ES2568895T3

ES2568895T3 - Nuevas composiciones inmunogénicas para la prevención y tratamiento de enfermedad meningocócica

Info

Publication number: ES2568895T3
Application number: ES02804818.9T
Authority: ES
Inventors: Gary W. Zlotnick; Leah D. Fletcher; John Farley; Liesel A. Bernfield; Robert J. Zagursky; Benjamin J. Metcalf
Original assignee: Wyeth Holdings LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2016-05-05
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: PT2332961T; LUC00041I1; CN1578785A; EP2332961A3; FR15C0056I1; ES2549764T3; CN102755631A; PT2341063E; MX339524B; IL245955A0; IL233545A; EP2348036A3; US20120301496A1; EP2341062B1; CA2849427A1; EP2343308B1; ES2549765T3; DK2348036T3; ES2603532T3; FR17C1042I2

Abstract

Una composición que comprende al menos una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia mayor del 97 % con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 56, 58 y 60.

Description

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SEQ ID NO 58: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 59: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de M98 250771.

SEQ ID NO 60: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771.

SEQ ID NO 61: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 62: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 63: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 64: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando

una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 65: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de CDC1135. SEQ ID NO 66: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135. SEQ ID NO 67: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 68: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 69: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 70: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 71: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO 72: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO 73: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 74: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 75: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 76: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 77: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC 1610. SEQ ID NO 78: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610. SEQ ID NO 79: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC 1492 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 80: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 81: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC 1492 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 82: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492 preparada usando una secuencia líder P4.

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SEQ ID NO 83: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492.

SEQ ID NO 84: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492. SEQ ID NO 85: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 86: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 87: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 88: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 89: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978.

SEQ ID NO 90: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978.

SEQ ID NO 91: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 92: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 93: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 94: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 95: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 96: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 97: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252697 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 98: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 99: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252697 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 100: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 101: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252697. SEQ ID NO 102: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697. SEQ ID NO 103: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6557 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 104: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 105: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 6557 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 106: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 107: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6557.

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SEQ ID NO 133: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 134: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 135: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 136: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 137: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622.

SEQ ID NO 138: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO 139: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 140: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 141: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de 870446 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 142: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 143: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446.

SEQ ID NO 144: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446.

SEQ ID NO 145: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 146: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 147: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ NO 148: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 149: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248. SEQ ID NO 150: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248. SEQ NO 151: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250809 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 152: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 153: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M98 250809 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 154: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 155: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO 156: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO 157: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa L5 M981 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

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SEQ ID NO 158: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 159: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de L5 M981 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 160: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 161: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981.

SEQ ID NO 162: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981.

SEQ ID NO 163: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 164: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 165: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de NMB cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 166: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 167: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB.

SEQ ID NO 168: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB.

SEQ ID NO 169: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 170: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 171: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250572 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 172: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 173: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572.

SEQ ID NO 174: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572.

SEQ ID NO 175: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 176: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 177: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 178: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 179: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.

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SEQ ID NO 180: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.

SEQ ID NO 181: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína

2086 madura de la cepa CDC937 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 182: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 183: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína

2086 madura de CDC937 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 184: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 185: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937.

SEQ ID NO 186: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937. SEQ ID NO 187: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 188: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada

usando una secuencia líder nativa. SEQ NO 189: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de M97 252097 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 190: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ NO 191: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097.

SEQ ID NO 192: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097.

SEQ ID NO 193: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 194: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 195: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de 870227 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 196: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando

una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 197: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227. SEQ ID NO 198: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227. SEQ ID NO 199: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa H355 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 200: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 201: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de H355 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 202: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 203: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa H355.

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SEQ ID NO 253: secuencia de ácido nucleico parcial que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 de una cepa de Neisseria lactamica. SEQ ID NO 254 a 259: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la familia de proteínas 2086. SEQ ID NO 260 a 278: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la Subfamilia A de 2086.

SEQ ID NO 279 a 299: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la Subfamilia B de 2086. SEQ ID NO 300: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la familia de proteínas 2086 (“proteínas 2086”) de acuerdo con una realización de la presente invención.

SEQ ID NO 301: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia A de proteínas 2086

de acuerdo con una realización de la presente invención. SEQ ID NO 302: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia B de proteínas 2086 de acuerdo con una realización de la presente invención.

SEQ ID NO 303: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BamHI

(Compuesto Nº 4623). SEQ ID NO 304: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción NdeI (Compuesto Nº 4624).

SEQ ID NO 305: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 4625). SEQ ID NO 306: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 5005). SEQ ID NO 307: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 5007). SEQ ID NO 308: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BglII

(Compuesto Nº 5135).

SEQ ID NO 309: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI (Compuesto Nº 5658). SEQ ID NO 310: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción SphI

(Compuesto Nº 5660).

SEQ ID NO 311: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI (Compuesto Nº 6385). SEQ NO 312: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BamHI y NdeI

(Compuesto Nº 6406). SEQ ID NO 313: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 6470). SEQ ID NO 314: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 6472). SEQ ID NO 315: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI

(Compuesto Nº 6473).

SEQ ID NO 316: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BglII y NdeI (Compuesto Nº 6474). SEQ ID NO 317: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 6495). SEQ ID NO 318: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 6496). SEQ ID NO 319: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción SphI

(Compuesto Nº 6543).

SEQ ID NO 320: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BglII (Compuesto Nº 6605). SEQ ID NO 321: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BglII y NdeI

(Compuesto Nº 6721). SEQ ID NO 322: secuencia de ácido nucleico para la secuencia líder P4. SEQ ID NO 323: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 1.

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SEQ ID NO 324: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 2.

