ES2573663T3

ES2573663T3 - Procedimiento para eliminar virus de una solución de anticuerpos monoclonales de concentración elevada

Info

Publication number: ES2573663T3
Application number: ES10755721.7T
Authority: ES
Inventors: Tomoko Hongo; Masayasu Komuro
Original assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2016-06-09
Anticipated expiration: 2030-03-26
Also published as: ES2573663T5; EP2412817A1; EP2412817A4; EP2412817B1; EP2412817B2; CN102365368A; CN102365368B; US9056896B2; JP5755136B2; US20120077963A1; JPWO2010109920A1; WO2010109920A1

Abstract

Procedimiento para producir una preparación que contiene un anticuerpo monoclonal, que comprende una etapa de eliminación de virus mediante la filtración de virus en una solución de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminación de virus, en el que (1) el contenido de monómero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o más; (2) la concentración de anticuerpo monoclonal en la solución de anticuerpos monoclonales varía de 20 mg/ml a 100 mg/ml; (3) la solución de anticuerpos monoclonales contiene, como mínimo, un aminoácido básico; y (4) la tasa de eliminación de parvovirus de la membrana para la eliminación de virus satisface las siguientes condiciones: LRV (Log Reduction Value: valor de reducción logarítmico) >= 4.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para eliminar virus de una solucion de anticuerpos monoclonales de concentracion elevada Sector tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento para eliminar virus existentes en una solucion de anticuerpos monoclonales de concentracion elevada y a un procedimiento para producir una solucion de anticuerpos monoclonales de concentracion elevada.

Antecedentes tecnicos

La inactivacion o eliminacion de virus es necesaria para el procedimiento de produccion de un farmaco de anticuerpo que contega un anticuerpo monoclonal producido por un cultivo celular, debido a los problemas sobre la contaminacion con virus de las materias primas o en las etapas de produccion. Como procedimiento para la inactivacion de virus que pueden contaminar un farmaco de anticuerpo, se realiza un tratamiento termico, un tratamiento que utiliza un agente quimico o similares. Sin embargo, los virus no pueden inactivarse de manera suficiente mediante solo dichos tratamientos. Ademas, estos procedimientos pueden desnaturalizar directamente el anticuerpo en el farmaco de anticuerpo. Partiendo de estos conocimientos previos, se realizan la separacion y la eliminacion de virus utilizando membranas de filtro como medios fisicos para eliminar virus sin desnaturalizacion quimica.

Como membranas de filtro para eliminacion de virus, son conocidas una membrana que comprende un material natural, tal como celulosa, y una membrana para la eliminacion de virus que comprende un material polimerico sintetico, tal como fluoruro de polivinilideno (PVDF) o polietersulfona (PES) (documentos no de patente 1 -4).

De manera ideal, puede filtrarse una mayor cantidad de anticuerpo en un corto periodo de tiempo y pueden eliminarse los virus con un rendimiento para la eliminacion de virus suficientemente elevado mediante la filtracion de un farmaco de anticuerpo utilizando un dispositivo para la eliminacion de virus que incluye la membrana anterior. Sin embargo, en la practica, una membrana de celulosa es problematica debido a que tiende a obstruirse incluso a concentraciones de anticuerpo de 20 mg/ml o superiores, muestra una baja resistencia a la presion y puede incrementar la presion de trabajo real hasta solo aproximadamente 100 kPa, a pesar de que la filtracion es posible, por ejemplo. De modo alternativo, una membrana de polimero sintetico puede tener una resistencia a la presion elevada y puede funcionar sin problemas incluso si se incrementa la presion de trabajo real hasta aproximadamente 300 kPa. Sin embargo, la membrana de polimero sintetico es problematica debido a que se obstruye cuando la concentracion de anticuerpo se incrementa hasta 20 mg/ml, haciendo que la filtracion sea imposible de realizar. Por lo tanto, la filtracion se realiza, en general, a bajas concentraciones de 10 mg/ml o inferiores.

Sin embargo, en los ultimos anos, se han incrementado las concentraciones farmaceuticas de farmacos de anticuerpo. Reflejando esta tendencia, esta aumentando la demanda de un incremento en la concentracion de anticuerpo durante la etapa de filtracion para eliminar virus. Cuando se incrementa la concentracion de anticuerpo en una solucion de anticuerpos monoclonales, los anticuerpos monoclonales tienden a asociarse entre si formando agregados. Cuando se realiza la filtracion utilizando una membrana que tiene un diametro de poro pequeno, como en el caso de una membrana para la eliminacion de virus, la asociacion de los anticuerpos monoclonales entre si resulta mas significativa debido al estres fisico resultante de la filtracion y, de este modo, la membrana para la eliminacion de virus se obstruye tal y como se ha descrito anteriormente.

En particular, a efectos de eliminar un virus pequeno que tiene un diametro de aproximadamente 18-24 nm, tal como un parvovirus, de una solucion de anticuerpos monoclonales a una tasa de eliminacion alta, se requiere una membrana para la eliminacion de virus con un diametro de poro pequeno destinado a la eliminacion de parvovirus. Dicha membrana es problematica debido a que se obstruye facilmente cuando se filtra una solucion de anticuerpos monoclonales de alta concentracion, la tasa de recuperacion del anticuerpo resultante es desfavorablemente baja y se requiere mucho tiempo para la filtracion.

Existe una referencia en la tecnica anterior que no da a conocer ningun anticuerpo monoclonal, pero da a conocer un procedimiento para eliminar virus de una solucion de proteinas mediante nanofiltracion. De manera especifica, el procedimiento dirigido a fibrinogeno comprende: anadir, como minimo, un ingrediente que se selecciona entre una sustancia caotropica seleccionada entre arginina, guanidina, citrulina, urea, un derivado de las mismas, y una sal de las mismas, y un compuesto seleccionado entre ester de polietoxi sorbitano y un derivado del mismo, a una solucion de proteinas; y, a continuacion, filtrar la solucion de proteinas utilizando una membrana para la eliminacion de virus que tiene un diametro de poro de 15 nm o mas y menos de 35 nm (documento de patente 1).

El documento de patente 1 da a conocer la suposicion de que el ingrediente puede suprimir o inhibir la asociacion de moleculas de proteina o la formacion de capas hidratadas en las proximidades de las moleculas. Sin embargo, las proteinas previstas en el presente documento son factores de coagulacion de la sangre, tales como el fibrinogeno y el factor VIII. Ademas, en los ejemplos en el documento de patente 1, se compara simplemente la permeabilidad de

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membrana de una solucion de fibrinogeno en presencia de arginina con la misma en ausencia de arginina. Ademas, la concentracion de fibrinogeno es inferior a 5 mg/ml y la materia descrita es una solucion de baja concentracion. El fibrinogeno es una proteina larga, fina y filiforme que tiene una longitud de casi 60 nm, que se polimeriza tras una hemorragia y, de este modo, es util para la hemostasia. Por otra parte, un anticuerpo monoclonal es una proteina esferica que tiene un diametro de aproximadamente 15 nm y que tiene propiedades fisicoquimicas (por ejemplo, punto isoelectrico e hidrofilicidad) que difieren de manera significativa de las del fibrinogeno. El documento de patente 1 es una invencion relacionada con el fibrinogeno. Ademas, la invencion del documento de patente 1 no es una tecnologia relacionada con anticuerpos monoclonales, sino una tecnologia relacionada con el fibrinogeno como una proteina que tiene propiedades que difieren completamente de las de los anticuerpos monoclonales. Por lo tanto, el documento de patente 1 no es una buena referencia para la purificacion de anticuerpos monoclonales.

El documento de patente 2 da a conocer un procedimiento para la eliminacion de virus de una solucion que contiene fibrinogeno que puede contener virus mediante la utilizacion de una membrana para la eliminacion de virus, que se caracteriza porque la solucion que contiene fibrinogeno contiene aminoacidos basicos o sales de los mismos y cloruro sodico. El documento de patente 2 tambien se refiere a la eliminacion de virus utilizando una membrana en la que se utiliza una solucion de fibrinogeno. Ademas, la concentracion de proteina en el documento de patente 2 se encuentra entre un minimo de 5 mg/ml y 16,5 mg/ml, lo que difiriere de manera significativa de la solucion de anticuerpos monoclonales de alta concentracion que es el objetivo de la presente solicitud. Ademas, la membrana para la eliminacion de virus utilizada en el documento de patente 2 es una membrana con una baja capacidad de eliminar virus pequenos, tales como parvovirus, y permite que los virus pequenos pasen a su traves. Los tamanos de los virus a eliminar por la invencion del documento de patente 2 son mayores que los de los virus objetivo de la presente solicitud. Por lo tanto, la tecnologia del documento de patente 2 no plantea ningun problema sobre la filtracion con respecto a la relacion entre los agregados de anticuerpos monoclonales y la membrana.

