ES2564841T3 - Composiciones y métodos para identificar neoantígenos específicos de un tumor - Google Patents

Composiciones y métodos para identificar neoantígenos específicos de un tumor Download PDF

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Abstract

Un método para identificar una pluralidad de péptidos neoantigénicos para preparar una composición inmunogénica específica de un sujeto, comprendiendo cada péptido neoantigénico un neoepítopo específico de tumor que comprende una mutación específica de tumor, método que comprende: a. identificar una pluralidad de mutaciones tumorales específicas de sujeto en genes expresados de un sujeto que tenga cáncer mediante secuenciamiento de ácidos nucleicos de genoma completo o de exoma completo de muestras del tumor y de tejido normal procedentes del sujeto, donde las mutaciones están presentes en el genoma de las células cancerígenas del sujeto pero no en el tejido normal del sujeto; b. donde cuando una mutación identificada en la etapa (a) es una mutación puntual: i. identificar un péptido mutante que tenga la mutación identificada en la etapa (a), donde dicho péptido mutante comprende un neoepítopo específico de tumor que se una a una proteína de HLA de clase I con una mayor afinidad que un péptido natural; y que tenga una IC50 inferior a 500 nM; c. donde cuando una mutación identificada en la etapa (a) sea una mutación de sitio de división, de cambio estructural, de lectura o de fusión génica: i. identificar un polipéptido mutante codificado por la mutación identificada en la etapa (a), donde dicho polipéptido mutante comprende un neoepítopo específico de tumor que se une a una proteína HLA de clase I.

Description

DESCRIPCION
Composiciones y metodos para identificar neoantigenos espedficos de un tumor Campo de la invencion
La presente invencion se refiere de forma general a la identificacion de neoantfgenos espedficos de tumor y a los 5 usos de dichos neoantigenos para producir vacunas contra el cancer.
Antecedentes de la invencion
Las vacunas contra tumores tipicamente estan compuestas de antfgenos tumorales y de moleculas inmunoestimulantes (p.ej., citocinas o ligandos de TLR) que actuan juntas para inducir celulas T citotoxicas espedficas de antigeno (CTLs) que reconozcan y lisen las celulas tumorales. Actualmente, casi todas las vacunas 10 contienen antfgenos tumorales compartidos o preparaciones de celulas tumorales enteras (Gilboa, 1999). Los antigenos tumorales compartidos son protemas inmunogenicas con una expresion selectiva en tumores a lo largo de muchos individuos, y normalmente se administran a los pacientes como peptidos sinteticos o protemas recombinantes (Boon et al., 2006). Por el contrario, las preparaciones de celulas tumorales enteras se administran a los pacientes como celulas irradiadas autologas, lisatos celulares, fusiones celulares, preparaciones protemas de 15 choque termico o ARNm total (Parmiani et al., 2007). Puesto que las celulas tumorales enteras son aisladas del paciente autologo, las celulas expresan antigenos tumorales espedficos del paciente, asf como antfgenos tumorales compartidos. Finalmente, existe una tercera clase de antigenos tumorales que raramente han sido usados en vacunas debido a dificultades tecnicas para identificarlos (Sensi et al. 2006). Esta clase consiste en protemas con mutaciones espedficas de tumor que dan como resultado secuencias de aminoacidos alteradas. Dichas protemas 20 mutadas tienen el potencial de: (a) marcar umvocamente un tumor (respecto a celulas no tumorales) para reconocimiento y destruccion por parte del sistema inmune (Lennerz et al., 2005); (b) evitar una tolerancia de celulas T centrales y a veces perifericas, y asf ser reconocidas por receptores de celulas T mas efectivos, de mayor avidez (Gotter et al., 2004).
Rammensee et al. (2002), Immunological Reviews 188: 164-176, describe que para obtener una seleccion de 25 antigenos tumorales adecuados para ser atacados en un paciente de cancer particular, es necesario realizar un
analisis de las diferencias entre las celulas tumorales y las normales a un nivel molecular.
Por lo tanto, existe la necesidad de un metodo para identificar neoepttopos que sean utiles como vacunas tumorales. Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para identificar una pluralidad de peptidos neoantigenicos tal como se 30 define en las reivindicaciones anexas.
La presente descripcion se refiere en parte al descubrimiento de un metodo para identificar peptido capaces de provocar una respuesta de celulas T espedficas de tumor.
En un aspecto, la descripcion proporciona metodos para identificar un neoantfgeno a traves de la identificacion de una mutacion espedfica de tumor en un gen expresado de un sujeto que padece cancer. En algunos aspectos, 35 cuando la mutacion es una mutacion puntual el metodo comprende ademas la identificacion del peptido mutante que tiene la mutacion. Preferiblemente, el peptido mutante se une a una protema HLA de clase I con una mayor afinidad que un peptido natural, y tiene una IC50 inferior a 500 nM. En otros aspectos, cuando la mutacion es una mutacion de sitio de division, de un cambio estructural, de lectura o de fusion genica, el metodo comprende ademas la identificacion del polipeptido mutante codificado por la mutacion. Preferiblemente, el polipeptido mutante se une a 40 una protema HLA de clase I.
Opcionalmente, el metodo incluye ademas seleccionar peptidos o polipeptidos que activen celulas T CD8 antitumorales.
El peptido o polipeptido mutante se une preferiblemente a una protema HLA de clase I con una mayor afinidad que un peptido natural y tiene una IC50 inferior a 500 nM. Preferiblemente, el peptido o polipeptido tiene una IC50 inferior 45 a 250 nM. Mas preferiblemente, el peptido o polipeptido tiene una IC50 inferior a 100 nM. Lo mas preferiblemente, el peptido o polipeptido tiene una IC50 inferior a 50 nM.
El peptido mutante tiene una longitud de aproximadamente 8-10 aminoacidos. En otro aspecto, tiene una longitud de aproximadamente 8-50 aminoacidos. Por ejemplo, el peptido mutante tiene una longitud superior a los 10 aminoacidos, superior a los 15 aminoacidos, superior a los 20 aminoacidos, superior a los 30 aminoacidos. 50 Preferiblemente, los peptidos mutantes tienen una longitud de aproximadamente 24-40 aminoacidos.
Tambien se describen en la presente memoria metodos para inducir una respuesta inmune espedfica de tumor en un sujeto a traves de la administracion de uno o mas peptidos o polipeptidos identificados segun los metodos de la invencion y un adyuvante. El adyuvante, por ejemplo, es un adyuvante basado en TLR o un adyuvante basado en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aceite mineral. En algunos aspectos, el peptido o polipeptido y el adyuvante basado en TLR se emulsionan con un adyuvante basado en aceite mineral. Opcionalmente, el metodo incluye ademas la administracion de un agente anti- inmunosupresor tal como un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PDI, un anticuerpo anti-PD-LI, un anticuerpo anti-CD25 o un inhibidor de IDO.
En la presente memoria tambien se describen metodos para inducir una respuesta inmune espedfica de tumor en un sujeto mediante la administracion al sujeto de celulas dendnticas autologas o de celulas que presentan antfgenos que han sido pulsadas con uno o mas de los peptidos o polipeptidos identificados segun los metodos de las invenciones. Opcionalmente, el metodo incluye ademas la administracion de un adyuvante tal como, por ejemplo, un adyuvante basado en TLR o un adyuvante basado en aceite mineral. En algunos aspectos, el peptido o polipeptido y el adyuvante basado en TLR se emulsionan con un adyuvante basado en aceite mineral. En algunas realizaciones, el metodo incluye ademas la administracion de un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores incluyen, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PDI, un anticuerpo anti-PD-LI, un anticuerpo anti-CD25 o un inhibidor de IDO.
En la presente memoria tambien se describe un metodo para vacunar o tratar un sujeto de cancer mediante la identificacion de una pluralidad de mutaciones espedficas de tumor en un gen expresado del sujeto, la identificacion de peptidos o polipeptidos mutantes que tienen las mutaciones espedficas de tumor identificadas, la seleccion de uno o mas de los peptidos o polipeptidos mutantes identificados que se una a una protema HLA de clase I, preferiblemente con una afinidad mayor que un peptido natural, y que sea capaz de activar celulas T CD8 anti- tumorales, y la administracion al sujeto de uno o mas de los peptidos o polipeptidos seleccionados, o de las celulas dendnticas autologas o las celulas que presentan antfgenos pulsadas con uno o mas peptidos o polipeptidos identificados. El peptido mutante tiene una longitud de aproximadamente 8-10 aminoacidos. En otro aspecto, tiene una longitud de aproximadamente 8-50 aminoacidos. Por ejemplo, el peptido mutante tiene una longitud superior a los 10 aminoacidos, superior a los 15 aminoacidos, superior a los 20 aminoacidos, superior a los 30 aminoacidos. Preferiblemente, los peptidos mutantes tienen una longitud de aproximadamente 24-40 aminoacidos.
Opcionalmente, el metodo incluye ademas la administracion de un adyuvante tal como, por ejemplo, un adyuvante basado en TLR o un adyuvante basado en aceite mineral. En algunos aspectos, el peptido o polipeptido y el adyuvante basado en TLR se emulsiona con un adyuvante basado en aceite mineral. En algunas realizaciones, el metodo incluye ademas la administracion de un agente anti-inmunosupresor. Los agentes anti-inmunosupresores incluyen, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PDI, un anticuerpo anti-PD-LI, un anticuerpo anti-CD25 o un inhibidor de IDO.
En algunos casos, dicho sujeto recibio un trasplante de celulas madre hematopoyeticas.
El sujeto es un humano, un perro, un gato o un caballo. El cancer es cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer gastrico, cancer de colon, cancer testicular, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer de cerebro, melanoma, linfoma, tal como linfoma de celulas B o leucemia, tal como leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia linfodtica cronica o leucemia linfodtica de celulas T.