SEQ ID NO 325: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 3.

SEQ ID NO 326: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 4.

SEQ ID NO 327: es la secuencia de aminoácidos de P4431.

SEQ ID NO 328: es la secuencia de aminoácidos de P5136.

SEQ ID NO 329: es una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Una nueva clase de antígenos con actividad bactericida con funcionalidad cruzada con el serogrupo B de Neisseria meningitidis evitaría la necesidad de un enfoque de PorA multivalente para la inmunización contra la infección. Dicho antígeno se ha identificado inesperadamente y se describe y reivindica en el presente documento. La presencia de dicho antígeno se observó por primera vez en una mezcla compleja de proteínas de membrana externa solubles (sOMP) de una cepa meningocócica. La actividad bactericida de este antígeno se siguió mediante una serie de etapas de fraccionamiento y purificación de proteínas hasta que la mezcla de proteínas de interés contenía solamente algunas proteínas. Las proteínas principales de esta mezcla se identificaron por secuenciación de aminoácidos N terminal y mapeo de péptidos. La proteína de interés que mostraba actividad bactericida se identificó como proteína ORF2086, una proteína lipidada (también denominada más específicamente LP2086). La “proteína ORF2086” se refiere a una proteína codificada por la fase abierta lectura 2086 (ORF2086) de una especie de

Neisseria.

Como se describe en el presente documento, se han identificado nuevos candidatos a composición inmunogénica basándose en la proteína ORF2086 de una especie de Neisseria (también denominada “proteína 2086” o proteína “ORF2086” usados de forma intercambiable en el presente documento, o P2086 para las proteínas no lipidadas y LP2086 para versión lipidada de las proteínas) aisladas de N. meningitidis combinando fraccionamiento celular, la extracción de detergente diferencial, la purificación de proteínas con la preparación de antisueros, y un ensayo de actividad bactericida utilizando múltiples cepas. Como alternativa a las composiciones inmunogénicas potenciales y diagnósticos desvelados en las referencias citadas anteriormente, la presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para tratar y/o prevenir la infección meningocócica mediante el uso de proteínas, partes inmunogénicas de las mismas y equivalentes biológicos de las mismas, así como genes que codifican dichos polipéptidos, partes equivalentes, anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a las mismas.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se identificaron inesperadamente agentes inmunogénicos basados en una proteína 2086 como se define en las reivindicaciones adjuntas, incluyendo polipéptidos aislados, como candidatos inmunogénicos basándose en la capacidad de dichos agentes para mostrar reactividad cruzada o ausencia de especificidad de cepa. En particular, se identificaron candidatos que demostraron inesperadamente la capacidad de (1) inducir anticuerpos bactericidas para múltiples cepas de Neisseria y/o gonocócicas; (2) reaccionar con la superficie de múltiples cepas; (3) conferir protección pasiva contra una exposición en vivo; y/o (4) evitar la colonización. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden dichos agentes inmunogénicos, incluyendo polipéptidos aislados, y/o equivalentes biológicos de los mismos, así como procedimientos para usarlos contra la infección por N. meningitidis. (Véase, Ejemplo 1 en el presente documento para la metodología usada en la identificación de la proteína 2086).

Como se usa en el presente documento, la expresión “no específico de cepa” se refiere a la característica de un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra más de una cepa de N. meningitidis, (por ejemplo, cepas meningocócicas heterólogas). La expresión de “reactividad cruzada” como se usa en el presente documento se usa de forma intercambiable con la expresión “no específico de cepa”. La expresión “antígeno de N. meningitidis no específico de cepa inmunogénico” como se usa en el presente documento, describe un antígeno que puede aislarse de N. meningitidis, aunque también puede aislarse de otra bacteria (por ejemplo, otras cepas de Neisseria, tales como cepas gonocócicas, por ejemplo), o prepararse usando tecnología recombinante.

Las proteínas 2086 de la presente invención incluyen proteínas lipidadas y no lipidadas. Además, la presente divulgación también contempla del uso de las proteínas inmaduras o preproteínas que corresponden a cada proteína como compuestos/composiciones intermedios.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a los agentes inmunogénicos anteriores, de acuerdo con implementaciones de la divulgación.

Adicionalmente, la presente invención proporciona composiciones y/o composiciones inmunogénicas y su uso en la prevención, el tratamiento de meningitis meningocócica, en particular enfermedad meningocócica de serogrupo B, así como procedimientos para preparar dichas composiciones.

Se ha mostrado que las composiciones de la presente invención son altamente inmunogénicas y capaces de inducir

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la producción de anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos tienen reactividad cruzada para las cepas menigocócicas heterólogas de serogrupo, serotipo y serosubtipo. En consecuencia, las presentes composiciones superan las deficiencias de intentos de vacuna de N. meningitidis anteriores mostrando la capacidad para inducir anticuerpos bactericidas a cepas de Neisseria heterólogas. Por lo tanto, entre otras ventajas, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que pueden componerse con menos componentes para inducir protección comparable a agentes previamente usados. Las composiciones o agentes inmunogénicos de las mismas (por ejemplo, polipéptidos, partes inmunogénicas o fragmentos y equivalentes biológicos) pueden usarse solos o en combinación con otros antígenos o agentes para inducir protección inmunológica de infección meningocócica y enfermedad, así como para inducir protección inmunológica de infección y/o enfermedad provocada por otros patógenos. Esto simplifica el diseño de una composición inmunogénica para su uso contra infección meningocócica reduciendo el número de antígenos requeridos para protección contra múltiples cepas. De hecho, la proteína 2086 purificada reducirá drástica e inesperadamente el número de proteínas requeridas para proporcionar una cobertura inmunogénica adecuada de las cepas responsables de la enfermedad meningocócica. La proteína 2086 puede expresarse de forma recombinante en E. coli como una lipoproteína, que es la forma de tipo silvestre de la proteína, a niveles mucho mayores que en los meningococos nativos.

