BRPI0709960A2

BRPI0709960A2 - anticorpos glicosilados

Info

Publication number: BRPI0709960A2
Application number: BRPI0709960-6A
Authority: BR
Inventors: Hansen Silke; Kuenkele Klaus-Peter; Reusch Dietmar; Schumacher Ralf
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2011-08-02
Also published as: US7846724B2; IL194165A0; EP2007809B2; ES2395136T5; IL301499B2; IL233150A0; US20140193404A1; CN103864923A; KR101275452B1; US11673958B2; AU2007236198A1; EP2007809B1; AU2007236198B2; AR060386A1; MX2008012953A; ECSP088814A; JP5078990B2; CR10300A; CA2647288C; CA3128738A1

Abstract

<B>ANTICORPOS G LICOSI LADOS<D>A presente invenção refere-se a um anticorpo do tipo IgG1 ou lgG3 humana, sendo glicosilado com uma cadeia de açúcar em Asn297, sendo o dito anticorpo distinguido pelo fato de que a quantidade de fucose na dita cadeia de açúcar é pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1 ,3-galactose do terminal N é 1% ou menos, e os usos dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-POS GLICOSILADOS".

A presente invenção refere-se a um anticorpo recombinante quetem uma região Fc expressada e glicosilada, pela qual uma importante estru-tura de carboidrato do núcleo, anexada à região Fc do anticorpo, é comple-tamente fucosilada. A presente invenção refere-se também a células hospe-deiras CHO (do ovário do hamster chinês), métodos para selecionar tais cé-lulas hospedeiras CHO e o uso desse anticorpo recombinante.Antecedentes da Invenção

As imunoglobulinas ou anticorpos na sua forma nativa são usu-almente glicoproteínas tetraméricas compostas de duas cadeias leves e pe-sadas. Os anticorpos contêm domínios constantes que designam os anticor-pos a classes tais como IgA, IgD, IgE, IgM, e IgG, e várias subclasses taiscomo IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4. Os anticorpos de seres humanos das clas-ses IgGI e lgG3 usualmente medeiam ADCC (citotoxicidade mediada porcélulas dependentes de anticorpos).

Há também outras moléculas conhecidas que são similares aanticorpos e contêm, por exemplo, um domínio Iigante de uma proteína hete-róloga, tal como um recpetor, Iigantes ou enzima, e a região Fc de um anti-corpo. Tais proteínas de fusão Fc são descritas, por exemplo, por Staliba,P.etal., Nature Biotech. 16:1357-1360 (1998), e patente n2 US 5.610.297.

Os anticorpos monoclonais eliciam quatro funções efetoras:ADCC, fagocitose, citotoxicidade dependente de complementos (CDC) etaxa de meia-vida/depuração. ADCC e fagocitose são mediadas através dainteração de anticorpos ligados a células com FcyR (receptores Fc gama);CDC através da interação de anticorpos ligados a células com uma série deproteínas que constituem o sistema de complementos. CDC está relaciona-do à ativação de C3 Iigante de C1q e/ou ligação do receptor Fc da parte Fc.Caso a ativação de C3 Iigante de C1q e/ou a ligação do receptor Fc de umaparte constante do anticorpo deva ser reduzida, usualmente são usados an-ticorpos lgG4 que não ativam a sistema de complementos, não se ligam aC1q e não ativam C3. Alternativamente, são usadas as partes Fc que com-preendem uma região constante de cadeia pesada gama-1 com certas mu-tações tais como L234A e L235A ou D265A e N297A (documento n- WO99/51642).

Sabe-se muito bem no estado da técnica modificar os domíniosconstantes de anticorpos para melhorar as funções efetoras. Tais métodosestão descritos, por exemplo, no documento n- WO 99/54342.

Routier, F.H. et al.,Glycoconjugate J. 14:201-207 (1997) relatamo padrão de glicosilação de um anticorpo IgG1 humanizado expressado emcélulas CHO-DUKX. Este anticorpo apresenta uma razão molar de Fuc:Mande 0,8:3,0, que se refere a uma proporção de glicosilação de 80%. Niwa, R.et al.,J. Immunol. Methods 306:151-160 (2005) relatam anticorpos IgG1 elgG3 anti-CD20 produzidos de forma recombinante em fucosilação de CHODG44 de cerca de 90%. Mimura, Y. et al.,J. Immunol. Methods 247:205-216(2001) relatam que butirato aumenta a produção de IgG quimérica humanaem células CHO-K1 e ao mesmo tempo mantendo a função e o perfil de gli-coformas. Os perfis de oligossacarídeos apresentam um teor considerávelde estruturas de glicanos afucosilados. Raju, T.S., BioProcess International1:44-53 (2003) relatam o impacto da variação de glicosilação por sistemasde expressão na atividade biológica de imunoglobulinas terapêuticas e nanomenclatura. Rituximab apresenta 9-10% de fucosilação (Niwa, R. et al.,J.Immunol. Methods 306:151-160 (2005). Fujii, S. J. Bioi Chem. 265:6009-6018 (1990) relatam que IgG bovina inclui cerca de 11% de IgG afucosilada.Mizouchi, T., J. Immunol. 129:2016-2020 (1982) relatam que IgG humana écerca de 14% afucosilada. Bergwerff, A.A., Glycoconjugate J. 12:318-330(1995) relata que os anticorpos produzidos em SP2/0 do camundongo con-têm oligossacarídeos do ácido N-glicolil-neuramínico (NGNA) em grandesquantidades. Nahrgang, S. et ai, em "Animal Cell Technology: Products fromCells, Cells as Products", Bernard, A. et ai (editores), Kluwer Academic Pu-blishers, Dordrecht, NL, 1999, páginas 259-261, relatam que para a expres-são em CHO de IgG1 depois de transfecção transiente, uma glicosilaçãogobal deficiente é encontrada. Lund, J. et ai, Moi Immunol. 30:741-748(1993) relatam a produção recombinante de um anticorpo quimérico de ca-mundongo/humano em células de transfectoma do camundongo. O anticor-po IgG1 é afucosilado em uma quantidade de 13%. Patel, T.P. et al., Bio-chem. J. 285:839-845 (1992) relatam a glicosilação de anticorpos a partir decélulas de hibridoma e ascite do camundongo. Niwa, R. et al., J. Immunol.

