ES2564541T3 - Hidrólisis eficiente de una lignocelulosa con producción integrada de enzimas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para degradar a una biomasa lignocelulósica previamente tratada, que comprende las etapas de: c) cultivar un microorganismo que es capaz de producir por lo menos una enzima que tiene una actividad celulolítica y/o hemicelulolítica en un medio de crecimiento, obteniendo de esta manera una suspensión rica en microorganismos, que comprende dicha por lo menos una enzima; d) elaborar el microorganismo y/o la suspensión rica en microorganismos de la etapa c), por (i) un tratamiento mecánico que comprende el sometimiento a una entrada de energía volumétrica de 1-500 kW/m3, durante un período de tiempo de 0,1-60 min; y/o (ii) un tratamiento mecánico que se selecciona entre un tratamiento con un mezclador, un tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino; y/o (iii) un tratamiento mecánico que implica bombear la suspensión espesa de fermentación que contiene microorganismos desde el recipiente de fermentación hasta el recipiente de hidrólisis; e) someter a una biomasa lignocelulósica previamente tratada conjuntamente con el producto de la etapa d) a la acción de un reactor para la hidrólisis de una biomasa con el fin de obtener unos azúcares solubles.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

DESCRIPCION

Hidrolisis eficiente de una lignocelulosa con produccion integrada de enzimas Campo del invento

El presente invento proporciona un procedimiento para la produccion biotecnologica de unos compuestos monomericos, tales como unos azucares y/o etanol a partir de una carga de alimentacion lignocelulosica.

Antecedentes del invento

Debido a los recursos limitados de aceites minerales y a las demandas para reducir las emisiones de CO2, la industria qmmica esta buscando unas secuencias de produccion mas sostenibles para la fabricacion de productos qmmicos de consumo de primera necesidad, tales como combustibles lfquidos y productos qmmicos de base. Una parte de esa estrategia se enfoca en la conversion de una biomasa lignocelulosica en unos productos qmmicos o combustibles versatiles, tales como etanol. Una biomasa lignocelulosica contiene una celulosa (~ 25-40 % p/p s.s.), hemicelulosa (~ 15-25 % p/p s.s.) y lignina (~ 15-30 % p/p s.s.) como componentes principales y unas cantidades minoritarias de otros hidratos de carbono, de ceras, de protemas y de compuestos inorganicos. La composicion espedfica de cualquier carga de alimentacion se puede determinar tal como ha sido descrito por Sluiter y colaboradores, 2008. Entre las formas de una biomasa vegetal, una masa lignocelulosica que se deriva de cualesquiera corrientes residuales forestales y agncolas, tales como los residuos de madera y la paja de los cereales, es particularmente bien idonea para la conversion de productos qmmicos de consumo y de combustibles a causa de su disponibilidad, su bajo costo y su produccion sana para el medio ambiente. Adicionalmente, los analisis de los ciclos de vida de los procesos de produccion, que utilizan unas cargas de alimentacion lignocelulosicas, indican unas reducidas emisiones de gases de invernadero cuando se compara con unos procedimientos que se basan en otras cargas de alimentacion.

Se han descrito diversas opciones de procesos que describen la conversion de una biomasa lignocelulosica en etanol y otros productos qmmicos basicos (Pejo y colaboradores, 2008). Para realizar estos procesos a una escala industrial es particularmente deseable transferir a los productos finales la maxima cantidad de energfa, de carbono y del contenido de masa que estan comprendidos en la carga de alimentacion renovable. En el momento presente, ninguno de los procesos de conversion que se han descrito ha llevado a realidad esto en su plena extension.

Unas tfpicas operaciones unitarias para la conversion biotecnologica de un material lignocelulosico (p.ej. una paja) en unos productos que anaden valor (p.ej. etanol) son: un desencolado mecanico, un tratamiento previo ffsico- qmmico, una hidrolisis enzimatica, una fermentacion y una recuperacion de los productos.

Una barrera clave en la realizacion de la produccion celulosica de etanol a escala industrial es la hidrolisis enzimatica eficiente en cuanto a los costos de una lignocelulosa previamente tratada con unas altas concentraciones de materiales solidos.

La hidrolisis de la fraccion de celulosa ha sido identificada como uno de los obstaculos principales en la conversion de una lignocelulosa en etanol. En el momento presente, el costo y el rendimiento de las enzimas que se requiere para una hidrolisis eficiente de biomasas son los principales “cuellos de botella”.

La conversion de materiales lignocelulosicos madereros o agncolas en unos azucares y adicionalmente en etanol es un proceso complejo que implica varias etapas que comprenden unas combinaciones secuenciales de un desencolado mecanico de una biomasa, un tratamiento hidrotermico previo, una hidrolisis enzimatica o qmmica de la biomasa, una fermentacion microbiana de unos materiales hidrolizados de la biomasa y una recuperacion de etanol realizada corriente abajo del proceso mediante una destilacion o unos procesos equivalentes tecnologicos.

[Desencolado mecanico de una biomasa]

Unas tfpicas etapas de desencolado implican un tratamiento mecanico, tal como de corte, trituracion o molienda, de la carga de alimentacion, que tfpicamente requiere un importante consumo de energfa y provoca unos importantes costos operativos. Las cargas de alimentacion son cortadas o trituradas a la forma de unas partfculas que tienen un tamano situado entre 0,5 mm y 2 cm, lo cual hace posible un proceso uniforme de suspension dentro de una fase acuosa. El hecho de suspender las partfculas de una carga de alimentacion dentro de una suspension espesa bombeable que puede ser transferida a unas operaciones unitarias realizadas corriente abajo requiere grandes cantidades de agua, lo cual se suma adicionalmente a los costos de funcionamiento del proceso (Tolan, 2002).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[Tratamiento previo]

La conversion de un material lignocelulosico en unos productos, tales como el etanol, comprende con frecuencia una etapa de tratamiento previo ffsico-qmmico. El tratamiento previo tiene como finalidad retirar y separar una hemicelulosa con respecto de una celulosa, romper y retirar la envoltura de lignina, disminuir la cristalinidad de la celulosa, aumentar el area de superficie accesible de la celulosa y/o aumentar el tamano de poros de la celulosa para facilitar la penetracion de los agentes de hidrolisis (Tolan, 2002; Wyman y colaboradores, 2005). La etapa de tratamiento previo moviliza preferentemente a la fraccion de pentosas de dicha biomasa, al mismo tiempo que aumenta la digestibilidad de la fraccion solida que contiene celulosa (Wyman y colaboradores, 2005).

La etapa de tratamiento previo se lleva a cabo con frecuencia usando una suspension espesa acuosa. Preferiblemente, dicha suspension espesa tiene un alto contenido de materiales solidos, conteniendo una masa seca de la carga de alimentacion en el orden de 20 a 40 % (p/p). El procedimiento de tratamiento previo comprende con frecuencia un tratamiento hidrotermico presurizado (a ~ 100-250 °C) de la biomasa en la ausencia o presencia de unos catalizadores de caracter acido (esto es, H2SO4, HCl, H3PO4) o basico (esto es, NH4OH, NaOH, KOH, cal), que se anaden en unas concentraciones situadas entre 0,1 y 15 % p/p de la carga de alimentacion (Kumar y colaboradores, 2009a; Kumar y colaboradores, 2009b; Kumar y colaboradores, 2009c, Wyman y colaboradores, 2005). Los penodos de tiempo de reaccion vanan entre 10 s (segundos) y 2 h (horas) para proporcionar una transformacion eficiente de los componentes de la biomasa como preparacion para la hidrolisis y la fermentacion de la biomasa.

Unas estrategias alternativas de los tratamientos previos comprenden unos tratamientos hidrotermicos suaves combinados con la utilizacion de unos disolventes organicos o de unos lfquidos ionicos para reducir la recalcitrancia de la biomasa y solubilizar a los componentes de lignina y celulosa de la biomasa. Estas ultimas opciones de tratamiento previo tienen con frecuencia unos costos mas altos y una eficiencia limitada.

Chandra y colaboradores (2007) han descrito que un tratamiento previo hidrotermico en la ausencia o presencia de un acido diluido es un metodo preferible para reducir la recalcitrancia de la biomasa a la hidrolisis, puesto que el moviliza a la hemicelulosa y despolimeriza parcialmente a la lignina sin que se produzca ninguna solubilizacion. Adicionalmente, el da como resultado unas fibras celulosicas amorfas con una gran area de superficie, que es ideal para una hidrolisis enzimatica.

Dependiendo de la naturaliza de los catalizadores y del perfil de temperaturas que se aplique, un tratamiento previo puede conducir tambien a la formacion de unos agentes inhibidores solubles, que incluyen el acido acetico, un azucar (p.ej. el furfural, el HMF) y unos productos de degradacion de la lignina, que pueden reducir la efectividad de unos procesos de hidrolisis y de fermentacion realizados corriente abajo (Margeot y colaboradores, 2009). Para aumentar la efectividad de la hidrolisis y de la fermentacion, el material sobrenadante del tratamiento previo necesita ser desechado o puede ser desintoxicado (Tolan, 2002).

[Hidrolisis de una biomasa previamente tratada]

La descomposicion de la suspension espesa de biomasa previamente tratada en unos azucares monomericos fermentables se puede ejecutar mediante una hidrolisis catalizada ya sea por unos acidos o por unas enzimas. La hidrolisis enzimatica es mas selectiva y precisa menos intensidad de energfa que unas metodologfas qmmicas comparables (tales como la que se basa en los acidos), proporcionando por lo tanto unas condiciones economicas mas favorables de los procesos y potencialmente un rendimiento mas alto de etanol durante una fermentacion.

Los sistemas de enzimas son unas mezclas de mas de una actividad enzimatica. Unos apropiados sistemas de enzimas son en este sentido unos sistemas de enzimas que convierten a unos azucares polimericos, tales como una celulosa y una hemicelulosa, en unos monomeros de hexosas (por ejemplo glucosa) y de pentosas (por ejemplo xilosa) que contienen tipicamente actividades de celulasa, hemicelulasa y beta-glucosidasa. Los sistemas de enzimas que contienen actividades de celulasa y beta-glucosidasa se producen con frecuencia en unos cultivos lfquidos sumergidos de hongos, p.ej. Trichoderma sp. y/o Aspergillus sp..Un residuo de biomasa fungica es separado usualmente desde el caldo de fermentacion y desechado. Luego el caldo de fermentacion es concentrado, estabilizado y formulado para que sea enviado el resultante producto enzimatico.

La hidrolisis enzimatica de una biomasa se conduce corrientemente en unas condiciones en las que la dosificacion total de enzimas comprende 1 - 5 % p/p (10-20 FPU/ g de celulosa) de las cargas de alimentacion. Dependiendo del regimen de dosificacion y de la composicion espedfica de actividades del sistema de enzimas aplicado, una biomasa es hidrolizada a 40 - 55 °C durante 1 - 7 dfas. Hasta aproximadamente un 80-90 % p/p de los azucares polimericos contenidos en la biomasa se convierten en sus respectivos monomeros.

De acuerdo con Kristensen y colaboradores (2009) la hidrolisis enzimatica de una biomasa se conduce con frecuencia con un mas bajo contenido de materiales solidos de 10 - 20 % p/p. Un contenido de materiales solidos

que esta situado por encima de 15 % p/p conduce con frecuencia a unas perdidas significativas en los rendimientos de azucares monomericos. Este efecto es debido a los problemas que estan asociados con la mezcladura homogenea de unas suspensiones espesas que tienen un alto contenido de materiales solidos, conduciendo a una distribucion irregular de las enzimas. Ademas, una acumulacion de productos finales, tales como celobiosa y 5 glucosa, que se liberan durante una hidrolisis enzimatica puede conducir a una inhibicion inherente de las actividades de celulasa y beta-glucosidasa (Xiao y colaboradores, 2004a).

Cardona & Sanchez (2007) describen el uso de un material sobrenadante del tratamiento previo y/o de unos materiales hidrolizados previos de biomasas como un substrato para la induccion del crecimiento y de las enzimas para la produccion de enzimas fungicas. Howard y colaboradores, (2003) describen el uso directo de un caldo de 10 fermentacion lfquido agotado procedente de la fermentacion fungica para realizar la hidrolisis. Rao y colaboradores, (1985) indican la utilizacion de la suspension espesa entera de fermentacion fungica para una hidrolisis eficiente de substratos de celulosas. Unos medios artificiales se usaron para la produccion de enzimas para hidrolisis, que no permite ajustar a medida de los deseos los sistemas de enzimas para hidrolisis para una espedfica opcion de carga de alimentacion y/o de tratamiento previo. Otra desventaja del metodo descrito por Rao y colaboradores, (1985) 15 consiste en que el esta limitado a unas actividades enzimaticas secretadas, puesto que no se ha emprendido nada para facilitar la liberacion de enzimas no secretorias o que estan fijadas a la superficie de celulas.

