ES2568801T3 - Composiciones de anticuerpos anti-VEGFR-3 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al VEGFR-3 humano que comprende una LCDR1 de SEQ ID NO 1, una LCDR2 de SEQ ID NO 2, una LCDR3 de SEQ ID NO 3, una HCDR1 de SEQ ID NO 6, una HCDR2 de SEQ ID NO 7 y una HCDR3 de SEQ ID NO 8.

Description

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SEQ ID NO: 15
Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos correspondientes de la cadena pesada del Anticuerpo 1 se designan como SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente. Como en el caso de la secuencia para la cadena ligera, los restos de aminoácidos 1-18 de la SEQ ID NO: 14 constituyen una secuencia secretora útil en la expresión y extracción de la cadena pesada de diversas líneas de células hospedadoras de mamífero, pero que no están presentes en el anticuerpo maduro. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada madura del Anticuerpo 1 se designa en el presente documento como SEQ ID NO: 16.
La especificidad de un anticuerpo puede determinarse basándose en su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un anticuerpo (Kd), mide la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a anticuerpo. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre un anticuerpo con su antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo con su sitio de unión a antígeno del anticuerpo como con la valencia del anticuerpo, que se refiere al número de sitios de unión a antígeno de un epítopo particular. Cuanto menor sea el valor de la Kd, mayor será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y el sitio de unión al anticuerpo.
La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, el Anticuerpo 1 -SEQ ID NO: 13), o polinucleótidos que comprenden una cualquiera de las regiones VH o una parte de las mismas, o una cualquiera de las CDR de VH, incluyendo cualquiera de sus variantes, de un anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, el Anticuerpo 1). La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, el Anticuerpo 1 -SEQ ID NO: 11), o polinucleótidos que comprenden una cualquiera de las regiones VL o una parte de las mismas, o una cualquiera de las CDR de VH, incluyendo cualquiera de sus variantes, de un anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, el Anticuerpo 1).
La invención también incluye vectores de expresión que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Como vectores ejemplares se incluyen ácidos nucleicos de plásmidos, fagémidos, cósmidos, virus y fagos u otras moléculas de ácido nucleico que son pueden efectuar su replicación en hospedadores procariotas o eucariotas, tal como en una célula, por ejemplo, una célula de mamífero. Los vectores de expresión típicos contienen secuencias de inicio y terminación de la transcripción y traducción y promotores útiles para la regulación de la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los vectores también pueden contener casetes de expresión genética que contienen una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del vector tanto en eucariotas como en procariotas, es decir, vectores lanzadera y marcadores de selección para sistemas tanto de procariotas como de eucariotas. Típicamente, los vectores contienen un marcador que proporciona un rasgo fenotípico para la selección de hospedadores transformados, tal como conferir resistencia a antibióticos tales como ampicilina o neomicina.
Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos y promotores inducibles. Las secuencias/promotores de control de expresión representativos incluyen el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, las regiones operadoras y promotoras principales del fago lambda, la región de control de la proteína de recubrimiento fd, los promotores glucolíticos de levadura, por ejemplo, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de la fosfatasa ácida de levadura, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de acoplamiento alfa de levadura, promotores derivados de citomegalovirus humanos, promotor de metalotionina, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de la polihedrina y promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus y virus de simio, por ejemplo, los promotores de SV40 tempranos y tardíos.
La invención también incluye hospedadores no humanos tales como células que contienen un polinucleótido o un vector de la invención. Por “hospedador” se entiende un organismo multicelular no humano o una “célula hospedadora”, que se refiere a una célula o a una población de células en la que se introduce un polinucleótido o un vector de la invención. Una célula hospedadora de la presente invención puede ser una célula o una línea celular eucariota, tal como una célula o una línea celular vegetal, animal, de vertebrado, mamífero, roedor, ratón, primate o ser humano. Las células eucariotas adecuadas incluyen células de levadura y de otros hongos, de insectos, de plantas, de seres humanos y de animales, incluyendo células de mamífero, tales como líneas de hibridoma, células COS, células NS0 y células CHO. Por “una población de células hospedadoras” se entiende un grupo de células cultivadas en las que puede introducirse y expresarse un polinucleótido o un vector de la presente invención. Se contempla cualquier célula hospedadora que sustente la expresión de un polinucleótido o un vector de la invención.
Un hospedador de la presente invención también puede ser un procariota. Los hospedadores procariotas adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tal como Bacillus subtilis, y Streptomyces.
