ES2574993T3

ES2574993T3 - Construcciones de fusión y uso de las mismas para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora

Info

Publication number: ES2574993T3
Application number: ES10075271.6T
Authority: ES
Inventors: Pablo Umana; Peter Bruenker; Claudia Ferrara Koller; Tobias Suter
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2003-01-22
Filing date: 2004-01-22
Publication date: 2016-06-23
Anticipated expiration: 2024-01-22
Also published as: US8367374B2; PL222219B1; NZ603037A; CN103540600A; JP2015142590A; PL393647A1; AU2010200408C1; US8859234B2; NO20053872D0; AU2004205802A1; SG179292A1; PL393641A1; EP2264152A2; JP2013233151A; PL224786B1; US20040241817A1; NO339270B1; DE602004028337D1; MXPA05007781A; EP2264151A3

Abstract

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de fusión, en el que dicho polipéptido de fusión: tiene actividad 7(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) o actividad 7(1,4)-galactosiltransferasa (GalT); y comprende el dominio de localización en Golgi de una 7(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnT I) humana.

Description

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las células NK. La unión detectada en este ensayo es específica de FcgammaRIIIa, según se demuestra mediante el uso de un fragmento de anticuerpo específico de FcgammaRIIIa competitivo (véase la figura 13). FIG. 17. Análisis FACS de la expresión de CD4truncada (tCD4) de las líneas celulares productoras de anticuerpos IgG1 antiCD20 quiméricas estables (a) BHK 150228 (tipo salvaje), y (b) clon BHK15022811 (glicomodificada con M2GnTIII). La expresión de tCD4 está operablemente unida a la expresión de M2GnTIII a través de un elemento IRES en el vector de expresión de GnTIII pETR1537 y, por tanto, se utiliza como marcador indirecto para la expresión de GnTIII. Las intensidades de fluorescencia media y media geométrica fueron, respectivamente, 27,6 y 19,9 para las líneas células glicomodificadas, y 4,7 y 1,4 para las líneas celulares de tipo salvaje. FIG. 18. Espectro de MALDI/TOFMS de una mezcla de oligosacáridos neutros derivados de un anticuerpo IgG1 quimérico antiCD20 recombinante glicomodificado con M2GnTIII producido por la línea celular BHK15022811. La línea celular, la purificación del anticuerpo y la preparación y el análisis de los oligosacáridos se describen en la sección de Materiales y métodos del ejemplo 1. FIG. 19. Espectro de MALDI/TOFMS de una mezcla de oligosacáridos neutros derivados, mediante oligosacáridos liberados con PNGasaF y una posterior digestión con EndoH, de un anticuerpo IgG1 quimérico antiCD20 recombinante glicomodificado con M2GnTIII producido por la línea celular BHK15022811. La línea celular, la purificación del anticuerpo y la preparación y el análisis de los oligosacáridos se describen en la sección de Materiales y métodos del ejemplo 1. FIG. 20. Unión de anticuerpos IgG1 quiméricos antiCD20 recombinantes no modificados frente a glicomodificados con "M2GnTIII", producidos por líneas celulares estables, al receptor FcgammaRIIIa sobre células NK. El perfil de glicosilación del anticuerpo glicomodificado se muestra en las figuras 18 y 19. El ensayo de unión se realizó como se describe en la sección de Materiales y métodos del ejemplo 1. Se aislaron células NK humanas que expresan el receptor FcgammaRIIIa sobre su superficie a partir de un donante de un genotipo del cual se sabe que no produce el receptor FcgammaRIIc (es decir, homocigótico para un variante génico que contiene un codón de fin dentro del marco dentro de la secuencia codificadora de FcgammaRIIc). La intensidad de fluorescencia media geométrica, medida mediante FACS utilizando un fragmento de anticuerpo antiIgG humana marcado con FITC, aumenta con la cantidad de anticuerpo recombinante unido a las células NK. La unión detectada en este ensayo es específica de FcgammaRIIIa, según se demuestra mediante el uso de un fragmento de anticuerpo específico de FcgammaRIIIa competitivo (véase la figura 13). FIG. 21. Lisis mediada por el complemento (CML) de anticuerpos IgG1 quiméricos antiCD20 recombinantes no modificados frente a glicomodificados con "M2GnTIII". Ambos anticuerpos fueron producidos en células HEK293EBNA. La producción y el perfil de glicosilación del anticuerpo glicomodificado se muestra en la figura 6, y del anticuerpo no modificado en la figura 5. Las células diana (D) fueron células linfoblastoides humanas SKW6.4. Se utilizó el complemento humano para el ensayo. La lisis se midió mediante la liberación de LDH. Los detalles del ensayo se describen en la sección de Materiales y métodos del ejemplo 1. FIG. 22. Espectros de MALDI/TOFMS de mezclas de oligosacáridos neutros derivados de anticuerpos IgG1 "C225" quiméricos recombinantes que reconocen al receptor del factor del crecimiento epidérmico humano (EGFR), y producidos en células HEK293EBNA. (a) Anticuerpo no modificado producido en células HEK293EBNA transfectadas con el vector de expresión de anticuerpos pURSI28. (b) Anticuerpo glicomodificado con M2GnTIII producido en células HEK293EBNA cotransfectadas con el vector de expresión de anticuerpos pETRURSI28 y el vector de expresión de GnTIII pETR1519. Ambos anticuerpos se purificaron a partir del medio de cultivo mediante una cromatografía de afinidad de proteína A, seguida de una etapa de cromatografía de exclusión molecular en una matriz Superdex200 (Amersham), cambiando el tampón a solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los oligosacáridos se prepararon y se analizaron como se describe en la sección de Materiales y métodos del ejemplo 1. FIG. 23. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de anticuerpos IgG1 "C225" quiméricos antiEGFR recombinantes no modificados frente a glicomodificados con "M2GnTIII". Ambos anticuerpos fueron producidos en células HEK293EBNA. La producción y el perfil de glicosilación del anticuerpo glicomodificado se muestra en la figura 22b, y del anticuerpo no modificado en la figura 22a. Las células diana (D) fueron células de carcinoma escamoso humano A431 (ECACC n° 85090402). Las células efectoras (E) fueron PBMC humanas recién aisladas. Se empleó una proporción E:T de 25:1 en un ensayo ADCC de 4 horas de incubación, midiendo la citotoxicidad mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) con relación a controles de liberación máxima (utilizando un detergente en lugar de un anticuerpo) y de liberación espontánea (con medio de cultivo en lugar de anticuerpo). Los detalles del ensayo se describen en la sección de Materiales y métodos del ejemplo 1. FIG. 24. Secuencia del ácido nucleico (A) y secuencia de aminoácidos (B), respectivamente, del polipéptido de fusión de manosidasa IIGnTIII divulgado en el presente documento. FIG. 25. Secuencia del ácido nucleico (A) y secuencia de aminoácidos (B), respectivamente, del polipéptido de fusión de GnTIGnTIII divulgado en el presente documento. FIG. 26. Espectro de MALDI/TOFMS de una mezcla de oligosacáridos neutros derivados de un anticuerpo IgG1 quimérico antiCD20 C2B8 recombinante no modificado ("Cwt"; wt"wild type", tipo salvaje) producido en células HEK293EBNA transfectadas con el vector de expresión de anticuerpos pETR1520. El anticuerpo se purificó a partir del medio de cultivo y los oligosacáridos se prepararon y se analizaron como se describe en la sección de Materiales y métodos del ejemplo 5. FIG. 27. Espectro de MALDI/TOFMS de una mezcla de oligosacáridos neutros derivados de un anticuerpo IgG1 quimérico antiCD20 C2B8 recombinante glicomodificado ("Cbrt") producido en células HEK293EBNA cotransfectadas con el vector de expresión de anticuerpos pETR1520 y con el vector de expresión del polipéptido de fusión de GnTIII (pETR1519). El anticuerpo se purificó a partir del medio de cultivo y los oligosacáridos se