Cuando unos sistemas de enzimas que se derivan de Trichoderma se usan para la hidrolisis de biomasas unas actividades de beta-glucosidasa extracelulares se vuelven con frecuencia limitadoras de la velocidad y del rendimiento debido a su actividad espedfica, que es bastante baja, y a la significativa inhibicion de los productos 20 finales por la glucosa que se ha liberado durante el proceso (Xiao y colaboradores, 2004a), Shewale, 1982). Por lo tanto, unas preparaciones de una enzima celulasa o unas mezclas de ellas son suplementadas tfpicamente con unas actividades alternativas de beta-glucosidasa (BGL), puesto que ellas son producidas por ejemplo por Aspergillus niger (Seidle y colaboradores, 2004). Unos regfmenes de dosificacion patrones para preparaciones de BGL recomiendan la adicion de 0,01 a 2 unidades de celobiasa (CBU) por g de celulosa para aumentar la cinetica de 25 hidrolisis y los rendimientos de azucares monomericos (Chauve y colaboradores, 2010).

Unas estrategias alternativas para afrontar el problema tecnico de la hidrolisis de biomasas con mas altas concentraciones de materiales solidos comprenden unos procesos que realizan simultaneamente una hidrolisis enzimatica y una fermentacion (SSF).

[Fermentacion de etanol]

30 La produccion industrial de etanol se lleva a cabo tradicionalmente por medio de la levadura S. cerevisiae. Unas nuevas cepas microbianas (ya sea levaduras o bacterias) han sido tratadas recientemente por ingeniena genetica para utilizar eficientemente tambien unos azucares que no son glucosa, que se derivan de la materia prima lignocelulosica. La utilizacion de pentosas y de todas las hexosas mejora la econoirna de la produccion de etanol.

[Recuperacion del producto]

35 El etanol es recuperado tfpicamente a partir de los medios de fermentacion por unos conocidos metodos de destilacion y/o rectificacion.

Problema que se ha de resolver

Las tecnicas convencionales para la degradacion de una biomasa, o bien son ineficaces o dependen de la adicion, que consume tiempo y gastos, de unas enzimas o unas mezclas de enzimas que se han producido por separado, 40 que son apropiadas para la degradacion de la biomasa espedfica. Por lo tanto, el objetivo del presente invento es la creacion de un procedimiento mejorado para la degradacion de una biomasa, tal como una biomasa lignocelulosica, mediando evitacion de estas desventajas.

Sumario del invento

El presente invento proporciona un procedimiento para degradar una biomasa lignocelulosica previamente tratada, 45 que comprende las etapas de:

c) cultivacion de un microorganismo que es capaz de producir por lo menos una enzima que tiene una actividad celulolftica y/o hemicelulolttica en un medio de crecimiento, obteniendose de esta manera una suspension rica en microorganismos, que comprende dicha por lo menos una enzima;

d) elaboracion del microorganismo y/o de la suspension rica en microorganismo de la etapa c) por 50

(i) un tratamiento mecanico que comprende el sometimiento a una entrada de energfa volumetrica de 1-500 kW/m3, durante un penodo de tiempo de 0,1-60 min;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

y/o

(ii) un tratamiento mecanico que se selecciona entre un tratamiento con un mezclador, un tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino;

y/o

(iii) un tratamiento mecanico que implica bombear la suspension espesa de fermentacion que contiene microorganismos, desde el recipiente de fermentacion hasta el recipiente de hidrolisis;

e) sometimiento conjunto de una biomasa lignocelulosica previamente tratada y del producto de la etapa d), a la accion de un reactor para la hidrolisis de una biomasa con el fin de obtener unos azucares solubles.

Opcionalmente, la biomasa lignocelulosica previamente tratada se ha obtenido a partir de una biomasa lignocelulosica mediante un tratamiento ffsico-qmmico. Es posible que el medio de crecimiento de la etapa c) comprenda una biomasa lignocelulosica, que preferiblemente ha sido tratada previamente. En una forma de realizacion particular de lo anterior, el medio de crecimiento final, en el que es cultivado el microorganismo, comprende una parte de una suspension espesa previamente tratada, de manera tal que el procedimiento para degradar una biomasa lignocelulosica comprende las etapas de:

a) un tratamiento previo ffsico-qmmico de una biomasa lignocelulosica para obtener una suspension espesa previamente tratada;

b) separacion de la suspension espesa previamente tratada de la etapa a) en dos partes, la parte A y la parte B;

c) incorporacion de la parte A en un medio de crecimiento en bruto para proporcionar un medio de crecimiento final, y cultivacion de por lo menos un microorganismo capaz de producir por lo menos una enzima que tiene una actividad celulolffica y/o hemicelulolffica en el medio de crecimiento final, obteniendose de esta manera una suspension rica en microorganismos que comprende dicha por lo menos una enzima;

d) elaboracion del microorganismo y/o de la suspension rica en microorganismos de la etapa c), en que dicha elaboracion comprende un tratamiento mecanico que es uno o mas de los siguientes:

(i) un tratamiento mecanico que comprende el sometimiento a una entrada de energfa volumetrica de 1-500 kW/m3 durante un peffodo de tiempo de 0,1-60 min;

y/o

(ii) un tratamiento mecanico que se selecciona entre un tratamiento con un mezclador, un tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino;

y/o

(iii) un tratamiento mecanico que implica bombear la suspension espesa de fermentacion que contiene microorganismos, desde el recipiente de fermentacion hasta el recipiente de hidrolisis;

e) sometimiento conjunto de la parte B y del producto de la etapa d) a la accion de un reactor para la hidrolisis de una biomasa con el fin de obtener unos azucares solubles.

Los hongos son unos microorganismos preferidos en la etapa c). La elaboracion de la etapa d) puede realizarse por medios ffsicos o mecanicos o qmmicos o por una combinacion de ellos. Los azucares solubles, obtenidos a partir de la etapa e), pueden ser sometidos opcionalmente a unos procesos de conversion realizados corriente abajo, tales como la produccion de etanol. Con esta finalidad, se puede llevar a cabo por ejemplo una separacion del tipo de solido/ffquido para obtener una fase lfquida rica en azucares, que comprende los azucares solubles.

El presente invento crea un procedimiento mejorado para la hidrolisis de una biomasa lignocelulosica. El presente invento describe un procedimiento de hidrolisis y fermentacion para la produccion de etanol a partir de los residuos de una biomasa lignocelulosica (un ejemplo del cual se muestra en la Fig. 1), que integra la utilizacion eficiente de una produccion de enzimas integrada.

De acuerdo con el presente invento, la produccion de unas enzimas para hidrolisis es integrada dentro del proceso, preferiblemente en estrecha proximidad con relacion al procedimiento de hidrolisis. Subsiguientemente, la suspension espesa de fermentacion entera, que contiene unos sistemas de enzimas solubles y una biomasa fungica, se usa para hidrolizar a unas cargas de alimentacion lignocelulosicas a la forma de azucares componentes. La produccion integrada de dichos sistemas de enzimas usando una porcion de las cargas de alimentacion para el tratamiento previo como un medio de fermentacion, proporciona una optima flexibilidad en las cargas de alimentacion y en las opciones de tratamiento previo.

En un aspecto clave del invento se encontro, de modo sorprendente, que el hecho de elaborar de manera ffsica o mecanica o qmmica a la biomasa microbiana, en particular cizallar mecanicamente a la biomasa fungica antes de una hidrolisis con enzimas, dara como resultado una cinetica de hidrolisis mas rapida y superiores rendimientos de azucares monomericos (p.ej. glucosa) en comparacion con el hecho de usar el material sobrenadante o el caldo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

fermentacion sin elaborar a la biomasa microbiana o el hecho de usar solamente unos componentes solubles de enzimas para hidrolisis, que estan contenidos en el material sobrenadante clarificado del caldo de fermentacion.

Descripcion detallada del invento

El presente invento cubre un procedimiento mejorado para la degradacion de una biomasa, tal como una biomasa lignocelulosica. La biomasa que se somete al procedimiento de acuerdo con el invento puede ser cualquier biomasa como se describira seguidamente. Se incluye en este concepto una biomasa que comprende grandes partmulas o trozos cortos y gruesos, tales como residuos de madera, rastrojos de mafz, bagazo de cana de azucar, paja de cereales, y de esta manera el desencolado mecanico se puede llevar a cabo opcionalmente antes del procedimiento real del presente invento.

Alternativamente, la mayona de las partmulas de una biomasa, tal como el 90 % o mas de las partmulas, son suficientemente pequenas para poder ser tratadas en una suspension (suspension espesa), es decir tienen un diametro no mayor que 2 cm, preferentemente no mayor que 0,5 cm, mas preferiblemente no mayor que 2 mm, de manera tal que no se requiere un desencolado mecanico. Sin embargo, en el caso de que se Ileve a cabo un desencolado mecanico, este se lleva a cabo de la siguiente manera:

[Desencolado mecanico]

De acuerdo con una forma preferida de realizacion del invento, cualquier biomasa lignocelulosica sera sometida a un desencolado grosero utilizando un aparato tal como un molino de martillos o de bolas o una trituradora o cualquier tipo de, o unas combinaciones de dichos aparatos que sean apropiados para cortar en trozos un residuo de biomasa, en donde el 90 % o mas de las partmulas en la masa tienen un diametro no mayor que 2 mm, dando como resultado una biomasa con un pequeno tamano de partmulas.

[Tratamiento previo]

La meta del tratamiento previo es una desestabilizacion y/o una hidrolisis parcial de las estructuras polimericas de la biomasa (en forma de partmulas pequenas). La biomasa, que ha de ser sometida al tratamiento previo, esta tipicamente seca, es decir, no esta suspendida en una fase lfquida. Esta biomasa es luego transferida a un recipiente de reaccion usando cualquier sistema de transporte que sea conocido en la tecnica, tal como por ejemplo una cinta transportadora o un dispositivo transportador del tipo de un tornillo sinfm. La biomasa en forma de partmulas pequenas es transferida a un recipiente resistente a la presion y luego es sometida a un tratamiento previo.

El producto de la etapa de tratamiento previo es denominado sinonimamente "suspension espesa" o "biomasa tratada previamente" o " biomasa lignocelulosica tratada previamente" o "suspension espesa de biomasa tratada previamente".

El tratamiento previo puede ser un tratamiento previo qmmico, es decir, un tratamiento con un acido o con una base. Preferiblemente, el se puede llevar a cabo en la presencia de un catalizador de caracter acido, que en un ejemplo no limitativo se puede seleccionar a partir de una gama de eleccion de H2SO4, H2NO3, HCl, H3PO4 y SO2. En una forma de realizacion particularmente preferida, el acido constituye el H2SO4. El catalizador de caracter acido se puede aplicar en unas concentraciones de 0-10 % p/p s.s. de una carga de alimentacion. En una forma de realizacion mas preferida del invento, la concentracion del acido es ajustada a 0,1-3 % p/p s.s. de una carga de alimentacion.

El tratamiento previo puede ser alternativamente un tratamiento termico, tal como una exposicion a unas temperaturas de mas que 80 °C. Sin embargo, es sumamente preferido que se combinen un tratamiento qmmico y un tratamiento termico. En una forma de realizacion del invento que es incluso mas preferida, el tratamiento previo hidrotermico o bien se puede llevar a cabo a o por encima de la presion atmosferica. El tratamiento previo en la presencia de un catalizador de caracter acido puede consistir tambien en el empleo de vapor de agua presurizado caliente que produce unas temperaturas comprendidas entre 120 y 250 °C. En estas condiciones, la biomasa puede ser tratada previamente durante un penodo de tiempo comprendido entre 0,1 y 60 min antes de realizar una elaboracion adicional de la biomasa y una etapa de neutralizacion opcional, que puede consistir en el empleo de cal o de cualquier otra base, de manera tal que el medio de reaccion tenga un pH de 3,5 - 6.

En otro aspecto del invento, el desencolado y el tratamiento previo se pueden llevar a cabo simultaneamente. En este caso, la biomasa preferentemente seca es transportada al recipiente de tratamiento previo y al mismo tiempo es puesta en contacto con agua. El tratamiento previo hidrotermico puede ser conectado mecanicamente con la etapa de desencolado de la biomasa, de manera tal que ese tratamiento previo se puede llevar a cabo en un modo de funcionamiento o bien discontinuo (por tandas) o continuo. Como un ejemplo no limitativo para un modo de tratamiento previo continuo, el tratamiento previo se podna llevar a cabo en un recipiente cerrado resistente a la presion, que esta acoplado con un mecanismo transportador del tipo de un tornillo sinfm.

En otra forma preferida de realizacion del invento, el tratamiento previo hidrotermico se lleva a cabo en un modo de explosion causada por vapor de agua, en el que la biomasa es sometida a una inyeccion de vapor de agua caliente por encima de la presion atmosferica. La presion inducida por el vapor de agua sera preferentemente de 1-30 atm (a 120-250 °C), a la que dicha biomasa sera expuesta durante 0,1-60 min. Despues de esto, la presion es liberada 5 repentinamente desde el recipiente de reaccion, transfiriendo de esta manera la biomasa previamente tratada a un recipiente colector secundario. Un ejemplo no limitativo de un recipiente de reaccion para llevar a cabo el tratamiento de explosion por vapor de agua puede ser un reactor del tipo de canon de vapor de agua (de Autoclave Engineers, Erie, Pa) que consiste en un reactor provisto de una camisa de vapor de agua, que consiste en un tubo de Hastelloy cerrado por dos valvulas de bola. Unos calentadores electricos asociados son colocados sobre todas las superficies

10 expuestas, no provistas de camisa, del reactor y son controlados a la temperatura del punto de ajuste del tratamiento previo. Una inyeccion directa de vapor de agua se usa tambien para llevar rapidamente a la biomasa hasta la temperatura del tratamiento previo. La presion del vapor de agua se ajusta y controla de manera que se mantenga la deseada temperatura del tratamiento previo. Todos los materiales del tratamiento previo salen a traves de un troquel reemplazable situado en el fondo del reactor y son recogidos en un saco de nylon soportado dentro de un deposito

15 de evaporacion subita, de paredes gruesas, provisto de camisa y refrigerado.

