ES2574052T3 - Formulaciones farmacéuticas altamente concentradas que comprenden anticuerpo anti-CD20 - Google Patents

Abstract

Una formulación farmacéutica estable altamente concentrada para administración subcutánea de un anticuerpo anti-CD20 farmacéuticamente activo que comprende: a. de 50 a 350 mg/ml de anticuerpo anti-CD20; b. de 1 a 100 mM de un agente tamponador que proporciona un pH de 5,5 ± 2,0; c. de 1 a 500 mM de un estabilizante o una mezcla de dos o más estabilizantes; d. del 0,01 al 0,1% de un tensioactivo no iónico; y e. de 1.000 a 16.000 U/ml de una enzima hialuronidasa, preferentemente aproximadamente 2.000 U/ml o 12.000 U/ml.

Description

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1) en el ensayo se utilizan células diana de las que se sabe que expresan el antígeno diana reconocido por la región del anticuerpo que se une al antígeno;

2) en el ensayo se utilizan como células efectoras las células mononucleadas de sangre periférica humana (PBMC), aisladas de la sangre de un donante sano elegido al azar;

3) el ensayo se realiza de acuerdo con el método siguiente:

i) se aíslan las PBMC aplicando procedimientos estándar de centrifugación por densidad y se suspenden a 5 X 106 células/ml en un medio de cultivo celular RPMI;

ii) se cultivan las células diana por métodos estándar de cultivo de tejidos, se recolectan de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90%, se lavan en un medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 micro-Curios de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se suspenden de nuevo en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml;

iii) se trasvasan 100 microlitros de la anterior suspensión final de células diana a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos;

iv) el anticuerpo se diluye en serie de 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microtitulación de 96 pocillos, se ensayan por triplicado varias concentraciones de anticuerpo que abarcan la totalidad del anterior intervalo de concentraciones;

v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales de la placa, que contienen las células diana marcadas, reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (VN) de un detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de anticuerpo (ver el anterior apartado iv);

vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales de la placa, que contienen a las células diana marcadas, reciben 50 microlitros de medio RPMI de cultivo celular en lugar de la solución de anticuerpo (véase el apartado anterior iv);

vii) después se centrifuga la placa de microtitulación de 96 pocillos a 50 x g durante 1 minuto y se incuba a 4ºC durante 1 hora;

viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión PBMC (véase el apartado anterior i) a cada pocillo, obteniéndose una proporción de células efectoras:diana de 25:1 y se introducen las placas en un incubador en una atmósfera con un 5% de CO2 a 37ºC durante 4 horas;

ix) se recoge el líquido sobrenadante sin células de cada pocillo y se cuantifica experimentalmente la radiactividad liberada (ER) empleando un contador gamma;

x) se calcula el porcentaje de lisis específica de cada concentración de anticuerpos según la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en la que ER es la radiactividad media cuantificada (véase el apartado anterior ix) de dicha concentración de anticuerpo, MR es la radiactividad media cuantificada (véase el apartado anterior ix) para los controles MR (véase el apartado anterior v) y SR es la radiactividad media cuantificada (véase el apartado anterior ix) para los controles SR (véase el apartado anterior vi);

4) “ADCC aumentada” se define como un incremento del porcentaje máximo de lisis específica observado en el intervalo de concentraciones de anticuerpo ensayada antes y/o una reducción de la concentración de anticuerpo requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro de un intervalo de concentraciones de anticuerpo ensayada antes. El aumento de ADCC se refiere a la ADCC medida en el ensayo anterior, mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células hospedadoras, aplicando los mismos métodos estándar de producción, purificación, formulación y almacenaje, que los expertos en biología ya conocen, pero que no se producen en las células de ingeniería genética que sobreexpresan al GnTIII.

Dicha “ADCC aumentada” puede obtenerse por glucoingeniería de dichos anticuerpos, es decir, ampliando dichas funciones efectoras naturales, mediadas por células, de los anticuerpos monoclonales por ingeniería de su componente oligosacárido, del modo descrito por Umaña, P. et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999 y US

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El término “citotoxicidad dependiente de complemento” (CDC) indica la lisis de células tumorales humanas diana por acción del anticuerpo de acuerdo con la invención en presencia de complemento. La CDC se mide preferentemente por tratamiento de una preparación de células que expresan CD20 con un anticuerpo anti-CD20 de acuerdo con la invención, en presencia de complemento. Se encuentra CDC si con una concentración de 100 nM el anticuerpo se induce la lisis (muerte celular) del 20% o más de las células tumorales después de 4 horas. El ensayo se lleva a

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probado también la producción a partir de animales transgénicos (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14, 975-81, 1996).

