ES2645418T3 - Amplificación de una secuencia de un ácido ribonucleico - Google Patents
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Abstract
Un procedimientos de amplificación de ARN viral de secuencia desconocida de una muestra, que comprende: a) añadir una poli-A-polimerasa a una muestra de ARN viral no poliadenilado para unir un tramo de poli (A) al extremo 3'del ARN viral; (b) hibridar un oligonucleótido con el tramo de poli (A), en el que dicho oligonucleótido comprende un dominio de hibridación que comprende un tramo de poli (T) y un dominio funcional que comprende una región promotora de ARN polimerasa; (c) sintetizar ADNc bicatenario a partir del ARN víral y oligonucleótido, en el que la síntesis del ADNc bicatenario a partir del ARN viral y el oligonucleótido comprende la transcripción inversa de una primera cadena de dicho ADNc y la síntesis de una segunda cadena de dicho ADN; (d) amplificar el ADNc bicatenario con una ARN polimerasa para producir ARN antisentido amplificado; y (e) convertir el ARN antisentido amplificado en ADNc amplificado.
Description
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Amplificacion de una secuencia de un acido ribonucleico
Descripcion
CAMPO
La presente invencion se refiere a procedimientos y composiciones para marcar, amplificar, purificar y o caracterizar acido ribonucleico (ARN) en una muestra. En particular, se proporcionan procedimientos para la preparacion de ARN viral de secuencia desconocida a partir de una muestra para su analisis posterior.
ANTECEDENTES
Las tecnologfas de secuenciacion de proxima generacion estan revolucionando el proceso para la identificacion de patogenos en una muestra. Sin embargo, estas tecnologfas estan tipicamente limitadas en cuanto a que requieren una cantidad relativamente grande de ADN de entrada para secuenciar, mientras que las muestras clmicas/forenses/ambientales importantes de interes pueden contener niveles bajos de acido nucleico del patogeno viral importante. Para agravar aun mas este problema esta el hecho de que muchos virus patogenos importantes tienen genomas que estan compuestos por ARN.
El documento US 5.545.522 describe procesos en los que se sintetiza acido desoxirribonucleico complementario (ADNc) a partir de una secuencia de acido ribonucleico (ARN) usando un cebador complementario unido a una region promotora de la ARN polimerasa complementaria y, despues, se transcribe el aRn antisentido (ARNa) a partir del ADNc introduciendo una ARN polimerasa capaz de unirse a la region promotora.
El documento WO 99/29907 describe procedimientos para fabricar acidos nucleicos que implican anadir una secuencia de nucleotidos conocida al extremo 3' del primer ARN que tiene una secuencia conocida en el extremo 5' para formar un segundo ARN y transcribir de forma inversa el segundo ARN para formar un ADNc.
SUMARIO
La presente invencion proporciona procedimientos de amplificacion de ARN viral de secuencia desconocida de una muestra, que comprende: (a) anadir una poli-A-polimerasa a una muestra de ARN viral no poliadenilada para unir un tramo de poli(A) sobre el extremo 3' del ARN viral; (b) hibridar un oligonucleotido al tramo de poli(A), en el que dicho oligonucleotido comprende un dominio de hibridacion que comprende un tramo de poli(T) y un dominio funcional que comprende una region promotora de ARN polimerasa; (c) sintetizar ADNc de doble cadena a partir del ARN viral y el oligonucleotido, en el que la smtesis de ADNc bicatenario a partir del ARN viral y el oligonucleotido comprende la transcripcion inversa de una primera hebra de dicho ADNc y sintetizar una segunda hebra de dicho ADN; (d) amplificar el ADNc bicatenario con una ARN polimerasa para producir ARN antisentido amplificado; y (e) convertir el ARN antisentido amplificado en ADNc amplificado. En algunas realizaciones, dicho dominio de hibridacion esta en el extremo 3' de dicho oligonucleotido y dicho dominio funcional esta en el extremo 5' de dicho oligonucleotido. En algunas realizaciones, dicha region promotora de la ARN polimerasa comprende una region promotora de T7. En algunas realizaciones, dicha segunda hebra de dicho ADN. se sintetiza usando ARNasa H y ADN polimerasa. En algunas realizaciones, el ARN antisentido amplificado es una amplificacion de al menos 50 veces de dicho ADNc bicatenario. En algunas realizaciones, dicho aRn antisentido amplificado es una amplificacion de al menos 100 veces de dicho ADNc bicatenario. En algunas realizaciones, dicho aRn antisentido amplificado es una amplificacion de al menos 500 veces de dicho ADNc bicatenario. En algunas realizaciones, el ARN antisentido amplificado es una amplificacion de al menos 1000 veces de dicho ADNc bicatenario. En algunas realizaciones, convertir el ARN antisentido amplificado en ADNc amplificado comprende la transcripcion inversa. En algunas realizaciones, dicha muestra comprende una muestra biologica, ambiental y / o forense.
La presente invencion tambien proporciona procedimientos de secuenciacion de ARN viral de secuencia desconocida de una muestra, que comprende: (1) amplificar dicho ARN viral mediante: (a) anadir una poli-A- polimerasa a una muestra de ARN viral no poliadenilada para unir un tramo de poli(A) sobre el extremo 3' del ARN viral; (b) hibridar un oligonucleotido al tramo de poli(A), en el que dicho oligonucleotido comprende un dominio de hibridacion que comprende un tramo de poli(T) y un dominio funcional que comprende una region promotora de ARN polimerasa; (c) sintetizar ADNc de doble cadena a partir del ARN viral y el oligonucleotido, en el que la smtesis de ADNc bicatenario a partir del ARN viral y el oligonucleotido comprende la transcripcion inversa de una primera hebra de dicho ADNc y sintetizar una segunda hebra de dicho ADN; (d) amplificar el ADNc bicatenario con una ARN polimerasa para producir ARN antisentido amplificado; y (e) convertir el ARN antisentido amplificado en ADNc amplificado; y (2) secuenciar dicho ARN viral usando el ADNc amplificado. En algunas realizaciones, la secuenciacion es mediante una tecnica de secuenciacion de la proxima generacion.
Tambien se divulga en el presente documento kits para realizar la secuenciacion (por ejemplo, secuenciacion de siguiente generacion) y/o amplificacion de ARN (por ejemplo, poliadenilacion, transcripcion inversa, smtesis de ARN y transcripcion inversa) mediante los metodos de la invencion.