Se prefiere que el penodo de tiempo y la temperatura de la elaboracion se seleccionen de una manera tal que unas cantidades maximas de los constituyentes de la biomasa se hidrolicen a la forma de sus monomeros componentes de una manera sumamente eficiente y economica, sin la produccion de cantidades significativas de unos productos de degradacion tales como furfural.

20 Corrientemente, la fraccion de lignina de las cargas de alimentacion previamente tratadas estara dentro del intervalo de 10-70 % en peso de lignina/peso de las sustancias secas de una carga de alimentacion previamente tratada. El contenido de lignina de la carga de alimentacion previamente tratada se puede medir de acuerdo con unos metodos conocidos por los expertos en la especialidad, tales como por ejemplo, pero sin limitarse a, los que se describen en:

http://www.nrel.gov/biomass/analytical procedures.html.

25 Despues de ejecutar dichas opciones de tratamiento previo, el contenido de materiales solidos secos de la suspension espesa resultante de biomasa seran de alrededor de 10-50 % p/p s.s. de la carga de alimentacion. La meta principal de una estrategia de tratamiento previo seleccionada es seleccionar el metodo mas eficiente en cuanto a energfa y costos que prepare a la biomasa lignocelulosica de una manera tal que se solubilice la mayor parte de la fraccion de pentosas y las fibras de celulosa sean accesibles para unos sistemas de enzimas utilizados

30 en los procesos de hidrolisis realizados corriente abajo. La transferencia de la biomasa a las operaciones unitarias espedficas se ejecutara por bombeo o solamente mediante un flujo por gravedad.

[Procedimiento central del presente invento]

El presente invento proporciona un procedimiento para degradar una biomasa lignocelulosica previamente tratada, que comprende las etapas de

35 c) cultivacion de un microorganismo que es capaz de producir por lo menos una enzima que tiene una

actividad celulolttica y/o hemicelulolttica en un medio de crecimiento, obteniendose de esta manera una suspension rica en microorganismos que comprende dicha por lo menos una enzima;

d) elaboracion del microorganismo y/o de la suspension rica en microorganismos de la etapa c) por

40 (i) un tratamiento mecanico que comprende el sometimiento a una entrada de energfa volumetrica

de 1-500 kW/m3 durante un penodo de tiempo de 0,1-60 min; y/o

(ii) un tratamiento mecanico que se selecciona entre un tratamiento con un mezclador, un tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino;

45 y/o

(iii) un tratamiento mecanico que implica bombear la suspension espesa de fermentacion que contiene microorganismos desde el recipiente de fermentacion hasta el recipiente de hidrolisis;

e) sometimiento conjunto de la biomasa lignocelulosica previamente tratada y del producto de la etapa d), a la accion de un reactor para la hidrolisis de la biomasa con el fin de obtener unos azucares solubles.

50 Se prefiere que, en este procedimiento, la biomasa lignocelulosica previamente tratada se haya obtenido a partir de una biomasa lignocelulosica por un tratamiento ffsico-qmmico, tal como el tratamiento previo que mas arriba se ha descrito.

En una forma de realizacion del invento, que es particularmente preferida, el medio de crecimiento de la etapa c) comprende una biomasa lignocelulosica, que preferiblemente ha sido tratada previamente. Diversas actividades

enzimaticas, tales como - pero sin limitarse a - unas actividades celuloftticas y hemiceluloftticas, forman conjuntamente un sistema de enzimas, es decir que los sistemas de enzimas son unas mezclas de mas de una actividad enzimatica. Mas de una estas actividades puede estar contenida, en algunos casos, dentro de la misma molecula de un polipeptido, pero es mas ftpico que un sistema de enzimas comprenda una mezcla de varios, tal 5 como mas de dos, esto es mas de tres, polipeptidos enzimaticos diferentes, en donde cada uno de estos tiene por lo menos una actividad deseada, de manera tal que las actividades combinadas formen el sistema de enzimas.

Los procedimientos y los sistemas que se han descrito por este invento se distinguen de las ensenanzas de la tecnica anterior. El presente invento proporciona una produccion integrada de enzimas, en la que subsiguientemente una biomasa previamente tratada y la suspension espesa de microorganismos que se ha obtenido en la etapa d) se 10 utilizan para la hidrolisis de dicha biomasa. Se podna mostrar, de manera sorprendente, que la presencia del material sobrenadante del tratamiento previo no afecta a los procesos enzimaticos de hidrolisis o fermentacion que se realizan corriente abajo. Ademas, se mostro de manera sorprendente que el uso de la suspension espesa de fermentacion entera, que comprende un micelio y un material sobrenadante procedentes de la produccion de enzimas, manifestaba un rendimiento superior en la hidrolisis de una biomasa en comparacion con el solo material 15 sobrenadante de fermentacion obtenido a partir de dicha produccion de enzimas, o en comparacion con unas preparaciones enzimaticas comerciales comparables. Ademas, se podna demostrar que el hecho de elaborar por medios ffsicos y/o mecanicos y/o qmmicos el microorganismo de acuerdo con la etapa d) proporciona una activacion optima de unos sistemas de enzimas para hidrolisis extra e intracelulares que actuan sinergicamente en unas operaciones de hidrolisis realizadas corriente abajo para dar como resultado una degradacion optima de unas 20 cargas de alimentacion lignocelulosicas a la forma de componentes de azucares monomericos, tales como glucosa y xilosa.

[Produccion de enzimas (etapa c)]

La produccion de enzimas de acuerdo con la etapa (c) es caracterizada de la siguiente manera: una suspension espesa de una biomasa lignocelulosica previamente tratada se inocula, en una primera etapa, con un 25 microorganismo, que puede ser un microorganismo del tipo de una bacteria, una arquea, una levadura o un hongo, que es capaz de producir unas actividades enzimaticas celuloftticas y hemicelulolfticas. Una actividad celulolftica es una actividad capaz de degradar, por ejemplo hidrolizar, a una celulosa, de manera tal que sea capaz de hidrolizar a algunos o a todos los enlaces glucosfdicos alft presentes. Una actividad hemicelulolftica es una actividad capaz de degradar, por ejemplo hidrolizar, a una hemicelulosa de manera tal que sea capaz de hidrolizar a algunos o a todos 30 los enlaces glucosfdicos alft presentes. Una hemicelulosa incluye unos bloques de construccion tales como los de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano.

En un ejemplo no limitativo, dichas actividades enzimaticas comprenden las de exo- y endocelulasas (esto es, las de celobiohidrolasa (CBH) I, II, endoglucanasa (EG) I-IV, beta-glucosidasa (BGL)), las de exo- y endohemicelulasas (esto es, las de xilanasa, xilosidasa, xilobiasa, arabinasa, arabinofucosidasa, mananasa, manosidasa, galactasa y 35 galactosidasa) y las de esterasas (Howard y colaboradores, 2003, Lynd y colaboradores, 2002). Por lo tanto, el invento comprende una forma preferida de realizacion en la que la por lo menos una enzima con actividad celulolftica y/o hemicelulolftica tiene una o mas actividades seleccionadas entre el conjunto que se compone de: las de celobiohidrolasa del tipo I o del tipo II (CBH I o CBH II), de endoglucanasa del tipo I, II, III o IV (EGI, EGII, EGIII, EGIV), de beta-glucosidasa (BGL), de esterasa, de exo-hemicelulasa y de endo-hemicelulasa. Es incluso mas 40 preferido que la exo hemicelulasa y la endo-hemicelulasa se seleccionen preferentemente entre xilanasa, xilosidasa, xilobiasa, arabinasa, arabinofucosidasa, mananasa, manosidasa, galactasa y galactosidasa.

Unos ejemplos no limitativos de bacterias que producen dichas actividades enzimaticas y que por lo tanto se pueden usar preferente de acuerdo con el presente invento, comprenden Actinobacter sp., Agrobacterium sp., Bacillus sp., Burkholdria sp., Clostridia sp., Caldicellulosiruptor sp., Cellvibrio sp., Halobacterium sp., Pseudomonas sp., 45 Paenibacillus sp., Xanthomonas sp. y Thermobifida sp. (Howard y colaboradores, 2003, Maki y colaboradores 2009).

Unos ejemplos no limitativos de arqueas que producen dichas actividades enzimaticas y que por lo tanto se pueden usar preferentemente de acuerdo con el presente invento comprenden Pyrochoccus sp., Sulphobolus sp., Staphylothermus sp. y Thermococcus sp., (Maki y colaboradores, 2009).

Los hongos son generalmente los microorganismos mas preferidos para el presente invento. El procedimiento de 50 acuerdo con este invento se puede llevar a cabo preferentemente de tal manera que el microorganismo sea un hongo, que se selecciona preferentemente entre el conjunto que se compone de: Trichoderma sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. y Talaromyces sp. Unos ejemplos no limitativos de hongos que producen dichas actividades enzimaticas y que por lo tanto se pueden usar preferentemente de acuerdo con el presente invento, comprenden Aspergillus sp., Chaetomium sp., Chrysosporium sp., Fusarium sp., Humicola sp., Orpinomyces sp., Pencillium sp., 55 Phanerochaete sp., Piromyces sp., Talaromyces sp., Trametes sp. y Trichoderma sp. o sus respectivos holomorfos (Howard y colaboradores, 2003). Es especialmente preferido un hongo que se selecciona entre Trichoderma sp. y Talaromyces sp.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

La eleccion del organismo que produce enzimas se puede determinar por la composicion de hidratos de carbono de la suspension espesa de una carga de alimentacion previamente tratada, por la cantidad de las actividades enzimaticas que se han producido por los organismos particulares y por las caractensticas bioffsicas que abarcan unos parametros tales como la estabilidad de la temperature, la selectividad para un substrato, la actividad espedfica y la tolerancia a inhibidores.

Para la induccion de la produccion de enzimas, dichos micro-organismos seran incubados a una conveniente temperatura de crecimiento, que puede variar tfpicamente entre 14 y 102 °C, preferiblemente entre 28 y 102 °C, dependiendo del microorganismo que se use. El penodo de tiempo de incubacion hasta el comienzo de la produccion de enzimas puede variar significativamente con el tipo del microorganismo (Lynd y colaboradores, 2002) y con la carga de alimentacion previamente tratada, pero se puede ensayar con unos metodos descritos por Xiao y colaboradores (2004b) or Bobey y Ederer (1981).

En un aspecto preferido del presente invento, la produccion de enzimas se ejecuta con una cepa hiperproductora de celulasa del hongo filamentoso Trichoderma reesei (anamorfo: Hypocrea jecornia). Un ejemplo no limitativo de dicho organismo es la cepa Rut-C30 de Trichoderma ressei (Lynd y colaboradores, 2002, Szijarto y colaboradores, .2004). Todavfa en otro aspecto preferido del invento, los sistemas de enzimas fungicas se producen en una biomasa previamente tratada como la unica fuente de carbono significativa. Esto se realiza de manera preferible con uno hongos tales como el Trichoderma reesei. Los cultivos iniciadores de Trichoderma reesei se pueden dejar crecer en una suspension espesa de una carga de alimentacion previamente tratada hasta que comience la produccion de esporas, lo cual puede ser cuantificado usando unos metodos tales como unas mediciones espectrofotometricas a DO600 nm. Luego el hongo se deja crecer durante 3 - 7 dfas mediando mezcladura constante a 50-250 rpm y en unas condiciones controladas de pH, temperatura asf como de oxfgeno. A lo largo de la fermentacion es cntico el hecho de que el hongo es incubado a 30 °C y a un pH de ~5 para proporcionar una cantidad maxima de enzima y de biomasa. En el dfa 5 se ejecuta tfpicamente la produccion maxima de biomasa y de enzima, siendo posible un tratamiento ulterior.

