ES2573277T3

ES2573277T3 - Métodos, composiciones y kits de generación de muestras empobrecidas en ARNr o de aislamiento del ARNr de las muestras

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Publication number: ES2573277T3
Application number: ES14181813.8T
Authority: ES
Inventors: Roy R. Sooknanan
Original assignee: Epicentre Technologies Corp
Current assignee: Epicentre Technologies Corp
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2016-06-07
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: US20180044660A1; DK2816111T3; US20140235847A1; CN102625838B; US9745570B2; EP2816111B1; EP2464729B1; EP2816111A1; EP2464729B9; WO2011019993A3; EP2464729A2; EP2464729A4; HK1205190A1; WO2011019993A2; US10435683B2; CN102625838A; DK2464729T3; US20110040081A1

Abstract

Una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido, en la que dichas moléculas de ARNr antisentido comprenden múltiples moléculas de ARNr antisentido diferentes complementarias a sustancialmente la totalidad de las secuencias presentadas por moléculas de ARNr seleccionadas de los grupos que consisten en: al menos cuatro moléculas de ARNr seleccionadas entre moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S; dos moléculas de ARNr que consisten en moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S; cuatro moléculas de ARNr que consisten en moléculas de ARNr cloroplástico eucariota 16S, 23S, 4,5S y 5S; y tres moléculas de ARNr que consisten en moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S; donde dichas moléculas de ARNr antisentido comprenden marcadores de afinidad en una proporción de al menos un marcador de afinidad por cada 10 nucleobases de dichas moléculas de ARNr antisentido, o donde dichas moléculas de ARNr antisentido comprenden marcadores de afinidad en una proporción de al menos un marcador de afinidad por cada 8 nucleobases de dichas moléculas de ARNr antisentido.

Description

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una parte de una primera cadena el fragmento de ADN genómico, y siendo el segundo cebador de cada dicho al menos un par de cebadores complementario a una parte de la segunda cadena del fragmento de ADN genómico, e incubar en condiciones en las que se generen copias de ADN bicatenario que contengan el promotor de la ARN polimerasa de al menos una parte del fragmento de ADN genómico, en la que el promotor de la ARN polimerasa es

5 capaz de dirigir la síntesis de ARN del ARN antisentido correspondiente a la totalidad de la al menos una molécula de ARNr; o: ii) ligar dicho fragmento de ADN genómico o un producto de amplificación por PCR del mismo en un vector de ADN que comprenda un promotor de ARN polimerasa, obteniéndose un clon genómico, en la que el promotor de la ARN polimerasa de dicho clon genómico es capaz de dirigir la síntesis del ARN antisentido que sea complementario a la al menos una molécula de ARNr usando dicho ADN bicatenario que está ligado en dicho vector de ADN como molde.

[0021] En algunas realizaciones de los métodos de generación de moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y de las composiciones generadas usando el método, las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad no presentan ninguna secuencia espaciadora transcrita interna de ARNr. En algunas otras realizaciones, las

15 moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad presentan secuencias espaciadoras transcritas internas seleccionadas entre: i) una secuencia presentada por la región espaciadora de ARNr de ITS1, que está ubicada entre un gen de ARNr 18S eucariota y un gen de ARNr 5,8S eucariota; ii) una secuencia presentada por la región espaciadora de ARNr de ITS2, que está ubicada entre un gen de ARNr 5,8S eucariota y un gen de ARNr 18S eucariota; iii) una secuencia presentada por una ITS 16S-23S procariota; e iv) una secuencia presentada por una ITS de ARNr 23S-5S procariota.

[0022] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión que comprende moléculas de unión a marcadores de afinidad, en la que las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad, solas o en

25 combinación, presentan secuencias correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr de longitud completa seleccionada entre: moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S.

[0023] Una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión que comprende moléculas de unión a marcadores de afinidad se genera mediante la incubación de la composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad con una matriz de unión que comprende moléculas de unión a marcadores de afinidad en condiciones de unión, en la que el marcador de afinidad se une a las moléculas de unión a marcadores de afinidad que están unidas a la matriz o al soporte sólido (por ejemplo, micropartículas), formándose un par de unión específico. En algunas realizaciones, el presente método

35 comprende además la etapa de lavar la composición en condiciones en las que se retiren las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que no se unan específicamente a la matriz de unión, generando así una composición purificada que comprenda moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que se unan a la matriz de unión.

[0024] En realizaciones particulares de dicho aspecto de la invención, la composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión puede ser cualquier composición de moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad descrita en el presente documento, y se puede generar usando cualquier método de generación de una composición que comprenda moléculas de ARNr antisentido descrita en el presente documento.

45 [0025] En una realización particular de esta composición, las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad comprenden biotina como marcador de afinidad, en la que la biotina se une a al menos aproximadamente dos nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido y la matriz de unión comprende una micropartícula a la que se une una molécula de unión a marcador de afinidad que comprende estreptavidina o avidina. En algunas otras realizaciones de esta composición, las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad comprenden biotina como marcador de afinidad, en la que la biotina se une a al menos aproximadamente dos a cuatro nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido, o a al menos tres a cinco nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido, o a al menos cuatro a seis nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido, o a al menos seis a ocho

55 nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido.

[0026] En algunas realizaciones de la invención, se usa cualquiera de las composiciones que comprenden moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad, incluyendo cualquiera de las composiciones que comprenden moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión, en un método de la invención para generar una muestra empobrecida en ARNr o para aislar esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa.

[0027] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de generación de una muestra 65 empobrecida en ARNr a partir de una muestra inicial que comprenden: a) proporcionar i) una muestra inicial que

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empobrecida en ARNr a partir de una muestra inicial que comprenden: a) proporcionar; i) una muestra inicial que comprende moléculas de ARN, en la que las moléculas de ARN comprenden moléculas de ARNr y al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés; ii) una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad complementarias a esencialmente la totalidad de la secuencia presentada por la al menos 5 una molécula de ARNr seleccionada entre: moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S; e iii) una matriz de unión (por ejemplo, micropartículas) que comprende moléculas de unión a marcadores de afinidad; b) poner en contacto la muestra inicial con la composición en condiciones que permitan que al menos parte de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y al menos parte de las moléculas de ARNr formen híbridos de ARNr bicatenarios, generando así una muestra tratada; c) poner en contacto la muestra tratada con la matriz de unión en condiciones que permitan que al menos una parte de los híbridos de ARNr bicatenarios se unan a la matriz de unión y se retiren de la muestra tratada, generando así una muestra empobrecida en ARNr, en la que la muestra empobrecida en ARNr comprende esencialmente la totalidad (por ejemplo, >90 %..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ..., o >99,9 %) de la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés presente en la muestra

15 inicial) y en la que, la muestra empobrecida en ARNr bien: i) está >99,0 % exenta (por ejemplo, >99,0 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 %, 99,95 % o 99,99 % exenta) de moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan una secuencia de al menos una molécula de ARNr presente en la muestra inicial, o ii) contiene niveles no detectables de la al menos una molécula de ARNr de la muestra inicial medidos usando electroforesis de gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio.

[0032] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de generación de una muestra empobrecida en ARNr a partir de una muestra inicial que comprenden: a) proporcionar i) una muestra inicial que comprende moléculas de ARN, en la que las moléculas de ARN comprenden moléculas de ARNr y al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés; e ii) una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido 25 marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión (por ejemplo, micropartículas que comprenden moléculas de unión a marcadores de afinidad), en la que las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad, solas o en combinación, presentan secuencias correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr de longitud completa seleccionada entre: moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S; b) poner en contacto la muestra inicial con la composición en condiciones que permitan que al menos parte de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad de la composición y al menos parte de las moléculas de ARNr formen híbridos de ARNr bicatenarios que se unan a la matriz de unión, generando así una muestra tratada; y c) retirar la matriz de unión a la que se han unido los híbridos de ARNr bicatenarios, generando así una muestra empobrecida en ARNr, en la que la muestra empobrecida en ARNr: i) está esencialmente exenta de 35 secuencias de ARNr presentadas por la al menos una molécula de ARNr y comprende esencialmente la totalidad de la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés presente en la muestra inicial (por ejemplo, al menos >90 % ..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ..., o >99,9 % de la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés presente en la muestra inicial) e ii) bien, está esencialmente exenta (por ejemplo, >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ..., o >99,9 % exenta) de secuencias de ARNr presentadas por la al menos una molécula de ARNr presente en la muestra inicial o contiene niveles no detectables de la al menos una molécula de ARNr de la muestra inicial medidos usando electroforesis de gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. En realizaciones particulares del presente método de la invención, la composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión es cualquier composición de moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad descrita en el presente documento y/o se genera usando cualquier método de

45 generación de una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido descrita en el presente documento.

[0033] En realizaciones particulares de cualquiera de los métodos de generación de una muestra empobrecida en ARNr, la muestra empobrecida en ARNr está un 98,0 % exenta de moléculas de ARNr que presentan secuencias de la al menos una molécula de ARNr (por ejemplo, 98,0 % exenta, 98,5 % exenta, 99,0 % exenta, 99,5 % exenta, 99,7 % exenta, 99,9 % exenta, 99,99 % exenta o 100 % exenta). En otras realizaciones, la al menos una molécula de ARNr incluye tanto el ARNr 28S como el ARNr 18S, y la muestra empobrecida en ARNr está 99,0 % exenta (por ejemplo, 99,5 % exenta) de moléculas de ARNr que presentan secuencias del gen de ARNr 28S y del gen de ARNr 18S. En otras realizaciones, la muestra empobrecida en ARNr contiene niveles no detectables de moléculas de ARNr que presentan secuencias de la al menos una molécula de ARNr (por ejemplo, no detectables medidos 55 usando electroforesis de gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio). En algunas realizaciones del método, la composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad no presenta ninguna secuencia espaciadora transcrita interna de ARNr. En algunas otras realizaciones del método, la composición que comprende las moléculas de ARNr antisentido presenta secuencias espaciadoras transcritas internas seleccionadas entre: i) una secuencia presentada por la región espaciadora de ARNr de ITS1, que está ubicada entre un gen de ARNr 18S eucariota y un gen de ARNr 5,8S eucariota; ii) una secuencia presentada por la región espaciadora de ARNr de ITS2, que está ubicada entre un gen de ARNr 5,8S eucariota y un gen de ARNr 28S eucariota; iii) una secuencia presentada por una ITS 16S-23S procariota; e iv) una secuencia presentada por una ITS de ARNr 23S-5S procariota. En realizaciones particulares de los métodos de generación de muestras empobrecidas en ARNr o de aislamiento del ARNr de una muestra, la etapa b) se realiza usando una composición que comprende moléculas de 65 ARNr antisentido que no presentan ninguna secuencia espaciadora transcrita interna de ARNr, mientras que, en

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ejemplo, una célula presentadora de antígeno (APC), tal como una célula dendrítica, un macrófago o una APC artificial para uso inmunoterapéutico). En algunas realizaciones, la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés o un producto de amplificación de la misma se usa para la transfección de una célula humana o animal del mismo individuo del que se obtuvo la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés (por ejemplo, para 5 fabricar una vacuna que comprenda la célula transfectada en APC para uso inmunoterapéutico para tratar una enfermedad, por ejemplo, cáncer, en un individuo humano o animal). En algunas realizaciones, la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés o un producto de amplificación de la misma se usa para la transfección de una célula de un ser humano o animal diferente de la célula de la que se obtuvo la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés (por ejemplo, para fabricar una vacuna que comprenda la célula transfectada en APC para uso inmunoterapéutico para tratar una enfermedad, por ejemplo, cáncer, en un individuo humano o animal). En ciertas realizaciones, la vacuna de ARN se fabrica usando la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés de un primer individuo, y la vacuna de ARN se usa para vacunar a un segundo individuo. En algunas realizaciones del método de generación de una muestra empobrecida en ARNr, el método comprende además el uso de la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés o un producto de amplificación de

15 la misma para fabricar una vacuna de ARN de uso terapéutico. En algunas realizaciones del método, la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés o un producto de amplificación de ARN sentido de la misma se usa para fabricar una vacuna de ARN que se usa para inocularla directamente en un paciente para uso terapéutico. En algunas realizaciones, la vacuna de ARN se fabrica usando la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés de una célula, de un tejido o de un órgano de un primer individuo y la vacuna de ARN se administra a dicho primer individuo como un tratamiento inmunoterapéutico. En algunas realizaciones, la vacuna de ARN se fabrica usando la al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés de un primer individuo y la vacuna de ARN se usa para vacunar a un segundo individuo.