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DESCRIPCION DETALLADA
La presente invencion se refiere a procedimientos y composiciones para marcar, amplificar, purificar y o caracterizar acido ribonucleico (ARN) en una muestra. La presente invencion se refiere a metodos para marcar un ARN diana con un marcador de acido nucleico y usar dicho marcador para amplificar el ARN diana para el analisis aguas abajo. La presente invencion se refiere al uso de poli-A-polimerasa para unir una cola de poli(A) a ARN (por ejemplo, un material genomico viral etc.) dentro de una muestra (por ejemplo, biologica, clmica, forense, ambiental, de investigacion etc.). En la invencion, el ARN en una muestra esta marcado con poli(A). En la invencion, el ARN marcado (marcado con poli(A) se amplifica (por ejemplo, mediante ARN polimerasa de T7 usando el procedimiento de Eberwine, etc.). En algunas realizaciones, los procedimientos de la invencion generan una gran cantidad de acido nucleico a partir de niveles traza de ARN
(por ejemplo, material genomico viral) presente en una muestra (por ejemplo, biologica, clmica, forense, ambiental, investigacion, etc.). La presente invencion implica la conversion de ARN (amplificado a partir de una muestra) en ADN (ADNc). En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona metodos para la secuenciacion (por ejemplo, secuenciacion de proxima generacion) de acidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ADNc). En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona la identificacion y / o caracterizacion de virus de ARN patogenicos en una muestra (por ejemplo, mediante marcado con poli(A), amplificacion de ARN, conversion de ARN a ADNc y secuenciacion de ADN). En algunas realizaciones, los procedimientos y kits descritos en el presente documento se usan para amplificar ARN de una muestra (por ejemplo, una muestra que contiene traza de ARN de una muestra).
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invencion comprenden una o mas de las etapas de: (1) poliadenilacion del ARN diana en una muestra mediante la adicion de polimerasa poli(A) (o un equivalente funcional) a una muestra para producir una cola de poli (A) en ARN no poliadenilado (por ejemplo, ARN viral) dentro de la muestra; (2) adicion de un cebador de transcripcion inversa (cebador de TI), que comprende un segmento 3'- poli(T) y una region promotora en 5' (por ejemplo, promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, promotor de ARN polimerasa T7), al ARN en una muestra; (3) hibridacion del segmento 3'-poli(T) de un cebador de TI al segmento de poli(A) de un ARN diana; (4) transcripcion inversa del ARN diana del cebador de TI; (5) smtesis de la segunda hebra (por ejemplo, usando ARNasa H y ADN polimerasa I), para producir ADNc bicatenario del ARN diana; (6) terminacion roma del ADNc (por ejemplo, con ADN polimerasa T4); (7) transcripcion de ADNc por una ARN polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de T7) en ARN antisentido amplificado (ARNa), (8) conversion (mediante transcripcion inversa de ARNm amplificado en ADNc y (9) analisis o manipulacion adicional de ADNc (por ejemplo, secuenciacion). En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden cada una de las etapas anteriores en orden. En algunas realizaciones, se realizan una o mas de las etapas anteriores. En algunas realizaciones, el orden de las etapas anteriores se modifica. En algunas realizaciones, las etapas se llevan a cabo usando diferentes tecnicas, componentes y / o reactivos que los descritos anteriormente. En algunas realizaciones, modificaciones, etapas adicionales, reordenamiento de etapas, etc. estan dentro del alcance de las realizaciones de la presente invencion.
En algunas realizaciones, en los procedimientos en el presente documento se usa una muestra que contiene ARN. En algunas realizaciones, una muestra puede ser cualquier muestra que comprenda una molecula de ARN diana. La muestra de ARN puede obtenerse de una celula, cultivo celular, un fluido corporal, un tejido, un organo, el medio ambiente (por ejemplo, muestras de aceite, muestras de agua y muestras de aire), etc. En ciertas realizaciones, las muestras comprenden una mezcla de uno o mas de ARN eucariotico, ARN bacteriano y / o ARN viral. En algunas realizaciones, la muestra de ARN comprende uno o mas tipos de ARN viral.
En algunas realizaciones de la divulgacion, cualquier acido nucleico adecuado (por ejemplo, ADN, ARN, etc.) proporciona un material de partida y / o un molde inicial para los procedimientos del presente documento. En algunas realizaciones de la divulgacion, el material de partida y / o el molde inicial comprenden ARN (por ejemplo, ARN viral, ARN genomico viral, ARN bacteriano, ARN humano, etc.). En la invencion, el material de partida y / o el molde inicial comprenden ARN viral y / o ARN genomico viral. En algunas realizaciones, el ARN viral puede ser monocatenario o bicatenario. El ARN de cualquier virus adecuado (conocido o desconocido) encuentra uso como diana en realizaciones de la presente invencion. En algunas realizaciones, el ARN objetivo comprende ARN de un virus ARNdc, virus ARN de cadena positiva, virus de ARNmc de sentido positivo, virus de ARNmc de sentido negativo o cualquier virus de familias de los mismos. En algunas realizaciones de la divulgacion, el material de partida y / o el molde inicial comprenden ARN bacteriano y/o ARN de transcriptoma bacteriano. Un material de partida inicial puede convertirse a partir de un primer tipo de acido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) en un segundo tipo de acido nucleico (por ejemplo, ARN o aDn). En la invencion, el acido nucleico del molde inicial comprende ARN viral no poliadenilado.
En algunas realizaciones, se usa un molde de acido nucleico adecuado para una poli (A) polimerasa (por ejemplo, ARN, ARN genomico viral, etc.). En algunas realizaciones, se usa una muestra que comprende un molde adecuado para una poli (A) polimerasa (por ejemplo, ARN, ARN genomico viral, etc.). En algunas realizaciones, se usa una muestra (por ejemplo, clmica, biologica, ambiental, forense, etc.) que puede contener, o se sospecha que contiene, uno o mas moldes para una poli (A) polimerasa (por ejemplo, ARN genomico viral). En algunas realizaciones, una muestra contiene ARN de uno o mas genomas virales (por ejemplo, genomas completos, genomas parciales, etc.). En algunas realizaciones, el ARN genomico viral carece de una cola de poli (A).
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En algunas realizaciones, se agrega un marcador de acido nucleico a un ARN diana. n algunas realizaciones, se agrega un marcador de acido nucleico al extremo 3' de un ARN diana. En algunas realizaciones, se anade qmmica o enzimaticamente un marcador de acido nucleico. En algunas realizaciones, un marcador de acido nucleico comprende un sitio de hibridacion para uno o mas oligonucleotidos (por ejemplo, para las siguientes etapas del presente documento). En las realizaciones descritas en el presente documento, el marcador de acido nucleico comprende, consiste en, o consiste esencialmente en un tracto de poli (A) (por ejemplo, 5-500 nucleotidos A, 20-250 nucleotidos A, etc.). Debe observarse que las realizaciones que se describen en el presente documento junto con un marcador poli (A) tambien pueden implementarse con marcadores de acido nucleico de otras secuencias. El alcance de la divulgacion en el presente documento no debe estar limitado por el tipo de marcador (por ejemplo, poli (A)) descrito junto con cualquier realizacion descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, se usan cebadores y otros oligonucleotidos adecuados para llevar a cabo las etapas de los presentes procedimientos. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos hibridan con una porcion (por ejemplo, cola de poli (A)) de acidos nucleicos diana. En algunas realizaciones, al menos una parte (por ejemplo, el extremo 3 ') de un oligonucleotido se hibrida con al menos una porcion (por ejemplo, cola de poli (A)) de un acido nucleico diana. En algunas realizaciones, al menos una parte (por ejemplo, el extremo 5') de un oligonucleotido no es complementaria del objetivo. En algunas realizaciones, se usan oligonucleotidos que comprenden un segmento poli (T). En algunas realizaciones, la parte en 3' de un oligonucleotido comprende un segmento poli (T). En algunas realizaciones, se usan oligonucleotidos que comprenden una region promotora de la ARN polimerasa. En algunas realizaciones, la parte en 5' de un oligonucleotido comprende una region promotora de ARN polimerasa. En algunas realizaciones, se usan oligonucleotidos que comprenden un segmento poli (T) en el extremo 3' y una region promotora de ARN polimerasa en o cerca del extremo 5'.