Methods 306:151-160 (2005), relatam para o anticorpo IgGI de CD20 umafucosilação de 91% depois da produção recombinante em CHO DG44, eMori, K. etal., Biotech. Bioeng. 88:901-908, uma ficosilação de 94%. Davies,J. et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294 (2001) relatam que a expressão deanticorpos com glicoformas alteradas leva a um aumento de ADCC. Shee-ley, D.M. et al., Anal. Biochem. 247:1020110 (1997) comparam a glicosilaçãode anticorpos em diferentes sistemas de expressão. Shields, R.L. et al., J.Biol Chem. 277:26733-26740 (2002) relatam que a falta de fucose em Fc deIgG1 humana melhora a ligação de FcyRI 11 e ADCC. Um anticorpo anti-Her2sendo cerca de 90% fucosilado também apresenta ADCC em uma quantida-de considerável. Zhu, L. et al., Nature Biotechnol. 23:1159-1169 (2005), rela-tam sobre a produção de anticorpos humanos em ovos de galinha. Os do-cumentos n22 WO 2004/087756 e WO 2005/005635 descrevem anticorposaperfeiçoados contra IGF-1R.Sumário da Invenção

A invenção compreende um anticorpo do tipo IgGI ou lgG3 hu-mana sendo glicosilado com uma cadeia de um açúcar em Asn297, sendo odito anticorpo distinguido pelo fato de que a quantidade de fucose no dito açú-car é de pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou me-nos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 1% ou menos.

De acordo com a invenção, o termo "quantidade" significa aquantidade do dito açúcar na cadeia de açúcar em Asn297, relacionada àsoma de GO, G1, G2 (sem manose (4 e 5)) como 100% e como calculado noExemplo 3.

De acordo com a invenção, é possível fornecer anticorpos e/oucélulas hospedeiras CHO com uma fucosilação de mesmo 99,4% ou mais,99,5% ou mais, ou 99,9% ou mais.

De preferência, a quantidade de NGNA é 0,5% ou menos, maispreferivelmente 0,1% ou menos, e mesmo não-detectável por LCMS (Cro-matografia Líquida/Espectrometria de Massas).

De preferência, a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal Né 0,5% ou menos, mais preferivelmente 0,1% ou menos, e mesmo não-detectável por LCMS.

A cadeia de açúcar apresenta, de preferência, características deglicanos ligados ao N anexados a Asn297 de um anticorpo expressado deforma recombinante em uma célula CHO.

De preferência, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. De pre-ferência, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

A invenção compreende ainda uma célula CHO capaz de ex-pressar de forma recombinante um anticorpo do tipo IgGI ou lgG3 humanasendo glicosilada com uma cadeia de açúcar em Asn297, sendo o dito anti-corpo distinguido pelo fato de que na cadeia de açúcar a quantidade de fu-cose é pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou me-nos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 1% ou menos.

Tal linhagem de células é uma linhagem de células huMAbclGF-1 R>B1-E10_9-16 depositada segundo o Tratado de Budapeste noreconhecimento internacional do depósito de microorganismos com o propó-sito de processo de patente, com Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha, em 21 de junho de 2006 sob oNúmero de Acesso DSM ACC 2795.

As quantidades preferidas do açúcar estão mencionadas acima.

De preferência, a célula CHO é uma célula CHO que compreen-de deleção (por exemplo, DG44) ou inativação funcional de ambos alelosDHFR ou uma deleção de um alelo DHFR e uma inativação funcional do se-gundo alelo DHFR (por exemplo, DXB11).

A invenção compreende ainda uma composição de acordo coma invenção para uso em terapia médica humana.

O anticorpo da composição de acordo com a invenção é, de pre-ferência, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo hu-manizado, um anticorpo não-humano, um anticorpo de cadeia única quecompreende a parte constante da cadeia pesada de IgGI ou lgG3, ou umaparte constante da cadeia pesada de IgGI ou lgG3.

A invenção compreende ainda o uso de um anticorpo de acordocom a invenção para a fabricação de um medicamento. De preferência, omedicamento é útil para imunossupressão para o tratamento de distúrbiosmediados por células T, distúrbios auto-imunes, doenças infecciosas, doen-ças cancerígenas.

A invenção compreende ainda uma composição farmacêuticaque compreende um anticorpo de acordo com a invenção.

Um outro objeto da invenção é um método para a seleção deuma célula CHO para a produção recombinante de um anticorpo monoclonaldo tipo IgGI ou lgG3 humana sendo glicosilado com uma cadeia de açúcarem Asn 297, sendo o dito anticorpo distinguido pelo fato de que a quantida-de de fucose na dita cadeia de açúcar é pelo menos 99%, e além disso, aquantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 1% ou menos, sendo que o dito método compre-ende cultivar uma célula CHO transfectada com um anticorpo de IgGI oulgG3 e um gene de DHFR, sob pressão de seleção de DHFR e MTX, pegarclones individuais expandindo os clones e selecionando um clone que pro-duz um anticorpo com o padrão de glicosilação de acordo com a invenção.De preferência, o cultivo é realizado por pelo menos duas, de preferênciapelo menos três semanas.

Um outro objeto da invenção é o uso de uma célula CHO de a-cordo com a invenção para a produção recombinante de um anticorpo mo·noclonal.

Um outro objeto da invenção é um método para a produção re-combinante de um anticorpo monoclonal em uma célula CHO de açodo coma invenção.

A célula CHO é uma célula hospedeira para a expressão recom-binante de polipeptídeos heterólogos.Breve Descrição do Desenho

A figura 1 é um gráfico de barras ilustrando a atividade de ADCCou sua falta em anticorpos da invenção e em anticorpos de controle e com-parativos.

Descrição Detalhada da Invenção

Os anticorpos contêm estruturas de carboidratos em posiçõesconservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, sendo que cada isó-topo possui uma coleção distinta de estruturas de carboidratos ligadas a N,que afetam variavelmente a montagem, secreção ou atividade funcional deproteínas (Wright, A. e Morrison, S. L. Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997).A estrutura do carboidrato anexado ligado em N varia consideravelmente,dependendo do grau de processamento, e pode incluir alto teor de manose,multiplamente ramificada, bem como oligossacarídeos complexos biantena-dos (Wright, A. e Morrison, S. L. Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997).