La invención también incluye procedimientos para producir un anticuerpo de la presente invención, que conllevan cultivar una célula hospedadora que exprese uno o más polinucleótidos que codifiquen un anticuerpo de la presente invención, y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.
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Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse como medicamentos en medicina humana y administrarse mediante diversas vías. Más preferentemente, las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la presente invención son para administración parenteral. Dichas composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo, como se desvela en el presente documento, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, los términos “inhibir” o “neutralizar” con respecto a una bioactividad de un anticuerpo de la invención dan a entender la capacidad de antagonizar, prohibir, prevenir, restringir, disminuir, alterar, eliminar, detener, reducir o invertir sustancialmente una bioactividad del VEGFR-3 humano, incluyendo, pero sin limitación, una bioactividad del VEGFR-3 humano, como se mide en el Ejemplo 4 o 5 del presente documento.
Como se usa en el presente documento, los términos “tratar” y “tratamiento” se refieren a tratamiento terapéutico, en el que el objeto es prevenir o ralentizar (aminorar) un cambio fisiológico no deseado asociado con una enfermedad o un trastorno. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen el alivio de los síntomas, la disminución del grado de una enfermedad o un trastorno, la estabilización de una enfermedad o un trastorno (es decir, en el que la enfermedad o el trastorno no empeore), el retraso o disminución de la progresión de una enfermedad o trastorno, la mejora o alivio de la enfermedad o trastorno y la remisión (bien parcial o total) de la enfermedad o trastorno, ya sea detectable o no detectable. “Tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Las personas que necesitan tratamiento incluyen las que ya tienen la enfermedad o el trastorno, así como las propensas a tener la enfermedad o el trastorno.
Las composiciones de la invención pueden incluir una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un anticuerpo de la invención. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo, o parte del anticuerpo, para suscitar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo, o parte del anticuerpo, se supera mediante los efectos terapéuticamente beneficiosos.
La terapia puede ser de “primera línea”, es decir, como un tratamiento inicial en pacientes que previamente no han tenido un tratamiento contra el cáncer, bien en solitario o en combinación con otros tratamientos; o de “segunda línea”, como un tratamiento en pacientes que previamente ya han tenido un régimen de tratamiento contra el cáncer, bien en solitario o en combinación con otros tratamientos; o de “tercera línea”, “cuarta línea”, etc., bien en solitario o en combinación con otros tratamientos.
La terapia también puede ofrecerse a pacientes que han tenido tratamientos previos que han sido parcialmente satisfactorios, pero que son intolerantes al tratamiento en particular. La terapia también puede ofrecerse como un tratamiento adyuvante, es decir, para prevenir la reaparición del cáncer en pacientes con enfermedad actualmente no detectable o después de la extirpación quirúrgica del tumor.
Los cánceres tratados con la invención incluyen tumores primarios y tumores secundarios o metastásicos que han metastatizado a través del sistema linfático (incluyendo los metastatizados de pulmón, mama o próstata).
Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o que aún no están sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como leucemias y linfomas) o pueden ser tumores sólidos.
Los tipos de cánceres a tratar con los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de ovario, eritroleucemia humana, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, carcinoma de células renales, cáncer pancreático, cáncer de pulmón y cáncer de colon. Además, dada la función de la ruta de VEGF-C/VEGFR-3 en la promoción de la linfangiogénesis y dado que, para la mayoría de los tipos de cáncer, el primer sitio de metástasis son los ganglios linfáticos, debería esperarse que el bloqueo de la ruta de VEGF-C/VEGFR-3 inhiba las metástasis de los ganglios linfáticos, por ejemplo, de cáncer de mama, pancreático, gástrico o colorrectal (Roberts et al., Cancer Res., 66(5), 26502657(2006)).
El anticuerpo puede administrarse solo (monoterapia), o en combinación con uno o más agentes o tratamientos terapéuticamente eficaces (terapia de combinación). El otro agente terapéuticamente eficaz puede conjugarse con el anticuerpo, incorporarse en la misma composición que la del anticuerpo o puede administrarse como una composición distinta. El otro agente o tratamiento terapéuticamente eficaz puede administrarse antes, durante y/o después de la administración del anticuerpo. El otro agente terapéuticamente eficaz puede administrarse para aumentar el efecto terapéutico del anticuerpo, o para disminuir los efectos secundarios negativos del anticuerpo.
Los procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento pueden usarse para tratar a cualquier mamífero, incluyendo primates, tales como monos y seres humanos, caballos, vacas, gatos, perros, conejos y roedores, tales como ratas y ratones, de un modo adecuado. En una realización, el mamífero a tratar es un ser humano.