Las condiciones de la solucion (por ejemplo, pH y fuerza ionica) cuando se utiliza una membrana para la eliminacion de virus en un procedimiento de purificacion para un anticuerpo monoclonal, son variadas. Por consiguiente, las propiedades fisicoquimicas de la superficie del anticuerpo y de la superficie de la membrana difieren dependiendo de las condiciones de la solucion. En realidad, se ha dado un caso en el que el flujo era muy bajo despues de la filtracion de los anticuerpos dependiendo de las condiciones de la solucion. La interaccion entre la superficie del anticuerpo y la superficie de la membrana es una de las razones para un flujo tan bajo, y, en particular, la interaccion electrostatica que actua entre las dos afecta a un flujo tan bajo. La propiedad de la carga electrica de la superficie del anticuerpo y de la superficie de la membrana se expresa como potencial superficial (potencial zeta) que cambia a un estado de potencial positivo o negativo dependiendo de la relacion entre el pH de la solucion y el punto isoelectrico (pi). Se sabe que pi de un anticuerpo monoclonal varia de 6 a 10. Cuando el pH < pi, un anticuerpo monoclonal tiene un potencial muy positivo y actua negativamente en la filtracion de la membrana. Por lo tanto, se cree que si se disminuye el potencial superficial de un anticuerpo y se suprime su interaccion electrostatica con la membrana, se mejorara el flujo durante la filtracion. Mientras tanto, en tales condiciones de la solucion, una solucion de anticuerpos monoclonales de alta concentracion es problematica porque la estabilidad de la dispersion es baja debido a las propias cargas de los anticuerpos, los anticuerpos tienden a formar agregados y, de este modo, el flujo disminuye con el tiempo durante la filtracion de membrana.

De manera especifica, no existe ningun documento de la tecnica anterior que se refiera a un procedimiento para eliminar incluso virus pequenos utilizando una membrana en un corto periodo de tiempo con un alto rendimiento a partir de una solucion de anticuerpos monoclonales de alta concentracion a traves del control de los potenciales superficiales de la membrana y de los anticuerpos y la supresion de la asociacion de los anticuerpos (contenidos en una solucion a alta concentracion) entre si, para mejorar la filtrabilidad de la membrana.

Documentos de la tecnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: publicacion de patente de Estados Unidos No. 2003/0232969 Documento de patente 2: publicacion de patente de Japon (Kokai) No. 2001-335509

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Manabe. S, Removal of virus through novel membrane filtration method. (“Eliminacion de virus a traves de un nuevo procedimiento de filtracion por membrana”, Dev. Biol. Stand., (1996) 88: 81-90.

Documento no de patente 2: Brandwein H y otros, Membrane filtration for virus removal (“Filtracion por membrana para la eliminacion de virus”), Dev Biol (Basilea)., (2000) 102: 157-63.

Documento no de patente 3: Aranha-Creado y otros, Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter. (“Depuracion del virus de la leucemia murino de una solucion de anticuerpos monoclonales mediante un filtro de membrana microporosa hidrofila de PVDF”), Biologicals. (1998) Junio; 26 (2): 167-72.

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Documento no de patente 4: Moce-Llivina y otros, Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions (“Comparacion de las membranas de fluoruro de polivinilideno y polietersulfona en la filtracion de suspensiones virales”), Journal of Virological Methods, (2003) Abril, volumen 109, numero 1, paginas 99-101.

Caracteristicas de la invencion

Objetivo a resolver por la invencion

En vista de los problemas anteriores, un objetivo de la presente invencion es dar a conocer un procedimiento para la eliminacion incluso de virus pequenos, de una solucion de anticuerpos monoclonales de alta concentracion utilizando una membrana y, de este modo, recuperar el anticuerpo en un corto periodo de tiempo con un alto rendimiento en forma de un filtrado.

Medios para resolver el objetivo

Como resultado de estudios exhaustivos para resolver los problemas anteriores, los presentes inventores de la presente invencion han descubierto que los virus existentes en una solucion de anticuerpos monoclonales de alta concentracion pueden eliminarse en una tasa de eliminacion elevada a traves de la filtracion con una membrana para la eliminacion de virus utilizando una solucion de anticuerpos monoclonales complementada con un aminoacido basico. De este modo, han desarrollado la presente invencion. De manera especifica, se da a conocer la siguiente invencion, segun la presente invencion.

[1] Un procedimiento para producir una preparacion que contiene un anticuerpo monoclonal, que comprende una etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de virus en una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

(2) la concentracion de anticuerpo monoclonal en la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 20 mg/ml a 100 mg/ml;

(3) la solucion de anticuerpos monoclonales contiene, como minimo, un aminoacido basico; y

(4) la tasa de eliminacion de parvovirus de la membrana para la eliminacion de virus satisface las siguientes condiciones: LRV (Log Reduction Value: valor de reduccion logaritmico) > 4.

[2] Un procedimiento para eliminar virus en una solucion de anticuerpos monoclonales, que comprende una etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de virus en una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

[3] Un procedimiento para producir una preparacion que contiene un anticuerpo monoclonal, que comprende una etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de virus en una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

(4) el potencial zeta Ei1 (mV) del anticuerpo monoclonal en la solucion satisface las siguientes condiciones:

a) 0 mV < Ei 1 - Em < 20 mV, con respeto al potencial zeta Em (mV) de la membrana para la eliminacion de virus; y satisface las siguientes condiciones:

b) 10 mV < Ei0 - Ei1 < 40 mV, con respecto al potencial zeta Ei0 (mV) del anticuerpo monoclonal en la solucion (pH = 4 y fuerza ionica de 0,1 mM) que contiene el anticuerpo monoclonal.

[4] Un procedimiento para eliminar virus mediante la filtracion de una solucion de anticuerpos monoclonales que contiene un anticuerpo monoclonal utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que: 1 2

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

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a) 0 mV < Ei 1 - Em < 20 mV, con respecto al potencial zeta Em (mV) de la membrana para la eliminacion de virus; y satisface las siguientes condiciones:

b) 10 mV < Ei0 - Ei 1 < 40 mV, con respeto al potencial zeta Ei0 (mV) del anticuerpo monoclonal en una solucion (pH = 4 y fuerza ionica de 0,1 mM) que contiene el anticuerpo monoclonal.

[5] El procedimiento, segun [3] o [4], en el que el potencial zeta Ei 1 (mV) del anticuerpo monoclonal en la solucion de anticuerpos monoclonales satisface las siguientes condiciones:

-4% x Em < Ei1 < -550% x Em, con respecto al potencial zeta Em (mV) de la membrana para la eliminacion de virus.

[6] El procedimiento, segun cualquiera de [3] a [5], en el que el potencial zeta Ei0 (mV) del anticuerpo monoclonal contenido en una solucion (pH = 4 y fuerza ionica de 0,1 mM) que contiene el anticuerpo monoclonal es de +25 mV o superior.

[7] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [6], en el que la solucion de anticuerpos monoclonales se prepara mediante cultivo celular.

[8] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [7], en el que el pH de la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 4 a 7.

[9] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [8], en el que el material de la membrana para la eliminacion de virus es celulosa.

[10] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [9], en el que el material de la membrana para la eliminacion de virus es un polimero sintetico hidrofilizado.

[11] El procedimiento, segun [10], en el que el polimero sintetico es fluoruro de polivinilideno, polietersulfona, polisulfona o polietileno.

[12] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [11], en el que el aminoacido basico es arginina, histidina, lisina o un derivado de los mismos, o una sal de los mismos.

[13] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [12], en el que el contenido de aminoacido basico en la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 0,1 mmol/g a 20 mmol/g con respecto al anticuerpo.

[14] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [13], en el que el rendimiento de anticuerpo es de 2 kg/m2/3 horas/bar (basandose en la presion) o mas.

