ES2567190T3

ES2567190T3 - Composición antigénica de micobacterias

Info

Publication number: ES2567190T3
Application number: ES11799673.6T
Authority: ES
Inventors: Stephane Andre Georges Godart; Amina Laanan; Dominique Ingrid Lemoine
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: HRP20160606T1; CO6751288A2; PH12013501204A1; CN106822883A; EA027920B1; JP2014505036A; AU2011343367B2; HUE028452T2; EP3023106B1; US20180071378A1; PL2651436T3; IL226448A; HRP20191843T1; ES2574403T3; MX2013006818A; AU2011343368C1; US20190183998A1; JP5951634B2; MY161412A; BR112013014599A2

Abstract

Una composición inmunógena que comprende un antígeno relacionado con M72, en la que el antígeno relacionado con M72 comprende una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID No: 1, el pH de dicha composición está en el intervalo de 7,0 a 9,0 y la conductividad de la composición es de 5 mS/cm o menor.

Description

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En una realización particular, la composición inmunógena comprende tanto una saponina como un agonista de TLR4. En un ejemplo específico, la composición inmunógena comprende QS21 y 3D-MPL.

Un agonista de TLR-4, tal como un lipopolisacárido, tal como 3D-MPL, se puede usar en cantidades de entre 1 y 100 ug por dosis humana de la composición inmunógena. Se puede usar 3D-MPL en un nivel de aproximadamente 50 ug, por ejemplo de entre 40 a 60 ug, de forma adecuada de entre 45 a 55 ug o de entre 49 y 51 ug o de 50 ug. En otra realización, la dosis humana de la composición inmunógena comprende 3D-MPL en un nivel de aproximadamente 25 ug, por ejemplo, de entre 20 a 30 ug, de forma adecuada de entre 21 a 29 ug o de entre 22 a 28 ug o de entre 23 y 27 ug o de entre 24 y 26 ug, o de 25 ug.

Una saponina, tal como QS21, se puede usar en cantidades de entre 1 y 100 ug por dosis humana de la composición inmunógena. Se puede usar QS21 en un nivel de aproximadamente 50 ug, por ejemplo de entre 40 a 60 ug, de forma adecuada de entre 45 a 55 ug o de entre 49 y 51 ug o de 50 ug. En otra realización, la dosis humana de la composición inmunógena comprende QS21 en un nivel de aproximadamente 25 ug, por ejemplo, de entre 20 a 30 ug, de forma adecuada de entre 21 a 29 ug o de entre 22 a 28 ug o de entre 23 y 27 ug o de entre 24 y 26 ug, o de 25 ug.

Cuando tanto un agonista de TLR4 como saponina están presentes en la composición inmunógena, entonces la proporción en peso de agonista de TLR4 con respecto a saponina es de forma adecuada de entre 1:5 a 5:1, de forma adecuada de entre 1:2 a 2:1, tal como aproximadamente 1:1. Por ejemplo, cuando 3D-MPL está presente en una cantidad de 50 ug o 25 ug, entonces QS21 también puede estar presente de forma adecuada en una cantidad de 50 ug o 25 ug, respectivamente, por dosis humana de la composición inmunógena. Determinadas composiciones inmunógenas de la presente invención comprenden QS21 y 3D-MPL, en una cantidad de entre 1 y 100 ug de cada por dosis humana, tales como en una cantidad de entre 10 y 75 ug de cada por dosis humana. Las composiciones inmunógenas de la presente invención pueden comprender de forma adecuada QS21 y 3D-MPL, en una cantidad de entre 15 y 35 ug de cada por dosis humana, tales como en una cantidad de entre 20 y 30 ug de cada por dosis humana.

En una realización, el inmunoestimulante es un agonista de TLR9, por ejemplo como se establece en el documento WO2008/142133. En un ejemplo específico, este agonista de TLR9 es un oligonucleótido inmunoestimulador, en particular un oligonucleótido que contiene un motivo CpG no metilado. Estos oligonucleótidos son muy conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO96/02555, WO99/33488 y US5.865.462. Los agonistas de TLR9 adecuados para su uso en las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento son CpG que contienen oligonucleótidos, que contienen opcionalmente dos o más motivos CpG dinucleótidos separados por al menos tres, de forma adecuada al menos seis o más nucleótidos. Un motivo CpG es un nucleótido de citosina seguido de un nucleótido de guanina.