Todos los anticuerpos contienen estructuras de hidrato de carbono en posiciones conservadas de las regiones constantes de cadena pesada, cada isotipo posee un ordenamiento distinto de estructuras de hidrato de carbono unidas a N, lo cual afecta de modo variable el ensamblamiento, la secreción o la actividad funcional de la proteína (Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotech. 15, 26-32, 1997). La estructura del hidrato de carbono unido sobre N varía de modo considerable en función del grado de procesado y puede incluir oligosacáridos complejos de alto contenido en manosa, de ramificaciones múltiples y también biantenarios. Típicamente existe un procesado heterogéneo de estructuras de núcleo oligosacárido unidas a un sitio particular de glucosilación, de modo que incluso los anticuerpos monoclonales existen en glucoformas múltiples. De igual manera se ha demostrado que ocurren diferencias importantes en la glucosilación de anticuerpos entre líneas celulares e incluso se han observado diferencias menores en una línea celular determinada que se haya cultivado en condiciones diferentes (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5(8), 813-22, 1995).

Una manera de obtener incrementos grandes de potencia, manteniendo un proceso de producción sencillo y evitando potencialmente efectos secundarios indeseables, consiste en ampliar las funciones efectoras naturales, mediadas por células, de los anticuerpos monoclonales por ingeniería de su componente oligosacárido, tal como se describe en Umaña, P. et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999 y US-6.602.684. Los anticuerpos de tipo IgG1, los anticuerpos más utilizados en la inmunoterapia contra el cáncer, son glucoproteínas que tienen un sitio de glucosilación unido a N conservado, en el Asn297 de cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 están enterrados entre dos dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipéptido y su presencia es esencial para que el anticuerpo pueda medir en funciones efectoras, como son la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5, 813-822, 1995; Jefferis, R. et al., Immunol. Rev. 163, 59-76, 1998; Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15, 26-32, 1997).

Se ha demostrado previamente que la sobreexpresión de la β(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (“GnTIII”), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisectados en células de ovario de hámster chino (CHO) aumenta significativamente la actividad ADCC “in vitro” de un anticuerpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) producido por células CHO de ingeniería genética (ver Umaña, P. et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999; y el documento WO 99/154342, cuyos contenidos se incorporan a la presente en su totalidad por referencia). El anticuerpo chCE7 pertenece a un grupo grande de anticuerpos monoclonales no conjugados que tienen una gran afinidad y especificidad tumorales, pero tienen una potencia insuficiente para ser útiles en sentido clínico cuando se produce en líneas celulares industriales estándar que carecen de la enzima GnTIII (Umaña, P. et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999). Este estudio fue el primero en demostrar que se podrían obtener grandes incrementos de la actividad ADCC por ingeniería de las células que produce al anticuerpo, para que expresen a la GnTIII, lo cual a su vez conduce a un incremento de la proporción de oligosacáridos bisectados asociados a la región constante (Fc), incluidos los oligosacáridos no fusosilados bisectados, por encima de los niveles encontrados en los anticuerpos de origen natural.

El término “expresión del antígeno CD20” indica un nivel significativo de expresión del antígeno CD20 en una célula, preferentemente en la superficie de una célula T o B, más preferentemente una célula B, de un tumor y de un cáncer, respectivamente, preferentemente un tumor no sólido. Los pacientes que tienen un “cáncer que expresa CD20” pueden determinarse por ensayos estándar ya conocidos de la técnica. La “expresión del antígeno CD20” indica también preferentemente un nivel significativo del antígeno CD20 en una célula, preferentemente en la superficie de una célula T o B, más preferentemente de una célula B, en una enfermedad autoinmune. La expresión del antígeno CD20 se mide por ejemplo, aplicando una detección inmunohistoquímica (IHC), FACS o una detección basada en la PCR del ARNm correspondiente.