[15] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [14], en el que la solucion de anticuerpos monoclonales contiene uno o mas tipos de elementos seleccionados entre una sal inorganica, un ingrediente tampon, un surfactante y un sacarido.

[16] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [15], en el que la filtracion que utiliza la membrana para la eliminacion de virus es filtracion en linea.

[17] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [16], en el que la etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus se realiza despues de cromatografia, concentracion o intercambio de tampon.

[18] El procedimiento, segun cualquiera de [1] a [17], en el que la etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus se realiza despues de concentracion o intercambio de tampon.

Efecto de la invencion

Segun la presente invencion, tanto la supresion de la formacion de agregados por los anticuerpos como el control de la relacion entre el potencial de los anticuerpos y el de la membrana se vuelven posibles, se puede tratar una solucion de anticuerpos monoclonales de alta concentracion en un corto periodo de tiempo con alto rendimiento, y se pueden eliminar incluso virus pequenos a tasas de eliminacion elevadas. Segun la presente invencion, se pueden esperar efectos adicionales, de manera que se puede simplificar la etapa de produccion de farmacos de anticuerpo, la etapa puede ser mas compacta y puede reducirse el coste de la etapa.

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Realizaciones para llevar a cabo la invencion

En lo sucesivo, la presente invencion se describira en detalle.

Los anticuerpos a utilizar en la presente invencion son anticuerpos monoclonales. Ademas, los anticuerpos monoclonales pueden producirse o purificarse mediante cualquier procedimiento. Los anticuerpos a utilizar en la presente invencion son, de manera preferente, anticuerpos monoclonales que se preparan mediante el cultivo de celulas animales, tales como CHO. Basicamente, se puede utilizar cualquiera de las tecnicas conocidas para la produccion de anticuerpos monoclonales. Se inmuniza un animal con un antigeno segun un procedimiento general de inmunizacion, se criban las celulas que producen anticuerpos monoclonales mediante un procedimiento de cribado conocido, se preparan los hibridomas de estas celulas con celulas tumorales, se cultivan los hibridomas a gran escala, de manera que pueden prepararse los anticuerpos monoclonales.

Ademas, los anticuerpos monoclonales a utilizar en el presente documento no se limitan a anticuerpos monoclonales (de raton) producidos por hibridomas. Entre los ejemplos de anticuerpos monoclonales a utilizar en el presente documento se incluyen anticuerpos quimericos modificados artificialmente con el proposito de reducir la antigenicidad de heteroanticuerpo contra un ser humano, o similares. De manera alternativa, tambien se puede utilizar un anticuerpo humanizado reconstruido para la presente invencion. Dicho anticuerpo humanizado reconstruido se prepara mediante la sustitucion de una region determinante de complementariedad de un anticuerpo humano por la misma de un anticuerpo de un mamifero no humano, tal como un raton. Para ello, tambien se conocen tecnicas generales de recombinacion de genes. Se puede obtener un anticuerpo humanizado reconstruido mediante dicho procedimiento conocido.

La concentracion de un anticuerpo en una solucion de anticuerpos monoclonales varia de 20 mg/ml a 100 mg/ml, de manera preferente, varia de 20 mg/ml a 80 mg/ml, de manera mas preferente, varia de 20 mg/ml a 70 mg/ml y, de manera aun mas preferente, varia de 20 mg/ml a 50 mg/ml. Cuando se incrementa la concentracion de un anticuerpo, la tasa de filtracion mediante una membrana para la eliminacion de virus tiende a disminuir.

La pureza de anticuerpo en una solucion de anticuerpos monoclonales es del 90% o mas (monomero) y, de manera mas preferente, del 95% o mas. Las impurezas distintas de monomeros contenidas en una solucion de anticuerpos son asociados y agregados que son dimeros, trimeros, tetrameros o multimeros mayores que los tetrameros de anticuerpos. Cuando las cantidades de asociados o agregados son elevadas, la membrana para la eliminacion de virus se obstruye despues de la filtracion y, de este modo, no se puede obtener un alto rendimiento.

Una solucion de anticuerpos monoclonales contiene, como minimo, un aminoacido basico. Como aminoacido basico, se pueden utilizar arginina, histidina, guanidina, lisina o un derivado de los mismos, o una sal de los mismos. Un aminoacido basico es, de manera preferente, arginina, histidina, lisina, o un derivado de los mismos, o una sal de los mismos. Un aminoacido basico es, de manera mas preferente, arginina o un derivado del mismo, o una sal del mismo.

La concentracion de un aminoacido basico en una solucion de anticuerpos monoclonales varia, de manera preferente, de 10 mM a 300 mM en vista del efecto de mejorar la filtrabilidad. Ademas, el contenido de aminoacido basico (con respecto a los anticuerpos) en una solucion de anticuerpos monoclonales varia, de manera preferente, de 0,1 mmol/g a 20 mmol/g, de manera mas preferente, varia de 0,3 mmol/g a 10 mmol/g y, de manera aun mas preferente, varia de 0,6 mmol/g a 7 mmol/g, en vista del efecto de mejorar la filtrabilidad.

(Principio de accion del aminoacido basico)

La razon del porque se mejora la filtrabilidad mediante la adicion de un aminoacido basico a una solucion de anticuerpos monoclonales sigue siendo una incognita. Los presentes inventores de la presente invencion consideran lo siguiente. Se sabe que un anticuerpo esta, en general, cargado (+) en el punto isoelectrico o inferior. Se cree que un aminoacido basico en la presente invencion tiene el efecto de disminuir el potencial de la superficie del anticuerpo y, de este modo, suprimir la interaccion electrostatica (atraccion electrostatica) con la carga (-) de la membrana para la eliminacion de virus. Ademas, en general, en el intervalo de pH proximo al punto isoelectrico de los anticuerpos, estos tienden a asociarse entre si a traves de interaccion hidrofoba, ya que la repulsion electrostatica entre los anticuerpos disminuye; o la filtrabilidad tiende a disminuir debido a la interaccion hidrofoba entre los anticuerpos y la membrana. Se considera que un aminoacido basico tambien tiene un efecto de supresion de la interaccion hidrofoba anticuerpo-anticuerpo y la interaccion hidrofoba anticuerpo-membrana.

El potencial superficial de los anticuerpos o de una membrana se expresa como potencial zeta. Con respecto a un procedimiento para medir el potencial zeta de superficie de anticuerpos o de una membrana, el potencial zeta de superficie se puede medir mediante un procedimiento de dispersion de luz electroforetica utilizando un analizador de potencial zeta ELS-Z (Otsuka Electronics Co., Ltd.), por ejemplo, pero el procedimiento de medicion no se limita a este. Cuando el potencial zeta de los anticuerpos monoclonales en condiciones de la solucion determinadas se designa como Ei 1 (mV) y el potencial zeta de una membrana para la eliminacion de virus en condiciones de la solucion determinadas se designa como Em (mV), los dos tienen, de manera deseable, la siguiente relacion. En el

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presente documento, la expresion "el potencial zeta de una membrana para la eliminacion de virus en condiciones de la solucion determinadas" se refiere a "el potencial zeta de la membrana para la eliminacion de virus correspondiente en condiciones en las que la membrana para la eliminacion de virus se llena con una solucion que tiene la misma composicion que la de una solucion de anticuerpos monoclonales, pero que no contiene anticuerpos monoclonales".

La relacion entre el potencial zeta Ei1 de anticuerpos y el potencial zeta Em de una membrana se representa, de manera deseable, por

0 mV < Ei 1 - Em < 20 mV,

Cuando el resultado de Ei1 - Em se encuentra dentro del intervalo que permite la disminucion de la interaccion entre los anticuerpos y la membrana, se cree que tiene un efecto en la mejora de la tasa de filtracion de la membrana. Un valor para Ei 1 - Em de mas de 20 mV provoca un aumento de la interaccion electrostatica entre los anticuerpos y la membrana, lo cual tiene un efecto adverso sobre la filtracion.