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Tal como se emplea en la presente, la expresión región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina pretende incluir los variantes alélicos naturales de la región Fc de una inmunoglobulina, así como los variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones, pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar en funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden delecionarse del Nterminal o del Cterminal de la región Fc de una inmunoglobulina sin una pérdida sustancial de la función biológica. Estos variantes pueden seleccionarse según reglas generales conocidas en la técnica para que tengan un efecto mínimo sobre la actividad (véase, por ejemplo, Bowie, J.U. et al., Science, 247:13061310 (1990).

Tal como se emplea en la presente, un polipéptido de fusión "que tiene actividad β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III" se refiere a polipéptidos de fusión que son capaces de catalizar la adición de un resto Nacetilglucosamina (GlcNAc) en enlace β14 al manósido βenlazado del núcleo de trimanosilo de oligosacáridos N enlazados. Esto incluye polipéptidos de fusión que muestran una actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica, a la actividad de la β(1,4)N acetilglucosaminiltransferasa III, también conocida como β1,4manosilglicoprotema 4 betaNacetilglucosaminiltransferasa (EC 2.4.1.144), según el Comité de Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NCIUBMB), según se mide en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en que exista dependencia de la dosis, no es necesario que sea idéntica a la de la β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III, sino que puede ser sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada comparada con la β(1,4)N acetilglucosaminiltransferasa III (es decir, el polipéptido candidato mostrará mayor actividad o una actividad no más de aproximadamente 25 veces menor, y preferiblemente una actividad no más de aproximadamente 10 veces menor, y lo más preferiblemente una actividad no más de aproximadamente tres menor con relación a la β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III).

