ES2575226T3

ES2575226T3 - Péptidos permeables celulares inhibidores de la ruta de transducción de la señal JNK para su uso en el tratamiento de la uiveítis

Info

Publication number: ES2575226T3
Application number: ES11775734.4T
Authority: ES
Inventors: Jean-Marc Combette; Catherine Deloche; Claire Abadie
Original assignee: Xigen Inflammation Ltd
Current assignee: Xigen Inflammation Ltd
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2016-06-27
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: EP2902035A1; HK1187266A1; EP2902035B1; ES2688030T3; PL2902035T3; PL2627346T3; EP2627346A1; DK2627346T3; CY1120936T1; EP2627346B1; WO2012048893A1; HK1210056A1; DK2902035T3

Abstract

(Poli)péptido quimérico que comprende un (poli)péptido inhibidor de JNK para su uso en el tratamiento de la uveítis, comprendiendo o consistiendo el (poli)péptido quimérico en toda la secuencia de D-aminoácidos de SEQ ID Nº: 11, o en un fragmento o una variante de la misma que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90% con toda la secuencia de D-aminoácidos de SEQ ID Nº: 11.

Description

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Peptidos permeables celulares inhibidores de la ruta de transduccion de la senal JNK para su uso en el tratamiento de la uiveftis.

La presente invencion se refiere al campo de la utilizacion de inhibidores de protefna quinasa y mas especfficamente al uso de inhibidores de la protefna quinasa, quinasa amino terminal c-Jun, (poli)peptidos inhibidores de JNK, peptidos quimericos, o de acidos nucleicos que los codifican, y a composiciones farmaceuticas que los contienen, para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas, como orzuelos, chalazion, conjuntivitis, queratitis, escleritis, episcleritis, endoftalmitis, panoftalmitis, irititis, uveitis, ciclitis, coroiditis, celulitis orbitaria, retinitis y/o miositis del musculo ocular, etc.

La cantidad de enfermedades oftalmicas (oculares), en particular enfermedades oftalmicas (oculares) cronicas y no cronicas representa un desaffo considerable para los sistemas sanitarios publicos. Las enfermedades oftalmicas son enfermedades del ojo. La presente invencion se centra en enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas. Estas incluyen, por ejemplo, enfermedades inflamatorias de los parpados, la conjuntiva, la cornea, la esclerotica, el cuerpo vftreo, la uvea, el cuerpo ciliar, la coroides, el hueso orbital, las glandulas lacrimales, el iris, etc. Ejemplos de estas enfermedades inflamatorias son orzuelos, chalazion, conjuntivitis, queratitis, escleritis, episcleritis, endoftalmitis, panoftalmitis, irititis, uveitis, ciclitis, coroiditis, celulitis orbitaria, retinitis y/o miositis del musculo ocular.

Se han identificado quinasas c-Jun NH2-terminales (JNK) como protefna quinasas activadas por estres que fosforilan c-Jun en dos sitios en su dominio de activacion NH2-terminal. La via de las JNK se activa por determinadas citoquinas, mitogenos, estres osmotico e irradiacion. La fosforilacion del componente c-Jun del factor de transcripcion de protefna activadora AP-1 resulta en una produccion de citoquinas proinflamatorias. Durante la inflamacion, la activacion temprana del endotelio vascular, que libera importantes factores quimiotacticos como RANTES, IL-8, ICAM y VCAM, conduce a la infiltracion y reincorporacion de leucocitos. Las celulas que se infiltran liberan a su vez diferentes grupos de productos proinflamatorios o antiinflamatorios que contribuyen a danos tisulares e inflamacion. Muchos de los productos genicos implicados en la respuesta inflamatoria son regulados por el factor de transcripcion de protefna activadora (AP-1), y la via de la quinasa c-Jun NH2-terminal (JNK): COX-2, ciclooxigenasa-2; IFN-g, interferon-gamma; iNOS, oxido nftrico sintasa inducible; TNF-a, factor alfa de necrosis tumoral; MCP-1, protefna-1 cofactor de membrana; MIP-1, protefna-1 intrfnseca principal; IL-2, interleucina-2, ... En monocitos estimulados por lipopolisacaridos (LPS) y macrofagos tisulares, el TNF-a se produce a traves de la activacion de la via de JNK y se modula mediante su inhibicion.