El medio de crecimiento comprende tfpicamente una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno, opcionalmente unas vitaminas y unos minerales trazas. La fuente de carbono es suministrada a razon de 1-30 % p/v, mas preferiblemente de 1-10 % p/v e incluso mas preferiblemente de 1-8 % p/v al medio de cultivacion. Las fuentes de carbono pueden comprender una biomasa lignocelulosica natural o previamente tratada, tal como una que esta constituida a base de madera, paja de cereal, bagazo, hierba de pasto y celulosa, y una pasta papelera en bruto obtenida a partir de la produccion de pasta papelera y de papel. Unas fuentes de carbono alternativas pueden comprender una celulosa purificada, una pasta papelera, un suero de leche, unas melazas o unos azucares tales como glucosa y lactosa. Se puede usar una combinacion de fuentes de carbono, en la que una fuente de carbono es el producto de la etapa b) o un equivalente del mismo, mientras que esta presente otra fuente de carbono, tal como la que se ha descrito anteriormente en este parrafo. La fuente de nitrogeno es suministrada a razon de 0,1-10 % p/v, mas preferiblemente de 0,1-8 % p/v e incluso mas preferiblemente de 0,1-4 % p/v al medio de cultivacion. Las fuentes de nitrogeno comprenden un expulsor de soja, un lfquido de maceracion de mafz, un extracto de levadura, una harina verde (hierba molida), un salvado de trigo, un grano agotado de destilena y unas sales de amonio inorganicas. Las vitaminas y los minerales trazas se pueden suministrar a razon de 0-5 % p/v, mas preferiblemente de 0,001-1 % p/v, al medio de cultivacion. Los minerales trazas suministrados al medio de cultivacion pueden comprender unas sales de Fe, Mn, Zn y Co, mientras que las vitaminas anadidas al medio de cultivacion pueden comprender unos complejos de vitamina B, biotina o una coalbumina.

Las composiciones exactas de los medios de cultivacion y las condiciones ffsicas exactas para obtener un crecimiento efectivo de los productores de la enzima celulasa son conocidas por los expertos en la especialidad. La seleccion final del medio de cultivacion dependera del microorganismo que se use.

En una forma preferida de realizacion del invento, tanto la biomasa de microorganismo(s) como el medio de fermentacion agotado que contiene una biomasa lignocelulosica residual y la mayona de las actividades enzimaticas celulasas y hemicelulasas, se usaran en la etapa de elaboracion de biomasa realizada corriente abajo.

En el presente invento se encontro de manera sorprendente que unas proporciones significativas de las actividades de celulasas y hemicelulasas son retenidas en la biomasa de una carga de alimentacion previamente tratada residual y en la biomasa fungica producida.

De manera incluso mas interesante, se podna demostrar que la hidrolisis de una biomasa era mas eficiente cuando se empleaba la suspension de fermentacion entera que conterna enzimas (el material sobrenadante y el micelio / la biomasa) en comparacion con un experimentos de hidrolisis que emplean solamente un material sobrenadante de fermentacion que contiene enzimas o unas preparaciones de enzimas comerciales.

Esto se puede ejecutar opcionalmente disociando en dos corrientes a la suspension espesa de biomasa, que es obtenible mediante el tratamiento previo, de manera tal que una parte sea sometida a la etapa c), mientras que otra

parte sea sometida directamente a la etapa e). Los investigadores han encontrado sorprendentemente que una parte de la biomasa previamente tratada puede ser sometida a la accion del medio de crecimiento del microorganismo. Se entiende que el microorganismo es, por lo tanto, capaz de producir unas enzimas apropiadas para la degradacion de la biomasa previamente tratada. Por lo tanto, el presente invento crea tambien, dentro de una forma preferida de 5 realizacion un procedimiento para degradar a una biomasa celulosica que comprende las etapas de:

a) un tratamiento previo ffsico-qmmico de una biomasa lignocelulosica para obtener una suspension espesa previamente tratada;

b) separacion de la suspension espesa previamente tratada de la etapa a) en dos partes, la parte A y la parte B;

10 c) incorporacion de la parte A en un medio de crecimiento en bruto para proporcionar un medio de

crecimiento final, y cultivacion de por lo menos un microorganismo capaz de producir por lo menos una enzima que tiene una actividad celulolttica y/o hemicelulolftica, obteniendose de esta manera una suspension rica en microorganismos que comprende dicha por lo menos una enzima;

d) elaboracion del microorganismo y/o de la suspension rica en microorganismos de la etapa c), en que

15 dicha elaboracion comprende un tratamiento mecanico que es uno o mas de los siguientes:

(i) un tratamiento mecanico que comprende el sometimiento a una entrada de energfa volumetrica de 1-500 kW/m3, durante un penodo de tiempo de 0,1-60 min;

y/o

(ii) un tratamiento mecanico que se selecciona entre un tratamiento con un mezclador, un

20 tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino;

y/o

(iii) un tratamiento mecanico que implica bombear la suspension espesa de fermentacion que contiene microorganismos desde el recipiente de fermentacion al recipiente de hidrolisis;

e) sometimiento conjunto de la parte B y del producto de la etapa d) a la accion de un reactor para la

25 hidrolisis de biomasas con el fin de obtener unos azucares solubles.

Un esquema de flujos del procedimiento se presenta en la Figura 1.

En una forma preferida de realizacion de este procedimiento, la parte A es la parte minoritaria de la suspension espesa previamente tratada que se ha obtenido en la etapa A, de manera preferible de 1 a 20 % (en peso de materiales solidos secos), mas preferiblemente de 1 a 5 % (en peso de materiales solidos secos) y de manera 30 sumamente preferible de 1 a 5 % (en peso de materiales solidos secos). Los materiales solidos son unas partfculas ngidas, es decir unas partfculas que no son solubilizadas en la fase lfquida en las condiciones del procedimiento que se usan.

[Elaboracion del microorganismo (etapa (d)]

Se encontro de modo sorprendente que la elaboracion por medios ffsicos y/o mecanicos y/o qmmicos de la 35 suspension espesa de sedimentacion en la etapa d) antes de la etapa de hidrolisis e) y el sometimiento del producto elaborado a la etapa e) aumentaran la cinetica de hidrolisis de la biomasa y conduciran a unos rendimientos mas altos de azucares solubles (Figura 2). Como un rendimiento mas alto de azucar soluble se entiende en el presente contexto que el rendimiento, que se puede obtener despues de 72 h en las condiciones que se describiran en el Ejemplo 4, es mas alto cuando el producto de la etapa c) es sometido a la etapa d) que cuando se omite la etapa d). 40 La tecnica anterior (Rao y colaboradores, 1985) no es capaz de divulgar dicho tratamiento. Unos experimentos testigos, en los que una preparacion de celulasa comercial (Celluclast, de Novozymes, Dinarmaca) / BGL (Novo 188, de Novozymes, Dinamarca) se trato mecanicamente antes de la hidrolisis de lignocelulosas no da como resultado un aumento de la cinetica de hidrolisis de lignocelulosas o un rendimiento mas alto de azucares solubles.

En una forma de realizacion, el microorganismo obtenido por la etapa de cultivacion c) es aislado despues de esta 45 etapa de cultivacion, tal como por ejemplo por centrifugacion o por otros procesos bien conocidos en la especialidad. En esta forma de realizacion, el microorganismo aislado es sometido a la etapa d). Sin embargo en una forma de realizacion alternativa y mas preferida del invento, la suspension entera que contiene microorganismos, es decir el producto de cultivacion de (c) que comprende el microorganismo y el medio de crecimiento, es elaborado ffsica y/o mecanica y/o qmmicamente antes de una hidrolisis de la biomasa. La utilizacion de la suspension entera, que 50 contiene microorganismos, y no solamente la del material sobrenadante de la suspension que contiene microorganismos para realizar una hidrolisis de la biomasa permite una dosificacion mas eficiente de la enzima en operaciones de hidrolisis de la biomasa realizadas corriente abajo, como los investigadores de este invento han encontrado de modo sorprendente. El tratamiento puede ser ffsico, qmmico o una combinacion de estos tipos.

En una practica preferida del invento, la suspension que contiene microorganismos es sometida a una agitacion con 55 unas velocidades aumentadas del rotor en el recipiente de fermentacion. En todavfa otra practica preferida del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

invento, la suspension que contiene microorganismos es bombeada y cizallada en un tubo de transferencia que contiene un ultrathorax. Una cualquiera de estas formas de realizacion puede ser particularmente util si el microorganismo es un hongo, de manera tal que el tratamiento comprende un tratamiento del micelio fungico.

El tratamiento mecanico se puede llevar a cabo de la siguiente manera: El puede comprender el sometiendo del microorganismo o de la suspension de microorganismos a una entrada de energfa volumetrica (tambien denominada "entrada de energfa") de 1 - 500 kW/m3, mas preferiblemente de 1 - 200 kW/m3, incluso mas preferiblemente de 1 - 100 kW/m3, preferiblemente durante un penodo de tiempo de 0,1 - 60 min, mas preferiblemente de 1 - 30 min, e incluso mas preferiblemente de 1-10 min.

El tratamiento mecanico se puede seleccionar entre un tratamiento con un mezclador, un tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino. Dicho tratamiento mecanico puede anadir un esfuerzo de cizalladura mecanica o una fuerza de trituracion al microorganismo y puede romper o destruir a las membranas celulares y/o a las paredes celulares; o al micelio fungico o unas partes del mismo. Mas de uno de dichos tratamientos se puede combinar con cada uno de los otros. La ruptura o destruccion de las estructuras celulares, tales como las membranas celulares y/o las paredes celulares, o del micelio fungico o de partes del mismo, se puede ensayar por unos metodos bien conocidos por la persona experta en la especialidad, tal como un microscopio.

En una practica preferida de este invento, la suspension que contiene microorganismos es sometida a tratamiento, es decir es cizallada aumentando la velocidad del elemento impulsor al final del ciclo de produccion de enzimas por fermentacion.

La efectividad del proceso mecanico es controlada por el gradiente relativo de energfa aplicado a la biomasa de microorganismos en un recipiente de reaccion.

Alternativamente, el esfuerzo de cizalladura, que conduce a un aumento en la actividad de la enzima para hidrolisis, puede ser inducido bombeando la suspension espesa de fermentacion que contiene microorganismos desde la fermentacion hasta el recipiente de hidrolisis. La suspension que contiene microorganismos puede ser bombeada y sometida a cizalladura en un tubo de transferencia. El microorganismo puede ser cizallado de esta manera. En terminos de velocidades de cizalladura, la suspension que contiene microorganismos es sometida a 1.600 - 50.000 l/s, mas preferiblemente a 1.600 -27.000 l/s, e incluso mas preferiblemente a 1.600 - 10.000 l/s. Este tratamiento es apropiado para inducir un aumento en la actividad de la enzima para hidrolisis. Este tratamiento se puede realizar preferiblemente durante un penodo de tiempo de 0,01 a 100 s.

Alternativamente, la suspension que contiene microorganismos puede ser sometida a una homogenizacion a alta presion o a un tratamiento ultrasonico o a otros dispositivos conocidos por una persona experta en la especialidad para inducir un alto esfuerzo de cizalladura, tales como un Ultraturrax. En una practica preferida del invento, la suspension que contiene microorganismos es sometida a una agitacion a velocidades aumentadas del rotor en el recipiente de fermentacion. En todavfa otra practica preferida del invento, la suspension que contiene microorganismos es bombeada en tubo de transferencia. El microorganismo puede ser cizallado de esta manera. En terminos de velocidades de cizalladura, la suspension que contiene microorganismos es sometida a 1.600 - 50.000 l/s, mas preferiblemente a 1.600 - 27.000 l/s, e incluso mas preferiblemente a 1.600 - 10.000 l/s para inducir un aumento en la actividad de la enzima para hidrolisis durante un penodo de tiempo de 0,01 a 100 s.

El lector entendera que el invento comprende cualquier combinacion espedfica de los valores que aqrn se divulgan. Por ejemplo, ha de entenderse que cualquier tasa de cizalladura espedfica o intervalo de tasa de cizalladura que aqrn se describe, es divulgada espedficamente en combinacion con cualquier penodo de tiempo espedfico para llevar a cabo dicho tratamiento (en min o s) que aqrn se divulgue. Tambien cualquier entrada de energfa volumetrica o intervalo de entrada de energfa volumetrica que aqrn se divulga ha de entenderse como divulgado espedficamente en combinacion con cualquier penodo de tiempo (en min o s) espedfico para aplicar dicha entrada que aqrn se divulga. Tambien son una parte constituyente del invento aquellas formas de realizacion en las que el producto de la entrada de energfa volumetrica (en kW/m3) por el tiempo (en min) es equivalente a cualquier producto de estos parametros que se divulgue aqrn. Tambien son una parte constituyente del invento aquellas formas de realizacion en las que el producto de la tasa de cizalladura (en 1/s) por el tiempo (en s) es equivalente a cualquier de estos parametros que se divulgue aqrn. En una forma particular de realizacion del invento las metodologfas de lisis mecanica y qmmica son combinadas, lo cual aumenta la efectividad de cualquiera de los metodos.

En una practica particular del invento, el microorganismo o la suspension que contiene microorganismos se mezcla con un agente tensioactivo, de manera sumamente preferiblemente Triton X-100 en unas concentraciones de 0,01-2 % p/p s.s. de micelio, mas preferiblemente de 0,01-1 % p/p s.s. de micelio, e incluso mas preferiblemente de 0,01-0,5 % p/p s.s. de micelio. Subsiguientemente, la mezcla de microorganismos y del agente tensioactivo es sometida preferentemente a un proceso de cizalladura que mas arriba se ha descrito, que por ejemplo es particularmente util si el microorganismo es un hongo, de manera tal que su micelio puede ser cizallado. (Los agentes tensioactivos o detergentes no constituyen una clase particularmente limitada de compuestos usualmente

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

organicos que tfpicamente contienen tanto unos grupos hidrofobos como unos grupos hidrofilos, y por lo tanto tienen un caracter anfffilo).