Os anticorpos do tipo IgGI e lgG3 são glicopropteínas que têmum sítio de glicosilação ligado a N conservado em Asn297 em cada domínioCH2. Os dois oligossacarídeos complexos biantenados anexados a Asn297ficam enterrados entre os domínios CH2, formando contatos extensivos coma cadeia principal do polipeptídeo, e sua presença é essencial para o anti-corpo mediar funções efetoras tal como a citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC) (Lifely, M.R. et ai, Glycobiology 5:813-822 (1995); Jef-feris, R. et ai, lmmunol. Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. e Morrison, S.L.Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997).

Como aqui utilizado, o termo "região Fc do tipo IgG humana"inclui, de preferência, também variantes alélicas de ocorrência natural daregião Fc de uma imunogllobulina (anticorpo), bem como variantes que têmalterações que são substituições, adições ou deleções, mas que não afetama glicosilação de ASn297. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem serdeletados do terminal N ou terminal C da região Fc de uma imunoglobulinasem perda substancial da função biológica. Tais variantes podem ser sele-cionadas de acordo com regras gerais conhecidas nessas técnicas, de modoa ter efeito mínimo sobre a atividade (vide, por exemplo, Bowie, J.U. et ai,Science 247:1306-1310 (1990)).

O termos "anticorpo" engloba as várias formas de anticorpos,incluindo, porém sem limitações, anticorpos integrais, fragmentos de anticor-pos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos produzidospor engenharia genética, desde que as propriedades características de a-cordo com a invenção sejam retidas. Portanto, um anticorpo de acordo coma invenção contém pelo menos uma parte Fc funcionalmente ativa (ligantede Fc) do tipo IgGI ou lgG3 que compreende Asn glicosilado.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpomonoclonal", como aqui utilizado, referem-se a uma preparação de molécu-las de anticorpo com seqüência de aminoácidos idêntica. Conseqüentemen-te, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que apre-sentam uma única especificidade de ligação, que têm regiões variáveis econstantes derivadas de seqüências de imunoglobulinas de linhagem germi-nal humana.

O termo "anticorpo" quimérico refere-se a um anticorpo mono-clonal que compreende uma região variável, isto é, uma região ligante, deum fonte ou espécie, e pelo menos uma parte de uma região constante deuma fonte ou espécie diferente, preparada usualmente por técnicas de DNArecombinante. Os anticorpos quiméricos que compreendem uma região vari-ável murina e uma região constante humana são especialmente preferidos.Tais anticorpos quiméricos mu ri nos/humanos são o produto de genes deimunoglobulina expressados que compreendem segmentos de DNA que co-dificam regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de DNAque codificam regiões constantes de imunoglobulina humana. Os métodospara produzir anticorpos quiméricos envolvem técnicas de DNA recombinan-te convencionais e de transfecção gênica agora bem-conhecidas nessa área(vide, por exemplo, Morrison, S.L. et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984); patentes n22 US 5.202.238 e 5.204.244).

O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos nosquais a estrutura ou "regiões determinantes de complementaridade" (CDR)foram modificadas para compreender a CDR de uma imunoglobulina de es-pecificidade diferentes em comparação com aquela da imunoglobulina origi-nária. Em uma modalidade preferida, uma CDR murina é enxertada na regi-ão da estrutura de um anticorpo humano para preparar um "anticorpo huma-nizado" (vide, por exemplo, Riechmann, L. etal., Nature 332:323-327 (1988);e Neuberger, M.S. etal, Nature 314:268-270 (1985)). As CDRs particular-mente preferidas correspondem àquelas que representam seqüências quereconhecem os antígenos assinalados acima para anticorpos quiméricos ebifuncionais.

O termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, pretende inclu-ir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de seqüên-cias de imunoglobulinas de linhagem germinal humana. Tais regiões sãodescritas, por exemplo, por Johnson, G e Wu, T.T. Nucleic Acids Res.28:214-218 (2000) e as bases de dados lá referenciadas, e são úteis desdeque as propriedades de acordo com a invenção sejam retidas. Os anticorposhumanos são bem-conhecidos nessas técnicas (van Dijk, M.A. e van deWinkel, J.G. Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374 (2001)). Os anticorpos hu-manos podem ser produzidos também em animais transgênicos (por exem-plo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um re-pertório completo ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência daprodução de imunoglobulina endógena. A transferência da coleção de genesde imunoglobulinas de linhagem germinal humana nesses camundongosmutantes de linhagem germinal resulta na produção de anticorpos humanosapós desafio de antígenos (vide, por exemplo, Jakobovits, et ai, Proc. Na-tl.Acad. Sei. USA 90:2551-2555 (1993); Jakobovits et ai, Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann, M. et ai, Year Immunol. 7:33-40 (1993)). Os anti-corpos humanos podem ser produzidos também em bibliotecas de apresen-tação de fagos (Hoogenboom, H.R. e Winter, G., J. Moi Biol. 227:381-388(1992);Marks, J.D. et ai, J. Moi Biol. 222:581-597 (1991)). As técnicas deCole et al. e Boerner et ai também estão disponíveis para a preparação deanticorpos monoclonais humanos (Cole et ai, "Monoclonal Antibodies andCâncer Therapy", Alan R. Liss, página 77 (1995); e Boerner, P. et ai, J. Im-munol. 147:86-95 (1991)). Um anticorpo humano engloba as várias formasde anticorpos, de preferência anticorpos monoclonais, incluindo, porém semlimitações, anticorpos integrais, fragmentos de anticorpos e anticorpos pro-duzidos por engenharia genética (anticorpos variantes ou mutantes), desdeque as propriedades características de acordo com a invenção sejam reti-das. São especialmente preferidos os anticorpos humanos recombinantes.

O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui utilizado,pretende incluir todos anticorpos humanos que são preparados, expressa-dos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos iso-lados a partir de uma célula hospedeira de acordo com a invenção, usandoum vetor de expressão recombinante transfectado nessas célula hospedeira.