La WO 2009/143865 A1 describe el uso de inhibidores de peptidos JNK con permeabilidad celular para el tratamiento de diversas enfermedades seleccionadas de entre enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares, enfermedades cancerosas, diabetes, incluyendo diabetes de tipo 1 o tipo 2, enfermedades inflamatorias, alopecia, incluyendo alopecia areata, enfermedades pulmonares, enfermedades neuronales o neurodegenerativas, enfermedades hepaticas, enfermedades espinales, enfermedades uterinas, enfermedades infecciosas virales y trastornos depresivos.

La WO 2010/113753 A1 describe un agente profilactico o terapeutico que comprende, como principio activo, un peptido inhibidor de las JNK de menos de 150 aminoacidos de longitud que contiene al menos un D- aminoacido para enfermedades retinales, incluyendo degeneracion macular asociada a la edad, edema macular diabetico, retinopatfa diabetica (excluyendo el edema macular diabetico), coriorretinopatfa exudativa central, estrfas angioides, desprendimiento del pigmentario retinal, coroiditis multifocal, maculopatfa neovascular (limitada exclusivamente a casos provocados por gran miopia, sfndrome del disco inclinado u osteoma coroideo), retinopatfa del prematuro, retinitis pigmentaria, enfermedad de Leber, oclusion de las arterias retinianas, oclusion de las venas retinianas, coriorretinopatfa serosa central, macroaneurisma retiniano, desprendimiento de retina, vitreorretinopatfa proliferativa, enfermedad de Stargardt, esclerosis coroidea, coroideremia, distrofia macular viteliforme, enfermedad de Oguchi, fyundus albipunctatus, retinitis punctata albescens, y atrofia girada de la coroides y de la retina.

Por tanto, los inhibidores de JNK se han utilizado en diversos modelos de inflamacion y han demostrado ejercer efectos antiinflamatorios y beneficiosos en enfermedades inflamatorias como la artritis y el asma.

La presente invencion proporciona un (poli)peptido quimerico que comprende un (poli)peptido inhibidor de JNK destinado al uso en el tratamiento de la uveitis, comprendiendo o consistiendo el (poli)peptido quimerico en toda la secuencia de D-aminoacidos de SEQ ID N°: 11, o en un fragmento o una variante de la misma que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90% con toda la secuencia de D-aminoacidos de SEQ ID N°: 11. La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica destinada al uso en el

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tratamiento de la uveitis que incluye un (poli)peptido quimerico que comprende o consiste en toda la secuencia de D-aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID N°: 11, o en un fragmento o una variante que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90% con toda la secuencia de D-aminoacidos de SEQ ID N°: 11.

Por consiguiente, el objeto de la presente invencion es proporcionar terapias alternativas o mejoradas que posibiliten una nueva cura, preferentemente mejorada, de la uveitis.

Este objeto se resuelve mediante el uso de un (poli)peptido inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invencion, es decir, el uso de un (poli)peptido quimerico que comprende o consiste en toda la secuencia de D-aminoacidos de acuerdo con la sEq ID N°: 11, o en un fragmento o una variante de la misma que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90% con toda la secuencia de D-aminoacidos de SEQ ID N°: 11, en el tratamiento de la uveitis.