Ademas, con respecto al potencial de la membrana para la eliminacion de virus de la presente invencion, la membrana para la eliminacion de virus esta cargada negativamente dentro del intervalo de pH de la presente solicitud. Ademas, los anticuerpos estan cargados positivamente. Para expresarlo de otra manera, la relacion entre el potencial zeta Ei1 de anticuerpos y el potencial zeta Em de una membrana se representa, de manera deseable, por

-4% x Em < Ei 1 < -550% x Em

En el caso de los anticuerpos monoclonales de la presente invencion, el potencial zeta (potencial basico) de los anticuerpos, Ei0 (mV), al pH de o por debajo del punto isoelectrico de los anticuerpos, de manera especifica, pH = 4, y fuerza ionica de 0,1 mM, es, de manera deseable, de +25 mV o superior. De manera especifica, el potencial zeta es, de manera preferente, de +27 mV o superior y es, de manera mas preferente, de +29 mV o superior.

Para suprimir la interaccion electrostatica entre los anticuerpos y una membrana y, de este modo, permitir la expresion de alta filtrabilidad (flujo) mediante la adicion de un aminoacido basico, el potencial superficial (potencial zeta) Ei 1 de los anticuerpos disminuye, de manera deseable, hasta +20 mV o inferior.

Ademas, la relacion entre el potencial zeta de los anticuerpos Ei0 y Ei1 se representa, de manera deseable, por

10 mV < Ei0 - Ei1 < 40 mV.

Cuando el resultado de Ei0 - Ei1 es inferior a 10 mV, el efecto de disminuir el potencial basico de los anticuerpos es debil y, de este modo, no se puede obtener el efecto esperado de mejora de la tasa de filtracion.

El pH de una solucion de anticuerpos monoclonales varia, de manera preferente, de 4,0 a 7,0. Cuando el pH es inferior a 4,0 o superior a 7,0, los propios anticuerpos se pueden desnaturalizar o degradar. Dentro del intervalo de pH que varia de 4,0 a 7,0, los propios anticuerpos son estables y la superficie de los mismos esta cargada positivamente, de modo que se suprime la formacion de agregados. Ademas, un aminoacido basico muestra el efecto de mejorar la filtrabilidad dentro del intervalo de pH entre 4,0 y 7,0 despues de la filtracion de anticuerpos (contenidos en una solucion a alta concentracion) utilizando una membrana para la eliminacion de virus.

Una solucion de anticuerpos monoclonales puede contener ademas uno o mas tipos de elementos seleccionados entre sales inorganicas, ingredientes de tampon, surfactantes y sacaridos.

La solucion de anticuerpos monoclonales puede contener NaCl, una sal tampon, o similares, como sal inorganica. Como tampon, se pueden utilizar un tampon de acetato, un tampon de citrato, un tampon de fosfato, un tampon de Tris-HCl o similares. La concentracion de la sal inorganica o la concentracion del ingrediente de tampon varia, de manera preferente, de 10 mM a 500 mM en terminos de fuerza ionica. En el presente documento, la fuerza ionica se puede calcular mediante la siguiente formula.

Fuerza ionica = 1/2 x E (Ci x Zi2)

Ci; molaridad, Zi; valencia ionica

Como surfactante, se puede utilizar un surfactante no ionico, tal como Tween 20 o Tween 80. La concentracion de dicho surfactante que puede estar contenido varia del 0,01% en peso al 0,05 % en peso.

Como sacarido (por ejemplo, un monosacarido, un disacarido, un trisacarido, un oligosacarido o alcohol de azucar) que es un aditivo, la glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sorbosa, maltosa, sacarosa, sorbitol, manitol, dextrano o

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similares, pueden estar contenidos en una cantidad que varia del 1% en peso al 10 % en peso y que varia, de manera preferente, del 1% en peso al 5% en peso.

Como material para una membrana para la eliminacion de virus, se pueden utilizar celulosa o un polimero sintetico hidrofilizado. Como celulosa, se pueden utilizar celulosa regenerada, celulosa natural, celulosa de acido acetico y similares. Como polimero sintetico hidrofilizado, se pueden utilizar fluoruro de polivinilideno (PVDF) hidrofilizado, polietersulfona (PES) hidrofilizado, polietileno (PE) hidrofilizado, polisulfona (PS) hidrofilizada o similares. Un ejemplo de un procedimiento de hidrofilizacion es un procedimiento para introducir un grupo funcional hidrofilo o fijar un polimero hidrofilo a la superficie de una membrana a traves de recubrimiento, reaccion de injerto, reaccion de reticulacion o similares.

Con respecto a la forma de la membrana, se pueden utilizar una membrana plana o una membrana de fibra hueca. Cuando el area de la membrana es grande, se puede emplear un pequeno filtro (preparado mediante la carga de un recipiente con la membrana). Por lo tanto, la membrana utilizada en el presente documento es, de manera preferente, una membrana de fibra hueca. Se puede preparar un filtro en el que el espacio esta dividido por una membrana en un espacio principal en la cara de entrada para una solucion a ser filtrada y un espacio secundario en la cara de salida para la solucion filtrada. Cuando se utiliza una membrana para la eliminacion de virus para la filtracion, se puede utilizar en forma del filtro.

Es necesaria una membrana para la eliminacion de virus para conseguir una accion de eliminacion de parvovirus de LRV4 o mas y, de manera mas deseable, LRV5 o mas. Entre los ejemplos de filtros de eliminacion de virus disponibles en el mercado para la eliminacion de parvovirus se incluyen Planova® 15N (Asahi Kasei Medical) y Planova® 20N (Asahi Kasei Medical), en los que la membrana para la eliminacion de virus comprende celulosa, y Virosart CPV (Sartorius) y Viresolve Pro (Millipore) que comprenden PES hidrofilizada.

Existe un caso con respecto a parvovirus, en el que los anticuerpos monoclonales estan contaminados con los mismos en un procedimiento de produccion como resultado de la contaminacion de celulas CHO (derivadas de raton) con un parvovirus del raton. Las directrices de evaluacion de seguridad viral (ICH Q5A) para productos farmaceuticos biologicos producidos utilizando celulas animales han sido publicadas por la FDA.

Los parvovirus no tienen envoltura, de manera que son fisica y quimicamente estables. Por lo tanto, los parvovirus son resistentes al calor, pH bajo y al tratamiento con un agente quimico, que, en general, se llevan a cabo durante una etapa de inactivacion del procedimiento de produccion para una preparacion biologica. Por lo tanto, existe la necesidad creciente de un procedimiento para eliminar parvovirus utilizando una membrana para la eliminacion de virus como procedimiento para la eliminacion de virus, que tenga un modo de accion que difiera del de un procedimiento de inactivacion.

Los parvovirus pertenecen a la familia Parvoviridae y se sabe que son actualmente de los virus mas pequenos (1824 nm de diametro). Entre los ejemplos de parvovirus se incluyen parvovirus del raton (MVM), parvovirus porcino (PPV) y parvovirus canino (CPV). Para la evaluacion de la membrana para la eliminacion de virus de la presente solicitud, se utiliza PPV como virus modelo.

El rendimiento de eliminacion de virus de una membrana para la eliminacion de virus se representado mediante LRV (Valor de reduccion logaritmico).

El LRV se obtiene mediante el calculo del cambio en la concentracion viral en una solucion de anticuerpos entre antes y despues de la filtracion con la membrana para la eliminacion de virus mediante la siguiente formula.

LRV = log10 (Co/Cf)

en la que

Co = concentracion viral en una solucion de anticuerpos antes de la filtracion con la membrana para la eliminacion de virus, y

Cf = concentracion viral en la solucion de anticuerpos despues de la filtracion con la membrana para la eliminacion de virus

La concentracion viral puede expresarse con el titulo de infectividad, el numero de copias de acidos nucleicos virales y similares. Entre los ejemplos de un procedimiento para medir el titulo de infectividad se incluyen un procedimiento TCID50 y un procedimiento de placa. El numero de copias de acidos nucleicos virales se puede medir mediante un procedimiento de PCR o similar.

Antes de la filtracion con una membrana para la eliminacion de virus, la concentracion de los anticuerpos monoclonales se debe ajustar a un intervalo de 20 mg/ml a 100 mg/ml y la composicion de la solucion de anticuerpos debe ajustarse para contener, como minimo, un aminoacido basico. Tal como se ha descrito

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anteriormente, el pH de una solucion de anticuerpos monoclonales varia, de manera preferente, de 4 a 7. La concentracion de un aminoacido basico varia, de manera preferente, de 0,1 mmol/g a 20 mmol/g por anticuerpo.