Los "pacientes" o "sujetos" son cualquier mamífero que padezca las enfermedades o afecciones de acuerdo con la invención y son preferentemente seres humanos.

El término “cáncer que expresa CD20” tal como se emplea en el presente documento indica preferentemente los linfomas (preferentemente linfoma no de Hodgkin de células B (NHL)) y leucemias linfocíticas. Tales linfomas y leucemias linfocíticas incluyen por ejemplo, (a) los linfomas foliculares, (b) linfomas de células pequeñas no divididas/linfoma de Burkitt (incluyendo el linfoma endémico de Burkitt, el linfoma esporádico de Burkitt y los linfomas no de Burkitt), (c) los linfomas de zonas marginales (influido el linfoma de extranodal de zona marginal de células B (linfomas de tejido linfático asociado a mucosa, MALT), el linfoma nodal de zona marginal de células B y el linfoma esplénico de zona marginal), (d) linfoma de células del manto (MCL), (e) linfoma de células grandes (incluido el linfoma difuso de células B grandes (DLCL), el linfoma difuso de células grandes, el linfoma inmunoblástico, el linfoma primario mediastinal de células B, el linfoma angiocéntrico-linfoma pulmonar de células B), (f) el linfoma de células vellosas, (g) el linfoma linfocítico, la macroglobulinemia de Waldenstrom, (h) la leucemia linfocítica aguda (ALL), la leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL), la leucemia prolinfocítica de células B,

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los neoplasmas de células plasmáticas, el mieloma de células plasmática, el mieloma múltiple, el plasmacitoma y

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la enfermedad de Hodgkin.

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-del 0,01 al 0,1 % de un tensioactivo no iónico; y

-preferentemente una cantidad eficaz de al menos una enzima hialuronidasa.

La formulación farmacéutica estable, muy concentrada, de un anticuerpo anti-CD20 farmacéuticamente activo de la presente invención puede prepararse en forma líquida o puede prepararse en forma liofilizada. La concentración de anticuerpo dentro de la formulación reconstituida puede aumentarse por reconstitución de una formulación liofilizada para obtener una concentración de proteína dentro de la formulación reconstituida que se sitúa aproximadamente entre 2 y 40 veces mayor que la concentración de proteína en la mezcla antes del paso de la liofilización.

La concentración preferida de anticuerpo anti-CD20 se sitúa entre 50 y 150 mg/ml, la especialmente preferida entre 75 y 150 mg/ml, la incluso más preferida en 120 ± 20 mg/ml, la particularmente preferida en aproximadamente 120 mg/ml.

La concentración preferida del agente tampón se sitúa entre 1 y 50 mM, más preferentemente entre 10 y 30 mM; la concentración especialmente preferida es aproximadamente de 20 mM. Los expertos conocen varios agentes tampón de la técnica, ya descritos antes. El agente tampón preferido se elige entre el grupo formado por un tampón histidina, un tampón ácido acético y un tampón ácido cítrico, lo más preferentemente un tampón L-histidina/HCl. El tampón histidina de acuerdo con la invención se emplea en una cantidad aproximadamente de 1 mM a 50 mM, preferentemente de aproximadamente 10 mM a 30 mM y más preferentemente todavía de aproximadamente 20 mM. El tampón ácido acético de acuerdo con la invención es preferentemente de aproximadamente 10 mM a 30 mM y lo más preferentemente de aproximadamente 20 mM. El tampón ácido cítrico de acuerdo con la invención se sitúa preferentemente aproximadamente entre 10 mM y 30 mM y lo más preferentemente en aproximadamente 20 mM.

Con independencia del tampón utilizado, el pH se ajustará en un valor comprendido aproximadamente entre 4,5 y 7,0 y preferentemente aproximadamente entre 5,5 y 6,5, también preferentemente entre el grupo formado por 5,5, 6,0, 6,1 y 6,5. Este pH puede conseguirse ajustando con un ácido o con una base conocidos en la técnica o empleando mezclas adecuadas de componentes tampón o por ambos métodos.