En otra practica preferida del invento, el microorganismo o la suspension que contiene microorganismos se mezcla con un disolvente organico, que comprende ya sea aminas, o bien eteres o alcoholes, tales como el etanol en unas concentraciones de 1-30 % p/v, mas preferiblemente de 1-20 % p/v, e incluso mas preferiblemente de 1-5 % p/v. Subsiguientemente, el microorganismo o la mezcla de agentes tensioactivos se somete a un proceso de cizalladura de elaboracion, mas arriba descrito, que es por ejemplo particularmente util si el microorganismo es un hongo, de manera tal que su micelio pueda ser cizallado.

La entrada de energfa espedfica dentro de la suspension espesa se puede ejecutar ya sea aumentando la velocidad del elemento impulsor del recipiente de fermentacion, bombeando la suspension espesa de fermentacion desde la rafz hasta el recipiente diana y homogeneizando a alta presion en un espedfico recipiente de reaccion. La adicion de unos agentes qrnmicos, tales como unas sales, unos disolventes organicos, unas enzimas y unos agentes tensioactivos, reduce de manera significativa la entrada de energfa necesaria para obtener una satisfactoria lisis de los micelios y la liberacion de componentes de enzimas intracelulares.

En otro aspecto del invento, el tratamiento mecanico se ejecuta mediante una lisis qrnmica, que se puede ejecutar por medio de la adicion de unas sales inorganicas (osmolisis), unas enzimas, unos disolventes organicos y/o unos agentes tensioactivos. En un aspecto particular del invento, la lisis de celulas del micelio se induce por adicion de 0,01-10 M, mas preferiblemente de 0,01-5 M, e incluso mas preferiblemente de 0,1-1 M, de unas sales inorganicas tales como NaCl, KCl, u otros agentes de esfuerzo qmmico tales como (NH2)2CO, CH6ClN3.

En otro aspecto particular del invento, el reactivo para la lisis qrnmica puede comprender un agente tensioactivo cargado o no cargado electricamente (Biotechnol Lett. (1980) 2, paginas 43-48), tal como Tween-80 (no cargado), Triton X-100 (no cargado), SDS (cargado negativamente) o CTAB (cargado positivamente), que se emplean en unas concentraciones de 0,1-3 % p/p s.s. de una biomasa microbiana, mas preferiblemente 0,1-1 % p/p s.s. de un micelio e incluso mas preferiblemente a 0,5-1 % p/p s.s. de biomasa microbiana, respectivamente.

En otro aspecto del invento, el reactivo para la lisis qrnmica puede comprender una enzima o un sistema de enzimas tales como quitinasa (Plant Pathol. (200) 49, paginas 573-589), que es aplican en unas concentraciones de 0,01-10 % p/p s.s. de una biomasa microbiana, mas preferiblemente de 0,01-1 % p/p s.s. de un micelio e incluso mas preferiblemente a unas concentraciones de 0,01-01% p/p s.s. de un micelio respectivamente, seguidos por una incubacion a 20-70 °C durante 0,1 - 72 h, respectivamente.

En una practica particular del invento, las metodologfas de lisis mecanica y qrnmica son combinadas, lo que se cree que aumenta la efectividad de cualquiera de los metodos.

En una practica particular del invento, el microorganismo es mezclado con un agente tensioactivo, de manera sumamente preferible Triton X-100, en unas concentraciones de 0,01-5 % p/p s.s. de biomasa de microorganismos, mas preferiblemente de 0,01-1 % p/p s.s. de biomasa con microorganismos. Subsiguientemente la mezcla de microorganismos y del agente tensioactivo es sometida a una entrada de energfa volumetrica de 1 - 500 kW/m3, mas preferiblemente de 1 - 200 kW/m3 durante 0,1 - 60 min para conseguir un tratamiento efectivo.

En otra practica preferida del invento, la biomasa con microorganismos se mezcla con un disolvente organico que comprende ya sea unas aminas, o bien unos eteres o alcoholes, tales como el etanol en unas concentraciones de 540 % p/v, mas preferiblemente de 20-40 % p/v e incluso mas preferiblemente de 30-35 % p/v. Subsiguientemente, la mezcla de microorganismos y un disolvente organico es sometida a una entrada de energfa volumetrica de 1 - 500 kW/m3, mas preferiblemente de 1 - 200 kW/m3 durante 0,1 - 60 min para conseguir un tratamiento efectivo.

La entrada de energfa espedfica dentro de la suspension espesa se puede ejecutar ya sea aumentando la velocidad del elemento impulsor del recipiente de fermentacion, bombeando la suspension espesa de fermentacion desde la rafz hasta el recipiente diana y por una homogeneizacion a alta presion en un recipiente de reaccion espedfico. La adicion de unos agentes qrnmicos tales como unas sales, unos disolventes organicos, unas enzimas y unos agentes tensioactivos reduce significativamente la entrada de energfa necesaria para obtener una satisfactoria lisis de los micelios y una liberacion de componentes intracelulares de las enzimas.

Se ha encontrado, inesperadamente, que la liberacion de actividades enzimaticas intracelulares a partir de un organismo productor de enzimas puede aumentar el rendimiento de hidrolisis del sistema de enzimas empleado de manera tal que se pueden emplear unos mas bajos regfmenes de dosificacion de celulasa y de beta-glucosidasa.

Los datos de acuerdo con este invento muestran de manera sorprendente que una biomasa miceliana cizallada o elaborada ffsica o mecanica o qmmicamente de otro modo distinto antes de la hidrolisis, liberara tanta cantidad de beta-glucosidasa (BGL) como la que en caso contrario tendna que ser suministrada extrmsecamente para obtener el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

mismo rendimiento de hidrolisis. La cizalladura y la adicion extrmseca de actividades de BGI tiene un efecto aditivo que proporciona unos mas altos rendimientos de azucares y una cinetica de sacarificacion aumentada.

La liberacion de actividades enzimaticas unidas a un micelio permite tambien una reduccion en la dosificacion de la enzima celulasa sin comprometer a la cinetica de hidrolisis ni a los rendimientos de azucares solubles procedentes de una biomasa lignocelulosica. En resumen, las ensenanzas que aqm se divulgan demuestran que la utilizacion de una carga de alimentacion previamente tratada como el unico medio de crecimiento permite la produccion de unos sistemas de enzimas que estan muy bien adaptados para descomponer a este material lignocelulosico espedfico. Por lo tanto, la produccion de enzimas in situ, tal como se divulga en este invento, permite la maxima flexibilidad en la eleccion de unas cargas de alimentacion lignocelulosicas y de unas opciones de tratamiento previo. Ademas, la utilizacion de la entera suspension espesa de fermentacion agotada para unas operaciones de hidrolisis de la biomasa realizadas corriente abajo permite un regimen de dosificacion mas eficiente, que aumenta el rendimiento de productos y las eficiencias en cuanto a costos de las enzimas.

Los regfmenes de dosificacion de enzimas en unas operaciones de hidrolisis pueden ser reducidos tambien por la liberacion de actividades enzimaticas intracelulares a partir de organismos productores de enzimas, reforzando el rendimiento de sistemas de enzimas extracelulares.

Si se usa un hongo para la produccion de enzimas, la meta de la etapa de elaboracion d) es la rotura de la totalidad o de algunas partes del hongo tales como el micelio fungico.

[Hidrolisis de una biomasa (etapa (e)]

Para ejecutar una descomposicion de una biomasa lignocelulosica previamente tratada en unos azucares hexosas (p.ej. glucosa) y pentosas (p.ej. xilosa) monomericos fermentables, la suspension espesa de fermentacion agotada (el material sobrenadante y el micelio) procedente de la produccion integrada de enzimas, se anade conjuntamente con una biomasa previamente tratada a un reactor para la hidrolisis de la biomasa. Tal como se conoce corrientemente, las hexosas son unos monosacaridos con seis atomos de carbono y las pentosas son unos monosacaridos con cinco atomos de carbono.

En un ejemplo no limitativo una suspension espesa de biomasa previamente tratada, que tiene un contenido de materiales solidos hasta de 30 %, preferiblemente de 15-30 % (p/p) puede preferiblemente ser hidrolizada en un modo discontinuo.

Es evidente para los expertos en la especialidad que la dosificacion del sistema de enzimas para hidrolisis, la temperatura de incubacion, el penodo de tiempo de permanencia, los regfmenes de alimentacion opcionales para la hidrolisis de la biomasa y la eficiencia de hidrolisis estan inherentemente vinculados con el sistema particular de enzimas y de la carga de alimentacion que se empleen.

En una forma particular de realizacion del invento, la hidrolisis de la suspension espesa de biomasa tratada previamente se ejecutara mediante unos sistemas de enzimas producidos por dicho hongo filamentoso Trichoderma reesei.

En este caso, la suspension espesa de una carga de alimentacion previamente tratada se mezcla con una suspension espesa de fermentacion agotada y opcionalmente cizallada, que contiene los sistemas de enzimas hidroltticas. El preferido regimen de dosificacion para cargas de alimentacion lignocelulosicas en estas condiciones vana entre 0,1-1 % peso de las enzimas/peso de la carga de alimentacion o 1-20 FPU/g de celulosa contenida en la carga de alimentacion (Zu y colaboradores, 2009).

La hidrolisis de una biomasa previamente tratada se ejecuta a unas temperaturas comprendidas entre 45 - 55 °C con unos penodos de tiempo de permanencia comprendidos entre 18 y 72 h. En una forma de realizacion particularmente preferida de este invento, una hidrolisis discontinua de una paja de cereal previamente tratada se ejecuta con unas dosificaciones de enzimas de 0,25-0,8 % peso de enzimas/s.s de la carga de alimentacion previamente tratada con o sin una suplementacion adicional con beta-glucosidasa y a una temperatura de 50-53 °C en el transcurso de 72 h.

Sorprendentemente, incluso con unos bajos regfmenes de dosificacion de enzimas se podnan obtener unos rendimientos de hidrolisis por encima de 50 % p/p con respecto a los azucares totales contenidos en dicha carga de alimentacion. Estos altos rendimientos de azucares con unos bajos regfmenes de dosificacion de enzimas se podnan conseguir debido a la produccion integrada de unos sistemas de enzimas eficientes, tal como se ha descrito con anterioridad.

Esta opcionalmente comprendido en este invento el hecho de que la beta-glucosidasa es anadida en la etapa e) del procedimiento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Preferiblemente, la reaccion de hidrolisis esta caracterizada porque los azucares solubles obtenidos en la etapa e) comprenden unos azucares de C5 y/o C6 monomericos, preferiblemente glucosa y/o xilosa.

En una forma de realizacion preferida de este invento, el material hidrolizado de una biomasa, que contiene un material sobrenadante rico en azucares y unos residuos solidos ricos en lignina, sera sometido a un proceso de separacion de solido/lfquido, que se puede ejecutar por ejemplo por centrifugacion, filtracion o simple decantacion por gravedad. Se entiende que unos azucares solubles son todos los azucares que predominantemente se pueden encontrar en la fase lfquida si se lleva a cabo una separacion del tipo solido/lfquido, como es conocido por una persona experta en la especialidad.

[Fermentacion de materiales hidrolizados de una biomasa]

Un opcional aspecto adicional de este invento es la fermentacion del material hidrolizado de una biomasa que se ha obtenido en la etapa e). Por lo tanto, el invento comprende tambien el procedimiento mas arriba descrito, que esta caracterizado ademas porque la fase rica en azucares es elaborada ulteriormente. En una forma particular de realizacion, la fase lfquida rica en azucares es elaborada ulteriormente para dar etanol. Unos microorganismos pueden ser empleados dentro del sentido de este invento para convertir en etanol a unos materiales hidrolizados de biomasas que contienen pentosas y hexosas.

Es preferido que, en esta etapa, se use una fase lfquida rica en azucares, obtenible a partir de la etapa e) que comprenda un alto contenido de azucares fermentables, que preferentemente es el del orden de 15-50 % p/v. El contenido de azucares es en este contexto el contenido de todas las pentosas y hexosas. En una forma preferida de realizacion del invento, este material hidrolizado de una biomasa tiene un contenido de azucares de 16-25 % p/v. En una forma de realizacion mas preferida del invento, el material hidrolizado de una biomasa tambien contiene unos nutrientes adicionales (esto es unas protemas, unas sales y unos azucares) que se han arrastrado a partir de unos procesos integrados de produccion de enzimas.

La fermentacion del material hidrolizado de una biomasa para dar etanol se puede ejecutar con unas cepas microbianas que muestran una robustez del procedimiento, una alta tolerancia para agentes inhibidores y etanol, unos rendimientos confiables de productos en unas concentraciones altas y bajas de azucares. Unos ejemplos no limitativos de dichos microorganismos, que pueden convertir a los azucares en etanol, incluyen la levadura de panaderos S. cerevisiae, Pichia stipitis, Hansenula polymorpha, Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Zymomonas mobilis, E. coli, Klebsiella oxytoca y Fusarium oxysporum.

