ES2566338T3 - Método para identificación de la sensibilidad de un paciente a la terapia de inhibición de la telomerasa - Google Patents

Método para identificación de la sensibilidad de un paciente a la terapia de inhibición de la telomerasa Download PDF

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Abstract

Un método de monitorización de un paciente respecto a un evento adverso relacionado con la terapia de inhibición de la telomerasa en el que el método comprende testar una muestra biológica del paciente respecto a la longitud o distribución de la longitud de los telómeros, y en el que el paciente está siendo tratado con el inhibidor de la telomerasa para tratar un cáncer.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para identificacion de la sensibilidad de un paciente a la terapia de inhibicion de la telomerasa.
Campo de la Invencion
La invencion se refiere en general al campo de la identificacion de pacientes que son sensibles a agentes inhibidores de la telomerasa. En particular, la invencion proporciona metodos para deteccion de pacientes en cuyo tratamiento debena limitarse o modificarse el uso de inhibidores de la telomerasa debido a que pertenecen a una categona de riesgo de desarrollar sensibilidad limitante tal como trombocitopenia.
Antecedentes
Los telomeros son elementos geneticos localizados en los extremos de todos los cromosomas eucariotas que preservan la estabilidad del genoma y la viabilidad celular por prevencion de recombinacion y degradacion aberrantes del DNA (McClintock, 1941, Genetics vol. 26, (2) pp 234-282; Muller, 1938) The collecting net, vol. 13, (8) pp 181-198). En los humanos, la secuencia telomerica esta compuesta de 10-20 kilobases de repeticiones TTAGGG (Harley et al., 1990) Nature vol. 345 pp 458-460; Blackburn, (1991) Nature vol. 350 pp 569-573; de Lange et al., (1990) Mol. Cell. Biol. Vol. 10, (2) pp 518-527). Existen evidencias crecientes de que la perdida gradual de secuencias de la repeticion telomerica (TTAGGG) puede ser un mecanismo de sincronizacion ("reloj") que limita el numero de divisiones celulares en las celulas humanas normales (Allsopp et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 10114-10118; Harley et al., (1990) Nature, vol. 345, pp. 458-460; Hastie et al., (1990) Nature, vol. 346, pp. 866-868; Vaziri et al., (1993) Amer. J. Hum. Genet., vol. 52, pp. 661-667). En contraste, las celulas inmortales son capaces de mantener una longitud telomerica estable por regulacion creciente o reactivacion de la telomerasa, una ribonucleoprotema enzimatica que es capaz de anadir repeticiones telomericas a los extremos de los cromosomas (Greider y Blackburn (1985) Cell, vol. 43, pp. 405-413; Greider y Blackburn, (1989) Nature, vol. 337, pp. 331-337; Morin (1989) Cell, vol. 59, pp. 521-529).
La telomerasa es una enzima que anade nucleotidos a los telomeros en los extremos de los cromosomas, coadyuvando a prevenir el acortamiento telomerico hasta longitudes cnticas. Estructuralmente, la telomerasa es un complejo macromolecular singular que incorpora una cadena de RNA en su sitio activo. Este RNA incluye la secuencia telomerica complementaria (3'-AUCCCAAUC-5'), que funciona a la vez para anclar la telomerasa al telomero y como plantilla para anadir repeticiones al extremo del cromosoma. La telomerasa es activa esencialmente en todos los canceres, pero generalmente esta presente a niveles muy bajos o no detectables en el tejido adulto normal. Asf, la longitud media de los telomeros de las celulas normales vana entre los individuos y disminuye con la edad (vease Figura 7). El acortamiento de los telomeros en los tejidos normales puede acelerarse tambien por estres oxidante, fisiologico o inmunologico y por exposicion a agentes toxicos.
Las celulas del cancer sufren generalmente tandas repetidas de division celular y tienen telomeros que son estables, pero mas cortos que los de las celulas normales. La activacion de la telomerasa es necesaria para que la mayona de las celulas del cancer se repliquen indefinidamente y hace posible con ello el crecimiento y la metastasis de los tumores. (Kim et al., Science vol. 266 pp 2011-2015; Greider CW, Blackburn EH. Sci Am Feb: 92-97, 1996; Shay JW y Wright WE. "Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase" Carcinogenesis 26:867-74, 2005). Por tanto, la inhibicion de la telomerasa se considera como una estrategia de tratamiento prometedora para una gran diversidad de tipos de tumores solidos y enfermedades hematologicas malignas (Harley CB, Nature Rev. Cancer, vol. 8 pp 167-179; 2008).
GRN163L es un oligonucleotido de tio-fosforamidato con una "cola" de 5'-palmitono. El mismo inhibe la actividad de la telomerasa intracelular por fijacion a la region plantilla del RNA componente de la holoenzima telomerasa. (Shea- Herbert et al., Oncogene 24:5262-8, 2005). GRN163L ha demostrado inhibicion de la telomerasa y efectos de inhibicion del crecimiento de las celulas del cancer tanto in vitro como in vivo (Dikmen ZG, et al. Cancer Res. 65:7866-73, 2005; Djojosobruto MW et al. Hepatol 42:1-11, 2005; Hochreiter AE, et al. Clin Cancer Res 12:3184-92 2006). GRN163L se encuentra actualmente en pruebas clmicas en canceres de tumores solidos y hematologicos.
En cualquier tratamiento del cancer, la toxicidad inducida por la quimioterapia puede dar como resultado reducciones en la intensidad de dosis relativa de la quimioterapia. Las toxicidades inducidas por el tratamiento pueden incluir anemia, neutropenia, leucopenia y trombocitopenia. La trombocitopenia es una toxicidad inducida por quimioterapia que se presenta tfpicamente en la primera tanda de tratamiento por quimioterapia y puede llegar a ser mas grave durante tandas de tratamiento repetidas. Los farmacos que dan como resultado toxicidades pueden tener aplicaciones limitadas debido a intensidad reducida de dosis (RDI), retardos de dosis y reducciones relativas de dosis. Tales reducciones de dosis, intensidad reducida de dosis y retardo de dosis utilizados como medios de disminucion de la toxicidad pueden socavar el control de la enfermedad y la supervivencia global, particularmente en pacientes con enfermedades malignas potencialmente curables. Por regla general se recomienda que a fin de obtener la ratio beneficio/riesgo maxima por la quimioterapia, la dosis prescrita debena individualizarse conforme a la meta de la terapia y la respuesta.
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El tratamiento de la trombocitopenia esta determinado por la etiologfa y la gravedad de la enfermedad. El concento principal en el tratamiento de la trombocitopenia es eliminar el problema subyacente, tanto si significa la interrupcion de farmacos sospechosos de causar trombocitopenia, como si se trata de aportar factores inmunologicos o inflamatorios. Los pacientes con trombocitopenia grave pueden tratarse con transfusiones de plaquetas de un donante durante cierto periodo de tiempo. Adicionalmente, ha sido aprobado el Oprelvekina (NEUMEGa™, Wyeth) para la prevencion de trombocitopenia grave subsiguiente a la quimioterapia mielosupresora en pacientes adultos con enfermedades malignas no mieloides. Otro farmaco, Romiplostina (NpLATE™, Amgen Inc.) ha sido aprobado para el tratamiento de la purpura trombocitopenica idiopatica cronica (ITP).
En este contexto, un test altamente predictivo para pacientes que son sensibles al desarrollo de toxicidad inducida por la terapia de inhibicion de la telomerasa podna proporcionar una reduccion significativa en la carga total de toxicidad asociada con la terapia de inhibicion de la telomerasa, y hana posible el uso mas seguro de la terapia de inhibicion de la telomerasa sin denegacion inadecuada de acceso a su utilizacion.
La presente invencion esta orientada a presentar metodo para determinacion de la susceptibilidad de los pacientes de cancer a desarrollar toxicidades limitantes del tratamiento, tales como trombocitopenia, como consecuencia de la terapia de inhibicion de la telomerasa.
Sumario de la Invencion
La invencion proporciona un metodo de monitorizacion de un paciente en relacion con un evento adverso relacionado con la terapia de inhibicion de la telomerasa en el que el metodo comprende testar una muestra biologica del paciente respecto a la longitud o distribucion de la longitud de los telomeros y en el que el paciente esta siendo tratado con el inhibidor de la telomerasa para tratar un cancer.
El paciente puede monitorizarse por
(a) determinacion de la longitud media o mediana de los telomeros en una muestra biologica que comprende celulas obtenidas a partir del individuo mairnfero antes de o durante el tratamiento con una terapia de inhibicion de la telomerasa y multiplicacion de la longitud media o mediana de los telomeros por un coeficiente para llegar a un componente de la longitud de los telomeros;
(b) multiplicacion de la dosis de tratamiento propuesta por un coeficiente para llegar a un componente de dosificacion;
(c) calculo de la suma del componente telomero, el componente de dosificacion y una constante; y
(d) determinacion de la probabilidad esperada de una reaccion adversa en el individuo mamffero por tratamiento con la terapia de inhibicion de la telomerasa.
En un aspecto del metodo, el individuo mamffero es un humano.
En un aspecto del metodo, el evento adverso se selecciona de trombocitopenia, anemia, leucopenia, o neutropenia.
El metodo en el que el tratamiento adverso es trombocitopenia de grados 3 o 4. En un aspecto del metodo, la muestra biologica es celulas sangumeas obtenidas del individuo mamffero. En un aspecto, las celulas sangumeas son celulas blancas. El metodo en el que las celulas blancas se seleccionan de granulocitos o linfocitos. En un aspecto, las celulas sangumeas son granulocitos. Los granulocitos se seleccionan de neutrofilos, basofilos o eosinofilos. En otro aspecto, las celulas sangumeas son linfocitos. En otro aspecto, las celulas sangumeas son monocitos o macrofagos.
En un aspecto del metodo, el individuo mamffero esta siendo tratado con el inhibidor de la telomerasa para tratar un cancer, en donde el inhibidor de la telomerasa es un oligonucleotido. En un aspecto del metodo, el inhibidor de la telomerasa es GRN163L.
En un aspecto del metodo, el cancer se selecciona del grupo constituido por cancer de mama, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer testicular, cancer gastrico, cancer gastrointestinal, cancer de faringe, cancer rectal, cancer de pancreas, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de hfgado, cancer de vejiga, cancer del tracto urinario, cancer de tiroides, cancer renal, cancer de piel, cancer cerebral, leucemia, mieloma y linfoma.
En el metodo, el componente de longitud de los telomeros es un componente positivo cuando se calcula el cambio porcentual.
En el metodo, el componente de dosificacion es un componente negativo cuando se calcula el cambio porcentual.
En el metodo, el metodo comprende adicionalmente el paso de asignar al individuo la probabilidad de sufrir una reaccion adversa al tratamiento con el inhibidor de la telomerasa.
En el metodo, las longitudes basales mas cortas de los telomeros estan asociadas con un riesgo incrementado de una reaccion adversa.
En el metodo, la dosificacion incrementada esta asociada con un riesgo incrementado de reaccion adversa.
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En el metodo, la longitud basal de los telomeros se determina por analisis FISH, analisis de transferencia Southern, analisis PCR o analisis STELA.