Se anade un aminoacido basico a un eluato de anticuerpos para alcanzar una concentracion determinada despues del tratamiento con cromatografia, de manera que se pueda ajustar el pH a un valor determinado. De manera alternativa, tambien se puede realizar un intercambio de tampon mediante un procedimiento conocido, de manera que la composicion del tampon del eluato se intercambia por la composicion de una solucion ajustada a una concentracion determinada del aminoacido basico y el pH. Ademas, la concentracion del anticuerpo y el intercambio de tampon se realizan simultaneamente, de manera que la composicion de la solucion tambien se puede ajustar segun se desee. El ajuste del pH se puede realizar utilizando NaOH, HCl, acido inorganico, acido organico y tampon. Como tampon, se pueden utilizar un tampon de acetato, un tampon de citrato, un tampon de fosfato o similares.

El procedimiento de filtracion de una solucion de anticuerpos utilizando una membrana para la eliminacion de virus se lleva a cabo, de manera preferente, mediante filtracion en linea. De manera especifica, se pueden emplear una filtracion a presion constante utilizando una presion de filtracion constante o una filtracion a velocidad constante utilizando una velocidad de filtracion constante. La filtracion se realiza con una presion de filtracion que es la misma que o esta por debajo del nivel que la membrana puede soportar, dependiendo del material de la membrana para la eliminacion de virus a utilizar en el presente documento. Por ejemplo, en el caso de una membrana para la eliminacion de virus que comprende celulosa, la presion optima varia de 49 kPa (0,5 bar) a 98 kPa (1 bar). En los casos de PVDF hidrofilizado, PES hidrofilizada y PS hidrofilizada, la presion optima varia de 98 kPa (1 bar) a 490 kPa (5 bar).

La temperatura para la filtracion con una membrana para la eliminacion de virus puede estar dentro de cualquier intervalo de temperaturas, siempre que no tenga ningun efecto sobre el estado de la solucion de anticuerpos (el anticuerpo no se desnaturalice). De manera preferente, la temperatura varia de 4°C a 40°C y varia, de manera mas preferente, de 4°C a 35°C. La temperatura tiene un efecto sobre la viscosidad de la solucion de anticuerpos y tambien tiene un efecto sobre el flujo despues de la filtracion con una membrana para la eliminacion de virus. De este modo, la temperatura varia, de manera mas preferente, de 20°C a 35°C, dependiendo de la propia estabilidad del anticuerpo a la temperatura.

Despues del ajuste de la solucion para tener una composicion determinada y antes de la filtracion con una membrana para la eliminacion de virus, tambien se puede realizar una filtracion previa con un filtro que comprende una membrana con un diametro de poro mayor que el de la membrana para la eliminacion de virus. En el presente documento, como dicho filtro con un diametro de poro mas grande, se pueden utilizar Planova® 35N, Planova® 75N (estas son fabricadas por Asahi Kasei Medical), un filtro de 0,1 pmi, un filtro de 0,2 pmi, o similares. Sin la filtracion previa, la filtracion tambien se puede realizar directamente utilizando una membrana para la eliminacion de virus.

En general, el rendimiento de los anticuerpos (la cantidad de anticuerpo tratado) de 2 kg/m2/3 horas/bar (o 98 kPa) se obtiene por area de membrana para la eliminacion de virus, tiempo y presion de filtracion dentro de los intervalos mencionados anteriormente de concentracion de anticuerpos, presion de filtracion y temperatura. El rendimiento de los anticuerpos se calcula a partir del volumen (V) de filtrado por unidad anterior y la concentracion (C) de los anticuerpos recogidos en el filtrado (rendimiento de anticuerpos = V x C). Tanto la filtrabilidad como el rendimiento final se pueden evaluar basandose en el rendimiento.

(Posicion para la filtracion viral aguas abajo)

Se lleva a cabo una etapa de filtracion con una membrana para la eliminacion de virus despues de la cromatografia, despues de la concentracion, o despues de la concentracion/intercambio de tampon. Entre los ejemplos de cromatografia se incluyen la cromatografia en columna utilizando una columna rellena con una resina de intercambio ionico o una resina de filtracion en gel y la cromatografia de membrana utilizando una membrana porosa sobre la superficie de la cual se ha dispuesto un grupo de intercambio ionico. Entre los ejemplos de modos de separacion para la cromatografia se incluyen cromatografia de filtracion en gel, cromatografia de intercambio ionico (intercambio cationico; CEX o intercambio anionico; AEX), cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC), cromatografia de afinidad, cromatografia de afinidad a quelato metalico y cromatografia de hidroxiapatita Un ejemplo de cromatografia que utiliza un ligando es la cromatografia que utiliza intercambio ionico e interaccion hidrofoba combinados.

Se puede llevar a cabo una etapa de concentracion, segun un procedimiento conocido, utilizando una membrana de ultrafiltracion (UF). De manera especifica, la etapa puede realizarse mediante concentracion centrifuga.

Tambien se puede llevar a cabo una etapa de intercambio de tampon segun un procedimiento conocido. De manera especifica, la etapa de intercambio de tampon puede realizarse simultaneamente con la concentracion utilizando una membrana de ultrafiltro. La etapa de intercambio de tampon tambien se puede realizar mediante un procedimiento de filtracion en gel. La etapa de intercambio de tampon tambien se puede realizar mediante un procedimiento de dialisis utilizando una membrana de dialisis.

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Posteriormente a la filtracion utilizando una membrana para la eliminacion de virus, tambien se puede llevar a cabo un tratamiento de purificacion tambien mediante tratamiento por cromatograffa. Ademas, se puede conseguir una concentracion incluso mas elevada mediante el tratamiento con UF. La formulacion final tambien se puede realizar utilizando la misma composicion de solucion que la de despues de la filtracion con una membrana para la eliminacion de virus. Ademas, se anade un sacarido, un surfactante o similares, despues de la filtracion con una membrana para la eliminacion de virus y, a continuacion, se puede realizar tambien la formulacion final. Tambien es posible el intercambio del tampon por un disolvente que tiene otra composicion. Tambien se puede llevar cabo una liofilizacion.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, se utilizaron Planova® 20N (Asahi Kasei Medical) (en lo sucesivo denominado filtro A) que comprende una membrana de fibra hueca de celulosa como membrana para la eliminacion de virus y un filtro (en lo sucesivo denominado filtro B) que comprende una membrana de fibra hueca de fluoruro de polivinilideno hidrofilizado como membrana para la eliminacion de virus.

Ademas, como modelo de producto intermedio de una preparacion de anticuerpos monoclonales, se preparo una solucion de anticuerpos monoclonales segun el procedimiento descrito en la publicacion de patente internacional No. 04/087761 tal como se describe a continuacion ("Preparacion de anticuerpos monoclonales") y, a continuacion, se utilizo.

(Preparacion del filtro B)

Se agito y mezclo a 70°C utilizando un mezclador henschel (Mitsui Mining Co., Ltd.; formato: 20B) una composicion que comprendfa el 49% en peso de resina de fluoruro de polivinilideno (Kureha Corporation, T#1300) con un fndice de fluidez (MFI) de 2,5 (g/10 ml) y el 51% en peso de ftalato de diciclohexilo (Osaka Organic Chemical Industry Ltd., producto industrial), se enfrio y, a continuacion, se pulverizo. La composicion resultante se aplico utilizando una tolva a un extrusor de doble husillo cogiratorio (Technovel Corporation, KZW25TW-50MG-NH (-600)), se fundio y se mezclo a 210°C y, a continuacion, se disolvio de manera homogenea. Posteriormente, los productos disueltos de manera homogenea se extruyeron cada uno en forma de fibra hueca a partir de un orificio giratorio que comprende un orificio anular (diametro interior: 0,8 mm; diametro exterior: 1,05 mm) mientras se inyectaba ftalato de dibutilo (Daihachi Chemical Industry Co., Ltd., producto industrial) a 130°C en el interior hueco. Los productos se enfriaron y se solidificaron en agua de refrigeracion regulada a una temperatura de 10°C, 20°C, 30°C, o 40°C y, a continuacion, se enrollaron alrededor de un marco metalico a una velocidad de 50 m/minuto. Posteriormente, se extrajeron el ftalato de diciclohexilo y el ftalato de dibutilo y se retiraron con una solucion acuosa de alcohol isopropflico al 58% en peso (Daihachi Chemical Industry Co., Ltd., producto industrial). La solucion acuosa de alcohol isopropflico al 58% en peso adherida se sustituyo por agua. El producto resultante se sumergio en agua y, a continuacion, se calento a 125°C utilizando una autoclave (Hirayama Manufacturing Corporation, HV-85) durante 4 horas. El agua adherida se sustituyo por alcohol isopropflico (Daihachi Chemical Industry Co., Ltd., producto industrial) y, a continuacion, el producto resultante se seco utilizando un secador de vacfo (Stec Co., Ltd.) a una temperatura de 60°C, de manera que se obtuvo una membrana de fibra hueca microporosa. En todas las etapas desde el enrollado hasta el secado, el tratamiento se llevo a cabo mientras las longitudes de las fibras huecas permanecfan fijas.