En una realización, el enlace internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o posiblemente un enlace fosforotioato, aunque también se pueden usar enlaces de fosfodiéster y otros internucleótidos, incluyendo oligonucleótidos con uniones de internucleótidos mezclados. Los procedimientos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en el documento US5.666.153, US5.278.302 y WO95/26204. Se contemplan oligonucleótidos que comprenden diferentes uniones internucleótidos, por ejemplo, fosfodiésteres de fosforotioato mezclados. Se pueden usar otros enlaces internucleótidos que estabilicen el oligonucleótido.

Los ejemplos de oligonucleótidos CpG adecuados para su inclusión en las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento tienen las siguientes secuencias. En una realización, estas secuencias contienen uniones internucleótidas modificadas de fosforotioato.

OLIGO 1 (SEQ ID No: 9): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

OLIGO 2 (SEQ ID No: 10): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEQ ID No: 11): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OLIGO 4 (SEQ ID No: 12): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID No: 13): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender las secuencias anteriores ya que tienen deleciones o adiciones inconsecuentes de las mismas.

En una realización, el inmunoestimulante es un tocol. En la técnica se conocen bien los tocoles y se describen en el documento EP0382271. En una realización particular, el tocol es alfa-tocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa-tocoferol (también conocido como succinato de vitamina E).

Las composiciones inmunógenas de acuerdo con la invención se pueden usar en medicina, en particular para la profilaxis, el tratamiento o la mejora de infección por micobacterias, tal como infección por Mycobacterium tuberculosis. En general, las composiciones inmunógenas se proporcionarán por administración a seres humanos, aunque también pueden ser de valor en medicina veterinaria, tal como para su administración a bovinos.

Se proporciona el uso de una composición inmunógena de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento, en particular un medicamento para la profilaxis, el tratamiento o la mejora de infección por

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mM pH 6,1]) y se agitó el recipiente hasta que todo el lípido estaba en suspensión. Después, se prehomogeneizó esta suspensión con un mezclador de alto cizallamiento y se homogeneizó con alta presión hasta que el tamaño de los liposomas se redujo hasta alrededor de 90 nm ± 10 nm medido por DLS. Después, se filtraron de forma estéril los liposomas.

B. Formulación ASA:

Etapa 1: Dilución de liposomas concentrados

Se añadió tampón de fosfato Na2/K 100 mM pH 6,1, diluido 10 veces, a agua para inyección hasta alcanzar una concentración de tampón de fosfato de 10 mM en la formulación final. Después se añadió un 30 % (p/v) de solución de sorbitol en agua para inyección (WFI) hasta alcanzar una concentración de un 4,7 % en la formulación final, esto se agitó durante de 15 a 45 minutos a temperatura ambiente.

Después, se añadieron los liposomas concentrados (preparados de DOPC, colesterol y 3D-MPL a 40 mg/ml, 10 mg/ml y 2 mg/ml respectivamente) a la mezcla hasta alcanzar una concentración de 100 ug/ml de 3D-MPL en la formulación final.

Posteriormente, se agitó la mezcla durante de 15 a 45 minutos a temperatura ambiente.

Etapa 2: Adición de QS21

Usando una bomba peristáltica, se añadieron existencias a granel de QS21 a los liposomas diluidos bajo agitación magnética hasta alcanzar una concentración de 100 ug/ml en la formulación final. Se agitó la mezcla durante de 15 a 45 minutos.

La formulación final ASA (sorbitol) contenía 2 mg de DOPC, 500 ug de colesterol, 100 ug de 3D-MPL/ml y 100 ug de QS21/ml, un 4,7 % de sorbitol y cloruro de sodio 5 mM y fosfato 10 mM.

Etapa 3: Se comprobó que el PH era 6,1 ± 0,1

Etapa 4: Filtración estéril

Se realizó la filtración estéril usando un filtro de poliétersulfona (PES) de PALL Corporation.

Etapa 5: Almacenamiento a de +2 ºC a +8 ºC.

La composición coadyuvante obtenida, que comprendía MPL 3-des-O-acilado y QS21 en una formulación liposomal y que contenía sorbitol como agente de tonicidad (designado ASA (sorbitol)), se almacenó después a 4 ºC.