En un aspecto del metodo, la longitud basal de los telomeros se determina por analisis FISH.
Conforme a otra realizacion de la presente invencion, el paciente puede ser monitorizado tambien por
(a) determinacion de la longitud media o mediana de los telomeros en una muestra biologica que comprende celulas obtenidas a partir del individuo mairnfero antes de o durante el tratamiento con una terapia de inhibicion de la telomerasa y multiplicacion de la longitud media o mediana de los telomeros por un coeficiente para llegar a un componente de la longitud de los telomeros;
(b) multiplicacion de la dosis de tratamiento propuesta por un coeficiente para llegar a un componente de dosificacion;
(c) calculo de la suma del componente telomero y el componente de dosificacion y el logaritmo del numero basal de plaquetas del individuo para determinar el nadir de plaquetas predicho durante las primeras semanas de tratamiento; y
(d) determinacion de la probabilidad esperada de trombocitopenia en el individuo mai^ero como consecuencia del tratamiento con la terapia de inhibicion de la telomerasa.
En esta memoria se describe un medio accesible por computadora que comprende una base de datos que incluye una pluralidad de registros, en donde cada registro asocia (a) informacion que identifica un individuo marnffero, con (b) informacion que indica si el individuo tiene telomeros acortados y en donde cada registro asocia adicionalmente (a) con (c) informacion que identifica la presencia o ausencia de un elemento adverso resultante de la administracion de un inhibidor de la telomerasa al individuo.
Conforme a otro aspecto de la invencion, se proporciona GRN163L para uso en el tratamiento del cancer, en donde dicho tratamiento consiste en la administracion de al menos aproximadamente 1,6 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de GRN163L el dfa 1 y en aproximadamente el dfa 8 de un ciclo de 21 dfas.
Conforme a otro aspecto de la invencion, se proporciona GRN163L para uso en el tratamiento del cancer, en donde dicho tratamiento consiste en la administracion de al menos aproximadamente 1,6 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de GRN163L el dfa 1 y en aproximadamente el dfa 15 de un ciclo de 28 dfas.
En tales usos de la invencion, dicha administracion puede consistir en al menos aproximadamente 7,2 mg/kg o en al menos aproximadamente 9 mg/kg.
Otros aspectos y ventajas de la invencion resultaran mas claramente evidentes cuando la descripcion detallada siguiente de la invencion se lee junto con los dibujos acompanantes.
Breve Descripcion de los Dibujos
Fig. 1 es un grafico que muestra los niveles de plaquetas a lo largo del tiempo para pacientes individuales en los grupos 1-3 del estudio. Las lmeas quebradas horizontales muestran los intervalos para niveles diferentes de trombocitopenia. Los drculos en los momentos indican que los pacientes recibieron una dosis de GRN163L y se recogieron las plaquetas.
Fig. 2 es un grafico que muestra los niveles de plaquetas a lo largo del tiempo para pacientes individuales en el grupo 4 del estudio. Las lmeas quebradas horizontales muestran los intervalos para niveles diferentes de trombocitopenia. Los drculos en los momentos indican que los pacientes recibieron una dosis de GRN163L y se recogieron las plaquetas.
Fig. 3 es un grafico que muestra los niveles de plaquetas a lo largo del tiempo para pacientes individuales en el grupo 5 del estudio. Las lmeas quebradas horizontales muestran los intervalos para niveles diferentes de trombocitopenia. Los drculos en los momentos indican que los pacientes recibieron una dosis de GRN163L y se recogieron las plaquetas.
Fig. 4 es un grafico que muestra los niveles de plaquetas a lo largo del tiempo para pacientes individuales en el grupo 6 del estudio. Las lmeas quebradas horizontales muestran los intervalos para niveles diferentes de trombocitopenia. Los drculos en los momentos indican que los pacientes recibieron una dosis de GRN163L y se recogieron las plaquetas.
Fig. 5 es un grafico que muestra el cambio en los niveles de plaquetas en el nadir a las 5 semanas frente a la longitud de los telomeros de granulocitos basales en los pacientes del estudio. Los drculos indican pacientes dosificados con 0,4, 0,8 y 1,5 mg/kg. Los triangulos indican pacientes dosificados con 4,8 mg/kg.
Fig. 6 es un grafico que muestra el cambio en la longitud de los telomeros de granulocitos basales en el nadir a las 5 semanas frente al numero de regfmenes citotoxicos experimentados por los pacientes antes de la inclusion en este estudio.
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Fig. 7 es un grafico que muestra el cambio en la longitud de los telomeros en funcion de la edad.
Descripcion Detallada de la Invencion
Los expertos en la tecnica apreciaran que la invencion descrita en esta memoria es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas espedficamente, con inclusion de la adicion de otros componentes de factores de riesgo que pueden ser relevantes para diferentes poblaciones de pacientes o combinaciones de terapia de inhibicion de la telomerasa con otros tratamientos. Debe entenderse que la invencion incluye la totalidad de dichas variaciones y modificaciones. La invencion incluye tambien la totalidad de los pasos, caractensticas, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o que se indican en la memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualesquiera y la totalidad de las combinaciones de dos cualesquiera o mas de los pasos o caractensticas.
La presente invencion no debe considerarse limitada en alcance por las realizaciones espedficas descritas en esta memoria, que se exponen unicamente para propositos de ejemplificacion. Productos, composiciones y metodos funcionalmente equivalentes estan claramente dentro del alcance de la invencion que se describe en esta memoria.
Todas las referencias citadas, con inclusion de patentes o solicitudes de patente se incorporan en la presente por referencia. No se hace reconocimiento alguno de que cualquiera de las referencias constituya tecnica anterior.
A. Definiciones
Los terminos que siguen tienen los significados siguientes a no ser que se indique otra cosa. Un "individuo mairnfero", "individuo" o "paciente" hace referencia a un mamffero. Para los propositos de esta invencion, los marnfferos incluyen humanos; mamfferos importantes en agricultura, tales como ganado, caballos, ovejas; y/o mamfferos veterinarios, tales como gatos, conejos, roedores y perros. Un "paciente" significa un individuo que esta recibiendo tratamiento medico o veterinario.
Una "dosis" significa cantidad a administrar de una vez, tal como una cantidad de medicacion especificada. Para GRN163L, la dosis inicial de un adulto es desde aproximadamente 0,8 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg; desde aproximadamente 1,6 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. La dosis de un adulto para GRN163L es de aproximadamente 1,6 mg/kg; o aproximadamente 3,2 mg/kg; o aproximadamente 4,8 mg/kg; o aproximadamente 6,2 mg/kg; o aproximadamente 7,2 mg/kg; o aproximadamente 9 mg/kg; o aproximadamente 12 mg/kg; hasta aproximadamente 20 mg/kg. La dosis puede administrarse dos veces por semana, una sola vez por semana o con otros regfmenes de administracion. Pueden requerirse dosis mayores para producir la remision deseada en algunos pacientes. Las dosis pueden administrarse por una infusion de 2-24 horas, mas preferiblemente por una infusion de 2-4 horas.
El termino "longitud basal de telomero" o "longitud media o mediana de telomero" significa la longitud media o mediana de los telomeros del paciente en las celulas apropiadas antes de o al mismo tiempo que el paciente recibe el primer tratamiento del inhibidor de la telomerasa.
El termino "nadir de plaquetas durante las primeras semanas de tratamiento" significa el numero de plaquetas presentes en la sangre del paciente o pacientes en el punto mmimo en las primeras semanas despues del tratamiento. Las primeras semanas de tratamiento significa las semanas 1-12 de tratamiento, preferiblemente 1-8 de tratamiento, mas preferiblemente 1-6 de tratamiento, y mas preferiblemente 1-4 de tratamiento.
"Evento adverso" o "reaccion adversa" significa el desarrollo de una condicion medica indeseable o el deterioro de una condicion medica pre-existente siguiente o durante la exposicion a un farmaco. Una reaccion adversa puede seleccionarse de trombocitopenia, anemia, leucopenia, o neutropenia. Donde la reaccion adversa es trombocitopenia y la suma del componente telomero y el componente de dosificacion y una constante determina la disminucion porcentual del recuento de plaquetas en el individuo mamffero con respecto al recuento de plaquetas del individuo antes del tratamiento. Donde la reaccion adversa es trombocitopenia, la reaccion adversa puede ser cualquier grado de trombocitopenia. La reaccion adversa puede ser trombocitopenia de grados 3 o 4.
La trombocitopenia ha sido clasificada en grados diferentes dependiendo del numero de plaquetas en la sangre del individuo mamnfero.
Grado de Trombocitopenia
Numero de plaquetas/microlitro
Grado 1
75-150.000
Grado 2
50-75.000
Grado 3
25-50.000
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El termino "neutropenia" significa la presencia de numeros anormalmente bajos de neutrofilos en la sangre.
El termino "leucopenia" significa un numero anormalmente bajo de celulas blancas en la sangre.
El termino "anemia" significa una deficiencia en el componente portador de ox^geno en la sangre, medido en concentraciones unitarias en volumen de hemoglobina, volumen de celulas rojos de la sangre o numero de celulas rojos de la sangre.
El termino "numero de plaquetas basales" significa el numero de plaquetas por microlitro de la sangre del individuo mairnfero antes del tratamiento con el inhibidor de la telomerasa. "Ratio beneficio/riesgo" significa la relacion entre los riesgos y beneficios de un tratamiento o procedimiento dado. Un riesgo aceptable esta relacionado con el potencial para sufrir enfermedad o lesion que sena tolerada por un individuo a cambio de los beneficios de la utilizacion de una sustancia o proceso que causara dicha enfermedad o lesion. La aceptabilidad de un riesgo depende de datos cientfficos, factores sociales y economicos, y de los beneficios percibidos originados por un producto qmmico o farmaco que crea el o los riesgos en cuestion.
Una "muestra biologica" es una muestra de sangre o muestra de tejido del individuo marnffero. En un aspecto, la muestra biologica es sangre que contiene celulas blancas. En un aspecto, las celulas blancas son granulocitos. Los granulocitos son uno o mas de neutrofilos, basofilos o eosinofilos. En otro aspecto, las celulas blancas son uno o mas de linfocitos, monocitos o macrofagos. Preferiblemente, las celulas son celulas no cancerosas o normales.
Un "inhibidor de la telomerasa" es un compuesto que inhibe o bloquea directa o indirectamente la expresion o actividad de la telomerasa. Se dice que un inhibidor de la telomerasa inhibe o bloquea la telomerasa si la actividad de la telomerasa en presencia del compuesto es menor que la observada en ausencia del compuesto. Preferiblemente, la telomerasa es telomerasa humana. Preferiblemente, el inhibidor de la telomerasa es un inhibidor del sitio activo. Mas preferiblemente, el inhibidor de la telomerasa es un antagonista de la plantilla de hTR.