Posteriormente, se llevo a cabo un tratamiento de hidrofilizacion mediante un procedimiento de injerto para la membrana microporosa anterior. Se preparo la solucion de reaccion utilizada en el presente documento mediante la disolucion de acrilato de hidroxipropilo (Osaka Organic Chemical Industry Ltd., producto industrial) en una solucion acuosa al 25% en volumen de 3-butanol (Junsei Chemical Co., Ltd., producto industrial) para conseguir acrilato de hidroxipropilo al 8% en volumen y, a continuacion, se realizo un burbujeo de nitrogeno durante 30 minutos mientras se mantema a 45°C. En primer lugar, en una atmosfera de nitrogeno, la membrana microporosa se irradio con 25 kGy de rayos y utilizando Co60 como fuente de radiacion mientras se enfriaba con hielo seco a -60°C. La membrana microporosa irradiada de este modo se dejo reposar durante 15 minutos a una presion reducida de 13,4 Pa o menos. La solucion de reaccion anterior y la membrana microporosa se pusieron en contacto entre sf a 60°C y, a continuacion, se dejaron reposar durante 1 hora. A continuacion, la membrana microporosa se lavo con una solucion acuosa de alcohol isopropflico al 58% en peso y, a continuacion, se sometio a 4 horas de secado al vacfo a 60°C. De este modo, se obtuvo una membrana microporosa hidrofila. Se confirmo que el agua se infiltraba de manera espontanea en los poros cuando la membrana microporosa se puso en contacto con el agua. Ambos extremos del haz de 12 membranas microporosas se sellaron con poliuretano. El haz de membranas se conecto a un cartucho en el que las membranas de fibra hueca de poliestireno se repartieron en un espacio en la cara de entrada y un espacio en la cara de salida, de manera que se preparo un filtro (area de membrana eficaz: 0,001 m2). El filtro obtenido por el procedimiento anterior que comprende las membranas de fibra hueca de PVDF hidrofilizado se indica en lo sucesivo en el presente documento como filtro B.

(Preparacion de anticuerpos monoclonales)

Se anadio un sobrenadante de cultivo libre de suero de celulas CHO (1500 ml) (nivel de expresion: 700 mg/l) que contema un anticuerpo monoclonal humano (IgG1 humana) depurado con un filtro de profundidad y un filtro de

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membrana de 0,2 |j.m (velocidad lineal: 500 cm/h) a una columna de proteina A (GE Healthcare Bioscience, MabSelect 20 mm DI X 20 cm) que habia sido equilibrada con tampon de fosfato de sodio 10 (mmol/l) (pH 6,0). A continuacion, se eluyo el anticuerpo monoclonal humano (velocidad lineal: 500 cm/h) utilizando 5 volumenes de columna de tampon de citrato de sodio 20 mmol/l (pH 3,4). El eluato se neutralizo con tampon de fosfato de sodio 10 mmol/l (pH 8,2), se ajusto a pH 8,0 utilizando Tris-Hcl 1,5 (mmol/l) y, a continuacion, se anadio (velocidad lineal: 300 cm/h) a una columna de intercambio anionico (GE Healthcare Bioscience, Q Sepharose XL 10 mm DI X 15 cm) que habia sido equilibrada con Tris-HCl 10 mmol/l. Despues de completar la adicion, se aplicaron 3 volumenes de columna de tampon de equilibrado se aplicaron a la columna (velocidad lineal: 300 cm/h). La fraccion no adsorbida a la columna se ajusto a pH 5,0 con acido acetico 1,0 mol/l y, a continuacion, se anadio el producto resultante (velocidad lineal: 300 cm/h) a una columna de intercambio cationico (GE Healthcare Bioscience, SP Sepharose FF, 26 mm DI X 15 cm) que habia sido equilibrada con tampon de acetato de sodio 20 mmol/l (pH 5,0). Despues de completar la adicion, el producto resultante se lavo con 5 volumenes de columna de tampon de equilibrado (velocidad lineal: 300 cm/h) y, a continuacion, se aplicaron adicionalmente 5 volumenes de columna de tampon de acetato de sodio 20 mmol/l/cloruro de sodio 0,30 (mol/l) (pH 5,0), de manera que se eluyo la solucion de anticuerpos monoclonales humanos (velocidad lineal: 300 cm/h). El eluato se sometio a concentracion e intercambio de la composicion de tampon utilizando una membrana de ultrafiltracion (Millipore, Biomax-30; 50 cm2), de manera que se cumplieron las siguientes condiciones de la solucion (tal como se muestran en la tabla 1 y la tabla 2 a continuacion).

(Medicion del rendimiento de eliminacion de virus)

Se diluyeron celulas PK-13 cultivadas (obtenidas de ATCC; ATCC No. CRL-6489) con D-MEM (Invitrogen Corporation, glucosa elevada) (la mezcla se denomina en lo sucesivo "FBS/D-MEM al 3%") complementado con suero bovino al 3% en volumen (Upstate, calentado en agua a 56°C durante 30 minutos para la inactivacion y, a continuacion, utilizado) y penicilina/estreptomicina al 1% en volumen (+10000 unidades/ml de penicilina, +10000 pg/ml de estreptomicina, Invitrogen Corporation). De este modo, se preparo una suspension diluida con una concentracion de celulas de 2,0 x 105 celulas/ml. Se dispenso la suspension de celulas a 100 pl cada uno a todos los pocillos de diez placas de cultivo celular de base redonda de 96 pocillos (Falcon) que habian sido preparadas.

Posteriormente, las cantidades totales de las mezclas de productos filtrados sometidos a 3 horas de filtracion se diluyeron 10 veces, 102 veces, 103 veces, 104 veces y 105 veces con FBS/D-MEM al 3%, preparando de este modo los diluyentes. Ademas, cada solucion original recogida inmediatamente antes de la filtracion se diluyo 102 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces y 107 veces con FBS/D-MEM al 3%, preparando de este modo los diluyentes. A las placas de cultivo celular de 96 pocillos en las que se habia dispensado la suspension de celulas anterior, se dispensaron cada filtrado, los diluyentes de 10 veces, 102 veces, 103 veces, 104 veces y 105 veces preparadas a partir del filtrado y los diluyentes de 102 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces y 107 veces preparadas a partir de la solucion original, a 100 (pl) por 8 pocillos, seguido de 10 dias de cultivo a 37°C en una atmosfera de dioxido de carbono al 5% dentro de una incubadora.

A continuacion, las placas de cultivo celular anteriores se sometieron despues de 10 dias de cultivo a la medicion de TCID50 (titulo de infectividad al 50%) mediante un procedimiento de adsorcion de eritrocitos (Virus Jikken Gaku (Estudio experimental de virus), General, Ed., National Institute of Infectious Diseases, pag. 173). Se diluyo 5 veces sangre conservada de pollo (Nippon Biotest Laboratories Inc.) con PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., preparado mediante un procedimiento segun la informacion incluida con el producto comercial) y, a continuacion, se sometio a 5 minutos de centrifugacion a 2500 rpm y 4°C, de manera que precipitaron los eritrocitos. Se extrajeron los sobrenadantes mediante succion. Los precipitados obtenidos de este modo que contenian los eritrocitos se diluyeron de nuevo 200 veces con PBS(-).