Tal como se emplea en la presente, un polipéptido de fusión "que tiene actividad β(1,4)galactosiltransferasa" o "que tiene actividad GalT" se refiere a polipéptidos de fusión que son capaces de catalizar la adición de un resto galactosa de UDPgalactosa al terminal GlcNAc no reductor en oligosacáridos Nenlazados. Esto incluye polipéptidos de fusión que muestran una actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica, a la actividad de la β(1,4)galactosiltransferasa, también conocida como UDPGal:GlcNAcβ1,4galactosiltransferasa (EC 2.4.1.38), según el Comité de Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NCIUBMB), según se mide en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en que exista dependencia de la dosis, no es necesario que sea idéntica a la de la β(1,4)galactosiltransferasa, sino que puede ser sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada comparada con la β(1,4)galactosiltransferasa (es decir, el polipéptido candidato mostrará mayor actividad o una actividad puede no ser de más de aproximadamente 25 veces menor, y preferiblemente una actividad no más de aproximadamente 10 veces menor, y lo más preferiblemente una actividad no más de aproximadamente tres menor con relación a la β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III).

Un ácido nucleico o un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo 95 %, "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia tal como se divulga en el presente documento, se refiere a que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o una serie de nucleótidos hasta 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. La secuencia pregunta puede ser la secuencia completa que aparece en FIG. 24 o FIG. 25.

Como cuestión práctica, cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular que sea al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos o secuencia de polipéptido tal como se divulga en el presente documento, puede determinarse de modo convencional utilizando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar el mejor apareamiento global entre una secuencia pregunta (una secuencia tal como se divulga en el presente documento,) y una secuencia caso, también denominado alineamiento de secuencia global, puede determinarse utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci., 6:237245 (1990). En el alineamiento de secuencias, las secuencias pregunta y caso son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse convirtiendo las T en U. El resultado de dicho alineamiento de secuencia global se indica en porcentaje de coincidencia. Los parámetros preferidos utilizados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de coincidencia son: Matriz = unitaria, ktuple = 4, penalización de desapareamiento = 1, penalización de unión = 30, longitud del grupo de aleatorización = 0, puntuación de corte = 1, penalización de hueco = 5, penalización del tamaño de hueco = 0,05, tamaño de la ventana = 500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos caso, lo que sea más corto.

Si la secuencia caso es más corta que la secuencia pregunta por deleciones 5' o 3', no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no considera los truncamientos 5' y 3' de la secuencia caso cuando calcula el porcentaje de coincidencia. Para las secuencias caso truncadas en los extremos 5' o 3', con relación a la secuencia pregunta, el porcentaje de coincidencia se corrige calculando el número de bases de la secuencia pregunta que están 5' y 3' de la secuencia caso, que no estén apareadas/alineadas, como porcentaje de las bases totales de la secuencia pregunta. Si un nucleótido está

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Un anticuerpo que tiene mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) significa un anticuerpo que tiene una mayor ADCC según se determina mediante cualquier método adecuado conocidos por los expertos en la técnica. Un ensayo de ADCC in vitro aceptado es como sigue:

1) el ensayo emplea células diana de las cuales se sabe que expresan el antígeno diana reconocido por la región de unión al antígeno del anticuerpo; 2) el ensayo emplea células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC), aisladas a partir de la sangre de un donante sano elegido de modo aleatorio, como células efectoras; 3) el ensayo se realiza según el siguiente protocolo:

i) las PBMC se aíslan utilizando procedimientos de centrifugación de densidad convencionales y se suspenden a 5 x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI; ii) las células diana se cultivan mediante métodos de cultivo tisular convencionales, se recolectan en la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad mayor que 90 %, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microcurios de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular, y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml; iii) se trasladan 100 microlitros de la suspensión de células diana final anterior a cada uno de los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos; iv) el anticuerpo se diluye en serie desde 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpos resultantes a las células diana en una placa de microvaloración de 96 pocillos, ensayando por triplicado diversas concentraciones de anticuerpos que abarquen el intervalo de concentración completo anterior; v) para los controles de liberación máxima (LM), 3 pocillos más en la placa que contienen las células diana marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2 % (en v/v) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv anterior); vi) para los controles de liberación espontánea (LE), 3 pocillos más en la placa que contienen las células diana marcadas reciben 50 microlitros de un medio de cultivo celular RPMI, en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv anterior); vii) la placa de 96 pocillos entonces se centrifuga a 50 x g durante 1 minuto y se incuba durante una hora a 4 °C; viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i anterior) a cada pocillo para producir una proporción de células efectoras:diana de 25:1, y las placas se colocan en un incubador bajo una atmósfera de CO2 al 5 % a 37 °C durante 4 horas; ix) el sobrenadante exento de células de cada pocillo se recolecta y se cuantifica la radiactividad experimentalmente liberada (RE) utilizando un contador gamma; x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo según la fórmula (RELM)/(LMLE) x 100, en la que RE es la radiactividad media cuantificada (véase el punto ix anterior) para esa concentración de anticuerpo, LM es la radiactividad media cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles de LM (véase el punto v anterior), y LE es la radiactividad media cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles LE (véase el punto vi anterior);