[0036] En otras realizaciones más, la invención proporciona métodos de uso de la composición que comprende

25 moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad de aislamiento de esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan una secuencia de la al menos una molécula de ARNr de longitud completa seleccionada entre moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y 23S, moléculas de ARNr procariota 16S y 5S.

[0037] Así pues, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de aislamiento de esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa, método que comprende: a) proporcionar i) una muestra inicial que comprende moléculas de ARN, en la que las moléculas de ARN comprenden moléculas de ARNr y moléculas de ARN distinto de ARNr; ii) una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad 35 que presenta secuencias correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr de longitud completa seleccionada entre: moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S; e iii) una matriz de unión (por ejemplo, micropartículas) que comprenden moléculas de unión a marcadores de afinidad; b) poner en contacto la muestra inicial con la composición en condiciones que permitan que al menos parte de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y al menos parte de las moléculas de ARNr formen híbridos de ARNr bicatenario, generando así una muestra tratada; c) poner en contacto la muestra tratada con la matriz de unión en condiciones que permitan que al menos una parte de los híbridos de ARNr bicatenarios se unan a la matriz de unión; d) retirar la matriz de unión a la que se han unido los híbridos de ARNr bicatenarios que comprenden las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y la al menos parte de las moléculas de ARNr de la muestra

45 tratada; y e) incubar la matriz de unión en una solución en condiciones en las que la al menos parte de las moléculas de ARNr de la muestra tratada se liberen en la solución, aislando así esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan una secuencia de al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial (por ejemplo, al menos >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ... o >99,9 % de la al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial).

[0038] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de aislamiento de esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa, método que comprenden: a) proporcionar i) una muestra inicial que comprende moléculas de ARN, en la que las moléculas de ARN comprenden moléculas de ARNr y moléculas de 55 ARN distinto del ARNr; ii) una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que presentan secuencias correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr de longitud completa seleccionada entre: moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S; e iii) una matriz de unión (por ejemplo, micropartículas) que comprenden moléculas de unión a marcadores de afinidad; b) poner en contacto la muestra inicial con la composición en condiciones que permitan que al menos parte de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y al menos parte de las moléculas de ARNr formen híbridos de ARNr bicatenarios, generando así una muestra tratada; c) poner en contacto la muestra tratada con la matriz de unión en condiciones que permitan que al menos una parte de los híbridos de ARNr bicatenarios se una a la matriz de unión; d) retirar la matriz de unión a la que se han unido los híbridos de ARNr bicatenarios que comprenden las 65 moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y la al menos parte de las moléculas de ARNr de la muestra

tratada; y e) incubar la matriz de unión en una solución en condiciones en las que la al menos parte de las moléculas de ARNr de la muestra tratada se liberen en la solución, generando así una muestra de ARNr aislada que comprende esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan una secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial (por ejemplo, al

5 menos >90 % ..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ... o >99,9 % de la al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial) y en la que la muestra de ARNr aislada está esencialmente exenta (por ejemplo, al menos >90 % ..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ... o >99,9 % exenta) de las moléculas de ARN distinto del ARNr presentes en la muestra inicial.

[0039] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de aislamiento de esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa, método que comprende: a) proporcionar i) una muestra inicial que comprende moléculas de ARN, en la que las moléculas de ARN comprenden moléculas de ARNr y moléculas de ARN distinto del ARNr; ii) una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad 15 que presenta secuencias correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr de longitud completa seleccionada entre: moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S; e iii) una matriz de unión (por ejemplo, micropartículas) que comprenden moléculas de unión a marcadores de afinidad; b) poner en contacto la muestra inicial con la composición en condiciones que permitan que al menos parte de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y al menos parte de las moléculas de ARNr formen híbridos de ARNr bicatenarios, generando así una muestra tratada; c) poner en contacto la muestra tratada con la matriz de unión en condiciones que permitan que al menos una parte de los híbridos de ARNr bicatenarios se unan a la matriz de unión; d) retirar la matriz de unión a la que se unen los híbridos de ARNr bicatenarios que comprenden las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad y la al menos parte de las moléculas de ARNr de la muestra

25 tratada; y e) incubar la matriz de unión en una solución en condiciones en las que la al menos parte de las moléculas de ARNr de la muestra tratada se liberen en la solución, generando así una muestra de ARNr aislada que comprende esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan una secuencia de al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial (por ejemplo, al menos >90 % ..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ... o >99,9 % de la al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial) y en la que, bien i) la muestra de ARNr aislada está esencialmente exenta (por ejemplo, al menos >90 % ..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ... o >99,9 % exenta) de las moléculas de ARN distinto del ARNr presentes en la muestra inicial, o ii) contiene niveles no detectables de ARN distinto del ARNr de la muestra inicial medidos usando electroforesis de gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio.

35 [0040] En algunas realizaciones de los métodos de aislamiento de esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa, la muestra de ARNr aislada procede de una muestra inicial (por ejemplo, que comprende una muestra biológica, incluyendo una muestra médica, tal como saliva, esputo, heces, orina o una muestra celular, tisular u orgánica, una muestra medioambiental, una muestra metagenómica o cualquier otro tipo de muestra que pueda contener el ARN de interés), independientemente de que la muestra no se prepare o se prepare (por ejemplo, por fijación usando una solución, por ejemplo, formalina o etanol; montaje en un portaobjetos; o mediante el uso de otros procedimientos conocidos en la técnica) y el ARNr aislado se analiza para determinar el género, la especie o la cepa de origen, indicando así qué género, especie o cepa en particular estaba presente en la muestra inicial y, por lo

45 tanto, en la muestra o entorno en particular del que se recogió la muestra. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el método se usa para identificar y estudiar los organismos presentes en un “microbioma” de ser humano, animal o planta, por ejemplo, para aplicaciones de investigación, medicina o agricultura. En algunas realizaciones, la muestra de ARNr aislada procede de una muestra inicial que comprende una muestra de una muestra humana, animal o vegetal que se proporciona para ensayos o análisis de diagnóstico o teranóstico médico (por ejemplo, para detectar un microorganismo patógeno, tal como un patógeno fungicida o bacteriano, que esté o pueda estar relacionado con

o sea causante de un estado patológico, por ejemplo, una bacteria patógena que se pueda detectar o diagnosticar basándose en el análisis de al menos una molécula de ARNr, por ejemplo, según lo descrito por Chakravorty, S. et al., J. Microbiol. Methods 69: 330-339, 2007 y por Millar, B. C. et al. en Current Issues Mol. Biol. 9: 30 21-40, 2007). En algunas realizaciones, la muestra de ARNr asilada se analiza usando cualquiera de los muchos métodos de

55 secuenciación de nueva generación conocidos en la técnica (por ejemplo, tras el marcaje del extremo 3’, o de los extremos 3’ y 5’ de las moléculas aisladas de ARNr y de su transcripción inversa para fabricar moldes de ADN monocatenario lineal marcado o desmarcado, o moldes de ADN monocatenario circular para la secuenciación de nueva generación (por ejemplo, usando una plataforma de secuenciación Roche 454™, Illumina Solexa™, Life Technologies SOLID™, Pacific Biosciences, Intelligent Biosistemas, Helicos, Qiagen, u otra plataforma de secuenciación de nueva generación). En otras realizaciones más, la muestra de ARNr aislada se analiza mediante PCR en tiempo real.

[0041] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de aislamiento de esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia en al menos una 65 molécula de ARNr de longitud completa, método que comprende: a) proporcionar i) una muestra inicial que

comprende moléculas de ARN, en la que las moléculas de ARN comprenden moléculas de ARNr y moléculas de ARN distinto del ARNr; e ii) una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión (por ejemplo, micropartículas que comprenden moléculas de unión a marcadores de afinidad), en la que las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad, solas o en 5 combinación, presentan secuencias correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr de longitud completa seleccionada entre: moléculas de ARNr citoplasmático eucariota 25S, 26S, 28S, 18S, 5,8S y 5S, moléculas de ARNr mitocondrial eucariota 12S y 16S, y moléculas de ARNr procariota 23S, 16S y 5S; b) poner en contacto la muestra inicial con la composición en condiciones que permitan que al menos algunas de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad de la composición y al menos parte de las moléculas de ARNr formen híbridos de ARNr bicatenarios que se unan a la matriz de unión, generando así una muestra tratada; y c) retirar la matriz de unión a la que están unidos los híbridos de ARNr bicatenarios, aislando así esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa. En algunas realizaciones del presente método, el método comprende además la etapa de lavar la matriz de unión a la que están unidos los híbridos de ARNr bicatenarios para retirar las 15 moléculas de ARN distinto del ARNr no unidas específicamente de la muestra. En algunas realizaciones, la muestra tratada se conserva sobre la matriz de unión para su futuro análisis o uso. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de incubar la matriz de unión en una solución en condiciones en las que la al menos parte de las moléculas de ARNr de la muestra tratada se liberen en la solución, generando así una solución de la muestra de ARNr aislada que comprende esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan una secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial (por ejemplo, al menos >90 % ..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ...o >99,9 % de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan una secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa presente en la muestra inicial) y en la que, bien i) la muestra de ARNr aislada está esencialmente exenta (por ejemplo, al menos >90 % ..., >95 % ..., >98 % ..., >99 % ..., >99,8 % ... o >99,9 % exenta)

25 de las moléculas de ARN distinto del ARNr presentes en la muestra inicial, o ii) contiene niveles no detectables de ARN distinto del ARNr de la muestra inicial medidos usando electroforesis de gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. En algunas realizaciones, la muestra de ARNr aislada es de una muestra medioambiental o metagenómica, y el ARNr aislado se analiza para determinar los géneros, las especies o las cepas que estaban presentes en la muestra y, por lo tanto, el ambiente particular del que se recogió la muestra. En algunas realizaciones, la muestra de ARNr aislada se analiza (por ejemplo, mediante secuenciación de nueva generación, PCR de transcripción inversa en tiempo real u otro método, tal como un método descrito en cualquier parte del presente documento).

[0042] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos de la invención de generación de una muestra

35 empobrecida en ARNr o de aislamiento de esencialmente la totalidad de las moléculas de ARN que, bien solas o en combinación, presentan la secuencia de al menos una molécula de ARNr de longitud completa, el método usa cualquiera de las composiciones que comprenden moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad obtenidas usando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para generar moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad.