Los criterios de seleccion para las opciones del procedimiento y la eleccion del organismo son una robustez del procedimiento, una tolerancia para productos/agentes inhibidores/temperaturas y unos rendimientos de etanol consecuentemente altos (Fischer y colaboradores, 2008; Matsushika y colaboradores, 2009).

Las fermentaciones etanolicas se pueden conducir a unas temperaturas comprendidas entre 28 y 70 °C durante 10 - 48 h dependiendo del valor optimo de la temperatura y de la eficiencia de fermentacion del microorganismo utilizado (Matsushika y colaboradores, 2009).

Las ensenanzas de la tecnica anterior indican que los lfmites de conversion teoricos para la conversion de hexosas en etanol pueden ser de 51 % p/p (es decir 1 g de glucosa por 0,51 g de etanol) para unas levaduras (Matsushika y colaboradores, 2009).

En las divulgaciones que aqrn se describen, se encontro de manera sorprendente que el tratamiento previo no influye sobre el rendimiento de la hidrolisis de una biomasa o de las operaciones de fermentacion.

Las fermentaciones de hexosas con unas cepas de levadura se pueden realizar a unas temperaturas de 28 - 35 °C, a un pH de 4 - 6 y se pueden completar en 10 - 48 h. Como un resultado de la fermentacion se obtiene una suspension espesa que contiene una biomasa de levadura y aproximadamente 0,5 - 25 % p/v de etanol, dependiendo de la concentracion inicial de azucares del material hidrolizado de la biomasa y de la eficiencia de conversion para azucares de los tipos de pentosas y hexosas,

[Recuperacion de etanol]

La recuperacion de etanol a partir de unos lfquidos de fermentacion se puede ejecutar por medio de diversos metodos conocidos por los expertos en la especialidad. Uno de dichos procesos es un procedimiento convencional de destilacion y rectificacion que conffa en un equipo empleado en las industrias de la cervecena y qmmicas, tal como unas columnas de destilacion. Estas tecnologfas estan bien consagradas en la industria y unos aparatos alternativos son de por sf conocidos (Leland, 2008, Cardona y Sanchez, 2007). En una forma alternativa de realizacion del invento, el etanol se recupera mediante una tecnologfa de separacion por arrastre, siendo ejemplos

no limitativos de dicha tecnolog^a una separacion por arrastre en vado, una separacion por arrastre con un gas o una evaporacion por atomizacion.

Las practicas del presente invento pueden dar como resultado un producto de etanol al 90-100 % v/v. Este producto se puede mezclar opcionalmente con unos aditivos o elaborar alternativamente para formular un producto que sera 5 enviado al consumidor final.

Definicion de terminos:

En el presente invento se usan un cierto numero de terminos, que se definen seguidamente.

Los terminos "biomasa" y "biomasa lignocelulosica" se refieren a cualquier material celulosico o lignocelulosico e incluyen unos materiales que comprenden una celulosa y opcionalmente comprenden ademas una hemicelulosa, 10 una lignina, un almidon, asf como unos polisacaridos, oligosacaridos y/o monosacaridos. Una biomasa puede comprender tambien unos componentes adicionales, tales como una protema, unos lfpidos, unas ceras, unos compuestos fenolicos y unos esteroides. Una biomasa se puede derivar generalmente de una unica fuente, o comprende una mezcla que se deriva de mas de una sola fuente; por ejemplo, una biomasa podna comprender una mezcla de granzas de trigo y de paja de trigo o una mezcla de hierba y hojas. Unos ejemplos no limitativos de una 15 biomasa son plantas cultivadas bioenergeticas, residuos agncolas, residuos solidos municipales, residuos solidos industriales, un lodo procedente de la fabricacion de papel, residuos de corrales, asf como residuos madereros y forestales. Unos ejemplos no limitativos espedficos de una biomasa pura incluyen granzas de avena, carozos de mafz, residuos de plantas cultivadas tales como cascaras de mafz, hojas y tallos de mafz, plantas herbaceas, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, hierba de pasto, papel residual, bagazo de cana de 20 azucar, sorgo, soja componentes obtenidos a partir de la molienda de granos, arboles, ramas, rafces, hojas, virutas de madera, aserrm de madera, arbustos y matorrales, hortalizas y legumbres, frutas, flores y estiercol animal.

El termino "desencolado mecanico" se refiere a cualquier metodo mecanico para reducir el tamano de las partfculas de una biomasa. Ejemplos no limitativos de aplicaciones de desencolado son una molienda con molinos de martillos o una trituracion.

25 El termino "biomasa previamente tratada" significa una biomasa que ha sido sometida a un tratamiento ffsico- qmmico antes de una sacarificacion. Unos tratamientos tales como unos tratamientos previos se describen adicionalmente en el presente texto.

El termino "lignocelulosico" se refiere a una composicion que comprende a la vez lignina y celulosa. Un material lignocelulosico puede comprender tambien una hemicelulosa.

30 El termino "celulosico" se refiere a una composicion que comprende una celulosa.

El termino "sacarificacion" o "hidrolisis de una biomasa" se refiere a la produccion de azucares fermentables a partir de unos polisacaridos.

El termino "azucar fermentable" se refiere a unos oligosacaridos y monosacaridos que pueden ser usados como una fuente de carbono por un microorganismo en un proceso de fermentacion para producir unos productos tales como 35 el etanol.

El termino "material hidrolizado" se refiere al producto de una sacarificacion, que contiene los azucares producidos en el proceso de sacarificacion, la biomasa no hidrolizada remanente y las enzimas usadas para la hidrolisis de la biomasa.

El termino "suspension espesa" se refiere a una mezcla de un material insoluble y un lfquido.

40 El termino "suspension espesa miscible" se refiere a una suspension espesa que se vuelve sustancialmente homogenea bajo la accion del sistema de agitacion a la que ella es sometida. El termino "miscibilidad" se refiere a esta propiedad de una suspension espesa.

El termino "suspension espesa entremezclada a fondo" se refiere a un estado en el que los componentes de la suspension espesa estan distribuidos de una manera sustancialmente uniforme (homogenea) a todo lo largo de la 45 suspension espesa.

Por el concepto de "peso en seco" o "p.s." de una biomasa se entiende el peso de una biomasa desde la que se ha retirado la totalidad, o esencialmente la totalidad, del agua. El peso en seco se mide tfpicamente de acuerdo con la norma E1756-01 de la Sociedad Americana Para Ensayos y Materiales (ASTM acronimo de American Society for

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Testing and Materials) (Standard Test Method for Determination of Total Solids in Biomass = metodo de ensayo clasico para la determinacion del contenido total de materiales solidos en una biomasa) o la norma T-412 om-02 de la norma de la Asociacion tecnica de la industria de pasta papelera y de papel, Inc. (TAPPI acronimo de Technical Association of the Pulp and Paper Industry, Inc.) (Moisture in Pulp, Paper ans Paperboard = humedad en pasta papelera, papel y carton).

El termino "peso en seco" (d.w.) o "sustancia seca" (s.s.) se refiere a la cantidad total de peso en seco de una biomasa que se ha anadido a un reactor de un sistema discontinuo o de sistema discontinuo alimentado, calculado en el momento de la adicion, como un tanto por ciento del peso total de la composicion que esta reaccionando en el reactor al final del experimento.

El termino "enzimas para la sacarificacion" o "enzimas hidrolizantes" se puede recibir a un sistema de enzimas para la sacarificacion, que se compone de una o mas enzimas (en donde se prefiere mas de una), que se usan para hidrolizar a la biomasa polimerica liberando de esta manera unos oligosacaridos y/o unos monosacaridos dentro de un material hidrolizado. Un sistema de enzimas para la sacarificacion comprende una o mas enzimas seleccionadas del conjunto de las "glucosidasas" que hidroliza(n) a los enlaces de eter de unos di-, oligo- y polisacaridos y que se encuentran en la clasificacion de enzimas EC 3.2.1.x del grupo general de las "hidrolasas" (EC 3.). Adicionalmente, pueden estar presentes otras enzimas que pueden pertenecer o no a este grupo. Las glucosidasas utiles en el presente metodo pueden ser categorizadas por el componente de biomasa que ellas hidrolizan. Las glucosidasas que son utiles en el presente metodo incluyen unas glucosidasas que hidrolizan a las celulosas (por ejemplo, unas celulasas, endoglucanasas, exoglucanasas, celobiohidrolasas, beta-glucosidasas), unas glucosidasas que hidrolizan a las hemicelulosas, denominadas hemicelulasas, (por ejemplo, xilanasas, endoxilanasas, exoxilanasas, beta- xilosidasas, arabinoxilanasas, manasas, galactasas, pectinasas, glucuronidasas), y unas glucosidasas que hidrolizan a los almidones (por ejemplo, amilasas, a-amilasas, p-amilasas, glucoamilasas, a-glucosidasas, isoamilasas). Por lo demas, puede ser util anadir otras actividades al sistema de enzimas de sacarificacion, tales como las de peptidasas (EC 3.4.x.i), lipasas (EC 3.1.1.x y 3.1.4.x), ligninasas (EC 1.11.1.x), y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73) para llegar a liberar a los polisacaridos con respecto de otros componentes de la biomasa. Es bien conocido en la especialidad que unos microorganismos que producen enzimas que hidrolizan a polisacaridos exhiben con frecuencia una actividad, tal como una degradacion de celulosas, que es catalizada por varias enzimas o por un grupo de enzimas que tienen diferentes especificidades para substratos. Asf, una "celulasa" procedente de un microorganismo puede comprender un grupo of enzimas, todas o algunas de las cuales pueden contribuir con una actividad degradadora de celulosas. Unas preparaciones de enzimas comerciales o no comerciales, tales como una celulasa, pueden comprender numerosas enzimas que dependen del esquema de purificacion que se ha utilizado para obtener la enzima. Asf, las enzimas para sacarificacion, que se usan en el presente metodo, comprenden por lo menos una "celulasa", y esta actividad puede ser catalizada por mas de una enzima. Opcionalmente, las enzimas para sacarificacion que se usan en el presente metodo pueden comprender por lo menos una hemicelulasa, dependiendo generalmente del tipo de biomasa previamente tratada que se usa en el presente procedimiento. Por ejemplo, tfpicamente no se necesita una hemicelulasa cuando una biomasa sacarificante es tratada previamente con un acido y es incluida tfpicamente cuando una biomasa sacarificante es tratada previamente en unas condiciones neutras o basicas. Se pueden obtener comercialmente unas enzimas para sacarificacion tales como la celulasa Spezyme® CP (de Genencor International, Rochester, N.Y.) y la xilanasa Multifect® (de Genencor). Ademas, unas enzimas para sacarificacion se pueden producir por medios biologicos, incluyendo el uso de unos microorganismos recombinantes. Se pueden desarrollar unas enzimas de sacarificacion, que se pueden usar en el presente procedimiento.

El acronimo SSF representa una sacarificacion y una fermentacion simultaneas, y es el acronimo de “simultaneous saccharification and fermentation”.

Ejemplos

Se usan los siguientes terminos:

"HPLC" es el acronimo de High Performance Liquid Chromatography, cromatograffa de fase lfquida de alto rendimiento, "C" es Centfgrados, "kPa" es kiloPascales, "m" es metro , "mm" es milfmetro, "kW" es kilovatio, "|im" es micrometro, "|jl" es microlitro, "ml"es mililitro, "l" es litro, "min" es minuto, "mM" es milimolar, "cm" is centfmetro, "g" es gramo, "kg" es kilogramo, "p" es peso, "h" es horas, "temp" o "T" es temperatura, "theoret" es teorico, "pretreat" es pre-tratamiento, "DWB" es peso en seco de una biomasa , "ASME" es el acronimo de American Society of Mechanical Engineers = Sociedad Americana de Ingenieros Mecanicos, "s.s." es el acronimo de stainless steel = acero inoxidable, "in" es pulgada, "PSD" es el acronimo de particle size distribution = distribucion de tamanos de partroulas, "d-50" es el diametro de partroulas en que un 50 % del volumen acumulado de las partroulas esta por debajo de este tamano , "d-95" se refiere a un diametro de partroulas en que un 95 % del volumen acumulado de las partroulas esta por debajo de este tamano, "rpm" es el acronimo de revoluciones por minuto.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El acido sulfurico, el hidroxido de amonio, el acido acetico, la acetamida, el extracto de levadura, la glucosa, la xilosa, el sorbitol, el MgSO4 ■ 7 H2O, el acido fosforico y el acido cftrico se obtuvieron a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.).

La composicion de una biomasa es medida por uno cualquiera de los metodos clasicos bien conocidos en la especialidad, tal como el metodo ASTM E1758-01 "metodo normalizado para la determinacion de hidratos de carbono por medio de una HPLC".

Ejemplo 1: Medicion de azucares monomericos

Para determinar el progreso de la hidrolisis de una paja, se toman muestras a intervalos de tiempo apropiados y el contenido de azucares solubles se determina por medio de una HPLC.

Los azucares solubles (tales como glucosa, celobiosa, xilosa, xilobiosa, galactosa, arabinosa y manosa) en un lfquido de sacarificacion se midieron por medio de una HPLC (de Agilent Technologies, Palo Alto, Calif.).