Un "polinucleotido" o "oligonucleotido" se refiere a una subunidad polfmera u oligomera de nucleosido de ribosa y/o desoxirribosa que tiene desde aproximadamente 2 a aproximadamente 200 subunidades contiguas, desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20 subunidades contiguas, desde aproximadamente 10 a aproximadamente 15 subunidades. Las subunidades de nucleosido pueden estar unidas por una diversidad de enlaces intersubunidad que incluyen, pero sin caracter limitante, enlaces fosfodiester, fosfotriester, metilfosfonato, P3' ^ N5' fosforamidato, N3'^ P5' fosforamidato, N3'^ P5' tiofosforamidato, y fosforotioato. El termino incluye tambien tales polfmeros u oligomeros que tienen modificaciones, conocidas por un experto en la tecnica, en el azucar (v.g., sustituciones 2'), la base (vease la definicion de "nucleosido" mas adelante), y los terminos 3' y 5'. En realizaciones en las que el resto de oligonucleotido incluye una pluralidad de enlaces intersubunidad, cada enlace puede formarse utilizando la misma qmmica, o puede utilizarse una mixtura de qmmicas de enlace. Cuando un oligonucleotido se representa por una secuencia de letras, tal como "ATGUCCTG", se entendera que los nucleotidos estan dispuestos en orden 5'^ 3' de izquierda a derecha. La representacion de la secuencia de bases del oligonucleotido de esta manera no implica el uso de tipo particular alguno de subunidad internucleosfdica o modificaciones en el componente base o en cualquier otra parte del oligonucleotido.
El termino "nucleosido" incluye los nucleosidos naturales con inclusion de formas 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, v.g., como se describe en Komberg y Baker, DNA Replication, 2a edicion (Freeman, San Francisco, 1992), y analogos. "Analogos", con referencia a nucleosidos, incluye nucleosidos sinteticos que llevan restos de nucleobases modificados (vease definicion de "nucleobase" mas adelante) y/o restos azucar modificados, v.g., como se describe generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, Nueva York, 1980). Tales analogos incluyen nucleosidos sinteticos disenados para mejorar las propiedades de fijacion, v.g., estabilidad, especificidad, o analogas, tal como fue descrito por Uhlmann y Peyman (Chemical Reviews 90:543-584, 1990). Un oligonucleotido que contenga tales nucleosidos, y que contiene tfpicamente enlaces internucleosfdicos sinteticos resistentes a las nucleasas, puede designarse en sf mismo como un "analogo".
Una "nucleobase" incluye (i) nucleobases nativas de DNA y RNA (uracilo, timina, adenina, guanina, y citosina), (ii) nucleobases o analogos de nucleobases modificadas(os) (v.g., 5-metilcitosina, 5-bromouracilo, o inosina) y (iii) analogos de nucleobases. Un analogo de nucleobase es un compuesto cuya estructura molecular mimetiza la de una base de DNA o RNA tfpica.
Un oligonucleotido que tiene "enlaces resistentes a las nucleasas" se refiere a uno cuya cadena principal tiene enlaces subunidad que son sustancialmente resistentes a la escision por las nucleasas, en forma no hibridada o hibridada, por las nucleasas extracelulares e intracelulares comunes en el cuerpo; es decir, el oligonucleotido exhibe poca o ninguna escision por las nucleasas en las condiciones de nucleasas normales en el cuerpo al que esta expuesto el oligonucleotido. Los enlaces N3' ^ P5' fosforamidato (NP) o N3'^ P5' tiofosforamidato (NPS) descritos mas adelante son resistentes a las nucleasas.
El termino "lfpido" se utiliza extensamente en esta memoria para abarcar sustancias que son solubles en disolventes organicos, pero escasamente solubles, si acaso, en agua. El termino lfpidos incluye, pero sin caracter limitante, hidrocarburos, aceites, grasas (tales como acidos grasos y trigliceridos), esteroles, esteroides y formas derivadas de
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estos compuestos. L^pidos preferidos son acidos grasos y sus derivados, hidrocarburos y sus derivados, y esteroles, tales como colesterol.
Los acidos grasos contienen usualmente numeros pares de atomos de carbono en una cadena lineal (comunmente 12-24 carbonos) y pueden ser saturados o insaturados, pudiendo contener, o estar modificados de modo que contengan, una diversidad de grupos sustituyentes. Por simplicidad, el termino "acido graso" abarca tambien derivados de acidos grasos, tales como grasas o esteres.
El termino "hidrocarburo" abarca compuestos que consisten exclusivamente en hidrogeno y carbono, unidos por enlaces covalentes. El termino abarca hidrocarburos de cadena abierta (alifaticos), que incluyen hidrocarburos de cadena lineal y ramificada, e hidrocarburos tanto saturados como mono- y poli-insaturados. El termino abarca tambien hidrocarburos que contienen uno o mas anillos aromaticos.
Como se utiliza en esta memoria, el termino "lfpido" incluye tambien compuestos anfipaticos que contienen a la vez restos lipfdicos e hidrofilos.
El termino "tumor", como se utiliza en esta memoria, se refiere a todo crecimiento y proliferacion de celulas neoplasticas, sea maligno o benigno, y todas las celulas y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.
Un "farmaco mejorador" es un farmaco que puede aminorar o eliminar el riesgo del desarrollo de la reaccion adversa. Por ejemplo, Oprelvekina (NEUMEGA™, Wyeth) esta aprobado para la prevencion de la trombocitopenia grave subsiguiente a la quimioterapia mielosupresora en pacientes adultos con enfermedades malignas no mieloides. Otro farmaco, la Romiplostina (NPLATE™, Amgen Inc.) ha sido aprobado para el tratamiento de la purpura trombocitopenica idiopatica cronica (ITP).
Un "cancer" puede ser un tumor maligno. Al menos 80 % de todos los canceres son carcinomas, e incluyen, pero sin caracter limitante, cancer de mama, carcinomas tanto ductales como lobulares de la mama; cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer testicular, cancer gastrico, cancer gastrointestinal, cancer de faringe, cancer rectal, cancer pancreatico, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de hngado (con inclusion de carcinoma hepatocelular), cancer de vejiga, cancer del tracto mamario, cancer de tiroides, cancer renal, cancer de piel (con inclusion de carcinoma de celulas basales, el carcinoma de piel mas comun distinto del melanoma y carcinoma de celulas escamosas, una forma comun de cancer de piel), y cancer cerebral. Las celulas de cancer que constituyen un carcinoma se conocen como "celulas de carcinoma". En el termino "cancer" se incluyen tambien canceres de las celulas sangumeas tales como leucemias, linfomas y mielomas, y canceres de otros tipos de tejido tales como sarcomas, mesotelioma, gliomas, melanoma, neuroblastoma, etc.
Una "prognosis" se utiliza en esta memoria para hacer referencia a la prediccion de la probabilidad de una reaccion adversa al tratamiento con un inhibidor de la telomerasa. El termino "prediccion" se utiliza esta memoria para hacer referencia a la probabilidad de que un individuo o paciente mamffero responda favorable o desfavorablemente a un farmaco o un conjunto de farmacos, y tambien a la extension de dichas respuestas.
El termino "terapia adyuvante" se utiliza generalmente para hacer referencia a un tratamiento que se proporciona adicionalmente a un tratamiento primario (inicial). En el tratamiento del cancer, el termino "terapia adyuvante" se utiliza para hacer referencia a quimioterapia, terapia hormonal y/o terapia de radiacion siguiente a la eliminacion quirurgica del tumor, con la finalidad primaria de reducir el riesgo de la recurrencia del cancer.
B. Descripcion Detallada
La practica de la presente invencion empleara, a no ser que se indique otra cosa, metodos convencionales de biologfa molecular, microbiologfa, biologfa celular y bioqmmica que estan dentro de la experiencia en la tecnica. Dichos metodos se explican detalladamente en la bibliograffa, tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis: A practical Approach (M.J. Gait editor, 1984); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., editores, 1987) y "PCR: The Polymerase Chain reaction" (Mullis et al., editores, 1994).
La presente descripcion proporciona un algoritmo para determinar la probabilidad de una reaccion adversa al tratamiento con un inhibidor de la telomerasa. El metodo esta basado en la identificacion de (1) la longitud media o mediana de telomeros en una celula de un paciente y la dosificacion del inhibidor de la telomerasa recibida pueden servir para determinar la probabilidad de que el paciente sufra una reaccion adversa a la terapia con el inhibidor de la telomerasa, (2) ciertos pesos asignados a la longitud y la dosis media o mediana del telomero reflejan su valor en la prediccion de la respuesta a la terapia y se utilizan en una formula; y (3) determinacion de valores umbral utilizados para dividir los pacientes en grupos con grados variables de riesgo de desarrollar una reaccion adversa, tales como grupos de riesgo bajo, medio y alto o grupos en los cuales la probabilidad de una reaccion adversa a los inhibidores de la telomerasa es baja, media o alta. El algoritmo proporciona un registro numerico que puede ser utilizado para tomar decisiones de tratamiento concernientes a la terapia de los pacientes de cancer.
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1. Tecnicas para Determinacion de la Longitud de los Telomeros
Estan disponibles varios metodos para medida de la longitud de las repeticiones telomericas en las celulas. Generalmente, las celulas cuyos telomeros deben medirse se afslan de la muestra biologica del paciente. El DNA se afsla de las celulas por metodos conocidos en la tecnica, tales como por ejemplo los protocolos de proteinasa K, RNAsa A y fenol/cloroformo (Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a edicion (1989) o el uso de kits de purificacion de DNA disponibles comercialmente.
A. Analisis de transferencias Southern
Un metodo para el analisis de las longitudes de telomeros consiste en medir la longitud del fragmento de restriccion terminal (tRf) por analisis de Transferencias Southern. En este metodo, el DNA celular se digiere con las enzimas de restriccion tales como Hinf 1 y Rsal y se pasa en geles de agarosa para transferencia a filtros Nytran. Los filtros se hibridan con una sonda espedfica de telomeros tal como (TTAGGG)3. Se generan autorradiograffas sin pantalla de intensificacion utilizando el rango de respuesta lineal del film y se escanean con un densitometro. La salida se digitaliza. La longitud media del telomero se define como I(ODi)/I(OD|/Li) donde ODi es la salida del densitometro (unidades arbitrarias) y Li es la longitud del DNA en la posicion i. Se calculan las sumas a lo largo del rango de 3-17 KB. Este calculo supone que el DNA se transfiere con eficiencia igual desde todos los puntos en el gel y que el numero de secuencias diana (repeticiones telomericas) por fragmento de DNA es proporcional a la longitud del DNA. La senal de los geles puede normalizarse para la senal de otras transferencias Southern utilizando una sonda de control a fin de estimar la cantidad total de DNA telomerico asf como su longitud. (Harley et al., Nature 345:458-460 (1990), Englehardt et al., Leukemia 12:13-24 (1998)). Este metodo da tambien la distribucion de tamanos de las longitudes de los telomeros en la poblacion de celulas de la cual se aislo el DNA. Dado que los telomeros cortos son particularmente susceptibles a la disfuncion telomerica, las modificaciones de la presente invencion podnan incluir calculos basados en la longitud telomerica media o mediana de los telomeros cortos (v.g., para el cuartil de telomeros mas corto).
B. Reaccion en Cadena de Polimerasa
Se han desarrollado metodos de la reaccion en cadena de polimerasa (PCR) para medir las longitudes medias de los telomeros y espedficas de los cromosomas. El primer metodo proporciona una medida del DNA telomerico con relacion al DNA genomico (tfpicamente un gen de una sola copia) como valor de ratio simple de una muestra de DNA genomico (Cawthon RM, Nucl. Acids Res. Vol. 30, pp e47).