A continuacion, se dispensaron 100 pl de cada diluyente de PBS(-) de los precipitados de eritrocitos preparados de este modo a todos los pocillos de las placas de cultivo celular anteriores. Despues de dejar reposar las placas durante 2 horas, se confirmo visualmente la presencia o ausencia de eritrocitos adsorbidos a las superficies del tejido celular cultivado. Se determino que los pocillos en los que se habia confirmado la adsorcion eran pocillos en los cuales habia tenido lugar la infeccion viral. Se determino que los pocillos en los que no se habia confirmado la adsorcion eran pocillos en los cuales no habia tenido lugar la infeccion. Se determino el numero de dichos pozos. Con respecto a la presencia o ausencia de infeccion viral en cada una de las soluciones de cultivo obtenidas de este modo, se confirmo la proporcion para el filtrado, los diluyentes del mismo o los diluyentes de la solucion original. Se calculo el log(TCID50/ml) como el titulo de infectividad mediante el procedimiento de Reed-Muench (Virus Jikken Gaku (Estudio experimental de virus, General, Ed., National Institute of Infectious Diseases, pags. 479-480). Se observo que la tasa de eliminacion del virus LRV era LRV4 o mas.

(Medicion de la pureza del anticuerpo monoclonal)

Se prepararon soluciones de anticuerpos monoclonales utilizando HPLC (Shimadzu Corporation, Prominence; columna: TOSOH Corporation, columna de GPC, gel TSK G3000SWXL, fase movil: tampon de fosfato (pH 6,9)/solucion acuosa de cloruro sodico 0,3 (mol/l)) para cumplir las condiciones de la solucion de los ejemplos y ejemplos comparativos siguientes. Se midio la pureza de cada una de las soluciones de anticuerpos monoclonales basandose en la proporcion de las areas pico. Los resultados son como se muestran en la tabla 3 a continuacion.

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(Medicion de los potenciales zeta (potenciales superficiales) del anticuerpo y la membrana)

Se midio el potencial zeta mediante un procedimiento de dispersion de luz electroforetica utilizando un analizador de potencial zeta ELS-Z (Otsuka Electronics Co., Ltd.), segun las instrucciones del fabricante (Referencia: informacion en la web de Otsuka Densi, www/photal co. jp.). Se calculo el potencial zeta (Ei1) de los anticuerpos bajo unas condiciones de la solucion determinadas basandose en la movilidad. Se observo que el potencial zeta (Ei0) de los anticuerpos en una solucion de NaCl (pH = 4, fuerza ionica: 0,1 mM) era de +37 mV. Se midio el potencial zeta (Em) de la membrana utilizando un analizador de potencial zeta ELS-Z (Otsuka Electronics Co., Ltd.) de manera similar a lo indicado anteriormente, segun las instrucciones del fabricante. De manera especifica, se midio el potencial zeta (Em) de la membrana utilizando unidades de celdas para muestras de placa plana (Otsuka Electronics Co., Ltd.), se coloco la membrana sobre las mismas y, a continuacion, se lleno la membrana con una solucion que tenia la misma composicion de la solucion de anticuerpos, pero sin contener anticuerpos. Bajo dichas condiciones, se midio el potencial zeta utilizando particulas de monitorizacion (Otsuka Electronics Co., Ltd.) recubiertas con hidroxipropilcelulosa y que comprendian latex de poliestireno con potencial casi cero (Referencia: informacion en la web de Otsuka Densi, www/photal co. jp.). En el caso de una membrana que comprende celulosa, se preparo una membrana plana en lugar de una membrana de fibra hueca (Referencia: publicacion de patente japonesa (Kokai) No. 59-45333 A) y, a continuacion, se midio el potencial zeta de la superficie. Los potenciales zeta de los anticuerpos y de la membrana son como se muestran en la tabla 4 a continuacion.

Ejemplos 1 a 7 y ejemplos comparativos 1-5

Tal y como se ha descrito anteriormente, se sometio cada solucion de anticuerpos monoclonales a concentracion e intercambio de composicion de tampon para satisfacer las condiciones de la tabla 1. En esta etapa, se midio la pureza de los anticuerpos monoclonales mediante el procedimiento anterior. Posteriormente, se anadio PPV (0,5% en volumen) y, a continuacion, se agito bien el producto resultante. Se sometieron las soluciones de los ejemplos 1 a 7 y las soluciones de los ejemplos comparativos 1 a 5 a 3 horas de filtracion en linea utilizando el filtro A que tenia un area de membrana de 0,001 m2 bajo una presion de 98 kPa (1 bar). Se calculo la cantidad de anticuerpos monoclonales que podian filtrarse (kg/m2/3 h/bar) y los resultados se muestran en la tabla 1. Se evaluo el rendimiento de eliminacion de PPV mediante el procedimiento anterior. Ademas, los resultados de la medicion de la pureza de los anticuerpos se muestran en la tabla 3.

Tabla 1:

: Aditivo Concentracion de anticuerpo (mg/ml) Concentracion de aminoacido basico por anticuerpo (mmol/g) pH Rendimiento (kg/m2/3 horas/bar)

Ejemplo 1: Arginina 100 mM 30 3,3 4,0 2,92

Ejemplo 2: Arginina 100 mM 20 5,0 4,0 2,73

Ejemplo 3: Histidina 100 mM 30 3,3 4,0 2,10

Ejemplo 4: Arginina 100 mM 30 3,3 5,4 2,30

Ejemplo 5: Arginina 50 mM 30 1,7 5,4 2,30

Ejemplo 6: Arginina 100 mM 35 2,9 5,4 2,20

Ejemplo 7: Histidina 20 mM Cloruro sodico 100 mM 30 0,7 6,0 2,40

Ejemplo comparativo 1: Cloruro sodico 100 mM 30 0 4,0 1,58

Ejemplo comparativo 2: Cloruro sodico 100 mM 20 0 4,0 1,83

Ejemplo comparativo 3: Ninguno 30 0 4,0 0,75

Ejemplo comparativo 4: Cloruro sodico 100 mM 30 0 5,4 1,26

Ejemplo comparativo 5: Cloruro sodico 100 mM 30 0 6,0 0,70

Ejemplos 8-14 y ejemplos comparativos 6-9

Tal y como se ha descrito anteriormente, se sometio cada solucion de anticuerpos monoclonales a concentracion e intercambio de composicion de tampon para satisfacer las condiciones de la tabla 2. En esta etapa, se midio la pureza de los anticuerpos monoclonales mediante el procedimiento anterior. Posteriormente, se anadio PPV (0,5% en volumen), se agito bien el producto resultante. Se sometieron las soluciones de los ejemplos 8 a 14 y las soluciones de los ejemplos comparativos 6 a 9 a 3 horas de filtracion en linea utilizando el filtro B que tenia un area de membrana de 0,001 m2 bajo una presion de 294 kPa (3 bar). Se calculo la cantidad de anticuerpos monoclonales que podian filtrarse (kg/m2/3 h/bar) y los resultados se muestran en la tabla 2. Se evaluo el rendimiento de

eliminacion de PPV mediante el procedimiento anterior. Ademas, los resultados de la medicion de la pureza de los anticuerpos se muestran en la tabla 3.

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Tabla 2:

Ejemplo 8: Arginina 100 mM 30 3,3 4,0 2,33

Ejemplo 9: Histidina 100 mM 30 3,3 4,0 2,30

Ejemplo 10: Arginina 100 mM 30 3,3 5,4 2,40

Ejemplo 11: Arginina 100 mM 30 3,3 7,0 2,33

Ejemplo 12: Arginina 100 mM Cloruro sodico 100 mM 30 3,3 7,0 2,42

Ejemplo 13: Arginina 100 mM 50 2 4,0 2,30

Ejemplo 14: Arginina 100 mM 70 1,4 4,0 2,10

Ejemplo comparativo 6: Cloruro sodico 100 mM 30 0 4,0 1,90

Ejemplo comparativo 7: Cloruro sodico 100 mM 30 0 7,0 1,67

Ejemplo comparativo 8: Ninguno 30 0 4,0 1,45

Ejemplo comparativo 9: Ninguno 30 0 7,0 0,43

Tabla 3:

: Aditivo Concentracion de anticuerpo (mg/ml) pH Pureza de anticuerpo (%)