En la presente memoria tambien se describen composiciones farmaceuticas que contienen el peptido o el polipeptido identificados segun los metodos de la invencion y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
Por ejemplo, en la presente memoria se describe una composicion que contiene al menos dos peptidos SF3B1 distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a los 50 aminoacidos y contiene una leucina en la posicion de aminoacido 625; una histidina en la posicion de aminoacido 626; un acido glutamico en la posicion de aminoacido 700; un acido aspartico en la posicion de aminoacido 742; o una arginina en la posicion de aminoacido 903; cuando se numeran segun el SF3B1 natural.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que contiene al menos dos peptidos MYD88 distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una treonina en la posicion de aminoacido 232; una leucina en la posicion de aminoacido 258; o una prolina en la posicion de aminoacido 265, cuando se numeran segun el MYD88 natural.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que contiene al menos dos peptidos TP53 distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una arginina en la posicion de aminoacido 111; una arginina en la posicion de aminoacido 215; una serina en la posicion de aminoacido 238; una glutamina en la posicion de aminoacido 248; una fenilalanina en la posicion de aminoacido 255; una cistema en la posicion de aminoacido 273 o una asparagina en la posicion de aminoacido 281, cuando se numera segun el TP53 natural.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que contiene al menos dos peptidos ATM distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una fenilalanina en la posicion de aminoacido 1252; una arginina en la posicion de aminoacido 2038; una histidina en la posicion de aminoacido 2522; o una cistema en la posicion de aminoacido 2954, cuando se numera segun el ATM natural.
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En la presente memoria tambien se describe una composicion que comprende al menos dos peptidos Abl distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una valina en la posicion de aminoacido 244; una valina en la posicion de aminoacido 248; un acido glutamico en la posicion de aminoacido 250; una alanina en la posicion de aminoacido 250; una histidina en la posicion de aminoacido 252; una arginina en la posicion de aminoacido 252; una fenilalanina en la posicion de aminoacido 253; una histidina en la posicion de aminoacido 253; una lisina en la posicion de aminoacido 255; una valina en la posicion de aminoacido 255; una glicina en la posicion de aminoacido 276; una isoleucina en la posicion de aminoacido 315; una asparagina en la posicion de aminoacido 315; una leucina en la posicion de aminoacido 317; una treonina en la posicion de aminoacido 343; una treonina en la posicion de aminoacido 351; una glicina en la posicion de aminoacido 355; una valina en la posicion de aminoacido 359; una alanina en la posicion de aminoacido 359; una isoleucina en la posicion de aminoacido 379; una leucina en la posicion de aminoacido 382; una metionina en la posicion de aminoacido 387; una prolina en la posicion de aminoacido 396; una arginina en la posicion de aminoacido 396; una tirosina en la posicion de aminoacido 417; o una serina en la posicion de aminoacido 486, cuando se numeran segun el ABL natural.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que contiene al menos dos peptidos FBXW7 distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una leucina en la posicion de aminoacido 280; una histidina en la posicion de aminoacido 465; una cistema en la posicion de aminoacido 505; o un acido glutamico en la posicion de aminoacido 597, cuando se numeran segun el FBXW7 natural.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que contiene al menos dos peptidos MAPK1 distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una asparagina en la posicion de aminoacido 162; una glicina en la posicion de aminoacido 291; o una fenilalanina en la posicion de aminoacido 316; cuando se numeran segun el MAPK1 natural.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que contiene al menos dos peptidos GNB1 distintos, donde cada peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una treonina en la posicion de aminoacido 180, cuando se numera segun el GNB1 natural.
En la presente memoria tambien se describe un metodo para tratar un sujeto con un tumor resistente a imatinib que comprende administrar a un sujeto positivo en HLA-A3 una composicion de peptido Bcr-abl con una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y contiene una lisina en la posicion de aminoacido 255, cuando se numera segun el bcr-abl natural.
En la presente memoria tambien se describe un metodo para tratar un sujeto con un tumor resistente a imatinib que comprende administrar al sujeto uno o mas peptidos que contengan una mutacion bcr-abl, donde el peptido tiene una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos y se une a una protema HLA de clase I con una IC50 inferior a 500 nM.
A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria tienen el mismo significado utilizado habitualmente por los especialistas en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria a la hora de llevar a la practica la presente invencion, a continuacion se describen los metodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente especificacion, que incluye definiciones, prevalecera. Adicionalmente, los materiales, metodos y ejemplos descritos en la presente memoria son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y de las siguientes reivindicaciones, y quedan abarcadas por las mismas.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1: muestra el equilibrio de especificidad y toxicidad autoinmune usando 3 clases de antfgenos para vacunas tumorales. Las celulas tumorales enteras pueden ser la formulacion de antfgenos menos espedficas para vacunas tumorales, ya que el conjunto completo de antfgenos de protemas expresado en las celulas tumorales incluye miles de protemas que tambien estan presentes en otras celulas del cuerpo. Los antfgenos tumorales sobreexpresados son ligeramente mas espedficos debido a que han sido seleccionados para una expresion mucho mayor y mas selectiva en tumores en comparacion con otras celulas del cuerpo. No obstante, es imposible evaluar todas las celulas del cuerpo para determinar la expresion de dichos antfgenos y existe un riesgo sustancial de que otras celulas los sobreexpresen. Finalmente, las protemas mutadas generan neoepttopos que estan presentes solo en las celulas tumorales y que proporcionan el mayor nivel de especificidad.
Figura 2: es un esquema de una estrategia de vacunacion con neoantfgenos personalizada que puede aplicarse al tratamiento de cualquier cancer. Tambien destacamos la posibilidad de aplicar esta estrategia en dos escenarios unicos. En el primer caso, un paciente es vacunado en un periodo temprano tras el trasplante de celulas madre hematopoyeticas (HSCT) (p.ej., como ocurre en la CLL, la cMl y otras leucemias). El periodo post-HSCT temprano es un momento terapeutico unico ya que el sistema inmune es competente debido a la reconstitucion con HSCT,
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superando de este modo los defectos inmunes del hospedante inducidos por el tumor o el tratamiento. Ademas, la abundancia de citocinas homeostaticas en un entorno de linfopenia, tal como el periodo temprano post-HSCT, puede contribuir a la expansion rapida de celulas T. En el segundo caso, un paciente es vacunado de forma temprana en el curso de la enfermedad cuando la competencia inmune puede estar mas intacta en las etapas tempranas de la enfermedad, antes de sufrir danos por exposicion a quimioterapia (p.ej., para tumores solidos o hematopoyeticos). Puesto que el sistema inmune probablemente es mas activo en estas dos situaciones espedficas, sugerimos que estas son las situaciones ideales para aplicar estrategias de vacunacion de tumores.
Figura 3: muestra una estrategia para identificar neoepftopos tumorales, que se describe en 3 etapas: (1) usar tecnologfas de secuenciamiento, detectar mutaciones geneticas que esten presentes en el tumor pero no en el ADN de lmea germinal de un paciente individual; (2) usar algoritmos de prediccion, predecir si los peptidos mutados tienen el potencial para unirse a alelo de HLA personal; opcionalmente dichos peptidos predichos pueden ser evaluados experimentalmente para determinar su union a protemas HLA apropiadas. Adicionalmente, dichos genes tambien deben ser expresados en celulas tumorales; (3) generar celulas T ex vivo y evaluar si son capaces de reconocer celulas que expresen la protema mutada; alternativamente, se puede usar espectrometna de masas para detectar peptidos elrndos de las protemas HLA de la superficie celular. Para la leucemia linfocftica cronica, nuestros estudios hasta la fecha demuestran que hay un promedio de 23 mutaciones de alteracion proteica por paciente, 46 peptidos mutantes de union predichos y 15-25 peptidos mutantes de union validados. De estos, nosotros anticipamos que ~7-12 peptidos son expresados y procesados en las celulas tumorales (aunque esto puede diferir entre los tumores y pacientes).
Figura 4: muestra cinco clases de mutaciones que generan neoepftopos tumorales potenciales. Pueden surgir nuevos epftopos espedficos de tumor como resultado de mutaciones puntuales contrasentido, de sitio de division, de cambio estructural o de lectura (asterisco rojo), o a partir de la fusion de dos genes (o dentro del mismo gen). En particular, mutaciones de sitio de division, de cambio estructural, de mutaciones de lectura y de fusiones genicas, pueden generar todas nuevas tiras de aminoacidos (en magenta) que normalmente no son traducidas, pero que ahora se expresan y se traducen como consecuencia de la mutacion. Las mutaciones contrasentido conducen a peptidos con cambios individuales de aminoacidos.
Figura 5: muestra la frecuencia de las mutaciones por clase en pacientes de CLL. Nuestros estudios aplicando secuenciamiento de nueva generacion a una serie de 7 tumores de CLL revelan que las celulas de CLL albergan muchas mutaciones, que proporcionan una fuente abundante de posibles peptidos mutados. Se observo que el numero total de alteraciones geneticas no silenciosas en la CLL oscilo entre 17-155 por individuo, la mayona de las cuales fueron mutaciones puntuales alteradas somaticamente (contrasentido). Los tumores de 4 pacientes tambien albergaban mutaciones de sitio de division; para 3 pacientes, se identificaron nuevas fusiones genicas mediante secuenciamiento de ARN.
Figura 6: muestra datos de predicciones automatizadas (Etapa 2A de la estrategia de la Figura 3) de union de peptidos (para peptidos que albergan una mutacion contrasentido espedfica) contra cada uno de los 6 alelos de HLA (MHC de clase I) de un paciente. Magenta = ligandos fuertes; verde = ligandos intermedios.
Figura 7: muestra metodos para confirmar la expresion de ARN de genes mutados (Etapa 2B de la estrategia de la Figura 3). A. Para el paciente de CLL 7, se observo que mas de la mitad de los genes mutados con peptidos de union a HLA predichos estaban expresados al nivel de ARN. B. Tambien usamos pirosecuenciamiento de ARN para detectar ARNs expresados que albergan mutaciones espedficas observadas en ADN. C. Se pueden validar nuevas fusiones genicas observadas mediante secuenciamiento de ADN usando clonacion PCR-TOPO de la region del punto de ruptura (se representa una fusion descubierta para el paciente 2).
Figura 8: muestra un metodo y datos para la validacion experimental de la union de peptido de HLA (Etapa 2C de la
estrategia de la Figura 3). A. Esquema de validacion experimental de la union de peptido a alelos de HLA
espedficos. B. Sumario de peptidos mutados candidatos identificados en los pacientes 1 y 2. Las celulas sombreadas indican que el analisis esta en progreso. C. Datos de prediccion vs afinidad de union verificada experimentalmente de los peptidos generados a partir de alteraciones geneticas (mutacion contrasentido o fusion genica) correspondientes al paciente 2. Un valor umbral de prediccion de IC50 < 120 nM (lmea continua vertical a la izquierda) da como resultado que todos los peptidos presentan union experimental a la HLA de clase I.