En el Analisis de la longitud de los telomeros Simples (STELA), se determinan las longitudes de los telomeros de cromosomas individuales (Baird et al., Nature Genetics 33 203-207 (2003). En este proceso, el DNA se digiere con una enzima de restriccion tal como EcoRI y se cuantifica por fluorometna de Hoechst. Un enlazador o "telorette" que comprende varias bases complementarias a la region monocatenaria TTAGGG del cromosoma, precedido en el extremo 5' por 20 nucleotidos de DNA de secuencia singular. Este telorette se reasocia al colgante TTAGGG en el extremo del telomero y se liga al extremo 5' de la cadena complementaria rica en C del cromosoma. Esto marca eficazmente el extremo del telomero con una cola de telorette que tiene una secuencia singular capaz de fijarse a uno de los cebadores de la PCR. La reaccion en cadena de polimerasa (PCR) se realiza luego utilizando un cebador ("teltail") que es complementario a la cola del telorette junto con un cebador que corresponde a la region del cromosoma adyacente al telomero. El cebador correspondiente a la region del cromosoma adyacente al telomero puede hacerse tambien espedfico del cromosoma aprovechando los polimorfismos cromosomicos. Despues de la PCR. Los fragmentos de DNA se resuelven por electroforesis en gel de agarosa y se detectan por hibridacion de transferencias Southern con una sonda adyacente al telomero cebado aleatoriamente. El tamano de los fragmentos hibridados puede determinarse a partir de standards de tamano en el gel y utilizarse para calcular la longitud de los telomeros individuales. Este metodo proporciona tambien la distribucion de tamano de los telomeros del cromosoma espedfico elegido como objetivo en la poblacion de celulas de la que se aislo el DNA. Dado que la PCR sesga la amplificacion de los fragmentos cortos del DNA, STELA es particularmente util para analisis de los telomeros mas cortos en una celula. Esto tiene aplicacion en la presente invencion como se ha descrito arriba.
C. Citometria de flujo y analisis FISH
La longitud media o mediana de las repeticiones telomericas en ^las celulas? puede determinarse tambien utilizando hibridacion in situ fluorescente (FISH) con sondas marcadas de acido nucleico peptfdico (PNA) espedficas para repeticiones telomericas en combinacion con medidas de fluorescencia por citometna de flujo (Flow-FISH). (Vease Baerlocher et al., Nature Protocols vol. 1, 2365-2376 (2006) incorporado por referencia en su totalidad). La ventaja de Flow-FISH radica en proporcionar informacion multiparametrica acerca de la longitud de las repeticiones telomericas en miles de celulas individuales. Flow-FISH multicolor automatizada es uno de los metodos mas rapidos y mas sensibles disponibles para medir la longitud media o mediana de los telomeros en granulocitos, celulas T naff, celulas T de memoria, celulas B y celulas agresoras naturales (NK) en la sangre humana. (Baerlocher y Lansdorp, Methods in Cell boil. 75, 719-750 (2004).
En Flow-FISH se centrifuga sangre entera, se lisan las celulas rojos y el lisado de celulas rojos se separa del sedimento de celulas constituido por granulocitos, monocitos, linfocitos, plaquetas y cualesquiera celulas rojos
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remanentes. El sedimento de celulas blancas de la sangre se resuspenden en un tampon de hibridacion y se somete a recuento. Los celulas blancas humanos nucleadas de la sangre se mezclan con timocitos de bovino, incluidos como control interno dado que estas celulas se obtienen facilmente y debido a que la longitud de los telomeres en los timocitos de bovino es aproximadamente 2-3 veces mayor que el valor medido tipicamente en las celulas humanas. De acuerdo con ello, estas celulas de control se distinguen facilmente de las celulas de test humanas y proporcionan un punto de referencia para medidas de la fluorescencia de los telomeres. La mixtura de celulas humanas y timocitos de bovino se hibrida con la sonda de PNA (acido nucleico peptfdico) marcada con Cy5 o con fluorescerna, que es complementaria a la secuencia de repeticion de los telomeros. Una segunda mixtura de las celulas no se hibrida con la sonda. Esta ultimo es necesario para medir el nivel de autofluorescencia en las celulas de interes y hacer posible el calculo de la longitud de los telomeros a partir de la hibridacion espedfica del PNA. La sonda de PNA marcada con fluorescerna o Cy5 esta disponible comercialmente. Despues de la hibridacion, las celulas se reducen a un sedimento y se lava el sedimento de celulas. Las celulas pueden someterse a contratincion con concentraciones no saturantes de un tinte de DNA y diversos anticuerpos. Las muestras de celulas se analizan en un citometro de flujo.
El primer paso en el analisis subsiguiente es identificar las celulas utilizando luz directa y dispersion lateral en una grafica de puntos bivariante. Pueden observarse tres poblaciones de celulas. Los timocitos de bovino pueden distinguirse de los linfocitos humanos, los cuales pueden distinguirse a su vez de los granulocitos. Por combinacion de la fluorescencia en los graficos de contorno pueden obtenerse histogramas de fluorescencia de las diferentes poblaciones de celulas, que se utilizan para calculos subsiguientes de la longitud de los telomeros. Pueden utilizarse anticuerpos espedficos para celulas CD45RA y CD20 a fin de realizar el analisis de la longitud de los telomeros de poblaciones espedficas dentro de la poblacion de linfocitos. La longitud media de telomero puede determinarse sustrayendo la fluorescencia de las poblaciones de celulas blancas de la sangre sin tenir del nivel de fluorescencia de las celulas PNA tenidas. Este metodo recoge una senal media de los telomeros de cada celula individual, por lo que puede obtenerse la distribucion de tamanos de telomero de la poblacion global, y podna analizarse el subconjunto de celulas con telomeros cortos. Esto tiene aplicacion en la presente invencion como se ha descrito arriba.
2. Algoritmo para predecir los niveles de plaquetas, o cambios despues de la terapia de inhibicion de la telomerasa y para generar la probabilidad de reaccion adversa
Un aspecto de la presente invencion es utilizar la longitud media medida de los telomeros en las celulas del paciente para proporcionar informacion concerniente a la probabilidad de una reaccion adversa a un inhibidor de la telomerasa antes de la administracion de un inhibidor de la telomerasa. En el paso siguiente, la longitud media medida de los telomeros se multiplica por un coeficiente que refleja su contribucion con relacion al riesgo de la reaccion adversa al tratamiento con un inhibidor de la telomerasa a fin de determinar el componente de longitud de los telomeros.
El paso siguiente consiste en tomar la dosis propuesta del inhibidor de la telomerasa y multiplicar la dosis por un coeficiente que refleja su contribucion con relacion al riesgo de reaccion adversa al tratamiento con un inhibidor de la telomerasa para determinar el componente de dosificacion. El componente de longitud de los telomeros y el componente de dosificacion se suman con un factor de ordenada del origen para determinar la probabilidad de la reaccion adversa.
Por ejemplo, la ecuacion para describir el numero predicho de plaquetas en el nadir de plaquetas en un paciente despues de 4 semanas completas de tratamiento es como sigue:
# predicho de plaquetas = numero basal de plaquetas - (numero basal de plaquetas x % cambio en plaquetas/100)
% cambio en # de plaquetas = (-73,8) - 6,6 x dosis de inhibidor (mg/kg) + 11,2 x longitud media de los telomeros (kpb)
La ecuacion para describir el numero predicho de plaquetas en el nadir de plaquetas en un paciente durante las primeras 4 semanas de tratamiento es como sigue:
# predicho de plaquetas = e
[(-0,38) - 0,13 x dosis de inhibidor (mg/kg) + 0,25 x longitud media de los telomeros (kpb) + 0,80 x log del numero basal de plaquetas]
Pueden calcularse intervalos de prediccion, por ejemplo, para predecir el cambio porcentual probable en los niveles de plaquetas o el nadir de plaquetas para pacientes o individuos con un conjunto particular de valores basales y de tratamiento, por ejemplo, longitud de los telomeros, plaquetas basales y nivel de dosis. La ecuacion de regresion proporciona el valor esperado para un individuo futuro con covariantes especificadas (J. Neter et al. Applied linear statistical models: regression, analysis of variance, and experimental designs, 3a edicion, pp. 81-83 (1990)). Sin embargo, debido al error de distribucion del muestreo asf como a la variabilidad interindividual, un paciente puede tener niveles de plaquetas que caen por encima o por debajo del valor predicho. Puede generarse una serie de intervalos de prediccion con cobertura decreciente. Por ejemplo, puede generarse un intervalo de prediccion de 99% con lfmites superior e inferior Pu99 y Pl99 que contendna, por termino medio, 99% de los niveles de plaquetas observados en los pacientes; y puede generarse tambien un intervalo de prediccion de 90% con niveles superior e inferior Pu90 (< Pu99) y Pl90 (> Pl99) que contendna, por termino medio, 90% de los niveles de plaquetas observados
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futuros. Esto hace posible determinar la probabilidad de que el paciente pudiera desarrollar una trombocitopenia de grado 3 o 4.
La probabilidad de riesgo de una reaccion adversa, como se determina por el algoritmo de la presente invencion, proporciona instrumentos valiosos para que el medico clmico tome decisiones de tratamiento cnticas. As^ si el riesgo de un paciente particular es bajo, el medico podna decidir que despues de la eliminacion quirurgica del cancer, el paciente pueda tratarse agresivamente con dosis altas y frecuencia elevada de administracion del inhibidor de la telomerasa. Si, por el contrario, se determina que el nivel de riesgo es alto, puede utilizarse esta informacion para decidir el nivel de dosificacion del inhibidor de la telomerasa a administrar y el regimen de dosificacion a utilizar, con inclusion del uso de semanas sin dosis administrada alguna, denominadas semanas "de descanso". El medico puede decidir monitorizar mas estrechamente al paciente respecto a reacciones adversas, tales como trombocitopenia. El medico puede decidir administrar un agente farmaceutico mejorador simultaneamente con el inhibidor de la telomerasa. Si el riesgo del paciente respecto a una reaccion adversa es alto, pueden utilizarse otras modalidades de tratamiento para combatir el cancer en dicho paciente particular. Otras modalidades de tratamiento para un cancer particular incluyen, por ejemplo, otras quimioterapias tales como tratamientos basados en antraciclina y/o taxano, inhibidores HER, inhibidores EGFR y/u otras opciones de tratamiento, tales como terapia de radiacion sola, antes o despues de la quimioterapia.
3. Inhibidores de la telomerasa y tratamiento del cancer con un inhibidor de la telomerasa
La telomerasa es una ribonucleoprotema que cataliza la adicion de secuencias de repeticion telomericas (que tienen la secuencia 5'-TTAGGG-3' en humanos) a los extremos de los cromosomas. Se ha demostrado que una diversidad de celulas de cancer son telomerasa-positivas, con inclusion de celulas tumorales de cancer de piel, tejido conectivo, adiposo, de mama, de pulmon, de estomago, de pancreas, de ovario, de cervix, de utero, de rinon, de vejiga, de colon, de prostata, del sistema nervioso central (CNS), de retina y hematologicos (tales como mieloma, leucemia y linfoma). El direccionamiento de la telomerasa puede ser eficaz para proporcionar tratamientos que discriminen entre celulas malignas y normales en alto grado, evitando muchos de los efectos secundarios deletereos que pueden acompanar a los regfmenes quimioterapeuticos direccionados indiscriminadamente a las celulas en division.