Tal como se utiliza aquf, el concepto "enfermedad oftalmica inflamatoria cronica o no cronica" se refiere normalmente a enfermedades inflamatorias cronicas o no cronicas del ojo. La enfermedad puede ser por ejemplo extraocular o intraocular. Esto incluye enfermedades de los parpados, la conjuntiva, la cornea, la esclerotica, el cuerpo vftreo, la uvea, el cuerpo ciliar, la coroides, el hueso orbital, las glandulas lacrimales, el iris, etc. En este sentido se incluyen preferentemente: orzuelos, chalazion, conjuntivitis, queratitis, escleritis, episcleritis, endoftalmitis, panoftalmitis, irititis, uveitis, ciclitis, coroiditis, celulitis orbitaria, retinitis, miositis del musculo ocular. La presente invencion se refiere en particular al tratamiento de la uveitis, por ejemplo el tratamiento de la uveitis anterior, la uveitis intermedia, la uveitis posterior y la panuveitis. El tratamiento de la uveitis anterior es particularmente preferente.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que algunos (poli)peptidos inhibidores de JNK son particularmente adecuados para el tratamiento de estas enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas en un sujeto.

En el contexto de la presente descripcion que comprende la presente invencion, un (poli)peptido inhibidor de JNK se puede derivar normalmente de una secuencia IB1 humana o de rata, preferentemente de una secuencia de aminoacidos tal como se define o codifica mediante cualquiera de las secuencias de acuerdo con la SEQ ID N°: 102 (representa la secuencia de ADNc de IB1 de rata y su secuencia de aminoacidos prevista), la SEQ ID N°: 103 (representa la secuencia de protefnas IB1 de rata codificada por el lfmite exon- intron del donante de empalme genico rIB1), la SEQ ID N°: 104 (representa la secuencia de protefnas IB1 de Homo sapiens), o la SEQ ID N°: 105 (representa la secuencia de ADNc de IB1 de Homo sapiens), de forma especialmente preferente de una secuencia de aminoacidos tal como se define o codifica mediante cualquiera de las secuencias de acuerdo con la SEQ ID N°: 104 (representa la secuencia de protefnas IB1 de Homo sapiens), o la SEQ ID N°: 105 (representa la secuencia de ADNc de IB1 de Homo sapiens), o de cualquier fragmento o variante de las mismas. Dicho de otro modo, el (poli)peptido inhibidor de JNK comprende un fragmento, variante o variante de dicho fragmento de una secuencia IB1 humana o de rata. Las secuencias IB humanas o de rata se definen o codifican, respectivamente, mediante las secuencias de acuerdo con la SEQ ID N°: 102, SEQ ID N°: 103, SEQ ID N°: 104 o SEQ ID N°: 105.

Preferentemente, un (poli)peptido inhibidor de JNK de este tipo tal como se describe aquf comprende una longitud total de menos de 150 residuos aminoacidos, preferentemente un intervalo entre 5 y 150 residuos, de forma especialmente preferente entre 10 y 100 residuos, de forma particularmente preferente entre 10 y 75 residuos y de forma totalmente preferente entre 10 y 50 residuos, por ejemplo entre 10 y 30, entre 10 y 20 o entre 10 y 15 residuos aminoacidos.

De forma especialmente preferente, dicho (poli)peptido inhibidor de JNK y los intervalos arriba indicados se pueden seleccionar entre cualquiera de las secuencias arriba mencionadas, de forma todavfa mas preferente de una secuencia de aminoacidos tal como se define de acuerdo con la SEQ ID N°: 104 o tal como se codifica mediante la SEQ ID N°: 105, de forma particularmente preferente en la region entre los nucleotidos 420 y 980 de la SEQ ID N°: 105 o los aminoacidos 105 y 291 de la SEQ ID N°: 104, y de forma totalmente preferente en la region entre los nucleotidos 561 y 647 de la SEQ ID N°: 105 o los aminoacidos 152 y 180 de la SEQ ID N°: 104.

En particular, un (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf normalmente se une a JNK y/o inhibe la activacion de al menos un factor de transcripcion activado por JNK, por ejemplo c-Jun o ATF2 (veanse, por ejemplo, las SEQ ID N°: 15 y 16, respectivamente) o Elk1.