Ejemplo 2: Preparación de composición coadyuvante ASA (NaCl 150 mM)

Se preparó una composición coadyuvante que comprendía monofosforil lípido A 3-des-O-acilado y QS21 en una formulación liposomal usando cloruro de sodio como agente de tonicidad.

A. Procedimiento de preparación de liposomas:

Se secó una mezcla de lípido (DOPC), colesterol y monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) en un disolvente orgánico a vacío. Después, se añadió solución salina tamponada con fosfato (NaCl 100 mM, fosfato 50 mM pH 6,1) y se agitó el recipiente hasta que todo el lípido estaba en suspensión. Después, se prehomogeneizó esta suspensión con un mezclador de alto cizallamiento y se homogeneizó con alta presión hasta que el tamaño de los liposomas se redujo hasta alrededor de 90 nm ± 10 nm medido por DLS. Después se filtraron de forma estéril los liposomas sobre una membrana de PES de 0,22 um.

B. Formulación ASA:

Etapa 1: Dilución de liposomas concentrados

Se añadió tampón de fosfato Na2/K 100 mM pH 6,45, diluido 10 veces y NaCl 1,5 M, a agua para inyección hasta alcanzar respectivamente concentraciones de fosfato 10 mM y NaCl 150 mM en la formulación final. Se agitó la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron los liposomas concentrados (preparados de DOPC, colesterol y 3D-MPL a 40 mg/ml, 10 mg/ml y 2 mg/ml respectivamente) a la mezcla hasta alcanzar una concentración de 100 ug/ml de 3D-MPL en la formulación final. Posteriormente, se agitó la mezcla durante de 5 a 15 minutos a temperatura ambiente.

Etapa 2: Adición de QS21

Se añadieron existencias a granel de QS21 a los liposomas diluidos bajo agitación magnética hasta alcanzar una concentración de 100 ug/ml en la formulación final. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente.

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(continuación)

ug QS21: DO QS21 desactivado

1,4 1,5 2 2,5 3 5 Adyuvante*: 0,612 0,669 1,139 1,294 1,391 1,416 0,03 > 97,2% > 97% > 96% > 95% > 94% > 90% > 98,2 %

*50 ug de equivalente de QS21 sometido a prueba. Tampón de cloruro de sodio 150 mM.

Los datos anteriores se muestran gráficamente en la figura 1.

El Límite de detección en este ensayo está en 0,9 ug de QS21, y DO de 0,12

5 Se estimó que la desactivación de QS21 en una composición coadyuvante que comprendía cloruro de sodio 150 mM era de más de un 98,2 % para el equivalente de 50 ug de QS21 sometido a prueba. En el caso de un equivalente de 90 ug sometido a prueba, la conclusión es más de un 99 %.

Después, se comparó la desactivación de QS21 con una composición coadyuvante equivalente que comprendía sorbitol y cloruro de sodio de sólo 5 mM. Se generaron los datos después del almacenamiento de ASA a 4 ºC o

10 después de estabilidad acelerada (7 días a 37 ºC). Para ASA en sorbitol, se realizó la curva estándar de QS21 en un tampón que contenía sorbitol.

Muestra: Punto temporal LDD QS21 desactivado

Composición coadyuvante (ASA) NaCl 150 mM: T0 < 1,4 > 97,2 %

7 días a 37 °C: < 0,9 > 98,2 %

Composición coadyuvante (ASA) sorbitol, NaCl 5 mM: T0 < 2 > 97,8 %

7 días a 37 °C: <1 > 96 %

11 meses a 4 ºC: <2 > 97,8 %*

Equivalente de 50 ug de QS21 sometido a prueba excepto * equivalente de 90 ug de QS21 sometido a prueba.

Se concluyó que QS21 se desactivaba adecuadamente en un tampón de cloruro de sodio bajo.

Ejemplo 4: Congéneres de MPL.

15 Químicamente, 3D-MPL es una mezcla de un monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Cada molécula de 3D-MPL separada se denomina un congénere. Es importante que la composición de congénere permanezca constante, sin cambios entre la proporción de congéneres. También es importante que cualquier tampón usado permita que la composición de congénere sea la misma que en los liposomas concentrados usados para preparar la composición coadyuvante.