Figura 9: muestra la union diferencial predicha de peptidos mutados vs lmea germinal (es decir, tambien
denominados progenitores, naturales o normales) a alelos de HLA. 12 de 25 peptidos mutados de union a HLA predicha del Pt 2 presentan una union de >2 veces superior (umbral de corte = lmea punteada roja) a la de los peptidos progenitores. Esto ademas aumenta la especificidad de los peptidos mutados. Los peptidos mutados son espedficos por dos razones: en primer lugar, muchos de los receptores de celulas T que reconocen un peptido mutado probablemente no detectan el peptido progenitor natural; en segundo lugar, algunos de los peptidos mutados pueden unirse a HLA con una mayor afinidad que el peptido progenitor. Puesto que la primera propiedad no puede predecirse computacionalmente, nos hemos centrado en predecir la segunda propiedad y realizar una seleccion para su inclusion en vacunas solo de los peptidos que presenten una mayor union a HLA en los peptidos mutados respecto a los peptidos naturales.
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Figura 10: muestra la reactividad de celulas T contra un neoepftopo de CLL personal candidate (Etapa 3 de la estrategia de la Figura 3). Se observo que las celulas T aisladas del paciente 1 tras terapia pueden detectar un peptido TLK2 mutado espedfico (peptido n° 7) (usando el ensayo Elispot).
Figura 11: muestra que las mutaciones BCR-ABL generan muchos peptidos que se ha predicho que se unen a alelos HLA-A y HLA-B. Aplicando el algoritmo de prediccion NetMHC (Nielsen et al. PLoS One. 2007, 2(8):e796), se predijeron los peptidos generados a partir de las mutaciones BCR-ABL con potencial para unirse a 8 alelos HLA-A y -B comunes. Las mutaciones BCR-ABL mas comunes se ordenan en frecuencia decreciente (de izquierda a derecha), y se muestran los valores de IC50 predichos para varios peptidos de union a MHC de clase I. En total, se predijo la union de 84 peptidos con buena afinidad, definida como una IC50 inferior a 1000, de entre una amplia variedad de alelos de HLA. De todos los peptidos predichos, se predijo que 24 de 84 (29%) son ligandos fuertes con una IC50 < 50. 42 peptidos (50%) resultaron ser ligandos intermedios, definidos por una IC50 de entre 50 y 500. 18 peptidos (21%) fueron ligandos debiles, definidos por una IC50 de entre 500 y 1000.
Figura 12: demuestra que el peptido BCR-ABL que alberga la mutacion E255K se une a protemas HLA y se asocia con celulas T espedficas, polifuncionales en pacientes de CML. A. Puntuaciones de union obtenidas experimentalmente de E255K-B (y el peptido progenitor) a HLA A3 y miembros de supertipo. B. En celulas T CD8+ expandidas a partir de HLAA3 + E255K + paciente tras HSCT, se detecto secrecion de IFNgamma contra el peptido E255K-B (MUT) y APCs que expresan A3+ que expresan el minigen E255K (MG). Esta respuesta fue suprimida en presencia del anticuerpo de bloqueo de clase I (w6/32). C. Las celulas secretoras de IFN-gamma tambien fueron tetramer+ para el peptido mutado y fueron polifuncionales (D), secretando IP10, TNFalfa y GM-CSF (en base al ensayo Luminex).
Figura 13: muestra que los clones de celulas T derivadas de paciente pueden reconocer epftopos espedficos de tumor y matar celulas que presentan dichos epftopos. A. La reactividad respecto al epftopo de celulas T CD8+ de CML66 (peptido 66-72C) esta restringida por HLA B-4403. B. Se puede nucleofectar de manera eficiente ARNm de CML66 en celulas B expandidas con CD40L. C. Las celulas T CD8+ espedficas de CML66 son citotoxicas para celulas CD40L que expresan CML66 mediante nucleofeccion de ARN o mediante pulso de peptido, pero no para las dianas de control.
Figura 14: muestra genes mutados significativamente en CLL. A. Los 9 genes mutados mas significativamente de las 64 muestras de CLL. N -territorio cubierto total en pares base a lo largo de 64 muestras secuenciadas. Los valores- p y -q se calcularon comparando la probabilidad de ver la constelacion observada de mutaciones con las tasas de mutacion de fondo calculadas a lo largo de conjunto de datos. Barras rojas - genes no conocidos previamente como mutados en CLL; barras grises - genes en los que se ha reportado previamente una mutacion en CLL. B. Tipo (contrasentido, sitio de division, sinsentido) y localizacion de mutaciones en ATM, SF3B1, TP53, MYD88, FBXW7, DDX3X, MAPK1 y GNB1 descubiertas entre los 64 CLLs (la posicion y la mutacion en las muestras de CLL se muestran encima del gen) en comparacion con las mutaciones publicadas previamente en bibliograffa o en la base de datos COSMIC (las lmeas muestran la posicion de las mutaciones debajo del gen).
Figura 15: muestra que el SF3B1 se expresa en muestras de CLL (7a columna del grafico) y tiene una mayor expresion que muchas celulas de control, que incluyen: PBMC, M: monocito; CC: lmeas de celulas de cancer (que incluyen K562, Jurkat, IM9, MCF-7, Hela, Ovcar, RPMI, OTM, MCF-CAR, KM12BM y MM1S).
Figura 16: permite que las mutaciones SF3B1 generen peptidos que se predice que se unen a alelos de HLA espedficos de pacientes. Por ejemplo, se predice que un peptido que incluye la mutacion comun SF3B1 K700E se une fuertemente a HLA.
Descripcion detallada de la invencion
Una de las barreras crfticas para desarrollar una inmunoterapia curativa y espedfica de tumor es la identificacion y seleccion de antfgenos tumorales altamente restringidos para evitar autoinmunidad. Los neoantfgenos tumorales, que surgen como consecuencia de un cambio genetico dentro de celulas malignas, representan la clase de antfgenos mas espedfica de tumores. Los neoantfgenos apenas han sido usados en vacunas debido a las dificultades tecnicas para identificarlos. Nuestra estrategia para identificar neoepftopos espedficos de tumor implica tres etapas. (1) identificacion de mutaciones de ADN usando genoma completo o exoma completo (es decir, solo los exones capturados) o secuenciamiento de ARN frente a muestras de lmea germinal coincidente de cada paciente; (2) aplicacion de algoritmos de prediccion de union peptido-MHC validados para generar un conjunto de epftopos de celulas T candidatos que puedan unirse a los alelos de HLA del paciente, basados en mutaciones no silenciosas presentes en los tumores; y (3) demostracion opcional de celulas T espedficas de antfgeno frente a peptidos mutados o demostracion de que un peptido candidato se une a protemas de HLA sobre la superficie del tumor.
Por consiguiente, la presente descripcion se refiere a metodos para identificar y/o detectar epftopos de celulas T de un antfgeno. Espedficamente, la descripcion proporciona un metodo para identificar y/o detectar neoantfgenos espedficos de tumor que sean utiles para inducir una respuesta inmune espedfica de tumor en un sujeto.
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En particular, la descripcion proporciona un metodo para vacunar o tratar a un sujeto mediante la identificacion de una pluralidad de mutaciones espedficas de tumor en el genoma de un sujeto. Se seleccionan los peptidos y polipeptidos mutantes que tengan las mutaciones identificadas y que se unan a una protema HLA de clase I. Opcionalmente, dichos peptidos y polipeptidos se unen a una protema HLA de clase I con una afinidad mayor que el peptido natural y/o son capaces de activar celulas T CD8 antitumorales. Dichos peptidos se administran al sujeto. Alternativamente, se administran celulas que presentan antigenos autologos que han sido pulsadas con los peptidos.
La importancia de antigenos mutados, o neoepftopos, en el control inmune de tumores ha sido destacada en estudios seminales que demuestran que: (a) los ratones y los humanos a menudo montan respuestas de celulas T a antigenos mutados (Parmiani et al., 2007; Sensi y Anichini, 2006); (b) los ratones pueden ser protegidos de un tumor mediante inmunizacion con un unico peptido mutado que este presente en el tumor (Mandelboim et al., 1995); (c) los supervivientes a largo plazo de melanoma espontaneos o mediados por vacunas montan respuestas de celulas T citotoxicas (CTL) de memoria fuerte frente a los antigenos mutados (Huang et al., 2004; Lennerz et al., 2005; Zhou et al., 2005a); (d) finalmente, los pacientes de linfoma folicular muestran una remision molecular cuando se inmunizan con protemas de inmunoglobulina mutadas espedficas de paciente que estan presentes en celulas tumorales autologas (Baskar et al., 2004). Ademas, las respuestas de cTl en estos pacientes estan dirigidas a las regiones mutadas mas que a las regiones compartidas de la protema de inmunoglobulina. Adicionalmente, dichos peptidos mutados tienen el potencial de: (a) marcar urnvocamente un tumor para el reconocimiento y la destruccion por parte del sistema inmune, reduciendo de esta forma el riesgo de autoinmunidad; y (b) evitar la tolerancia de celulas T perifericas y centrales, permitiendo que el antfgeno sea reconocido por receptores de celulas T mas efectivos, de alta avidez (Figura 1).
Raramente se observan mutaciones identicas en cualquier gen particular a lo largo de los tumores (y son incluso de baja frecuencia para las mutaciones directoras mas comunes). Por lo tanto, los metodos de la presente invencion identificaran de forma exhaustiva mutaciones tumorales espedficas de paciente. Usando tecnologfas de secuenciamiento altamente paralelas, herramientas de prediccion de union HLA-peptido y ensayos bioqmmicos, los metodos de la invencion permiten: (1) la identificacion exhaustiva de peptidos mutados que sean expresados y que se unan a protemas HLA presentes en un tumor del paciente; (2) la monitorizacion de la respuesta inmune natural de pacientes de cancer frente a dichos neoepftopos identificados; (3) la determinacion de si las celulas T citotoxicas reconocen dichos peptidos en el contexto de protemas HLA del paciente puede lisar de forma selectiva celulas tumorales autologas ex vivo. Esta estrategia aborda varias cuestiones fundamentales relativas a como interactua el sistema inmune de los pacientes de cancer con los neoepftopos tumorales. Estas incluyen: ^cual y que fraccion de neoepftopos tumorales son detectados por las celulas T?, ^cuantos precursores de celulas T son capaces de responder a los neoepftopos?, ^como de frecuentes son la memoria espedfica de neoepftopo y las celulas T efectoras en circulacion y en el tumor?, quanta avidez presentan las celulas T por dichos epftopos?, ^son funcionales las celulas T espedficas de neoepftopos? Las respuestas a estas cuestiones proporcionan tanto la justificacion como la estrategia para usar neoepftopos en vacunas humanas.