Igualmente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf preferentemente comprende o consiste en al menos una secuencia de aminoacidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 1 a 4, 13 a 20 y 33 a 100, o un fragmento, derivado o variante de la misma. De forma especialmente preferente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf puede contener 1, 2, 3, 4 o incluso mas copias

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de una secuencia de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID N°: 1 a 4, 13 a 20 y 33 a 100, o un fragmento, derivado o variante de la misma. Si estan presentes en mas de una copia, estas secuencias de aminoacidos de acuerdo con SEQ ID N°: 1 a 4, 13 a 20 y 33 a 100, o variantes, fragmentos o derivados de las mismas tal como se describen aquf pueden estar unidas directamente entre si sin ninguna secuencia de enlace o a traves de una secuencia de enlace que comprende de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5 aminoacidos. Los aminoacidos que forman la secuencia de enlace se seleccionan preferentemente entre glicina o prolina como residuos aminoacidos. De forma especialmente preferente, estas secuencias de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID N°: 1 a 4, 13 a 20 y 33 a 100, o fragmentos, variantes o derivados de las mismas, tal como se dan a conocer aquf, pueden estar separadas entre si por una bisagra de dos, tres o mas residuos prolina.

Los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden estar compuestos por L- aminoacidos, D-aminoacidos o una combinacion de ambos. Preferentemente, los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf comprenden al menos 1 o incluso 2, preferiblemente al menos 3, 4 o 5, de forma especialmente preferente al menos 6, 7, 8 o 9, y de forma particularmente preferente al menos 10 o mas D-aminoacidos y/o L-aminoacidos, pudiendo estar dispuestos los D-aminoacidos y/o L-aminoacidos en las secuencias inhibidoras de JNK tal como se dan a conocer aquf en forma de bloques, no en forma de bloques o de un modo alternado.

De acuerdo con una realizacion no reivindicada, los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden estar compuestos exclusivamente por L-aminoacidos. En este caso, los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden comprender o consistir en al menos una "secuencia inhibidora de JNK nativa" de acuerdo con la SEQ ID N°: 1 o 3. En este contexto, la expresion "nativa" o "secuencia(s) inhibidora(s) de JNK nativa(s)" se refiere a secuencias de (poli)peptidos inhibidores de JNK no alteradas de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 1 o 3, tal como se dan a conocer aquf, compuestas totalmente por L-aminoacidos.