Os "domínios constantes" não estão envolvidos diretamente naligação de um anticorpo a um antígeno, mas apresentam outras funções taiscomo funções efetoras. As regiões constantes da cadeia pesada que corres-pondem a IgG1 são denominadas cadeia γ1. As regiões constantes da ca-deia pesada que correspondem a lgG3 são denominas cadeia γ3. As cadei-as pesadas γ constantes humanas são descritas detalhadamente por Kabat,E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5â edição, Pu-blic Health Service, Natonal Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); e porBruegemann, M. et ai, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987); Love, T.W. et al.,Methods Enzymol. 178:515-527 (1989). Os domínios constantes do tipolgG1 ou lgG3 são glicosilados em Asn297. "Asn 297", de acordo com a in-venção, significa o aminoácido asparagina localizado na posição aproximada297 na região Fc; baseado em pequenas variações de seqüências de anti-corpos, Asn297 pode estar localizado também alguns aminoácidos (usual-mente não mais do que ± 3 aminoácidos) a montante ou a jusante. Porexemplo, em um anticorpo de acordo com a invenção "Asn297" está Iocali-zado na posição de aminoácido 298.

A glicosilação de IgGI ou lgG3 humana ocorre em Asn297 comoglicosilação de oligossacarídeos complexos biantenados fucosilados termi-nados com até 2 resíduos de Gal (galactose). Estas estruturas são designa-das como resíduos de glicanos G0, G1 (a1,6 ou a1,3) ou G2, dependendoda quantidade de resíduos de Gal no terminal (Raju, T. S., BioProcess Inter-national 1:44-53 (2003)). A glicosilação do tipo CHO de partes Fc do anticor-po está descrita por Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14:201-207 (1997).O termo "região variável" (região variável de uma cadeia leve(VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)), como aqui utilizado, deno-ta cada par de cadeias leve e pesada que ETA envolvido diretamente naligação do anticorpo ao antígeno.

De acordo com a invenção, pode ser selecionado um anticorpoque produz uma célula hospedeira CHO que é capaz de fornecer por inter-médio de expressão recombinante uma composição de anticorpo monoclo-nal que apresenta um padrão de glicosilação de acordo com a invenção. Talcélula CHO hospedeira compreende um ou mais vetores de expressão para10 a expressão recombinante desse anticorpo. De preferência, a célula hospe-deira é estável transfectada com o(s) vetor(es) e o anticorpo que codificaácidos nucléicos estão integrados no genoma da célula hospedeira CHO.

O termo "célula CHO" engloba as varias formas de células doovários do hamster chinês (CHO) baseadas em alelos dhfr inativados, depreferência deletados (deficientes em desidrofolato redutase (dhfr")). Taiscélulas dhfr" e métodos para sua geração estão descritos, por exemplo, emUrlaub, G. et ai, Cell 33:405-412; Urlaub, G. et ai, Som. Call Molec. Genet.12 555:566 (1986); Kolkekar et ai, Biochemistry 36:10901-10909 (1997). Depreferência, a célula é uma linhagem de célula DG44. Tais células CHO dhfr"podem ser produzidas usando raios gama para eliminar o lócus dhfr inteiro.Em células do tipo selvagem não-mutadas dhfr é uma enzima essencial paraa síntese de novo de glicina, purinas, e timidilato. Isto permite que o gene dedhfr codificado em plasmídeos seja usado como um marcador selecionáveldominante e um ampliador de genes para a expressão de proteínas em Ii-nhagens de células deficientes em dhfr". A mutação dhfr" em células DG44 éestável e irreversível. As células CHO co-transfectadas exitosamente comvetor(es) de expressão para um anticorpo do tipo IgGI ou lgG3 humana e ogene de DHFR possuirão a fenótipo dhfr+ e podem ser selecionados facil-mente cultivando as colônias em meio isento de timidina e hipoxantina econtendo opcionalmente metotrexato (MTX) para ampliação.

As células DG44 são bem-conhecidas no estado da arte e estãodisponíveis, por exemplo, como linhagens de células, por exemplo, na Invi-trogen Corpo. (USA). As células DG44 podem se desenvolver aderentes, emsuspensão e/ou em meio isento de soro. Como aqui utilizados, os termos"célula", "linhagem de células" e "cultura de células" são utilizados de formaintercambiável e todas as designações de linhagens de células CHO dhfr"(dois alelos dhfr deletados) incluem a progênie. Assim sendo, as palavras"transformantes" e "células transformadas" incluem a célula em questão pri-mária e culturas derivadas dela sem levar em conta o número de transferên-cias. Deve ser entendido também que toda progênie não precisa ser preci-samente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ouinadvertidas. A progênie variante que tem as propriedades de glicosilaçãode acordo com a invenção conforme tríadas quanto a elas na célula trans-formada originalmente está incluída.

De preferência, a linhagem de células CHO dhfr" é co-ampliadacom pelo menos DHFR como um gene marcador selecionável. Por exemplo,um vetor de expressão mamífero que contém o marcador ou marcadores se-lecionáveis e o gene do anticorpo são co-transfectados dentro de células CHOrecebedoras. As colônias resultantes podem ser selecionadas e as colôniasque apresentam o fenótipo esperado são capazes de expressar o anticorpo.Marcadores selecionáveis adicionais podem ou não ser de uma natureza do-minante. Os exemplos de marcadores selecionáveis adicionais para usar co-transfecção incluem adenosina desaminase (Kaufman, R.J. et ai, Proc. NatiAcad. Sei. USA 83:3136-3140 (1986)) asparagina sintetase (Cartier, M. et ai,Moi Cell Biol. 7:1623-1628 (1987), gene trpB de E. coli e gene hisD de Sal-monella (Harman, S.C. e Mulligan, R.C., roc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8047- 8051 (1988), ribonucleotídeo redutase do camundongo M2 (Thelander, M. eThelander, L., EMBO J. 8:2475-2479 (1989), gene humano de resistência amúltiplos fármacos (Kane, S.E. et ai, Gene 84:439-446 (1989), glutamina sin-tetase (Bebbington, C.R. et ai, "DNA Cloning, volume III, D.M. Glover (editor),IRL Press, páginas 163-188, 1987), xantina guanina fosforribosil transferase(gpt) (Mulligan, R.C. e Berg, P., Science 209:1422-1427 (1980), higromicina B(Santerre, R.F. et ai, Gene 30:147-156 (1984), gene de neomicina (Southern,P.J. e Berg, P., Mol. Appi Genet. 1:327-341 (1982).Os marcadores selecionáveis podem também fornecer a basesobre a qual os genes que codificam o anticorpo podem ser ampliados. Naco-transfecção de uma linhagem de células CHO1 os DNA s dos vetores sãofreqüentemente integrados no cromossoma da célula no mesmo lócus. As-sim sendo, o uso de apenas um dos marcadores selecionáveis como a basepara ampliação normalmente resulta em um aumento paralelo no número decópias de ambos genes. Um marcador selecionável específico para uso des-ta maneira é dhfr que permite que a ampliação desejada seja obtida atravésdo uso de concentrações crescentes de MTX. Um segundo marcador sele-cionável preferido é GS que permite ampliação pela adição de metioninasulfoximina (MSX).

