルスに感染させる。 組換えインフルエンザノイラミニダーゼの産生に用いる宿主細胞は、昆虫など の下等真核生物由来のもの、たとえば昆虫細胞系ｓｆ９が好ましいが、サッカロ ミセスまたはピチアなどの酵母細胞も使用しうる。 さらに本発明は、複製起点、膜アンカーをコードする領域を欠損したインフル エンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾 バージョン、コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナ ル配列、シグナル配列の５'に位置するプロモーターおよびコード領域の３'に位 置する転写ターミネーターを含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼ を発現するための２種のベクターに関する。さらに詳しくは、本発明は、複製起 点、膜アンカーをコードする領域を欠損したウイルス株“Ａ／ビクトリア／３／ ７５”のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域、またはそ の修飾バージョンを含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを 発現するためのベクターを提供する。 昆虫細胞中で発現するには、このようなベクターを野生型バキュロウイルスま たはその誘導体とともに細胞中に入れる。組換えバキュロウイルスは、二重相同 的組換えによって得られ、ここではベクターの発現モジュールがウイルスのゲノ ムに導入される。プラーク精製後、組換えバキュロウイルスのストックが得られ 、続いて、それを用いてｓｆ９細胞などを感染させることができる。 シグナル配列は、インフルエンザＮＡ２ウイルス“Ａ／ビクトリア／３／７５ ”の血球凝集素遺伝子由来のものであるのが好ましい。本発明は、ベクターｐＡ ｃ２ＩＶＮＡｓ(ベルギー、ベー−９０００ゲント、カー・エ・レーデガンクス トラート３５番、ラボラトリウム・ボーア・モレキュライル・ビーオロジー−プ ラシスデンコレクチエ(ＬＭＢＰ)に１９９４年１月３日に提出され、寄託番号は ＬＭＢＰ２９７６である)を用いて、二重相同的組換え手段によって、たとえば バキュロウイルスなどのウイルスを形質転換するのが好ましい。ここでは、転写 制御シグナル、シグナル配列およびコード領域からなるベクターの発現モジュー ルを、ウイルスのゲノムに組み入れる。 本発明の他の具体例においては、本発明にしたがって第２のベクターを使用す る。このベクターは酵母中で使用されることを企図されており、たとえば複製起 点、ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび柄部分をそれぞれコードする領域を欠 損しているウイルス株“Ａ／ビクトリア／３／７５”のインフルエンザＮＡ２ノ イラミニダーゼ遺伝子のコード領域、またはその修飾バージョン、コード領域の ５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列、シグナル配列の５' に位置するプロモーターおよびコード領域の３'に位置する転写ターミネーター を含む。 プロモーターおよびターミネーター配列は相同的であり、メチロフィック酵母 ピチア・パストリス由来であることが好ましく、アルコールオキシダーゼＩ遺伝 子配列などが該当する。シグナル配列はたとえば、サッカロミセス・セレビシア エのプレプロ接合因子αの分泌シグナルである。 このベクターｐＰＰ１ＩＶＶＡｆｌｓはベルギー、ベー−９０００ゲント、カ ー・エ・レーデガンクストラート３５番、ラボラトリウム・ボーア・モレキュラ イル・ビーオロジー−プラシスデンコレクチエ(ＬＭＢＰ)に１９９５年１月３日 に提出され、寄託番号はＬＭＢＰ３２２３である。 本発明の組換えノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルス、特にＮＡ２型 のインフルエンザウイルスに対する防御免疫を産生することが可能であることが 見いだされている。したがって、本発明はまた、組換えノイラミニダーゼを含む インフルエンザに対するワクチンに関する。 さらにまた本発明は、組換えノイラミニダーゼの製造方法および精製方法に関 する。 本明細書および請求の範囲において語句「ＮＡｓ」は、分泌可能な(組換え)ノ イラミニダーゼを意味する。「ｐＮＡ」は、プロナーゼで処理された天然のノイ ラミニダーゼを意味する。「ＮＡ」はノイラミニダーゼを意味する。 次に述べる実施例において本発明をさらに詳しく説明するが、この実施例は説 明の手段としてのみ意図されたものであり、本発明の範囲を限定するものではな い。 実施例１ 組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの発現、精製および特性付け 材料および方法 １.分泌されるノイラミニダーゼをコードする遺伝子の構築およびそのバキュロ ウイルス発現系への組込み ａ.プラスミド プラスミドｐＶ６／２１は、１コピーのＡ／ビクトリア／３／７５(Ｈ３Ｎ２) インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子を含むｐＢＲ３２２の誘導体 である(ヴァン・ロムプイら，１９８２)。ｐＳＶ５１およびｐＳＶ２３ｍとｐＳ Ｖ２４ｍの両方は、それぞれ後期および初期ＳＶ４０置換ベクターであり、他の 文献に記載されている(ヒュイルブレックら，１９８８)。ｐＳＲＳ−８は、Ａ／ ビクトリア／３／７５(Ｈ３Ｎ２)の血球凝集素(ＨＡ)遺伝子の出発配列を含むｐ ＰＬａ２３１１に基づくプラスミドである(ヒュイルブレックら，１９８８)。バ キュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ９４１が、ラッコウおよびサマー ズによって設計された(１９８９)。 ｂ.ＨＡシグナルペプチド配列のサブクローニング(ｐＩＶ−プレＨＡ) １８３０ｂｐのｐＳＲＳ−８のＢｓｔＮＩフラグメントをクレノウ酵素で満た した。ＰｖｕＩＩリンカー(ＧＣＡＧＣＴＧＣ)を続いて配列した。得られるフラ グメントおよびｐＢＲ３２２をＰｖｕＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、それぞれ７ ３１ｂｐおよび１６９９ｂｐのフラグメントを単離した。これらの２つのフラグ メントを連結して、Ｇ_-16(ＡＴＧ＝＋１，＋２，＋３)で出発するＨＡ遺伝子の ５'非翻訳領域、次いで完全なＨＡシグナルペプチド配列および成熟ＨＡの最初 の２，３個のコドンを含むｐＩＶプレＨＡを作成した。 ｃ.分泌されうるＮＡをコードするキメラ配列：ｐＡＴＩＶＮＡｓの構築 ｐＶ６／２１をＰｖｕＩで開環し、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼで処理した 。この混合物にＨｉｎｄＩＩＩリンカーを連結し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで切断 した。約１５００ｂｐのＮＡフラグメントを選択し、ｐＳＶ２３ｍの非反復Ｈｉ ｎｄＩＩＩ制限部位でクローニングした(ｐＳＶ２３ｍＩＶＮＡ)。左回りのイン サートをもつプラスミドをＦｎｕｄＩＩおよびＳａｌＩで続いて切断し、膜アン カー配列の欠損したＮＡ遺伝子を含む１２９１ｂｐフラグメントを回収した。ｐ ＩＶプレＨＡをＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩとともにインキュベートし、ＨＡシグ ナル配列をもつ８６１ｂｐのフラグメントを保存した。ＰｖｕＩＩ／ＰｓｔＩブ ラント末端の連結によって、最終的に両方のフラグメントを結合し、ｐＡＴ１５ ３の２２５３ｂｐ−ＳａｌＩ／ＰｓｔＩフラグメントに挿入し、ｐＡＴＩＶＮＡ ｓを得た。このプラスミドは、成熟ＨＡの最初の２，３個のアミノ酸、すぐに続 いてシグナルペプチド／膜アンカーを欠損したＮＡ配列および“柄”をコードす る領域の一部を含むＨＡのシグナルペプチドをコードする配列を有している。Ｈ ＡおよびＮＡフラグメントの連結によって、成熟ＨＡの５位に対応する単一のア ミノ酸が置換された(ＧｌｙからＡｌａへ)。ミン・ジョウら(１９８８)およびバ ン・ロムプイら(１９８２)の文献に記載の情報に基づき、ＮＡｓ中の連結部位に 隣接する予測されたＤＮＡおよびアミノ酸配列を図２に示す。 ｄ.バキュロウイルストランスファーベクターへのＮＡｓの組込み ｐＡＴＩＶＮＡｓの１３６８ｂｐ−ＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＳ Ｖ５１の５５６２ｂｐ−ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントおよびｐＳＶ２４ｍ の６２４ｂｐ−ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントに連結した。ＮＡｓ遺伝子を 含む１６４７ｂｐ−ＢａｍＨＩフラグメントの１コピーおよびＳＶ４０ポリ(Ａ) 部位を、ポリヘドリンプロモーターに対する正確な方向を考慮しながらｐＶＬ９ ４１の非反復制限部位へ続いて挿入し、ｐＡｃ２ＩＶＮＡｓを得た。この構築物 はＳｆ９細胞の同時トランスフェクション後の野生型ＡｃＮＰＶのＤＮＡとの相 同的組換えを可能にする。組換えウイルスの子孫は、サマーズおよびスミス(１ ９８７)に記載されている連続的プラーク精製操作によって単離した。 ２.昆虫細胞培養−ＮＡｓの産生 ルーチン培養のために、昆虫細胞Ｓｆ９を、１０％ウシ胎児血清および５０μ g／mlのゲンタマイシンを含むＴＣ１００培地中で集密的細胞単層として維持し た。組換えバキュロウイルスに感染させるために、８５０cm²の回転ビン内に培 養物を移し、２５rpmで回転して懸濁液２００ml中で成長させた。次いで、対数 増殖期の終わりに、懸濁細胞(２×１０⁶細胞／ml)を組換えバキュロウイルスに １.０モイ(ｍｏｉ：感染多重度)で感染させた。