El o los estabilizantees (que se emplean como sinónimos con el término “agente estabilizante” en la presente descripción de patente) se elige(n) preferentemente entre el grupo formado por una sal, un hidrato de carbono, un sacárido y aminoácidos(s), más preferentemente un hidrato de carbono o un sacárido, más preferentemente un azúcar admitido por las autoridades como aditivo o excipiente apropiado para formulaciones farmacéuticas, elegido lo más preferentemente entre el grupo formado por la α,α-trehalosa dihidratada, NaCl y metionina. La concentración preferida del estabilizante se sitúa entre 15 y 250 mM o más preferentemente entre 150 y 250 mM. Es especialmente preferida una concentración de aproximadamente 210 mM. La formulación puede contener un estabilizante secundario, en cuyo caso este estabilizante secundario será preferentemente la metionina, preferentemente con una concentración de 5 a 25 mM, más preferentemente con una concentración de 5 a 15 mM. La concentración especialmente preferida de la metionina es aproximadamente de 10 mM.

El tensioactivo no iónico es preferentemente un polisorbato, se elige más preferentemente entre el grupo formado por el polisorbato 20, polisorbato 80 y un copolímero de polietileno-polipropileno. La concentración del tensioactivo no iónico se sitúa entre el 0,01 y el 0,1 % (p/v) o entre el 0,02 y el 0,08 % (p/v) y preferentemente entre el 0,02 y el 0,06 % (p/v), lo más preferentemente en aproximadamente el 0,06 % (p/v).

El término “azúcar” se emplea en el presente documento para indicar un azúcar farmacéuticamente aceptable, empleado en una cantidad comprendida entre 25 mM y 500 mM. Preferentemente entre 100 y 300 mM. Con mayor preferencia entre 180 y 240 mM. Preferentemente en 210 mM.

La concentración de la enzima hialuronidasa dependerá de la enzima hialuronidasa concreta que se emplee para la preparación de la formulación de acuerdo con la invención. Los expertos podrán determinar fácilmente la cantidad eficaz de enzima hialuronidasa en base a las enseñanzas que se describen a continuación. Deberá proporcionarse en una cantidad suficiente, de modo que sea posible un aumento de la dispersión y absorción del anticuerpo anti-CD20 co-administrado. La cantidad eficaz de enzima hialuronidasa se sitúa preferentemente entre aproximadamente 1.000 y

16.000 U/ml, con lo cual dicha cantidad equivale aproximadamente a un valor entre 0,01 mg y 0,15 mg de proteína, en base a la actividad específica supuesta de 100.000 U/mg. La concentración preferida de la enzima hialuronidasa se sitúa aproximadamente entre 1.500 y 12.000 U/ml. Es especialmente preferida una concentración situada aproximadamente entre 2.000 U/ml y aproximadamente 12.000 U/ml. Las cantidades recién especificadas equivalen a la cantidad de enzima hialuronidasa añadida inicialmente a la formulación. La enzima hialuronidasa está presente en forma de formulación final combinada o para el uso en la co-administración, por ejemplo, en forma de co-formulación que se describe a continuación. El tema importante para la formulación reivindicada es que a la vez esté disponible para el uso y/o se inyecte en la forma de la composición reivindicada.

La enzima hialuronidasa puede derivarse de animales, muestras humanas o fabricarse en base a la tecnología de ADN recombinante del modo descrito a continuación.

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Más particularmente, las formulaciones farmacéuticas estables muy concentradas de acuerdo con la presente invención tienen una de las composiciones siguientes:

a) de 100 a 150 mg/ml de anticuerpo anti-CD20, dicho anticuerpo es preferentemente rituximab, ocrelizumab el HuMab<CD20>; de 1 a 50 mM de un tampón histidina, preferentemente L-histidina / HCl, de pH aproximadamente 5,5; de 15 a 250 mM de un estabilizante, que es preferentemente α,α-trehalosa dihidratada y opcionalmente metionina como segundo estabilizante, con una concentración de 5 a 25 mM; un tensioactivo no iónico elegido entre el grupo del polisorbato 20 y polisorbato 80, preferentemente del 0,02 al 0,06 % (p/v) y opcionalmente de

1.000 a 16.000 U/ml de una enzima hialuronidasa, preferentemente la rHuPH20, lo más preferentemente con una concentración de 2.000 U/ml a 12.000 U/ml.