Debido a que se descubrió que los anticuerpos dirigidos contra la proteína 2086 de una única cepa destruían cepas no relacionadas (es decir, heterólogas), se realizó un intento de caracterizar un gran número de cepas heterólogas con respecto a la presencia de un “homólogo de 2086” y determinar el nivel de conservación de secuencia. Aunque aproximadamente el 70 % de las cepas ensayadas por PCR tuvieron homólogos de 2086 que podrían amplificarse usando los cebadores que amplificaron el gen de 2086 original de la cepa 8529, el aproximadamente 30 % restante fueron negativas por este ensayo. Se descubrió que este aproximadamente 30 % restante contenía un homólogo de 2086 que tenía solamente aproximadamente el 60 % de homología de secuencia de aminoácidos con el gen de 2086 derivado de 8529 original. Se identificaron otros cebadores que podrían amplificar un homólogo de 2086 de este aproximadamente 30 % de cepas. Se han designado las cepas N. meningitidis ensayadas como pertenecientes a la Subfamilia A o Subfamilia B dependiendo de qué conjunto de cebadores pueda amplificar un homólogo de 2086. Los detalles de estos experimentos se resumen en el Ejemplo 5 posterior.

La presencia de una proteína 2086 en numerosos serosubtipos

Para determinar el nivel de conservación de secuencia del gen 2086 entre cepas de N. meningitidis, se han clonado varios representantes de Subfamilias A y B como genes de longitud completa y se han presentado para análisis de secuencia de ADN. Usando cebadores como se desvela en el presente documento, véase, por ejemplo, Tabla IV, se han identificado veinticuatro cuatro cepas menigocócicas del serogrupo B que expresan antígenos de diferentes serosubtipos y también expresan una proteína compartida, P2086. Se proporcionan ejemplos de estas secuencias en el presente documento y se muestran como secuencias de ADN maduras (es decir, se han escindido todas las secuencias señal de lipoproteína en el resto de cisteína). Véase, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2-252 pares, sin limitación.

Aunque la proteína 2086 no está presente en grandes cantidades en cepas de tipo de silvestre, es una diana para anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos, a diferencia de los producidos en respuesta a las PorA, son capaces de destruir cepas que expresan serosubtipos heterólogos.

Los anticuerpos para la proteína 2086 también protegen de forma pasiva a crías de rata de la exposición a meningococos (véase Tabla VII). La expresión recombinante de la proteína 2086 permite el uso de la proteína 2086 como una composición inmunogénica para la prevención de la enfermedad meningocócica. Todos los candidatos a composición inmunogénica meningocócica recientes en ensayos clínicos han sido mezclas complejas o preparaciones de proteína de membrana externa que contenían muchas proteínas diferentes. La proteína PorA, que proporciona especificidad de serosubtipo, requerirá la inclusión de 6 a 9 variantes en una composición inmunogénica para proporcionar aproximadamente 70-80 % de cobertura de serosubtipos relacionados con enfermedad. Por el contrario, se ha demostrado claramente en el presente documento que los antisueros para una única proteína 2086 sola son capaces de destruir representativos de seis serosubtipos responsables de aproximadamente el 65 % de los aislados de enfermedad en Europa occidental y los Estados Unidos. Por lo tanto, la proteína 2086 purificada tiene el potencial de reducir el número de proteínas requeridas para proporcionar una cobertura de composición inmunogénica adecuada de los serosubtipos responsables de la enfermedad meningocócica.

Proteínas, partes inmunogénicas y equivalentes biológicos

Las proteínas 2086 proporcionadas por la presente invención son proteínas aisladas. El término “aislado” significa alterado por la mando del hombre del estado natural. Si una composición o sustancia “aislada” aparece en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambas. Por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido presente de forma natural en un animal vivo no está “aislado”, pero el mismo polipéptido o polinucleótido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, como se emplea el término en el presente documento. En consecuencia, como se usa en el presente documento, la expresión “proteína aislada” abarca proteínas aisladas de una fuerte natural y proteínas preparadas usando tecnología recombinante, así como dichas proteínas cuando se combinan con otros antígenos y/o aditivos, tales como vehículos, tampones, adyuvantes, etc. farmacéuticamente aceptables, por ejemplo.

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Secuencia de Subfamilia A de 2086 (SEC ID 301)

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La referencia “x” es cualquier aminoácido. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 es cualquiera de 0 a 4 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 preferentemente comprende 0 o 4

aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 preferentemente comprende 0 o 3 aminoácidos. Subfamilia B de 2086 (SEC ID 302)

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La referencia “x” es cualquier aminoácido.

La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos.

La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 preferentemente comprende 0 o 5 aminoácidos.

De acuerdo con implementaciones de la presente invención, las subfamilias de proteína 2086 pueden subdividirse adicionalmente en grupos. Por ejemplo, se desvelan los siguientes grupos en el presente documento: SEQ ID NO: 212 de números pares; SEQ ID NO: 14-24 de números pares; SEQ ID NO: 26-42 de números pares; SEQ ID NO: 5060; SEQ ID NO: 62-108 de números pares; SEQ ID NO: 110-138 de números pares; SEQ ID NO: 140-156 de números pares; SEQ ID NO: 158-174 de números pares; y SEQ ID NO: 224-252 de números pares.