En algunas realizaciones, los oligonucleotidos y / o acidos nucleicos producidos por las etapas descritas en el presente documento comprenden al menos un dominio de amplificacion. Como se usa en el presente documento, un dominio de amplificacion sera principalmente una secuencia que puede soportar la amplificacion de un acido nucleico que comprende dicha secuencia (por ejemplo, mediante PCR, mediante ARN polimerasa, etc.). El uso de secuencias de acido nucleico en reacciones de amplificacion es bien conocido en la tecnica, y en el presente documento se describen ejemplos no limitantes. En algunas realizaciones, un dominio de amplificacion comprendera una secuencia que puede soportar la union y extension del cebador. Se aplican reglas estandar para el diseno de cebadores (Sambrook, 1994). En algunas realizaciones, un dominio de amplificacion comprendera preferiblemente un sitio de union al cebador para la amplificacion por PCR. Los parametros para el diseno de cebadores para PCR son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Beasley et al, 1999). Tambien se contemplan sitios de union al cebador para otros tipos de procedimientos de amplificacion. En algunas realizaciones, un dominio de amplificacion comprende una secuencia promotora (por ejemplo, para una ARN polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de T7)). En algunas realizaciones, una secuencia promotora (un "dominio de transcripcion") es una secuencia de acido nucleico a la que se une una ARN polimerasa para iniciar la transcripcion. En algunas realizaciones, un dominio de amplificacion en un acido nucleico monocatenario comprende una unica hebra de la region promotora (por ejemplo, para una ARN polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de T7)). En algunas realizaciones, se usa un oligonucleotido que comprende la segunda hebra de una region promotora (por ejemplo, para una ARN polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de T7)). En algunas realizaciones, un oligonucleotido tambien comprende otros dominios funcionales (por ejemplo, dominios de marcaje, dominios de hibridacion (por ejemplo, poli (T), etc.). En algunas realizaciones, un oligonucleotido que comprende una cadena de una region promotora se hibrida con un acido nucleico que comprende la segunda cadena de una region promotora para producir una region promotora bicatenaria (por ejemplo, para una ARN polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de T7)).
En ciertas realizaciones de la invencion, los procedimientos comprenden reducir el ADN de una muestra (por ejemplo, antes del marcaje con poli (A) del ARN objetivo, antes de la TI del objetivo, antes de la amplificacion del ARN objetivo, etc.). Los expertos en la tecnica conocen bien los procedimientos para reducir el ADN o separar el ADN del ARN. Un abordaje habitual para reducir el ADN es incubar la muestra con ADNasa. Otro procedimiento para separar el ADN del ARN es la precipitacion en cloruro de litio. Los sistemas de aislamiento de ARN basados en filtros tambien son conocidos en la tecnica.
En algunas realizaciones de la invencion, los procedimientos comprenden reducir el ARNm poliadenilado de una muestra antes de marcar con poli(A) el ARN objetivo. Los expertos en la tecnica conocen bien procedimientos para aislar espedficamente ARNm poliadenilado de una muestra. Por ejemplo, un procedimiento comun para aislar ARNm poliadenilado comprende hibridar el ARNm poliadenilado con un oligonucleotido poli (T). Tfpicamente, el oligonucleotido poli (T) esta unido a una superficie, tal como una columna o una esfera. Despues de que el ARNm poliadenilado se hibrida con el oligonucleotido de poli (T), se puede separar de la muestra. Por ejemplo, si el ARNm poliadenilado se hibrida con el oligonucleotido de poli (T) inmovilizado sobre una esfera magnetica. A continuacion, las esferas pueden separar de la muestra usando un iman.
En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden agotar el ARNr de la muestra. Dependiendo de la composicion de la muestra, puede ser deseable agotar el ARNr eucariotico, el ARNr bacteriano o ambos. El ARNr puede hibridar con uno o mas oligonucleotidos complementarios al menos a una parte de uno o mas del ARNr 17S, ARNr 18S o ARNr 28S o eucariotas o al menos una parte de uno o mas del ARNr 16S o ARNr 23S o procariotas.
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Los complejos de hibridacion se eliminan de la muestra con un sistema de captura apropiado.
La poliadenilacion es la adicion de una cola de poli (A) a una molecula de ARN. La poliadenilacion se lleva a cabo mediante una poli-A polimerasa. La polimerasa Poli-A es una enzima comercialmente disponible que cataliza la adicion de adenosina al extremo 3' del ARN de una manera independiente de la secuencia. En algunas realizaciones, cualquier enzima adecuada para anadir una cola de poli (A) al extremo 3' de un ARN, de una manera independiente de la secuencia encuentra uso en la presente invencion. La poli-A polimerasa tambien se conoce como: polinucleotido adenililtransferasa, NTP polimerasa, enzima de adenilacion de ARN, AMP polinucleotidilexotransferasa, ATP-polinucleotido adenililtransferasa, ATP-polinucleotidilexotransferasa, poli(A) sintetasa, poliadenilato nucleotidiltransferasa, poliadenilato polimerasa, poliadenilato sintetasa, acido poliademlico polimerasa, polimerasa poliademlica, riboadenilato terminal transferasa, factores de formacion de poli(A) hidrolasa ARN, PF1 o adenosina trifosfato;acido ribonucleico adenililtransferasa, En algunas realizaciones, cualquier poli (A) polimerasa adecuada para la adicion de adenosinas (por ejemplo,> 5,> 10,> 20,> 50, etc.) al extremo 3' de un molde de ARN inicial (por ejemplo, ARN genomico viral) encuentra uso con realizaciones de la presente invencion. En algunas realizaciones, cualquier poli (A) polimerasa adecuada para producir un sitio de union para un promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, aRn polimerasa de T7) encuentra uso en realizaciones de la presente invencion. En algunas realizaciones, cualquier polimerasa adecuada para la smtesis de ARN independiente de molde encuentra uso con las realizaciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, cualquier polimerasa adecuada para la smtesis de poli(A) independiente de molde encuentra uso con las realizaciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden usar poli (A) polimerasas tales como poli (A) polimerasa I de E. coli o poli (A) polimerasa de levadura. Tambien se pueden usar poli (A) polimerasas de origen de mairnfero o viral. Las enzimas poli (A) polimerasas recombinantes pueden usarse en los procedimientos y kits de la presente divulgacion. Las enzimas poli (A) polimerasas se describen en, por ejemplo, Yehudai-Resheff, S. et al. (2000); Mohanty y Kushner (1999); Mohanty y Kushner (2000); Cao y Sarkar (1997); Raynal et al. (1996).