２時間後、感染細胞を新鮮な血 清フリーのＴＣ１００培地に移し、懸濁液をさらに４８時間インキュベートした 。下記のとおり、ＮＡｓを培地から精製した。 ３.インフルエンザＸ−４７ウイルスの成長 Ａ／ビクトリア／３／７５の天然のＮＡの製造源として、インフルエンザ株Ｘ −４７をプロナーゼで処理した後に用いた。Ｘ−４７ウイルスは、１１日齢の胚 の入ったニワトリの卵の卵黄嚢空隙中で培養した。２５.５℃で２日間インキュ ベートした後、卵を４℃で一夜冷却し、次の処理に用いるため卵黄嚢液を採集し た。 ４.緩衝液系 通例、次の緩衝液を用いた： 緩衝液Ａ：２０mM ジエタノールアミン/ＨＣｌ,ｐＨ８.５； 緩衝液Ｂ：５０mM ＮａＡｃ,ｐＨ５.５； 緩衝液Ｃ：１０mM ＮａＰ,ｐＨ７.４，１５０mMＮａＣｌ； 緩衝液Ａおよび緩衝液Ｃは、さらに４％ブタノール(他に特別に指示がない限り) および２mM ＣａＣｌ₂を含む。 ５.ＮＡｓの精製 ａ.硫酸アンモニウム分画 植え付け(上記参照)後、Ｓｆ９懸濁培養物(通例、約１リットル)を採集し、４ ０００×ｇで１５分間遠心分離を行って細胞レムナントを沈降させた。すべての 処理は４℃で行った。最初の精製段階においては、溶液に５mM ＮＡＮ₃を加える 。透明になった粗培地をｐＨ７.５にて硫酸アンモニウム分画に付した。２０％ から６０％の(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄で沈殿した物質を遠心分離(１００００×ｇ，６０分 ) によって集め、緩衝液Ａ(ブタノールなし)＋２０mM ＮａＣｌに、出発体積の１ ／１０の量にて溶解した。再溶解した沈殿物を同緩衝液５０体積に対して２４時 間透析(ｍｗｃｏ“モレキュラー・ウエイト・カット−オフ”)した。ここでは、 緩衝液を３回連続的に交換した。２００００×ｇで１５分間遠心分離して不溶成 分を除去した。 ｂ.セファロースＱ−アニオン交換クロマトグラフィー 透析した溶液に先ず４％ブタノールを加え、続いて緩衝液Ａ＋２０mM ＮａＣ ｌを流速２５ml／時間で通して平衡化したセファロースＱ−カラム(２.５cm×１ ０cm)に流した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、洗浄緩衝液から２５０mMまで のＮａＣｌの直線濃度勾配で溶離を行った(２５０ml，２５ml/時間)。ＮＡｓを 含む各２.５mlのフラクションを酵素活性およびＥＬＩＳＡレベルを測定するこ とによって同定した。ＮＡ活性は単一ピークとしてカラムから溶出した。 ｃ.Ｎ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースアフィニティークロマト グラフィー (非組換え)インフルエンザＮＡおよびバクテリアＮＡ酵素の精製のためのこの アフィニティーマトリックスの使用が文献に記載されている(カトルカサスおよ びイリアーノ，１９７１；ブッチャー，１９７７)。アフィニティーマトリック スの正確な分画は、初めに推奨された緩衝液条件を適用した場合にのみ達成され た。セファロースＱによる分離後に活性画分を集め、等量の２００mM ＮａＡｃ ，ｐＨ５.５を加えた。続いて、該活性画分を、緩衝液Ｂと１００mM ＮａＣｌで 平衡化したＮ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースカラム(１.５×５cm )に通した。続いて、平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、緩衝液Ｂで脱塩した。次 いで、緩衝液Ａで第２の洗浄段階を行った。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを加えた緩 衝液Ａを用い、流速１０ml／時間でＮＡｓを溶出した(２mlの画分を集めた)。 ｄ.スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー Ｃentriprep(登録商標)濃縮機(アミコン；ｍｗｃｏ：３０ｋｄ)を用いてアフ ィニティーカラムの溶出物を２.０mlに濃縮した。次いで、濃縮物を体積１.０ml のサンプル画分にて、緩衝液Ｃおよび４％ブタノールで平衡化したスーパーデッ ク ス２００ゲル濾過カラム(１.５cm×６０cm)を用いるクロマトグラフィーに付し た。流速１０ml／時間にてカラムを平衡化緩衝液で溶離し、１.０mlの画分を集 めた。長期貯蔵するために、−２０℃で関連画分を集め、前述のように濃縮し、 続いて最終濃度が５０％になるまでグリセロールを加えた。 精製タンパク質の分子量を評価するために、ウマの脾臓から得たアポフェリチ ン(４４３ｋｄ)、サツマイモから得たβ−アミラーゼ(２００ｋｄ)、酵母から得 たアルコール脱水素酵素(１５０ｋｄ)、ウシ血清アルブミン(６７ｋｄ)および炭 酸デヒドラーゼ(２９ｋｄ)でゲル濾過カラムを測定した(すべてシグマ・ケミカ ル・コーポレイションから入手)。 ６.ｐＮＡの製造および精製 ａ.プロナーゼ処理 Ｘ−４７に感染した鶏卵の卵黄嚢液をまず低速(１０００×ｇ，１０分)で遠心 分離して透明化し、次いで１３０００×ｇで１６時間遠心分離してウイルスを沈 降させた。ウイルス沈降物を１００感染卵等価物当たり１０mlの緩衝液Ｃに再懸 濁し、ウイルスをこれ以上精製をすることなく、２mg/mlまでのプロナーゼを加 えた。軽く振とうしながら、混合物を２０℃で１６時間インキュベートした。続 いて、残りのウイルスコアおよび不溶のプロナーゼ成分を４℃にて超遠心分離( １０００００×ｇ，１時間)によって除去した。次いで、放出されたＮＡ頭部を 含上清をカラムクロマトグラフィーにて精製した。 ｂ.セファロースＳ−カチオン交換クロマトグラフィー クロマトグラフィー操作は、４℃にて行った。粗ｐＮＡサンプルを５倍に希釈 し、５０mM ＮａＡＣ，ｐＨ５.５、２mM ＣａＣｌ₂および１％ブタノールを加え た。次いで、溶液を緩衝液Ｂ＋１％ブタノールおよび５０mM ＮａＣｌで平衡化 したセファロースＳカラム(１.５cm×１０cm)に流す。同じ緩衝液から５００mM ＮａＣｌまで直線勾配を用いて結合した物質を溶離した。ピークの酵素活性を示 す画分を集め、Ｃentriprep(登録商標)濃縮機(アミコン；ｍｗｃｏ：３０ｋｄ) を用いて２.０mlに濃縮した。 ｄ.スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー ＮＡｓの場合と同様にしてスーパーデックス２００ゲル濾過を行った(ブタノ ール濃度が１％である以外)。純ｐＮＡを５０％グリセロール中に−２０℃で貯 蔵した。 ７.ＮＡ酵素アッセイ ポティアら(１９７９)の方法に基づいて、ＮＡの触媒活性のアッセイを行った 。簡単に述べると、１００μlの反応体積にて、基質として１mMの２'−(４−メ チルウンベリフェリル)−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の存在下、−２０ ０mM ＮａＡＣ，ｐＨ６.５、２mM ＣａＣｌ₂および１％ブタノールを用いて酵素 試験を行った。３７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、０.５mlの１３ ３mMグリシン、８３mMのＮａＨＣＯ₃、６０mM ＮａＣｌ,pＨ１０.７を加えて反 応を停止した。３６５ｎｍの吸光度を測定することによって、遊離の４−メチル ウンベリフェロンを測定した。１ユニットは、１分間に１モルの４−メチルウン ベリフェロンを放出する酵素量として定義した。 ８.免疫学的技術 ａ.ポリクローナル抗ｐＮＡＩｇＧの製造 精製ｐＮＡに対するポリクローナル抗血清をニュージーランド系の３カ月齢の ウサギで作製した。一次免疫感作は、それぞれ投与量当たり５０μgのｐＮＡと ７５％のフロイントアジュバントを含む５００μlを四肢に筋肉内投与して行っ た。６週間後、動物は２つの対応する二次免疫注射を後肢に受けた。ＩｇＧ画分 を製造するために、タンパク質Ａセファロース(ファルマシアＬＫＢ)に吸着させ ることによって集めた血清を精製した。 ｂ.ＥＬＩＳＡ マイクロタイタープレートにウサギの抗ｐＮＡＩｇＧを塗布した。試験するサ ンプルを０.１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで希釈した。ウサギのビオチ ン化抗ｐＮＡＩｇＧ、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合 体(ベーリンガー)を用いて結合した抗原を検出した。該プレートをｐ−ニトロフ ェニルホスフェート(シグマ・ケミカル・コーポレイション)とともにインキュベ ートして酵素反応を促進した。マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍ に おける吸光度を測定した。 ９.分析方法 レムリ法(１９７０)に従い、１０％分離ゲル上でＳＤＳ／ＰＡＧＥを行った( 他に特記したもの以外は)。他に特記したもの以外は、β−メルカプトエタノー ルの存在下に全サンプルを変性した。１０％ゲル中で、マーカータンパク質とし て、ホスホリラーゼｂ(９４ｋｄ)、ウシ血清アルブミン(６７ｋｄ)、卵白アルブ ミン(４３ｋｄ)、炭酸脱水素酵素(２９ｋｄ)およびトリプシンインヒビター(２ ０.１ｋｄ、常に可視ではない)(ファルマシア)を用いた。勾配ゲルに次の質量標 準を展開した：ミオシン(２２ｋｄ)、β−ガラクトシダーゼ(１１６ｋｄ)、ホス ホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミン(バイオラド）。モリ シー(１９８１)に記載の方法の変更法によってゲル上で銀着色を行った。ブラッ ドフォード(１９７６)の方法により、ニワトリの卵白アルブミンを標準としてタ ンパク質濃度を定量した。 １０.架橋分析 １０mM Ｈｅｐｅｓ中の１.０Ｍ溶液(ｐＨ７)として、架橋分子ＢＳ³を新たに 調製した。濃度０.５mMのＢＳ³を、反応量３０μlにて加え、タンパク質を架橋 した。