20 Como se muestra en la figura 2, se examinó la composición de congénere en liposomas concentrados de 3D-MPL (liposomas concentrados LIP07-217, primera columna de la figura 2), una composición coadyuvante que comprendía liposomas de 3D-MPL y QS21 en un tampón de NaCl 150 mM (coadyuvante NaCl 150 mM, o ASA (NaCl 150 mM), segunda columna), y una composición coadyuvante que comprendía liposomas de 3D-MPL y QS21 en un tampón de sorbitol y NaCl 5 mM (coadyuvante sorbitol, o ASA (sorbitol), columnas 3-7).

25 También se examinó la composición de congénere en dos lotes de coadyuvante ASA (sorbitol) en el día 0 y 7 días después de la preparación y se mantuvo a 37 ºC para asegurar que no se producía evolución con el tiempo (véanse las últimas cuatro columnas de la figura 2).

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Etapa 5: Almacenamiento a de +2 ºC a +8 ºC.

La composición coadyuvante obtenida, que comprendía MPL 3-des-O-acilado y QS21 en una formulación liposomal y que contenía sorbitol como agente de tonicidad (designado ASA (sorbitol-3)), se almacenó después a 4 ºC.

Ejemplo 7: Preparación de composición coadyuvante ASA (NaCl 150 mM -2)

Se preparó una composición coadyuvante que comprendía monofosforil lípido A 3-des-O-acilado y QS21, en un nivel reducido con relación al ejemplo 2, en una formulación liposomal usando cloruro de sodio como agente de tonicidad.Ésta se preparó como sigue:

A. Procedimiento de preparación de liposomas:

B. Formulación ASA:

Etapa 1: Dilución de liposomas concentrados

Se añadió tampón de fosfato Na2/K 100 mM pH 6,45, diluido 10 veces y NaCl 1,5 M, a agua para inyección hasta alcanzar respectivamente concentraciones de fosfato 10 mM y NaCl 150 mM en la formulación final. Se agitó la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron los liposomas concentrados (preparados de DOPC, colesterol y 3D-MPL a 40 mg/ml, 10 mg/ml y 2 mg/ml respectivamente) a la mezcla hasta alcanzar una concentración de 50 ug/ml de 3D-MPL en la formulación final. Posteriormente, se agitó la mezcla durante de 5 a 15 minutos a temperatura ambiente.

Etapa 2: Adición de QS21

Se añadieron existencias a granel de QS21 a los liposomas diluidos bajo agitación magnética hasta alcanzar una concentración de 50 ug/ml en la formulación final. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente.

Etapa 3: Se comprobó el PH para que fuera de 6,1 ± 0,1

Etapa 4: Filtración estéril

Etapa 5: Almacenamiento a de +2 ºC a +8 ºC.

La composición final de ASA (NaCl 150 mM -2) era de 1 mg de DOPC, 250 ug de colesterol, 50 ug de MPL 3-des-Oacilado, 50 ug de QS21 por 1 ml, fosfato 10 mM y NaCl 150 mM.

Ejemplo 8: Preparación de antígenos de proteínas

M72 con dos restos de His N terminales (SEQ ID No: 3)

Construcción del vector de expresión de M72

Se generó una codificación de plásmido para la secuencia de aminoácidos de Mtb72f con una marca de 6-His adicional en el extremo N terminal por la unión secuencial en tándem de los marcos de lectura abiertos (ORF) que codificaban el fragmento C terminal de Mtb32a hasta el ORF longitud completa de Mtb39a seguido en el extremo C terminal con la porción N terminal de Mtb32a. Esto se llevó a cabo usando oligonucleótidos específicos de secuencia que contenían sitios de restricción única (EcoRI y EcoRV) y estaban desprovistos de los codones detención en los extremos C terminales (en el caso del fragmento C terminal de Mtb32a y Mtb39a) para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN genómico de la cepa de M. Tuberculosis H37Rv. usando este vector como plantilla, se realizó una mutación de Ser706 a Ala estuvo por mutagénesis dirigida a sitio. Se verificó la orientación apropiada de los insertos así como la mutación Ser706Ala por secuenciación de ADN.