En algunas realizaciones, los procedimientos del presente documento implican la amplificacion de ARN usando el procedimiento de Eberwine (Van Gelder et al. Proc Natl Acad Sci USA. l990 Mar; 87(5):1663-7; Eberwine et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89:3010-3014), procedimientos de Eberwine modificados y porciones de los mismos. El procedimiento de Eberwine aprovecha el hecho de que el ARNm eucariotico tiene una cola de poli (A) de origen natural. Este procedimiento usa la cola de poli (A) para unir un promotor de ARN polimerasa de T7 al ARNm, seguido de amplificacion de ARN extensa con ARN polimerasa de T7.
En algunas realizaciones, se describe el marcaje (por ejemplo, marcaje en el extremo 3') del ARN objetivo con un marcador de acido nucleico (por ejemplo, el tramo de poli (A)) (por ejemplo, qmmicamente, enzimaticamente). En algunas realizaciones, la poliadenilacion en 3' se realiza mediante una poli (A)) polimerasa (o un equivalente funcional) a una muestra para producir una cola de poli (A) sobre ARN no poliadenilado (por ejemplo, ARN viral). Los expertos en la tecnica conocen procedimientos para anadir secuencias de acidos nucleicos a moleculas de ARN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se usa una poli (A) polimerasa, tal como poli (A) polimerasa I de E. coli o poli (A) polimerasa de levadura, para anadir una secuencia de poli (A) al extremo 3' de una ARN.
En algunas realizaciones, el ADN complementario (ADNc) se sintetiza a partir de un molde de ARN (por ejemplo, ARN objetivo, ARN objetivo poliadenilado, ARN objetivo marcado, etc.) en una reaccion catalizada por una enzima transcriptasa inversa y una enzima ADN polimerasa. En algunas realizaciones, se anaden a la muestra un cebador de transcripcion inversa (cebador TI), transcriptasa inversa y desoxinucleotido trifosfatos (A, T, G, C). En algunas realizaciones, un cebador de TI comprende un segmento de hibridacion en 3' (por ejemplo, para hibridar a un ARN objetivo marcado) y una region promotora en 5' (por ejemplo, promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, promotor de ARN polimerasa de T7). En algunas realizaciones, un cebador de TI comprende un segmento 3'-poli(T) y una region promotora en 5' (por ejemplo, promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, promotor de ARN polimerasa de T7). En algunas realizaciones se sintetiza una cadena de ADN que es complementaria al ARN objetivo. En algunas realizaciones, se produce un ADN / ARN hfbrido (una hebra de cada uno). En algunas realizaciones, para sintetizar una cadena de ADN adicional (para producir un ADNc duplex), el ARN objetivo de la cadena hfbrida se digiere (por ejemplo, usando una enzima como ARNasa H). Despues de la digestion del ARN, queda un ADN monocatenario (ADNmc). En algunas realizaciones, debido a que los acidos nucleicos monocatenarios son hidrofobos, tiende a enrollarse alrededor de sf mismo y formar un lazo en horquilla en 3'. En algunas realizaciones, a partir del bucle de la horquilla, una ADN polimerasa puede usarlo como un cebador para transcribir una secuencia complementaria del ADNc mc, dando como resultado un ADNc bicatenario con secuencia identica al ARN objetivo. Cualquier otro procedimiento adecuado para la smtesis de ADNc y / o la smtesis de las segundas hebras esta dentro del alcance de las realizaciones de la presente invencion (Vease, por ejemplo, Nature Methods 2, 151-152 (2005); D'Alessio & Gerard. Nucleic Acids Res. 1988 March 25; 16(5 Pt B): 1999-2014). En algunas realizaciones descritas en el presente documento, despues de la smtesis de una primera cadena de ADNc a partir de un molde de ARN, la smtesis de la segunda cadena se lleva a cabo por cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, usando ARNasa H y ADN polimerasa I) para producir un ADNc de doble cadena.
Cualquier transcriptasa inversa adecuada para llevar a cabo los procedimientos descritos en el presente documento encuentra uso con la presente invencion. En algunas realizaciones, la transcriptasa inversa es la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Moloney (MMLV) o la transcriptasa inversa del virus de la
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mieloblastosis aviar (AMV). La transcriptasa inversa puede ser una transcriptasa inversa mutante, siempre que los mutantes conserven la actividad de srntesis de ADNc. Los ejemplos de mutantes de transcriptasa inversa incluyen aquellos con actividad de ARNasa H reducida o ausente (por ejemplo, Superscript™ II, Superscript® III y ThermoScript® (Invitrogen)) y aquellos con actividad potenciada a temperatures mas altas (Superscript III y ThermoScript). (Invitrogen)).
En algunas realizaciones, se realizan etapas para eliminar los extremos salientes y / o adhesivos de acidos nucleicos (por ejemplo, ADNc) a traves de un procedimiento de terminacion roma. En algunas realizaciones, se llevan a cabo etapas para eliminar los extremos salientes y / o adhesivos del ADNc producido por los procedimientos descritos en el presente documento mediante tecnicas comprendidas en la materia. En algunas realizaciones se producen extremos romos en el ADNc. Los extremos romos se pueden realizar mediante diversas enzimas y / o combinaciones de enzimas. Por ejemplo, la ADN ligasa de T4 formara los extremos romos en el ADN rellenando los salientes de 5' usando su actividad de polimerasa 5'-3', o recortando los salientes en 3' con su actividad de exonucleasa 3'-5'. De manera similar, la nucleasa de frijol mungo cortara los salientes 5' o 3' como una exonucleasa. Cualesquiera otras tecnicas apropiadas de formacion de extremos romos conocidas en la materia encuentran uso en el presente documento.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los ADNc producidos por los procedimientos descritos en el presente documento se transcriben mediante una ARN polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de T7) en ARN (por ejemplo, ARN antisentido amplificado (ARNa)). En algunas realizaciones descritas en el presente documento, pueden producirse copias multiples de ARNa a partir de un unico ADNc a traves de la transcripcion de ARN, amplificando asf la secuencia. En algunas realizaciones, una secuencia de acido nucleico se amplifica mediante srntesis procesiva de multiples moleculas de ARN a partir de un unico molde de ADNc, lo que da como resultado una ARN antisentido amplificado (ARNa). Los procedimientos para la srntesis de ARNa se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 5.545.522, 5.716.785 y 5.891.636. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, estos procedimientos implican la incorporacion de un promotor de ARN polimerasa en una molecula de ADNc cebando la srntesis de ADNc con un complejo de cebador que comprende un oligonucleotido sintetico que contiene el promotor. Despues de la srntesis de ADNc de doble cadena, se agrega una transcriptasa inversa y el ARN antisentido se transcribe a partir del molde de ADNc. La amplificacion, que tfpicamente sera de al menos aproximadamente 500 veces, pero puede ser de al menos aproximadamente 1.000, 5.000, 10.000, 15.000 o 20.000 veces o mas, se puede lograr a partir de cantidades de nanogramos o menos de ADNc. Una ventaja de la srntesis procesiva de ARNa sobre la PCR es que solo se necesita conocer una region de secuencia compartida para sintetizar ARNa; la PCR generalmente requiere que las secuencias compartidas sean conocidas tanto en 5' como en 3' a la region de interes, y que estas regiones flanqueantes esten suficientemente cerca para permitir una amplificacion eficiente.