Una secuencia polipeptídica de la invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de las SEQ ID NO: 56, 58, 60 de números pares es decir, 100 % idéntica, o puede incluir varias alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el % de identidad sea menor del 100 %. Dichas alteraciones incluyen al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácido. Las alteraciones pueden suceder en las posiciones amino o carboxilo-terminal de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de aminoácidos de referencia.

Por lo tanto, la invención también proporciona proteínas que tienen identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos contenidas en la Lista de Secuencia (es decir, SEQ ID NO: 56, 58, 60 de números pares). Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia es preferentemente mayor del 97 % (por ejemplo, 97 %, 99 %, 99,9 % o más). Estas proteínas homólogas incluyen mutantes y variantes alélicas.

En realizaciones preferidas de la invención, las proteínas 2086 u otros polipéptidos 2086 (por ejemplo, partes inmunológicas y equivalentes biológicos como se define en las reivindicaciones adjuntas) generan anticuerpos bactericidas para cepas homólogas y al menos una heteróloga de meningococos. Específicamente, los anticuerpos para los polipéptidos 2086 protegen de forma pasiva las crías de rata de la exposición, tal como intranasal, a meningococos. En realizaciones preferidas adicionales, los polipéptidos 2086 muestran dicha protección para crías de rata para cepas homólogas y al menos una cepa heteróloga. El polipéptido puede seleccionarse del Sumario de

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Secuencia anterior, como se expone en las SEQ ID NO: 56, 58, 60 de números pares, o el polipéptido puede ser cualquier fragmento inmunológico o equivalente biológico de los polipéptidos enumerados. Preferentemente, el polipéptido se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NO: 56, 58, 60 de números pares en el Sumario de Secuencias anterior.

También se desvelan en el presente documento variantes alélicas u otras de los polipéptidos 2086 que son equivalentes biológicos. Los equivalentes biológicos desvelados en el presente documento mostrarán la capacidad para (1) inducir anticuerpos bactericidas para cepas homólogas y al menos una cepa heteróloga de Neisseria y/o cepa gonocócica; (2) reaccionar con la superficie de cepas homólogas y al menos una cepa de Neisseria y/o gonocócica heteróloga; (3) conferir protección pasiva contra una exposición en vivo; y/o (4) evitar la colonización. Los equivalentes biológicos desvelados en el presente documento tienen al menos aproximadamente 60 %, preferentemente al menos inserto de aproximadamente 70 %, más preferentemente al menos aproximadamente 75 %, aún más preferentemente aproximadamente 85 %, aún más preferentemente aproximadamente 85 %, aún más preferentemente aproximadamente 90 %, aún más preferentemente 95 % o aún más preferentemente 98 %, o aún más preferentemente 99 % de similitud con uno de los polipéptidos 2086 especificados en el presente documento (es decir, las SEQ ID NO: 2-252 de números pares), a condición de que el equivalente sea capaz de inducir sustancialmente las mismas propiedades inmunogénicas que una de las proteínas 2086 de la presente invención.

Como alternativa, los equivalentes biológicos desvelados en el presente documento tienen sustancialmente las mismas propiedades inmunogénicas de una de las proteínas 2086 en las SEQ ID NO: 2-252 de números pares. De acuerdo con realizaciones de la presente invención, los equivalentes biológicos tienen las mismas propiedades inmunogénicas que las SEQ ID NO: 56, 58, 60 de números pares.

Los equivalentes biológicos desvelados en el presente documento se obtienen generando variantes y modificaciones de las proteínas de la presente invención. Estas variantes y modificaciones de las proteínas se obtienen alterando las secuencias de aminoácidos por inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos se modifica, por ejemplo, sustituyendo para crear un polipéptido que tenga sustancialmente las mismas cualidades o cualidades mejoradas. Un medio preferido para introducir alteraciones comprende realizar mutaciones predeterminadas de la secuencia de ácido nucleico del polipéptido por mutagénesis dirigida.

Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de un polipéptido de la presente invención y aún obtener una molécula que tenga inmunogenicidad de N. meningitidis. Por ejemplo, sin limitación, ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos, incluyendo sustitución no conservada y conservada, en una secuencia sin pérdida apreciable de inmunogenicidad. Debido a que es la capacidad interactiva y naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica de ese polipéptido, pueden realizarse varias sustituciones de secuencia de aminoácidos en una secuencia polipeptídica (o, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente) y no obstante obtener un polipéptido con propiedades similares. La presente invención como se define en las reivindicaciones adjuntas, contempla cualquier cambio a la estructura de los polipéptidos del presente documento, así como la secuencias de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos, en los que el polipéptido conserva la inmunogenicidad. Un experto habitual en la materia sería capaz fácilmente de modificar los polipéptidos y polinucleótidos desvelados en consecuencia, basándose en las directrices proporcionadas en el presente documento.

Por ejemplo, se han identificado ciertas regiones variables en las que es permisible la sustitución o deleción. La secuencia consenso de 2086, como se ha analizado previamente, muestra regiones conservadas y no conservadas de la familia de proteínas 2086 de acuerdo con una implementación de la presente invención.

En la realización de dichos cambios, puede utilizarse cualquier técnica conocida por los expertos en la materia. Por ejemplo, sin pretender limitarse a lo mismo, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva a un polipéptido se entiende en general en la técnica. Kyte y col. 1982. J. Mol. Bio. 157:105-132.

También puede realizarse sustitución de aminoácidos similares basándose en la hidrofilia, particularmente cuando se pretende usar el polipéptido o péptido equivalente funcional biológico creado de este modo en realizaciones inmunológicas: la Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101, indica que el mayor promedio local de hidrofilia de un polipéptido, como se gobierna por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica del polipéptido.