b) 120 ± 20 mg/ml de anticuerpo anti-CD20, este anticuerpo es preferentemente rituximab, ocrelizumab el HuMab<CD20>; de 10 a 30 mM, preferentemente 20 mM de un tampón histidina, preferentemente L-histidina / HCl de pH aproximadamente 5,5; de 150 a 250 mM, preferentemente 210 mM de un estabilizante que es preferentemente la α,α-trehalosa dihidratada y opcionalmente la metionina como segundo estabilizante, con una concentración de 5 a 25 mM, preferentemente de 5 a 15 mM, lo más preferentemente de 10 mM; un tensioactivo no iónico elegido entre el grupo del polisorbato 20 y el polisorbato 80, preferentemente del 0,02 al 0,06 % (p/v) y opcionalmente de 1.000 a 16.000 U/ml, preferentemente de 1.500 a 12.000 U/ml, lo más preferentemente de 2.000 U/ml a 12.000 U/ml de una enzima hialuronidasa, preferentemente la rHuPH20.

c) 120 mg/ml del anticuerpo anti-CD20, este anticuerpo es preferentemente rituximab, ocrelizumab el HuMab<CD20>; de 10 a 30 mM, preferentemente 20 mM de un tampón histidina, preferentemente L-histidina / HCl de un pH de aproximadamente 5,5; de 150 a 250 mM, preferentemente 210 mM de un estabilizante que es preferentemente la α,α-trehalosa dihidratada y opcionalmente metionina como segundo estabilizante, con una concentración de 5 a 25 mM, preferentemente de 5 a 15 mM, lo más preferentemente 10 mM; un tensioactivo no iónico elegido entre el grupo del polisorbato 20 y el polisorbato 80, preferentemente del 0,02 al 0,06 % (p/v) y opcionalmente de 1,000 a 16.000 U/ml, preferentemente de 1.500 a 12.000 U/ml, lo más preferentemente de 2.000 U/ml a 12.000 U/ml de una enzima hialuronidasa, preferentemente la rHuPH20.

d) 120 mg/ml de anticuerpo anti-CD20, preferentemente rituximab; 20 mM de un tampón histidina, preferentemente L-histidina / HCl de pH aproximadamente 5,5; 210 mM de la α,α-trehalosa dihidratada y opcionalmente 10 mM de metionina como segundo estabilizante; un tensioactivo no iónico elegido entre el grupo del polisorbato 20 y el polisorbato 80, preferentemente del 0,02 al 0,06 % (p/v) y opcionalmente de 2.000 U/ml a 12.000 U/ml de una enzima hialuronidasa, preferentemente la rHuPH20.

e) una formulación liofilizada que contiene 120 mg/ml del anticuerpo anti-CD20, preferentemente rituximab; 20 mM de un tampón histidina, preferentemente la L-histidina/HCl de pH aproximadamente 5,5; 210 mM de α,α-trehalosa dihidratada y opcionalmente 10 mM de metionina como segundo estabilizante; un tensioactivo no iónico elegido entre el grupo del polisorbato 20 y el polisorbato 80, preferentemente del 0,02 al 0,06 % (p/v) y opcionalmente de

2.000 U/ml a 12.000 U/ml de una enzima hialuronidasa, preferentemente la rHuPH20.

Se proporciona una formulación farmacéutica estable de un anticuerpo anti-CD20 farmacéuticamente activo que contiene de aproximadamente 30 mg/ml a 350 mg/ml, por ejemplo de 30 mg/ml a 100 mg/ml (incluidos aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml o aproximadamente 100 mg/ml) de ocrelizumab (por ejemplo, el 2H7.v16 humanizado); de aproximadamente 1 a 100 mM de un agente tamponador (por ejemplo, acetato sódico) que ajuste el pH a 5,5 ± 2,0 (por ejemplo, pH 5,3); aproximadamente de 15 a 250 mM de un estabilizante o una mezcla de dos o más estabilizantees (incluida la trehalosa, por ejemplo, aproximadamente un 8 % de trehalosa dihidratada); aproximadamente del 0,01 al 0,1 % (p/v) de un tensioactivo no iónico; y opcionalmente una cantidad eficaz de al menos una enzima hialuronidasa (por ejemplo, la rHuPH20), preferentemente en una cantidad de aproximadamente 1.500/ml a aproximadamente 12.000 U/ml.