En algunas realizaciones, se produce ADNc que contiene un promotor para la ARN polimerasa de SP6, T3 o T7. La ARN polimerasa utilizada para la transcripcion debe ser capaz de unirse operativamente a la region promotora particular empleada en el complejo promotor-cebador. Una ARN polimerasa preferente es la que se encuentra en los bacteriofagos, en particular los fagos SP6, T3 y T7.
En algunas realizaciones, el ARNa amplificado creado por los procedimientos descritos en el presente documento se transcribe de forma inversa en ADNc. Las transcriptasas inversas adecuadas se describen en el presente documento y las condiciones adecuadas para dicha transcripcion inversa estan dentro de la experiencia de los expertos en el campo.
Se dispone de una serie de procesos dependientes de molde para amplificar las secuencias presentes en una muestra dada. Un ejemplo no limitante es la reaccion en cadena de la polimerasa (denominada PCR) que se describe coN detalle en las patentes de Estados Unidos numeros 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y en Innis et al, 1988. Otros procedimientos no limitantes para la amplificacion de secuencias de acido nucleico objetivo que se pueden usar en la practica de la presente invencion se divulgan en las patentes de Estados Unidos numeros 5.843.650, 5.846.709, 5.846.783, 5.849.546, 5.849.497, 5.849.547, 5.858.652, 5.866.366, 5.916.776, 5.922.574, 5.928.905, 5.928.906, 5.932.451, 5.935.825, 5.939.291 y 5.942.391, solicitud de GB N° 2 202 328, y en la solicitud de PCT N°. PCT/US89/01025.
En algunas realizaciones, se puede realizar un procedimiento de amplificacion por PCR con transcriptasa inversa para amplificar poblaciones de ARN. Los procedimientos de transcripcion inversa del ARN en ADNc son bien conocidos (vease Sambrook 1989). Procedimientos alternativos para la transcripcion inversa usan ADN polimerasas termoestables. Estos procedimientos se describen en el documento WO 90/07641. Adicionalmente, se describen procedimientos representativos de RT-PCR en la patente de Estados Unidos N.° 5.882.864.
Otros procedimientos de amplificacion de acido nucleico no limitantes incluyen sistemas de amplificacion basados en la transcripcion (TAS), incluida la amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh y col., 1989; Gingeras y col., solicitud de PCT WO 88/10315). La solicitud europea N.° 329 822 divulga un procedimiento de amplificacion de acido nucleico que implica sintetizar dclicamente el ARN monocatenario (("ARNmc"), ADNmc y ADN bicatenario (ADNbc), que se puede usar de acuerdo con la presente invencion.
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La amplificacion basada en secuencia de acido nucleico (NASBA) (Guatelli, 1990; Compton, 1991) hace uso de tres enzimas, transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT), ARNasa H de E. coli y ARN polimerasa de T7 para inducir ciclos repetidos de transcripcion inversa y transcripcion de ARN. La reaccion de NASBA comienza con el cebado de la smtesis de ADNc de la primera cadena con un oligonucleotido espedfico de gen (cebador 1) que comprende un promotor de ARN polimerasa de T7. La ARNasa H digiere el ARN en el duplex de ADN:ARN resultante que proporciona acceso de un cebador (o cebadores) espedfico del objetivo aguas arriba (cebador 2) a la copia de ADNc del objetivo u objetivos de ARN espedficos. AMV-RT extiende el segundo cebador, produciendo un segmento de ADNc de doble cadena (ADNdc) con un promotor de polimerasa de T7 en un extremo. El ADNc sirve como molde para la ARN polimerasa de T7 que sintetizara muchas copias de ARN en la primera fase de la reaccion NASBA dclica. El ARN sirve como moldes para una segunda ronda de transcripcion inversa con el segundo cebador espedfico del gen, produciendo finalmente mas moldes de ADN que respaldan la transcripcion adicional. En algunas realizaciones, NASBA puede adaptarse a la presente invencion para proporcionar amplificacion de las secuencias objetivo.
En ciertas realizaciones, se usa amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA). La SDA es un esquema de amplificacion isotermica que incluye cinco etapas: union de cebadores de amplificacion a una secuencia objetivo, extension de los cebadores mediante una polimerasa de exonucleasa deficiente que incorpora un trifosfato de desoxinucleosido alfa-tio, mellado del acido nucleico de doble cadena hemifosforotioato en un sitio de restriccion, disociacion de la enzima de restriccion del sitio de la muesca, y extension desde el extremo 3' de la muesca mediante una polimerasa deficiente en exonucleasa con desplazamiento de la cadena no molde aguas abajo. La formacion de mellas, la polimerizacion y el desplazamiento se producen de forma concurrente y continua a una temperatura constante, ya que la extension desde la mella regenera otro sitio de restriccion de hemifosforotioato. En realizaciones en las que se usan cebadores para ambas cadenas de una secuencia objetivo bicatenaria, la amplificacion es exponencial, ya que las cadenas sentido y antisentido sirven como moldes para el cebador opuesto en rondas de amplificacion posteriores. En algunas realizaciones, SDA puede adaptarse a la presente invencion para proporcionar amplificacion de las secuencias objetivo.
En ciertas realizaciones, se usa amplificacion por transcripcion de ARN. Las moleculas de ADN con promotores pueden ser moldes para una cualquiera de varias ARN polimerasas (Sambrook 1989). Una reaccion de transcripcion in vitro eficiente puede convertir un unico molde de ADN en cientos e incluso miles de transcritos de ARN. Si bien este nivel de amplificacion es ordenes de magnitud menor que la que se logra mediante otros procedimientos de amplificacion, es suficiente para la amplificacion de acidos nucleicos, y proporciona smtesis de acidos nucleicos sin la necesidad de cebadores opuestos en ninguno de los extremos de una secuencia deseada.
En algunas realizaciones, los procedimientos y kits divulgados en el presente documento encuentran uso con tecnicas de biologfa molecular adicionales para el analisis de acidos nucleicos o que implican el mismo. En algunas realizaciones, las secuencias de acido nucleico (por ejemplo, polimorfismos de un solo nucleotido, mutaciones, secuencia completa, etc.) se detectan y / o se determinan por cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, ensayo de deteccion de acido nucleico, secuenciacion de acido nucleico, hibridacion de acido nucleico, etc. ). El alcance de la presente invencion no esta limitado por la aplicacion, los procedimientos o las tecnicas con los que encuentran uso (por ejemplo, deteccion de acidos nucleicos, secuenciacion de acidos nucleicos, identificacion de acidos nucleicos, etc.).
En algunas realizaciones, las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento encuentran uso con la secuenciacion de acidos nucleicos (por ejemplo, produccion de material de partida para la secuenciacion a partir de pequenas cantidades de ARN viral). En algunas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento se usan para preparar un molde de acido nucleico a partir de una muestra para su uso en la secuenciacion de acido nucleico. En algunas realizaciones, se detecta acido nucleico y / o se determina la secuencia de un acido nucleico mediante secuenciacion de acido nucleico. En algunas realizaciones, el acido nucleico se secuencia usando cualquier tipo de tecnologfa de secuenciacion adecuada. La presente invencion no esta limitada por el tipo de metodo de secuenciacion usado. A continuacion se describen ejemplos de procedimientos de secuenciacion. Entre los ejemplos no limitantes ilustrativos de las tecnicas de secuenciacion de acidos nucleicos se incluyen, pero no se limitan a, secuenciacion de terminacion de cadena (Sanger), secuenciacion de terminacion de colorante y metodos de secuenciacion de la proxima generacion.