室温にて１時間インキュベートした。続いて、５μlの１.０Ｍトリス(ｐ Ｈ８.０)を加えて反応を停止した。ポリペプチドのパターンをＳＤＳ／ＰＡＧＥ で分析した。 １１.糖質分析 タンパク質サンプル(０.１μg〜１μg)を５００mMトリス／ＨＣｌ(ｐＨ８.０) 、５％ＳＤＳ、５０mMβ−メルカプトエタノール中で煮沸して変性した。最終Ｓ ＤＳ濃度の少なくとも７倍過剰となるように２.５％のＮＡ−オクチルグルコシ ドを加えた後、ＮＡ−グリカナーゼを加え(約０.５ユニット；製造者によるユニ ット)、反応混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。消化パターンをＳ ＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。 結果 １.ｐＮＡの精製 ここに記載した実験においては、合計１８６個の感染卵を処理した。異なる精 製段階とその結果を表１にまとめた。卵黄嚢液およびウイルスの沈積物を収穫し 、プロナーゼを濃度２mg/mlで加え、混合物を２０℃で１６時間インキュベート した。超遠心分離後、上清におよそ６０％のＮＡ活性が見られた。この条件下で は、活性の損失の主たる原因は、ウイルス粒子のＮＡ頭部の除去が不完全なこと であることがわかった。プロナーゼ濃度を高くすること、インキュベーション時 間を長くすること、またはインキュベーション温度を上げることは、ＮＡが徐々 に失活するのが促進されるため、これらによって収量が増加することはなかった (データは示さず)。続いて、粗ｐＮＡ物質を希釈し、ｐＨ５.５にした。次いで 、セファロースＳ−カチオン交換を行った。ｐＮＡを最大収量で得るために、す べての溶液に１％ブタノールを加えた。ほとんどのタンパク質は、セファロース Ｓカラムにしっかりとは固定されず、勾配溶離において、ＮａＣｌが４００mMの 時点において、ひとつのピークが記録されただけであった(示さず)。ＳＤＳ／Ｐ ＡＧＥにおいてコンタミネーションバンドが観察されなかったので、この物質は 、実質的に純粋なＮＡであった(図３Ａ、レーン３)。さらに、銀着色では、セフ ァロースＳプールとセファデックス２００ゲル濾過工程の間に少しも差異がなか った(図３Ａ、レーン３と４を比較せよ)。最後のカラムでは、画分６０において 分子量２１０ｋｄに対応する単一の鈴形状のピークが得られた(示さず)。連続精 製工程を図３Ａに示す。 ＳＤＳ／ＰＡＧＥでは、それぞれ約５４ｋｄと約５２ｋｄに対応する２本のバ ンドとしてｐＮＡを実際に目視することができた。ここで後者は、銀着色の相対 的強度から判るように、最も頻繁に現れるものであった。おそらく、この２つは 、柄領域の異なる２カ所の部位でプロナーゼによる好適な切断を受けたことから 誘導されたものである。化学製剤ＢＳ³との架橋から、ｐＮＡが真正の四量体タ ンパク質として回収されることが確認された(図３Ｂ)。 ２.ＮＡｓの構築および発現 インフルエンザＮＡ２株“Ａ／ビクトリア／３／７５”のＮＡ遺伝子を、その ＮＡ末端膜アンカーから分離し、代わりにシグナルペプチドスプライシング部位 を含むＡ／ビクトリア／３／７５ＨＡ遺伝子の５'配列に結合した。これによっ て、分泌可能で可溶性産物の合成が可能になった。得られるキメラ遺伝子は、成 熟ＨＡの最初の４個の末端アミノ酸のコドンを含むＨＡシグナル配列、すぐに続 いて膜通過部分(アンカー)および柄領域の一部(アミノ酸１〜４５)を欠損したＮ Ａ配列からなる。両方のＤＮＡ配列は、同じ読み取り枠内にあり、余分のアミノ 酸は導入されなかった。連結の結果として、成熟ＨＡタンパク質の５位に対応す るただひとつのアミノ酸置換が行われた(図２)。ｐＶＬ９４１を移入ベクターと して用いて、このキメラ配列の１個のコピーをＡｃＮＰＶバキュロウイルスのポ リヘドリンプロモーターの後に組み込んだ。Ｓｆ９昆虫細胞の植え付け後、可溶 性タンパク質が実際に産生されたことを示すＮＡ活性を培地中で迅速に検出した 。感染後およそ４８時間で培地中のＮＡｓ活性がプラトーレベルに達したことを 図４に見ることができる。さらにインキュベーションを行うと、おそらく細胞溶 解が拡大する結果と考えられるが、総タンパク質濃度が劇的に低下しはじめるの で、よい結果を生まなかった。親Ｓｆ９単層と広範囲の懸濁培養物間の中間の運 搬が最小に制限される場合に、発現が最も盛んであるらしいことが見出された( データ示さず)。種々の精製実験に基づき、ＮＡｓは６〜８mg/lで変化する濃度 および適度に低い産生能力で発現されるが、なおしかし、他の分泌される複合体 糖タンパク質について報告された収量(ジャービスら，１９９０)と比較可能なレ ベルであることを決定した。 ３.ＮＡｓの精製 ＴＣ１００培地を、可溶性タンパク質内容物の特異的酵素活性がピークに達す る感染の４８時間後に収穫した(図４)。ＮＡｓ精製の種々の工程を表１にまとめ た。粗培地に対し、２０％〜６０％飽和硫酸アンモニウム沈殿法を行うと、適度 に２倍の濃度の増加が得られ、物質の濃縮を行うことができた。大規模な透析お よび不溶生成物の除去を行った後、４％ブタノールを加えた。ブタノールを添加 することが、ＮＡｓの収量の増加に非常に有利な影響があり、特にタンパク質濃 度が低い場合に効果的であることが見出された。培地の疎水性の程度を限定する ことが、不溶性凝集物の形成を避けるのに必要であることも考慮しうることであ る。続いて、溶液をセファロースＱ−アニオン交換クロマトグラフィーによって 分画した(図５)。塩勾配の開始時に適度に対称的なピークでＮＡ活性が溶出した 。ＥＬＩＳＡ試験より、残りの画分にはＮＡ関連物質が含まれないことがわかっ た。この時点で、出発時のタンパク質の量のおよそ９７.５％が除去され、ほぼ ２０の要因によって特異的活性が増加した。次いで、Ｎ−(ｐ−アミノフェニル) オキサム酸アガロースカラムに通すために、溶液のｐＨを５.５まで下げた。初 期の実験から、ＮＡ置換オキサム酸が、インフルエンザＮＡの強い可逆的インヒ ビターであることが知られている(エドモンド，１９６６)。インフルエンザウイ ルスまたはバクテリアのノイラミニダーゼに対する選択的吸収体としてＮ−(ｐ −アミノフェニル)オキサム酸アガロースを使用することは、最初にカトルカサ スおよびイリアーノ(１９７１)によって、後にブッチャー(１９７７)によって証 明された。最初の操作にしたがって、高ｐＨの緩衝液(１００mM ＮａＨＣＯ₃， ｐＨ９.１)でノイラミニダーゼを溶離した。しかし、我々の実験では、これらの 条件では、ＮＡｓの溶出は不完全で、遅い結果しか得られなかった。しかし、ｐ Ｈを高め、かつ塩濃度を高めることによって、効果的な放出が達成できた。溶出 に先立って、低濃度の塩の存在下、ｐＨ８.５で追加の洗浄工程を行うことによ って、多量の非特異的に結合したタンパク質をカラムから除去した。緩衝剤とし てＮａＨＣＯ₃よりもジエタノールアミンの方を選ぶことによって、沈殿するこ となく２mM ＣａＣｌ₂を吸収することが可能になった。ＮＡ活性の保持力が、Ｃ ａ⁺⁺イオンに幾分左右されることが繰り返し報告されている(チョンら，１９６ ６；ヂモック，１９７１)。このことが本実験に相当するかどうかは詳細に調査 しなかった。 痕跡量の残留混濁物を除去するために、溶出液を限外濾過によって濃縮し、ス ーパーデックス２００ゲル濾過に付す(図６）。Ａ₂₈₀測定では、それぞれ約２０ ０ｋｄ、約１３０ｋｄおよび約５４ｋｄにおいて溶出した吸光度の異なる３つの ピークが生じた。ＥＬＩＳＡ法によって測定された溶出液の免疫反応性パターン は、記録された３つの各ピークのＡ₂₈₀プロフィールを正確に表現していること がわかったが、これはすべての物質がＮＡｓ特異的であることを示唆している。 ピーク画分のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析では、分子量の僅かな減少および画分数の増 加が認められたが、予測した領域である約５５ｋｄに強いバンドが現れた。(図 ７)。ＢＳ³を用いた架橋分析によって２２０ｋｄピークは四量体のＮＡｓである と同定された。一方、分子サイズが小さい方の２つのピークは、それぞれ二量体 および単量体のＮＡｓであることがわかった。ただし、ここで後者の形体は定量 的重要性に限定される(図７Ｂ)。球形体をもつと考えられる四量体や単量体ＮＡ ｓとは異なり、二量体ＮＡｓは、その棒様の構造のために、その現実の分子量よ りも僅かに上で溶出すると考えられる。より注目すべき事は、完全に組み立てら れた四量体構造のＮＡｓしか触媒活性を示さないことであった。四量体形状は、 酵素活性に必須とされる色々な局在的コンホメーション変化を引き出すことが可 能である。精製過程の工程表を表２に示す。 ４.ＮＡｓの特性 ＮＡｓをβ−メルカプトエタノールの存在下にＳＤＳと煮沸して変性すると、 ＮＡｓは完全解離して分子量約５５ｋｄの単量体鎖になった。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ ゲルの銀着色により四量体および二量体ＮＡｓは、均質に精製されることがわか った。単量体ＮＡｓについては、痕跡量の混濁物が目視されるので、僅かに質の 低いものであった。還元剤のない条件下で変性を行うと、四量体および二量体Ｎ Ａｓは、約１１０ｋｄの二量体鎖として移動した(示さず)。これらの結果から、 ＮＡｓ二量体はジスルフィド架橋により内部で結合しており、さらに非共有結合 的相互作用を介して会合することができ、それによって、天然のＮＡの構造に対 応する四量体タンパク質が形成されることが示された。 昆虫細胞が、哺乳類および他の高等細胞のＮＡグリコシル化パターンとは幾ら か異なるパターンを生み出すことが繰り返し報告されている(ヒシアおよびロビ ンス，１９８４；バターおよびヒュー，１９８１；バターら，１９８１；クロダ ら，１９９０)。したがって、組換えＮＡｓと会合したＮＡ結合糖質の量が、天 然のｐＮＡと比較して調査された。代表的なタンパク質サンプルをＮＡグリカナ ーゼ酵素で処理し、続いてＳＤＳ／ＰＡＧＥ法で分析した(図９)。