4) una "mayor ADCC" se define como un aumento en el porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo ensayado anteriormente y/o una reducción en la concentración de anticuerpo requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo ensayado anteriormente. El aumento en la ADCC se relaciona con la ADCC, medida en el anterior ensayo, mediada por el mismo anticuerpo, producido en el mismo tipo de células hospedadoras, utilizando los mismos métodos convencionales de producción, purificación, formulación y conservación, que son conocidos por los expertos en la técnica, pero que no ha sido producido por células hospedadoras modificadas para que sobreexpresen la glicosiltransferasa GnTIII.

Tal como se emplea en la presente, la expresión anticuerpo antiCD20 significa un anticuerpo que reconoce de modo específico una fosfoproteína no glicosilada de la superficie celular de 35.000 Dalton, denominada de forma típica antígeno de diferenciación restringido de linfocitos B humanos Bp35, denominado habitualmente CD20.

La presente divulgación se basa en el descubrimiento de que la modificación de células productoras de anticuerpos para que expresen un nuevo polipéptido de fusión que tiene actividad β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) o, como alternativa, actividad β(1,4)galactosiltransferasa ("GalT"), y que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi, produce anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y mayor función efectora. Como alternativa, pueden obtenerse anticuerpos con mayor función efectora y/o mayor unión al receptor de Fc modificando células productoras de anticuerpos para que aumenten la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad catalítica αmanosidasa II. Las construcciones de fusión que tienen actividad GnTIII o GaIT pueden coexpresarse con las moléculas de ácidos nucleicos que codifican ManII o GnTII.

Por consiguiente, la presente divulgación puede referirse a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de fusión, en el que el polipéptido de fusión tiene actividad β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), y comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido

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citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, mayor fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), mayor secreción de citoquinas, mayor captación de antígenos mediada por el complejo inmunológico por células presentadoras de antígenos, mayor citotoxicidad celular mediada por Fc, mayor unión a células NK, mayor unión a macrófagos, mayor unión a células polimorfonucleares (PMN), mayor unión a monocitos, mayor reticulación de anticuerpos unidos a dianas, mayor señalización directa inductora de la apoptosis, mayor maduración de células dendríticas, y mayor cebado de células T.

La célula hospedadora tal como se divulga en el presente documento es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6, o una célula de hibridoma, y el polipéptido producido por dicha célula hospedadora es un anticuerpo antiCD20, tal como IDECC2B8. La célula hospedadora puede ser el anticuerpo monoclonal antiEGFR humano quimérico C225.

Además de comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión tal como se divulga en el presente documento, las células hospedadoras tal como se divulgan en el presente documento pueden comprender además al menos un ácido nucleico transeccionado que codifica una molécula de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que conserva una región Fc funcional, o una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina. El al menos un ácido nucleico transeccionado puede codificar un anticuerpo antiCD20, el anticuerpo monoclonal antineuroblastoma humano quimérico chCE7, el anticuerpo monoclonal anticarcinoma de células renales humano quimérico chG250, el anticuerpo monoclonal anticarcinoma de mama, colon y pulmón humano quimérico ING1, el anticuerpo monoclonal antiantígeno 171A humano humanizado 3622W94, el anticuerpo antitumor colorrectal humano humanizado A33, el anticuerpo antimelanoma humano dirigido contra el gangliósido GD3 R24, el anticuerpo monoclonal anticarcinoma de células escamosas humano quimérico SF25, un anticuerpo antiEGFR humano, un anticuerpo anteEGFRvIII humano, un anticuerpo antiPSMA humano, un anticuerpo antiPSCA humano, un anticuerpo antiCD22 humano, un anticuerpo antiCD30 humano, un anticuerpo antiTAG72, un anticuerpo antiantígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), un anticuerpo antigangliósido GD3, un anticuerpo antigangliósido GD2, un anticuerpo antigangliósido GM2, un anticuerpo antigangliósido humano, un anticuerpo antiEGFRvIII, un anticuerpo antiintegrina, un anticuerpo antiCD80, un anticuerpo antiLeY, un anticuerpo antimucina, un anticuerpo antiMUC18, un anticuerpo antiCD33 humano, un anticuerpo antiCD38 humano, un anticuerpo antiCD40 humano, un anticuerpo antiCD45 humano, un anticuerpo antiCD52 humano, un anticuerpo anti CD138 humano, un anticuerpo antivariante de HLADR humano, un anticuerpo anti EpCAM humano, un anticuerpo antiCEA humano, un anticuerpo antiMUC1 humano, un anticuerpo antiproteína central de MUC1 humana, un anticuerpo antiMUC1 aberrantemente glicosilado humano, un anticuerpo contra los variantes de fibronectina humana que contienen el dominio EDB, o un anticuerpo antiHER2/neu humano.