Por consiguiente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf consiste en al menos una secuencia de aminoacidos (nativa) NH2-Xnb-RPTTLXLXXXXXXXQD- Xna-Xnb-COOH (L-IB generico (s)) [SEQ ID N°: 3] y/o el dominio de union de JNK (JBDs) de IB1 XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX (L-IB (generico)) [SEQ ID N°: 19]. En este contexto, cada X representa normalmente un residuo aminoacido, preferentemente seleccionado entre cualquier residuo de aminoacido (nativo). Xna representa normalmente un residuo aminoacido, preferentemente seleccionado entre cualquier residuo aminoacido excepto serina o treonina, siendo n (la cantidad de repeticiones de X) igual a 0 o 1. Ademas, cada Xnb se puede seleccionar entre cualquier residuo aminoacido, siendo n (la cantidad de repeticiones de X) igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 2030 o mas, con la condicion de que, si n (la cantidad de repeticiones de X) es 0 para Xna, Xnb no comprende una serina o treonina en su extremo N-terminal con el fin de evitar una serina o treonina en esta posicion. Preferentemente, Xnb representa una extension contigua de residuos peptfdicos derivados de SEQ ID N°: 1 o 3. Xna y Xnb pueden representar D-aminoacidos o L-aminoacidos. Adicionalmente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf puede comprender o consistir en al menos una secuencia de aminoacidos (nativa) seleccionada entre el grupo que comprende el dominio de union de JNK de IB1 DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (L-IB1) [SEQ ID N°: 17]. De forma especialmente preferente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf puede ademas comprender o consistir en al menos una secuencia de aminoacidos (nativa) NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH (L-IB1 (s)) [SEQ ID N°: 1 ]. Ademas, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf puede comprender o consistir en al menos una secuencia de aminoacidos (nativa) seleccionada entre el grupo que comprende el dominio de union de JNK de IB1 L-lB1(s1) (NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID N°: 33); L-IB1(s2) (NH2-TTLNLF- PQVPRSQ-COOH, SEQ ID N°: 34); L-IB1(s3) (NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID N°: 35); L-IB1(s4) (NH2-RPT- TLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID N°: 36); L-IB1(s5) (NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID N°: 37); L-IB1(s6) (NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID N°: 38); L-IB1(s7) (NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID N°: 39); L-IB1(s8) (NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID N°: 40); L-IB1(s9) (NH2-TLNLFPQVPRSQ- COOH, SEQ ID N°: 41); L-IB1(s10) (NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID N°: 42); L-IB1 (s11) (NH2- PTTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID N°: 43); L-IB1(s12) (NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID N°: 44); L- IB1(s13) (NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID N°: 45); L-IB1 (s14) (NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID N°: 46); L-IB1(s15) (NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID N°: 47); L-IB1 (s16) (NH2-NLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID N°: 48); L-IB1(s17) (NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID N°: 49); L-IB1(s18) (NH2-TLNLFPQVPRS- COOH, SEQ ID N°: 50); L-IB1(s19) (NH2-TTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID N°: 51); L-IB1(s20) (NH2- PTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID N°: 52); L-IB1 (s21) (NH2-RPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID N°: 53); L-IB1(s22) (NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID N°: 54); L-IB1(s23) (NH2-PKRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID N°: 55); L- IB1(s24) (NH2-RPKRPTTLNLF-COOH, SEQ ID N°: 56); L-IB1(s25) (NH2-LFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID N°: 57); L-IB1(s26) (NH2-NLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID N°: 58); L-IB1(s27) (NH2-LNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID N°: 59); L-IB1(s28) (NH2-TLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID N°: 60); L-IB1(s29) (NH2-TTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID N°: 61); L-IB1(s30) (NH2-PTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID N°: 62); L-IB1(s31) (NH2-RPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID N°: 63); L-IB1(s32) (NH2-KRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID N°: 64); L-IB1(s33) (NH2-PKRPTTLNLF- COOH, SEQ ID N°: 65); y L-IB1(s34) (NH2-RPKRPTTLNL-COOH, SEQ ID N°: 66).

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Adicionalmente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf puede comprender o consistir en al menos una secuencia de aminoacidos (nativa) seleccionada entre el grupo que comprende el dominio de union de JNK (largo) de IB1 PGTGCGD- TYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (IB1-largo) [SEQ ID N°: 13], el dominio de union de JNK (largo) de IB2 IPSPSVEEP- HKHRPTTLRLTTLGAQDS (IB2-largo) [SEQ ID N°: 14], el dominio de union de JNK de c-Jun GAYGYSNPKILKQS- MTLNLADPVGNLKPH (c-Jun) [SEQ ID N°: 15], el dominio de union de JNK de ATF2 TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV (ATF2) [SEQ ID N°: 16] (veanse, por ejemplo, las FIGURAS 1A-1C). En este contexto, una alineacion revelo una secuencia de 8 aminoacidos parcialmente conservada (vease, por ejemplo, la FIG. 1A) y una comparacion adicional de los JBDs de IB1 e IB2 revelo dos bloques de siete y tres aminoacidos que estan altamente conservados entre las dos secuencias.