バンドが相対 的に置き換わっていることから、ＮＡｓと会合したＮＡ結合糖質の合計量は、天 然の分子と比べて僅かに少ないと結論付けることができる(図９Ａと図９Ｂを比 較せよ)；この系で発現する他の糖タンパク質に対して行われた結果と一致する 知見である(クロダら，１９８６；ドミンゴおよびトロウブリッジ，１９８８； ヴァン・ドルネン・リッテルら，１９９１)。変性、酵素的脱グリコシルＮＡｓ 体が、そのオリジナルのオリゴマー構造にかかわらず、同じ電気泳動的挙動で移 動することも確立され、このことから、一次ＮＡｓが一様な鎖長のポリペプチド として合成されたことが確認される(図９Ｂ、レーン３，５および９を比較せよ) 。ＮＡグリカナーゼで処理されたポリペプチド鎖の分子量は、４７.５ｋｄと見 積もられ、これは予測されるアミノ酸配列から計算された理論的分子量４７，７ １７ｄに一致する。十分興味深いことに、グリコシル化二量体および単量体ＮＡ ｓと一致するバンドはゲル内で、グリコシル化四量体ＮＡｓから誘導されたバン ドよりもやや急速に移動するので、ＮＡグリコシル化の度合は、四量体を形成す る能力と関係しているように思われた(図９Ｂ、レーン２に対してレーン４およ び６；図７Ａも参照せよ)。ＮＡ結合糖質、さらに詳しくはＡｓｎ₂₀₀に結合する オリゴ糖質鎖が、隣接するサブユニットとの相互作用に介入することによって四 量体構造の安定化に一部役割を担うことができるということが示唆されている( バルゲーゼら，１９８３；バルゲーゼおよびコールマン，１９９１)。 四量体タンパク質のみがＮＡｓの触媒特性を有した。単離された四量体ＮＡｓ は、ほとんど精製ｐＮＡと同一の特異的活性レベルを呈した(表１および表２)。 各単量体は触媒部位を有しているが、低次構造のＮＡｓ体が酵素活性をもたない という知見は、おそらくインフルエンザＮＡの機能性における四次相互作用にと っての重大な役割を反映している。 ＮＡｓの抗原特性を確かめるために、等しい濃度のタンパク質サンプルを作り 、続いて２倍希釈し、ポリクローナル抗ｐＮＡＩｇＧに基づくサンドイッチＥＬ ＩＳＡで試験した(図１０)。四量体ＮＡｓでは、ｐＮＡの参考グラフと同様の滴 定曲線が得られたが、これは、両方が同一かまたは非常によく似た抗原特性をも つことを示している。抗原性に小さなシフトが認められるけれども、論証できる ような酵素活性がないにもかかわらず、二量体および単量体ＮＡｓの抗原活性は 実 質的にそのまま残っていた。抗原性におけるこの小さな差異は、抗原活性／Ａ_{28 0} 比が僅かに上回っている四量体ピークのゲル濾過プロフィールから同様に明ら かであった(図６)。天然の四量体構造に対して産生された多数の抗体分子は、不 完全に組み立てられたＮＡｓに効率的に結合すること、たとえば隣接するサブユ ニット間の接触領域を認識することが不可能であったということも有り得る。四 量体フォーメーションによって誘発される局部的な変化もまた、多数の微細な抗 原差異を引き起こす。 論考 本発明の主たる目的は、分泌され、正確に折り畳まれたタンパク質としてのイ ンフルエンザノイラミニダーゼの合成、およびワクチン用剤として使用しうる均 質な生成物を得るための精製操作の決定であった。ＮＡ２インフルエンザウイル ス株Ａ／ビクトリア／３／７５のＮＡ遺伝子から、シグナル配列(膜アンカー機 能)を有する元のＮＡ末端領域が、インフルエンザＨＡ遺伝子の５’配列の一部 と置き換えられたキメラ遺伝子を構築した。続いて、ＨＡから誘導された切断可 能なシグナルペプチドにより実質的に分泌可能なＮＡ(ＮＡｓ)をコードする、得 られる構築物を、強力なポリヘドリンプロモーターの転写調節下にバキュロウイ ルス発現ベクターに組み込んだ。宿主昆虫細胞Ｓｆ９の感染後、培養培地中にＮ Ａｓが分泌された。精製結果に基づいて、６〜８mg/lの範囲で発現のレベルを評 価した。バキュロウイルスに感染している間に、分泌による宿主細胞のタンパク 質切断能力が劇的に減少することが論証された(ジャービスおよびサマーズ，１ ９８９)。それにもかかわらず、記載された産生系は実験室スケールの予防接種 の研究に適用可能であり、相当なスケールアップにも好適である。 ＮＡｓの精製は、第１の硫酸アンモニウム分画段階、それに続く３種のクロマ トグラフィー段階を含む実質的に４段階の操作からなった。酵素活性の獲得につ いては、精製タンパク質としておよそ２５％のＮＡｓが回収されることを評価し た。ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより、ＮＡｓを予分別して、架橋分析 によりそれぞれ四量体、二量体および単量体ＮＡｓ(ここで後者はほんの少量し か存在しない)として同定される分子サイズの異なる３つの集団に分けた。主要 な２つの形体、四量体および二量体ＮＡｓは、約等量で得られ、ＳＤＳ／ＰＡＧ Ｅおよび銀着色で審査したところ均質であった。 ＮＡｓの酵素および免疫特性を評価するために、比較対称タンパク質として天 然のＮＡを単離することが必要であった。Ｘ−４７ウイルスのＡ／ビクトリア／ ３／７５ＮＡの頭部をプロナーゼ処理により切断し、次いでカチオン交換および ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。架橋後、ｐＮＡが完全な膜結合Ｎ Ａの四量体構造を保持していることを確認した。 ＮＡｓの触媒特性は、四量体タンパク質のみが酵素活性を呈するという非常に 変わったものであった。四量体ＮＡｓは、ほどんどｐＮＡに相当する特異的活性 を有した。二量体および単量体ＮＡｓが変性タンパク質であるという理由で単純 に不活性であったというのは可能性が低いことである。なぜなら、精製操作中こ れらの形体もまた、基質結合部位に基づくアフィニティークロマトグラフィーに よってしっかりと補足されたからである。これは、酵素の触媒部位は機能的に完 全にちがいないが、次に続く触媒への移行が明らかにできないことを示唆してい る。 ＮＡグリカナーゼ処理により、概してＮＡｓの糖質含量がｐＮＡの糖質含量と 比べて僅かに低いこと示されたが、これはこの系で発現する他の糖タンパク質に おいても認められることであった(クロダら，１９８６；ドミンゴおよびトロウ ブリッジ，１９８８；バン・ドルネン・リッテルら，１９９１)。ハイポグリコ シル化は、二量体および単量体ＮＡｓにおいて明らかに、より顕著であった。Ｘ 線回折分析による構造の研究から、Ａｓｎ₂₀₀に結合した糖質鎖が隣接するサブ ユニットの接触をより接近したものにすることが示されたが、これは、その鎖が 、四量体構造を強化するためのさらなる相互作用を提供したことを示唆している (バルゲーゼら，１９８３；バルゲーゼおよびコールマン，１９９１)。 精製ｐＮＡに対して産生されたポリクローナルＩｇＧとの四量体ＮＡｓの反応 性は実質的に完全であったが、これは、両方のタンパク質が非常に類似した抗原 特性をもつことを示している。二量体および単量体ＮＡｓの場合に抗原性の小さ いシフトを認めることは可能であった。これまでに述べてきたことから、四量体 構造のインフルエンザＮＡのみに結合するモノクローナル抗体を単離することが 可能であると推論することができた。このような抗体は、おそらく隣接するサブ ユニットから誘導された表面の抗原決定基との相互作用に入るか、あるいは別の 考え方として、四量体形成中のコンホメーション再構成後に形成されたエピトー プを認識する。さらに、糖質組成における差異もまた抗原特性を変更する。 実施例２ ピチア・パストリスによる組換えノイラミニダーゼの分泌 序論 昆虫細胞に加えて、酵母が組換えインフルエンザノイラミニダーゼ産生用の宿 主細胞として使用しうるかどうかを判定するために、ノイラミニダーゼの酵素的 “帽子”部位を含む発現ベクターを構築した。 材料および方法 １.ベクターおよび宿主 ピチア・パストリスのプラスミドｐＰＩＣ９（インビトロゲン製）を用いて発 現カセットを構築した。このプラスミドは、ピチア・パストリスの誘導可能なア スコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ）遺伝子の複製起点、アンピシリン耐性遺伝 子、プロモーターおよびターミネーター領域、サッカロミセス・セレビシアエの α因子のプレプロ分泌シグナル、ならびにピチア・パストリスのＨＩＳ４マーカ ーを含む。宿主としては、メチロトロフィックな酵母菌ピチア・パストリス（イ ンビトロゲン）を用いた。 ２.発現カセットの構築 部位特異的突然変異誘発法によって、Ａ／ビクトリア／３／７５のノイラミニ ダーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列にＳｔｕＩ制限部位を導入した。制限部位の位置は Ｐｒｏ７９とした。この制限部位を用いて、酵素的活性中心を含むノイラミニダ ーゼ遺伝子の免疫原性“帽子配列”を、ＳｔｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単 離し、ピチア・パストリスのプラスミドｐＰＩＣ９のＳｎａＢＩ制限部位にクロ ーニングすることができた。図１５はｐＰＩＣ９プラスミドの模式図を示す。図 １６はプレプロシグナル配列と組換えノイラミニダーゼの融合領域である。プロ ペプチドは外来性のＫＥＸ２プロテアーゼによって後期ゴルジ体内で切断される 。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）₂ジペプチドはＳＴＥ１３型のジペプチジルアミノペプチ ドによって除去される。外側のチロシン残基は切断されず、組換えノイラミニダ ーゼ上でＮ末端に残るが、これは不必要である。 ＳａｌＩ切断法によってＨＩＳ４選択マーカーの位置で得れらるプラスミドを 直線化し、続いてポリエチレングリコールの存在下にピチア・パストリスのＧＴ Ｓ１１５（his４）原形質体に形質転換した。形質転換体から単離されたＤＮＡ をサザン分析に付した。この分析により、内部（しかし欠失あり）his４座の位 置に相同的組換えを介して組み込まれた発現ベクターが示された。