La presente divulgación también se dirige a un método para producir un polipéptido en una célula hospedadora de mamífero que comprende (a) cultivar una célula hospedadora modificada para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad β(1,4)N acetilglucosaminiltransferasa III o como alternativa actividad β(1,4)galactosiltransferasa ("GaIT"), bajo condiciones que permiten la producción de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo completa, un fragmento de anticuerpo que conserva una región Fc funcional, y una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina, en el que dicho polipéptido de fusión que tiene actividad GnTIII o como alternativa, actividad de GaIT se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de dicho polipéptido producido por dicha célula hospedadora; y (b) aislar dicho polipéptido. El polipéptido de fusión puede comprender el dominio catalítico de la β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III. El polipéptido de fusión puede comprender además el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi. Preferiblemente, el dominio de localización en Golgi es el dominio de localización de manosidasa II o β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa II y el dominio de localización de α16 fucosiltransferasa de núcleo. Los polipéptidos producidos mediante los métodos divulgados en el presente documento tienen mayor afinidad de unión al receptor de Fc y/o mayor función efectora. Preferiblemente, la mayor función efectora es una o más de la siguientes: mayor citotoxicidad celular mediada por Fc (incluyendo mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), mayor fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), mayor secreción de citoquinas, mayor captación de antígenos mediada por el complejo inmunológico por células presentadoras de antígenos, mayor unión a células NK, mayor unión a macrófagos, mayor unión a monocitos, mayor unión a células polimorfonucleares, mayor señalización directa inductora de la apoptosis, mayor reticulación de anticuerpos unidos a dianas, mayor maduración de células dendríticas, o mayor cebado de células T. La mayor afinidad de unión al receptor de Fc es preferiblemente una mayor unión a receptores activadores de Fc, tales como FcγRIIIa.

La presente divulgación se dirige a un polipéptido producido mediante los métodos divulgados en el presente documento que puede tener una mayor proporción de oligosacáridos bisectados en la región Fc de dicho polipéptido. El polipéptido producido por los métodos divulgados en el presente documento puede tener una mayor proporción de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc como resultado de dicha modificación. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o complejo. El polipéptido producido por las células hospedadoras y los métodos divulgados en el presente documento puede tener una mayor proporción de oligosacáridos bisectados no fucosilados en la región Fc. Los oligosacáridos bisectados no fucosilados pueden ser híbridos o complejos. De modo específico, los métodos divulgados en el presente documento pueden utilizarse para producir polipéptidos en los que al menos 15 %, más

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preferiblemente al menos 20 %, más preferiblemente al menos 25 %, más preferiblemente al menos 30 %, más preferiblemente al menos 35 %, más preferiblemente al menos 40 %, más preferiblemente al menos 45 %, más preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 % de los oligosacáridos en la región Fc del polipéptido son no fucosilados. Los métodos divulgados en el presente documento también pueden utilizarse para producir polipéptidos en los que al menos 15 %, más preferiblemente al menos 20 %, más preferiblemente al menos 25 %, más preferiblemente al menos 30 %, más preferiblemente al menos 35 %, más preferiblemente al menos 40 %, más preferiblemente al menos 45 %, más preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 % de los oligosacáridos en la región Fc del polipéptido son bisectados. Además, los métodos divulgados en el presente documento pueden utilizarse para producir polipéptidos en los que al menos 15 %, más preferiblemente al menos 20 %, más preferiblemente al menos 25 %, más preferiblemente al menos 30 %, más preferiblemente al menos 35 %, más preferiblemente al menos 40 %, más preferiblemente al menos 45 %, más preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 % de los oligosacáridos en la región Fc del polipéptido son bisectados y no fucosilados. Los métodos divulgados en el presente documento también pueden utilizarse para producir polipéptidos en los que al menos 15 %, más preferiblemente al menos 20 %, más preferiblemente al menos 25 %, más preferiblemente al menos 30 %, más preferiblemente al menos 35 % de los oligosacáridos en la región Fc del polipéptido son híbridos, bisectados y no fucosilados.