Los inhibidores de la telomerasa identificados hasta la fecha incluyen oligonucleotidos, preferiblemente oligonucleotidos que tienen enlaces resistentes a las nucleasas, asf como compuestos de molecula pequena.
A. Compuestos de Molecula Pequena
Inhibidores de molecula pequena de la telomerasa incluyen, por ejemplo, BRACO19 ((9-(4-(N,N- dimetilamino)fenilamino)-3,6-bis(3-pirrolidino-propionamido)acridina (vease Mol. Pharmacol. 61 (5): 1154-62, 2002); DODD (dietiloxadicarbocianina), y telomestatina. Estos compuestos pueden actuar como estabilizadores G-quad, que promueven la formacion de una configuracion G-quad inactiva en el componente RNA de la telomerasa. Otros inhibidores de la telomerasa de molecula pequena incluyen BIBR1532 (acido 2-[(E)-3-naften-2-il-but-2- enoilamino]benzoico) (vease Ward & Autexier, Mol. Pharmacol. 68:779-786, 2005; tambien J. Biol. Chem. 277 (18): 15566-72, 2002); AZT y otros analogos de nucleosidos, tales como ddG y ara-G (veanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nums. 5.695.932 y 6.638.789), y ciertos derivados de tiopiridina, benzo[b]tiofeno, y pirido[b]tiofeno, descritos por Gaeta et al. en las Patentes U.S. nums. 5.767.278, 5.770.613, 5.863.936, 5.656.638 y 5.760.062. Un ejemplo es 3- clorobenzo[b]tiofeno-2-carboxi-2'-[(2,5-diclorofenil-amino)tia]hidrazina, descrito en la Patente U.S. No. 5.760.062.
B. Inhibidores de la telomerasa Basados en Oligonucleotidos: Secuencia y Composicion
Los genes que codifican tanto la protema como los componentes de RNA de la telomerasa humana han sido clonados y secuenciados (veanse los documentos de Patente U.S. nums. 6.261.836 y 5.583.016, respectivamente, los dos cuales se incorporan en esta memoria por referencia). Pueden direccionarse oligonucleotidos contra el mRNA que codifica el componente protemico de la telomerasa (cuya forma humana se conoce como transcriptasa inversa de la telomerasa humana, o hTERT) o el componente RNA de la holoenzima de la telomerasa (cuya forma humana se conoce como RNA de la telomerasa humana, o hTR). Patentes U.S. nums. 5.583.016; 5.776.679; y 5.837.857, que se incorporan en esta memoria por referencia.
La secuencia plantilla del componente RNA de la telomerasa esta localizada en la region definida por los nucleotidos 46-56 (5'-CUAACCCUAAC-3') (SEQ ID NO: 1), que es complementaria a una secuencia telomerica compuesta de aproximadamente una y dos tercios de unidades de repeticiones telomericas. La region plantilla funciona para especificar la secuencia de las repeticiones telomericas que anade la telomerasa a los extremos de los cromosomas y es esencial para la actividad de la enzima telomerasa (vease v.g. Chen et al., Cell 100:503-514, 2000; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (14): 7982-7987, 2001). El diseno de agentes antisentido, ribozima o RNA de interferencia pequeno (siRNA) para inhibir o causar la destruccion de mRNAs es muy conocido (vease, por ejemplo, Lebedeva, I, et al. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, vol. 41: 403-419, abril 2001; Macejak, D, et al., Journal of Virology, vol. 73 (9): 7745-7751, septiembre 1999, y Zeng, Y. et al., PNAS vol. 100 (17) p. 9779-9784, 19 de agosto, 2003), y tales agentes pueden disenarse para direccionar el mRNA de hTERT e inhibir con ello la produccion de la protema hTERT en una celula diana, tal como una celula de cancer (veanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nums. 6.444.650 y 6.331.339). Los oligonucleotidos que direccionan hTR (es decir, el componente de
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RNA de la enzima) actuan como inhibidores de la actividad de la enzima telomerasa por bloqueo o interferencia de otro tipo con la interaccion de hTR con la protema hTERT, interaccion que es necesaria para la funcion de la telomerasa. Vease, por ejemplo, Villeponteau et al., Patente U.S. No. 6.548.298.
Una region diana preferida de hTR es la region molde, que abarca los nucleotidos 30-67 del componente RNA de la telomerasa humana. A los oligonucleotidos direccionados a esta region se hace referencia en esta memoria como "inhibidores de la plantilla de hTR" (vease, v.g., Herbert et al., Oncogene 21(4): 638-42 (2002).) Preferiblemente, un oligonucleotido de este tipo incluye una secuencia que es complementaria o cuasi-complementaria a cierta porcion de la region de 11 nucleotidos que tiene la secuencia 5'-CUAACCCUAAC-3' (SEQ ID NO: 1), abarcando los nucleotidos 46-56 del componente RNA de la telomerasa humana (hTR).
Otra region diana preferida es la region que abarca los nucleotidos 137-179 de la telomerasa humana (hTR) (vease Pruzar et al., Nucl. Acids Research, 30:559-568, 2002). Dentro de esta region, la secuencia que abarca 141-153 es una diana preferida. La publicacion PCT WO 98/28442 describe el uso de oligonucleotidos de al menos 7 nucleotidos de longitud para inhibir la telomerasa, donde los oligonucleotidos estan disenados de modo que sean complementarios a porciones accesibles de la secuencia de hTR fuera de la region molde, que incluye los nucleotidos 137-196, 290-319, y 350-380 de hTR.
La region del oligonucleotido terapeutico que esta direccionada a la secuencia hTR es con preferencia exactamente complementaria a la secuencia hTR correspondiente. Si bien pueden tolerarse desapareamientos en ciertos casos, cabe esperar que los mismos disminuyan la especificidad y actividad del conjugado oligonucleotfdico resultante. En realizaciones particulares, la secuencia de bases del oligonucleotido se selecciona por tanto de modo que incluya una secuencia de al menos 5 nucleotidos exactamente complementarios al hTR diana, pudiendo obtenerse una inhibicion mejorada de la telomerasa si se emplean longitudes crecientes de secuencia complementaria, tales como al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 13 o al menos 15 nucleotidos exactamente complementarios del hTR diana. En otras realizaciones, la secuencia del oligonucleotido incluye una secuencia de al menos 5 a 20, de al menos 8 a 20, de al menos 10 a 20 o de al menos 10 a 15 nucleotidos exactamente complementarios a la secuencia hTR diana.
Puede obtenerse una actividad optima de inhibicion de la telomerasa cuando la longitud total del oligonucleotido se selecciona de modo que sea complementaria a la secuencia de hTR diana. Sin embargo, no es necesario que la longitud total del oligonucleotido sea exactamente complementaria a la secuencia diana, y la secuencia de oligonucleotidos puede incluir regiones que no son complementarias a la secuencia diana. Tales regiones pueden anadirse, por ejemplo, para conferir otras propiedades al compuesto, tales como secuencias que facilitan la purificacion. Alternativamente, un oligonucleotido puede incluir repeticiones multiples de una secuencia complementaria a una secuencia de hTR diana.
El metodo incluye la monitorizacion de un paciente al que le esta siendo administrado un inhibidor oligonucleotidico de la telomerasa del tipo compuesto por un oligonucleotido que tiene enlaces intersubunidad resistentes a las nucleasas y una secuencia de oligonucleotido eficaz para fijar la hibridacion espedfica de secuencia a una region plantilla de hTR. Preferiblemente, la cantidad del inhibidor de la telomerasa es eficaz para inhibir la proliferacion de celulas de cancer en el individuo cuando el inhibidor de la telomerasa se administra solo.
El oligonucleotido puede tener una longitud de 10-20 bases. Preferiblemente, el oligonucleotido tiene una longitud de 13-20 bases e incluye la secuencia (5'-TAGGGTTAGACAA-3') (SEQ ID NO: 2). Un inhibidor de la telomerasa ilustrativo es el compuesto identificado como GRN163L, o un analogo del mismo. Este compuesto tiene (i) enlaces internucleosfdicos N3'^P5'-tiofosforamidato; (ii) la secuencia 5'-TAGGGTTAGACAA-3' (SEQ ID NO: 2); y (iii) un resto palmitoflo (C16) enlazado al extremo 5' del oligonucleotido a traves de un enlazador glicerol o aminoglicerol.
Los enlaces internucleosfdicos en el oligonucleotido pueden incluir cualquiera de las qrnmicas de oligonucleotidos disponibles, v.g. fosfodiester, fosfotriester, metilfosfonato, P3'^N5'-fosforamidato, N3'^P5'-fosforamidato, N3'^P5'- tiofosforamidato, y fosforotioato. Tfpicamente, pero sin caracter necesario, la totalidad de los enlaces internucleosfdicos dentro del oligonucleotido seran del mismo tipo, aunque el componente oligonucleotfdico puede sintetizarse utilizando una mixtura de enlaces diferentes.
En realizaciones preferidas, el oligonucleotido tiene al menos un enlace N3'^P5'-fosforamidato (NP) o N3'^P5'- tiofosforamidato (NPS), enlace que puede representarse por la estructura: 3'-(-NH-P(=O)(-XR)-O-(-5'), en donde X es O o S y R se selecciona del grupo constituido por hidrogeno, alquilo, y arilo; y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, cuando XR es Oh o SH. Mas preferiblemente, la totalidad de los enlaces del oligonucleotido son enlaces NP o, muy preferiblemente, la totalidad de enlaces son NPS.
Una secuencia particularmente preferida para un oligonucleotido inhibidor de la plantilla hTR es la secuencia complementaria a los nucleotidos 42-54 del hTR. El oligonucleotido que tiene esta secuencia de enlaces (TAGGGTTAGACCA) (SEQ ID NO: 2) y N3'^P5'-tiofosforamidato (NPS) se designa en esta memoria como GRN163. Vease, por ejemplo, Asai et al., Cancer Research 63:3931-3939 (2003); Gryaznov et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22(5-8): 577-81 (2003).
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Estos compuestos pueden prepararse como se describe, por ejemplo, en McCurdy et al., Tetrahedron Letters 38:207-210 (1997) o Pongracz & Gryaznov, Tetrahedron Letters 49:7661-7664 (1999). Los monomeros 3'-amino- nucleosido de partida pueden prepararse como se describe en Nelson et al., J. Org. Chem. 62:7278-7287 (1997) o por los metodos descritos en Gryaznov et al., Publicacion de la Solicitud US No. 2006/0009636.