Para obtener el vector que codifica para M72, que sólo tiene 2 restos de His en el extremo N terminal, se borraron cuatro His haciendo uso de un sistema de mutagénesis dirigida a sitio comercial. Después de la verificación de la secuencia, extirpar la secuencia de codificación de M72 del plásmido por reacción enzimática, se purificó con gel y se ligó en un vector pET. Después, se verificó la secuencia del plásmido recombinante. Este plásmido codifica para M72 bajo el control de un promotor de T7. Se conduce la expresión de T7 ARN polimerasa a partir de un integrante genómico en el huésped de expresión y se induce usando un sistema basado en operón de lac (lacI) y una señal de inducción química de IPTG. Se proporciona el plásmido de expresión con resistencia a kanamicina.

Se transformó el plásmido que codifica para la proteína de fusión de M72 bajo el control de un promotor T7 en la cepa de HMS174 (DE3) de E.coli , usando un procedimiento de electroporación. Se secuenciaron la secuencia de codificación del inserto de M72 y las regiones flanqueantes en ambas cepas y se encontró que eran idénticas a la secuencia determinada de la construcción de plásmido original.

5 Fermentación

Se descongeló un vial de semilla de trabajo sedimentada a temperatura ambiente. Se preparó una predilución mezclando la semilla de trabajo con 4,9 ml de medio precultivo. Se usó 1 ml de la pre-dilución para inocular el precultivo líquido que consiste en 400 ml de medio precultivo complementado con 50 mg/l de sulfato de kanamicina y 10 g/l de glucosa.

10 Composición de medio precultivo

Ingrediente: Concentración

KH2PO4: 14,83 g/l

K2HPO4: 1,65 g/l

(NH4)2SO4: 5,82 g/l

Extracto de levadura: 6,21 g/l

Glicerol al 87 % (p/p): 14,54 ml/l

Solución de metal y sal(1): -FeCl3 6H2O -MgSO4 7H2O -Solución de microelementos(2): -ZnSO4 7H2O -MnSO4 H2O -CuSO4 5H2O -CoCl2 6H2O -H3BO3 -Na2MoO4 2H2O -HCl 4N: 9,7 ml/l 3,3 g/l 58 g/l 116 ml/l 7,65 g/l 5,28 g/l 1,1 g/l 1,1 g/l 0,3 g/l 2,64 g/l 6,2 ml/l

Solución de biotina y CaCl2(2): -Biotina -CaCl2 2 H2O: 0,97 ml/l 0,05 g/l 61,7 g/l

El pH del medio está ajustado a 6,5 con solución de NaOH (25 %) Se filtra el medio a través de 0,22 um

(1) pH ajustado a 1,50 con solución de HCl (37 %); se filtra la solución a través de 0,22 um (2) Se filtra la solución a través de 0,22 um

Se incubó el precultivo en un matraz de agitación de 2 litros a 30 ºC bajo agitación (200 RPM) hasta que la DO650nm alcanzó un valor entre 2 y 4 (tiempo de incubación aproximado: 16 horas). Es ese estadio, se inoculó un fermentador de 72 litros (volumen total) que contenía 45 litros de medio de cultivo complementado con 34 mg/l de sulfato de

15 kanamicina con 52 ml de precultivo líquido.

Composición de medio de cultivo

Ingrediente: Concentración

MgSO4 7H2O: 0,63 g/l

FeCl3 6H2O -Solución de microelementos(1): -ZnSO4 7H2O -MnSO4 H2O -CuSO4 5H2O: 0,056 g/l 1,91 ml/l 7,65 g/l 5,28 g/l 1,1 g/l

(continuación)

Ingrediente: Concentración

-CoCl2 6H2O -H3BO3 -Na2MoO4 2H2O -HCl 4N: 1,1 g/l 0,3 g/l 2,64 g/l 6,2 ml/l

HCl 37 %: 0,40 ml/l

Extracto de levadura: 35 g/l

(NH4)2SO4: 2,10 g/l

KH2PO4: 18,70 g/l

Glutamato de sodio: 2,5 g/l

Glicerol 87 %: 0,276 ml/l

Glucosa: 20 g/l

Solución de biotina(2):: 0,22 ml/l

-Biotina: 1 g/l

CaCl2 2 H2O: 0,21 g/l

Se filtra la solución a través de 0,22 um

(1) Se filtra la solución a través de 0,22 um (2) pH ajustado a 11,0 con solución de NaOH (25 %); se filtra la solución a través de 0,22 um

Durante la fase de crecimiento, se mantuvo el pH a 6,8  0,2 por adición periódica de un 25 % (v/v) de NH4OH y un 25 % (v/v) de H3PO4. Después de la incubación durante 16 horas a 30 ºC, se inició la alimentación semicontinua con medio de alimentación.