[0043] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos de generación de una muestra empobrecida en ARNr o de aislamiento de esencialmente la totalidad del ARNr que, bien solas o en combinación, presenta una secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa a partir de una muestra inicial, la composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que están unidas a una matriz de unión

45 comprende biotina como marcador de afinidad, en la que la biotina se une a al menos aproximadamente dos a ocho nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido, y la matriz de unión comprende micropartículas a las que la estreptavidina y la avidina se unen como molécula de unión a marcador de afinidad. En algunas otras realizaciones del presente método, las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad comprenden biotina como marcador de afinidad, en las que la biotina se une a al menos aproximadamente dos a cuatro nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido, o a al menos aproximadamente tres a cinco nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido, o a al menos aproximadamente cuatro a seis nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido, o a al menos aproximadamente seis a ocho nucleobases por cada cien nucleobases de las moléculas de ARNr antisentido.

55 [0044] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos de la invención de generación de una muestra empobrecida en ARNr o de aislamiento de esencialmente la totalidad del ARNr que, bien solo o en combinación, presenta una secuencia en al menos una molécula de ARNr de longitud completa a partir de una muestra inicial, la muestra inicial contiene ARN degradado, y el método se usa para generar una muestra empobrecida en ARNr para su posterior análisis y uso. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra inicial es una muestra de FFPE que contiene ARN degradado, y el método se usa para generar una muestra empobrecida en ARNr que contenga al menos una molécula de ARN distinto del ARNr de interés, en el que la muestra empobrecida en ARNr se usa para analizar la expresión o expresión relativa de una o más moléculas de ARN, seleccionadas entre ARNm, ARNim, ARNnc, ARNpiwi y ARN que comprende el transcriptoma completo (menos el ARNr) de una o varias células, tejidos,

65 órganos u organismos, seleccionándose el método de análisis entre análisis de micromatrices (por ejemplo,

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[0067] En otras realizaciones de un kit o sistema, las composiciones que comprenden moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad corresponden a al menos el 95,0 % de la totalidad de la al menos una secuencia de ARNr (por ejemplo, 95,0 % … 95,5 % ... 96,0 % ... 96,5 % ...97,0 % ... 97,5 % ... 98 % ... 98,5 % ... 99,0 % ... 99,5 % ... 99,9 ... o 100 % de la al menos una molécula de ARNr (por ejemplo, en las que las composiciones

5 comprenden moléculas de ARNr antisentido que presentan, solas o en combinación, secuencias correspondientes a la totalidad de la secuencia de ARNr de longitud completa para una determinada molécula de ARNr).

Breve descripción de las figuras

10 [0068] El anterior sumario y la descripción se entienden mejor cuando se leen en combinación con las figuras anexas que se incluyen a modo de ejemplo y no a modo de limitación.

La Figura 1A muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que contiene los siguientes amplicones de PCR: Carril M-escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -300 ng de amplicón de PCR para ARNr 18S

15 humano; Carril 2 -300 ng de amplicón de PCR para ARNr 5,8S humano; Carril 3 -300 ng de amplicón de PCR para ARNr 5S humano; Carril 4 -300 ng de amplicón de PCR para segmento 5’ de ARNr 23S de E. coli; Carril 5 300 ng de amplicón de PCR para segmento 3’ de ARNr 23S de E. coli; Carril 6 -300 ng de amplicón de PCR para ARNr 16S de E. coli; y Carril 7 -300 ng de amplicón de PCR para ARNr 5SS de E. coli. La Figura 1B muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que contiene las siguientes secuencias

20 antisentido: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -300 ng de ARNr 18S antisentido humano; Carril 2 -300 ng de ARNr 5,8S antisentido humano; Carril 3 -300 ng de ARNr 5S antisentido humano; Carril 4 300 ng de segmento 5’ de ARNr 23S de E. coli; Carril 5 -300 ng de segmento 3’ de ARNr 23S de E. coli; Carril 6 -300 ng de ARNr 16S antisentido de E. coli; y Carril 7 -300 ng de ARNr 5S antisentido de E. coli. La Figura 1C muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que contiene los siguientes carriles: Carril

25 M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -300 ng de ARNr antisentido biotinilado 28S a base de T7; y Carril 2 -300 ng de ARNr antisentido biotinilado 28S a base de SP6. La Figura 2A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARNr antisentido biotinilado tras la purificación con microesferas directamente sobre la columna; Carril 2 -ARNr antisentido biotinilado tras la purificación del sobrenadante tras la extracción de las microesferas; y Carril 3 -control de ARNr

30 antisentido biotinilado. La Figura 2B muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -control de ARNr antisentido biotinilado; Carril 2 -ARNr antisentido biotinilado tras la purificación tras 20 μl de microesferas; Carril 3 -ARNr antisentido biotinilado tras la purificación tras 2 x 20 μl de microesferas; y Carril 4 -ARNr antisentido biotinilado tras la purificación tras 40 μl de microesferas.

35 La Figura 3A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARNr antisentido biotinilado al 10 % menos microesferas; Carril 2 -ARNr antisentido biotinilado al 10 % más 20 μl de microesferas; Carril 3 -ARNr antisentido biotinilado al 10 % más 40 μl de microesferas; Carril 4 -ARNr antisentido biotinilado al 20 % menos microesferas; Carril 5 -ARNr antisentido biotinilado al 20 % más 20 μl microesferas; y Carril 6 -ARNr antisentido biotinilado al 20 % más 40 μl microesferas.

40 La Figura 3B muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARNr antisentido biotinilado al 35 % menos microesferas de estreptavidina; Carril 2 -ARNr antisentido biotinilado al 35 % más microesferas de estreptavidina; Carril 3 -ARNr antisentido biotinilado al 50 % menos microesferas de estreptavidina; Carril 4 -ARNr antisentido biotinilado al 50 % más microesferas de estreptavidina; Carril 5 -ARNr antisentido biotinilado al 60 % menos microesferas de estreptavidina; y Carril 6 -ARNr antisentido biotinilado al

45 60 % más microesferas de estreptavidina. La Figura 3C muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -PCR de ARNr antisentido biotinilado al 35 % menos microesferas de estreptavidina; Carril 2 -PCR de ARNr antisentido biotinilado al 35 % más microesferas de estreptavidina; Carril 3 -PCR de ARNr antisentido biotinilado al 50 % menos microesferas de estreptavidina; Carril 4 -PCR de ARNr antisentido biotinilado al 50 % más microesferas

50 de estreptavidina; Carril 5 -PCR de ARNr antisentido biotinilado al 60 % menos microesferas de estreptavidina; y Carril 6 -PCR de ARNr antisentido biotinilado al 60 % más microesferas de estreptavidina. El Panel 1 muestra cebadores de ARNr 23S-5’. El Panel 2 muestra cebadores de ARNr 23S-3’. El Panel 3 muestra cebadores de ARNr 16S-5’. El Panel 4 muestra cebadores de ARNr 16S-3’. La Figura 4 muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -Sustracción de la

55 mezcla de ARN total de L. plantarum más ARNr antisentido biotinilado de E. coli; y Carril 2 -Sustracción de la mezcla de ARN total de L. plantarum menos ARNr antisentido biotinilado de E. coli. La Figura 5, paneles A -D, que muestran lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carriles 1, 2 -resultado de la PCR para 50 ng ARN total de E. coli de entrada más sustracción; Carriles 3, 4 -resultado de la PCR para 100 ng ARN total de E. coli de entrada más sustracción; Carriles 5, 6 -resultado de la PCR para 500

60 ng ARN total de E. coli de entrada más sustracción; Carriles 7, 8 -resultado de la PCR para 1.000 ng ARN total de E. coli de entrada más sustracción; Carriles 9, 10 -resultado de la PCR para 2.500 ng ARN total de E. coli de entrada más sustracción; Carriles 11, 12 -resultado de la PCR para 5.000 ng ARN total de E. coli de entrada más sustracción; Carriles 13, 14 -resultado de la PCR para 500 ng ARN total de E. coli de entrada menos sustracción; y Carril 15 -resultado de PCR para la reacción de control sin molde. El Panel 5A muestra la RT-PCR

65 de ARNr 23S-5’. El Panel 5B muestra la RT-PCR de ARNr 16S-5’. El Panel 5C muestra la RT-PCR de ARNr 5S.

El Panel 5D muestra la RT-PCR de ARNm de ompA. La Figura 6A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -300 ng de ARN total de E. coli intacto; y Carril 2 -300 ng de ARN total de E. coli fragmentado. La Figura 6B muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARN total de E. coli

5 intacto menos sustracción; Carril 2 -ARN total de E. coli intacto más sustracción; Carril 3 -ARN total de E. coli fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -ARN total de E. coli fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. El Panel 2 muestra la transferencia Northern de ARNm de ompA. El Panel 3 muestra la transferencia Northern de ARNr 23S. El Panel 4 muestra la transferencia Northern de ARNr 16S. El Panel 5 muestra la transferencia Northern de ARNr 5S. La Figura 6C muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARN total de E. coli intacto menos sustracción; Carril 2 -ARN total de E. coli intacto más sustracción; Carril 3 -ARN total de E. coli fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -ARN total de E. coli fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra la RT-PCR de ompA. El Panel 2 muestra la RT-PCR 5’ de ARNr 23S. El Panel 3 muestra la RT-PCR 5’ de ARNr 16S. El Panel 4 muestra la RT-PCR 5’ de ARNr 5S.

15 La Figura 7A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARNr antisentido biotinilado 28S; Carril 2 -ARNr antisentido biotinilado 18S; Carril 3 -ARN total humano; Carril 4 -ARN total humano más ARNr antisentido biotinilado 28S; Carril 5 -ARN total humano más ARNr antisentido biotinilado 18S; Carril 6 -ARN total de ratón; Carril 7 -ARN total de ratón más ARNr antisentido biotinilado 28S; Carril 8 -ARN total de ratón más ARNr antisentido biotinilado 18S; Carril 9 -ARN total de rata; Carril 10 -ARN total de rata más ARNr antisentido biotinilado 28S; y Carril 11 -ARN total de rata más ARNr antisentido biotinilado 18S. La Figura 7B muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARN total humano (HeLa) menos sustracción; Carril 2 -ARN total humano (HeLa) más sustracción; Carril 3 -ARN total de ratón (3T3) menos sustracción; Carril 4 -ARN total de ratón (3T3) menos sustracción; Carril 5 -ARN total de rata (NRK) menos sustracción; y Carril 6 -ARN total de rata (NRK) más sustracción.