Los monosacaridos se midieron directamente en el material hidrolizado. La materia insoluble se retiro a partir del material hidrolizado por medio de una centnfuga. El pH del lfquido separado se ajusto, si fuese necesario, con acido sulfurico. El lfquido separado se diluyo, si fuese necesario, y luego se filtro haciendolo pasar a traves de un filtro con jeringa de 0,2 pm directamente dentro de un vial para una HPLC.

Para el analisis de los azucares disueltos totales, 10 ml de una muestra diluida se colocaron en un vial puesto a presion y se anadieron 349 pl de H2SO4 al 75 %. El vial se tapo coloco dentro del autoclave durante una hora para hidrolizar todos los azucares a la forma de monosacaridos. Las muestras se enfriaron y su pH se ajusto mediante carbonato de sodio hasta el valor de pH necesario, luego las muestras se filtraron dentro de los viales para HPLC y se analizaron mediante una HPLC. Despues de la tanda, las concentraciones en la muestra se determinaron a partir de unas curvas patron para cada uno de los compuestos.

Ejemplo 2: Tratamiento fisico-quimico previo de una paja de trigo

Una paja de trigo se molio a un tamano de partfculas de menos que 2 cm. Subsiguientemente, la paja molida se mezclo con agua y se anadio H2SO4 como un catalizador para tratamiento previo seguido por un tratamiento hidrotermico bajo una alta presion.

La suspension resultante de una carga de alimentacion previamente tratada se uso entonces para la produccion de una enzima para hidrolisis y para el proceso de sacarificacion en unas operaciones realizadas corriente abajo.

Ejemplo 3: Produccion de unas enzimas para hidrolisis usando una carga de alimentacion previamente tratada

Las enzimas para hidrolisis (p.ej., celulasas y hemicelulasas), destinadas a la conversion de un material lignocelulosico en unos azucares componentes, se produjeron en unos cultivos sumergidos del hongo filamentoso Trichoderma reesei.

En una etapa de cultivacion primaria, unos cultivos de siembra se dejaron crecer en un matraz con sacudimiento con una capacidad de 2 l que habfa sido llenado con 400 ml de un caldo de cultivo que habfa sido suplementado con 2 % p/v de una biomasa tratada previamente (vease el Ejemplo 2) y con 0,5 % v/v de un lfquido de maceracion de mafz. El medio se inoculo con una preparacion de esporas fungicas, que tema una Densidad Optica (DO) a 600 nm de 10. Los cultivos en el matraz de sacudimiento se dejaron crecer durante 48 h a 30 °C y a un pH de 5 mediando una agitacion constante de 250 rpm.

El aumento de la escala del cultivo de siembra se realizo en unos biorreactores con un volumen de trabajo de 5 l. La composicion del medio de cultivacion era identica que en la disposicion primaria de cultivo de siembra. Cada biorreactor fu inoculado con 10 % v/v del cultivo de siembra primario. El cultivo se dejo crecer a 30 °C (pH 5) durante 48 h con una agitacion constante de 350 rpm.

La produccion principal de las enzimas se llevo a cabo en un biorreactor que tema una capacidad de 150 l con un volumen de trabajo de 100 l. El medio de cultivacion era identico a los cultivos de siembra anteriores. Sin embargo, para la produccion de unas enzimas para hidrolisis se anadieron 8 % p/v de una biomasa previamente tratada y 2 % v/v de un lfquido de maceracion de mafz. El caldo de cultivo se inoculo con 5 % v/v del cultivo de siembra secundario. El hongo productor de enzimas, Trichoderma reesei, se dejo luego crecer a 30 °C mediando una agitacion constante a 350 rpm. El crecimiento comenzo durante 5 dfas a un pO2 constante de 25 % con el fin de asegurar una produccion optima de enzimas en condiciones aerobias. Despues de las condiciones de cultivacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

durante 5 dfas, se cosecho la suspension espesa de fermentacion que contema la enzima entera, la cual contema residuos de la biomasa previamente tratada, del caldo (medio) de fermentacion agotado y del micelio fungico.

La concentracion total de enzimas (protemas) solubles en el caldo de fermentacion (material sobrenadante) se determino por el metodo de Bradford con una albumina de suero bovino como un patron de referencia (Bradford, M., 1976).

En unos experimentos de hidrolisis realizados corriente abajo se utilizo o bien el material sobrenadante que contema enzimas o la suspension espesa de fermentacion total (material sobrenadante + biomasa previamente tratada + micelio fungico).

Ejemplo 4: Hidrolisis de paja

Una paja de trigo previamente tratada se hidrolizo o bien con unos sistemas de celulasas que conteman (i) el material sobrenadante que se ha descrito en el Ejemplo 3, (ii) la suspension fungica completa (el micelio fungico + la biomasa + el material sobrenadante) o (iii) la suspension fungica completa en la cual el micelio fungico habfa sido sometido a cizalladura antes de la hidrolisis de la paja. Los experimentos de hidrolisis se realizaron tambien opcionalmente en la presencia de una beta-glucosidasa (BGL) anadida externamente.

Las reacciones de hidrolisis se realizaron en un volumen de reaccion de 1 l con 20 % p/p s.s. de una paja previamente tratada a 50 °C durante 72 h en un medio que se habfa ajustado a un pH de 5. El regimen de dosificacion de la enzima para hidrolisis fue de 0,5 % p de celulasa/p de paja previamente tratada. La dosificacion de la enzima fue referenciada a la concentracion total de protemas en el caldo de fermentacion agotado tal como se determino en el Ejemplo 2. Opcionalmente, las reacciones se realizaron con una actividad adicional de BGL (de Novo 188, de Novozymes, Dinamarca). La actividad de BGL se anadio dosificadamente a razon de 2 Unidades de Celobiosa (CBU)/mg de celulasa. Las CBU's se determinaron tal como ha sido descrito por Prior y colaboradores (2008).

Las reacciones de sacarificacion se llevaron a cabo en un sistema de biorreactores mediando agitacion constante (a 50 rpm) para asegurar iguales condiciones de reaccion. En unos experimentos particulares, una suspension espesa de fermentacion que contema unas enzimas para hidrolisis se sometio a cizalladura mediante un aumento de la velocidad del elemento impulsor (L5M, de Silverson Machines Ltd.) hasta 8.000 rpm durante 30 min antes del proceso de hidrolisis de lignocelulosa realizado corriente abajo. Para determinar la cinetica de hidrolisis y los rendimientos de glucosa, se tomaron muestras a las 3, 7, 24 y 48 h. La liberacion aparente de glucosa se midio mediante una metodologfa de HPLC como mas arriba se ha descrito. Los resultados de las diferentes disposiciones de hidrolisis se muestran en la Fig. 2.

Los datos que aparecen en la Fig. 2 indican que la cizalladura de una biomasa fungica antes de la hidrolisis aumenta la cinetica de hidrolisis y los rendimientos de glucosa terminales, si la suspension fungica de Trichoderma que contiene enzimas (vease el Ejemplo 3) se usa para la hidrolisis de una paja tratada previamente en ausencia de una suplementacion con BGL, .

Unos experimentos de hidrolisis de una paja previamente tratada realizados solamente con un caldo de fermentacion (material sobrenadante) suplementado con BGL mostraron una cinetica de hidrolisis y unos rendimientos de glucosa terminales que eran similares a los de unas reacciones realizadas con una suspension espesa de fermentacion cizallada completa en ausencia de BGL.

La reaccion de hidrolisis con una suspension espesa de fermentacion completa cizallada (es decir el micelio fungico, la biomasa y el material sobrenadante) que adicionalmente se habfa suplementado con BGL, mostro una cinetica de hidrolisis y un rendimiento de azucares mas favorables en comparacion con todos los otros procedimientos de hidrolisis que se examinaron. Este sorprendente efecto puede ser debido a la liberacion de unas actividades enzimaticas intracelulares y/o unidas superficialmente con el microorganismo, las cuales actuan sinergicamente con unos sistemas de celulasas solubles en el caldo de fermentacion.

Descripcion de las Figuras:

Fig. 1: Proceso de conversion de una biomasa en etanol que incluye el arrastre del micelio a partir de una produccion de enzimas in situ, L = lignina, P = pentosa, H = hexosa. La Fig. 1 es un diagrama de bloques que generalmente ilustra el proceso de refinacion biologica que se uso para convertir una lignocelulosa en etanol a traves de una secuencia de fermentacion de acuerdo con el presente invento.

Fig. 2: Liberacion de glucosa a partir de una paja previamente tratada. Condiciones de hidrolisis: 20 % p/p s.s. de una biomasa previamente tratada. Dosificacion de una enzima celulasa: 0, 5 % p de enzima soluble/p de biomasa previamente tratada. Dosificacion de BGL opcional: 2 CBU/mg de la enzima celulasa. Toma de muestras a las 3, 7,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

24, 48 y 72 h. La hidrolisis de la biomasa se realizo o bien con un caldo de fermentacion que contema enzimas o con una suspension espesa de fermentacion completa cizallada/no cizallada (un material sobrenadante del caldo + una biomasa + una biomasa fungica) en la presencia y en la ausencia de una actividad adicional de BGL.

Bibliografia

Chauve y colaboradores (2010) Biotechnology for Biofuels [Biotecnologfa para biocombustibles] 2010, 3:3 Bradford, M. (1976), Anal. Biochem. 72:248-254

Prior B.A., Day D.F. (2008) Appl. Biochem. Biotechnol. 146(1-3), paginas 151-64

Pejo, E.T., Oliva, J.M. y Ballestros, M. (2008) Realistic approach for full-scale bioethanol production from lignocellulose: a review [Un enfoque realista para la produccion a plena escala de bioetanol a partir de lignocelulosa: una recopilacion] J. Sci& Indust. Research 67, paginas 874-884

Howard, R.L., Abotsi, E., van Rensburg, J. Howard, S. (2003) Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. [Biotecnologfa de la lignocelulosa: exitos de la bioconversion y la produccion de enzimas] Afri. J. Biotechnol. 2, paginas 602-619

Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton y D. Crocker (2008) Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. [Determinacion de hidratos de carbono estructurales y de lignina en una biomasa] Laboratory Analytical Procedure (LAP) Technical Report NREL/TP-510-42618,
http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf

Kumar R, Mago G, Balan V, Wyman CE. (2009a) Physical and chemical characterizations of corn stover and poplar solids resulting from leading pretreatment technologies. [Caracterizaciones ffsicas y qmmicas de materiales solidos de rastrojos de mafz y de alamos que resultan de unas tecnologfas avanzadas de tratamiento previo] Bioresour. Technol. 100(17), paginas 3948-62.

Kumar R, Wyman CE. (2009b) Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies. [Efectos de unas enzimas celulasas y xilanasas sobre la desconstruccion de materiales solidos procedentes del tratamiento previo de alamos que resulta de unas tecnologfas avanzadas] Biotechnol Prog. 2009, 25(2), paginas 302-14.

Kumar R, Wyman CE. (2009c) Effect of additives on the digestibility of corn stover solids following pretreatment by leading technologies. [Efectos de unos aditivos sobre la digestibilidad de materiales solidos de rastrojos de mafz a continuacion de un tratamiento previo unas tecnologfas avanzadas]. Biotechnol Bioeng. 2009, 15 de abril; 102(6):1544-57.

Wyman CE, Dale BE, Elander RT, Holtzapple M, Ladisch MR, Lee YY. (2005) Comparative sugar recovery data from laboratory scale application of leading pretreatment technologies to corn stover. [Datos comparativos de la recuperacion de azucares a partir de una aplicacion a la escala de laboratorio de unas tecnologfas avanzadas de tratamiento previo a rastrojos de mafz]. Bioresour. Technol. 96(18), paginas 2026-32.

Chandra, R.R., Bura, R., Mabee, W.E., Berlin, A., Pan, X:, Saddler, J.N. (2007) Substrate Pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Tratamiento previo de substratos: ^La clave para una hidrolisis enzimatica efectiva de materiales celulosicos? [Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 108, paginas 67-93.

Margeot, A., Han-Hagerdahl, B., Edlund, M., Slade, R., Monot, F. (2009) New improvements for lignocellulosic ethanol. Nuevos perfeccionamientos para etanol lignoceulosico]. Curr. Opin.Biotechnol. 20, paginas 1-9.

Chandrakant, P., Bisaria, V. S. (1998) Simultaneous bioconversion of cellulose and hemicellulose to ethanol. [Byconversion simultanea de celulosa y de hemicelulosa en etanol] Crit. Rev. Biotechnol. 18, paginas 295-331

Xiao, Z., Zhang, X., Gregg, D.J., Saddler, J.N. (2004a) Effects of sugar inhibition on cellulose and beta-glucosidase during enzymatic hydrolysis of softwood substrates. [Efectos de la inhibicion de azucares sobre celulosa y beta- glucosidasa durante una hidrolisis enzimatica de substratos de madera blanda] Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116, paginas 1115-1125

Hodge, D.B., Karim, M.N., Schell, D.J., McMillan, J.D. (2009) Model-based fed-batch for high-solids enzymatic cellulose hydrolysis. [Cultivo discontinuo alimentado basado en un modelo para la hidrolisis enzimatica de celulosas con alto contenido de materiales solidos]. Appl Biochem Biotechnol 152, paginas 88-107

Reith, J.H., den Uli, H., van Veen, H., de Laat, W.T.A.M., Niessen, J.J., de Jong, E., Elbersen, H.W., Weusthuis, R., van Dijken, J.P., Raamsdonk, L. (2002) Co-production of bioethanol, electricity, and heat from biomass residues.