Una diversidad de enfoques de smtesis pueden utilizarse para conjugar un resto lipidico L al oligonucleotido, dependiendo de la naturaleza del enlace seleccionado; vease, por ejemplo, Mishra et al., Biochim. et Biophys. Acta 1264:229-237 (1995), Shea et al., Nucleic Acids Res. 18:3777-3783 (1995), o Rump et al., Bioconj. Chem. 9:341-349 (1995). Tipicamente, la conjugacion se realiza utilizando grupos funcionales adecuados en un termino oligonucleotidico. Por ejemplo, el grupo 3'-amino presente en el termino 3' de los oligonucleotidos NP y NPS puede hacerse reaccionar con acidos carboxflicos, cloruros de acido, anhidridos y esteres activos, utilizando catalizadores adecuados de acoplamiento, para formar un enlace amidico. Los grupos tiol son adecuados tambien como grupos funcionales (vease Kupihar et al., Bioorg. Med. Chem. 9:1241-1247 (2002)). Diversos modificadores funcionalizados con amino y tiol de longitudes de cadena diferentes estan disponibles comercialmente para smtesis de oligonucleotidos.
Enfoques espedficos para preparacion de grupos lipidicos a un termino de un oligonucleotido NP o NPS incluyen los descritos en la Publicacion de Solicitud U.S. No. 2005/0113325, que se incorpora en esta memoria por referencia. Ademas de los enlaces amida arriba indicados, por ejemplo, los lipidos pueden unirse tambien a la cadena del oligonucleotido utilizando un derivado fosforamidito del lipido, para producir un enlace fosforamidato o tiofosforamidato que conecta el lipido y el oligonucleotido. El grupo 3'-amino libre del oligonucleotido totalmente protegido fijado al soporte puede hacerse reaccionar tambien con un aldehido lipidico adecuado, seguido por reduccion con cianoborohidruro de sodio, que produce un enlace amina.
El oligonucleotido GRN163 administrado solo ha demostrado actividad inhibidora in vitro en cultivo de celulas, que incluye celulas de carcinoma epidermoide, epitelio de mama, carcinoma renal, adenocarcinoma renal, pancreatico, de cerebro, colon, prostata, leucemia, linfoma, mieloma, epidermico, cervical, de ovario y de cancer hepatico.
El oligonucleotido GRN163 ha sido ensayado tambien y ha demostrado ser terapeuticamente eficaz en una diversidad de modelos de tumores animales, con inclusion de celulas de ovario y de pulmon, tanto de celulas microdticas como de celulas no microdticas.
C. Conjugados Lipido-Oligonucleotido
Preferiblemente, el inhibidor enzimatico basado en oligonucleotidos incluye al menos un grupo lipidico enlazado covalentemente (vease la Publicacion U.S. No. 2005/0113325, que se incorpora en esta memoria por referencia). Esta modificacion proporciona propiedades excelentes de captura celular, tales que puede obtenerse un efecto biologico equivalente utilizando cantidades menores del oligonucleotido conjugado comparado con la forma no modificada. Cuando se aplica al escenario terapeutico humano, esto puede traducirse en riesgos de toxicidad reducidos, y ahorro de costes.
El grupo lipidico L es tipicamente un hidrocarburo o acido graso alifatico, con inclusion de derivados de hidrocarburos y acidos grasos, siendo ejemplos los compuestos de cadena lineal saturados que tienen 14-20 carbonos, tales como acido miristico (tetradecanoico), acido palmrtico (hexadecanoico), y acido estearico (octadecanoico), y sus formas de hidrocarburos alifaticos correspondientes, tetradecano, hexadecano y octadecano. Ejemplos de otros grupos lipidicos adecuados que pueden emplearse son esteroles, tales como colesterol, y acidos grasos e hidrocarburos sustituidos, particularmente formas polifluoradas de estos grupos. El alcance del grupo lipidico L incluye derivados tales como derivados amina, amida, ester y carbamato. El tipo de derivado viene determinado a menudo por el modo de enlace al oligonucleotido, como se ilustra mas adelante.
En una estructura ilustrativa, el resto lipidico es palmitoil-amida (derivado de acido palmrtico), conjugada a traves de un enlazador aminoglicerol al grupo 5'-tiofosfato de un oligonucleotido enlazado por NPS. El NPS-oligonucleotido que tiene la secuencia representada por GRN163 y conjugada de esta manera (como se muestra mas adelante) se designa GRN163L en esta memoria. En una segunda estructura ilustrativa, el lipido, como una palmitoil-amida, esta conjugado por el grupo terminal 3'-amino de un oligonucleotido NPS.
imagen1
(palmitoflo)
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Para fijacion de un Kpido al termino 5', como se describe tambien en la Publication de Solicitud U.S. No. 2005/0113325, el oligonucleotido puede sintetizarse utilizando un soporte solido modificado que contiene Kpido. La reaction de 3-amino-1,2-propanodiol con un cloruro de acilo graso (RC(O)Cl), seguida por dimetoxitritilacion del alcohol primario y succinilacion del alcohol secundario, proporciona un compuesto intermedio que se acopla luego, por la via del grupo succinil-carboxilo libre, al soporte solido. Un ejemplo de un soporte modificado se muestra a continuation, donde S-- representa un soporte CPG de alquilamina de cadena larga, y R representa un Kpido.
imagen2
Este procedimiento va seguido por la smtesis del oligonucleotido en la direction 5' a 3', como se describe, por ejemplo, en Pongracz & Gryaznov (1999), que comienza con la desproteccion y fosfitilacion del grupo -ODMT. Esto es eficaz para producir, por ejemplo, la estructura siguiente, despues de escision del soporte solido:
imagen3
La estructura anterior, cuando -R es -(CH2)14CH3 (palmitoflo), se designa en esta memoria como GRN163L. IV. Administration
El cancer seria tambien uno que es sensible a la inhibition de las celulas de cancer por inhibition de la telomerasa. Como se ha indicado arriba, los inhibidores de la oligonucleotido-telomerasa, como se ilustran por GRN163 y GRN163L, han demostrado actividad inhibidora in vitro contra las celulas del cancer humano de rinon, pulmon, pancreas, cerebro, colon, prostata, mama, leucemia, linfoma, mieloma, epidermico, cervical, de ovario y de higado, e in vivo, por suministro local y sistemico, contra las celulas del cancer humano de cerebro, prostata, linfoma, mieloma, cervical, de pulmon, y de higado. Otras dianas preferidas incluyen canceres de pulmon microtitico, de esofago, de cabeza y cuello, y de estomago.
La dosis administrada y la pauta de dosificacion seguiran, por ejemplo, dosis conocidas o recomendadas para el inhibidor empleado, como se indica, por ejemplo, en los prospectos de productos farmaceuticos o en datos clmicos o de modelos animales publicados. Para GRN163L, la dosis inicial de adultos es de aproximadamente 0,8 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg; desde aproximadamente 1,6 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. La dosis de adultos para GRN163L es de aproximadamente 1,6 mg/kg; o aproximadamente 3,2 mg/kg; o aproximadamente 4,8 mg/kg; o aproximadamente 6,2 mg/kg; o aproximadamente 7,2 mg/kg; o aproximadamente 9 mg/kg; o aproximadamente 12 mg/kg; hasta aproximadamente 20 mg/kg. La dosis puede administrarse dos veces por semana, una vez por semana o con otros regimenes de administracion. Pueden requerirse dosis mayores para producir la remision deseada en algunos pacientes.
GRN163L puede administrarse a un paciente a una dosis de al menos aproximadamente 4,8 mg/kg de GRN163L el dia 1 y aproximadamente el dia 8 de un ciclo de 21 dias. Alternativamente, aquel puede administrarse a una dosis de al menos aproximadamente 4,8 mg/kg de GRN 163L el dia 1 y aproximadamente el dia 15 en un ciclo de 28 dias. Alternativamente, GRN163L puede administrarse a un paciente a una dosis de al menos aproximadamente 1,6 mg/kg de GRN163L dos veces en la primera semana de un ciclo de 14 dias.
El protocolo terapeutico para administracion del inhibidor de la telomerasa en la terapia dependera de diversos factores que incluyen, pero sin caracter limitante, el tipo de cancer, la edad y el estado general de salud del paciente, la agresividad de progresion de la enfermedad, la longitud de los telomeros y actividad de la telomerasa de las celulas enfermas a tratar, y la capacidad del paciente para tolerar los agentes de comprenden la combination, lo cual puede depender de la actividad de la telomerasa y la longitud de los telomeros en diversas celulas normales, particularmente celulas normales en tejidos altamente proliferativos, en particular, pero sin caracter limitante, la medula osea.
En general, se contempla el tratamiento de todos los tipos malignos de cancer y hematologicos. En realizaciones seleccionadas, la enfermedad diana comprende un tumor solido; en otras realizaciones, la enfermedad diana comprende una enfermedad maligna hematologica. Un curso ilustrativo de tratamiento implica dosis multiples. La
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secuencia de tratamientos de combinacion estara determinada por criterios de acatamiento clmico y/o datos preclmicos o clmicos que soportan estrategias de optimizacion de la dosis para aumentar la eficacia o reducir la toxicidad del tratamiento de combinacion. El tiempo entre dosis puede ser durante un periodo de aproximadamente 1-6 horas, a aproximadamente 6-12 horas, a aproximadamente 12-24 horas, a aproximadamente 1-2 d^as, a aproximadamente 1-2 semanas o periodos mas largos despues de la iniciacion del tratamiento. Durante un curso de tratamiento, puede re-evaluarse la necesidad de completar las dosis planificadas.
Los compuestos se pueden administrar por inyeccion directa de un tumor o su vasculatura. Alternativamente, el tumor puede infundirse o perfundirse con los compuestos terapeuticos utilizando cualquier vehmulo de suministro adecuado. Los compuestos se pueden administrar localmente a un organo afectado. Pueden realizarse tambien administracion sistemica. En caso apropiado puede aplicarse administracion continua; por ejemplo, donde un tumor ha sido escindido y se trata el lecho del tumor para eliminar la enfermedad residual. Se prefiere el suministro mediante jeringuilla o cateterizacion. Dicha perfusion continua puede tener lugar durante un periodo de aproximadamente 1-6 horas, a aproximadamente 6-12 horas, a aproximadamente 12-24 horas, a aproximadamente 1-2 dfas, a aproximadamente 1-2 semanas o mas larga despues de la iniciacion del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composicion terapeutica por perfusion continua sera equivalente a la dada por una sola inyeccion o inyecciones multiples, ajustada(s) a lo largo de un periodo de tiempo durante el cual tiene lugar la perfusion.