25 La Figura 8 muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -resultado de PCR para 100 ng de ARN total humano de entrada más sustracción; Carril 2 -resultado de PCR para 500 ng de ARN total humano de entrada más sustracción; Carril 3 -resultado de PCR para 5,0 μg de ARN total humano de entrada más sustracción; Carril 4 -resultado de PCR para 500 ng de ARN total humano de entrada menos sustracción; y Carril 5 -resultado de PCR para la reacción de control sin molde. El Panel A muestra la RT-PCR de ARNr 28S 5’. Panel B muestra la RT-PCR de ARNr 28S 3’. El Panel C muestra la RT-PCR de ARNr 18S 5’. El Panel D muestra la RT-PCR de ARNr 18S 3’. El Panel E muestra la RT-PCR de ARNr 5,8S. El Panel F muestra la RT-PCR de ARNr 5S. El Panel G muestra la RT-PCR de ARNm de GAPDH 5'. La Figura 9A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -ARN total de HeLa intacto más sustracción; Carril 3 -ARN total de HeLa fragmentado (1 minuto) menos

35 sustracción; Carril 4 -ARN total de HeLa fragmentado (1 minuto) más sustracción; Carril 5 -ARN total de HeLa fragmentado (2 minutos) menos sustracción; Carril 6 -ARN total de HeLa fragmentado (2 minutos) más sustracción; Carril 7 -ARN total de HeLa fragmentado (3 minutos) menos sustracción; y Carril 8 -ARN total de HeLa fragmentado (3 minuto) más sustracción. La Figura 9B muestra lo siguiente: Carril 1 -resultado de PCR para ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -resultado de PCR para ARN total de HeLa intacto más sustracción; Carril 3 -resultado de PCR para ARN total de HeLa fragmentado (1 minuto) menos sustracción; Carril 4 -resultado de PCR para ARN total de HeLa fragmentado (1 minuto) más sustracción; Carril 5 -resultado de PCR para ARN total de HeLa fragmentado (2 minutos) menos sustracción; Carril 6 -resultado de PCR para ARN total de HeLa fragmentado (2 minutos) más sustracción; Carril 7 -resultado de PCR para ARN total de HeLa fragmentado (3 minutos) menos

45 sustracción; Carril 8 -resultado de PCR para ARN total de HeLa fragmentado (3 minutos) más sustracción; y Carril 9 -resultado de PCR para la reacción de control sin molde. El Panel 1 muestra ARNr 28S 5'. El Panel 2 muestra ARNr 18S 5'. El Panel 3 muestra ARNr 5,8S. El Panel 4 muestra ARNr 5S. El Panel 5 muestra ARNm de GAPDH 5'. La Figura 10A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARN total de E. coli intacto menos sustracción; Carril 2 -ARN total de E. coli intacto más sustracción; Carril 3 -ARN total de E. coli fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -ARN total de E. coli fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra ARNm de ompA. El Panel 2 muestra ARNr 23S. El Panel 3 muestra ARNr 16S. El Panel 4 muestra ARNr 5S. La Figura 10B muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -resultado de PCR

55 para ARN total de E. coli intacto menos sustracción; Carril 2 -resultado de PCR para ARN total de E. coli intacto más sustracción; Carril 3 -resultado de PCR para ARN total de E. coli fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -resultado de PCR para ARN total de E. coli fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra ARNm de ompA. El Panel 2 muestra ARNr 23S. El Panel 3 muestra ARNr 16S. El Panel 4 muestra ARNr 5S. La Figura 11A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -ARN total de HeLa intacto más sustracción; Carril 3 -ARN total de HeLa fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -ARN total de HeLa fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra los resultados de un método ilustrativo de la presente invención. El Panel 2 muestra los resultados del método OLIGOTEX. La Figura 11B muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -resultados de PCR

65 para ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -resultados de PCR para el ARN total de HeLa

intacto más sustracción; Carril 3 -resultados de PCR para el ARN total de HeLa fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -resultados de PCR para el ARN total de HeLa fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra ARNr 28S-5’. El Panel 2 muestra ARNr 28S-3’. El Panel 3 muestra ARNr 18S-5’. El Panel 4 muestra ARNr 18S-3’. El Panel 5 muestra ARNr 5,8S. El Panel 6 muestra ARNr 5S.

5 La Figura 11C muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -resultados de PCR para ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -resultados de PCR para ARN total de HeLa intacto más sustracción; Carril 3 -resultados de PCR para ARN total de HeLa fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -resultados de PCR para ARN total de HeLa fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra GAPDH-5’. El Panel 2 muestra GAPDH-3’. El Panel 3 muestra PGK1-5’. El Panel 4 muestra PGK1-3’. La Figura 11D muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -resultados de PCR para ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -resultados de PCR para ARN total de HeLa intacto más sustracción; Carril 3 -resultados de PCR para ARN total de HeLa fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -resultados de PCR para ARN total de HeLa fragmentado más sustracción. El Panel 1 muestra ARN de Poly A n.º 1. El Panel 2 muestra ARN de Poly A n.º 3. El Panel 3 muestra ARN de Poly A n.º 15. El Panel 4 muestra

15 ARN biomórfico n.º 5. La Figura 12A muestra lo siguiente: Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -ARN total de HeLa intacto más sustracción; Carril 3 -ARN total de HeLa fragmentado menos sustracción; y Carril 4 -ARN total de HeLa fragmentado más sustracción. La Figura 12B muestra Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -resultados de PCR para ARN total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -resultados de PCR para ARN total de HeLa intacto más sustracción; Carril 3 -resultados de PCR para ARN total de HeLa fragmentado menos sustracción; y Carril 4 resultados de PCR para ARN total de HeLa fragmentado más sustracción; Panel 1 -ARNr 28S-5’; Panel 2 -ARNr 28S-3’; Panel 3 -ARNr 18S-5’; Panel 4 -ARNr 18S-3’; Panel 5 -ARNr 5,8S; y Panel 6 -ARNr 5S. La Figura 12C muestra Carril M -escalera de peso molecular de ADN; Carril 1 -resultados de PCR para ARN

25 total de HeLa intacto menos sustracción; Carril 2 -resultados de PCR para ARN total intacto de HeLa más sustracción; Carril 3 -resultados de PCR para ARN total fragmentado de HeLa menos sustracción; Carril 4 resultados de PCR para ARN total fragmentado de HeLa más sustracción; Panel 1 -GAPDH-5’; y Panel 2 -GAPDH-3’.

Definiciones

[0069] Se ha de entender que la terminología usada en el presente documento solo tiene el propósito de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitante. Además, salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un

35 experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Al describir y reivindicar la presente invención, se usarán las siguientes terminología y variantes gramaticales de acuerdo con las definiciones establecidas a continuación.

[0070] Cuando, en el presente documento, se usan expresiones tales como "por ejemplo", "tal/es como", "incluye", "que incluye" o variaciones de las mismas, estas expresiones no se considerarán expresiones limitantes, y se interpretarán en el sentido de "pero no limitado a" o "sin limitación".

[0071] Como se usa en el presente documento, una "composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad" significa "una composición que comprende moléculas de ARN que, bien solas o en

45 combinación, presentan una o más secuencias que son complementarias a esencialmente la totalidad de la secuencia presentada por la al menos una molécula de ARNr de longitud completa, en la que al menos una parte de los nucleótidos de dichas moléculas de ARN están unidas a un marcador de afinidad.

[0072] Como se usa en el presente documento, la expresión "una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr" o "una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido correspondientes a esencialmente la totalidad de” (o "la totalidad de la secuencia presentada por") "al menos una molécula de ARNr" o "una composición que comprende moléculas de ARNr antisentido que, solas o en combinación, son complementarias a esencialmente la totalidad" (o “la totalidad de la secuencia") “de al menos una molécula de ARNr de longitud completa" se refiere a una composición que

55 comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad que presentan, que se hibridarán específicamente con o se aparearán con o formarán complejo con, al menos el 95 % de las moléculas de ARN o fragmentos de moléculas de ARN que presentan una secuencia de una determinada molécula de ARNr de longitud completa. Preferentemente, las moléculas de ARNr antisentido de la composición se hibridarán específicamente con al menos el 95 % de las moléculas de una molécula de ARNr en particular o fragmentos de la misma en una muestra, de manera que, cuando se marquen por afinidad, dichas moléculas de ARNr antisentido se puedan usar con una matriz de unión para retirar al menos aproximadamente el 95 % de las moléculas de ARN o fragmentos de moléculas de ARN que presentan una secuencia de dicha molécula de ARNr en particular de la muestra. No es necesario que las secuencias de ácido nucleico antisentido presentadas en la composición compartan el 95 % de identidad de secuencia con el complemento de una determinada molécula de ARNr, sino que basta con que las secuencias de

65 ácido nucleico antisentido sean capaces de hibridarse, aparearse o formar complejo específicamente con al menos

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[0086] La presente invención aborda dicha necesidad, ya que proporciona, por ejemplo, métodos de extracción eficaz de moléculas de ARNr bien totalmente fragmentado o fragmentado de forma variable, dejando las transcripciones de ARN distinto del ARNr, en general, invariables. Además, el método funciona independientemente de cualquier "característica única" de las transcripciones de ARN no ribosomal tales como, una cola poli(A) como en 5 el caso del ARNm eucariota y, por tanto, no presenta ningún sesgo de selección en la recuperación de todas las transcripciones de ARN no ribosomal. En ciertas realizaciones para lograr estos objetivos, se sintetizan uno o más ARNr antisentido marcados por afinidad que representan esencialmente la totalidad de la secuencia de longitud completa de cada ARNr en su totalidad o en parte (por ejemplo, eucariota 28S, 26S, 25S, 18S, 5,8S y/o 5S y/o procariota 23S, 16S y 5S) y se hibridan a sus respectivas secuencias de ARNr complementarias en la muestra de ensayo, y los híbridos, así como cualquier molécula de ARNr antisentido marcada por afinidad sin hibridar residual, se retiran luego físicamente usando moléculas de unión a marcador de afinidad (por ejemplo, ligadas a una matriz de unión), dejando invariables las transcripciones de ARN distinto del ARNr. Dado que esencialmente la totalidad de (o toda) la secuencia de al menos uno, y preferentemente cada ARNr, se representa en la composición que comprende moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad, cualquier fragmento de tamaño del ARNr nativo

15 contenido en las muestras también es capaz de formar híbridos en las mismas condiciones de hibridación y retirarse eficazmente junto con cualquier secuencia de ARNr intacto que también pueda estar presente.

[0087] En realizaciones particulares, para lograr la extracción eficaz del ARNr, se usa un exceso molar de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad en la reacción de hibridación, lo que conduce el proceso de formación de híbridos a su finalización. Las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad en exceso también se pueden eliminar, ya que estas moléculas por sí mismas pueden contribuir a varios tipos de fondo en diferentes métodos o análisis cadena abajo. Para lograr esto, las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad contienen preferentemente una cantidad óptima de moléculas de marcador de afinidad, y se usa una cantidad apropiada de la matriz de unión que comprende las moléculas de unión al marcador de afinidad para retirar

25 las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad tanto hibridadas a ARNr como sin hibridar. Como se describe en los ejemplos, se desarrollaron condiciones que permiten la realización de los métodos usando muestras que comprenden un intervalo dinámico más amplio de ARN total que los métodos existentes, incluyendo el uso de muestras que comprenden cantidades submicrográmicas de ARN total.

Secuencias de ARNr y cebadores ilustrativos

[0088] La presente invención incluye composiciones que comprenden moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad correspondientes a esencialmente la totalidad de al menos una molécula de ARNr. La presente invención no se limita a composiciones que comprenden moléculas de ARNr antisentido que presentan secuencias

35 que son exactamente complementarias a determinadas moléculas de ARNr en la muestra, sino que incluye composiciones que comprenden moléculas de ARNr antisentido que se hibridan con o se aparean o forman complejo con cualquier molécula de ARNr de la muestra, sean o no dichas moléculas de ARNr del mismo organismo.

Realización ilustrativa

[0089] A continuación, se describe una realización ilustrativa que se puede usar para generar muestras empobrecidas en ARNr usando microesferas ligadas a moléculas de unión a marcador de afinidad (de aquí en adelante "microesferas de unión" o "microesferas"). Dicha realización no pretende limitarse a la presente invención,

45 sino que simplemente es una realización ilustrativa.