Composición de medio de alimentación

Ingrediente: Concentración

MgSO4 7H2O: 1,98 g/l

Ingrediente: Concentración

FeCl3 6H2O -Solución de microelementos(1): -ZnSO4 7H2O -MnSO4 H2O: 0,178 g/l 6,02 ml/l 7,65 g/l 5,28 g/l

-CuSO4 5H2O -CoCl2 6H2O -H3BO3 -Na2MoO4 2H2O -HCl 4N: 1,1 g/l 1,1 g/l 0,3 g/l 2,64 g/l 6,2 ml/l

HCl 37 %: 1,24 ml/l

Glutamato de sodio: 5 g/l

Extracto de levadura: 40 g/l

Glicerol 87 %: 590 ml/l

Solución de biotina(2): -Biotina: 2 ml/l 1 g/l

CaCl2 2 H2O: 0,66 g/l

Se filtra la solución a través de 0,22 um

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Ejemplo 10: Prevención de "desplazamiento salino" en composiciones que comprenden M72, inmunoestimulantes y que usan sorbitol como agente de tonicidad

Para comparar la estabilidad de composiciones inmunógenas que contienen NaCl 150 mM con composiciones que usan sorbitol como agente de tonicidad, se monitorizó la estabilidad de varias muestras usando SEC-HPLC y ELISA.

5 Procedimiento

Se prepararon tres tortas de liofilización diferentes, de modo que cuando se combinan con las formulaciones coadyuvantes apropiadas de los ejemplos 5 y 7 se obtendría el pH deseado:

(a) M72 con dos restos de His N terminales – pH objetivo 8.5 en vacuna reconstituida Se añadió un 15,75 % (p/v) de solución de sacarosa (preparada en agua para inyección) a agua para inyección

10 hasta alcanzar una concentración de sacarosa de un 6,3 %. Después, se añadió un 3 % (p/v) de solución de Tween80 (preparada en agua para inyección) hasta alcanzar una concentración de un 0,025 %. Después, se añadió tampón Tris-HCl 1 M pH 8,8 hasta alcanzar una concentración de tampón Tris 50 mM. Se agitó magnéticamente la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadió antígeno a granel purificado (M72 con dos restos de His N terminales, SEQ ID No: 3, como se preparó en el ejemplo 8) hasta

15 alcanzar una concentración de proteína de 25 ug/ml. Se agitó magnéticamente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se comprobó el pH y se encontró que era de 8,8. Se cargaron 0,5 ml de la mezcla obtenida en viales de vidrio de 3 ml, después se secó por congelación.

(b) M72 con dos restos de His N terminales – pH objetivo 8.0 en vacuna reconstituida Se añadió un 15,75 % (p/v) de solución de sacarosa (preparada en agua para inyección) a agua para inyección

20 hasta alcanzar una concentración de sacarosa de un 6,3 %. Después, se añadió un 3 % (p/v) de solución de Tween80 (preparada en agua para inyección) hasta alcanzar una concentración de un 0,025 %. Después, se añadió tampón Tris-HCl 1 M pH 8,8 hasta alcanzar una concentración de tampón Tris 20 mM. Se agitó magnéticamente la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadió antígeno a granel purificado (M72 con dos restos de His N terminales, SEQ ID No: 3, como se preparó en el ejemplo 8) hasta

25 alcanzar una concentración de proteína de 25 ug/ml. Se agitó magnéticamente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se comprobó el pH y se encontró que era de 8,8. Se cargaron 0,5 ml de la mezcla obtenida en viales de vidrio de 3 ml, después se secó por congelación.

(c) M72 con dos restos de His N terminales – pH objetivo 7.5 en vacuna reconstituida Se añadió un 15,75 % (p/v) de solución de sacarosa (preparada en agua para inyección) a agua para inyección

30 hasta alcanzar una concentración de sacarosa de un 6,3 %. Después, se añadió un 3 % (p/v) de solución de Tween80 (preparada en agua para inyección) hasta alcanzar una concentración de un 0,025 %. Después, se añadió tampón Tris-HCl 1 M pH 8,8 hasta alcanzar una concentración de tampón Tris 12,5 mM. Se agitó magnéticamente la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadió antígeno a granel purificado (M72 con dos restos de His N terminales, SEQ ID No: 3, como se preparó en el ejemplo 8) hasta

35 alcanzar una concentración de proteína de 25 ug/ml. Se agitó magnéticamente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se comprobó el pH y se encontró que era de 8,8. Se cargaron 0,5 ml de la mezcla obtenida en viales de vidrio de 3 ml, después se secó por congelación.