Os marcadores selecionáveis estão evidentemente sob o contro-le de elementos reguladores de DNA de modo a proporcionar sua expres-são. No caso do uso de dhfr como um marcador selecionável, os elementosreguladores são, de preferência, de uma fonte viral, tal como de vírus de tu-mor de DNA. É particularmente preferido o uso de um promotor tardio princi-pal de SV40 ou adenovírus. Ele é particularmente vantajoso nesse aspectopara remover o elemento intensificador do promotor, e assim "mutilando-o"eficazmente. Esta modificação permite que níveis maiores de ampliação dogene em cada concentração de seleção de metrotrexato do que ocorreria deoutra forma caso um promotor forte fosse usado. No caso do uso de neomi-cina como um marcador selecionável, um exemplo de um promotor apropri-ado é o promotor metalotioneína do camundongo.

O termo "ácido nucléico" ou "molécula de ácido nucléico", comoaqui utilizado, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Umamolécula de ácido nucléico pode ser de filamento único ou filamento duplo,mas, de preferência, é DNA de filamento duplo.

Um ácido nucléico está "ligado operacionalmente" quando ele écolocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácidos nucléi-cos. Por exemplo, o DNA para uma pré-seqüência ou líder secretória estáligada ao DNA para um polipeptídeo, caso ele esteja expressado como umapré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou in-tensificador está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora ca-so ele afete a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomaestá ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora caso ele estejaposicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, o termo "ligado ope-racionalmente" significa que as seqüências de DNA que estão sendo ligadassão "eis", e no caso de uma líder secretora, contíguas e em uma estrutura deleitura. Entretanto, os intensificadores não têm de ser contíguos. A ligação érealizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Caso tais sítiosnão existam, são usados adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Ii-gantes de acordo com a prática convencional.

Os anticorpos de acordo com a invenção são produzidos de pre-ferência por meios recombinantes. Tais meios são amplamente conhecidosnessas técnicas e compreendem a expressão de proteínas em células pro-carióticas e eucarióticas com subseqüente isolamento do polipeptídeo anti-corpo e usualmente purificação até uma pureza farmaceuticamente aceitá-vel. Para a expressão de proteínas, os ácidos nucléicos que codificam ca-deias leves e pesadas ou fragmentos delas são inseridos dentro de vetoresde expressão por métodos usuais. A expressão é realizada em células hos-pedeiras CHO e o anticorpo é recuperado das células ou sobrenadante, de preferência, depois da lise.

A produção recombinante de anticorpos é bem-conhecida nes-sas técnicas e está descrita, por exemplo, nos artigos revisionais de Makri-des, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202 (1999); Geisse, S. et ai, ProteínaExpr. Purif. 8:271-282 (1996); Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16:151:1612000); Werner, R.G., Drug Res. 48:870-880 (1998).

Os anticorpos podem estar presentes em células integrais, nosobrenadante, em um Iisado celular, ou em uma forma parcialmente purifi-cada ou substancialmente pura. A purificação é realizada para eliminar ou-tros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outrosácidos nucléicos ou proteínas celulares, por técnicas padronizadas, incluindotratamento alcalino/SDS, formação de bandas com CsCI, cromatografia decoluna, eletroforese em gel de agarose, e outras bem-conhecidas nessa á-rea (vide Ausubel, F. et ai, "Current Protocols in Molecular Biology", Green-de Publishing e Wiley lnterscience, New York (1987)).

As seqüências de controle, que são apropriadas para procariotas,incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma seqüência operado-ra, e um sítio de ligação de ribossomas. As células eucarióticas reconhecida-mente utilizam promotores, intensificadores e sinais de poliadenilação.

Os anticorpos monoclonais podem ser separados adequada-mente de um meio de cultura de hibridomas por procedimentos convencio-nais de purificação de imunoglobulinas, tais como, por exemplo, proteína Aem Sefarose, cromatografia com hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise,ou cromatografia de afinidade. O DNA e o RN que codificam os anticorposmonoclonais são isolados facilmente do hibridoma e seqüenciados usandoprocedimentos convencionais. As células de hibridoma podem servir comouma fonte de tais DNA e RNA. Depois de identificado e isolado, o DNA podeser inserido em vetores de expressão, que são então transfectados dentrode células CHO, que de outra forma não produzem a proteína imunoglobuli-na, para obter a síntese de anticorpos monoclonais recombinantes nas célu-las hospedeiras.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composiçãofarmacêutica que compreende uma composição da presente invenção, for-mulada em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. De prefe-rência, uma composição farmacêutica de acordo com o documento WO ne98/22136 é usada. Tal composição contém, por exemplo, em 1 mL, 2,0 mgde anticorpo, tampão de fosfato 15 mM, pH 6,5, cloreto de sódio 30 mM, 25mg de manita, 10 mg de arginina, 0,1 mg de Tween®.

Como aqui utilizado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitá-vel" inclui qualquer um e todos solventes, meios de dispersão, revestimen-tos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantesde absorção, e similares, que são fisiologicamente compatíveis. De prefe-rência, o veículo é apropriado para administração intravenosa, intramuscular,subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ouinfusão).Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal queretém a atividade biológica desjeada do anticorpo e não confere quaisquerefeitos colaterais indesejados (vide, por exemplo, Berge, S.M., et ai, J.Pharm. Sei. 66:1-19 (1977)). Tais sais estão incluídos na invenção. Os e-xemplos de tais sais incluem sais de adição de ácidos e sais de adição debases. Os sais de adição de ácidos incluem aqueles derivados de ácidosinorgânicos atóxicos, tais como sais de ácido clorídrico.