[0090] Se lavan las microesferas de unión y se suspenden en solución (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 1 mM y Triton-X100 exento de RNasa al 0,0005 %). Se deja que las microesferas de unión alcancen la temperatura ambiente. Se agitan vigorosamente con formación de vórtice las microesferas durante 20 segundos para producir una suspensión homogénea. Para cada reacción, se aplican con una pipeta 25 ul de las microesferas resuspendidas en un tubo de lavado de las microesferas. Se centrifugan las microesferas dispensadas a 10.000 rpm en un microcentrifugador de mesa de laboratorio durante 3 minutos. Se retira con pipeta cuidadosamente y se desecha el sobrenadante, sin perturbar el sedimento de microesferas. Se lavan las microesferas mediante la adición de 1 volumen de solución de lavado (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 1 M y EDTA 1 mM) igual al volumen original de

55 microesferas (por ejemplo, añadir 25 μl de solución de lavado por cada 25 μl de microesferas) al tubo. Se vuelven a suspender las microesferas mediante mezclado vigoroso con formación de vórtice. Se centrifuga el tubo a 10.000 rpm durante 3 minutos en un microcentrifugador de mesa de trabajo. Se retira con una pipeta cuidadosamente y se desecha el sobrenadante, sin perturbar el sedimento de microesferas. Se repiten las etapas de lavado, resuspensión, centrifugación y extracción con pipeta.

[0091] Se vuelven a suspender las microesferas en 1 volumen de solución de resuspensión. Por ejemplo, se añaden 25 μl de solución de resuspensión por cada 25 μl de las microesferas que se usaron originalmente. Se vuelven a suspender las microesferas mediante mezclado vigoroso con formación de vórtice para producir una suspensión homogénea. Se añaden 0,25 μl de inhibidor de RNasa ScriptGuard™ (EPICENTRE, Madison, WI) en el

65 tubo por cada 25 μl de microesferas resuspendidas y se conservan a temperatura ambiente.

[0092] Para una muestra que contiene, por ejemplo, de 50 ng a 1 ug de ARN total (por ejemplo, humano, de ratón

o de rata), en un tubo de microcentrifugación de paredes finas de 0,2 ml, se combinan: tampón de reacción x 10 (Tris-HCl 0,5 M, pH 7 0,5 y NaCl 1 M), una muestra de ARN total, una solución de extracción de ARNr (1,2 pmol de cada una de las moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad correspondientes a moléculas de ARNr

5 humano 28S, 18S, 5,8S y 5S) y agua exenta de RNasa. Se mezcla/n suavemente la/s reacción/es y se incuban a 68 ºC durante 10 minutos. Se retira/n el/los tubo/s de reacción a temperatura ambiente y se incuba/n durante al menos 15 minutos.

[0093] Se vuelven a suspender las anteriores microesferas lavadas pipeteando arriba y abajo. Para cada muestra, se pipetearon 25 μl de las microesferas a un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,5 ml exento de RNasa. Se añade la muestra de ARN total a temperatura ambiente al tubo apropiado que contiene las microesferas. Se mezcla bien con la pipeta el contenido del tubo hacia arriba y abajo. Se incuba cada tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos con la mezcla ocasional (cada 3-4 minutos) con formación suave de vórtice (baja sedimentación por gravedad) durante 5 segundos. Se coloca el tubo a 37 ºC durante 5 minutos. Inmediatamente, se centrifuga el tubo a

15 14.000 rpm en un microcentrifugador durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se retira con pipeta cuidadosamente cada sobrenadante, que contiene la muestra empobrecida en ARNr, a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml exento de RNasa. Si quedan microesferas todavía visibles en la muestra, y se desea el uso de la precipitación con etanol, se repite el procedimiento anterior. La muestra empobrecida en ARNr se puede purificar, por ejemplo, mediante precipitación con etanol o método de columna.

[0094] Para la precipitación con etanol, se ajusta el volumen de cada muestra a 180 μl usando agua exenta de RNasa. Se añaden 18 μl de acetato de sodio 3 M a cada tubo. Se añaden 2 μl de glucógeno (10 mg/ml) a cada tubo y se mezcla bien suavemente con formación de vórtice. Se añaden 3 volúmenes (600 μl) de etanol al 100 % enfriado con hielo a cada tubo y se mezcla bien suavemente con formación de vórtice. Se colocan los tubos a -20 ºC durante

25 al menos 1 hora. Se centrifugan los tubos a > 10.000 x g en un microcentrifugador durante 30 minutos. Se retira con cuidado el sobrenadante y se desecha. Se lava el precipitado con etanol al 70 % enfriado con hielo y se centrifuga a > 10.000 x g durante 5 minutos. Se retira con cuidado el sobrenadante y se desecha. Se repite la etapa de etanol y centrifugación. Se centrifuga brevemente para recoger cualquier sobrenadante residual. Se retira con cuidado el sobrenadante y se desecha, y se deja que el sedimento se seque al aire a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se disuelve el sedimento en el volumen deseado de agua exenta de RNasa o tampón.

[0095] Para la purificación en columna, se puede usar la columna RNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research; números de catálogo R1015, R1016) para purificar la muestra de ARN empobrecida en ARNr. Si se usa la columna RNA Clean & Concentrator™-5, se ha de seguir el procedimiento del fabricante titulado "Recuperación

35 del ARN total, incluyendo los pequeños ARN". El ARN eluido se puede usar inmediatamente después de conservarlo a una temperatura de -70 ºC a -80 ºC.

Tecnologías de secuenciación

[0096] Las muestras de ARN purificado generadas de acuerdo con la presente invención se pueden secuenciar usando cualquier tipo de tecnología de secuenciación adecuada. La presente invención no está limitada por el tipo de método de secuenciación empleado. A continuación, se describen métodos de secuenciación ilustrativos.

[0097] Los ejemplos no limitantes ilustrativos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos incluyen, pero

45 sin limitación, secuenciación de terminador de cadena (Sanger) y secuenciación del terminador de colorante. La secuenciación de terminador de cadena usa la terminación específica de secuencia de una reacción de síntesis de ADN usando sustratos de nucleótidos modificados. La extensión se inicia en un sitio específico en el ADN del molde usando un cebador de oligonucleótido radiactivo corto, u otro marcado, complementario al molde en esa región. El cebador de oligonucleótido se extiende usando una ADN polimerasa, cuatro bases de desoxinucleótido convencionales, y una baja concentración de un nucleótido de terminación de cadena, lo más comúnmente un didesoxinucleótido. Esta reacción se repitió en cuatro tubos separados con cada una de las bases turnándose como el di-desoxinucleótido. La incorporación limitada del nucleótido de terminación de cadena por la ADN polimerasa da lugar a una serie de fragmentos de ADN relacionados que solamente se terminan en las posiciones en las que se usa un di-desoxinucleótido en particular. Para cada tubo de reacción, los fragmentos se separan por tamaños

55 mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida en plancha o un tubo capilar lleno de un polímero viscoso. La secuencia está determinada por la lectura de qué carril produce una marca visualizada desde el cebador marcado a medida que se rastrea desde la parte superior del gel hacia la parte inferior.

[0098] La secuenciación de terminador de colorante marca alternativamente los terminadores. Se puede realizar la secuenciación completa en una sola reacción mediante el marcaje de cada uno de los terminadores de cadena de di-desoxinucleótido con un colorante fluorescente separado, que emite fluorescencia a una longitud de onda diferente.

[0099] Como alternativa a los métodos de secuenciación de Sanger y de terminador de colorante, ha surgido un 65 conjunto de métodos denominados técnicas de “secuenciación de nueva generación” (Voelkerding et al., Clinical

Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296). La mayoría de los métodos actuales describen el uso de la tecnología de secuenciación de nueva generación para la secuenciación de novo de genomas completos para determinar la secuencia de ácido nucleico principal de un organismo. Además, la re-secuenciación dirigida (secuenciación en profundidad) permite la detección de mutaciones sensibles en una población de la 5 secuencia de tipo silvestre. Algunos ejemplos incluyen el trabajo reciente que describe la identificación de variantes resistentes a los fármacos contra el VIH, así como las mutaciones de EGFR para la determinación de la respuesta a fármacos terapéuticos anti-TK. Publicaciones recientes describen el uso de secuencias de cebador de código de barras que permite la secuenciación simultánea de múltiples muestras durante una serie típica de secuenciación incluyendo, por ejemplo: Margulies, M. et al. "Genome Sequencing in Microfabricated High-Density Picolitre Reactors", Nature, 437, 376-80 (2005); Mikkelsen, T. et al. "Genome-Wide Maps of Chromatin State in Pluripotent and Lineage-Committed Cells", Nature, 448, 553-60 (2007); McLaughlin, S. et al. "Whole-Genome Resequencing with Short Reads: Accurate Mutation Discovery with Mate Pairs and Quality Values", ASHG Annual Meeting (2007); Shendure J. et al. "Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome", Science, 309, 1728-32 (2005); Harris, T. et al. "Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome", Science, 320, 106-9 (2008); Simen, B.

15 et al. "Prevalence of Low Abundance Drug Resistant Variants by Ultra Deep Sequencing in Chronically HIV-infected Antiretroviral (ARV) Naive Patients and the Impact on Virologic Outcomes", 16th International HIV Drug Resistance Workshop, Barbados (2007); Thomas, R. et al. "Sensitive Mutation Detection in Heterogeneous Cancer Specimens by Massively Parallel Picoliter Reactor Sequencing", Nature Med., 12, 852-855 (2006); Mitsuya, Y. et al. "Minority Human Immunodeficiency Virus Type 1 Variants in Antiretroviral-Naive Persons with Reverse Transcriptase Codon 215 Revertant Mutations", J. Vir., 82, 10747-10755 (2008); Binladen, J. et al. "The Use of Coded PCR Primers Enables High-Throughput Sequencing of Multiple Homolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing", PLoS ONE, 2, e197 (2007); y Hoffmann, C. et al. "DNA Bar Coding and Pyrosequencing to Identify Rare HIV Drug Resistance Mutations", Nuc. Acids Res., 35, e91 (2007).

25 [0100] En comparación con la secuenciación de Sanger tradicional, la tecnología de secuenciación de nueva generación produce grandes cantidades de puntos de datos de secuenciación. Una serie típica puede generar fácilmente de decenas a cientos de megabases por serie, con un potencial de producción diaria que alcanza el intervalo de las gigabases. Esto se traduce en varios órdenes de magnitud más que una placa de 96 pocillos convencional, que puede generar varios cientos de puntos de datos en un ensayo multiplex normal. Los amplicones diana que se diferencian en al menos un nucleótido se pueden distinguir con facilidad, incluso cuando hay múltiples dianas de especies u organismos afines. Esto mejora enormemente la capacidad de hacer el genotipado exacto. Los programas informáticos de alineamiento de secuencias de nueva generación usados para producir secuencias de consenso pueden identificar fácilmente nuevas mutaciones puntuales, lo que podría dar lugar a nuevas cepas con resistencia a los fármacos asociados. El uso de códigos de barras con cebador también permite la multiplexación de

35 diferentes muestras de pacientes en una sola serie de secuenciación.