La presente divulgación se dirige a un anticuerpo que puede modificarse para tener función efectora aumentada y/o afinidad de unión a receptor de Fc aumentada, producido mediante los métodos divulgados en el presente documento. Preferentemente, la función efectora aumentada es una o más de las siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada (incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada), fagocitosis celular mediada por Fc aumentada (ADCP), secreción de citoquinas aumentada, captación de antígenos por células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmune aumentada, unión a células NK aumentada, unión a macrófagos aumentada, unión a monocitos aumentada, unión a células polimorfonucleadas aumentada, señalización directa que aumenta la apoptosis aumentada, reticulación aumentada de anticuerpos unidos a su diana, maduración de células dendríticas aumentada o cebado de linfocitos T aumentado. La afinidad de unión a receptor de Fc aumentada puede ser unión aumentada a un receptor activante de Fc, más preferentemente FcγRIIIa. La divulgación se dirige además a fragmentos de anticuerpo que contienen la región Fc y a proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina. Dichos fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión muestran afinidad de unión a receptor de Fc aumentada y/o función efectora aumentada.

La presente divulgación se dirige además a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, a fragmentos de anticuerpo que mantienen la región Fc y a proteínas de fusión que tienen una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina tal como se divulga en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación se dirige además al uso de dichas composiciones farmacéuticas en un método de tratamiento para el cáncer. Específicamente, la presente divulgación se dirige a un método para el tratamiento del cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica tal como se divulga en el presente documento.

La presente divulgación también se dirige a una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, en la que el polipéptido de fusión tiene actividad β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIII"), y comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi; y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido tiene actividad manosidasa II (Man II). La molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión y la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene actividad manosidasa II pueden estar en el mismo vector o en diferentes vectores de expresión. l polipéptido de fusión puede comprender el dominio catalítico de GnT III. Además, el dominio de localización en Golgi puede ser el dominio de localización de Man II, de β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa I, de β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa II, de manosidasa I o de α16 fucosiltransferasa de núcleo. La célula hospedadora puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de insecto y una célula vegetal. Preferiblemente, la célula hospedadora es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula YO de mieloma, una célula P3X63 de mieloma de ratón, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de

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hibridoma.

La divulgación proporciona además una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), y comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi, un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido tiene actividad manosidasa II (Man II), y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido tiene actividad β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa II (GnT II). La molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad manosidasa II y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnT II pueden estar en el mismo vector o en diferentes vectores de expresión. También se prefiere que la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión esté en un vector de expresión, y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad Man II y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnT II estén en el mismo vector de expresión. También se prefiere que la molécula de ácido nucleico que codifica una ManII esté en un vector de expresión, y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnT II estén sobre el mismo vector de expresión. La GnT II puede estar en un vector de expresión, y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad Man II pueden estar sobre el mismo vector de expresión.

Además, la divulgación se dirige a una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, en el que el polipéptido de fusión tiene actividad de β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa (GaIT) y comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi; y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido tiene actividad de manosidasa II (Man II). La molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de manosidasa II pueden estar en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados. Preferiblemente, el polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de GaIT. El dominio de localización en Golgi puede ser el dominio de localización de Man II, de β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa I, de β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa II, de manosidasa I o de α16 fucosiltransferasa de núcleo. La célula hospedadora puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula YO de mieloma, una célula P3X63 de mieloma de ratón, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma.

La divulgación se dirige a una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, en el que el polipéptido de fusión tiene actividad de β(1,4)Nacetilglucosaminiltransferasa (GaIT) y comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi; y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido tiene actividad de manosidasa II (Man II); y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido tiene actividad de β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa II (TnT II). Preferiblemente, cada ácido nucleico está en el mismo vector de expresión. Como alternativa, cada molécula de ácido nucleico está en un vector separado. La divulgación proporciona además que la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión esté en un vector de expresión, y que la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de Man II y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnT II estén en el mismo vector de expresión. La divulgación también proporciona que la molécula de ácido nucleico que codifica una ManII esté en un vector de expresión, y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnT II estén en el mismo vector de expresión. La divulgación también proporciona que la molécula de ácido nucleico que codifica la GnT II esté en un vector de expresión, y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión y la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de Man II estén en el mismo vector de expresión. En una realización preferida, el polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de GaIT. En una realización preferida adicional, el dominio de localización en Golgi es el dominio de localización de Man II, de β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa I, de β(1,2)Nacetilglucosaminiltransferasa II, de manosidasa I o de α16 fucosiltransferasa de núcleo.