Uma composição da presente invenção pode ser administradapor uma série de métodos conhecidos nessas técnicas. Como deve ser ava-liados pelos versados nessas técnicas, a via e/ou modo de administraçãovariará dependendo dos resultados desejados.

Para administrar um composto da invenção por certas vias deadministração, pode ser necessário revestir o composto ou co-administrar ocomposto com um material para impedir sua inativação. Por exemplo, ocomposto pode ser administrado a um indivíduo em um veículo apropriado,por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamenteaceitáveis incluem solução salina e soluções aquosas de tampões.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções oudispersões aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporâneade soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso desses meios e agen-tes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido nessas técnicas.

Os termos "administração parenteral" e "administrado por viaparenteral", como aqui utilizados, significam modos de administração, dife-rentes de administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e inclui,sem limitações, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial,intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperito-neal, transtraqueal, subeutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular,subaraenóide, intra-espinhal, epidural, e intra-esternal.

Estas composições podem conter também adjuvantes, tais comoconservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e agentes dis-persantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegu-rada por procedimentos de esterilização, supra, e pela inclusão de váriosagentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, Paraben, coro-butanol,fenol, ácido sórbico, e similares. Pode ser desejável incluir agentes isotôni-cos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares, nas composições.Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode sercriada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoes-tearato de alumínio e gelatina.

Independentemente da via de administração selecionada, oscompostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hi-dratada apropriada, e/ou as composições farmacêuticas da presente inven-ção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveispor métodos conhecidos pelos versados nessas técnicas.

Os níveis reais da dosagem dos ingredientes ativos nas compo-sições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo aobter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a res-posta terapêutica desejada para um paciente, composição, e modo de admi-nistração específico, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagemselecionado dependerá de uma série de fatores farmacocinéticos, incluindoa atividade das composições específicas da presente invenção empregadas,ou do seu éster ou amida, via de administração, tempo de administração dataxa de excreção do composto específico que está sendo empregado, dura-ção do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados emcombinação com as composições específicas empregadas, a idade, sexo,peso, condição saúde geral e histórico médico anterior do paciente que estásendo tratado, e fatores similares bem-conhecidos nas técnicas de médicas.

A composição deve ser estéril e fluida até o grau em que a com-posição seja distribuível por seringa. Além da água, o veículo pode ser umasolução salina tamponada isotônica, etanol, poliol (por exemplo, glicerina,propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), e misturas apropriadasdeles.

A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso deum revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícu-la requerido no caso de dispersão, e pelo uso de surfactantes. Em muitoscasos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliál-coois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição.A absorção de longo prazo das composições injetáveis pode ser criada inclu-indo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, mono-estearato de alumínio ou gelatina.

Os exemplos e a figura que se seguem são fornecidos para auxi-liar a compreensão da presente invenção, cujo âmbito verdadeiro está enun-ciado nas reivindicações apensadas. Deve-se entender que modificaçõespodem ser feitas nos procedimentos enunciados, sem fugir do espírito dainvenção.

Exemplos

Linhagens de Células

A linhagem de células parental usada para a geração de umalinhagem de células para a expressão recombinante de IgG é uma linhagemde células do ovário do hamster chinês (CHO), CHO-DG44 (Flintoff, W.F. etal., Somat. Cell Genet 2:245-261 (1976); Flintoff, W.F. et ai, Mol. CeH Biol2:275-285 (1982); Urlaub, G., et al. Cell 33:405-412 (1983); Urlaub, G., et ai,Somat. Cell Genet. 12:555-566 (1986). As células CHO-DG44 perderamambos Iociendógenos para a enzima diidrofolato redutase (DHFR).

As células CHO-DG44 foram desenvolvidas em Meio MínimoAlfa MEM (Gibco N2 22561), FCS 10% dialisado (Gibco N2 26400-044) e 2mmol/L de L-gutamina, Hipoxantina 100 μΜ, timidina 16 μΜ (suplemento HT).

Plasm ídeos

O sistema de expressão compreendeu o promotor CMV e estádescrito na Tabela 1. Na qualidade de anticorpo, foi usado um anticorpo con-tra IGF-1R (documento n2 WO 2005/005635; AK18 ou AK22).Tabela 1

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>

Exemplo 1

Transfecção e Seleção

A transfecção do plasmídeo de expressão foi conduzida comFugene (Roche Diagnostics GmbH). Um dia depois da transfecção, as célu-las DG44 foram colocados sob pressão de seleção, consistindo em MeioMínimo Alfa MEM, 10% de FCS dialisado e 2 mmol/L de L-Glutamina e me-totrexato a 20 nM (MTX). Depois de 3 semanas sob pressão de seleção, clo-nes individuais foram coletados da placa e expandidos.

Os sobrenadantes foram coletados e a presença do anticorpo foianalisada com ELISA específica de IgG. Subclones foram expandidos aindamais e analisados quanto à produção do anticorpo específico.

Os clones foram adaptados para crescimento em cultura emsuspensão e meio isento de soro, HyQ SFM4 CHO-UtiIity (HyCIone n2SH30516), contendo MTX a 20 nM. Em paralelo, o Pedrão de glicosilação foideterminado. Os subclones foram selecionados disponibilizando a desfucosi-lação de 2,0% ou menos (referente à quantidade molar total de oligossacarí-deos).

Exemplo 2

Cultivo e Purificação

3 χ 105 células /mL foram desenvolvidas em frascos de batedeira(Corning) enchidos com 30 mL de meio a 37°C, 5% de CO2, 100 rpm, por 10dias. A densidade celular foi medida por Contador CASY e o sobrenadantefoi retirado para determinação da concentração do anticorpo por cromatogra-fia de afinidade com proteína A. Cerca de 20 mL de cada sobrenadante fo-ram purificados para caracterização bioquímica adicional por cromatografiacom proteína A (equilíbrio com PBS, lavagem com tampão de citrato de só-dio a 25 mM. pH 5,2, eluição com tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH2,8, CIP com NaOH a 10 mM).