[0101] Los métodos de secuenciación de nueva generación (NGS) comparten la característica común de las estrategias de alto rendimiento masivamente en paralelo, con el objetivo de reducir los costes de la comparación con los métodos de secuenciación antiguos. Los métodos de NGS se pueden dividir a grandes rasgos en los que requieren la amplificación de molde y los que no. Los métodos que requieren la amplificación incluyen la pirosecuenciación comercializada por Roche como las plataformas tecnológicas 454 (por ejemplo, GS 20 y GS FLX), la plataforma Solexa comercializada por Illumina, y la plataforma de enlace y detección de oligonucleótidos soportada (SOLiD) comercializada por Applied Biosystems. Los enfoques de no amplificación, también conocidos como la secuenciación de una sola molécula, se ilustran por la plataforma HeliScope comercializada por Helicos

45 BioSciences, y las plataformas emergentes comercializadas por VisiGen y Pacific Biosciences, respectivamente.

[0102] En la pirosecuenciación (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-2 96; patente de EE.UU. n.º 6.210.891; patente de EE.UU. n.º 6.258.568), el ADN de molde se fragmenta, se repara en los extremos, se liga a adaptadores y se amplifica clonalmente in situ mediante la captura de moléculas de molde individuales con perlas que portan oligonucleótidos complementarios a los adaptadores. Cada perla portadora de un solo tipo de molde está compartimentada en una microvesícula de agua en aceite, y el molde se amplifica clonalmente usando una técnica conocida como PCR en emulsión. La emulsión se rompe después de la amplificación y las perlas se depositan en pocillos individuales de una placa de picotitulación que funciona como una celda de flujo durante las reacciones de secuenciación. Se produce la introducción iterativa,

55 ordenada, de cada uno de los cuatro dNTP reactivos en la celda de flujo en presencia de enzimas de secuenciación e indicador luminiscente tal como luciferasa. En el caso de añadirse un dNTP apropiado en el extremo 3' del cebador de secuenciación, la producción resultante de ATP provoca una explosión de la luminiscencia dentro del pocillo, que se registra usando una cámara CCD. Es posible lograr longitudes de lectura superiores o iguales a 400 bases, y 1 x 106 lecturas de secuencia, lo que resulta en hasta 500 millones de pares de bases (Mb) de secuencia.

[0103] En la plataforma de Solexa/Illumina (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de EE.UU. n.º 6.833.246; patente de EE.UU. n.º 7.115.400; patente de EE.UU. n.º 6.969.488), los datos de secuenciación se producen en forma de lecturas de menor longitud. En este método, el ADN fragmentado de una sola cadena se repara en sus extremos para generar extremos romos 65 fosforilados 5’, seguido de la adición mediada por Klenow de una sola base A al extremo 3' de los fragmentos. La

adición de A facilita la adición de oligonucleótidos adaptadores salientes T, que se usan posteriormente para capturar las moléculas molde-adaptador en la superficie de una celda de flujo que está salpicada de anclajes de oligonucleótidos. El anclaje se usa como un cebador de PCR, pero debido a la longitud del molde y a su proximidad a otros oligonucleótidos de anclaje cercanos, la extensión por PCR genera el “arqueado sobre” la molécula para

5 hibridarse con un oligonucleótido de anclaje adyacente para formar una estructura puente en la superficie de la celda de flujo. Estos bucles de ADN se desnaturalizan y se escinden. A continuación, las cadenas directas se secuencian con terminadores de colorante reversibles. La secuencia de nucleótidos incorporados se determina mediante la detección de la fluorescencia después de la incorporación, con cada compuesto fluorescente y bloque retirado antes del siguiente ciclo de adición de dNTP. La longitud de la lectura de secuencia varía de 36 nucleótidos a más de 50 nucleótidos, con una producción total superior a mil millones de pares de nucleótidos en cada serie analítica.

[0104] La secuenciación de moléculas de ácido nucleico usando la tecnología SOLiD (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de EE.UU. n.º 5.912.148; patente de EE.UU. n.º 6.130.073) también implica la fragmentación del molde, el enlace a los adaptadores de 15 oligonucleótidos, la unión a perlas y la amplificación clonal por PCR en emulsión. Tras ello, las perlas que portan molde se inmovilizan sobre una superficie derivatizada de una celda de flujo de vidrio, y se aparea un cebador complementario al oligonucleótido adaptador. Sin embargo, en lugar de utilizar este cebador para la extensión de 3', se usa para proporcionar un grupo fosfato 5' para el enlace a sondas de interrogación que contienen dos bases específicas de la sonda seguidas de 6 bases degeneradas y uno de los cuatro marcadores fluorescentes. En el sistema SOLiD, las sondas de interrogación tienen 16 posibles combinaciones de las dos bases en el extremo 3' de cada sonda, y uno de los cuatro compuestos fluorescentes en el extremo 5'. El color del compuesto fluorescente y, por lo tanto, la identidad de cada sonda se corresponden con los esquemas de codificación de color-espacio especificados. Múltiples series (normalmente 7) de apareamiento de la sonda, enlace y detección del compuesto fluorescente son seguidas de la desnaturalización, y luego una segunda serie de secuenciación usando un cebador

25 que se compensa con una base con respecto al cebador inicial. De esta manera, la secuencia del molde se puede reconstruir computacionalmente, y las bases del molde son interrogadas dos veces, generando una mayor exactitud. La longitud de la lectura de la secuencia es de una media de 35 nucleótidos, y la producción global supera los 4 mil millones de bases por serie de secuenciación.

[0105] En ciertas realizaciones, se emplea la secuenciación por nanoporo (véase, por ejemplo, Astier et al., J Am Chem Soc. 8 de febrero de 2006; 128(5):1705-10). La teoría que hay tras la secuenciación por nanoporo tiene que ver con lo que ocurre cuando el nanoporo se sumerge en un fluido conductor y se aplica un potencial (tensión) a través: en estas condiciones, se puede observar una ligera corriente eléctrica debida a la conducción de los iones a través del nanoporo, y la cantidad de corriente es muy sensible al tamaño del nanoporo. Si pasan moléculas de ADN

35 (o pasa parte de la molécula de ADN) a través del nanoporo, esto puede crear un cambio en la magnitud de la corriente a través del nanoporo, permitiendo de ese modo la determinación de las secuencias de la molécula de ADN.

[0106] HeliScope de Helicos BioSciences (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de EE.UU. n.º 7.169.560; patente de EE.UU. n.º 7.282.337; patente de EE.UU. n.º 7.482.120; patente de EE.UU. n.º 7.501.245; patente de EE.UU. n.º 6.818.395; patente de EE.UU. n.º 6.911.345; patente de EE.UU. n.º 7.501.245) es la primera plataforma de secuenciación de una sola molécula comercializada. Este método no requiere la amplificación clonal. El ADN de molde se fragmenta y se poliadenila en el extremo 3', portando la adenosina final un marcador fluorescente. Los fragmentos de molde poliadenilados y 45 desnaturalizados se enlazan a oligonucleótidos poli(dT) en la superficie de una celda de flujo. Las ubicaciones físicas iniciales de las moléculas de molde capturadas se registran con una cámara CCD, y luego se escinde y se retira por lavado el marcador. La secuenciación se logra mediante la adición de la polimerasa y la adición en serie de reactivos de dNTP marcados por fluorescencia. Las incorporaciones dan lugar a la señal fluorescente correspondiente al dNTP, y la señal es capturada por una cámara CCD antes de cada serie de adición de dNTP. La longitud de la lectura de la secuencia varía de 25-50 nucleótidos, con una producción total superior a mil millones de pares de nucleótidos en cada serie analítica. Otros métodos emergentes de secuenciación de una sola molécula es la secuenciación en tiempo real mediante la síntesis usando una plataforma VisiGen (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; patente de EE.UU. n.º 7.329.492; solicitud de patente de EE.UU. n.º de serie 11/671956; solicitud de patente de EE.UU. n.º de serie 11/781166) en la que ADN cebado, inmovilizado, se somete a la 55 extensión de la cadena usando una polimerasa modificada fluorescentemente y moléculas aceptoras fluorescentes, generando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia detectable (FRET) tras la adición de nucleótidos. Otro sistema de secuenciación de una sola molécula en tiempo real desarrollado por Pacific Biosciences (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658,2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287296; patente de EE.UU. n.º 7.170.050; patente de EE.UU. n.º 7.302.146; patente de EE.UU. n.º 7.313.308; patente de EE.UU. n.º 7.476.503) utiliza pocillos de reacción de 50 a 100 nm de diámetro y que abarcan un volumen de reacción de aproximadamente 20 zeptolitros (10 x 10-21 l). Las reacciones de secuenciación se realizan usando el molde inmovilizado, ADN polimerasa phi29 modificada y altas concentraciones locales de dNTP marcados por fluorescencia. Las altas concentraciones locales y las condiciones de reacción continua permiten la captura de incorporaciones en tiempo real mediante la detección de la señal fluorescente usando excitación láser, una guía de

65 ondas óptica y una cámara CCD.

Soporte sólidos de matriz de unión

[0107] La matriz de unión empleada en la presente invención puede ser cualquier superficie o soporte sólido al que la molécula de unión al marcador de afinidad se pueda unir y que no presente unión inespecífica sustancial de las

5 moléculas de ARNr antisentido marcadas por afinidad. La presente invención no se limita a un soporte sólido. En algunas realizaciones, se emplean placas de poliestireno que contienen o bien 96 o 384 pocillos. En algunas realizaciones, se usan placas de microtitulación de 96 pocillos o 384 pocillos recubiertas con estreptavidina (SA) (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) como soportes sólidos. En algunas realizaciones, se emplean partículas o perlas. Las partículas se pueden fabricar de cualquier material adecuado, incluyendo, pero sin limitación, el látex. En algunas realizaciones, se emplean minicolumnas. Las columnas pueden contener moléculas de unión al marcador de afinidad. En otras realizaciones, se emplea una BEADARRAY (Illumina, San Diego, CA). Se contempla una variedad de otros soportes sólidos incluyendo, pero sin limitación, portaobjetos de vidrio, obleas de vidrio, oro, silicio, microchips, y otras superficies de plástico, metal, cerámica o biológicas.

15 Ejemplos

[0108] Se entiende que los ejemplos y las realizaciones que se describen en el presente documento solo son a efectos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada.

Ejemplo 1

Síntesis de moléculas de ARNr antisentido biotinilado que representan las secuencias de longitud completa de moléculas de ARN ribosomal (ARNr) de procariotas y eucariotas

25 [0109] Para sintetizar ARNr antisentido correspondiente a la secuencia completa de cada molécula de ARNr, se crearon moldes de PCR que contenían una secuencia promotora de fago en todos menos en un caso de la siguiente manera.

Moldes de PCR de ARNr 18S, 5,8S y 5S humano para la síntesis in vitro de ARNr antisentido

[0110] Se sintetizaron amplicones de PCR que representan las secuencias de ARNr de longitud completa 18S (n.º de acceso NR_003286), 5,8S (n.º de acceso U13369 REGIÓN: 6623-6779) y 5S (n.º de acceso NR_023363). Cada reacción de PCR de 100 μl comprendía 20 pmol de un cebador directo, 20 pmol de un cebador inverso que contenía la secuencia promotora de fago de ARN polimerasa de T7 (mostrada en cursiva) y 5 ng ADNc de primera cadena

35 cebado aleatoriamente creado a partir de ARN total de referencia humano universal (Stratagene) en condiciones de reacción de PCR FailSafe optimizadas según lo descrito por el fabricante (EPICENTRE Biotechnologies). Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron durante 25 ciclos a 30 ciclos en función del par de cebadores y los amplicones de PCR correspondientes a las secuencias de ARNr de longitud completa 18S, 5,8S y 5S, y los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR Qiaquick según las recomendaciones del fabricante (Qiagen). A continuación, se presenta una lista de los respectivos cebadores directos e inversos:

ARNr 18S

cebador directo (SEQ ID NO: 1: 5'-CCTACCTACCTGGTTGATCC) y

45 cebador inverso (SEQ ID NO: 2: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATC CTTCCGCAGGTTCAC-CTAC).