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con el ADNc que codificaba la fosfatasa alcalina (AP) humana para generar la proteína de fusión sR3-AP (Persaud y col. (2004) J. Cell Science 117: 2745-56; Pytowski, et al. (2005) J. Natl. Cancer Inst. 97(1): 14-21).
Producción de la proteína de fusión sR3-AP quimérica de ratón-humano y mutantes dirigidos a sitio de sR3-AP. Se prepararon construcciones quiméricas de humano-ratón y ratón-humano de los dominios similares a inmunoglobulina (Ig) N terminales de sR3-AP usando la técnica de PCR solapante (Ho y col., (1989), Gene 77: 5159) y se clonaron en el vector de expresión AP (Persaud y col., citados anteriorment; Pytowski y col., citados anteriormente). Se realizó mutagénesis dirigida a sitio de sR3-AP usando el Kit de Mutagénesis Dirigida a Sitio de QuickChange II XL siguiendo las instrucciones del fabricante (Stratagene). La presencia de sustituciones deseadas se verificó por secuenciación de ambas cadenas del ADNc a través de la región mutada usando el analizador Genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) y el Kit de Secuenciación de Ciclo BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems).
Expresión de proteínas VEGFR-3 solubles: El ADNc que codificaba las regiones extracelulares de sR3-AP de tipo silvestre y mutada se transfectó en células 293 FreeStyle™ (Invitrogen, n.º R79007) cultivadas en suspensión en un Medio de Expresión químicamente definido, sin proteínas, FreeStyle™ (Invitrogen, n.º 12338026). En algunos casos, la sR3-AP seleccionada se purificó usando cromatografía de afinidad con el anticuerpo anti-AP como se ha descrito anteriormente (Zhu y col., (1998) Cancer Res. 58: 3209-14) o mediante cromatografía de afinidad con los mAb Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2 inmovilizados, descritos en el presente documento.
Normalización de proteínas sR3 en medio acondicionado (MA): La actividad de la fosfatasa alcalina del MA se ensayó usando el kit de Quimioluminiscencia SEAP Great EscAPe™ 2.0 (Clontech, Mountain View, CA) usando el luminómetro Tropix TR7171 (Applied Biosystems, Foster City, CA). El MA se diluyó en proporción a su actividad AP en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (PBS-BSA) y volvió a ensayarse para verificar la normalización mediante mediciones de actividad de la AP y mediante transferencia Western.
Ensayos de unión de sR3-AP: Cien (100) 1 de MA normalizado se transfirieron a placas de microtitulación de 96 pocillos revestidas bien con VEGF-CNC, o con el compuesto de ensayo (200 ng/pocillo). Después de 2 h de incubación, las placas se lavaron 5 veces y la sR3-AP unida se detectó con quimioluminiscencia.
La especificidad de unión del Anticuerpo 1 y de un anticuerpo monoclonal de rata de referencia contra VEGFR-3 de ratón (denominado “Anticuerpo 2”) se ensayó con ELISA usando las partes extracelulares inmovilizadas del VEGFR3 de ratón y ser humano (dominios Ig 1-7). El Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 2 se unen fuertemente y de una manera dependiente de la dosis al VEGFR-3 de ser humano y ratón respectivamente. El Anticuerpo 1 del anticuerpo humano mostró reactividad cruzada leve, aunque reproducible, con el VEGFR-3 de ratón a concentraciones que superaban 10 nM. En cambio, el Anticuerpo 2 no demostró ninguna unión detectable con el VEGFR-3 de ser humano.
Los epítopos del Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2 están completamente contenidos dentro del segundo dominio similar a inmunoglobulina (Ig) del VEGF-3: Los sitios de unión a ligando de los tres miembros de la familia de receptores del VEGF están contenidos dentro de los tres dominios Ig N-terminales del domino extracelular. La especificidad de las especies del Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2 se utiliza para determinar cuál de los tres primeros dominios de Ig contiene los epítopos de estos anticuerpos. Las secuencias de ADN que codifican los dominios 1-3 de Ig de ratón y ser humano permutaron en diversas combinaciones para formar las siguientes construcciones de dominio extracelular de VEGFR-3: i) humano tipo silvestre; ii) ratón tipo silvestre; iii) quimera 1 (Ig1 humana-Ig2 humana-Ig3 ratón); quimera 2 (Ig1 humana-Ig2 ratón-Ig2 ratón); (iv) quimera 3 (Ig1 humana-Ig2 ratón-Ig3 ratón) y (v) quimera 4 (Ig1 humana-Ig2 ratón-Ig3 humana). Las construcciones se expresaron como proteínas de fusión con fosfatasa alcalina (AP) Persaud y col., citados anteriormente. Las proteínas codificadas se aislaron de los medios acondicionados (MA) de células transfectadas de manera transitoria y se normalizaron a la misma concentración de proteínas y actividad AP. La sR3-AP de ratón y ser humano se unieron a VEGF-CNC humano con similar afinidad. Por tanto, la capacidad de las diversas quimeras de sR3-AP para unirse a VEGF-CNC humano se ensayó como un medio para determinar que se conserva el plegamiento correcto de la proteína en los receptores quiméricos. La capacidad del Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2 para unirse a las proteínas quiméricas 1 a 4 muestra que los epítopos del Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2 están completamente contenidos dentro del segundo dominio de Ig (Ig2) del VEGFR-3 de ser humano y ratón respectivamente. Por ejemplo, el Anticuerpo 1 no se unirá a la quimera 2 o quimera 4, que contiene la secuencia del VEGFR-3 de ratón en el dominio 2 de Ig.