El sistema inmune de un humano puede clasificarse en dos subsistemas funcionales, esto es, el sistema inmune innato y el sistema inmune adquirido. El sistema inmune innato es la primera lmea de defensa contra infecciones, y la mayona de los patogenos potenciales son neutralizados rapidamente antes de que puedan causar, por ejemplo, una infeccion perceptible. El sistema inmune adquirido reacciona frente a estructuras moleculares, denominadas antfgenos, del organismo invasor. Existen dos tipos de reacciones inmunes adquiridas, a saber, la reaccion inmune humoral y la reaccion inmune mediada por celulas. En la reaccion inmune humoral, los anticuerpos secretados por celulas B a los fluidos corporales se unen a antfgenos derivados de patogeno, lo que conduce a la eliminacion del patogeno a traves de una serie de mecanismos, p.ej., lisis mediada por complemento. En la reaccion inmune mediada por celulas, se activan celulas T capaces de destruir otras celulas. Si, por ejemplo, las protemas asociadas con una enfermedad estan presentes en una celula, son fragmentadas, dentro de la celula, proteolfticamente en peptidos. Protemas celulares espedficas se unen entonces al antfgeno o peptido formados de esta manera y los transportan a la superficie de la celula, donde son presentados a los mecanismos de defensa molecular, en particular las celulas T, del cuerpo. Las celulas T citotoxicas reconocen dichos antfgenos y matan a las celulas que albergan los antfgenos.
Las moleculas que transportan y presentan peptidos sobre la superficie celular son denominadas protemas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC, del ingles “major histocompatibility complex”). Las protemas MHC se clasifican en protemas MHC de clase I y de clase II. Las estructuras de las protemas de las dos clases de MHC son muy similares; sin embargo, difieren de forma bastante considerable en su funcion. Las protemas MHC de clase I estan presentes sobre la superficie de casi todas las celulas del cuerpo, incluyendo la mayona de las celulas tumorales. Las protemas MHC de clase I se cargan de antfgenos que habitualmente proceden de protemas endogenas o de patogenos presentes dentro de las celulas, y a continuacion son presentadas a linfocitos-T citotoxicos (CTLs, del ingles “cytotoxic T-lymphocytes”). Las protemas MHC de clase II solo estan presentes sobre celulas dendrfticas, linfocitos B, macrofagos y otras celulas presentadoras de antfgeno. Principalmente presentan peptidos, que son procesados a partir de fuentes de antfgenos externas, es decir, del exterior de las celulas, en celulas T colaboradoras (Th, del ingles “T-helper”). La mayona de los peptidos ligados por las protemas MHC de clase I proceden de protemas citoplasmicas producidas en el propio organismo hospedante sano y normalmente no
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estimulan una reaccion immune. Por consiguiente, los linfocitos T citotoxicos que reconocen dichas moleculas MHC de auto-presentacion de peptido de clase I son eliminados en el timo o, tras su liberacion del timo, son eliminados o desactivados, es decir, entrenados (“tolerized”). Las moleculas MHC solo son capaces de estimular una reaccion immune cuando presentan peptidos a linfocitos T citotoxicos no entrenados. Los linfocitos T citotoxicos tienen, en su superficie, tanto receptores de celulas T (TCR) como moleculas CD8. Los receptores de celulas T son capaces de reconocer y unirse a peptidos que forman complejos con las moleculas de MHC de clase I. Cada linfocito T citotoxico expresa un unico receptor de celulas T que es capaz de unirse a complejos MHC/peptido espedficos.
Los peptidos se unen a las moleculas de MHC de clase I mediante union de afinidad competitiva dentro del retmulo endoplasmico, antes de ser presentadas sobre la superficie celular. Aqm, la afinidad de un peptido individual esta ligada directamente a su secuencia de aminoacidos y la presencia de estructuras de union espedficas en posiciones definidas dentro de la secuencia de aminoacidos Si la secuencia de dicho peptido es conocida, es posible, por ejemplo, manipular el sistema inmune contra celulas enfermas usando, por ejemplo, vacunas de peptidos.
Empleando algoritmos de ordenador, es posible predecir epftopos de celulas T potenciales, es decir secuencias de peptidos, que se unen a las moleculas de MHC de clase I o de clase II en la forma de un complejo que presenta peptidos y a continuacion, en dicha forma, son reconocidos por los receptores de celulas T de los linfocitos T. Actualmente, se hace uso en particular de dos programas, el SYFPEITHI (Rammensee et al., Immunogenetics, 50 (1999), 213-219) y el HLA_BIND (Parker et al., J. Immunol., 152 (1994), 163-175). Las secuencias de peptidos determinadas de este modo, que potencialmente pueden unirse a moleculas de MHC de clase I, a continuacion deben ser examinadas in vitro para determinar su capacidad de union real.
El objetivo tecnico de la presente invencion es proporcionar un metodo mejorado para identificar y realizar un escrutinio de epftopos de celulas T potenciales presentes en celulas tumorales, metodo que permite un examen simultaneo y rapido de un gran numero de secuencias de peptidos, para determinar su capacidad de union a moleculas de mHc espedficas.
En la presente invencion, el objetivo tecnico en el que se basa se alcanza proporcionando un metodo para identificar y/o detectar antigenos mutantes que estan presentes en tumores pero no en tejidos normales. El metodo usa de forma masiva el secuenciamiento genomico en paralelo de la porcion codificadora completa del genoma de un paciente de cancer para identificar los genes mutados espedficos en un tumor. Con el objetivo de reducir el numero de peptidos mutantes a aquellos con el potencial de unirse mas fuertemente a HLA que los peptidos naturales, y conferir asf especificidad de tumor, se usaran algoritmos bien establecidos para predecir peptidos que se unan a cualquiera de los 6 alelos de HLA de clase I unicos de cada paciente y se calculara una IC50 predicha para todos los peptidos de 9 o 10 unidades con residuos mutantes espedficos de tumor frente a aquellos con el residuo de lmea germinal. Tfpicamente, los peptidos con una IC50 predicha < 50 nM se consideran generalmente peptidos de media a alta afinidad de union y seran seleccionados para evaluar su afinidad empmcamente usando ensayos bioqmmicos de union a HLA. Finalmente, se determinara si el sistema inmune humano puede montar respuestas inmunes efectivas contra dichos antfgenos tumorales mutados y de este modo matar de forma efectiva a las celulas tumorales y no a las celulas normales.
Definiciones
Un “epttopo de celula T” debe entenderse con el significado de una secuencia de peptidos que puede unirse a moleculas de MHC de clase I o de clase II en la forma de una molecula de MHC que presenta un peptido o de un complejo de MHC, y a continuacion, en dicha forma, ser reconocido y unirse a linfocitos T citotoxicos o celulas T colaboradoras, respectivamente.
Un “receptor” debe entenderse que significa una molecula o grupo de moleculas biologicas capaces de unirse a un ligando. Un receptor puede servir para transmitir informacion en una celula, una formacion de celulas o un organismo. El receptor comprende al menos una unidad receptora y preferiblemente dos unidades receptoras, donde cada unidad receptora puede consistir en una molecula de protema, en particular una molecula de glicoprotema. El receptor tiene una estructura que complementa la de un ligando y puede formar complejo con el ligando como pareja de union. La informacion se transmite en particular a traves de cambios conformacionales del receptor despues de la formacion del complejo del ligando sobre la superficie de una celula. Segun la invencion, debe entenderse que un receptor significa en particular protemas de MHC de las clases I y II capaces de formar un complejo receptor/ligando con un ligando, en particular un peptido o un fragmento de peptido de longitud adecuada.
Un “ligando” debe entenderse que significa una molecula que tiene una estructura complementaria a la del receptor y que es capaz de formar un complejo con dicho receptor. Segun la invencion, debe entenderse que un ligando es en particular un peptido o un fragmento de peptido que tenga la longitud adecuada y las estructuras de union adecuadas en su secuencia de aminoacidos, de tal modo que el peptido o fragmento de peptido sea capaz de formar un complejo con protemas de MHC de clase I o MHC de clase II.
Un “complejo receptor/ligando” tambien debe entenderse con el significado de un “complejo receptor/peptido” o de un “complejo receptor/fragmento de peptido”, en particular una molecula de MHC de clase I o de clase II que presenta un peptido o un fragmento de peptido.
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Las “protemas o moleculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC)”, las “moleculas MHC”, las “protemas de MHC” o las “protemas de HLA” deben entenderse con el significado, en particular, de protemas capaces de unirse a peptidos que resultan de la ruptura proteolftica de antfgenos protemicos y que constituyen epftopos de celulas T potenciales, de transportarlos a la superficie celular y de presentarlos allf a celulas espedficas, en particular a celulas de linfocitos T citotoxicos o a celulas T colaboradoras. El complejo de histocompatibilidad principal en el genoma comprende la region genetica cuyos productos genicos expresados sobre la superficie celular son importantes para la union y la presentacion de antigenos endogenos y/o extranos, y por tanto para regular los procesos inmonologicos. El complejo de histocompatibilidad principal se clasifica en dos grupos de genes que codifican para protemas diferentes, a saber moleculas de MHC de clase I y moleculas de MHC de clase II. Las moleculas de las dos clases de MHC estan especializadas para diferentes fuentes de antfgenos. Las moleculas de MHC de clase I presentan antfgenos sintetizados endogenamente, por ejemplo protemas vmcas y antfgenos tumorales. Las moleculas de MHC de clase II presentan antfgenos protemicos que proceden de fuentes exogenas, por ejemplo de productos bacterianos. La biologfa celular y los modelos de expresion de las dos clases de MHC estan adaptados a estos diferentes roles.