ARNr 5,8S

cebador directo (SEQ ID NO: 3: 5'-CGACTCTTAGCGGTGGATCACTC) y cebador inverso (SEQ ID NO: 4: 5-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATC CTTCCGCAGGTTCAC-CTAC)

ARNr SS

55 cebador directo (SEQ ID NO: 5: 5'-GTCTACGGCCATACCACCCTGAA) y cebador inverso (SEQ ID NO: 6: 5-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAAG CCTACAGCACCCGGTAT-TC)

Moldes de PCR de ARNr 23S, 16S y 5S de Escherichia coli para la síntesis in vitro de ARNr antisentido

[0111] Se sintetizaron amplicones de PCR que representaban las secuencias de ARNr de longitud completa 23S (n.º de acceso EG30077), 16S (n.º de acceso EG30084) y 5S (n.º de acceso EG30070). Cada reacción de PCR de 100 μl comprendía 20 pmol de un cebador directo, 20 pmol de un cebador inverso que contenía la secuencia 65 promotora de fago de ARN polimerasa de T7 (mostrada en cursiva) y 5 ng ADNc de primera cadena cebado

aleatoriamente creado a partir de ARN total K-12 de E. coli en condiciones de reacción de PCR FailSafe optimizadas según lo descrito por el fabricante (EPICENTRE Biotechnologies). Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron durante 25 ciclos a 30 ciclos en función del par de cebadores y los amplicones de PCR correspondientes a las secuencias de ARNr de longitud completa 23S, 16S y 5S, y los productos de PCR se purificaron usando el kit

5 de purificación de PCR Qiaquick según las recomendaciones del fabricante (Qiagen). A continuación, se presenta una lista de los respectivos cebadores directos e inversos:

ARNr 23S

10 [0112] Para amplificar eficazmente la secuencia de ARNr 23S completa, se usaron dos pares de cebadores mediante lo que se dividió la secuencia de ARNr 23S de longitud completa en aproximadamente dos segmentos iguales. El segmento de ARNr 23S 5' comprendía cebador directo (SEQ ID NO: 7: 5'-AAGCGACTAAGCGTACACGGTGGA) y cebador inverso (SEQ ID NO: 8: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCTGGAAGCAGG GCATITGTTG) y el segmento de ARNr 23S 3'

15 comprendía cebador directo (SEQ ID NO: 9: 5'-CAACAAATGCCCTGCTTCCAGGAA) y cebador inverso (SEQ ID NO: 10: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACACGGTTCATTAGTACCGGTTAGCT).

ARNr 16S

20 cebador directo (SEQ ID NO: 11: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y cebador inverso (SEQ ID NO: 12: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAG GTGATCCAACCGCAGGTT).

ARNr 5S

25 cebador directo (SEQ ID NO: 13: 5'-TGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGT) y cebador inverso (SEQ ID NO: 14: 5-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGC CTGGCAGTTC-CCTACTCTC).

[0113] Cada amplicón de PCR (300 ng) que representa la respectiva secuencia de ARNr humano o de E. coli se 30 analizó mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio como se muestra en la Figura 1A.

Clon de ARN ribosomal 28S

[0114] La amplificación por PCR de la secuencia completa de ARNr 28S (n.º de acceso NR_003287) resultó no ser

35 muy eficaz, especialmente para la secuencia de extremo 5' de aproximadamente 1.200 nt, incluso tras la división de la secuencia de longitud completa en segmentos de 1 Kb a 2 Kb. Así pues, para generar el molde necesario para la síntesis in vitro del ARNr antisentido 28S, se clonó la secuencia de ARNr 28S tanto en un plásmido que contenía el promotor del fago T7 (pSP73; Promega Corporation) y como en un plásmido que contenía el promotor del fago SP6 (pSP64; Promega Corporation) usando métodos y estrategias de clonación convencionales (Maniatis et. al. (1982)

40 “Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory”, Cold Spring Harbor, Nueva York, y la información descrita por Maden et al. (1987) Biochem. J. 246: 519-527.

Síntesis in vitro de moléculas de ARNr antisentido biotiniladas desde los respectivos moldes de PCR para secuencias de ARNr 18S, 5,8S y 5S humanas y 23S, 16S y 5S de E. coli

45 [0115] Se usó bien un kit de transcripción de alto rendimiento para T7 AmpliScribe™ o un kit de transcripción FLASH para T7 AmpliScribe™ (EPICENTRE, Madison, WI) para reacciones de transcripción in vitro (IVT) que comprendían de 500 ng a 1.000 ng de los respectivos moldes (18S, 5,8S y 5S humanos, y 23S, 16S y 5S de E. coli) realizadas según lo descrito por el fabricante (EPICENTRE Biotechnologies) con la siguiente modificación -se

50 reemplazó el trifosfato de uridina (UTP) por mezclas¡ de biotina-16-UTP y UTP que comprendían 10 %, 20 %, 35 %, 50 % o 60 % de biotina-16-UTP. Se incubaron las reacciones de IVT a 37 ºC durante 4 a 6 horas, y a continuación, el molde de ADN usado en cada reacción se digirió con DNasa I según las recomendaciones del fabricante. Cada ARNr antisentido biotinilado se purificó posteriormente usando mini-columnas RNAspin ilustra según las recomendaciones del fabricante (GE Healthcare) y se eluyeron en agua exenta de RNasa. Se trató cada ARNr

55 antisentido purificado con DNasa I Baseline-Zero™ según las recomendaciones del fabricante (EPICENTRE Biotechnologies) para retirar todas las trazas del molde de ADN usado para la transcripción. Se volvió a purificar el ARNr antisentido biotinilado usando mini-columnas RNAspin illustra, se eluyó en agua exenta de RNasa y se determinó la concentración de ARN mediante la medición de la absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro. (Nota: los experimentos posteriores mostraron que se obtuvieron mejores resultados para la generación de muestras

60 empobrecidas en ARNr con respecto al ARNr 5,8S y 5S eucariota o ARNr 5S procariota usando al menos aproximadamente el 75 % de biotina-16-UTP en la reacción de transcripción in vitro).

[0116] Cada ARN antisentido purificado (300 ng), que representa toda la secuencia de ARNr humana o de E. coli, analizado mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, se muestra en Figure 1B.

65

imagen15

restante era más pronunciada en el Carril 2, donde las microesferas se retiraron antes del procedimiento de limpieza de ARN ZYMO. Aunque no está claro, es posible que la adición de la mezcla de reacción de hibridación con las microesferas directamente a la columna de purificación de ARN reduzca la capacidad de unión de la columna dando lugar a la pérdida adicional del ARN antisentido biotinilado. No obstante, a raíz de este experimento, fue evidente

5 que 20 μl de las microesferas recubiertas de estreptavidina fueron insuficientes para retirar toda la cantidad de ARNr antisentido biotinilado usada.

[0122] Así pues, se analizaron otros 20 μl adicionales de microesferas lavadas para determinar si serían suficientes para retirar los 4 μl de ARNr antisentido biotinilado. Se prepararon cuatro reacciones, comprendiendo cada una 4 μl del ARNr antisentido biotinilado de E. coli en 1 x tampón de hibridación hasta un volumen final de 20 μl. Las reacciones se incubaron a 68 ºC durante 5 minutos y después a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió cada una de las reacciones n.º 2 y n.º 3 a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml recién preparado que contenía 20 μl de las microesferas recubiertas con estreptavidina lavadas y resuspendidas. Se añadió la reacción n.º 4 a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml nuevo que contenía 40 μl de las microesferas recubiertas con 15 estreptavidina lavadas y resuspendidas. Se añadió la reacción de control n.º 1 a un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,5 ml solo con tampón de unión/lavado. Las reacciones se incubaron además a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación suave ocasional (3-4 minutos) con el fin de permitir la formación del complejo de biotina-estreptavidina. Las reacciones se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 minutos usando una centrifugadora de sobremesa para sedimentar las microesferas, y se transfirió cada sobrenadante a nuevos tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Al sobrenadante de la reacción nº 3, se añadieron 20 μl más de las microesferas recubiertas con estreptavidina lavadas y se incubaron de nuevo a temperatura ambiente con agitación suave ocasional (3-4 minutos). Se centrifugó la reacción n.º 3 a 12.000 rpm durante 5 minutos una vez más y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. El ARN antisentido biotinilado contenido en cada una de las cuatro reacciones se purificó usando el procedimiento de limpieza de ARN ZYMO y se eluyó en 10 μl de

25 agua exenta de RNasa. Se analizó todo el material eluido para cada una por electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, como se muestra en la Figura 2B.

[0123] En la Figura 2B, el Carril 2 muestra de nuevo que el ARNr antisentido biotinilado no se elimina por completo cuando se usan solo 20 μl de microesferas. Sin embargo, cuando se usaron bien 20 μl de microesferas seguidos de otros 20 μl de microesferas o 40 μl de microesferas, parece que hay una extracción completa del ARNr antisentido biotinilado añadido (Carril 3 y Carril 4, respectivamente). Por lo tanto, en general, se prefirió el tratamiento con 40 μl de microesferas, ya que necesitó menos etapas.

[0124] A continuación, se analizó la cantidad de microesferas usadas como se describe en la Figura 2B para

35 determinar si también era suficiente para retirar eficazmente los híbridos de ARN ribosomal ARN bicatenario (ARNr bicatenario) formados tras el apareamiento del ARNr antisentido biotinilado y el ARNr nativo contenido en el ARN total. En primer lugar, para demostrar la formación del híbrido del ARNr bicatenario, se mezclaron 500 ng de ARN total de E. coli con 4 μl del ARNr antisentido biotinilado de E. coli en una reacción que comprendía 1 x tampón de hibridación en un volumen final de 20 μl. La reacción se incubó a 68 ºC durante 5 minutos y después a temperatura ambiente durante 15 minutos, se purificó usando el procedimiento de limpieza de ARN ZYMO y se eluyó en 10 μl de agua exenta de RNasa. Se analizó una parte alícuota de 5 μl mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio junto con cantidades equivalentes del ARN total de E. coli individual y ARNr antisentido biotinilado como se muestra en la Figura 2C. La Figura 2C, carril 3 muestra la formación eficaz de los híbridos de ARNr bicatenarios en comparación con las muestras de ARN sentido y antisentido individuales (Carriles 1 y 2,

45 respectivamente).

[0125] A continuación, se analizó la extracción de los híbridos de ARNr bicatenarios usando las cantidades de las microesferas lavadas descritas en la Figura 2B. Se prepararon tres reacciones (n.º 1, n.º 2 y n.º 3), comprendiendo cada una 500 ng de ARN total de E. coli y 4 μl del ARNr antisentido biotinilado de E. coli en 1 x tampón de hibridación hasta un volumen final de 20 μl, junto con dos reacciones de control -una que contenía solo el ARNr antisentido biotinilado de E. coli (n.º 4) y la otra, solo el ARN total de E. coli (n.º 5). Las reacciones se incubaron a 68 ºC durante 5 minutos y después a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió cada una de las reacciones n.º 1 y n.º 3 a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml recién preparado que contenía 20 μl de las microesferas recubiertas con estreptavidina lavadas y resuspendidas. Se añadió cada una de las reacciones n.º 2 y 55 n.º 4 a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml recién preparado que contenía 40 μl de las microesferas recubiertas con estreptavidina lavadas y resuspendidas. Se añadió la reacción de control n.º 5 a un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,5 ml que solo contenía tampón de unión/lavado. Las reacciones se incubaron además a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación suave ocasional (3-4 minutos) con el fin de permitir la formación del complejo de biotina-estreptavidina. Las reacciones se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 minutos usando una centrifugadora de sobremesa para sedimentar las microesferas, y se transfirió cada sobrenadante a nuevos tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Al sobrenadante de la reacción nº 3, se añadieron 20 μl más de las microesferas recubiertas con estreptavidina lavadas y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave ocasional (3-4 minutos). Se volvió a centrifugar la reacción n.º 3 a 12.000 rpm durante 5 minutos y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. El ARN contenido en cada una de las cinco 65 reacciones se purificó usando el procedimiento de limpieza de ARN ZYMO y se eluyó en 10 μl de agua exenta de

RNasa. Se analizó una parte alícuota de 5 μl de cada una por electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, como se muestra en la Figura 2D. Además, se procesaron 250 ng de ARN total de E. coli sin tratar como control.