Identificación de aminoácidos de VEGFR-3 que constituye los epítopos del Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2: Se identificaron las doce (12) posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos del segundo dominio Ig del VEGFR-3 que diferían entre las proteínas de ser humano y ratón. En la tabla 4 se muestran estas posiciones, junto con los restos en las proteínas de ser humano y ratón.
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correspondientes de humano por ratón en VEGFR-3 en las posiciones 219 y 221 (P219L y L221V) permiten la unión del Anticuerpo 2 con la sR3-AP humana a niveles, respectivamente aproximadamente 55 veces y 10 veces, mayores de la unión del Anticuerpo 2 con la secuencia humana de tipo silvestre. También se demostró que la unión de las proteínas mutantes de ratón que contenían el aminoácido ortólogo humano en las posiciones 219 y 221 con VEGF-CNC aumenta ligeramente o no se ve afectada mientras que la unión de estas proteínas mutantes con el Anticuerpo 2 se anula (219) o reduce aproximadamente un 85 % (221).
Los criterios establecidos para considerar que un aminoácido comprende un epítopo para el Anticuerpo 2 es que la sustitución del ortólogo humano en sR3-AP de ratón reduciría significativamente la unión con el Anticuerpo 2 aunque reduciría (pero NO anularía) o dejaría sin afectar la unión con VEGF-CNC. Además, para un aminoácido que comprende un epítopo para el Anticuerpo 2, la sustitución del ortólogo de ser humano por ratón en la sR3-AP humana conduciría a una unión significativa con el Anticuerpo 2. Para el Anticuerpo 2, estos criterios se satisfacen mediante P219 y L221 de la sR3-AP de ratón.
Otro procedimiento para expresar los datos es calcular el porcentaje de unión máxima del Anticuerpo 2 con sR3-AP de tipo silvestre de ratón que se reconstituye mediante cada una de las mutaciones ortólogas individuales de humano por ratón dentro de la secuencia de sR3-AP humana. Esto demuestra que sustituyendo individualmente P219L y L221V con la secuencia de sR3-AP humana se produciría la reconstitución de aproximadamente 5 % y 1 % respectivamente de la unión máxima con el Anticuerpo 2 observada con la sR3-AP de tipo silvestre de ratón. Por lo tanto, se llega a la conclusión de que L219 y V221 son constituyentes del epítopo del Anticuerpo 2.
Puede observarse que el Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 2 se unen a epítopos muy similares en el VEGFR-3 humano y en el VEGFR-3 de ratón respectivamente, siendo en cada caso el resto clave el que está en la posición 219. Los datos de los siguientes ejemplos demuestran que tanto el Anticuerpo 1 como el Anticuerpo 2 son anticuerpos neutralizantes que pueden bloquear la actividad de sus antígenos respectivos, así como inhibir el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto in vivo. Dichos datos proporcionan pruebas adicionales para demostrar que el nuevo epítopo en el dominio Ig2 del VEGFR-3 identificado en el presente documento proporciona la característica ventajosa clave de ser un epítopo neutralizante. Los anticuerpos que se unen a dicho epítopo tienen, por tanto, la capacidad de bloquear la unión con el ligando, la señalización del VEGFR-3 y de inhibir el crecimiento tumoral in vivo.