Las moleculas de MHC de clase I constan de una cadena pesada y una cadena ligera y son capaces de unirse a un peptido de aproximadamente 8 a 11 aminoacidos, pero normalmente de 9 o 10 aminoacidos, si dicho peptido tiene las estructuras de union adecuadas, y de presentarlo a linfocitos T citotoxicos. El peptido unido a las moleculas de MHC de clase I procede de un antfgeno protemico endogeno. La cadena pesada de las moleculas de MHC de clase I preferiblemente es un monomero de HLA-A, HLA-B o HLA-C, y la cadena ligera es p-2-microglobulina.
Las moleculas de MHC de clase II constan de una cadena cc y de una cadena p y son capaces de unirse a un peptido de aproximadamente 15 a 24 aminoacidos si dicho peptido presenta las estructuras de union adecuadas, y de presentarlo a celulas T colaboradoras. El peptido unido a las moleculas de MHC de clase II normalmente procede de un antfgeno protemico exogeno extracelular. La cadena a y la cadena p son en particular monomeros HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP.
Una “vacuna” debe entenderse que significa una composicion para generar inmunidad para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades. Por consiguiente, las vacunas son medicamentos que comprenden antfgenos y que estan destinadas a uso en humanos o animales para generar una defensa espedfica y una sustancia protectora mediante vacunacion.
“Aislado” significa que el polinucleotido o polipeptido o fragmento, variante o derivado del mismo han sido purificados esencialmente de otros materiales biologicos con los que se encuentra asociado de forma natural, o que esta esencialmente libre de otros materiales biologicos derivados, p.ej., de una celula hospedante recombinante que ha sido modificada geneticamente para expresar el polipeptido de la invencion.
“Neoantfgeno” significa una clase de antfgenos tumorales que se activan por mutaciones espedficas de tumor en protemas expresadas.
“Purificado” significa que el polinucleotido o polipeptido o fragmento, variante o derivado del mismo, esta sustancialmente libre de otro material biologico con el cual se encuentra asociado de forma natural, o que esta libre de otros materiales biologicos derivados, p.ej., de una celula hospedante recombinante que ha sido modificada geneticamente para expresar el polipeptido. Es decir, p.ej., un polipeptido purificado es un polipeptido que es al menos aproximadamente un 70-100% puro, es decir, el polipeptido esta presente en una composicion en la que el polipeptido constituye aproximadamente el 70-100% en peso de la composicion total. En algunas realizaciones, el polipeptido purificado es aproximadamente puro al 75%-99% en peso, aproximadamente puro al 80%-99% en peso, aproximadamente puro al 90%-99% en peso, o aproximadamente puro al 95%-99% en peso.
Identificacion de mutaciones espedficas de tumor
La presente invencion se basa en la identificacion de determinadas mutaciones (p.ej., las variantes o alelos que estan presentes en las celulas de cancer). En particular, estas mutaciones estan presentes en el genoma de celulas de cancer de un sujeto que tiene cancer, pero no en el tejido normal del sujeto.
Las mutaciones geneticas en tumores se consideranan utiles para el ataque inmunologico a tumores si conducen a cambios en la secuencia de aminoacidos de una protema exclusivamente en el tumor. Las mutaciones utiles incluyen: (1) mutaciones no sinonimas que conduzcan a diferentes aminoacidos en la protema; (2) mutaciones de lectura en las que se modifica o elimina un codon de parada, lo que conduce a la traduccion de una protema mas larga con una nueva secuencia espedfica de tumor en el extremo C; (3) mutaciones de sitio de division que conducen a la inclusion de un intron en el ARNm maduro y por tanto de una secuencia de protema espedfica de tumor unica; (4) redisposiciones cromosomicas que dan lugar a una protema quimerica con secuencias espedficas de tumor en la union de 2 protemas (es decir, fusion de genes); (5) mutaciones o eliminaciones de cambio estructural que conducen a un nuevo marco de lectura abierto con una nueva secuencia de protema espedfica de tumor.
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Los peptidos con mutaciones o los polipeptidos mutados que surgen, por ejemplo, de mutaciones de sitio de division, de cambio estructural, de lectura o de fusion de genes en celulas tumorales pueden identificarse secuenciando ADN, ARN o protemas en celulas tumorales en comparacion con celulas normales.
Tambien dentro del alcance de la descripcion se encuentran los peptidos que incluyen las mutaciones espedficas de tumor identificadas previas. Las mutaciones tumorales conocidas pueden encontrarse en
http://www.Sanger.ac.uk/cosmic.
Se dispone de una variedad de metodos para detectar la presencia de una mutacion o alelo particular en el ADN o ARN de un individuo. Los avances en este campo han proporcionado un genotipado de SNP a gran escala preciso, facil y economico. Por ejemplo, muy recientemente se han descrito varias tecnicas nuevas, que incluyen la hibridacion espedfica de alelo dinamica (DASH), la electroforesis de gel diagonal de sistema de microplacas (MADGE), el pirosecuenciamiento, la ligacion espedfica de oligonucleotido, el sistema TaqMan, asf como varias tecnologfas de “chip” de ADN tal como los chips Affymetrix SNP. Estos metodos requieren de la amplificacion de la region genetica diana, ttpicamente mediante PCR. Otros metodos recien desarrollados, basados en la generacion de moleculas de senal pequenas mediante ruptura invasiva seguida de espectrometna de masas o en sondas de candado inmovilizadas y amplificacion de drculo giratorio, podnan eliminar finalmente la necesidad de PCR. A continuacion se resumen varios de los metodos conocidos en la tecnica para detectar polimorfismos de nucleotido individual espedficos. Se entiende que el metodo de la presente invencion incluye todos los metodos variables.
Los medios de deteccion basados en PCR pueden incluir amplificacion multiple de una pluralidad de marcadores simultaneamente. Por ejemplo, es bien conocido en la tecnica como seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR que no solapen en tamano y que puedan analizarse simultaneamente.
Alternativamente, es posible amplificar diferentes marcadores con cebadores que esten marcados diferencialmente y que, por tanto, puedan detectarse diferencialmente. Por supuesto, los medios de deteccion basados en hibridacion permiten la deteccion diferencial de multiples productos de PCR en una muestra. En la tecnica se conocen otras tecnicas para permitir el analisis multiple de una pluralidad de marcadores.
Se han desarrollado varios metodos para facilitar el analisis de polimorfismos de nucleotido individual en ADN genomico o en ARN celular. En una realizacion, el polimorfismo de base individual se puede detectar usando un nucleotido resistente a exonucleasa especializado, tal como se describe, p.ej., en Mundy, C. R. (Patente de EE.UU. n° 4.656.127). Segun el metodo, se permite que un cebador complementario a la secuencia alelica ubicada inmediatamente en posicion 3' respecto al sitio polimorfico sea hibridado con una molecula diana obtenida de un animal o humano particular. Si el sitio polimorfico sobre la molecula diana contiene un nucleotido que sea complementario al derivado de nucleotido resistente a exonucleasa particular presente, entonces dicho derivado sera incorporado en el extremo del cebador hibridado. Dicha incorporacion hace que el cebador se vuelva resistente a la exonucleasa, permitiendo con ello su deteccion. Puesto que la identidad del derivado resistente a exonucleasa de la muestra es conocida, un descubrimiento de que el cebador se haya vuelto resistente a exonucleasas revela que el nucleotido presente en el sitio polimorfico de la molecula diana era complementario al del derivado de nucleotido usado en la reaccion. Este metodo presenta la ventaja de que no requiere la determinacion de grandes cantidades de datos de datos de secuencia superfluos.
En otro aspecto descrito en la presente memoria, se usa un metodo basado en disolucion para determinar la identidad del nucleotido de un sitio polimorfico. Cohen, D. et al. (Patente de Francia 2.650.840; Solicitud PCT n° WO 91/02087). Como en el metodo de Mundy de la Patente de EE.UU. n° 4.656.127, se emplea un cebador que es complementario a las secuencias alelicas ubicadas inmediatamente en 3' respecto al sitio polimorfico. El metodo determina la identidad del nucleotido de dicho sitio usando derivados de didesoxinucleotido marcados, que, si son complementarios al nucleotido del sitio polimorfico, se incorporaran al extremo del cebador.
Un metodo alternativo, conocido como Analisis Genetic Bit o GBA® ha sido descrito por Goelet, P. et al. (Solicitud PCT n° 92/15712). El metodo de Goelet P. et al emplea mezclas de terminadores marcados y un cebador que es complementario a la secuencia que se encuentra en posicion 3' respecto a un sitio polimorfico. De este modo, el terminador marcado que se incorpora es determinado por el nucleotido presente en el sitio polimorfico de la molecula diana evaluada, y es complementario al mismo. Al contrario que en el metodo de Cohen et al (Patente de Francia 2.650.840; Solicitud PCT n° WO 91/02087) el metodo de Goelet P. et al preferiblemente es un ensayo en fase heterogenea, en el que el cebador o la molecula diana son inmovilizados sobre una fase solida.
Recientemente se han descrito varios procedimientos de incorporacion de nucleotidos guiada por cebadores para evaluar sitios polimorficos en ADN (Komher, J. S. et al, Nucl. Acids. Res. 17: 7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18: 3671 (1990); Syvanen, A.-C., et al., Genomics 8: 684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9: 107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208: 171-175 (1993)). Estos metodos difieren del GBA® en que se basan todos en la incorporacion de desoxinucleotidos marcados para discriminar entre bases en un sitio polimorfico. En dicho formato, puesto que la senal es proporcional al numero de desoxinucleotidos incorporados, los polimorfismos que se producen en experimentos del mismo nucleotido pueden dar como resultado
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senales que son proporcionales a la longitud del experimento (Syvanen, A.-C., et al., Amer. H. Hum. Genet. 52: 4659 (1993)).