Los (poli)peptidos inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invencion tal como se definen mas arriba estan compuestos en parte o exclusivamente por D-aminoacidos tal como se definen mas arriba. De forma especialmente preferente, estos (poli)peptidos inhibidores de JNK compuestos por D-aminoacidos consisten en secuencias D retroinversas no nativas de las secuencias inhibidoras de JNK (nativas) arriba indicadas. La expresion "(poli)peptidos retroinversos" se refiere a un isomero de una secuencia peptfdica lineal en los que la direccion de la secuencia esta invertida y la quiralidad de cada residuo aminoacido esta invertida (vease, por ejemplo, Jameson y col., Nature, 368,744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368,692-693 (1994)). La ventaja de combinar D-enantiomeros y sfntesis inversa consiste en que las posiciones de los grupos carbonilo y amino en cada enlace amfdico se intercambian, mientras que la posicion de los grupos de cadena lateral en cada carbono alfa se conserva. A no ser que se indique especfficamente otra cosa, se supone que cualquier secuencia o peptido de L-aminoacidos dada utilizada de acuerdo con la presente invencion se puede convertir en una secuencia o peptido D retroinverso mediante la sfntesis de una inversion de la secuencia o peptido con respecto a la secuencia o peptido de L-aminoacidos nativa correspondiente.

Los (poli)peptidos D retroinversos tal como se utilizan aquf y se definen mas arriba tienen diversas propiedades utiles. Por ejemplo, los(poli)peptidos D retroinversos tal como se utilizan aquf entran en las celulas con la misma eficiencia que las secuencias de L-aminoacidos tal como se utilizan aquf, mientras que las secuencias D retroinversas tal como se utilizan aquf son mas estables que las secuencias de L- aminoacidos correspondientes.

Por consiguiente, los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden comprender o consistir en al menos una secuencia D-retroinversa de acuerdo con la secuencia de aminoacidos NH2-Xnb- Xna-DQXXXXXXXLXLTTPR- Xnb-COOH (D-IB1 generico (s)) [SEQ ID N°: 4] y/o XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX (D-IB (generico)) [SEQ ID N°: 20]. Tal como se utilizan en este contexto, X, Xna y Xnb tienen el significado arriba definido (preferentemente representan D-aminoacidos), representando Xnb preferentemente una extension contigua de residuos derivados de SEQ ID N°: 2 o 4. Si n es 0 en Xna, Xnb preferentemente no incluye ninguna serina o treonina en su extremo C-terminal. Adicionalmente, los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden comprender o consistir en al menos una secuencia D retroinversa de acuerdo con la secuencia de aminoacidos que comprende el dominio de union de JNK (JBDs) de IB1 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD (D-IB1) [SEQ ID N°: 18]. De forma especialmente preferente, los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden comprender o consistir en al menos una secuencia D retroinversa de acuerdo con la secuencia de aminoacidos NH2- DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH (D-IB1(s)) [SEQ ID N°: 2]. Ademas, los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden comprender o consistir en al menos una secuencia D retroinversa de acuerdo con la secuencia de aminoacidos que comprende el dominio de union de JNK (JBDs) de IB1 D- IB1(s1) (NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID N°: 67); D-IB1(s2) (NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID N°: 68); D-IB1(s3) (NH2-PVQPFLNLT- TPRK-COOH, SEQ ID N°: 69); D-IB1(s4) (NH2-RPVQPFLNLTTPR- COOH, SEQ ID N°: 70); D-IB1(s5) (NH2-SRPVQP- FLNLTTP-COOH, SEQ ID N°: 71); D-IB1(s6) (NH2- QSRPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID N°: 72); D-IB1(s7) (NH2-DQS- RPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID N°: 73); D- IB1(s8) (NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID N°: 74); D-IB1(s9) (NH2-QP-FLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID N°: 75); D-IB1(s10) (NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID N°: 76); D-IB1(s11) (NH2-PVQPFLNLTTPR- COOH, SEQ ID N°: 77); D-IB1(s12) (NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID N°: 78); D-IB1(s13) (NH2- SRPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID N°: 79); D-IB1 (sl4) (NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID N°: 80); D- IB1(s15) (NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID N°: 81); D-IB1(s16) (NH2-FLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID N°: 82); D-IB1(s17) (NH2-PFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID N°: 83); D-IB1(s18) (NH2-QPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID N°: 84); D-IB1(s19) (NH2-VQPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID N°: 85); D-IB1(s20) (NH2-PVQPFLNLTTP- COOH, SEQ ID N°: 86); D-IB1(s21) (NH2-RPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID N°: 87); D-IB1(s22) (NH2- SRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID N°: 88); D-IB1(s23) (NH2-QSRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID N°: 89); D- IB1(s24) (NH2-DQSRPVQPFLN-COOH, SEQ ID N°: 90); D-IB1(s25) (NH2-DQSRPVQPFL-COOH, SEQ ID N°: 91); D-IB1(s26) (NH2-QSRPVQPFLN-COOH, SEQ ID N°: 92); D-IB1(s27) (NH2-SRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID N°: 93); D-IB1(s28) (NH2-RPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID N°: 94); D-IB1(s29) (NH2-PVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID N°: 95); D-IB1(s30) (NH2-VQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID N°: 96); D-IB1(s31) (NH2-QPFLNLTTPR-