大部分の形質 転換体は１〜２コピーのプラスミドを有しているが、高度分泌能力をもつ形質転 換体は、タンデム構造で宿主ゲノムに全体を組み込まれた複数コピーのプラスミ ドを持つことがわかった。該コピーの数は形質転換体当たり２５に達していた。 ３.ノイラミニダーゼの発現 最小グリセロール緩衝培地（ｐＨ６．０）中で形質転換体を予備成長させ、４ ８時間後に、０．５％メタノールを含む最小緩衝培地に移した。この結果、アル コールオキシダーゼＩプロモーターが誘導され、ノイラミニダーゼの“帽子”が 発現した。公知のノーザン分析法を用いて、細胞中のノイラミニダーゼのｍＲＮ Ａ量を評価した。この結果、非常に効果的に誘導がなされたことがわかった。 細胞上清のウエスタン分析から、分子量約７０ｋＤａの組換えノイラミニダー ゼが分泌されたことがわかった（図１７参照）。 ＰＮＧアーゼＦを用いて分泌産物を脱グリコシル化した。これによって、予測 された４３ｋＤａという大きさの“コア”産物が産生された。コピー数に応じて 培地中の組換えノイラミニダーゼの収量が１〜１．５mg/リットルの間で変動す ることがわかった。 実施例３ 材料および方法 １．実験動物 免疫感作開始時に８週齢の雌性同系繁殖系Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＣＫ Ｍol 、ベルギー）を用いた。受動免疫感作実験において、被検マウスは１２週齢であ った。１ケージ（４１０cm²）あたり３匹のグループに分け、食餌と水を任意に 与えた。 ２．ウイルス インフルエンザ株は、Ａ．ダグラス博士およびＪ．スケール博士から入手した （ＭＣＲ・ラボラトリーズ、ミル・ヒル、ロンドン）。実験用ウイルスＸ−３１ およびＸ−４７はＨ３Ｎ２抗原組成物を含み、該組成物は、Ａ／ＰＲ／８／３４ （Ｈ１Ｎ１）を遺伝子的に再編成することにより、それぞれＡ／アイチ／２／６ ８（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）として誘導される 。両方のウイルスのストックを、マウスが死亡する程度に肺を通して何回も注入 することによって順応させた。 ３．組換え分泌可能ＮＡ（ＮＡｓ） インフルエンザＮＡ Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）を、実施例１で 記載したバキュロウイルス昆虫細胞発現系で産生された精製組換えタンパク質と して投与した。ここで記載する免疫感作実験で使用する精製ＮＡｓ票品には、リ ン酸緩衝塩溶液として四量体と二量体分子の混合物が含まれていた。 ４．アジュバント 我々自身の実験室で行った組換えインフルエンザＨＡの免疫感作研究に基づい て、適当なアジュバントを選んだ。Ｒｉｂｉアジュバント（モノホスホリル脂質 Ａ（ＭＰＬＡ）、トレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ）、スクアレン およびＴｗｅｅｎ８０を含む）とサルモネラ・チフィムリウムＭＰＬＡの入った ビンを製造者の指示書（Ｒｉｂｉイムノケム・リサーチ）にしたがって満たした 。ムラミル・ジペプチド（ＭＤＰ）はシグマ・ケミカル・コーポレイションから 購入した。 ５．免疫感作プロトコル １μｇのＮＡｓを２００μlの用量で３回、３週間間隔で皮下注射にてマウス に投与した。最初の免疫感作では、通常マウスに用いるＲｉｂｉ用量の半分量中 （２ ５μｇのＭＰＬＡ、２５μｇのＴＤＭ、２μlのスクアレンおよび０．１％のＴ ｗｅｅｎ８０に相当）に、ＮＡｓを乳剤化した。２５μｇのＭＰＬＡと２５μｇ のＭＤＰをＮＡｓに加えてブースター注射を行った。対照動物にはアジュバント のＰＢＳ溶液を投与した。 ６．受動免疫感作 ３回目の免疫感作後３週間目に、心臓穿刺によってドナーマウスから採血し、 同様に処理されたマウスの血清標品を集めた。被検マウスに４００μlの免疫ま たは対照血清を１回投与の腹腔内注射を行った。 ７．インフルエンザチャレンジ ブースター注射後３週間目または受動免疫感作後１日目、軽度にエーテル麻酔 したマウスに、２０ＬＤ₅₀の即位的ウイルスを鼻孔内接種した。次いで、接種後 １０日間の直腸の温度と体重を測定することによって、感染の進行の程度を追跡 した。 ８．血清学的方法 ワクチン接種開始前１日（免疫前血清）および各免疫感作後２週間目の血液サ ンプルを尾部動脈から採血した。ＥＬＩＳＡ法により、ＮＡ特異的抗体について 個々の血清サンプルを試験した。マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp） に精製ＮＡｓを塗布し（５０ng/ウエル）、血清を５倍に希釈した。アルカリホ スファターゼ（シグマ・ケミカル・コーポレイション）と複合したウサギの抗（ マウスＩｇＧ）抗体を加え、次いでｐ−ニトロフェノール基質溶液（シグマ・ケ ミカル・コーポレイション）をプレートに加えてインキュベートすることによっ て特異的抗体の結合を定量した。マイクロタイタープレートリーダーにて４０５ nmにおけるＯＤ値を測定した。対照ウエル（免疫前血清で処理）よりも０．５高 い吸光度が得られるｌｏｇ₅血清希釈の逆数としてＮＡ抗体の力価を表した。 結果 １．実験設計 上記免疫感作プロトコルに従い、１グループ１２匹のマウスのグループ３つに 、ＮＡｓのワクチン接種を行った。同数の対照マウスを平行してＰＢＳで処理し た。 続いて、ワクチン接種マウスと対照マウスからなる対のグループをマウス順応Ｘ −４７またはＸ−３１にチャレンジさせた。一方、該対グループを受動免疫感作 実験の血清ドナーとした。 ２．血清応答 各ケージから１匹ずつ取り出した、１２匹のワクチン接種動物と１２匹の対照 動物からランダムに選択した血清で行うＥＬＩＳＡによってＮＡｓに対する抗体 応答を追跡した。マウスにおいてＮＡｓ免疫感作を行うと、血清中のＮＡｓ抗体 が著しく増加した。最初のブースター注射は、およそｌｏｇ₅量の３倍のＮＡｓ 抗体を増加したが、第２のブースター注射ではＮＡｓ抗体の力価がさらにまた約 ５倍の増加を示した。対照マウスにおいては、アジュバントの１回投与では、Ｎ Ａｓと反応する特異的抗体の有意な産生はなされなかった。 ３．ＮＡｓによるホモ変異防御 ワクチン接種後３週間目のワクチン接種マウスと対照マウスに対し、２０ Ｌ Ｄ₅₀量のホモＮＡ変異ウイルスＸ−４７を投与することにより、免疫を検定した （図１２）。体温の低下および体重の減少が測定されたことからわかるように、 すべての対照マウスは重篤な罹患状態に陥った。感染後４日目に、最初の死亡マ ウスが現れ、すべての対照マウスはウイルス接種後９日以内にすべて死亡した。 反対に、ＮＡｓワクチン接種マウスにおける臨床パラメーターは、一時的かつ小 さく低下しただけであった。すべてのワクチンマウスは感染から助かった。 第３の免疫感作を行わない場合、同レベルの防御免疫が達成されうるのかどう かという点についても調べた（ＮＡｓおよび／またはアジュバントの用量を増加 することによって補償されるという可能性があると考えられる）。これらの試験 は実質的に同一の実験計画に沿って行った。この作法で免疫感作したマウスは一 般に良好な耐性を呈したが、少数の個体は重篤な罹患状態に陥った。また、生存 率が８０％以下になることは殆ど無かったが、ワクチン接種マウスにおいて死亡 するものも時折あらわれた。しかし、３回の免疫感作によって達成された防御免 疫のレベルは、全般にわたって優れたものであることがわかった。 ４．ＮＡｓによるヘテロ変異防御 ７年抗原ドリフトによってＡ／ビクトリア／３／７５から誘導されたＮＡｓか ら分離されるＮＡを含むヘテロ−ＮＡ−変異ウイルスＸ−３１の２０ ＬＤ₅₀量 を、ワクチン接種マウスおよび対照マウスの別のグループに感染させて免疫性を 試験した（図１３）。Ｘ−４７免疫感作実験においても観察されたように、臨床 結果は劇的なものであった。対照動物は感染後５日目で既に死亡するものがあら われ始めた。死亡率は８日目に最大値に到達し、その後生存したのは１匹だけで あった。ＮＡｓで免疫感作したマウスは、通常は致命的なヘテロ変異ウイルスに 感染したにもかかわらず、１００％の生存率を示した。ホモ変異免疫実験の場合 と同様に、ワクチン接種マウスは体温を適度に正常レベルで維持することができ た。体重の損失は、ホモ変異の場合と比べて幾らかは顕著であったが、すべての マウスが６日目以降回復を始めた。 ５．防御免疫はＮＡｓ免疫血清の受動伝達によって獲得することができる 受動免疫感作による動物防御が、誘発される防御免疫に対して主に応答可能で ある体液性防御メカニズムであるかどうかを決定するために、該動物防御を試験 した。この目的のために、標準的操作にしたがってドナーマウスを免疫感作した 。該ドナー動物から採血して、１個体あたり平均約４００μlの血清を得た。対 照血清と免疫血清をそれぞれ集めた後、４００μlの血清を被検マウスに腹腔内 注射にて１回で投与した。適合させたＸ−４７ウイルスの２０ ＬＤ₅₀量にチャ レンジさせる前に、抗体分子がマウス内で満遍なく拡散しうるように２４時間の 間隔をあける。対照血清を接種された動物は、すぐに急性の低体温症になり、体 重が激しく減少し、最終的に死亡に至ったが、ＮＡｓ免疫血清を投与されたマウ スは、能動的に免疫感作された動物と実質的に同程度に防御された（図１４）。 したがって、ＮＡ抗体を予め循環させておくことにより完全な防御が得られると いう結論を下すことができる。 論考 インフルエンザに対する免疫は、長い間ほとんどＨＡ抗体の機能についてのみ 研究されていたが、免疫に寄与するＮＡの重要性は実質的に無視されてきた。こ の状況は、ＨＡを結合しうる抗体のみがウイルスを直接中和する能力をもつとい う観察結果に一部由来するものであった（ハースト，１９４２；デイブンポート ら，１９６４；キダら，１９８３）が、ＮＡに対する抗体が、広範囲の濃度にお いて一次感染を防御しうることはわかっていなかった（ジャヒエルおよびキルボ ーン，１９６６；キルボーンら，１９６８；ヨハンソン，１９８９）。