Los agentes terapeuticos se administran a un individuo, tal como un paciente humano, en una formulacion y en una cantidad eficaces para alcanzar un resultado clmicamente deseable. Para el tratamiento del cancer, resultados deseables incluyen reduccion en la masa tumoral (como se determina por palpacion u obtencion de imagenes; v.g., por radiograffa, escaneo con radionucleidos, escaneo CAT, o MRI), reduccion en la velocidad de crecimiento del tumor, reduccion en la velocidad de formacion de metastasis (como se determina v.g., por analisis histoqmmico de espedmenes de biopsia), reduccion en los marcadores bioqmmicos (con inclusion de marcadores generales tales como ESR, y marcadores espedficos de tumor tales como PSA de suero), y mejora en la calidad de vida (como se determina por evaluacion clmica, v.g., registro de Karnofsky), tiempo aumentado para la progresion, supervivencia exenta de enfermedad y supervivencia global. La cantidad de cada agente por dosis y el numero de dosis requeridas para alcanzar dichos efectos variaran dependiendo de muchos factores que incluyen la indicacion de la enfermedad, caractensticas del paciente a tratar y el modo de administracion. Tfpicamente, la formulacion y la ruta de administracion proporcionaran una concentracion local en el sitio de enfermedad comprendida entre 1 nM y 100 |jM de cada agente. El medico podra variar la cantidad de los compuestos, el portador, la frecuencia de dosificacion, y analogos, teniendo en cuenta factores tales como el estado de enfermedad neoplastica particular y su gravedad; el estado general del paciente; la edad, el sexo, y el peso del paciente; el modo de administracion; la idoneidad de administrar simultaneamente agentes anti-toxicidad sistemicos; la monitorizacion de las funciones organicas vitales del paciente; y otros factores monitorizados tipicamente durante la quimioterapia del cancer. En general, los compuestos se administran a una concentracion que proporciona resultados eficaces sin causar efectos secundarios perjudiciales o deletereos excesivos.
Los modos de administracion y formulacion pueden ser dependientes del farmaco y su modo de administracion aprobado. Cuando el inhibidor de la telomerasa es GRN163L, la formulacion de cloruro de sodio al 0,9% (solucion salina normal) y administracion por i.v. es una ruta preferida, preferiblemente por infusion durante 1 a 24 horas, mas preferiblemente durante 2 a 8 horas, v.g., una infusion durante 6 horas. Si bien los oligonucleotidos conjugados a ifpidos descritos en esta memoria, tales como GRN163L tienen caractensticas excelentes de penetracion celular y tisular, estos y otros compuestos pueden formularse para proporcionar beneficio adicional en esta area. Otros adyuvantes utiles incluyen sustratos para migracion transendotelial, tales como sistemas de captura de glucosa para facilitar la salida del espacio vascular al microentorno del tumor.
Los ejemplos que siguen se ofrecen a modo de ilustracion y no con caracter de limitacion.
Ejemplos
Ejemplo 1: Estudio de diversos parametros en pacientes a los que se han prescrito inhibidores de la telomerasa
Se diseno y condujo un estudio para determinar la probabilidad de desarrollo de trombocitopenia en una poblacion de pacientes de cancer con tumores solidos que estaban siendo tratados con el inhibidor de la telomerasa GRN163L. GRN163L es un inhibidor de la actividad de la telomerasa oligonucleotfdico 13-mero. El estudio utilizaba celulas sangumeas archivadas como fuente de la longitud de los telomeros celulares antes del estudio y registros de pacientes archivados coincidentes.
Diseno del Estudio
Los pacientes aceptados eran adultos con tumores solidos refractarios avanzados y tratados con GRN163L en una prueba clmica de fase I. GRN163L se administraba por dosificacion intravenosa semanal continua. Adicionalmente, se presentan datos provisionales correspondientes a un grupo 6 tratado con un regimen de dosificacion alternativo disenado para reducir el potencial para trombocitopenia. Esta era una prueba clmica multicentro de Fase I con grupos secuenciales de escalacion de la dosis. Los pacientes se inscribieron en grupos sucesivos a 0,4 a 4,8 mg/kg. Los grupos 1-5 recibieron semanalmente infusiones intravenosas de 2 horas de GRN163L. El grupo 6 recibio un
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protocolo de dosificacion intermitente de infusiones iv semanales de GRN163L (4,8 mg/kg) x 2, seguido por un descanso de 13 dfas. La culminacion de 1 ciclo (4 infusiones semanales) era requerida para la evaluacion de la Toxicidad Limitante de la Dosis (DLT).
Los pacientes se excluyeron del estudio si alguno de ellos tema una enfermedad maligna primaria o metastasis activa en el Sistema Nervioso Central; enfermedades malignas hematologicas; hemoglobina < 9,0 g/dL; ANC < 1500/mm3; recuento de plaquetas < 100.000/mm3; o una anormalidad en la qmmica del suero (bilirrubina, AST, ALT, albumina, creatinina).
La poblacion de pacientes incluia 28 pacientes. Los pacientes habfan recibido hasta 9 terapias previas para este tumor; mas de la mitad recibieron 4 o mas. Vease la Tabla 1.
Tabla 1. Datos Demograficos Basales
# de Pacientes
28 Sitio del Tumor Primario Sitio del Tumor Primario
Varon
20 Pulmon Otro
Mujer
8 Pulmon 3 Hueso 1
Edad; Mediana (anos)
63 Pleura 2 Mama 1
Intervalo 31
76 Gastro Orofaringe 1
Karnofsky
Status Esofago 1 Paratiroides 1
70-80
16 Estomago 1 Prostata 1
90-100
12 Pancreas 4 Piel 1
Fase 3
1 Hfgado 2 Testicular 1
Fase 4
26 Colon 5
Desconocida
1 Rectal 3 1
Los 28 pacientes de los grupos 1-5 recibieron al menos 1 infusion de GRN163L. Se administraron un total de 177 dosis. Vease la Tabla 2. La totalidad de los 28 pacientes interrumpieron el estudio; las razones para la interrupcion inclrnan enfermedad progresiva (22/28; 68%), muerte (3/28; 22%) y trombocitopenia (3/28; 11%).
Tabla 2. Dosificacion
Grupos
1 2 3 4 5 Total
Dosis (mg/kg)
0,4 0,8 1,6 3,2 4,8 --
# de Pacientes
2 2 2 8 14 28
Mediana # de Ciclos/paciente
3,0 3,0 1,5 1,5 2,0 2,0
Mediana # de Dosis/paciente
11,5 12,0 5,5 5,5 5,5 7,0
Porcentaje de Dosis Recibidas
100% 100% 100% 81% 84% 88%
Se tomaron muestras de sangre de los pacientes en momentos diferentes durante el estudio. Las Figuras 1-4 muestran los niveles de plaquetas en los pacientes a lo largo del tiempo en los diversos grupos.
Materiales y Metodos:
Se tomaron muestras de sangre de cada paciente antes del comienzo del tratamiento. La longitud mediana de los telomeros fue determinada por Repeated Diagnostics, Vancouver, Canada utilizando el metodo Flow-FISH, con discriminacion de las poblaciones de granulocitos y linfocitos por el metodo descrito en Baerlocher et al., "Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (Flow FISH) Nature Protocols vol. 1, No. 5: 23652376 (2006), que se incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad.
Resumidamente, se tomo sangre entera de los 28 pacientes. El sobrenadante se aspiro sin alterar el sedimento de celulas rojos o celulas blancas de la sangre. Las celulas se mezclaron con NH4Cl frio para lisar las celulas rojos. Las celulas se centrifugaron. El sobrenadante se aspiro y se retiro el lisado de celulas rojos. Los celulas blancas resultantes se suspendieron en Tampon de Hibridacion (5% dextrosa/Hepes 10 mM/0/1% BSA). Las celulas se contaron y se diluyeron a aproximadamente 5 x 106 celulas/200 pL de Tampon de Hibridacion.
Se aislaron timocitos de bovino de timo de bovino reciente y se fijaron en formaldel'ndo. Los timocitos de bovino fijados se mezclaron con Tampon de Hibridacion (Tris, NaCl, BSA, formamida ^desionizada?). Para el control de hibridacion sin marcar, se anadio a las celulas un stock de mezcla de hibridacion sin marcar. Para la Mixtura de
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Hibridacion Marcada, se anadio a las celulas sonda de hibridacion de acido nucleico peptidico (PNA) (CCC TAA CCC TAA CCC TAA marcado con Cy5 o fluorescema) (SEQ ID NO: 3). Las celulas se hibridaron con la sonda de PNA. Despues de ello se centrifugaron las celulas y el sedimento de celulas se lavo para eliminar la sonda no fijada.
Se calibro el citometro de flujo y las celulas se pasaron a traves del citometro de flujo. A partir del programa de software de analisis de los datos de citometna de flujo, se utilizo la plantilla de analisis Flow-FISH para calcular la fluorescencia de las diversas poblaciones de celulas. La fluorescencia se utilizo para calcular la longitud media de los telomeros.
Resultados
Se realizaron analisis univariante y multivariante para explorar los factores predictivos para disminuciones post- tratamiento en los niveles de plaquetas y la longitud basal de los telomeros. Los factores inclrnan edad, sexo, recuentos basales de plaquetas, tiempo desde la diagnosis del cancer, numero de regfmenes de quimioterapia citotoxicos o mielosupresores previos, terapia de radiacion previa, y longitud basal de los telomeros de granulocitos y linfocitos.
Las infusiones de GRN163L eran generalmente bien toleradas. Los eventos adversos (AE) que se consideraron como relacionados o posible/probablemente relacionados con el tratamiento se consignaron en 16/28 (57,1%) de los pacientes. Vease la Tabla 3. Los eventos adversos muy posible/probablemente relacionados eran reversibles y de Grado 1-2.
No se observo toxicidad limitante alguna (DLT) de la dosis en los grupos 1-3. En el Grupo 4 (3,2 mg/kg), un paciente que estaba tolerando satisfactoriamente la terapia murio por causa desconocida despues de la dosis 4a, y esto se considero como una DLT. En el Grupo 5 (4,8 mg/kg), se observaron dos DLTs, ambas por trombocitopenia (una de grado 4 y una de grado 2 que causaron un retardo > 2 semanas en el tratamiento).
Tabla 3: Eventos adversos comunicados relacionados (posible/probablemente) con el tratamiento en > 1 paciente f
Dosis (mg/kg)
0,4- 1,6 3,2 4,8 Total
# de Pacientes
6 8 14 28
Comunicado al menos 1 AE
2 (33,3%) 8 (100%) 13 (92,9%) 23 (82,1%)
Tiempo parcial de tromboplastina activada prolongado
Grado 1-2
0 6 (75%) 6 (42,9%) 12 (42,9%)
Grado 3
0 0 6 (42,9%) 6 (21,4%)
Trombocitopenia^
Grado 1-2
0 1 (12,5%) 3 (21,4%) 4 (14,3%)
Grado 3-4
0 1 (12,5%) 2 (14,3%) 3 (10,7%)
Anemia - Grado 2-3
0 1 (12,5%) 2 (14,3%) 3 (10,7%)
Leucopenia- Grado 1-3
0 0 2 (14,3%) 2 (7,1%)
Neutropenia - Grado 2-3
0 0 2 (14,3%) 2 (7,1%)
f Los eventos adversos en solo 1 paciente inclrnan fotofobia, neuropatfa periferica, velocidad de sedimentacion elevada, fosfatasa alcalina aumentada, linfopenia, dolor en el cuello por encima del sitio de abertura, quemazon al orinar, candidiasis, rigidez toracica, confusion, deshidratacion, AST elevada y muerte. $ No todas las lecturas de laboratorio coherentes con trombocitopenia se consignaron como eventos adversos.