Exemplo 3

Análise da Glicoestrutura do Anticorpo

O material do anticorpo purificado foi analisado por Cromatogra-fia Líquida/Espectrometria de Massa (LCMS) com análise do mapa de peptí-deos. As amostras foram reduzidas (Tris/HCI 0,4 M, Guanidina/HCI a 8 M,pH 8,5, DTT (3 mg/mL)), carboximetiladas (ácido iodo-acético) e clivadascom tripsina. A mistura peptídeo/glicopeptídeo foi separada com RP-HPLC eanalisada em linha com espectrometria de massas por spray de elétrons. Osespectros m/z da glicoestrutura que contém peptídeo foram integrados, e osresultados estão indicados na Tabela 2.

Tabela 2

Quantidade Relativa de Variantes de Glicosilação

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Man: Estruturas com alto teor de manose portando quatro e cinco resíduosde manose, respectivamente.

GO, G1, G2: cadeias pesadas reduzidas com carboidrato do tipo complexobiantenado fucosilado com 1, 2 ou 3 resíduos de galactose no terminal.

Não-fuc: cadeias pesadas reduzidas com carboidrato do tipo complexo bian-tenado sem fucose.

O clone 5 da linhagem de células CHO (hu MABclGF-1 R>B1-4E10_9_16) foi depositada segundo o Tratado de Budapeste no reconheci-mento internacional do depósito de microorganismos com o propósito deprocesso de patente, com Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen umZellculturen GmbH (DSMZ)1 Alemanha, em 21 de junho de 2006, sob o Nú-mero de Acesso DSM ACC 2795.

Os meios usados para cultivo dos diferentes clones foram obti-dos na Hyclone (HyQ SFM4 CHO-Utility, usado para clones 4-6) ou Sigma(C-8862, usado para os clones 1 -3 e 7).

A análise do mapa de peptídeos por LCMS foi realizada por in-tegração dos cromatogramas iônicos específicos de todos estados de cargaelétrica para todos glicopeptídeos.Bissecção de GIcNac, NGNA e alto teor de manose foram de-terminados da mesma maneira.

A bissecção de GIcNac e NGNA não foram detectáveis. A bis-secção de GIcNac e NGNA não são detectáveis, e assim sendo, a quantida-de de NGNA é 0,5% ou mais baixa, e é também 0,1% ou mais baixa.A quantidade de bissecção de GIcNac também é 0,5% ou mais baixa, e0,1% ou mais baixa.

Um cálculo exemplificativo de glicosilação (clone 3) está indica-do na Tabela 3 (Tabela 3-: clone 3, Tabela 3b: clone 5; peptídeo que com-preende Asn298, denominado H27).

Tabela 3a

<table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table>

Área: área de pico

H27_G0 - H27_G4: Glicopeptídeo H27 (contendo Asn298) com carboidratodo tipo complexo biantenado fucosilado com galactose no terminal χ (porexemplo, G4 com e unidades de galactose)Quantidade relativa sem Fuc: porcentagem de Fuc em relação a todos GO,G1, G2 sem glicoestrutura de manose (4 e 5) (alto teor de manose)H27_G1_1 NGNA - H27_G3_2NGNA : glicopeptídeo H27 contendo Asn298com carboidrato do tipo complexo biantenado fucosilado com unidades degalactose no terminal χ (por exemplo, G2 com 2 unidades) portando um adois ácidos N-glicolil-neuramínicosTabela 3b

Cálculo Exemplificativo de Glicosilação (clone 5)

<table>table see original document page 25</column></row><table>

1)Glicoestrutura do tipo complexo biantenado fucosilado com galactose noterminal χ (O, 1, 2, e 4, respectivamente)

2)Glicoestrutura do tipo complexo biantenado fucosilado com galactose noterminal χ (0, 1, 2, e 4, respectivamente) com resíduos adicionais de ácido n-glicolil-neuramínico

3)GIicoestruturas do tipo complexo biantenado fucosilado (principalmenteartefatos do método)

4)Estruturas com alto teor de manose portadoras de quatro ou cinco resíduosde manose, respectivamente

5)Glicoestruturas não-fucosiladas

Exemplo 4

Determinação de Funções Efetoras Mediadas por Anticorpo por HuMAbsanti-IGF-1 R

Para determinar a capacidade de os anticorpos HuMAb geradoseliciarem mecanismos efetores imunes, foram realizados estudos de citoto-xicidade de células dependente de anticorpo (ADCC).

Para estudar os efeitos dos anticorpos em ADCC, células decâncer prostático DU145 (HTB-81; 1 χ 10^6 em 2 a 4 mL de RPMI-FM) queexpressam IGF-1R foram marcadas com 1 μL de solução de 2,2':6',2"-terpiridina-6,6"-dicarboxilato de bis-(acetóxi-metila) (BATDA) por 25 min a37°C em uma incubadora de células. As células foram lavadas quatro vezescom 10 mL de RPMI-FM e centrifugadas por 10 min a 200 χ g com freio. De-pois disso, as células foram ajustadas até uma concentração de 1 χ 105 célu-las/mL. 5.000 células foram plaqueadas por cavidade em uma placa de fun-do redondo correspondente a um volume de 50 μL. Anticorpos HuMAB fo-ram adicionados em uma concentração final na faixa entre 25 e 0,1 ng/mLem um volume de 50 μL de meio de cultura de células. Subseqüentemente,50 μL de células efetoras, PBMC recém-isolado do sangue total ou célulasefetoras purificadas a partir dos cremes leucocitários (buffycoats), foram adi-cionados em uma razão de E:T na faixa de 25:1. As placas foram centrifuga-das imediatamente por 1 min a 200 χ g com freio, e incubadas por duas ho-ras a 37°C. Depois da incubação, as células foram centrifugadas por 10 mina 200 χ g, e 20 μL do sobrenadante foram transferidos para uma placa demicrotitulação Optiplate 96-F. 200 μΙ_ de solução de európio (à temperaturaambiente) foram adicionados, e a mistura foi incubada por 15 min em umabatedeira. A fluorescência resultante foi medida em um fluorômetro com re-solução de tempo, usando o protocolo EU-TDA da Perkin Elmer.