También pueden prepararse equivalentes biológicos de un polipéptido usando mutagénesis específica. La mutagénesis específica es una técnica útil en la preparación de polipéptidos de segunda generación, o polipéptidos

o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, derivados de las secuencias de los mismos, mediante mutagénesis específica del ADN subyacente. Dichos cambios pueden ser deseables cuando sean deseables sustituciones de aminoácidos. La técnica proporciona además una capacidad sencilla para preparar y ensayar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o más cambios de secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis específica permite la producción de mutantes mediante el uso de secuencias oligonucleotídicas específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebadores

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de suficiente tamaño y complejidad de secuencia para formar una doble cadena estable en ambos lados del punto de unión de deleción que se atraviesa. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, con de aproximadamente 5 a 10 restos en ambos lados del punto de unión de la secuencia que se altera.

En general, la técnica de mutagénesis específica se conoce bien en este campo. Como se apreciará, la técnica emplea típicamente un vector de fago que puede existir en una forma tanto monocatenaria como bicatenaria. Típicamente, la mutagénesis dirigida de acuerdo con la presente se realiza obteniendo en primer lugar un vector monocatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica toda o una parte de la secuencia polipeptídica de N. meningitidis seleccionada. Se prepara un cebador oligonucleotídico que porta la secuencia mutada deseada (por ejemplo, de forma sintética). Este cebador se hibrida después con el vector monocatenario, y se extiende mediante el uso de enzimas tales como fragmentos de Klenow de polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la cadena que porta la mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex en el que una cadena codifica la secuencia no mutada original y la segunda cadena porta la mutación deseada. Este vector de heterodúplex se usa después para transformar células apropiadas tales como células E. coli y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que portan la mutación. Los kits disponibles en el mercado vienen con todos los reactivos necesarios, excepto los cebadores oligonucleotídicos.

Los polipéptidos 2086 desvelados en el presente documento incluyen cualquier proteína o polipéptido que comprenda similitud de secuencia sustancial y/o equivalencia biológica a una proteína 2086 que tenga una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 2-252 de números pares. Además, un polipéptido 2086 como se define en las reivindicaciones adjuntas no se limita a una fuente particular. Por lo tanto, se desvela en el presente documento la detección general y el aislamiento de los polipéptidos de una diversidad de fuentes. Además, los polipéptidos 2086 pueden prepararse de forma recombinante, como se conoce bien en la técnica, basándose en las directrices proporcionadas en el presente documento, o de cualquier otra manera sintética, como se conocen en la técnica.

Un polipéptido 2086 puede escindirse provechosamente en fragmentos para su uso en análisis estructural o funcional adicional, o en la generación de reactivos tales como los polipéptidos relacionados con 2086 y anticuerpos específicos de 2086. Esto puede conseguirse tratando polipéptidos de N. meningitidis purificados o no purificados con una peptidasa tal como endoproteinasa glu-C (Boehringer, Indianápolis, IN). El tratamiento con CNBr es otro procedimiento por el que los fragmentos peptídicos pueden producirse a partir de polipéptidos 2086 de N. meningitidis naturales. También pueden usarse técnicas recombinantes para producir fragmentos específicos de una proteína 2086.

“Variante” como se usa el término en el presente documento, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia respectivamente, pero conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en su secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de los nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza posteriormente. Una variante típica de un polipéptido difiere en su secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. En general, las diferencias se limitan de modo que la secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean estrechamente similares en general y, en muchas regiones, idénticas (es decir, biológicamente equivalentes). Un polipéptido variante y de referencia pueden diferir en su secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar o no codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que se produzca de forma natural. Pueden prepararse variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.

La “identidad” como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre tramos de dichas secuencias. La “Identidad” y la “similitud” pueden calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitación los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Los procedimientos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J., y col 1984), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F., y col., 1990). El programa BLASTX está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.

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En consecuencia, pueden usarse anticuerpos monoclonales generados contra los polipéptidos de la presente divulgación para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados. Pueden usarse células del bazo de dichos ratones inmunizados para producir hibridomas anti-Id que secretan anticuerpos anti-Id monoclonales. Además, los anticuerpos anti-Id pueden acoplarse con un vehículo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) y usarse para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb final específico para un epítopo de R-PTPasa. Los anticuerpos anti-Id tienen por tanto sus epítopos idiotípicos, o “idiotopos” estructuralmente similares al epítopo que se evalúa, tal como polipéptidos de Streptococcus pyogenes.

También se entiende que el término “anticuerpo” incluye tanto moléculas intactas como fragmentos tales como Fab que son capaces de unirse con el antígeno. Los fragmentos Fab carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión tisular no específica que un anticuerpo intacto (Wahl y col., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316-325). Se apreciará que Fab y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden usarse para la detección y cuantificación de polipéptidos de N. meningitidis de acuerdo con los procedimientos para moléculas de anticuerpo intactas.

Los anticuerpos de la presente divulgación, tales como anticuerpos anti-idiotípicos (“anti-Id”), pueden emplearse en un procedimiento para el tratamiento o prevención de infección por Neisseria en huéspedes mamíferos, que comprende administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de anticuerpo, específica para un polipéptido como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo anti-Id también puede usarse como un “inmunógeno” para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal más, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. Por lo tanto, usando anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.

Los anticuerpos se usan de una diversidad de maneras, por ejemplo, para confirmación de que una proteína se expresa, o para confirmar cuándo una proteína se expresa. Puede incubarse anticuerpo marcado (por ejemplo, marcaje fluorescente para FACS) con bacterias intactas y la presencia del marcador en la superficie bacteriana confirma la localización de la proteína, por ejemplo.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos de la invención administrando los polipéptidos o fragmentos portadores de epítopos, análogos o células a un animal usando protocolos rutinarios. Para preparar anticuerpos monoclonales, se usa cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continuos.