La secuenciacion de terminacion de cadena utiliza la terminacion espedfica de secuencia de una reaccion de smtesis de ADN usando sustratos de nucleotidos modificados. La extension se inicia en un sitio espedfico en el ADN molde utilizando un cebador oligonucleotfdico radioactivo corto, u otro marcado, complementario del molde en esa region. El cebador oligonucleotfdico se extiende utilizando una ADN polimerasa, cuatro bases de desoxinucleotidos estandar y una concentracion baja de un nucleotido de terminacion de cadena, mas habitualmente un didesoxinucleotido. Esta reaccion se repite en cuatro tubos separados, turnandose cada una de las bases como didesoxinucleotido. La incorporacion limitada del nucleotido de terminacion de cadena por la ADN polimerasa da como resultado una serie de fragmentos de ADN relacionados que se terminan solamente en las posiciones en las que se utiliza dicho didesoxinucleotido particular. Para cada tubo de reaccion, los fragmentos se separan por tamano mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida plano o un tubo capilar relleno con un polfmero viscoso. La secuencia se determina leyendo que calle produce una marca visualizada desde el cebador marcado mientras se
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escanea desde la parte superior del gel hasta la parte inferior.
La secuenciacion del terminador de colorante marca, alternativamente los terminadores. La secuenciacion completa se puede llevar a cabo en una sola reaccion marcando cada uno de los terminadores de cadena de los didesoxinucleotidos con un colorante fluorescente separado, que brilla a una longitud de onda diferente.
Un conjunto de metodos conocidos como tecnicas de "secuenciacion de proxima generacion" han surgido como alternativas a los metodos de secuenciacion de Sanger y por terminador colorante (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296). La tecnologfa de secuenciacion de proxima generacion permite la secuenciacion de novo de genomas completos para determinar la secuencia de acidos nucleicos primaria de un organismo. La tecnologfa de secuenciacion de proxima generacion tambien proporciona resecuenciacion espedfica (secuenciacion profunda), que permite la deteccion de mutaciones sensibles dentro de una poblacion de secuencias de tipo salvaje. Algunos ejemplos incluyen trabajos recientes que describen la identificacion de variantes de VIH resistentes a farmacos, asf como mutaciones del EGFR para determinar la respuesta a farmacos terapeuticos anti-TK. Las publicaciones que describen la secuenciacion de proxima generacion permiten la secuenciacion simultanea de multiples muestras durante un ciclo de secuenciacion tfpica, incluyendo, por ejemplo: Margulies, M. et al. "Genome Sequencing in Microfabricated High-Density Picolitre Reactors", Nature, 437, 376-80 (2005); Mikkelsen, T. et al. "Genome-Wide Maps of Chromatin State in Pluripotent and Lineage-Committed Cells", Nature, 448, 553-60 (2007); McLaughlin, S. et al. "Whole-Genome Resequencing with Short Reads: Accurate Mutation Discovery with Mate Pairs and Quality Values", ASHG Annual Meeting (2007); Shendure J. et al. "Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome", Science, 309, 1728-32 (2005); Harris, T. et al. "Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome", Science, 320, 106-9 (2008); Simen, B. et al. "Prevalence of Low Abundance Drug Resistant Variants by Ultra Deep Sequencing in Chronically HIV- infected Antiretroviral (ARV) Naive Patients and the Impact on Virologic Outcomes", 16th International HlV Drug Resistance Workshop, Barbados (2007); Thomas, R. et al. "Sensitive Mutation Detection in Heterogeneous Cancer Specimens by Massively Parallel Picoliter Reactor Sequencing", Nature Med., 12, 852-855 (2006); Mitsuya, Y. et al. "Minority Human Immunodeficiency Virus Type 1 Variants in Antiretroviral-Naive Persons with Reverse Transcriptase Codon 215 Revertant Mutations", J. Vir., 82, 10747-10755 (2008); Binladen, J. et al. "The Use of Coded PCR Primers Enables High-Throughput Sequencing of Multiple Homolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing", PLoS ONE, 2, e197 (2007); y Hoffmann, C. et al. "DNA Bar Coding and Pyrosequencing to Identify Rare HIV Drug Resistance Mutations", Nuc. Acids Res., 35, e91 (2007).
En comparacion con la secuenciacion tradicional de Sanger, la tecnologfa de secuenciacion de proxima generacion produce grandes cantidades de puntos de datos de secuenciacion. Un ciclo tfpico puede generar facilmente de decenas a cientos de megabases por ciclo, con una potencia salida diaria que llega al rango de gigabases. Esto se traduce en varios ordenes de magnitud mayor que una placa estandar de 96 pocillos, que puede generar varios cientos de puntos de datos en ciclo multiplex tfpico. Los amplicones diana que difieren en tan poco como un nucleotido pueden distinguirse facilmente, incluso cuando estan presentes multiples dianas de especies u organismos relacionados. Esto mejora en gran medida la capacidad de realizar un genotipado exacto. Los programas de software de alineacion de secuencia de proxima generacion usados para producir secuencias consenso pueden identificar facilmente nuevas mutaciones puntuales, lo que podna dar lugar a nuevas cepas con resistencias a farmacos asociadas. El uso de la codificacion de barras de cebadores tambien permite la multiplexacion de diferentes muestras de pacientes dentro de un solo ciclo de secuenciacion.
Los metodos de secuenciacion de proxima generacion (NGS) comparten la caractenstica comun de las estrategias masivas paralelas de alto rendimiento, con el objetivo de reducir los costes en comparacion con los metodos de secuenciacion mas antiguos. Los metodos de nGs pueden dividirse en lmeas generales en aquellos que requieren amplificacion del molde y los que no lo hacen. Los metodos que requieren amplificacion incluyen la pirosequenciacion comercializada por Roche como las plataformas tecnologicas 454 (por ejemplo, GS 20 y GS FLX), la plataforma Solexa comercializada por Illumina y la plataforma de Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD) comercializada por Applied Biosystems. Los enfoques de no amplificacion, tambien conocidos como secuenciacion de una sola molecula, se ilustran mediante la plataforma HeliScope comercializada por Helicos BioSciences, y plataformas emergentes comercializadas por VisiGen y Pacific Biosciences, respectivamente.