Ejemplos 1 y 8: Arginina 100 mM 30 4,0 96,9

Ejemplo 2: Arginina 100 mM 20 4,0 97,0

Ejemplos 3 y 9: Histidina 100 mM 30 4,0 96,0

Ejemplos 4 y 10: Arginina 100 mM 30 5,4 95,0

Ejemplo 5: Arginina 50 mM 30 5,4 94,0

Ejemplo 6: Arginina 100 mM 35 5,4 95,0

Ejemplo 7: Histidina 20 mM Cloruro sodico 100 mM 30 6,0 95,0

Ejemplo 11: Arginina 100 mM 30 7,0 93,2

Ejemplo 12: Arginina 100 mM Cloruro sodico 100 mM 30 7,0 93,5

Ejemplo 13: Arginina 100 mM 50 4,0 94,0

Ejemplo 14: Arginina 100 mM 70 4,0 93,0

Ejemplos comparativos 1 y 6: Cloruro sodico 100 mM 30 4,0 87,8

Ejemplo comparativo 2: Cloruro sodico 100 mM 20 4,0 88,0

Ejemplos comparativos 3 y 8: Ninguno 30 4,0 95,7

Ejemplo comparativo 4: Cloruro sodico 100 mM 30 5,4 87,5

Ejemplo comparativo 5: Cloruro sodico 100 mM 30 6,0 87,0

Ejemplo comparativo 7: Cloruro sodico 100 mM 30 7,0 86,0

Ejemplo comparativo 9: Ninguno 30 7,0 90,6

Tabla 4:

: Aditivo pH Potencial zeta (Ei1) de anticuerpo (mV) Potencial zeta (Em) de membrana (mV) Ei1-Em Ei0-Ei 1

Ejemplo 1: Arginina 100 mM 4,0 +16 -3 19 21

Ejemplo 3: Histidina 100 mM 4,0 +13,2 -3 16,2 23,8

Ejemplo 4: Arginina 100 mM 5,4 +7,3 -4 11,4 29,7

Ejemplo 7: Histidina 20 mM Cloruro sodico 100 mM 6,0 +1,4 -6 7,4 35,6

Ejemplo 8: Arginina 100 mM 4,0 +16 -4 20 21

Ejemplo 10: Arginina 100 mM 5,4 +13,3 -6 13,3 29,7

Ejemplo 11: Arginina 100 mM 7,0 +0,6 -13 13,6 36,4

Ejemplo comparativo 1: Cloruro sodico 100 mM 4,0 +5,8 -5 10,8 31,1

Ejemplo comparativo 3: Ninguno 4,0 +37 -15 52 0

Ejemplo comparativo 5: Cloruro sodico 100 mM 6,0 0 -6 6 31

Ejemplo comparativo 6: Cloruro sodico 100 mM 4,0 +5,8 -4 9,8 31,1

Ejemplo comparativo 7: Cloruro sodico 100 mM 7,0 0 -13 13 37

Ejemplo comparativo 8: Ninguno 4,0 +37 -13 50 0

Ejemplo comparativo 9: Ninguno 7,0 +7 -22 29 30

Como resultado, se pudo conseguir un rendimiento de anticuerpo monoclonal de 2 kg/m2/3 h/bar o mas y pudieron 5 satisfacerse las condiciones de rendimiento de eliminacion de virus (PPV LRV 4 o mas) en los ejemplos 1 a 14.

Aplicabilidad industrial

La presente invencion se puede utilizar de manera eficaz como un procedimiento para la eliminacion de virus 10 durante el procedimiento de produccion de un farmaco de anticuerpo.

Claims

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10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para producir una preparacion que contiene un anticuerpo monoclonal, que comprende una etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de virus en una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

(2) la concentracion de anticuerpo monoclonal en la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 20 mg/ml a 100 mg/ml;

(3) la solucion de anticuerpos monoclonales contiene, como minimo, un aminoacido basico; y

(4) la tasa de eliminacion de parvovirus de la membrana para la eliminacion de virus satisface las siguientes condiciones: LRV (Log Reduction Value: valor de reduccion logaritmico) > 4.
2. Procedimiento para eliminar virus en una solucion de anticuerpos monoclonales, que comprende una etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de virus en una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

(2) la concentracion de anticuerpo monoclonal en la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 20 mg/ml a 100 mg/ml;

(3) la solucion de anticuerpos monoclonales contiene, como minimo, un aminoacido basico; y

(4) la tasa de eliminacion de parvovirus de la membrana para la eliminacion de virus satisface las siguientes condiciones: LRV (Log Reduction Value: valor de reduccion logaritmico) > 4.
3. Procedimiento para producir una preparacion que contiene un anticuerpo monoclonal, que comprende una etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de virus en una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

(2) la concentracion de anticuerpo monoclonal en la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 20 mg/ml a 100 mg/ml;

(3) la solucion de anticuerpos monoclonales contiene, como minimo, un aminoacido basico; y

(4) el potencial zeta Ei1 (mV) del anticuerpo monoclonal en la solucion satisface las siguientes condiciones:

a) 0 mV < Ei 1 - Em < 20 mV, con respeto al potencial zeta Em (mV) de la membrana para la eliminacion de virus; y satisface las siguientes condiciones:

b) 10 mV < Ei0 - Ei 1 < 40 mV, con respecto al potencial zeta Ei0 (mV) del anticuerpo monoclonal en la solucion (pH = 4 y fuerza ionica de 0,1 mM) que contiene el anticuerpo monoclonal.
4. Procedimiento para eliminar virus mediante la filtracion de una solucion de anticuerpos monoclonales que contiene un anticuerpo monoclonal utilizando una membrana para la eliminacion de virus, en el que:

(1) el contenido de monomero del anticuerpo monoclonal representa el 90% o mas;

(2) la concentracion de anticuerpo monoclonal en la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 20 mg/ml a 100 mg/ml;

(3) la solucion de anticuerpos monoclonales contiene, como minimo, un aminoacido basico; y

(4) el potencial zeta Ei1 (mV) del anticuerpo monoclonal en la solucion satisface las siguientes condiciones:

a) 0 mV < Ei 1 - Em < 20 mV, con respecto al potencial zeta Em (mV) de la membrana para la eliminacion de virus; y satisface las siguientes condiciones:

b) 10 mV < Ei0 - Ei1 < 40 mV, con respeto al potencial zeta Ei0 (mV) del anticuerpo monoclonal en una solucion (pH = 4 y fuerza ionica de 0,1 mM) que contiene el anticuerpo monoclonal.
5. Procedimiento, segun la reivindicacion 3 o 4, en el que el potencial zeta Ei1 (mV) del anticuerpo monoclonal en la solucion de anticuerpos monoclonales satisface las siguientes condiciones:

-4% x Em < Ei 1 < -550% x Em, con respecto al potencial zeta Em (mV) de la membrana para la eliminacion de virus.
6. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el potencial zeta Ei0 (mV) del anticuerpo monoclonal contenido en una solucion (pH = 4 y fuerza ionica de 0,1 mM) que contiene el anticuerpo monoclonal es de +25 mV o superior.
7. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la solucion de anticuerpos monoclonales se prepara mediante cultivo celular.
8. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el pH de la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 4 a 7.

5

10

15

20

25

30
9. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el material de la membrana para la eliminacion de virus es celulosa.
10. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el material de la membrana para la eliminacion de virus es un polimero sintetico hidrofilizado.
11. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, en el que el polimero sintetico es fluoruro de polivinilideno, polietersulfona, polisulfona o polietileno.
12. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el aminoacido basico es arginina, histidina, lisina o un derivado de los mismos, o una sal de los mismos.
13. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el contenido de aminoacido basico en la solucion de anticuerpos monoclonales varia de 0,1 mmol/g a 20 mmol/g con respecto al anticuerpo.
14. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el rendimiento de anticuerpo es de 2 kg/m2/3 horas/bar (basandose en la presion) o mas.
15. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la solucion de anticuerpos monoclonales contiene uno o mas tipos de elementos seleccionados entre una sal inorganica, un ingrediente tampon, un surfactante y un sacarido.
16. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la filtracion que utiliza la membrana para la eliminacion de virus es filtracion en linea.
17. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus se realiza despues de cromatografia, concentracion o intercambio de tampon.
18. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la etapa de eliminacion de virus mediante la filtracion de una solucion de anticuerpos monoclonales utilizando una membrana para la eliminacion de virus se realiza despues de concentracion o intercambio de tampon.