Polinucleótidos

Como con las proteínas de la presente invención, un polinucleótido de la presente invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia de las SEQ ID NO: 55, 57, 59, de números impares, es decir, es 100 % idéntica o puede incluir hasta un número de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de nucleótidos, y en el que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones 5’ o 3’ terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 57, 59 de números impares por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en dicha secuencia.

Como ejemplo, sin pretender limitarse al mismo, un polinucleótido de N. meningitidis aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos 70 % de identidad con cualquier secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-253; una variante degradada de la misma o un fragmento de la misma, en la que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta nn alteraciones de ácido nucleico sobre la región polinucleotídica completa de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1-253; en la que nn es el máximo número de alteraciones y se calcula por la fórmula:

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en la que xn es el número total de ácidos nucleicos de cualquiera de SEQ ID NO: 1-253 e y tiene un valor de 0,70, en la que cualquier producto no entero de xn e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más cercano antes de restar dicho producto de xn. Por supuesto, y también tener un valor de 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 %, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 % etc. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2-252 pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento de fase en esta secuencia codificante y de este modo alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.

Ciertas realizaciones de la presente invención se refieren a polinucleótidos (denominados en el presente documento

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(continuación)

Condición de rigurosidad: Híbrido polinucleotídico Longitud del híbrido (pb)I Temperatura de hibridación y tampónH Temperatura de lavado y tampónH

L: ARN: ARN < 50 TL; 2xSSC TL; SSC2x

M: ADN:ADN > 50 50EC; SSC4x -o40EC; SSC6x, formamida al 50 % 50EC; SSC2x

N: ADN:ADN <50 TN; SSC6x TN; SSC6x

O: ADN:ARN > 50 55EC; SSC4x -o42EC; SSC6x, formamida al 50 % 55EC; SSC2x

P: ADN:ARN < 50 TP; SSC6x TP; SSC6x

Q: ARN: ARN > 50 60EC; SSC4x -o-45EC; SSC6x, formamida al 50 % 60EC; SSC2x

R: ARN: ARN < 50 TR; SSC4x TR; SSC4x

pbI: La longitud del híbrido es la anticipada para la región o regiones hibridadas de los polinucléotidos que hibridan. Cuando se hibrida un polinucleótido con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es la del polinucleótido que hibrida. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o las regiones de complementariedades de secuencia óptimas. tampónH: SSPE (SSPE1x es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituir a SSC (SSC1x es NaCl 15 M y citrato sódico 15 M) en los tampones de hibridación y lavado; se realizan lavados durante 15 minutos después de completarse la hibridación. TB hasta TR: La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipa que son de menos de 50 pares de bases de longitud debería ser de 5-10EC menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, cuando Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 2(nº de bases A + T) + 4(nº de bases G +C). Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41(% G+C) – (600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+]) para SSC1x = 0,165 M).

Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para la hibridación de polinucleótidos en Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4.

También se desvelan en el presente documento polinucleótidos que son completamente complementarios de estos polinucleótidos que también proporcionan secuencias antisentido.

Los polinucleótidos de la invención se preparan de muchas maneras (por ejemplo, por síntesis química, de bibliotecas de ADN, del organismo en sí mismo) y pueden tomar diversas formas (por ejemplo, monocatenarias, bicatenarias, vectores, sondas, cebadores). El término “polinucleótido” incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen cadenas principales modificadas.

Proteínas de fusión

También se desvelan en el presente documento proteínas de fusión. Una “proteína de fusión” se refiere a una proteína codificada por dos genes fusionados, con frecuencia no relacionados, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden diversas partes de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína inmunogénica o parte de la misma. En muchos casos, el empleo de una región Fc de inmunoglobulina como parte de una proteína de fusión es ventajoso para su uso en terapia y diagnóstico dando como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (véase, por ejemplo, documento EP 0 232 262 A1). Por otro lado, para algunos usos sería deseable poder suprimir la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado. Los polinucleótidos 2086 de la invención se usan para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir la secuencia codificante del polipéptido maduro, por sí sola, o la secuencia codificante del polipéptido maduro en fase de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre, o pro o prepro-proteína, u otras partes de péptidos de fusión. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación de un polipéptido 2086 o polipéptido fusionado (véase Gentz y col., 1989). Por lo tanto, se contempla en una implementación de la presente invención la preparación de polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión que permiten la purificación de marcador His de productos de expresión. El polinucleótido también puede contener secuencias 5’ y 3’ no codificantes, tales como secuencias transcritas, no traducidas, señales de corte y empalme y de poliadenilación. Dicho polipéptido fusionado puede producirse por una célula huésped transformada/transfectada o infectada o infectada con un vehículo de clonación de ADN recombinante como se describe posteriormente y puede aislarse posteriormente de la célula huésped para proporcionar el polipéptido fusionado sustancialmente sin otras proteínas de células huésped.

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inducen una respuesta bactericida heteróloga. Las fracciones obtenidas de IEF, que se centraron en el intervalo de pH 5,5-7,0, indujeron una respuesta heteróloga a la mayoría de las cepas como se determina por el ensayo bactericida. Las fracciones de IEF agrupadas se concentraron y se retiraron los anfolitos por precipitación con etanol. Se consiguió una purificación adicional adsorbiendo algunas de las proteínas obtenidas en el intervalo de pH

5 de aproximadamente 5,5-7,8 en una columna de intercambio aniónico y comparando la actividad bactericida obtenida de inmunizar a los ratones con las proteínas adsorbidas y no adsorbidas. En referencia de nuevo a la Tabla II, aunque muchas proteínas se adsorbieron en la resina de intercambio aniónico, las proteínas que no se adsorbieron por la columna indujeron más anticuerpos bactericidas heterólogos.