19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[Coproduccion de bioetanol, electricidad y calor a partir de residues de biomasas] En: Twelfth European Conference and Technology Exhibition on Biomass for Energy, Industry and Climate Protection [Duodecima Conferencia Europea y Exhibicion de Tecnologfa sobre Biomasa para Energfa, Industria y Proteccion del Clima] , Amsterdam, The Netherlands [Pafses Bajos]

Palmquist, E., Hahn-Hagerdahl (2000a) Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I: inhibition and detoxification [Fermentacion de materiales hidrolizados lignocelulosicos I: inhibicion y desintoxicacion]. Bioresource Technology 74, paginas 17-24

Palmquist, E., Hahn-Hagerdahl (2000b) Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. [Fermentacion de materiales hidrolizados lignocelulosicos: II: inhibidores y mecanismos de inhibicion] Bioresource Technol. 74, paginas 25-33

Jing, X., Zhang, X. y Bao, J. (2009) Inhibition Performance of Lignocellulose Degradation Products on Industrial Cellulase Enzymes During Cellulose Hydrolysis. [Rendimiento de inhibicion de productos de degradacion de enzimas celulasas industriales durante la hidrolisis de celulosa] IApplied Biochemistry and Biotechnology 159, paginas 696707

Xiao, Z., Storms, R. y Tsang, A. (2004b) Microplate-based filter paper assay to measure total cellulase activity. [Ensayo con papel de filtro basado en microplacas para medir la actividad total de celulasas] Biotechnology and Bioengineering 88:832-837

Bobey, D., Ederer, G.M. (1981) Rapid detection of yeast enzymes by using 4-methylumbelliferyl substrates [Deteccion rapida de enzimas de levaduras usando unos substratos de 4-metilumbeliferilo] J.Clin.Microbiol.,paginas 2, 393-394

Maki, M., Leung, K.T., Qin, W. (2009) The prospects of cellulose producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. [Las perspectivas de bacterias productoras de celulosa para la byconversion de una biomasa lignocelulosica] Int. J. Biol. Sci. 5, paginas 500-516

Lynd, L.R., Weimer, P.J., van Zyl, W.H., Pretorius, I.S. (2002) Microbial cellulose utilisation: Fundamentals

and biotechnology. [Utilizacion microbiana de celulosa: Fundamentos y biotecnologfa] Microbiol. and Molecular.

Biology Rev. 66, paginas 506-577

Shewale JG. Beta-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose. [Beta-glucosidasa: su cometido en la smtesis de celulasas y en la hidrolisis de celulosa] (1982) Int J Biochem. 14, paginas 435-43

Seidle, H.F., Marten, I., Shoseyov, O., Huber, R.E. (2004), Physical and kinetic properties of the family 3 beta- glucosidase from Aspergillus niger which is important for cellulose breakdown. [Propiedades ffsicas y cineticas de la familia de 3 beta-glucosidasa procedente de Aspergillus niger que es importante para la descomposicion de celulosa] The Protein J. 23, paginas 11-23

Szijarto, N., Szengyel, Z., Liden, G., Reczey, K. (2004) Dynamics of cellulase production by glucose grown cultures of trichoderma reesei RUT-C30 as a response to addition of cellulose [Dinamica de la produccion de celulasas por cultivos de trichoderma reesei RUT-C30 que han crecido con glucosa como una respuesta a la adicion de celulosa] Appl. Biochem. Biophys. 115, paginas 115-124

Kristensen, J.B., Felby, C., Jorgensen, H. (2009) Yield-determining factors in high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose [Factores determinantes del rendimiento en la hidrolisis enzimatica de lignocelulosa con alto contenido de materiales solidos] Biotech. for Biofuels 2, paginas 1-22

Fischer, C.R., Klein-Marcuschamer, D., Stephanopoulos, G. (2008) Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production. [Seleccion y optimizacion de anfitriones microbianos para la produccion de biocombustibles] Metab. Eng. 10(6), paginas 295-304.

Shaw A.J., Podkaminer K.K., Desai S.G., Bardsley J.S., Rogers S.R., Thorne P.G., Hogsett D.A., Lynd L.R. (2008) Metabolic engineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. [Tratamiento por ingeniena metabolica de una bacteria termofila para producir etanol con alto rendimiento] Proc. Natl. Acad. Sci. 105(37), paginas 13769-74

Campell, J.A., Hansen, R.W., Wilson, J.R. (1999) Cost effective colorimetric microtitre plate enzymic assays for sucrose, glucose and fructose in sugarcane tissue extracts. [Ensayos enzimaticos en una placa de microtitulacion colorimetrica para sacarosa, glucosa y fructosa en extractos tisulares de cana de azucar] J. Sci. Food. Agicult. 79, paginas 232-236.

Matsushika A, Inoue H, Murakami K, Takimura O, Sawayama S. (2009) Bioethanol production performance of five recombinant strains of laboratory and industrial xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae. [Rendimiento de

5

10

15

20

25

30

35

40

produccion de bioetanol de cinco cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae que fermentan xilosa industrialmente]. Bioresour Technol. Abril de 2009 100(8) :2392-8.

Nigam JN. (2001) Ethanol production from hardwood spent sulfite liquor using an adapted strain of Pichia stipitis. [Produccion de etanol a partir de un lfquido de tratamiento con sulfito de una madera dura usando una cepa adaptada de Pichia stipitis]. J Ind Microbiol Biotechnol. 26(3), paginas 145-50.

Laplace JM, Delgenes JP, Moletta R, Navarro JM. (1992) Alcoholic glucose and xylose fermentations by the coculture process: compatibility and typing of associated strains. [Fermentaciones alcoholicas de glucosa y xilosa por el procedimiento de cocultivacion: compatibilidad y tipificacion de cepas asociadas] Can J Microbiol. 38(7), paginas 654-8

Tolan, J.S. (2002): logens process for producing ethanol from cellulosic biomass. [Procedimiento logens para producer etanol a partir de una biomasa celulosica.] Clean Technol. Environ.

Policy. 3, paginas 339-345

Cardona, C.A., Sanchez, O.J. (2007) Fuel ethanol production: Process design trends and integration opportunities. [Produccion etanolica de combustibles. Tendencias de diseno de procesos y oportunidades de integracion] Bioresource Technol. 98, paginas 2415-2457

Jorgensen, H., Vibe-Pedersen, J.,Larsen, J., Felby C. (2006) Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations. [Licuacion de lignocelulosa con altas concentraciones de materiales solidos]. Biotechnology and Bioengineering 96, paginas 862 - 870

Chadha B.S., Kanwar S.S., Saini H.S., Garcha H.S. (1995) Hybrid process for ethanol production from rice straw. [Procedimiento hnbrido para la produccion de etanol a partir de paja de arroz] Acta Microbiol Immunol Hung. 42(1):53-9.

Hennessey, S.M. Seapan, M., Elander, R.T., Tucker, M.P. (2006) Process for concentrated biomass saccharification. [Procedimiento para la sacarificacion de una biomasa concentrada] documento WO2009/045651A2

Leland, M.V. (2008) Separation technologies for recovery and dehydration of alcohols from fermentation broth. [Tecnologfas de separacion paras la recuperacion y deshidratacion de alcoholes a partir de un caldo de fermentacion] Biofuel, Biorpod.Bioref. 2, paginas 553-588

Rao, M., Desphpande, V., Seeta, R., Srinivasan, M.C., Mishra, C. (1985) Hydrolysis of sugarcane Bagasse by mycelium biomass from penicillium funiculosum. [Hidrolisis de un bagazo de cana de azucar por una biomasa con micelios procedente de penicillium funiculosum] Biotechnol. Bioengineer 27, 00. 1070-72

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para degradar a una biomasa lignocelulosica previamente tratada, que comprende las etapas de:

   c) cultivar un microorganismo que es capaz de producir por lo menos una enzima que tiene una actividad

   5 celulofftica y/o hemicelulofftica en un medio de crecimiento, obteniendo de esta manera una suspension

   rica en microorganismos, que comprende dicha por lo menos una enzima;

   d) elaborar el microorganismo y/o la suspension rica en microorganismos de la etapa c), por

   (i) un tratamiento mecanico que comprende el sometimiento a una entrada de energfa volumetrica de 1-500 kW/m3, durante un penodo de tiempo de 0,1-60 min;

   10 y/o

   (ii) un tratamiento mecanico que se selecciona entre un tratamiento con un mezclador, un tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino;

   y/o

   (iii) un tratamiento mecanico que implica bombear la suspension espesa de fermentacion que

   15 contiene microorganismos desde el recipiente de fermentacion hasta el recipiente de hidrolisis;

   e) someter a una biomasa lignocelulosica previamente tratada conjuntamente con el producto de la etapa d) a la accion de un reactor para la hidrolisis de una biomasa con el fin de obtener unos azucares solubles.
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la biomasa lignocelulosica previamente tratada se ha obtenido a partir de una biomasa lignocelulosica por un tratamiento ffsico-qmmico.

   20 3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en que el medio de

   crecimiento de la etapa c) comprende una biomasa lignocelulosica, que preferiblemente ha sido tratada previamente.
3. 4. Un procedimiento para degradar una biomasa lignocelulosica, que comprende las etapas de:

   a) un tratamiento ffsico-qmmico previo de una biomasa lignocelulosica para obtener una suspension espesa previamente tratada;

   25 b) separar la suspension espesa previamente tratada de la etapa a) en dos partes, la parte A y la parte B;

   c) incorporar la parte A en un medio de crecimiento en bruto para proporcionar un medio de crecimiento final, y cultivar por lo menos un microorganismo capaz de producir por lo menos una enzima que tiene actividad celulofftica y/o hemicelulofftica en el medio de crecimiento final, obteniendose de esta manera una suspension rica en microorganismos que comprende dicha por lo menos una enzima;

   30 d) elaborar el microorganismo y/o a la suspension rica en microorganismos de la etapa c), en que dicho

   tratamiento comprende un tratamiento mecanico que es uno o mas de los siguientes:

   (i) un tratamiento mecanico que comprende el sometimiento a una entrada de energfa volumetrica

   de 1-500 kW/m3, durante un penodo de tiempo de 0,1-60 min;

   y/o

   35 (ii) un tratamiento mecanico que se selecciona a partir de un tratamiento con un mezclador, un

   tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un molino; y/o

   (iii) un tratamiento mecanico que implica bombear la suspension espesa de fermentacion que contiene microorganismos, desde el recipiente de fermentacion hasta el recipiente de hidrolisis;

   40 e) someter conjuntamente a la parte B y al producto de la etapa d) a la accion de un reactor para la

   hidrolisis de una biomasa con el fin de obtener unos azucares solubles.
4. 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, en que el tratamiento mecanico en la etapa d) comprende el sometimiento a una entrada de energfa volumetrica de 1-500 kW/m3 durante un penodo de tiempo de 1-30 min.
5. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, en que el tratamiento mecanico en la etapa d) se 45 selecciona entre un tratamiento con un mezclador, un tratamiento con un homogeneizador y un tratamiento con un

   molino, en que el tratamiento mecanico puede anadir un esfuerzo de cizalladura mecanica o una fuerza de trituracion al microorganismo y puede romper o destruir a las membranas celulares y/o a las estructuras de las paredes celulares.
6. 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 hasta 6, en que el tratamiento mecanico 50 en la etapa d) implica bombear la suspension espesa de fermentacion que contiene microorganismos desde el

   recipiente de fermentacion hasta el recipiente de hidrolisis.

   22
7. 8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en que, cuando la etapa d) implica bombear, la tasa de cizalladura, a la que es sometida la suspension que contiene microorganismos, esta situada en el intervalo de 1.600 - 50.000 1/s.
8. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, en que el tratamiento se realiza durante un penodo de tiempo 5 de 0,01 a 100 s.
9. 10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en que el tratamiento comprende un tratamiento con energfa ultrasonica.
10. 11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en que la etapa d) comprende un tratamiento qmmico, que es un tratamiento con uno o mas agentes qmmicos, que se seleccionan

    10 entre el conjunto que se compone de unas sales, unos disolventes organicos, unos agentes tensioactivos y unas enzimas.
11. 12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones 1 hasta 4, en que la etapa d) comprende un tratamiento mecanico de acuerdo con las reivindicaciones 5 hasta 9 y un tratamiento con uno o mas agentes qmmicos de acuerdo con la reivindicacion 11.

    15 13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones 4 hasta 12, en que la parte

    A es la parte minoritaria de la suspension espesa previamente tratada que se ha obtenido en la etapa a, de 1 hasta 20 % (en peso de materiales solidos secos).
12. 14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones, en que el microorganismo es un hongo, que se selecciona entre el conjunto que se compone de: Trichoderma sp., Aspergillus sp., Penicillium

    20 sp. y Talaromyces sp..
13. 15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 14, en que el microorganismo es Trichoderma reesei.