COOH, SEQ ID N°: 97); D-IB1(s32) (NH2-PFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID N°: 98); D-IB1(s33) (NH2- FLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID N°: 99); y D-IB1(s34) (NH2-LNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID N°: 100).

Los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf se muestran en la Tabla 1 (SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100). La tabla muestra el nombre de los (poli)peptidos/secuencias inhibidores de JNK tal 5 como se dan a conocer aquf, asf como sus numeros de identificacion de secuencia, su longitud y la secuencia de aminoacidos. Ademas, la Tabla 1 muestra secuencias y sus formulas genericas, por ejemplo para las SEQ ID N°: 1, 2, 5, 6, 9 y 11 y las SEQ ID N°: 3, 4, 7, 8, 10 y 12, respectivamente. La Tabla presenta ademas las secuencias quimericas sEq ID N°: 9-12 y 23-32 (vease mas abajo), las secuencias L-IB1 SEQ ID N°: 33 a 66 y las secuencias D-IB1 SEQ ID N°: 67 a 100.

Nombre de peptido/secue: SEQ ID NO AAS< scusncia Tab|a 1

L-IB1 (s): 1 19 RPKRPTTLNLFPQVPRSQD (NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)

D-IB1(s}: 2 19 DGSRPVQPFLNLTTPRKPR (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH)

L-IB (generic} (s): 3 19 NH2-Xnb- RPTTLXLXXXXXXXQD-Xna-Xnb-COOH

D-IB (generic) (s): 4 19 NH2-Xnb-Xna-DGXXXXXXXLXLTTPR-Xnb-COOH

L-TAT: 5 10 GRKKRRQRRR (NH2-GRKKRRQRRR-COOH)

D-TAT: 6 10 RRRGRRKKRG (NH2-RRRQRRKKRG-COOH)

L-generic-TAT (s): 7 11 NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH

D-generic-TAT (s): a 11 NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH

L-TAT-IB1 (s): 9 31 GRKKIRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPGVPRSGD (NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-C00H)

L-TAT-IB (generic) (s): 10 29 NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb -RPTTLXLXXXXXXXQD-Xna-Xnb-COOFi

D-TAT-IBI(s): 11 31 DGSRPVGPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG (NH2-DQSRPVGPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH)

D-TAT-IB (generic) (s): 12 29 NH2-Xnb-Xna-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH

IB1-long: 13 29 PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT {NH2-PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT-C00H)

IB2-leng: 14 27 IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS (NH2-IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS-COOH)

c-Jun: 15 29 GAYGYSNPKILKGSMTLNLADPVGNLKPH (NH2-GAYGYSNPKILKGSMTLNLADPVGNLKPH-COOH)

ATF2: 16 29 TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV {NH2-TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV-COOFI}