Ejemplo 3: Mediciones de afinidad (Kd) para los anticuerpos anti-VEGFR-3
Los parámetros cinéticos de unión del Anticuerpo 1 se miden mediante resonancia de plasmón superficial en el biosensor BIACORE 2000 (BIACORE, Piscataway, NY) a 20 ºC. El dominio extracelular soluble del VEGFR-3 humano (sR3-AP) se inmoviliza en una microplaca detectora y el Anticuerpo 1 se inyecta sobre la superficie del sensor a concentraciones entre 0,8 y 6,25 nM. Los sensogramas se evalúan usando el programa BIA Evaluation 3.2 para determinar la velocidad de asociación (ka) y la velocidad de disociación (kd). La constante de disociación (Kd) se calcula a partir de las velocidades ka y kd usando la educación: Kd = ka/kd. Los análisis cinéticos BIAcore producen un valor Kd de 56 pM para la unión del Anticuerpo I con la sR3-AP inmovilizada. Por tanto, el Anticuerpo 1 tiene una afinidad extremadamente elevada por el VEGFR-3 humano en el que dicha afinidad es casi 2 órdenes de magnitud mayor que la de sR3-AP por VEGF-CNC.
Ejemplo 4. Bloqueo de la unión de VEGF-C con VEGFR-3 mediante anticuerpos anti-VEGFR-3
Para medir la capacidad de los anticuerpos VEGFR-3 para bloquear la unión de VEGF-C con VEGFR-3 humano, se utilizó un ensayo de bloqueo competitivo de VEGF-C. Se mezclaron anticuerpos o partículas de fagos solubles a una concentración de 0,001 g/ml a 5 g/ml con 50 ng de sR3-AP, se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se transfirió a placas de microtitulación de 96 pocillos cubiertas con VEGF-CNC (200 ng/pocillo). Después de 2 horas más, las placas se lavaron cinco veces y se añadió p-nitrofenil fosfato (Sigma) para cuantificar la unión de las moléculas sR3-AP a una DO405 nm. S e calculó la CI50, es decir, la concentración de Fab o de IgG necesaria para una inhibición del 50 % de la unión de sR3-AP con VEGF-CNC. Las formas Fab e IgG del Anticuerpo 1 bloquearon fuertemente la unión de sR3-AP a VEGF-CNC inmovilizado con un valor de CI50 de 2 y 1,3 nM, respectivamente. En cambio, un anticuerpo de control que se dirige al receptor de IGF humano y que se obtiene de la misma fagoteca es inactivo.
Ejemplo 5: Inhibición de la respuesta mitogénica estimulada por VEGF-CNC por el Anticuerpo 1
Para ensayar la capacidad del Anticuerpo 1 para inhibir la transducción de señal mediada por VEGFR-3, se preparó una línea celular NIH-3T3 que expresaba una forma quimérica de VEGFR-3 que fusionaba el dominio extracelular del VEGFR-3 humano con los dominios transmembrana y citoplasmáticos de cFMS humano. No se detectó expresión endógena del VEGFR-3 por las células parentales y la localización del receptor quimérico en la membrana plasmática se muestra mediante análisis FACS. Se sembraron células FMS-VEGFR-3 (5 x 103 células/pocillo) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Wallac, Gaithersburg, MD) en 200 ml de medio asérico y se incubaron a una temperatura de 37 ºC durante 72 horas. Se añadió anticuerpo hasta 20 nM y se preincubó a 37 ºC durante 1 hora, después de lo cual se añadió VEGF-CNC a una concentración final de 20 ng/ml. Después de 18 horas de incubación, a cada pocillo se añadieron 0,25 mCi de timidina marcada con tritio ([3H]-TdR) (Amersham) y se incubó
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150246118A1 (en) 2012-10-26 2015-09-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Lyve-1 antagonists for preventing or treating a pathological condition associated with lymphangiogenesis
KR101521981B1 (ko) * 2013-07-31 2015-05-20 가톨릭대학교 산학협력단 혈액암 줄기세포 증식 또는 생착 억제용 조성물
EP3244924B1 (en) * 2015-01-15 2021-04-07 Oncoquest Pharmaceuticals Inc. Methods of increasing delivery of anti-cancer agents to targets
CN110352068A (zh) 2016-12-02 2019-10-18 南加利福尼亚大学 合成的免疫受体及其使用方法
CN110004167A (zh) * 2019-04-16 2019-07-12 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 靶向vegfr-2和/或vegfr-3嵌合抗原受体及其应用
CN111808191A (zh) * 2020-05-11 2020-10-23 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中vegf含量的抗体对及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1353952B1 (en) * 1994-11-14 2007-04-11 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
BRPI0616923A2 (pt) 2005-10-06 2011-07-05 Lilly Co Eli anticorpos monoclonais, seus usos e composição farmacêutica

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