La divulgación proporciona además una célula hospedadora modificada para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad de GnT III y al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de Man II en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de un polipéptido producido por la célula hospedadora, en el que el polipéptido producido por la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo completa, un fragmento de anticuerpo y una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina.

La divulgación también proporciona una célula hospedadora modificada para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad de GnT III, al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene Man II y al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnT II en

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Pueden utilizarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos contra epítopos diana de interés. Estos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, totalmente humanos, monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos por un banco de expresión de ScFv, Fab, VH, IgG. Estos anticuerpos pueden ser útiles, por ejemplo, como agentes de diagnóstico o terapéuticos. Como agentes terapéuticos resultan de interés especialmente preferido los anticuerpos neutralizantes, es decir, aquellos que compiten por la unión con un ligando, sustrato o molécula adaptadora.

Para la producción de anticuerpos, se inmunizan diversos animales hospedantes mediante una inyección con la proteína diana de interés que incluyen, pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, etc. En los animales pueden generarse anticuerpos policlonales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sb) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. Pueden emplearse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedante, que incluyen, pero no se limitan a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, saponina, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles, como BCG (bacilo de CalmetteGuerin) y Corynebacterium parvum. Los animales se inmunizan contra el antígeno, contra conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 g o 5 g de la proteína o del conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o del conjugado en adyuvante de Freund mediante una inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a catorce días después los animales se sangran y el suero se ensaya para valorar los anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta que la valoración alcanza un valor de meseta. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas.

Los anticuerpos monoclonales para la diana de interés pueden prepararse utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero no se limitan a la técnica de hibridoma originariamente descrita por Kohler y Milstein, Nature, 256:495497 (1975), la técnica de hibridoma de células B humano (Kosbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:20262030 (1983)), y la técnica de hibridomaEBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 7796 (Alan R. Liss, Inc., 1985)). Además pueden utilizarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:68516855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604608 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452454 (1985) cortando y empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con la especificidad de antígeno apropiada, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano con la actividad biológica apropiada. Estas técnicas también pueden utilizarse para producir anticuerpos quiméricos que comprenden una molécula de anticuerpo de otros mamíferos. Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EEUU n° 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios con la especificidad deseada. La divulgación también se dirige a anticuerpos humanizados que se han glicomodificado según los métodos divulgados en el presente documento. Las técnicas para generar anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en la patente de EEUU n° 6.180.320 de Queen et al.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específica de la proteína diana de interés mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero no se limitan a fragmentos F(ab') 2 que pueden producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, pueden construirse bancos de expresión de Fab (Huse et al., Science, 246: 12751281 (1989)) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por la proteína diana de interés.

Cuando un anticuerpo o fragmento de anticuerpo ha sido identificado, para el cual se desea una modificación en el patrón de glicosilación, se identifica la secuencia de ácido nucleico codificadora y se aísla utilizando técnicas conocidas en la técnica.

a. Generación de líneas celulares para la producción de proteínas con un patrón de glicosilación alterado.

La presente divulgación proporciona sistemas de expresión de células hospedadoras para la generación de proteínas que tengan patrones de glicosilación modificados. En particular, la presente divulgación proporciona sistemas de células hospedadoras para la generación de glicoformas de proteínas que tengan un mayor valor terapéutico. Por tanto, la divulgación proporciona sistemas de expresión de células hospedadoras seleccionadas o modificadas para que expresen, por ejemplo, un polipéptido de fusión que tenga actividad β(1,4)N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), y que comprenda el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi heterólogo. De modo específico, dichos sistemas de expresión de células hospedadoras pueden modificarse para que comprendan una molécula de ácido nucleico recombinante que codifique dicho polipéptido de fusión, unida operativamente a un sistema promotor constitutivo o regulado.

La presente divulgación proporciona una célula hospedadora que puede haberse modificado para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad β(1,4)N

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1664: Híbrido no fuc. bisectado o Complejo no fuc. 49 1460 ó 1664 1460 60 Híbrido no fuc. bisectado (49 %)

1689: Complejo fuc. bisectado 3 1689 1689 5 Complejo fuc. bisectado (3 %)

1810: Híbrido fuc. bisectado o Complejo fuc. 15 1460 ó 1810 1460 1810 60 2 Híbrido fuc. bisectado (13 %) y Complejo fuc. (2 %)

1826: Híbrido no fuc. bisectado 4 1622 1622 7 Híbrido no fuc. bisectado (4 %)

1851: Complejo fuc. bisectado 3 1851 1851 2 Complejo fuc. bisectado (3 %)

1972: Híbrido fuc. bisectado 3 1622 1622 7 Híbrido fuc. bisectado (3 %)