この寛容 はおそらく、インフルエンザウイルスのライフサイクルの後期部分で、新たに形 成されたウイルスが感染細胞の表面で凝集するのを妨げるように働くＮＡｓを反 映している（コールマンおよびウォード，１９８５；ブラウンおよびレイバー， １９６８）。ＨＡとは逆に、ＮＡはインフルエンザウイルスのエンベロープの成 分のうちで少ないほうの成分であり、ＮＡ抗体の非中和効果に寄与しうるという 事実がさらに発見された（シュルマンら，１９６８）。この存在モル比率の相違 が、同様に個々の抗原に対する相対的抗体応答に影響を及ぼす。全インフルエン ザウイルスと連続的に対決するために、ＮＡと比べてＨＡが相対的に過剰に提供 されることが繰り返されると、おそらくＮａ特異的Ｔ細胞の援助が覚醒される結 果として、ＮＡ抗体の産生を抑制することができた（キルボーン，１９７６；ヨ ハンソンら，１９８７；キルボーンら，１９８７；ヨハンソンら，１９８７）。 したがって、防御ＮＡ免疫を研究するために、ＨＡ抗体を中和することに対する 妨害が排除され、ＨＡ抗原およびＮＡ抗原の競合を介したＮＡ免疫応答の阻害が 回避されるというシステムを発展させることが必要である。古典的アプローチは 、天然のＮＡ成分の単離に基づいて行われる（シュルマンら，１９６８；ヨハン ソンおよびキルボーン，１９９０；ギャラガーら，１９８４）かまたは別の場合 では限定されたシリーズのインフルエンザ株と血清学的に異なるＨＡおよびＮＡ 抗原との組み合わせ投与に基づいて行われる（ロットら，１９７４；キルボーン ，１９７６）かのいずれかであった。しかし、本明細書に記載した結果は、精製 、組換えＮＡタンパク質を用いる防御免疫感作を直接に説明するものである。Ａ ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＮＡ遺伝子は、膜アンカーをコ ードする領域がインフルエンザ血球凝集素遺伝子のシグナル配列と置換されるこ とによって分泌可能なタンパク質（ＮＡｓ）をコードする遺伝子に形質転換され た（実施例１を参照）。 ＮＡ抗体がウイルス粒子の放出および拡散を阻害することによりウイルス成長 の収率を効果的に抑制することができるというインビトロ技術がすでに確立され ている（ジャヒエルおよびキルボーン，１９６８；キルボーンら，１９６８）。 肺におけるウイルス力価の低下および肺機能障害の進行の抑制を測定することに より、ＮＡで免疫感作された動物から、同様の結論が引き出された（１１，１２ ，１３）。肺でのウイルス複製におけるＮＡ免疫の効果に大きな注意が向けられ ていたけれども、純粋なＮＡタンパク質による免疫感作が、臨床疾患の症候を予 防しうるか、または潜在的に致命的なインフルエンザに感染した後の生存チャン スを改良しうるかどうかは疑わしかった。この疑問に対する満足のいく答えはま だ得られていなかった。しかし、本明細書で示す結果は、通常致命的なインフル エンザ感染に対する完全防御が、純粋な組換えＮＡｓで免疫感作することによっ て達成されうることをを明確に説明しており、ここでは、既往の抗ＨＡ免疫メカ ニズムまたは保存された内部ウイルスタンパク質の抗原に対する細胞性記憶免疫 効果は排除される。 本明細書で説明した実験においては、３週間の間隔をおいて、１μｇのＮＡｓ を３回投与してマウスの免疫感作を行った。ワクチン接種した動物は全部インフ ルエンザウイルスの致命的感染から生還することができた（ここでウイルスはホ モまたはヘテロ変異ＮＡを発現した）。感染ウイルスの投与量が多くても、非常 に驚くべきことに、体温および体重の変化によって示されるように、免疫感作し た動物は臨床疾患の症候を示さないままであった。ＮＡｓとともに投与されるア ジュバントがすべて低い反応原特性を有することに注意することが重要であり、 そのために、ここで述べた免疫感作操作がヒトのワクチン接種に直接適用しうる のである。さらに、本発明ワクチンは、他の哺乳動物および鳥類に適用可能であ る。 無垢の被検マウスにＮＡｓで免疫感作したマウスの血清を受動伝達しても、同 レベルの防御が得られたが、このことはＮＡｓ免疫感作の防御効果が、ＮＡ抗体 の循環に基づいて説明できることを示している。 ここに記載したヘテロ変異防御に関し、ワクチンＡ／ビクトリア／３／７５の ＮＡ抗原と変異感染ウイルスＸ−３１に存在するＡ／アイチ／２／６８のＮＡの 間の構造的関係を考慮することが重要である。残念なことに、Ａ／アイチ／２／ ６８（Ｈ３Ｎ２）のＮＡに関しては、適用できる配列データはないが、アイチ株 と同年に単離されたＡ／ＮＴ／６０／６８（Ｈ３Ｎ２）（ベントレーおよびブロ ウニー，１９８２）のＮＡ配列と比較することはできる。両方のＮＡ変異体の頭 部領域を綿密に調査すると、２８位にアミノ酸の置換が発見される（その点で、 主要部は分子の表面にある）。 本発明ワクチンは、さらになお移転したドリフト変異体に対する防御をも提供 しうる可能性がある。さらに、ＮＡの遺伝子修飾によって遺伝子の変化をその抗 原構造にアレンジしうることが考えられる。このことから、たとえば異なるバー ジョンのＮＡの“カクテル”を製造することが可能になり、したがって、異なる インフルエンザ株に対する広範な防御が獲得できる。 図面 図１は分泌可能なＮＡ遺伝子の構築およびバキュロウイルス運搬ベクターへの その組込みのための方策を示す。関連する制限部位のみを示す。一本線は細菌プ ラスミド配列を示すが、濃い部分はＨＡ特異的（ベタ塗り）またはＮＡ特異的（ 点付き）配列を示す。ＨＡシグナル配列をシングルハッチングで示す。ＮＡシグ ナル配列／膜アンカー配列をダブルハッチングで示す。 図２は正のｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列およびＨＡシグナルペプチドとその ＮＡ膜アンカーを除去されたＮＡの間の連結部位のフランキング領域のアミノ酸 配列を示す。 図２Ａは非切断ＨＡ、詳しくはＡｌａ₁₆とＧｌｎ₁₇間のシグナルペプチダーゼ 制限部位（垂直破線）を含む非切断ＨＡを示す。ＮＡｓの分泌に用いるＮＡ末端 セグメントを矢印で示す。 図２ＢはＮＡの“柄”領域を示す。ＮＡｓの構築に必要とされる先端切断配列 を矢印で示す。 図２ＣはＡおよびＢからＮＡｓ配列がどのように構築されるかを示す。ここに 詳細に示されるのは、ＨＡ特異的配列およびＮＡ特異的配列間の融合領域である 。 ＮＡｓはおそらく成熟ＨＡの４個のＮＡ末端アミノ酸で開始し、突然変異コドン （点線の下線）がそれに続く。 図３には、精製ｐＮＡのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。図３Ａは精製段階の異 なるｐＮＡから得られるタンパク質サンプルの分析結果である。レーン１はマー カータンパク質を示す；レーン２は粗ｐＮＡを示す（１μg；ｐＮＡバンドは検 出可能レベル以下である）；レーン３はセファロースＳによる精製物を示す（１ μg）；レーン４はスーパーデックス２００による精製物を示す（１μg）。図３ Ｂに示すのは、ＢＳ³法により架橋した１μgのｐＮＡの５．０％〜７．５％の勾 配ゲルである。レーン１はマーカータンパク質を示す；レーン２は架橋後のｐＮ Ａを示す。余分のバンドが約１０５ｋｄ（二量体）、約１６０ｋｄ（三量体）お よび約２１０ｋｄ（四量体）に現れている。 図４は、Ｓｆ９細胞に組換えバキュロウイルスを植え付けた後の、酵素活性レ ベル（○）および総タンパク質濃度（◇）から誘導される、培養培地中に検出さ れる特異的活性（□）の時間経過にともなう変化を示す。 図５には、セファロースＱによるアニオン交換クロマトグラフィーを示す。（ ２０〜６０）％の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄沈殿を溶解し、透析した後、溶液（９７．５m gタンパク質、１１７,０００Ｕ）をセファロースＱカラムに通した。出発緩衝液 にＮａＣｌを添加して濃度２５０mMへ向かうＮａＣｌの直線勾配（…）による溶 離を行う前に、非結合物質を洗い流した。溶出液のタンパク質濃度をＡ₂₈₀（― ）を測定して追跡した。２．５mlの画分を集め、酵素活性（○）およびＥＬＩＳ Ａにおいて抗原性活性（△）を試験した。 図６はスーパーデックス２００によるＮＡｓのゲル濾過を示す。Ｎ−（ｐ−ア ミノフェニル）オキサム酸アガロース分離後の溶離液（２．６３mgのタンパク質 、４９，１００Ｕ）を２．０mlまで濃縮し、続いてサンプル量１．０mlの画分に て流速１０ml／時間のスーパーデックス２００カラムのクロマトグラフィーに付 した。Ａ₂₈₀を継続的に追跡した（―）。個々の画分（１．０ml）を酵素活性（ ○）および抗原性活性（△）を試験した。矢印は較正タンパク質の溶出液量を示 す（本文参照）：４４３ｋｄ（１）、２００ｋｄ（２）、１５０ｋｄ（３）、６ ７ｋｄ （４）および２９ｋｄ（５）。 図７は精製ＮＡｓのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。各レーンはスーパーデック ス２００ゲル濾過の特定の画分番号に対応する。図７Ａは１０μlのサンプルを 変性（β−メルカプトエタノール添加）した後のＳＤＳ／ＰＡＧＥパターンを示 す。レーンＡおよびＢはマーカータンパク質を示す。図７Ｂでは、タンパク質サ ンプルをＢＳ³で架橋し、続いてＳＤＳが存在するけれども非還元的な条件下で 、５．０％〜７．５％の勾配ゲルの電気泳動によって分離した。画分５７〜６８ は、１０μlのサンプル液量；画分７０〜７７は２５μlのサンプル液量である。 四量体のＮＡｓは約２２０ｋｄ（四量体）および約１１０ｋｄ（二量体）でバン ドを形成する。二量体および単量体ＮＡｓは、それぞれ約１１０ｋｄおよび約５ ５ｋｄのバンドとして現れる。 図８は精製段階の異なるＮＡｓからのタンパク質サンプルのＳＤＳ／ＰＡＧＥ の結果を示す。レーン１はマーカータンパク質；レーン２は粗培地（５μg）； レーン３は（２０〜６０）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄沈殿（５μg）；レーン４はセファ ロースＱ精製物（２．