Actualmente esta en marcha una serie de iniciativas para obtener informacion de secuencia directamente de millones de moleculas individuales de ADN o de ARN en paralelo. Las tecnologfas de secuenciamiento-por-smtesis de molecula individual en tiempo real se basan en la deteccion de nucleotidos fluorescentes segun se van incorporando a una cadena de ADN incipiente que es complementaria a la plantilla que se este secuenciando. En un metodo, se anclan covalentemente oligonucleotidos de 30-50 bases de longitud en el extremo 5' de portaobjetos de vidrio. Dichas cadenas ancladas realizan dos funciones. En primer lugar, actuan como sitios de captura para las cadenas de plantilla de diana si las plantillas se configuran con colas de captura complementarias a los oligonucleotidos ligados a superficie. Tambien actuan como cebadores para la extension del cebador dirigido por plantilla que conforma la base de la lectura de secuencia. Los cebadores de captura actuan como un sitio de posicion fija para la determinacion de la secuencia usando multiples ciclos de smtesis, deteccion y ruptura qmmica del colorante-ligando para eliminar el colorante. Cada ciclo consiste en anadir la mezcla de nucleotidos marcados/polimerasa, lavar, obtener imagenes y provocar la separacion por ruptura del colorante. En un metodo alternativo, la polimerasa se modifica con una molecula donante fluorescente y se inmoviliza sobre un porta de vidrio, mientras que cada nucleotido es codificado mediante colores con un resto fluorescente aceptor unido a un gamma-fosfato. El sistema detecta la interaccion entre una polimerasa marcada fluorescentemente y un nucleotido modificado fluorescentemente segun el nucleotido se va incorporando en la cadena en crecimiento. Tambien existen otras tecnologfas de secuenciamiento-por-smtesis.
Preferiblemente, se puede usar cualquier plataforma de secuenciamiento-por-smtesis para identificar mutaciones. Tal como se ha descrito antes, actualmente hay disponibles cuatro plataformas de secuenciamiento-por-smtesis principales: los Secuenciadores Genomicos de Roche/454 Life Sciences, el Analizador 1G de Illumina/Solexa, el sistema SOLiD de Applied BioSystems, y el sistema Heliscope de Helicos Biosciences. Las plataformas de secuenciamiento-por-smtesis tambien han sido descritas por Pacific BioSciences y VisiGen Biotechnologies. Todas estas plataformas pueden usarse en los metodos de la invencion. En algunas realizaciones, una pluralidad de moleculas de acido nucleico que esten siendo secuenciadas se une a un soporte (p.ej., un soporte solido). Para inmovilizar el acido nucleico sobre un soporte, se puede anadir un sitio de imprimacion universal/de secuencia de captura en el extremo 3' y/o 5' de la plantilla. Los acidos nucleicos pueden ligarse al soporte mediante hibridacion de la secuencia de captura con una secuencia complementaria unida covalentemente al soporte. La secuencia de captura (tambien denominada secuencia de captura universal) es una secuencia de acido nucleico complementaria a una secuencia unida a un soporte que puede actuar dualmente como cebador universal.
Como alternativa a una secuencia de captura, se puede ligar un miembro de un par de acoplamiento (tal como, p.ej., anticuerpo/antfgeno, receptor/ligando, o el par avidina-biotina tal como se describe, p.ej., en la Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2006/0252077) a todos los fragmentos que van a ser capturados sobre una superficie recubierta con un segundo miembro respectivo de dicho par de acoplamiento.
Despues de la captura, la secuencia se puede analizar, por ejemplo, mediante secuenciamiento/deteccion de moleculas individuales, p.ej., como se describe en los Ejemplos y la Patente de EE.UU. n° 7.283.337, incluyendo el secuenciamiento-por-smtesis dependiente de plantilla. En el secuenciamiento-por-smtesis, la molecula ligada a la superficie es expuesta a una pluralidad de trifosfatos de nucleotido marcados en presencia de polimerasa. La secuencia de la plantilla se determina por el orden de nucleotidos marcados incorporados en el extremo 3' de la cadena en crecimiento. Esto se puede realizar en tiempo real o se puede realizar en un modo de paso-y-repeticion. Para el analisis en tiempo real, se pueden incorporar diferentes etiquetas opticas a cada nucleotido y se pueden utilizar multiples laseres para la estimulacion de los nucleotidos incorporados.
Se puede utilizar cualquier tipo de celula o tejido para obtener muestras de acido nucleico para su uso en el diagnostico descrito en la presente invencion. En una realizacion preferida, la muestra de ADN o ARN se obtiene de un tumor o de un fluido corporal, p.ej., sangre, obtenida mediante tecnicas conocidas (p.ej., venipuncion) o saliva. Alternativamente, se pueden llevar a cabo tests de acido nucleico sobre muestras secas (p.ej., pelo o piel).
Alternativamente, se puede usar espectrometna de masas de protemas para identificar o validar la presencia de peptidos mutados unidos a protemas MHC sobre celulas tumorales. Los peptidos pueden ser elrndos mediante acido desde las celulas tumorales o desde moleculas de HLA que son inmunoprecipitadas desde el tumor, y a continuacion pueden ser identificados usando espectrometna de masas.
Peptidos neoantigenicos
La descripcion incluye ademas peptidos aislados que comprenden las mutaciones espedficas de tumor identificadas por los metodos de la invencion, peptidos que comprenden mutaciones espedficas de tumor conocidas, y polipeptidos mutantes o fragmentos de los mismos identificados mediante el metodo de la invencion. Estos peptidos y polipeptidos se denominan en la presente memoria “peptidos neoantigenicos” o “polipeptidos neoantigenicos”. El termino “peptido” se usa de forma intercambiable con el de “peptido mutante” y el de “peptido neoantigenico” en la presente especificacion para designar una serie de residuos, tfpicamente aminoacidos L, conectados unos a otros, tfpicamente mediante enlaces peptfdicos entre los grupos a-amino y carboxilo de aminoacidos adyacentes. De forma
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similar, el termino “polipeptido” se usa de forma intercambiable con el de “polipeptido mutante” y el de “polipeptido neoantigenico” en la presente especificacion para designar una serie de residuos, tipicamente aminoacidos L, conectados unos a otros, tipicamente mediante enlaces peptidicos entre los grupos a-amino y carboxilo de aminoacidos adyacentes. Los polipeptidos o peptidos pueden tener una variedad de longitudes, tanto en sus formas neutras (sin carga) como en sus formas de sal, y tanto libres de modificaciones tales como glicosilacion, oxidacion de cadena lateral o fosforilacion, como conteniendo dichas modificaciones, sujetos a la condicion de que la modificacion no destruya la actividad biologica de los polipeptidos tal como se describe en la presente memoria.
En determinadas realizaciones el tamano de la al menos una molecula de peptido neoantigenico puede comprender, aunque sin limitacion, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18,

aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23,

aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28,

aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33,

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aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48,

aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80,
aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120 o mas residuos de aminoacido, y cualquier rango derivable de los mismos. En realizaciones espedficas, las moleculas de peptidos neoantigenicos tienen una longitud igual o inferior a 50 aminoacidos.
En algunas realizaciones, los peptidos y polipeptidos neoantigenicos particulares son: para MHC de clase 1 de 13 residuos o menos de longitud y normalmente constan de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos, particularmente 9 o 10 residuos; para MHC de clase II, 15-24 residuos.
Se puede disenar un peptido mas largo de varios modos. En un caso, cuando se predicen o conocen los peptidos de union a HLA, un peptido de mayor longitud podna constar de: (1) peptidos de union individual con una extension de 2-5 aminoacidos hacia el extremo N y C de cada producto genico correspondiente; (2) una concatenacion de algunos o todos los peptidos de union con secuencias extendidas para cada uno. En otro caso, cuando el secuenciamiento revela una secuencia de neoepftopo larga (>10 residuos) presente en el tumor (p.ej., debido a un cambio estructural, una mutacion de lectura o una inclusion de intron que conduce a una nueva secuencia de peptido), un peptido de mayor longitud consistina en: (3) la tira completa de nuevos aminoacidos espedficos de tumor -superando de este modo la necesidad de usar prediccion computacional o ensayos in vitro de union de peptidos a protemas HLA. En ambos casos, el uso de un peptido de mayor longitud permite el procesamiento endogeno por parte de celulas del paciente y puede conducir a una presentacion de antfgenos mas efectiva y a una induccion de respuestas de celulas T mas efectiva.
Los peptidos y polipeptidos neoantigenicos se unen a una protema HLA. En algun aspecto, los peptidos y polipeptidos neoantigenicos se unen a una protema HLA con mayor afinidad que un peptido natural. El peptido o polipeptido neoantigenico tiene una IC50 como mucho de 5000 nM, como mucho de 500 nM, como mucho de 250 nM, como mucho de 200 nM, como mucho de 150 nM, como mucho de 100 nM, como mucho de 50 nM o menos.
Los peptidos y polipeptidos neoantigenicos no inducen una respuesta autoinmune y/o invocan una tolerancia inmunologica cuando se administran a un sujeto.
En la presente memoria tambien se describen composiciones que comprenden al menos dos o mas peptidos neoantigenicos. En algunas realizaciones la composicion contiene al menos dos peptidos distintos. Preferiblemente, los al menos dos peptidos distintos se derivan del mismo polipeptido. Por polipeptidos distintos se pretende indicar que el peptido puede variar en longitud, secuencia de aminoacidos o ambos. Los peptidos derivan de cualquier polipeptido del cual se sepa, o que se haya descubierto mediante los metodos de la invencion, que contiene una mutacion espedfica de tumor. Los polipeptidos adecuados a partir de los cuales se pueden derivar los peptidos neoantigenicos pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos COSMIC (
http://www.sanger.ac.uk/cosmic). COSMIC proporciona informacion exhaustiva sobre mutaciones somaticas en canceres humanos. El peptido contiene la mutacion espedfica de tumor. En algunos aspectos, la mutacion espedfica de tumor es una mutacion directora para un tipo de cancer particular. En algunos aspectos, los peptidos derivan de un polipeptido SF3B1, un polipeptido MYD88, un polipeptido TP53, un polipeptido ATM, un polipeptido Ab1, un polipeptido FBXW7, un polipeptido DDX3X, un polipeptido MAPK1 o un polipeptido GNB1.
Con un peptido SF3B1 se pretende indicar que el peptido contiene una porcion de un polipeptido SF3B1. Preferiblemente, un peptido SF3B1 incluye una leucina en la posicion de aminoacido 625; una histidina en la posicion de aminoacido 626; un acido glutamico en la posicion de aminoacido 700; un acido aspartico en la posicion de aminoacido 742; o una arginina en la posicion de aminoacido 903, cuando se numeran segun el SF3B1 natural. En la Tabla A se muestra un SF3B1 natural (SEQ ID NO: 1).