Se reconstituyeron las tortas de liofilización descritas anteriormente con 625 ul de las soluciones coadyuvantes preparadas en los ejemplos 5 y 7. Tras la reconstitución con solución coadyuvante, se obtuvieron las siguientes

40 composiciones inmunógenas:

(i) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (NaCl 150 mM – 2) pH 8,5

10 ug/ml de antígeno 5 % p/v de sacarosa Tris 40 mM

45 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21

50 NaCl 150 mM Fosfato 10 mM pH 8,5

(ii) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (NaCl 150 mM – 2) pH 8,0

10 ug/ml de antígeno

55 5 % p/v de sacarosa Tris 16 mM 0,02 % p/v de Tween80

500 ug de DOPC 125 ug de colesterol 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21

5 NaCl 150 mM Fosfato 10 mM pH 8,0

(iii) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (NaCl 150 mM – 2) pH 7,5

10 ug/ml de antígeno

10 5 % p/v de sacarosa Tris 12,5 mM 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol

15 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21 NaCl 150 mM Fosfato 10 mM pH 7,5

20 (iv) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (sorbitol – 2) pH 8,5

10 ug/ml de antígeno 5 % p/v de sacarosa Tris 40 mM 0,02 % p/v de Tween80

25 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21 NaCl 5 mM

30 4,7 % p/v de sorbitol Fosfato 10 mM pH 8,5

(v) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (sorbitol – 2) pH 8,0

10 ug/ml de antígeno

35 5 % p/v de sacarosa Tris 16 mM 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol

40 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21 NaCl 5 mM 4,7 % p/v de sorbitol Fosfato 10 mM

45 pH 8,0

(vi) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (sorbitol – 2) pH 7,5

10 ug/ml de antígeno 5 % p/v de sacarosa Tris 12,5 mM

50 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21

55 NaCl 5 mM 4,7 % p/v de sorbitol Fosfato 10 mM pH 7,5

5

10

15

20

25

30

35

Análisis de la muestra

Se caracterizaron las composiciones inmunógenas reconstituidas descritas anteriormente después del almacenamiento a 25 ºC o 30 ºC (T0, T6h y T24h).

Se realizó un análisis SEC-HPLC por inyección en un Supelco TSK-Gel5000Pwxl (ID 7,8 mm x 30 cm) equilibrado en tampón Tris 20 mM pH 8,5, detección por UV a 210 nm e índice de flujo de 0,5 ml/min.

Se cuantificó la antigenicidad por un ELISA de tipo sándwich en el que se captura el antígeno por un anticuerpo policlonal de conejo específico de M72 y posteriormente se revela por un anticuerpo monoclonal de ratón específico de M72(Mtb39). Se presentan todas los valores medidos con relación a la antigenicidad esperada basándose en la proteína a granel purificada usada para preparar las formulaciones sometidas a prueba.

Resultados

Los resultados se muestran en las figuras 6a-6d y 7.

Los perfiles de SEC-HPLC son estables tras la reconstitución en composiciones de sal baja usando sorbitol como agente de tonicidad en cada pH (es decir, pH 7,5, 8,0 y 8,5). Esto se puede contrastar con los perfiles de SEC-HPLC para composiciones inmunógenas que contienen NaCl 150 mM, que muestran cambios claros entre el perfil inicial obtenido y los que siguen al almacenamiento a 25 ºC o 30 ºC. Esta evolución se vuelve más intensa cuando se disminuye el pH de la composición de NaCl 150 mM.

Las mismas conclusiones se pueden extraer en términos de antigenicidad, permaneciendo las recuperaciones en gran parte estables tras la reconstitución en composiciones de sal baja usando sorbitol como agente de tonicidad a cada pH (es decir, pH 7,5, 8,0 y 8,5) hasta 24h a 30 ºC.

Ejemplo 11: Determinación de la conductividad para composiciones inmunógenas de la invención.