TABLA III

CB50 de la cepa diana

Procedimiento: Fracción H44/76 880049 H355 539* M982

sOMP sin LOS: 1.000 215 450 NC 50

Detergente Extracciones: Extracto citoplasmático 200 NT NT NT NT

TX-100: >800 >800 >800 >800 <25

Zwittergent 3-12: 400 >25 100 400 <25

Zwittergent 3-14: <25 NT NT NT NT

Zw.3-14 + NaCl: <25 NT NT NT NT

Sarcosilo: <25 NT NT NT NT

Zw.3-14 + calor: <25 NT NT NT NT

IEF Preparatorio: Fracciones 1-3 (pH 2,3-3,9) 50 NT NT NT NT

Fracción 4 (pH 4,1): >800 <25 100 <25 NT

Fracción 5 (pH 4,3): >800 <25 100 200 NT

Fracción 6 (pH 4,5): 400 NT NT NT NT

Fracción 7 (pH 4,8): <25 NT NT NT NT

Fracciones 8-9 (pH 5,0-5,3): <25 NT NT NT NT

Fracciones 10-17 (pH 5,5-7,8): >800 200 <800 <800 NT

Intercambio aniónico: Adsorbida 400 NT 100 100 NT

No adsorbida: >6.400 NT <800 <800 NT

NT: no ensayado *El aislado clínico 539 es una cepa homóloga de 8529, aislada del mismo brote

10 Como se muestra en la FIG. 1A, estaban presentes dos proteínas principales en la fracción no adsorbida como se determinó por SDS-PAGE. Para identificar estas proteínas, se realizaron dos tipos de análisis. Un análisis fue realizar degradación proteolítica limitada (Véase FIG. 1A y FIG. 1B) seguido de aislamiento de péptidos y secuenciación de proteínas directa. El otro análisis fue realizar SDS-PAGE seguido de escisión en gel, digestión

15 proteolítica y EM-CL/EM (Espectrometría de Masas en Tándem con Cromatografía Líquida), (véase FIG. 3) para obtener información espectral de masas sobre los componentes de las preparaciones de interés. (Véase procedimientos de mapeo y secuenciación de péptidos descritos posteriormente en esta sección).

La secuencia genómica de N. meningitidis A Sanger usando los procedimientos y algoritmos descritos en Zagursky y Russell, 2001, BioTechniques, 31:636-659. Este análisis de extracción produjo más de 12.000 posibles Marcos

20 Abiertos de Lectura (ORF). Tanto los datos de secuenciación directa como los datos espectrales de masas descritos anteriormente indicaron que los componentes principales de la fracción no adsorbida fueron los productos de varias ORF presentes en un análisis de la base de datos de Sanger. Las tres proteínas predominantes identificadas por esta metodología corresponden a las ORF 4431, 5163 y 2086 (véase FIGS. 1B y 3).

Aunque la ORF 4431 fue la proteína más predominante identificada en las fracciones, los anticuerpos de ratón para

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TABLA IV: CEBADORES

SEQ ID NO. (Compuesto Nº): Cebado r Secuencia Sitios de restricción

303 (4623): Inverso BamHI

304 (4624): Directo CTATTCTGCATATGACTAGGAGC NdeI

305 (4625): Directo AGCAGCGGAGGCGGCGGTGTC

306 (5005): Directo TGCCGATGCACTAACCGCACC

307 (5007): Inverso CGTTTCGCAACCATCTTCCCG

308 (5135): Inverso BglII

309 (5658): Directo GCGGATCCAGCGGAGGGGGTGGTGTCGCC BamHI

310 (5660): Inverso SphI

311 (6385): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGAAGC BamHI

312 (6406): Directo BglII y NdeI

313 (6470): Directo CTATTCTGCGTATGACTAG

314 (6472): Inverso GTCCGAACGGTAAATTATCGTG

315 (6473): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCC BamHI

316 (6474): Directo BglII y NdeI

317 (6495): Directo GACAGCCTGATAAACC

318 (6496): Inverso GATGCCGATTTCGTGAACC

319 (6543): Inverso GCGCATGCCTACTGTTTGCCGGCGATG SphI

320 (6605): Inverso BglII

321 (6721): Directo BglII y NdeI

Expresión de lipoproteínas de rLP2086 utilizando secuencia líder nativa:

En referencia a la FIG. 5, se transformó/transfectó o infectó con el plásmido pPX7340 células huésped BLR(DE3) pLysS (Life Sciences). Se seleccionó un transformante y se inoculó en 50 ml de Caldo de Cultivo Terrific que 5 contenía glucosa al 2 %, kanamicina (30 g/ml), cloranfenicol (30 g/ml) y tetraciclina (12 g/ml). La DO600 para el cultivo de una noche fue de 6,0. El cultivo de una noche se diluyó en 1 litro de Caldo de Cultivo Terrific con glicerol 1 % y los mismos antibióticos. La DO600 de partida fue de 0,4. Después de 2 horas la DO600 fue de 1,6 y se tomó una muestra pre-inducida. Se centrifugaron células equivalentes a una DO600 = 1 y se retiró el sobrenadante. El sedimento de células completas se resuspendió en 150 g de tampón Tris-EDTA y 150 l de tampón de muestras 10 SDS-PAGE 2x. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de 3,5 horas se tomó una muestra