Equilibrios de masas (en fracción molar en %): a) Picos a m/z 1502 y 1647: 7 + 7 % = 14 % (esperado). La digestión con EndoH para ambos picos generó m/z 1298 (13 % obtenido después de EndoH). b) Picos a m/z 1664 y 1810; 49 + 3 % = 62 %. Endow genera m/z 1460 (60 % obtenido) c) Picos a m/z 1826 y 1972: 4 + 3 % = 7 %. EndoH genera m/z 1622 (7 %) Resumen. Porcentaje relativo total de las estructuras que porta un GlcNAc bisectante: 88 % híbrido no fucosilado bisectado: 60 % híbrido fucosilado bisectado: 22 % complejo fucosilado bisectado: 6 %

Los anteriores datos (figuras 1 a 6) demuestran el nivel de expresión de GnTIII y el dominio de localización particular que se emplea para dirigir el dominio catalítico de GnTIII a Golgi, la influencia de la competencia por los sustratos de oligosacáridos modificados con GnTI entre el dominio catalítico de GnTIII recombinante y el núcleo endógeno de α1,6fucosiltransferasa, las enzimas ManII y GnTII. La mayor expresión de GnTIII lo favorece en esta competencia, conduciendo a unos niveles mayores de oligosacáridos híbridos bisectados y bisectados, no fucosilados, y a una reducción concomitante de los niveles de oligosacáridos complejos bisectados y bisectados, fucosilados. Esto también se había advertido previamente en el GnTIII de tipo salvaje (Umana, P. et al., Nature Biotechnol., 17:176180 (1999)). No obstante, a pesar de conducir a niveles similares globales de oligosacáridos bisectados, la localización del dominio catalítico de GnTIII a través de GnTI o a través de los dominios de localización de ManII conduce a una competencia más eficaz, con relación a la GnTIII de tipo salvaje, para los sustratos de oligosacáridos modificados con GnTI frente al núcleo endógeno de α1,6fucosiltransferasa, las enzimas ManII y GnTII.

La mayor eficacia de la fusión de GnTIGnTIII, comparado con la GnTIII de tipo salvaje, para la síntesis de oligosacáridos híbridos bisectados, y bisectados, no fucosilados, puede explicarse por una distribución más temprana en Golgi, en la dirección cis a trans del transporte del sustrato de glicoproteína, de GnTI con relación a GnTIII. Las distribuciones precisas en Golgi de GnTI y ManII se han determinado previamente mediante microscopía de inmunoelectrones cuantitativa (Rabouille, C. et al., J. Cell Sci., 108:16171627 (1995)). Ambas enzimas se codistribuyen a lo largo del Golgi, estando localizadas principalmente en las cisternas media y trans del apilamiento del Golgi, con unos niveles mayores en la cisterna media con relación a la cisterna trans. Las precisas distribuciones espaciales cuantitativas del núcleo de α1,6glucosiltransferasa, GnTII, y GnTIII de tipo salvaje aún no se han determinado. Sin embargo, lo anterior no explica por qué la fusión de ManIIGnTIII es significativamente más eficaz que la fusión de GnTIGnTIII para la síntesis de oligosacáridos híbridos bisectados, y bisectados, no fucosilados, puesto que GnTI y ManII tienen idénticas distribuciones espaciales a lo largo de los subcompartimentos del Golgi.

La mayor eficacia de la fusión de ManIIGnTIII indica la existencia de subcompartimentos de reacción de glicosilación funcional relativamente organizados dentro de los subcompartimentos físicos de las cisternas media y trans del Golgi. Se cree que las denominadas "enzimas de glicosilación de Golgi medio", GnTI, GnTII y ManII existen en el Golgi como complejos de alto peso molecular. Sin embargo, si los dominios de localización permiten que estas enzimas formen parte de estos complejos, esto debería ser igual para las fusiones de GnTIGnTIII y ManIIGnTIII. La expresión de la fusión de GnTIGnTIII recombinante no conduce al desplazamiento de la enzima GnTI de tipo salvaje endógena en ningún grado significativo para la síntesis de oligosacáridosFc, puesto que todas las construcciones de GnTIII empleados en la presente conducen a que una mayoría de los oligosacáridos sean modificados por reacciones de GnTI y de GnTIII.

Los datos de los inventores indican que, en virtud del dominio de localización de ManII, se produce un apareamiento funcional más preciso entre los dominios catalíticos de la GnTI endógena y la fusión de ManIIGnTIII recombinante. Se sabe que en otras vías biosintéticas se producen apareamientos organizados de enzimas que catalizan reacciones posteriores en una vía biosintética, de forma que se favorece la transferencia del producto de la primera reacción al segundo sitio catalítico con relación a la difusión de dicho producto para alejarlo de las enzimas, como en la glicólisis y

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