A magnitude da Iise celular por ADCC é expressa como % daliberação máxima de 6,6"-dicarboxilato de ^'^'^"-terpiridina (TDA) a partirdas células-alvo Iisadas por detergente, corrigido quanto à liberação espon-tânea de TDA a partir das respectivas células-alvo. Com padrão referencialde um anticorpo que apresenta "nenhuma ADCC" ADCC (citotoxicidade me-diada por células dependentes de anticorpos) é usado um anticorpo (mono-clonal) contra KLH (hemocianina do molusco "keyhole Iimpet') ou uma mistu-ra de IgG isolada a partir de cerca de 35.000 doadores ("Redimune"). Umanticorpo isento de fucose a 75% contra IGF-IR foi usado como controle po-sitivo. Um anticorpo de acordo com a invenção apresentou uma liberação deTDA que está dentro de 3xSD da liberação de TDA do anticorpo-padrão (Fi-gura 1).<table>table see original document page 28</column></row><table>

INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO OU OUTRO MATERIALBIOLÓGICO

(PCT Regra 13bis)

A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo ou outro material biológico mencionado norelatório descritivo

<table>table see original document page 28</column></row><table>C. ADDITIONALINDICATIONS (additional sheet)

Applicants : F. Hofifmann-La Roche AG1 et al.

Applicants fiíe reference: 23706 WO-SR

International application No.: PCT/EP2007/003164

Indications Relating to the Expert Solution in Respeet of Deposited Biological Material

Referred to in the Deseription

The indications relating to deposited biologíeal material are ali contained in the description.The following additional indications are not required to be part of the description andshould be trèated as "separate indications." They relate only to the expert solution.The additional indications madebelow relate to the deposited biological material referredto as:

huMab<lGF-lR>Bl-4ElO_9-16 DSM ACC2795

in the description on page 2/3.

The additional indications are:

For CA (Canada) designation:

In respect of the designation of Canada, samples of the deposited biological material will bemade available until the grant of the Canadian patent, or until the date on which theapplication is refused, or is abandoned and no longer subject to reinstatement, or iswithdrawn, as provided in RuIes 307 and 108 of the Patent Rules under the CanadianPatent Act, only by the issue of a sample to an independent expert nominated by theCommissioner (Rule 104(4))

For EP (European Patent) designation:

In respect of the designation of the EPO, samples of the deposited biological material willbe made available until the publication of the mention of the grant of the European patent,or until 20 years from the date of filing if the application is refiased or withdrawn or isdeemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the Implementing Regulationsunder the EPC, only by the issue of a sample to an expert nominated by requester (Rule28(4) EPC).

For SG (Singapore) designation:

Applicants hereby give notice of our intention that samples of the above-identifíed cultureshall be available only to experts in accordance with paragraph 3 of the Fourth Sehedule tothe Patents Rules 1995.TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DE-PÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE

PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 30</column></row><table>

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacio-nal de depósito foi obtido.Formato DSMZ-BP/4(página única) 12/2001Roche Diagnostics GmbHSandhofer Str. 116, D-68305 MannheimF. Hoffmann-La Roche AG124 Grenzaeherstr., CH-4070 BasesHoffmann-La ROehe Inc.340 Kingsland Stree, NutleyNJ 07110-1199, USA

<table>table see original document page 31</column></row><table>

1 indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a datarelevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade maisrecente.

3 Marcar com um X o campo aplicável

4 Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativosFormato DSMZ-BP/9 (única página) 12/2001

Claims

1. Anticorpo do tipo IgGI ou lgG3 humana sendo glicosilado comuma cadeia de açúcar em Asn297, sendo o dito anticorpo caracterizado pelofato de que a quantidade de fucose na dita cadeia de açúcar é pelo menos-99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantida-de da alfa-1,3-galatose do terminal N é 1% ou menos.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de que a quantidade de NGNA é 0,5% ou menos.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza-do pelo fato de que a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 0,5%ou menos.

4. Anticorpo, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracte-rizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizadoou humano.

5. Célula CHO capaz de expressar de forma recombinante umanticorpo do tipo IgGI ou lgG3 humana, sendo glicosilado com uma cadeiade açúcar em Asn297, sendo o dito anticorpo caracterizado pelo fato de quedentro da dita cadeia de açúcar a quantidade de fucose é pelo menos 99%,e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade dealfa-1,3-galactose do terminal N é 1 % ou menos.

6. Célula CHO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que compreende deleção de dois alelos de DHFR.

7. Linhagem de células CHO DSM ACC 2795.

8. Uso de um anticorpo como definido nas reivindicações de 1 a-5, em terapia médica humana.

9. Uso de um anticorpo como definido nas reivindicações de 1 a-5, para a fabricação de um medicamento.

10. Uso de um anticorpo como definido nas reivindicações de 1a 5, para a fabricação de um medicamento para imunossupressão, para otratamento de distúrbios mediado por células T, distúrbios auto-imunes, do-enças infecciosas, doenças cancerígenas.

11. Composição farmacêutica que compreende um anticorpocomo definido nas reivindicações de 1 a 5.

12. Método para a seleção de uma célula CHO para a produçãorecombinante de um anticorpo monoclonal do tipo IgGI ou lgG3 humanasendo glicosilado com uma cadeia de açúcar em Asn297, sendo o dito anti-corpo caracterizado pelo fato de que a quantidade de fucose na dita cadeiade açúcar é pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% oumenos e/ou a quantidade da alfa-1,3-galactose do terminal N é 1% ou me-nos, sendo que o dito método compreende cultivar uma célula CHO transfec-tada com um anticorpo IgGI ou lgG3, sob condições de pressão de seleçãode DHFR1 pegando os clones individuais, expandindo os clones e selecio-nando um clone que produz um anticorpo com o padrão de glicosilação deacordo com a invenção.

13. Uso de uma célula CHO como definida nas reivindicações dea 7, para a produção recombinante de um anticorpo monoclonal.

14. Método para a produção recombinante de um anticorpo mo-noclonal em uma célula CHO como definido nas reivindicações de 5 a 7.