5 [0126] En la Figura 2D, el Carril 1 muestra el ARNr bicatenario residual cuando se usan solo 20 μl de microesferas. Sin embargo, con bien 2 x 20 μl (Carril 2) o 1 x 40 μl de microesferas (Carril 3), los híbridos de ARNr bicatenarios ya no eran visibles, lo que indicaba que el ARNr antisentido biotinilado era capaz de aparearse a sus secuencias de ARNr sentido complementarias y facilitar su extracción mediante las microesferas de estreptavidina. La cantidad de ARN total de E. coli no pareció verse afectada por la adición de 40 μl de microesferas (Carril 5) en comparación con una cantidad similar de ARN total de E. coli sin tratar (Carril 6). Así pues, se hizo evidente que bastaban 40 μl de microesferas para retirar bien el ARNr antisentido biotinilado añadido o los híbridos de ARNr bicatenarios resultantes formados tras la hibridación del ARNr antisentido biotinilado al ARNr.

Ejemplo 3

15 Efecto del uso de diferentes niveles de biotina-UTP para la síntesis de ARNr antisentido biotinilado y su extracción con las microesferas recubiertas de estreptavidina

[0127] En los experimentos descritos en el Ejemplo 2 anterior, se usó ARNr antisentido biotinilado sintetizado usando una mezcla de UTP:biotina-UTP que comprendía biotina-UTP al 35 %. Para la cantidad de ARNr antisentido usada en la reacción de hibridación, se necesitaron 40 μl de las microesferas de estreptavidina para su eliminación eficaz. Por lo tanto, se pensó que el ARNr antisentido preparado con menores cantidades de biotina-UTP debería requerir menos microesferas de estreptavidina para su extracción cuantitativa, lo que resultaría en una reducción global del coste asociado con la cantidad de tanto la biotina-UTP como de las microesferas necesarias. Se

25 prepararon ARNr 16S y 23S antisentido biotinilados se prepararon usando soluciones de biotina-UTP bien al 10 % o al 20 % como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 y luego se prepararon mezclas de 4 μl convencionales de los respectivos ARNr antisentido biotinilados. Se usó el porcentaje de biotina-UTP usado en la reacción de transcripción in vitro para su síntesis para referirse al producto de ARNr antisentido biotinilado; por ejemplo, si el porcentaje de biotina-UTP usado en la reacción de transcripción in vitro era del 10 %, con el 90 % restante siendo UTP, el producto se denomina en el presente documento ARNr antisentido biotinilado al 10 %, a pesar de que el porcentaje de biotina-nucleótidos UTP incorporado en el producto puede ser inferior al 10 % en comparación con los nucleótidos UTP incorporados en el producto.

[0128] Se prepararon dos conjuntos de tres reacciones, comprendiendo cada una 4 μl del ARNr antisentido

35 biotinilado bien al 10 % (reacción n.º 1, n.º 2 y n.º 3) o al 20 % (reacciones n.º 4, n.º 5 y n.º 6) hasta un volumen final de 20 μl en 1 x tampón de hibridación. Las reacciones se incubaron a 68 ºC durante 5 minutos y después a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se transfirió cada una de las reacciones n.º 2 y n.º 5 a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml recién preparado que contenía 20 μl de las microesferas de estreptavidina lavadas, y cada una de las reacciones n.º 3 y n.º 6 se transfirió a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml recién preparado que contenía 40 μl de las microesferas de estreptavidina lavadas. Se transfirió cada una de las reacciones n.º 1 y n.º 4 a un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,5 ml que contenía 40 μl tampón de unión/lavado. Las reacciones se incubaron además a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación suave ocasional (3-4 minutos) con el fin de permitir la formación del complejo de biotina-estreptavidina. Las reacciones se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 minutos en una centrifugadora de sobremesa y el sobrenadante se transfirió a nuevos tubos de

45 microcentrifugación de 1,5 ml. Cualquier ARNr antisentido biotinilado que quedó en los sobrenadantes se purificó usando el procedimiento de limpieza de ARN ZYMO y se eluyó en 10 μl de agua exenta de RNasa. Se analizó toda la cantidad de cada muestra purificada mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, como se muestra en la Figura 3A.

[0129] En la Figura 3A, los Carriles 1 y 4 muestran el ARNr antisentido biotinilado al 10 % y al 20 % no tratado con microesferas, respectivamente. Los Carriles 2 y 3 muestran el ARNr antisentido biotinilado al 10 % tratado con 20 μl y 40 μl de microesferas, respectivamente. Los Carriles 5 y 6 muestran el ARNr antisentido biotinilado al 20 % tratado con 20 μl y 40 μl de microesferas, respectivamente. Claramente, hubo una cantidad importante de ARNr antisentido biotinilado tanto al 10 % como al 20 % restante independiente de bien 20 μl o 40 μl de microesferas usadas (Carriles

55 2, 3, 5 y 6). Sin embargo, la condición del 20 % (Carriles 5 y 6) fue claramente mejor que la condición del 10 % (Carriles 2 y 3). Así pues, pareció que al usar estos niveles inferiores de biotina-UTP para sintetizar el ARNr biotinilado, al menos parte del producto de ARNr antisentido sintetizado puede no contener suficientes moléculas de biotina para facilitar su extracción mediante las microesferas de estreptavidina.

[0130] Así pues, surgió la cuestión de si la biotina-UTP al 35 % usada en Ejemplo 2 era la concentración óptima para garantizar que todo el ARNr antisentido sintetizado contuviera suficientes moléculas de biotina para su posterior extracción con perlas de estreptavidina. Para responder a esta pregunta, se realizó el siguiente experimento para analizar los ARNr antisentido biotinilados creados según lo descrito en el Ejemplo 1 usando soluciones de biotina-UTP bien al 50 % o al 60 %. A continuación, se preparó la mezcla de 4 μl convencional de los respectivos ARNr 16S 65 y 23S antisentido biotinilados sintetizados usando los niveles del 50 % y del 60 % de botina-UTP. La mezcla de 4 μl

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manera: se diluyeron las muestras de ADNc con factor de dilución de 2 a 10 en función de la cantidad inicial. A continuación, se añadió 1 μl de cada dilución a 25 μl de reacción qPCR que comprendía 1 x FS PreMix E (GREEN), 12,5 pmol de cebadores de PCR directo e inverso y 1 unidad de mezcla enzimática FS. Las condiciones de ciclado fueron de 98 ºC durante 2 minutos, seguido de 40-45 ciclos a 98 ºC durante 5 segundos, 60 ºC durante 15 segundos 5 y 72 ºC durante 30 segundos usando el iGycler Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Se usaron los siguientes pares de cebadores de QPCR para las secuencias de ARNr 18S (SEQ. ID. NO. 30: SEQ. ID. NO. 31, SEQ. ID. NO. 52: 5'-CTTAGAGGGACAAGTGGCG, SEQ. ID. NO. 53: 5'-GTAGGGTAGGCACACGCTGA, SEQ. ID. NO. 54: 5'-GAAACTTAAAGGAATTGACGGAAG, SEQ. ID. NO. 55: 5'-GAATCGAGAAAGAGCTATCAATC, SEQ. ID. NO. 56: 5'-CGATTGGATGGTTTAGTGAGG y SEQ. ID. NO. 57: 5'-CCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAG), 28S (SEQ. ID. 10 NO. 58: 5'-GCCGAAACGATCTCAACCTA, SEQ. ID. NO. 59: 5'-CGCCAGTTCTGCTTACCAAA, SEQ. ID. NO. 60: 5'-CGGACCAAGGAGTCTAACA, SEQ. ID. NO. 61: 5'-CAGGCATAGTTCACCATCTTTCG, SEQ. ID. NO. 62: 5'-GGAGAGGGTGTAAATCTCGC, SEQ. ID. NO. 63: 5'-GCCGACTTCCCTTACCTACA, SEQ. ID. NO. 64: 5'-GTGTCAGAAAAGTTACCACAGG, SEQ. ID. NO. 65: 5'-GGCGAATTCTGCTTCACAATGATAG, SEQ. ID. NO. 66: 5'-GGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGT, SEQ. ID. NO. 67: 5'-TTGGCTGTGGTTTCGCTGGAT, SEQ. ID. NO. 68: 5'

15 GTGAACAGCAGTTGAACATGG y SEQ. ID. NO. 69: 5'-CTTCACAAAGAAAAGAGAACTCTCCC), 5,8S (SEQ. ID. No. 70: 5'-CGACTCTTAGCGGTGGATCA y SEQ. ID. NO. 71: 5'-AAGCGACGCTCAGACAG) y 5S (SEQ. ID. NO. 5 y SEQ. ID. NO. 72: 5'-AAAGCCTACAGCACCCGGTATTC).

[0172] Los resultados de QPCR se muestran en la siguiente Tabla 2: 20

TABLA 2

Conjuntos de cebadores de QPCR: Porcentaje de reducción del ARN ribosomal

Método ilustrativo: Método RiboMinus™

ARN total de HeLa intacto (2,5 μg): ARN total de HeLa fragmentado (2,5 μg) ARN total de HeLa intacto (2,5 μg) ARN total de HeLa fragmentado (2,5 μg)

1BS.5' (nt 100 -nt 247): > 99,9 % > 99,9 % 93,30 % 50 %

18S.3' (nt 1.544 nt 1.663): > 99,9 % > 99,9 % 97,10 % 81,10 %

18S.F3/R3 (nt 1.288 -nt 1.417): > 99,9 % > 99,9 % 96,40 % 34 %

18S.F4/R4 (nt 1.818 -nt 1.937): > 99,9 % > 99,9 % 97,40 % 88,30 %

28S 3,5K (nt 1.748 -nt 1.867): > 99,9 % > 99,9 % 85,60 % 0 %

28S n.º 2 (nt 1.324 -nt 1.530): > 99,9 % 99,60 % 92,80 % 90,50 %

28S.F5/R5 (nt 4.341 -nt 4.456): > 99,9 % > 99,9 % 93,80 % 78,20 %

28S.5' n.º 2 (nt 2.740 -nt 2.843): > 99,9 % > 99,9 % 92,80 % 29,30 %

28S.F3/R3 (nt 2.401 -nt 2.630): > 99,9 % > 99,9 % 83,50 % 0 %

28S.F41R4 (nt 3.732 -nt 3.851): > 99,9 % > 99,9 % 82,30 % 0 %

5,8S (nt 1 -nt 157): > 99,9 % > 99,9 % 99,40 % 99,60 %

5S (nt 1-nt 121): 96,80 % 97,80 % 91,80 % 88,90 %

[0173] Claramente, a partir de los resultados de la Tabla 2, el método ilustrativo fue significativamente más eficaz en la extracción de todas las secuencias de ARN ribosomal independientemente de los conjuntos de cebadores

25 usados para las secuencias de ARNr tanto 28S como 18S con ARN total bien intacto o fragmentado. Sin embargo, para el método RiboMinus™ con el ARN fragmentado, hubo poca o ninguna sustracción ribosomal en función de la ubicación de los diferentes juegos de cebadores para las secuencias de ARNr tanto 28S como 18S.

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Claims

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