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TABLA VI-A

Cepa: Serosubtipo Fuente

M97 251854: B:4z, PI:4 MPHL

M98 250622: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250572: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250771: B:4z, PI.22,14 MPHL

M98 250732: B:4z, PI.22,14a MPHL

M98 250809: B:15, PI:7,16 MPHL

M97 252697: B:1, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 252988: B:4, PI:6, P1.18,25,6 MPHL

M97 252976: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 252153: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 253248: B:15,PI:7, NT, 16 MPHL

CDC1610: P1:NT 4(15), P1.18-7,16-14 CDC

CDC1521: P1.6,3 2b(4) CDC

CDC1034: P1.7 4(15) CDC

L8: P1.7,1 15(4) Walter Reed

CDC1492: P1.7,1 4(15) CDC

870446: P1.12a,13 RIVM

CDC2369: P1.(9),14 CDC

6557: P1.(9),14, P1.22a,14a RIVM

2996: P1.5,2, P1.5a,2c RIVM

NmB: P1.5,2, P1.5a,2c UIOWA

L3: P1.5,2 Walter Reed

B16B6: P1.5,2 RIVM

CDC1135: CDC

L5: P1.NT, P1.21-6,1 Walter Reed

L4: P1.21,16 Walter Reed

W135: Walter Reed

C11: C:16, P1.7,1 CDC

Y: Walter Reed

TABLA VI-B

Cepa: Serosubtipo Fuente

M98 250670: B:1, PI:4 MPHL

M98 250024: B:1, PI:4 MPHL

M97 253524: B:1, PI:4 MPHL

M97 252060: B:1, PI:4 MPHL

M97 251870: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251836: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251830: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251905: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251898: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251885: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251876: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251994: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251985: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251957: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251926: B:4z, PI:4 MPHL

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(continuación)

Cepa: Serosubtipo Fuente

M97 252045: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252038: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252026: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252010: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252098: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252083: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252078: B:4z, PI:4 MPHL

M98 250735: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250797: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250768: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250716: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250699: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250393: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250173: B:4z,PI:10 MPHL

M97 253462: B:4z, PI:14 MPHL

M98 250762: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250610: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250626: B:15, PI:7,16 MPHL

M97 250571: B:15, PI:16 MPHL

M97 252097: B:15, PI:16, PI.7b,16 MPHL

M97 253092: B:1, PI:6 MPHL

M97 252029: B:15,PI:7, NT MPHL

M97 251875: B:15,PI:7, NT MPHL

CDC1127: PI.7,16 4(15) CDC

CDC982: PI.7,16 4(15) CDC

CDC1359: PI.7,16 4(15) CDC

CDC798: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1078: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1614: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1658: PI.7,16 15(4) CDC

H44/76: PI.7,16 15(4) RIVM

CDC1985: P1.7,13 4(15) CDC

L6: P1.7,1 ?(4) Walter Reed

CDC1573: P1.7,1 4(15) CDC

L7: P1.7,(9),1 Walter Reed

CDC937: P1.7,3, P1.7b,3 CDC

8529: P1.7,3, P1.7b,3 RIVM

880049: P1.7b,4 RIVM

CDC2367: P1.15 4(15) CDC

H355: P1.19,15 RIVM

CDC1343: P1.14 4(15) CDC

M982: P1.22,9 RIVM

870227: P1.5c,10 RIVM

B40: P1.5c,10 RIVM

5315: P1.5c,10 RIVM

CDC983: P1.5,2 CDC

CDC852: P1.5,2 CDC

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TABLA XIX

Variantes de rLP2086 de Subfamilia -Caracterización

rLP2086-8529: rLP2086-M982 rLP2086-80049 rLP2086-CDC1573

Medio de cultivo: Apollon (Sanford) Apollon HySoy HySoy

Solubilidad: Urea 4 M ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100

Etapas de purificación: TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE SEC

Pureza (%): 96 96 90 93

Rendimiento (mg/g de sedimento celular): 0,2 (fermentador) 1,6 (fermentador) 0,4 1,0

Tamaño: SEC (Z3-12) 95.000 110.000 150.000 100.000 120.000

EM: 27.785 (822 lípido) 27.719 (711 lipid) 28.044 (819 lípido) 28.385 (823 lípido)

Punto medio de transición de desnaturalización térmica (TM) ºC: 70 °C 75 °C 62 °C NT

Proteína disponible (mg): Urea – 34 mg Sarc – 36 mg Grupo 1 – 47 mg Grupo 2 – 17 mg 3,6 mg 4,9 mg

Homología de secuencia de 8529 (%): 100 94 92 87

La Tabla XX a continuación proporciona los resultados de ensayos bactericidas en suero fluorescentes para la Subfamilia A de 2086.

TABLA XX

Descripción: 250771 870446 6557 NMB M98 250732 M97 252697

rLP2086-252988, 10 g: >800 (99 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (99 %)* >800 (93 %)*

rLP2086-C11, 10 g: 200 >880 (91 %)* <25 - 200 400

rLP2086-250771, 10 g: >800 (92 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (96 %)* >800 (84 %)*

rLP2086-870446, 10 g: 400 >800 (99 %)* <25 - 400 400

rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (93 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (80 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rP1,22a,14a + rP1,5a,2c, 10 g: - 800 200 >800 (98 %)* - -

rLP2086-8529 +rLP2086-2996 + rP1,22a,14a +rP1,5a,2c, 10 g: 400 >800 (99 %)* 200 >800 (99 %)* 400 >800 (88 %)*

Vesículas de NMB/rLP2086-8529, 20 g: - 100 - 400 - -

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Claims

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