Tabla A: SF3B1 natural (SEQ ID NO: 1)
maki akthedi e aqi r e i qgk kaa1deasevg1ds t. g yydqe iygg sdsr f agyvtsiaate] edddddysssts 1 gqkkpgyhapva 1 1 ndipqsteq ydp i aehrppki ad redey kkhrrtmiisper1dpfadggktpdpkmnar tymdvinreqhl tkeerei rqql aekakagel kvvngaaasqppskrkrrw dqtadqtpgatpkklsswdqaetpghtpslrwdetpgrakgsetpgatpg s ki wdptp shtp a ga atpgrgdtpghatpghggat8 sarknrwdetpka e a- d t p gh g s g w a e tpr t d r g g d s _ g e t p t p g a s k a- k s r w do:, p a s qmg g s t pvltpgktp i gtpamnmatptpgh imsmtpe qlqawrwer e ide rnrp1s dee1d amfpeg ykv_pppagy vp i r tpar k11 atptp1ggmt g fhmqted r a in k svndqpsgnl p f 1 k p d d i qy f d k 1 1 vd vd e s 11 speeqkerkimk 1 llkikngtppmrkaalrqitdkarefgagplfnqilpllmsptledqerh 11vkvidr i1yk1dd1vrpyvhki1vviepl1idedyyarvegredisn1 a kaaglatmistmr p o. 1 d n md e y v rnttaraf a v v a s a 1 g i p s 11 p f 1 k a vo kskkswqarhtgikivqqi a i1mgc a i1ph1r s1veiiehgivdeqqa vrtisalaiaalaeaatpygiesfdsvlkplwkgirqhrgkglaaflkai g y 1 i p 1 md a e y a n y y t r e v ml i 11 r e i qs pde e mk k i v 1 k v v k qc c g t dg veanyiktedlppffkhfwqhrmaldrrnyrqlvdttvelankvgaaeid snvddlkdeaecyrkmvmet ie k imgn1gaadi dhklee qli dgi1ya f qeqttedsvrrd ngfgtvvnal gkrvkpylpqd cgtvd wrl nnksakvrqq a a d11sr t: a vvmktcqeea1mgh1g vv1y ey1geeypo vlgsilgalkai vnvi gmhkmtppikd1lpr11p i1k nrhe kvqe nc i dlvgr i adrgae yv s a r e w inr i c f e 11 e 11 k a h k k a i r r a t vn t f g y i a k a i g p h d v 1 a 111 n n 1kvqerqnrvcttvaiaivaetespftvlpadmneyrvpelnvqngvlks 1s f1fey1g emgad yiy a v tp11eda _ mdr d1vhr qtasavv qhms1gv y gfgcedslnhl1nyvwpnvfetsphvdqavmgadeg]rvadgpcrmdqyc 1qg1fhparkv rdvywk1ynsiyigsqdaliahypri ynddkn [. y1ry e1 dyil
Con un peptido MYD88 se pretende indicar que el peptido contiene una porcion de un polipeptido MYD88. Preferiblemente, un peptido MYD88 incluye una treonina en la posicion de aminoacido 232; una leucina en la posicion de aminoacido 258; o una prolina en la posicion de aminoacido 265, cuando se numeran segun el MYD88 5 natural. En la Tabla B se muestra un MYD88 natural (SEQ ID NO: 2).
Tabla B: MYD88 natural (SEQ ID NO: 2)
mrpdraeapgppamaaggpgagsaapvsstsslplaalnmrvrrrlsifl nvrtqvaadwtalaeemdfeyleirqletqadptgrlldawqgrpgasvg r1lei1tk1grddvliedgpsi eedcqkyi1kqqqeeaekp1qvaavdss vprtaelagittlddplghmperfdaficycpsdiqfvqemirqleqtny r1k1cvsdrdvlpgt cvws i a s e1i ek r crr mvvvvsddy1qs k e cdf qt k f als1spgahqk r1ip i k yk amkk e fp s i1r f i tvedyt npct k swfwt rlakalsdp
Con un peptido TP53 se pretende indicar que el peptido contiene una porcion de un polipeptido TP53. Preferiblemente, un peptido TP53 incluye una arginina en la posicion de aminoacido 111; una arginina en la posicion de aminoacido 215; una serina en la posicion de aminoacido 238; una glutamina en la posicion de aminoacido 248;
10 una fenilalanina en la posicion de aminoacido 255; una cistema en la posicion de aminoacido 273; o una asparagina en la posicion de aminoacido 281, cuando se numeran segun el TP53 natural. En la Tabla C se muestra un TP53 natural (SEQ ID NO: 3).
Tabla C: TP53 natural (SEQ ID NO: 3)
meepqsdpsvepp1s qe11sd1wklipennv1sp1psqamdd1m1s pddi eqwftedpgpdeaprmpeaappvapapaaptpaapapapswplsssvpsq k t. y qg s ygfrlgflh s g t a k s v Let. y s p a 1 n kmf c q 1 ak t c p v q 1 w v d s l. pppgtrvramaiykqsqhmtevvrrcphhercsdsdglappqhli rvegn lrveylddrntfrhsvvvpyeppevgsdcttihynymcnsscmggmnrrp iltiitledssgn 1 grnsfevrvcacpgrdrrteeenlrkkgephhelp p g s t. kra1pnntssspqpkk kp_ dgeyftlqirgrerfemf re_ nea_ e_ kdaqagkepggsrahsshlkskkgqstsrhkklmfktegpdsd
Con un peptido ATM se pretende indicar que el peptido contiene una porcion de un polipeptido ATM. Preferiblemente, un peptido ATM incluye una fenilalanina en la posicion de aminoacido 1252; una arginina en la 5 posicion de aminoacido 2038; una histidina en la posicion de aminoacido 2522; o una cistema en la posicion de aminoacido 2954, cuando se numeran segun el ATM natural. En la Tabla D se muestra un ATM natural (SEQ ID NO: 4).
Tabla D: ATM natural (SEQ ID NO: 4)
ms 1vlndl1iccrqlehdraterkkevekfkrli rdpetikhldrhsdsk qgkylnwdavfrf1qkyiqketeclriakpnvsastqasrqkkmqeissl vkyf ike anr r apr1k c qe11ny imdtvkdssngai ygadc s n i11kd i1 sv rky wce1aqqqw1e11svy fr1y1kpsqdvhrv1variihavtkgccs q t - dglnskfldffska1qcarqek sssglnhilaaltiflktlavnirir vcelgdeilptllyiwtqhrlndslkeviielfqlqiyihhpkgaktqek g ayes t. kwrs11y n1yd11vne1sh1gsrgk yssgfrn i avkenile1raa

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para identificar una pluralidad de peptidos neoantigenicos para preparar una composicion inmunogenica espedfica de un sujeto, comprendiendo cada peptido neoantigenico un neoepftopo espedfico de tumor que comprende una mutacion espedfica de tumor, metodo que comprende:
    a. identificar una pluralidad de mutaciones tumorales espedficas de sujeto en genes expresados de un sujeto que tenga cancer mediante secuenciamiento de acidos nucleicos de genoma completo o de exoma completo de muestras del tumor y de tejido normal procedentes del sujeto, donde las mutaciones estan presentes en el genoma de las celulas cancengenas del sujeto pero no en el tejido normal del sujeto;
    b. donde cuando una mutacion identificada en la etapa (a) es una mutacion puntual:
    i. identificar un peptido mutante que tenga la mutacion identificada en la etapa (a), donde dicho peptido mutante comprende un neoepftopo espedfico de tumor que se una a una protema de HLA de clase I con una mayor afinidad que un peptido natural; y que tenga una 1C50 inferior a 500 nM;
    c. donde cuando una mutacion identificada en la etapa (a) sea una mutacion de sitio de division, de cambio estructural, de lectura o de fusion genica:
    i. identificar un polipeptido mutante codificado por la mutacion identificada en la etapa (a), donde dicho polipeptido mutante comprende un neoepftopo espedfico de tumor que se une a una protema HLA de clase I.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde cada peptido mutante tiene una longitud de aproximadamente 8-10 aminoacidos.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, donde cada peptido mutante tiene una longitud de mas de 10 aminoacidos.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, donde cada peptido mutante tiene una longitud de mas de 15 aminoacidos.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, donde cada peptido mutante tiene una longitud de mas de 20 aminoacidos.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, donde cada peptido mutante tiene una longitud igual o superior a 30
    aminoacidos.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, donde cada peptido mutante tiene una longitud de entre 8 y 50 aminoacidos.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, donde cada peptido mutante tiene una longitud de 24-40 aminoacidos.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, donde una mutacion identificada en la etapa (a) es una mutacion de cambio estructural o de eliminacion que conduce a un nuevo marco de lectura abierto con una nueva secuencia protemica espedfica de tumor.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende seleccionar un peptido identificado en la etapa (b) o el polipeptido de la etapa (c) que activa celulas T CD8 anti-tumorales.
    imagen1
    Aumento de la especificidad tumoral
    Autommumdad decreciente
    Antigenos
    Ce u as
    tumora es
    Neoepitopos
    Tumora es
    sobreexpresados
    tumorales
    Enteras
    compartidos
    FIG. 1
    imagen2
    Estrategia de vacunacion con neoantigenos personahzada
    Secuenciar
    tumorales y
    I
    normales para
    Predecir la union
    Vacunar
    i
    I
    +/- HSCT
    identificar
    de peptidos
    con peptidos
    Reco eccion
    inhibidor
    mutaciones no
    mutantes a
    mutados
    de celulas
    anti-CTLA4.
    silenciosas
    a e os de HLA
    tumorales y
    ant-PD 1/PDL1
    especificas de tumor
    del paciente
    adyuvante
    norma es
    i
    o IDO
    mm r w w >
    Multiples
    Bloqueo de
    Escenarios
    dosis de
    optimos:
    nmuno
    \/acuna
    supre5ion
    (1) periodo post
    trasplante
    temprano
    (2) enfermedad temprana
    Union de peptido
    a a e os HLA
    Peptidos con
    del paciente
    mutaciones
    FIG. 2
    imagen3
    imagen4
    Cambio-estructural
    Eliminacion o insercion
    Etapa 1: Identificar las 5 clases de mutaciones que
    generan neoepitopos tumorales potenciales
    J/IPKHFIR (progenitor)
    Contrasentido
    LMPKLFIR (Mutado)
    Exon A
    Exon B
    Sitio-division
    NIKON
    Lectura
    PH
    Fusion gemca
    Gen A
    Gen B
    FIG. 4
    imagen5
    Etapa 2A: Predicciones automatizadas de peptidos contra cada uno de los alelos de los pacientes
    ■p=.