Las composiciones alternativas de formulaciones preferidas se describen en los ejemplos.

Se ha propuesto facilitar la inyección subcutánea de proteínas y anticuerpos terapéuticos empleando pequeñas cantidades de las glucoproteínas hialuronidasa solubles (sHASEGPs); véase WO 2006/091871. Se ha constatado que la adición de glucoproteínas hialuronidasa solubles (en forma de formulación combinada o por co-administración) facilita la administración del fármaco terapéutico a la hipodermis. Con despolimerización rápida del hialuronano HA en el espacio extracelular sHASEGP se reduce la viscosidad del intersticio, con lo cual aumenta la conductancia hidráulica y se consigue la administración de volúmenes mayores de forma segura y confortable al tejido subcutáneo. La mayor conductancia hidráulica inducida por la sHASEGP gracias a la viscosidad intersticial reducida permite una mayor dispersión, aumentando potencialmente la biodisponibilidad sistémica del fármaco terapéutico administrado por vía s.c.

Las formulaciones farmacéuticas estables muy concentradas de la presente invención que contienen una glucoproteína hialuronidasa soluble son, pues, especialmente indicadas para inyección subcutánea. Los expertos entenderán fácilmente que tal formulación, que contiene un anticuerpo anti-CD20 y una glucoproteína hialuronidasa soluble, puede proporcionarse para la administración en forma de formulación combinada única o como alternativa en

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La enzima hialuronidasa según la formulación de la presente invención se caracteriza por no tener efectos adversos en la integridad molecular del anticuerpo anti-CD20 en la formulación farmacéutica estable en el presente documento descrita. Además, la enzima hialuronidasa modifica simplemente la aportación del anticuerpo anti-CD20 a la circulación sistémica, pero no posee otras propiedades que pudieran proporcionar o contribuir a los efectos terapéuticos del anticuerpo anti-CD20 absorbido sistémicamente. La enzima hialuronidasa no está biodisponible sistémicamente y no afecta negativamente a la integridad molecular del anticuerpo anti-CD20 en las condiciones de almacenaje recomendadas de la formulación farmacéutica estable de acuerdo con la invención. Debe considerarse, por tanto, como un excipiente de la formulación del anticuerpo anti-CD20 según esta invención. Cuando despliega su efecto terapéutico, representa un constituyente de la forma farmacéutica separada del anticuerpo anti-CD20 terapéuticamente activo.

En la técnica anterior se conoce ya un gran número de enzimas hialuronidasas apropiadas para la presente invención. La enzima preferida es una enzima hialuronidasa humana, lo más preferentemente la enzima conocida como la rHuPH20. La rHuPH20 forma parte del grupo de las β-1,4-glucosil-hidrolasas activas en medio neutro y ácido, que despolimerizan al hialuronano por hidrólisis del enlace β-1,4 entre la posición C1 de la N-acetil-glucosamina y la posición C4 del ácido glucurónico. El hialuronano es un polisacárido que se ha encontrado en la sustancia base intracelular del tejido conjuntivo, por ejemplo del tejido intersticial subcutáneo y de ciertos tejidos especializados, tales como el cordón umbilical y el humor vítreo. La hidrólisis del hialuronano disminuye temporalmente la viscosidad del tejido intersticial y fomenta la dispersión de los líquidos inyectados o de los trasudados o exudados localizados, facilitando de este modo su absorción. Los efectos de la hialuronidasa son locales y reversibles con la reconstitución completa del hialuronano del tejido, que tiene lugar en un período de 24 a 48 horas [Frost, G.I., “Recombinant human hyaluronidase (rHuPH20): an enabling platform for subcutaneous drug and fluid administration”, Expert Opinion on Drug Delivery 4, 427-440, 2007]. El aumento de la permeabilidad del tejido conjuntivo por la hidrólisis del hialuronano guarda relación con la eficacia de la hialuronidasa para su aptitud para aumentar la dispersión y la absorción de las moléculas administradas simultáneamente.

El genoma humano contiene diversos genes de hialuronidasa. Solamente el producto genético de la PH20 posee actividad eficaz de hialuronidasa en las condiciones extracelulares fisiológicas y actúa como agente de dispersión, mientras que las hialuronidasas que son activas en medio ácido no poseen esta propiedad.