En la pirosecuenciacion (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de Estados Unidos n.° 6.210.891; patente de Estados Unidos n.° 6.258.568), el ADN molde se fragmenta, se reparan los extremos, se liga a los adaptadores y se amplifica clonalmente in situ capturando moleculas molde sencillas con perlas que llevan oligonucleotidos complementarios a los adaptadores. Cada perla portadora de un solo tipo de molde se compartimenta en una microvesfcula de agua en aceite y el molde se amplifica clonalmente utilizando una tecnica denominada PCR en emulsion. La emulsion se rompe despues de la amplificacion y las perlas se depositan en pocillos individuales de una placa de picotitulacion que funciona como una celda de flujo durante las reacciones de secuenciacion. La introduccion iterativa ordenada de cada uno de los cuatro reactivos de dNTP se produce en la celda de flujo en presencia de enzimas de secuenciacion e indicador luminiscente, tal como luciferasa. En el caso de que se anada un dNTP apropiado al extremo 3' del cebador de secuenciacion, la produccion resultante de ATP provoca una explosion de luminiscencia dentro del pocillo, que se registra utilizando una camara CCD. Es posible conseguir longitudes de lectura mayores o iguales a 400 bases 400
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bases y se pueden conseguir 1x106 lecturas de secuencias, dando como resultado hasta 500 millones de pares de bases (Mb) de secuencia.
En la plataforma Solexa / Illumina (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de Estados Unidos n.° 6.833.246; patente de Estados Unidos n.° 7.115.400; patente de Estados Unidos n.° 6.969.488), los datos de secuenciacion se producen en forma de lecturas de longitud mas corta. En este metodo, el ADN fragmentado monocatenario se repara en los extremos para generar extremos romos fosforilados en ', seguido de la adicion mediada por el fragmento Klenow de una unica base A al extremo 3' de los fragmentos. La adicion de A facilita la adicion de oligonucleotidos adaptadores sobresalientes de T, que se utilizan posteriormente para capturar las moleculas adaptadoras del molde sobre la superficie de una celda de flujo que esta tachonada con anclajes de oligonucleotidos. El anclaje se utiliza como cebador de PCR, pero debido a la longitud del molde y su proximidad a otros oligonucleotidos de anclaje cercanos, la extension por PCR da como resultado el "arqueamiento" de la molecula para hibridar con un oligonucleotido de anclaje adyacente para formar una estructura de puente sobre la superficie de la celda de flujo. Estos bucles de ADN son desnaturalizados y escindidos. A continuacion, las hebras delanteras se secuencian con terminadores colorantes reversibles. La secuencia de los nucleotidos incorporados se determina mediante deteccion de fluorescencia posterior a la incorporacion, con cada fluorescencia y bloque eliminados antes del siguiente ciclo de adicion de dNTP. La longitud de la lectura de la secuencia vana desde 36 nucleotidos a mas de 50 nucleotidos, con una produccion total superior a mil millones de pares de nucleotidos por analisis.
La secuenciacion de moleculas de acido nucleico usando tecnologfa SOLID (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de Estados Unidos n.° 5.912.148; patente de Estados Unidos n.° 6.130.073) tambien implica la fragmentacion del molde la union a los adaptadores de oligonucleotidos, la union a perlas y la amplificacion clonal por PCR en emulsion. Despues de esto, las perlas portadoras de molde se inmovilizan sobre una superficie derivatizada de una celda de flujo de vidrio y se hibrida un cebador complementario al oligonucleotido adaptador. Sin embargo, en lugar de utilizar este cebador para la extension en 3', en lugar de ello se utiliza para proporcionar un grupo fosfato en 5' para la union sondas identificadoras que contienen dos bases espedficas de sonda seguidas de 6 bases degeneradas y uno de cuatro marcadores fluorescentes. En el sistema SOLID, las sondas identificadoras tienen 16 posibles combinaciones de las dos bases en el extremo 3' de cada sonda y uno de cuatro fluor en el extremo 5'. El color fluorado y, por lo tanto, la identidad de cada sonda corresponde a esquemas de codificacion de espacio de color especificados. A varias rondas (normalmente 7) de hibridacion de la sonda, union y deteccion de fluor les sigue desnaturalizacion y, despues, una segunda ronda de secuenciacion usando un cebador que esta compensado por una base con respecto al cebador inicial. De esta manera, la secuencia molde puede reconstruirse por ordenador y las bases del molde se interrogan dos veces, lo que da como resultado una mayor precision. La longitud de lectura de la secuencia es de 35 nucleotidos y la produccion total supera los 4 mil millones de bases por ciclo de secuenciacion.
En ciertas realizaciones, se usa secuenciacion en nanoporos (vease, por ejemplo, Astier et al., J Am Chem Soc. 2006 Feb. 8; 128(5):1705-10). La teona detras de la secuenciacion en nanoporos tiene que ver con lo que se produce cuando el nanoporo se sumerge en un fluido conductor y se aplica un potencial (voltaje) a su traves: en estas condiciones se puede observar una ligera corriente electrica debido a la conduccion de iones a traves del nanoporo y la cantidad de corriente es extremadamente sensible al tamano del nanoporo. Si las moleculas de ADN pasan (o parte de la molecula de ADN pasa) a traves del nanoporo, se puede crear un cambio en la magnitud de la corriente a traves del nanoporo, lo que permite determinar las secuencias de la molecula de ADN.
HeliScope de Helicos BioSciences (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de Estados Unidos n.° 7.169.560; patente de Estados Unidos n.° 7.282.337; patente de Estados Unidos n.° 7.482.120; patente de Estados Unidos n.° 7.501.245; patente de Estados Unidos n.° 6.818.395; patente de Estados Unidos n.° 6.911.345; patente de Estados Unidos n.° 7.501.245) no requiere amplificacion clonal. El ADN molde se fragmenta y poliadenila en el extremo 3', portando la adenosina final un marcador fluorescente. Los fragmentos del molde poliadenilados desnaturalizados se ligan a oligonucleotidos poli(dT) sobre la superficie de una celda de flujo. Las localizaciones ffsicas iniciales de las moleculas molde capturadas son grabadas por una camara CCD y, despues, se escinde el marcador y se elimina mediante lavado. La secuenciacion se consigue mediante la adicion de polimerasa y la adicion en serie de reactivos de dNTP marcados con fluorescencia. Los acontecimientos de incorporacion producen una senal de fluor correspondiente al dNTP y la senal es capturada por una camara CCD antes de cada ronda de adicion de dNTP. La longitud de la lectura de la secuencia vana desde 25 nucleotidos a 50 nucleotidos, con una produccion total superior a mil millones de pares de nucleotidos por analisis.
Otros metodos emergentes de secuenciacion de moleculas individuales incluyen la secuenciacion en tiempo real mediante la smtesis utilizando una plataforma VisiGen (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; patente de Estados Unidos n.° 7.329.492; solicitud de patente de Estados Unidos n.° de serie 11/671.956; solicitud de patente de Estados Unidos n.° de serie 11/781.166) en la que el molde de ADN cebado inmovilizado se somete a extension de cadena usando una polimerasa modificada por fluorescencia y moleculas aceptoras fluorescentes, lo que da como resultado una transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia detectable (FRET) despues de la adicion de nucleotidos.