Los niveles de plaquetas a lo largo del tiempo para pacientes individuales que recibieron infusiones semanales de GRN163L se muestran por grupo de dosis en las Figuras 1-3. Los puntos de datos encirculados indican que el paciente recibio tratamiento en dicha visita. Los niveles de plaquetas a lo largo del tiempo para 5 de 6 pacientes en el protocolo intermitente de 4,8 mg/kg de dosificacion (Grupo 6) se muestran en la Figura 4.
Para comprender mejor los factores de paciente y tratamiento que inflrnan potencialmente en las disminuciones (o aumentos) de plaquetas, se desarrollo un modelo a fin de identificar indicadores del cambio porcentual en los niveles de plaquetas a las 4 semanas.
El cambio en los niveles de plaquetas despues de 4 semanas de tratamiento con GRN163L se represento graficamente con relacion a la longitud basal mediana de los telomeros en cada paciente en la Figura 5.
El primer modelo inclma 20-28 pacientes. La dosis y longitud basal de los telomeros de granulocitos eran indicaciones significativas. No se encontro interaccion alguna de la dosis con la longitud de los telomeros.
Tabla 4: Analisis Multivariante
Indicador
Coeficiente de Regresion Valor P
Dosis
-7 0,034
Longitud Basal de Telomeros de Granulocitos
8 0,023
5
El modelo se extendio para incluir 8 pacientes adicionales (la totalidad de los 28 pacientes en los Grupos 1-5). Las relaciones detectadas en el modelo anterior segrnan siendo significativas. El nivel basal de dosis de GRN163L y la longitud basal mediana de los telomeros de granulocitos eran ambos indicadores del % de disminucion de los niveles de plaquetas durante las 4 primeras semanas de tratamiento.
10
Tabla 5: Analisis Multivariante
Indicador
Coeficiente de Regresion Valor P
Interceptacion
-73,8 0,004
Dosis
-6,6 0,033
Longitud Basal de Telomeros de Granulocitos
11,2 0,005
Modelo: R-cuadrado=0,319853
La Figura 5 muestra el cambio porcentual desde la lmea base al nadir de 4 semanas en los niveles de plaquetas en funcion de la longitud basal de los telomeros de granulocitos. Las lmeas indican el cambio porcentual en funcion del 15 nivel de dosis de GRN163L.
La ecuacion para describir el numero predicho de plaquetas en un paciente durante las 4 primeras semanas de tratamiento es como sigue:
20 # Predicho de plaquetas = numero basal de plaquetas - (numero basal de plaquetas x % cambio en plaquetas/100)
% de cambio en # de plaquetas = (-73,8) - 6,6 x dosis de inhibidor (mg/kg) + 11,2 x longitud media de los telomeros (kpb)
En los analisis univariantes de los indicadores del cambio porcentual en los niveles de plaquetas, unicamente la 25 longitud de los telomeros de granulocitos era significativa (p = 0,024).
Tabla 6: Analisis Univariante
Indicador
Coeficiente de Regresion Valor p
Interceptacion
-84,54302 0,0018
Longitud basal de telomeros de granulocitos
9,17580 0,0241
Se desarrollo luego otro modelo para identificar indicadores de los niveles de plaquetas en log nadir durante las 4 30 primeras semanas. Este modelo dio como resultado un valor R2 mayor que indicaba un mejor ajuste a los datos.
Tabla 7: Analisis Multivariante
Indicador
Coeficiente de Regresion (b) Valor p
Interceptacion
-0,38 0,725
Dosis (mg/kg)
-0,13 0,017
Longitud basal de telomeros de granulocitos
0,25 0,001
Log de Plaquetas Basales
0,80 <0,001
Modelo: R-cuadrado= 0,645071
La ecuacion para describir el numero predicho de plaquetas en un paciente en el nadir durante las 4 primeras semanas de tratamiento es como sigue:
# Predicho de plaquetas = e
[(-0,38) - 0,13 x dosis de inhibidor (mg/kg) + 0,25 x longitud media de los telomeros (kpb) + 0,80 x log de numero basal de plaquetas]
En los analisis multivariantes de indicadores de los niveles de plaquetas en log nadir, unicamente era significativa la longitud de los telomeros de granulocitos (p = 0,004).
5
10
15
20
25
30
Tabla 8: Analisis Univariante
Indicador
Coeficiente de Regresion Valor p |
Interceptacion
3,42818 <,0001
Longitud basal de telomeros de granulocitos
0,27189 0,0040
Los intervalos de prediccion pueden calcularse, por ejemplo, para predecir el cambio porcentual probable en los niveles de plaquetas o el nadir de las plaquetas para pacientes o individuos con un conjunto particular de valores basales y de tratamiento, por ejemplo, longitud de los telomeros, plaquetas basales y nivel de dosis. La ecuacion de regresion proporciona el valor esperado para un individuo futuro con covariantes especificadas (J. Neter et al. Applied linear statistical models: regression, analysis of variance, and experimental designs, 3a edicion, pp.81-83 (1990)). Sin embargo, debido a error de distribucion del muestreo asf como a variabilidad interindividual, un paciente puede tener niveles de plaquetas que caigan por encima o por debajo de tal valor predicho. Puede generarse una serie de intervalos de prediccion con cobertura decreciente. Por ejemplo, puede generarse un intervalo de prediccion de 99% con lfmites superior e inferior Pu99 y Pl99 que podna contener, por termino medio, 99% de los niveles de plaquetas observados en los pacientes; podna generarse tambien un intervalo de prediccion de 90% con lfmites superior e inferior Pu90 (< Pu99) y Pl90 (> Pl99) que podna contener, por termino medio, 90% de los niveles de plaquetas observados futuros. Esto hace posible determinar la probabilidad de que el paciente pudiera desarrollar una trombocitopenia de grado 3 o 4.
La longitud media de los telomeros de las celulas normales difiere entre los individuos y disminuye con la edad como se muestra por los percentiles en la Figura 7. Las longitudes de los telomeros de granulocitos en los 28 pacientes en este estudio son generalmente mas cortas que lo normal, lo cual es coherente con los efectos de estres fisiologico y la quimioterapia. Aunque la historia de quimioterapia previa como se tabula en esta memoria no era predictiva de disminuciones de plaquetas, la misma estaba fuertemente correlacionada con las longitudes basales de los telomeros en un analisis univariante. La medida de la longitud de los telomeros refleja con alta precision los efectos de tratamientos previos junto con otras influencias hereditarias o adquiridas. La edad era tambien un indicador importante de la longitud de los telomeros.
Los resultados de este estudio demuestran una correspondencia estrecha entre los valores de longitud basal de los telomeros como se determinan por el test descrito y el riesgo de que el paciente desarrollara trombocitopenia limitante de la dosis.
Aunque la invencion se ha descrito con respecto a realizaciones y aplicaciones particulares, los expertos en la tecnica apreciaran la gama de aplicaciones y metodos de la invencion descritos en esta memoria, y la invencion no debe considerarse limitada a dichas realizaciones.
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■=400* 1
cuaacccuaa c 11
<210* 2 <211* 13 <212* DNA 1 ■; Secuencia artificial
<220*
<223* GRN-163 <400* 2
tagggttaga caa 13
<210* 3 <211* 18
<212* DNA
<213* Secuencia artificial <220*
■ ■ : Sonda de DNA
<400* 3
ccctaaocct aaccctaa 18

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de monitorizacion de un paciente respecto a un evento adverso relacionado con la terapia de inhibicion de la telomerasa en el que el metodo comprende testar una muestra biologica del paciente respecto a la longitud o distribucion de la longitud de los telomeros, y en el que el paciente esta siendo tratado con el inhibidor de la telomerasa para tratar un cancer.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el paciente es un humano.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el evento adverso se selecciona de trombocitopenia, anemia, leucopenia, o neutropenia.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la reaccion adversa es trombocitopenia de grados 3 o 4.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra biologica son celulas sangumeas obtenidas del paciente.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que las celulas sangumeas son celulas blancas.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que las celulas blancas son granulocitos.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que los granulocitos son neutrofilos, basofilos o eosinofilos.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 5, en el que las celulas blancas son linfocitos, monocitos o macrofagos.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el inhibidor de la telomerasa es un oligonucleotido.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el inhibidor de la telomerasa es GRN163L.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el cancer se selecciona del grupo constituido por cancer de mama, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer testicular, cancer hepatocelular, cancer gastrico, cancer gastrointestinal, cancer de faringe, cancer rectal, cancer de pancreas, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de hngado, cancer de vejiga, cancer del tracto urinario, cancer de tiroides, cancer renal, cancer de piel, cancer cerebral, carcinoma, melanoma, leucemia y linfoma.
  13. 13. GRN163L para uso en el tratamiento del cancer, en el que dicho tratamiento consiste en la administracion de al menos aproximadamente 1,6 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de GRN163L el dfa 1 y aproximadamente el dfa 8 de un ciclo de 21 dfas.
  14. 14. GRN163L para uso en el tratamiento del cancer, en el que dicho tratamiento consiste en la administracion de al menos aproximadamente 1,6 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de GRN163L el dfa 1 y aproximadamente el dfa 15 de un ciclo de 28 dfas.
  15. 15. GRN163L para uso en el tratamiento del cancer conforme a la reivindicacion 13 o la reivindicacion 14, en el que dicho tratamiento consiste en la administracion de GRN163L de al menos aproximadamente 7,2 mg/kg.
  16. 16. GRN163L para uso en el tratamiento de un cancer conforme a la reivindicacion 13 o la reivindicacion 14, en el que dicho tratamiento consiste en la administracion de GRN163L de al menos aproximadamente 9 mg/kg.
  17. 17. Un metodo conforme a la reivindicacion 1, en el que dicho paciente se monitoriza por
    (a) determinacion del promedio de longitud mediana de los telomeros en una muestra biologica que comprende celulas obtenidas del individuo marnffero antes de o durante el pretratamiento con una terapia de inhibicion de la telomerasa y multiplicacion de la longitud media o mediana de los telomeros por un coeficiente para llegar a un componente de la longitud de los telomeros;
    (b) multiplicacion de la dosificacion de tratamiento propuesta por un coeficiente para llegar a un componente de dosificacion; y
    (c) calculo de la suma del componente telomerico, el componente de dosificacion y una constante; y
    (d) determinacion de la probabilidad esperada de una reaccion adversa en el individuo mamffero como consecuencia del tratamiento con la terapia de inhibicion de la telomerasa.
  18. 18. Un metodo conforme a la reivindicacion 3, en el que dicho paciente se monitoriza por
    (a) determinacion de la longitud media o mediana de los telomeros en una muestra biologica que comprende celulas obtenidas del individuo mairnfero antes de o durante el tratamiento con una terapia de inhibicion de la telomerasa y multiplicacion de la longitud media o mediana de los telomeros por un coeficiente para llegar a un componente de la longitud de los telomeros;
    (b) multiplicacion de la dosis de tratamiento propuesta por un coeficiente para llegar a un componente de dosificacion; y
    (c) calculo de la suma del componente telomero, el componente de dosificacion y el log del numero basal de plaquetas del individuo para determinar el nadir de plaquetas predicho durante las primeras semanas de tratamiento;
    5 y
    (d) determinacion de la probabilidad esperada de trombocitopenia en el paciente como consecuencia del tratamiento con la terapia de inhibicion de la telomerasa.
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