La rHuPH20 es la primera enzima hialuronidasa humana y la única recombinante que actualmente está disponible para el uso terapéutico. El genoma humano contiene diversos genes de hialuronidasa; solamente el producto genético de la PH20 posee actividad eficaz de hialuronidasa en condiciones fisiológicas extracelulares y actúa como agente de dispersión. La proteína PH20 de origen natural tiene un anclaje lípido unido a los aminoácidos del extremo carboxi, que la une a la membrana plasmática. La enzima rHuPH20 desarrollada por Halozyme es una variante de eliminación truncada, que carece de tales aminoácidos en el extremo carboxi, que son los que dan lugar al anclaje sobre el lípido. Esto produce una enzima soluble, activa a pH neutro, similar a la proteína que se encuentra en los preparados de testículos bovinos. La proteína rHuPH20 se sintetiza con un péptido de señal de 35 aminoácidos, que se elimina del extremo N durante el proceso de secreción. La proteína rHuPH20 madura contiene una secuencia ortóloga auténtica en el extremo N, que se ha encontrado en los preparados de hialuronidasa bovina.

Las hialuronidasas PH20, incluidas la PH20 derivada de animales y la rHuPH20 humana recombinante, despolimerizan el hialuronano por hidrólisis del enlace β-1,4 entre la posición C1 de la N-acetil-glucosamina y la posición C4 del ácido glucurónico. El tetrasacárido es el producto de digestión más pequeño [Weissmann, B., “The transglycosilative action of testicular hyaluronidase”, J. Biol. Chem. 216, 783-94, 1955]. Esta estructura de N-acetil-glucosamina/ácido glucurónico no se encuentra en los glucanos fijados sobre N de los productos biológicos recombinantes y, por ello, la rHuPH20 no afectará la glucosilación de anticuerpos, en los que está formulada, por ejemplo, rituximab. La misma enzima rHuPH20 posee seis glucanos fijados sobre N por molécula, con estructuras de núcleo similares a las encontradas en los anticuerpos monoclonales. Tal como se ha anticipado, estas estructuras fijadas sobre N no cambian con el tiempo, lo cual confirma la falta de actividad enzimática de la rHuPH20 de estas estructuras glucano fijadas sobre N. El corto período de vida media de la rHuPH20 y la síntesis constante de hialuronano conducen a una acción corta y localizada de la enzima en los tejidos.

La enzima hialuronidasa, que es un excipiente de la formulación subcutánea de acuerdo con la presente invención, se obtiene preferentemente por la tecnología de ADN recombinante. De este modo se asegura que se obtendrá siempre la misma proteína (secuencia idéntica de aminoácidos) y que se evitarán las reacciones alérgicas causadas por las proteínas contaminantes purificadas simultáneamente durante la extracción de un tejido. La enzima hialuronidasa empleada en la formulación de acuerdo con la presente invención es preferentemente una enzima humana, lo más preferentemente la rHuPH20.

La secuencia de aminoácidos de la rHuPH20 (HYLENEX™) es bien conocida y está disponible con el nº de registro CAS 75971-58-7. Su peso molecular aproximado es de 61 kDa (véase también la Patente de Estados Unidos n.º 7.767.429).

Se han realizado múltiples comparaciones estructurales y funcionales entre la hialuronidasa de mamíferos de fuentes naturales y los clones de ADNc de la PH-20 de humanos y de otros mamíferos. El gen de la PH-20 es el gen empleado

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terapia de radiación se basa en el principio de que la radiación en dosis elevada suministrada a una zona diana producirá la muerte de las células reproductoras tanto del tejido tumoral como del normal. El régimen de dosificación de radiación se define en general en término de dosis de radiación absorbida (Gy), tiempo y fraccionamiento y el oncólogo tendrá que definirlo cuidadosamente. La cantidad de radiación que el paciente recibe dependerá de varias consideraciones, pero las dos más importantes son la ubicación del tumor en relación con otros estructuras u órganos críticos del organismo y la extensión que ha cubierto el tumor en su diseminación. Un curso típico de tratamiento para un paciente sometido a la terapia de radiación será un régimen de tratamiento durante un período de 1 a 6 semanas, con una dosis total comprendida entre 10 y 80 Gy, administrada al paciente en una sola fracción diaria de aproximadamente 1,8 -2,0 Gy, durante 5 días por semana. En una realización preferida de la presente invención se observa sinergismo cuando los tumores de pacientes humanos se tratan con el tratamiento de la invención combinado con la radiación. En otras palabras, la inhibición del crecimiento tumoral mediante los agentes que contienen la formulación del anticuerpo anti-CD20 de la invención se intensifica cuando se combina con la radiación, opcionalmente con agentes quimioterapéuticos o anticancerosos adicionales. Los parámetros de las terapias adyuvantes de radiación se han descrito, por ejemplo, en el WO 99/60023.

Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con el anticuerpo e incluyen, pero sin limitación un segundo (tercero, cuarto, etc.) agente(s) terapéutico(s) (en otras palabras: un cóctel de diferentes agentes quimioterapéuticos); otro anticuerpo monoclonal; un agente inhibidor del crecimiento; un agente citotóxico; un agente quimioterapéutico; un agente anti-angiogénico; y/o una citocina, etc.; o cualquier combinación apropiada de los mismos.

Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a cirugía para eliminar las células cancerosas y/o a terapia de radiación.

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo fabricado, que contiene la formulación farmacéutica de la presente invención y proporciona instrucciones para el uso de la misma. Este artículo fabricado consta de un contenedor. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, a los frascos, viales (por ejemplo, viales de doble cámara o de cámara múltiple), jeringuillas (por ejemplo jeringuillas de doble cámara o de cámara múltiple) y tubos de ensayo. El contenedor puede fabricarse con una gran variedad de materiales, por ejemplo de vidrio o de plástico. El contenedor contiene la formulación y lleva una etiqueta pegada sobre el mismo o asociada al mismo, el contenedor puede llevar también las indicaciones de uso. El contenedor que lleva la formulación puede ser un vial multiuso, que permite administraciones repetidas (por ejemplo, de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El artículo fabricado puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial o del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas e insertos del paquete con las instrucciones de uso.

El anticuerpo formulado de acuerdo con la presente invención es preferentemente esencialmente puro y de modo deseable esencialmente homogéneo (es decir, libre de proteínas contaminantes, etc., en tal caso la enzima hialuronidasa de la formulación según esta invención no deberá considerarse una proteína contaminante del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con la presente invención).

La invención se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no deberán tomarse sin embargo como limitadores del alcance de la invención.

Ejemplos

Las formulaciones de anticuerpo anti-CD20 para la administración subcutánea de acuerdo con la invención se han desarrollado en base a los resultados experimentales presentados a continuación aplicando métodos generales de preparación y de análisis y ensayos que se describen a continuación.

Ejemplo 1: Preparación de formulaciones líquidas muy concentradas

Se obtiene rituximab por técnicas ya conocidas en general de producción de proteínas recombinantes. Se expande una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) de ingeniería genética, preparada del modo descrito en el documento EP-B-2000149, en un cultivo celular a partir del banco de células originales (master cell bank). Se recolecta el anticuerpo monoclonal rituximab del líquido del cultivo celular y se purifica empleando la cromatografía de afinidad en la proteína A inmovilizada, la cromatografía de intercambio catiónico, un paso de filtración para eliminar los contaminantes víricos y después la cromatografía de intercambio aniónico y un paso de ultrafiltración/ diafiltración.

Se fabrica la rHuPH20 por técnicas ya conocidas en general para la producción de proteínas recombinantes. El proceso se inicia con la descongelación de células del banco de células de trabajo (working cell bank, WCB) o del banco de células originales (master cell bank, MCB), realizando la expansión del cultivo celular en una serie de frascos de centrifugación. Se emplea el cultivo celular de hasta 6 litros para obtener una fuente continua de células que se mantiene en presión selectiva con metotrexato. Después de expandirse a aproximadamente 36 litros, el cultivo se transfiere a un biorreactor de 400 litros para llegar a un volumen final del lote de aproximadamente 300 litros. El biorreactor de producción trabaja en modo discontinuo, sin presión de selección y la duración de la fase de producción es de aproximadamente dos semanas. La rHuPH20 se secreta al líquido de cultivo. Puede utilizarse también un biorreactor de 1000 litros para llegar a un volumen final del lote de 500 litros. Una vez finalizada la fase de producción

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