    (JO
    Afinidad de union fuerte
    ICso<50nM
    □
    Union intermedia
    IC&0<500nM
    imagen6
    23671,55 19369,42 29706,82 33914,47 30813,86 29921,86
    No mutado ASILLMTVt
    Mutado
    ASILLMTVT
    Posiciort
    F2R/NM_G01992 T@198
    188-196
    ASILLMTVT
    189-197
    SILLMTVTS
    130-198
    ILLMTVTSI
    191-199
    LLMTVTSiD
    192-200
    LMTVTSIDR
    133-201
    MTVTSiDRF
    194-202
    TVTSiDRFL
    135-203
    VTSSDRFLA
    196-204
    TSIDRFLAV
    33864,61
    8502,73 32065,73
    28921,10
    j4ljl] 11185,03
    32446,28
    6105,16 31413,34
    30402,31
    33262,16 41747,34
    5066,20
    17874,71 16830,38
    25673,87
    10165,34 17459,35
    4337,21
    7438,75 27799,40
    5703,43
    527,45 9124,17
    FIG. 6
    14437,61
    35076,88 31257,98
    921,87
    18346,73 13844,38
    19157,37
    42419,53 41445,55
    39837,33
    37470,89 35512,98
    27827,56
    7827,33 6665,52
    29667,50
    19864,06 20854,32
    34937,23
    34058,25 28-873,51
    1245,43
    11255,57 9553,74
    imagen7
    mutado
    Etapa 2B: Confirmacion de la expresion de ARN de genes mutados
    Clonacion PCR-TOPO
    Sec. de ARN
    Pirosecuenciamiento
    (fusiones genicas)
    deARN
    (mutaciones
    contrasentido)
    Genes
    Caspasa9 {chri)
    SF3B1
    iBCIDyB
    C18orf19 (chr18)
    C22orf28
    ' 00%
    rP53
    DMXL.1
    500 pb
    A:0°/{
    natural
    AP3B1
    F2R
    NIN
    LRRC41
    Fwd P
    Casp9
    C 6orf57
    \\\\
    ClSoriiy
    ESGTCGAGTCA
    \ CASP9 , ]/ C18orf19
    SLC46A1
    \ exon
    FNDC3B
    exon
    RNF150-
    G:5G,7%
    GDF2-
    ACSM2A-
    Rev P
  11. 49.2-
    KIAA0467-
    0 1020 30 40
    CASP9-C180RF19
    Expresion
    media de ARN
    500 pb
    ESGTCGAGTCA
    FIG. 7
    imagen8
    Etapa 2C: Vahdacion experimental de la union HLA-peptido
    el peptido de
    ensayo compile con
    el peptido de
    referenda por la
    j union a HLA en 2
    Peptido de union
    / dlas
    a MHC de referenda
    El peptido de
    marcado
    libre
    ensayo umdo es
    3000“
    cuantificado
    K 2000
    ligado
    sep HPLC
    2dias
    1000
    Se calcula la IC50
    12345678
    Tiempo min
    protema HLA
    FIG. 8A
    • Mutacion contrasent
    a Fusion gemca
    40000
    lass o
    #
    mutated
    senes
    # mutated genes predicted to generate HlA binding peptides
    peptides
    Peptides xpernierstaliy confirmed''
    genetic
    alteration
    30000
    tO
    O
    20000
    lots i tested
    10000
    Missense
    8/17 47%
    bolice si
    Q....
    GenefusiO!
    18/29 46%
    Missense
    So hoe site
    bene fusion
    Puntuacion predicha (ICS0)
    F G. 8C
    FIG. 8B
    6 Old
    Ratio de IC50 Natural/Mutado
    C16orf57
    KIAA0467
    LRRC41
    NIN SF3B1 SL C46A1 TBC1D98
    TP53
    GPR35
    FAM50A
    C22orf28
    |
    imagen9
    o m
    CD ^
    o ->j
    CD CD 05 ^
    Union diferencial predicha de peptidos mutados vs. linea germinal a alelos de HLA
    imagen10
    Etapa 3: Reactividad de celulas T frente a un neoepitopo de CLL personal candidato
    peptido 7
    mutado TLK-2
    Puntuacion de union a HLA-A301 = 41
    122
    PH A
    DCs
    solas
  12. 20.000 celulas T <
    Dus 4-
    peptido 7
    Paciente 1
    F G. 10
    imagen11
    Las mutaciones BCR-ABL generan muchos peptidos con prediccion de union a alelos de HLA-A y HLA-B
    0 HLA-A 0101
    “Ligandos predichos fuertes IC5o<50
    22 de 84 (29%)
    0 HLA-A 0201
    • H LA-
    0301
    Ligandos predichos intermedios (50<ICso<500); 42 (50%)
    HLA-A 1101
    18 (21 %)
    “Ligandos predichos debiles (500<IC5o<1000)
    I HLA-A 2402
    HLA-B 0702
    HLA-B 0801
    O HLA-B 1501
    fuerte
    100
    > mtermedio
    aebi
    1000
    F"
    >LU
    >to
    s>
    p-5 CNjN-
    oo ij^s lo ■o- co o oj lo c? cr> KL. oJ rv, co to l"- to
    in
    cn c?
    rv ojop
    'CM cm f\i cn so co s. P OGQh’i;13"'' ^“-1
    CN CO cm CM CM
    CO CM
    Li_
    >- LU LLi ^
    uis
    Li-0
    >o
    MUTAC ON BCR-ABL
    Frecuencia de Mutacion
    FIG. 11
    SFC/50.000 celulas CD8+
    Peptido
    Secuencia Capacidad de union a supertipo HLA A03 (SC50 n!Vl}
    ZZZ /// /
    A*11Q1 A*3QQ1 A*31Q1 A*3301 A*6801
    E255K- progenitor
    EWEGVWKK 63 m 10
    E255K-B
    KVYEGVWKK % zz 39 603 202 42860 45
    FIG. 12A
    imagen12
    E255K
    peptido 66-72C
    imagen13
    Genes mutados significativamente
    Mutaciones conductoras en CLL
    SF3B1 TP53 MYD88 ATM F8XW7 DDX3X'm MAPK1 GNB1 il M6PR
    imagen14
    n(%)
    N= valor p valor q
    10(16)
    250726 <1=0xi0 '' <6,3xl0&
    8(12,5)
    76514 <1.0x10’" <6.3x10°
    7(11)
    49253 <1.0x'G11 <6,3x10"
    7(9)
    583312 1.7x10 7 5,1x10"
    4(4,7)
    157770 3,8x10"' 1,5x10s
    3(4,7)
    124816 3,6x10" 1.1x10'"
    3(3,1)
    62572 5,7x10* 1.5x1 O’"
    2(3,1)
    65196 3,4x10S 7,9x10'"
    2(3,1)
    54411 1.2x10'* ..ZM'K
    C 4 8 12
    n° mutaciones / 64 CLLs
    SF3B1 Chr. 2q33.1
    mutaciones f
    . cll {
    ,-DCD
    toco
    QC.2L
    1
    K700E (x4)
    C74QE — G742D(x2) r-Q903R
    i
    | Contrasent. | Division
    Publicado 0 Cambio est. previamente ^sinsentido
    1304 aa
    -22 PP2A dominios repetic. -*»22
    i............................::.....::........_.............._.....i
    FBXW7 Ck 4 q31.3
    r__I
    mutaciones J §
    ,CLL l
    1 Contrasent. | Division
    as
    Ll.
    Q.
    IOLU LO !.f>
    40 CZi o> "if lO LO
    Ktrt!) cL ci cL
    Publicado
    previamente
    Cambio est. 1 Sinsentido
    Y///////////zMm mmmmv
    's m n n i \ \i\\ \\ n : f
    i im hi i ami
    70033 dominioF-box (278-324 WD1 = (378-413 aa)
    WD2 = (420-456 aa) WD3 = (459-488 aa) WD4 - (600-536 aa) M)5=(539-578 aa) WD6=(58-0-618 sa) WD7=(622-659 aa}
    Ln
    NJ
    FIG. 14B Coni.
    TP53 Chr. 17 p1 3.1 mutaciones f CLL 1 3
    IN*
    CO
    O
    S215R
    --C238S
    ..R248Q
    I255F rR273C
    | Contrasent.
    | Division
    | Publicado
    |] Cambio est.
    | previamente
    * Sinsentido
    10
    20
    30
    7M
    IBS ^DBD In 1*^ ^
    • t |* a i!Ei j>!«i i; i n^i h ft
    T “'p|P< “ST >f p j AD^Donninic actuac. (1-63 aa) cn co -r PD=Dominio rioa proceinas (64-E2 aa) ^ '.-id C/5
    NLS=Dom n a de ssfiglzaciDi de bralizacdn n linear (316-325aa)
    union ATF itelic H
    3-terminal helicasa
    MY DBS Chr.3p22
    mutaciones< CLL
    Dominic muerte
    iT..........W/&
    imagen15
    &....
    zziz
    tt
    663 Sfl Dominic de union aATF' de helica5a{211-403 aa) Dcminfc e-terminal de helicasa (414-575 aa) Estrudura j= caja DEAD' (347-35C aa)
    m
    MAPK1 Chr. 22q11.21
    309 aa
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    FAT=FRAP-ATM-TRRAP (1960-2566 aa) KMorrinio quinasa (2712-2962 aa) PRD=Qonnio regu ador P:KK (2960-3025 aa) FATC=Dominic C-term FA- (3024-3056 aa)
    V¥D1 = (53-63 aa) V¥D2 - (9-5-125 aa) MJaaWD3=(141-170 aa) WW= (182-212 aa) WD5=(224-254 aa) WD8 = (288-298 aa) WD6={310-341 aa)
    imagen16
    imagen17
    Frecoencia de mutacion
    Las mutaciones SF3B1 generan peptidos con union
    predicha a alelos de HLA de pacientes de CLL secuenciados
    o HLA-A11G1
    10
    □ HLA-A3201
    v{2pts)
    & HLA-A3101
    > Fuerte
    V HLA-AG201
    o HLA-B0801
    P 100
    HLA-A6801
    Intermedio
    (3pts)
    > Debi
    1000
    K700E G742D Q9Q3R R625L
    Mutacion SF3B1
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