Se midió la conductividad de una variedad de composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención y se comparó con la conductividad de soluciones de cloruro de sodio de control y con una composición inmunógena que contenía una cantidad convencional de cloruro de sodio.

Procedimiento

Se preparó una variedad de estándares que tenían concentraciones de cloruro del sodio de 0, 75, 100, 150, 250 y 300 mM a partir de una solución madre de cloruro de sodio 1500 mM por dilución en agua para inyección.

Se prepararon composiciones inmunógenas usando M72 con dos restos de His N terminales de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el ejemplo 8. Para investigar la contribución del propio antígeno y cualquier material residual en la masa purificada, también se prepararon tortas de liofilización de placebo excluyendo el componente de antígeno.

Usando un Malvern Zetasizer Nano y 1,5 ml de cada muestra en células de capilaridad plegadas, se aplicó un voltaje de 30 a 150 V (determinado automáticamente por el instrumento) y se determinó la conductividad.

Resultados

Conductividad de soluciones estándar de cloruro de sodio

Concentración de cloruro de sodio mM: Conductividad mS/cm

0: 0,0

75: 8,2

100: 10,7

150: 15,6

250: 23,9

300: 30,0

En la figura 8 se proporciona una curva estándar, basado en estos datos.

imagen13

Los resultados en la figura 9 y 10 muestran que las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 comparables se inducen después de tres inmunizaciones con cada una de las formulaciones de prueba. En consecuencia, se puede concluir que una reducción en la cantidad de sales presentes en las composiciones inmunógenas de la presente invención no conduce a un compromiso en las respuestas de linfocitos T inducidos.

5 Ejemplo 13: Investigación del "desplazamiento salino" en composiciones que comprenden M72 con CaCl2 o MgSO4 a pH 6,1 y 8,0.

Para investigar el impacto de otras sales sobre la estabilidad del antígeno M72, las soluciones se prepararon con un intervalo de concentraciones de CaCl2 o MgSO4 y a diferentes niveles de pH. La inspección visual se utilizó como una lectura de la estabilidad.

10 Procedimiento

Se diluyó antígeno a granel purificado (M72 con dos restos de His N terminales, SEQ ID No: 3) hasta una concentración de 100 ug/ml en dos tampones diferente (tampón succinato 10mM a pH 6,1, tampón Tris 10 mM a pH 8,0) que contenían cantidades especificadas de sales (NaCl 0 mM; 150 mM o 300 mM; CaCl2 40 mM, 80 mM o 160 mM; MgSO4 87,5 mM, 175 mM o 430 mM).

15 Se analizaron inmediatamente las muestras después de preparar.

Usando un medidor de la conductividad Mettler Toledo y 6 ml de cada muestra en un vial de vidrio siliconizado, se determinó la conductividad.

Resultados

Grupo: Sal Tampón pH(teórico) Conductividad (mS / cm) pH(medido) Observación Visual

A: 0 mM Succinato 10mM 6,1 1,1 6,3 Transparente

B: NaCl 150 mM Succinato 10mM 6,1 13,4 6,1 Transparente

C: NaCl 300 mM Succinato 10mM 6,1 20,0 6,1 Transparente

D: CaCl2 40 mM Succinato 10mM 6,1 8,0 6,1 Opalescente

E: CaCl2 80 mM Succinato 10mM 6,1 11,2 5,8 Opalescente + partículas grandes

F: CaCl2 160 mM Succinato 10mM 6,1 20,2 5,8 Opalescente + partículas grandes

G: MgSO4 87,5 mM Succinato 10mM 6,1 7,7 6,1 Opalescente

H: MgSO4 175 mM Succinato 10mM 6,1 12,4 5,9 Opalescente + partículas muy grandes

I: MgSO4 430 mM Succinato 10mM 6,1 20,4 5,9 Opalescente + partículas muy grandes

J: 0 mM Tris 10mM 8,0 0,463 8,0 Transparente

K: NaCl 150 mM Tris 10mM 8,0 12,13 8,0 Transparente

L: NaCl 300 mM Tris 10mM 8,0 21,1 8,0 Transparente

M: CaCl2 40 mM Tris 10mM 8,0 6,7 8,1 Partículas grandes

N: CaCl2 80 mM Tris 10mM 8,0 10,8 8,0 Opalescente + partículas grandes

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Claims

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