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Otro sistema de secuenciacion de moleculas individuales en tiempo real desarrollado por Pacific Biosciences (Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; patente de Estados Unidos n.° 7.170.050; patente de Estados Unidos n.° 7.302.146; patente de Estados Unidos n.° 7.313.308; patente de Estados Unidos n.° 7.476.503) utiliza pocillos de reaccion de 50-100 nm de diametro y que abarca un volumen de reaccion de aproximadamente 20 zeptolitros (10x10-21 l). Las reacciones de secuenciacion se llevan a cabo usando un molde inmovilizado, ADN polimerasa de phi29 modificada y concentraciones locales altas de dNTP marcados con fluorescencia. Las concentraciones locales altas y las condiciones de reaccion continuas permiten capturar acontecimientos de incorporacion en tiempo real mediante la deteccion de la senal fluorescente mediante excitacion por laser, una gma de ondas optica y una camara CCD.
En algunas realizaciones, las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento encuentran uso con deteccion de acido nucleico, caracterizacion y/o identificacion. En algunas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento se usan para preparar un molde de acido nucleico a partir de una muestra para su uso en el analisis posterior. En algunas realizaciones, el acido nucleico se detecta, caracteriza y/o identifica usando cualquier tecnologfa adecuada. La presente invencion no esta limitada por el tipo de metodos de analisis de acido nucleico usados. Ejemplos de procedimientos se describen a continuacion.
En algunas realizaciones, el acido nucleico se detecta mediante hibridacion con una sonda oligonucleotidica. Se dispone de diversos ensayos de hibridacion que usan varias tecnologfas de hibridacion y deteccion. Por ejemplo, en algunas realizaciones se usa el ensayo TaqMan (PE Biosystems, Foster City, Calif.; veanse, por ejemplo, las patetes de Estados Unidos n.° 5.962.233 y 5.538.848) El ensayo se realiza durante una reaccion de pCr. El ensayo TaqMan explota la actividad de exonucleasa 5'-3' de la ADN polimerasa AMPLITAQ GOLD. Una sonda compuesta por un oligonucleotido con un pigmento indicador en 5' (por ejemplo, un pigmento fluorescente) y un pigmento inactivador en 3' se incluye en la reaccion de PCR. Durante la PCR, si la sonda se une a su diana, la actividad nucleolftica 5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ GOLD escinde la sonda entre el pigmento indicador y el inactivador. La separacion del pigmento indicador del pigmento inactivador tiene como resultado un incremento de la fluorescencia. La senal se acumula con cada ciclo de PCR y se puede monitorizar con un fluonmetro.
En algunas realizaciones, el acido nucleico se detecta mediante analisis de transferencia Northern (por ejemplo, tras amplificacion mediante los procedimientos descritos en el presente documento). El analisis de transferencia Northern implica la separacion de acido nucleico y la hibridacion de una sonda marcada complementaria.
En algunas realizaciones, el acido nucleico se detecta utilizando un ensayo de deteccion (por ejemplo, despues de la amplificacion por los procedimientos descritos en el presente documento) que incluye, pero no se limita a los mismos, procedimientos de escision por apareamiento erroneo enzimatico (por ejemplo, Variagenics, Patentes de Estados Unidos n.° 6.110.684, 5.958.692, 5.851.770); reaccion en cadena de la polimerasa; procedimientos de hibridacion ramificada (por ejemplo, Chiron, Patentes de Estados Unidos n.° 5.849.481, 5.710.264, 5.124.246, y 5.624.802); replicacion por cfrculo rodante (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 6.210.884, 6.183.960 y 6.235.502); nAsBA (por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.409.818); tecnologfa de balizas moleculares (por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 6.150.097); tecnologfa de sensor E (Motorola, Patentes de Estados Unidos n.° 6.248.229, 6.221.583, 6.013.170 y 6.063.573); tecnologfa de sonda dclica (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 5.403.711, 5.011.769 y 5.660.988); procedimientos de amplificacion de senal de Dade Behring (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 6.121.001, 6.110.677, 5.914.230, 5.882.867, and 5.792.614); reaccion en cadena de la ligasa (Barnay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); ensayos de FULL-VELOCITY; y procedimientos de hibridacion en sandwich (por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.288.609). En otras realizaciones, el ensayo de deteccion empleado es el ensayo INVADER (Third Wave Technologies) que se describe en las patentes de EE.UU. N.° 5.846.717, 5.985.557, 5.994.069, 6.001.567, y 6.090.543, WO 97/27214, WO 98/42873, Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17: 292 (1999), y Hall et al., PNAS, USA, 97: 8272 (2000).
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede proporcionarse en un kit. En un ejemplo no limitativo, el kit, en un medio contenedor adecuado, comprende, uno o mas de: una poli (A) polimerasa, transcriptasa inversa, ARN polimerasa, nucleotidos; tampon; ARN de control, oligonucleotido, etc. Cualquiera de los otros reactivos tratados en el presente documento o implicados por los procedimientos descritos tambien puede incluirse en un kit.
Claims (13)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Un procedimientos de amplificacion de ARN viral de secuencia desconocida de una muestra, que comprende:a) anadir una poli-A-polimerasa a una muestra de ARN viral no poliadenilado para unir un tramo de poli (A) al extremo 3'del ARN viral;(b) hibridar un oligonucleotido con el tramo de poli (A), en el que dicho oligonucleotido comprende un dominio de hibridacion que comprende un tramo de poli (T) y un dominio funcional que comprende una region promotora de ARN polimerasa;(c) sintetizar ADNc bicatenario a partir del ARN viral y oligonucleotido, en el que la smtesis del ADNc bicatenario a partir del ARN viral y el oligonucleotido comprende la transcripcion inversa de una primera cadena de dicho ADNc y la smtesis de una segunda cadena de dicho ADN;(d) amplificar el ADNc bicatenario con una ARN polimerasa para producir ARN antisentido amplificado; y(e) convertir el ARN antisentido amplificado en ADNc amplificado.
- 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho dominio de hibridacion esta en el extremo 3' de dicho oligonucleotido y dicho dominio funcional esta en el extremo 5' de dicho oligonucleotido.
- 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha region promotora de ARN polimerasa comprende una region promotora de T7.
- 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha segunda cadena de dicho ADN se sintetiza usando ARNasa H y ADN polimerasa.
- 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho ARN antisentido amplificado:(i) es al menos una amplificacion de 50 veces de dicho ADNc de doble hebra;(ii) es al menos una amplificacion de 100 veces de dicho ADNc de doble hebra;(iii) es al menos una amplificacion de 500 veces de dicho ADNc de doble hebra; y/o(iv) es al menos una amplificacion de 1000 veces de dicho ADNc de doble hebra.
- 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la conversion del ARN antisentido amplificado en ADNc amplificado comprende la transcripcion inversa.
- 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha muestra comprende una muestra biologica, ambiental y / o forense.
- 8. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas la formacion de extremos romos en el ADNc.
- 9. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas deplecionar el ADN de la muestra.
- 10. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas reducir el ARNm poliadenilado de la muestra antes del ARN objetivo de marcado con poli (A).
- 11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la poli-A-polimerasa es poli (A) polimerasa I de E. coli o poli (A) polimerasa de levadura.
- 12. Un procedimientos de secuenciacion de ARN viral de secuencia desconocida de una muestra, que comprende:(1) amplificar dicho ARN viral por el procedimiento de la reivindicacion 1; y(2) secuenciar dicho ARN viral usando el ADNc amplificado.
- 13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que dicha secuenciacion es mediante una tecnica de secuenciacion de proxima generacion.
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