５μg）；レーン５はＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサ ム酸アガロース分離後の精製物（１μg）；レーン６はスーパーデックス２００ ゲル濾過後の四量体および二量体ＮＡｓ画分（１μg）を示す。 図９は、ＮＡ−グルカナーゼ切断およびＳＤＳ／ＰＡＧＥから評価される、ｐ ＮＡとＮＡｓに結合した糖質含量の比較分析を示す。酵素ＮＡ−グルカナーゼは ３５ｋｄのバンドとして現れる。図９Ａでは、レーン１はマーカータンパク質； レーン２は非切断ｐＮＡ（１μg）；レーン３はＮＡ−グルカナーゼ処理したｐ ＮＡ（１μg）を示す。図９Ｂでは、レーン１および８はマーカータンパク質； レーン２は非切断四量体ＮＡｓ；レーン３はＮＡ−グルカナーゼ処理した四量体 ＮＡｓ；レーン４は非切断二量体ＮＡｓ；レーン５はＮＡ−グルカナーゼ処理し た二量体ＮＡｓ；レーン６は非切断単量体ＮＡｓ；レーン７はＮＡ−グルカナー ゼ処理した単量体ＮＡｓを示す。 図１０は、ＮＡｓとｐＮＡ間の抗原的な近同一性を説明する。ｐＮＡとＮＡｓ のサンプルを等しいタンパク質濃度とし、続いてＥＬＩＳＡにおいて２倍に希釈 した。図は特異的抗原に対して測定されたＳ字型の抗原性カーブを示す。ｐＮＡ は○；四量体ＮＡｓは◇；二量体ＮＡｓは□；および単量体ＮＡｓは△で示され る。 ＮＡｓに対する抗体応答を図１１で説明する。各免疫感作後１４日目に（矢印 で表示）、マウスから血液サンプルを採血し、ＮＡｓ抗体の存在をＥＬＩＳＡに て測定した(実験詳細については本文参照)。ベタ塗りバーおよびハッチングバー は、それぞれワクチン接種および対照動物の平均血清力価(±Ｓ．Ｄ)を表す。 図１２はホモ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは…；ＢおよびＣ では▼］および対照マウス［Ａでは―；ＢおよびＣでは●］を２０ ＬＤ₅₀のホ モ変異，マウス順応Ｘ−４７ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を記録 し、直腸温度（Ｂ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を追跡 した（実験詳細については本文参照）。データ点は平均値±Ｓ．Ｄで得る。 図１３はヘテロ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは…；Ｂおよび Ｃでは▼］および対照マウス［Ａでは―；ＢおよびＣでは●］を２０ ＬＤ₅₀の ヘテロ変異，マウス順応Ｘ−３１ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を 記録し、直腸温度（Ｂ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を 追跡した（実験詳細については本文参照）。データ点は平均値±Ｓ.Ｄで得る。 図１４は受動免疫感作による防御を示す。ＮＡｓ免疫血清［Ａでは…；Ｂおよ びＣでは▼］および対照血清［Ａでは―；ＢおよびＣでは●］の腹腔内注射によ ってマウスのグループを受動的に免疫感作した。２４時間後に、マウスは２０ ＬＤ₅₀のマウス順応Ｘ−４７ウイルスへのチャレンジを受けた（実験詳細は本文 を参照）。生存率、直腸温度および体重をそれぞれＡ、ＢおよびＣに示す。デー タ点は平均値±Ｓ.Ｄで得る。 図１５は、ＡＯＸＩプロモーターおよびターミネーター配列に加えて、ピチア ・パストリスのＨＩＳ４マーカーおよびサッカロミセス・セレビシアエのα因子 遺伝子のプレプロ分泌シグナルを含むプラスミドｐＰＩＣ９の模式図を示す。多 重クローニング部位は分泌シグナルの後に位置する。 図１６はプレプロ分泌シグナルとノイラミニダーゼの組換え“帽子”部分の間 の融合領域である。“ＫＥＸ２”は、後期ゴルジ体において外来性ＫＥＸ−２プ ロテアーゼによってプロペプチドが切断される位置を示す。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）₂ ジペプチドはＳＴＥ１３型のジペプチジルアミノペプチダーゼによって除去さ れる。チロシン残基はノイラミニダーゼ由来ではないが、除去されない。次のプ ロリンはＸ−４７ノイラミニダーゼの７９位に一致する。 図１７は、個々の形質転換体の５個の培地サンプルについての１２．５％ポリ アクリルアミドゲルのウエスタンブロットである。レーン１は非形質転換体のピ チア・パストリス株の培地サンプルを含む。ＴＣＡで沈殿した培養培地１ml中の タンパク質マテリアルをレーン毎に展開した。 この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２０ ０ゲル濾過後の液量は、２行程のクロマトグラフィーによる精製物を合わせたも のである。 この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２０ ０ゲル濾過後の特定の液量は、２行程のクロマトグラフィーからのＮＡｓ画分を 合わせたものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ミン・ジョウ，ヴィリー・アルフォンス ベルギー、ベー−9070 デステルベルゲ ン、ヤーガースストラート11番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノ イラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を 適当な培養培地中で培養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードす る領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコー ド領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に 先立ち、シグナル配列が相内で連結している）；次いで ｂ）培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離する ことによって得られる実質的単離体である組換えノイラミニダーゼ。 ２．組換え発現ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ（ＬＭＢＰ２９７６）を用いてウ イルスのゲノムの２重相同的組換えを行なってウイルスを形質転換し、該ウイル スに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで培養培地から発現 産物ノイラミニダーゼを単離することによって得られる、実質的単離体である組 換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ。 ３．組換え発現ベクターｐＰＰ１ＶＮＡｆｌｓ（ＬＭＢＰ３２２３）をトラン スフェクトさせた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで必要に応じて培 養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することによって得られる、組換え インフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ。 ４．宿主細胞が下等真核生物由来であることを特徴とする請求項１、２または ３に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。 ５．宿主細胞が昆虫細胞であることを特徴とする請求項１、２または４に記載 の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。 ６．昆虫細胞がｓｆ９昆虫細胞であることを特徴とする請求項５に記載の組換 えインフルエンザノイラミニダーゼ。 ７．宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項１、３または４に記載 の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。 ８．インフルエンザワクチン用の請求項１〜７に記載の組換えインフルエンザ ノイラミニダーゼ。 ９．ＮＡ２型インフルエンザワクチン用の請求項２〜７のいずれかに記載の組 換えインフルエンザノイラミニダーゼ。 １０．ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザノイラ ミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョン； ｂ）コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列 ｃ）シグナル配列の５'に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３'に位置する転写ターミネーター を含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。 １１．ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているウイルス株“Ａ／ビク トリア／３／７５”のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領 域、またはその修飾バージョン； ｂ）コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列 ｃ）シグナル配列の５'に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３'に位置する転写ターミネーター を含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するベクター 。 １２．シグナル配列がインフルエンザＮＡ２ウイルス“Ａ／ビクトリア／３／ ７５”（Ｈ３Ｎ２）の血球凝集素遺伝子由来であることを特徴とする請求項１０ または１１に記載のベクター。 １３．プロモーターがポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする請求 項１０、１１または１２に記載のベクター。 １４．転写ターミネーターがＳＶ４０および／またはポリヘドリン遺伝子由来 であることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載のベクター。 １５．寄託番号がＬＮＢＰ２９７６であるベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ。 １６．ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび柄部分の少なくとも一部をそ れぞれコードする領域を欠損しているインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の コード領域、またはその修飾バージョン； ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列 ； ｃ）シグナル配列の５'に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３'に位置する転写ターミネーター を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクタ ー。 １７．ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび柄部分の少なくとも一部をそ れぞれコードする領域を欠損しているウイルス株“Ａ／ビクトリア／３／７５” のインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域、またはその修飾バージ ョン； ｂ）コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列 ； ｃ）シグナル配列の５'に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３'に位置する転写ターミネーター を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現する ベクター。 １８．シグナル配列がサッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロシグ ナル配列であることを特徴とする請求項１６または１７に記載のベクター。 １９．プロモーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩプロモ ーターであることを特徴とする請求項１６、１７または１８に記載のベクター。 ２０．転写ターミネーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩ 遺伝子由来であることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれかに記載のベクタ ー。 ２１．寄託番号がＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ。 ２２．請求項１に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼを含むワクチ ン。 ２３．請求項２〜９に記載の組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを 含むワクチン。 ２４．インフルエンザに対するワクチンにおける請求項１に記載の組換えイン フルエンザノイラミニダーゼの使用。 ２５．ＮＡ２型のインフルエンザに対するワクチンにおける請求項２〜９に記 載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼの使用。 ２６．ａ）適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナ ル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダー ゼ遺伝子のコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコー ドする領域および必要に応じて柄部分をコードする領域を欠損している）または その修飾バージョンを含む発現ベクターを構築し； ｂ）得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細 胞を培養培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 ２７．ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シ グナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニ ダーゼ遺伝子のコード領域（該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠 損している）またはその修飾バージョンからなる発現モジュールを含む発現ベク ターを構築し； ｂ）ウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段 によって持ち込み； ｃ）得られた該形質転換ウイルスに宿主細胞を感染させ； ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を 培養培地中で培養し；次いで ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 ２８．ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シ グナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株“Ａ／ビクトリ ア／３／７５”のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域（ 該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している）またはその修飾 バージョンからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し； ｂ）組換えバキュロウイルスを得るために、野生型バキュロウイルスまたはそ れから誘導されたバキュロウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二 重相同的組換え手段によって持ち込み； ｃ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ； ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を 培養培地中で培養し；次いで ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 ２９．ａ）二重相同的組換え手段によって、寄託番号ＬＭＢＰ２９７６である ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓの発現モジュールでバキュロウイルスを形質転換し ； ｂ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を 培養培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 ３０．ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シ グナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株“Ａ／ビクトリ ア／３／７５”のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域（ 該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部分 をコードする領域を欠損している）またはその修飾バージョンからなる発現モジ ュールを含む発現ベクターを構築し； ｂ）得られた該組換えベクターで宿主細胞を形質転換し； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細 胞を培養培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 ３１．ａ）寄託番号ＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ でピチア・パストリスを形質転換し； ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換し； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細 胞を培養培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 ３２．硫酸アルミニウム分画手段を行い、次いで少なくとも１種のクロマトグ ラフィー処理を行う培養培地からの組換えノイラミニダーゼの精製方法。 ３３．クロマトグラフィー処理が、アニオン交換クロマトグラフィーを行い、 次いでアフィニティーマトリックスカラムに通し、さらにゲル濾過を行うことか らなる請求項３２に記載の精製方法。 ３４．クロマトグラフィー処理が、セファロースＱアニオン交換クロマトグラ フィーを行い、次いでＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸アガロースカラム に通し、さらにスーパーデックス２００ゲル濾過を行うことからなる請求項３３ に記載の精製方法。