L-IB1: 17 23 □TYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(NH2-DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT-COOH)

D-IB1: 18 23 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD (NH2-TDQSRPVGPFLNLTTPRKPRYTD-COOH)

L-IB (generic): 19 19 XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX (NH2-XRPTTLXLXXXXXXXQDS7TX-COOH)

D-IB (generic): 20 19 XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX (NH2-XS/TDGXXXXXXXLXLTTPRX-COOH)

L-generic-TAT: 21 17 XXXX RKKRR Q R R RXXXX (N H2- XXXX RKKR RQ R R RXXXX- CO 0 H)

D-generic-TAT: 22 17 XXXXRRRQRRKKRXXXX (NH2-XXXXRRRQRRKKRXXXX-COOH)

L-TAT-IB 1: 23 35 GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPCVPRSCDT (NH2-GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPQVPRaQDT- COOH)

Nombre peptido/secuencia: SEQ ID NO AA Secuencia Tabla 1 cont.

L-TAT-IB (generic): 24 42 XXXXXXXRKKRRGRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXGDS/TX (NHrXXXXXXXRKKRRGRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXGDS/TX-GOOH)

D-TAT-IB1: 25 35 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG (nh2-tdqsrpvqpflnlttprkprytdpprrrqrrkkrg- COOH)

D-TAT-IB (generic): 26 42 XT/ s dqxxxxxxx lxltt p rxxxxxxxx r r rg rr k k RXXXXXXX ((nh2-xt/sDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX -COOH)

L-TAT-IB1(s1): 27 30 RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (NH2-RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)

L-TAT-IB1(s2): 28 30 GRKKRRQRRRXncRPKRPTTLNLFPQVPRSGD (NH2-GRKKRRQRRRXncRPKRPTTLNLIFPQVPRSQD-COOH)

L-TAT-IB1(s3): 29 29 RKKRRGRRRXpTRPKRPTTLNLFPGVPRSGD (NH2-RKKRRQRRRXncIRPKRPTTLNLFPGVPRSGD-COOH)

D-TAT-IB1(s1): 30 30 DGSRPVGPFLNLTTPRKPRPPRRRGRRKKR (NH2-DGSRPVGPFLNLTTPRKPRPPRRRGRRKKR-G00H)

D-TAT-IB 1(s2): 31 30 DGSRPVGPFLNLTTPRKPRX^RRRGRRKKRG (NH2-DGSRPVQPFLNLTTPRKPRXncRRRQRRKKRG-COOH)

D-TAT-IB1(s3): 32 29 DGSRPVQPFLNLTTPRKPRXncRRRQRRKKR (NHj-DQSRPVGPFLNLTTPRKPRX^RRRQRRKKR-GOOH)

L-IB1 (si): 33 13 TLNLFPQVPRSQD (NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH)

L-IB1(s2): 34 13 TTLNLFPGVPRSG(NH2-TTLNLFPGVPRSG-CG0H)

L-IB1(s3): 35 13 PTTLNLFPGVPRS (NH2-PTTLNLFPGVPRS-GOOH)

L- IB 1 (s4): 36 13 RPTTLNLFPQVPR (NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH)

L-IB1(s5): 37 13 KRPTTLNLFPQVP (NH^KRPTTLNLFPQVP-COOH)

L- IB1(s6}: 38 13 PKRPTTLNLFPQV (NH^PKRPTTLNLFPQV-COOFI}

L-IB1(s7): 39 13 RPKRPTTLNLFPG (NH2-RPKRPTTLNLFPG-G00H)

L- IB1(s8): 40 12 LNLFPQVPRSQD (NH^LNLFPQVPRSQD-COOH)

L- IB 1 (s9): 41 12 TLNLFPQVPRSQ (NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH)

L-IB1 (s10): 42 12 TTLNLFPGVPRS (NH2-TTLNLFPGVPRS-COOH)

L- IB 1 (s 11): 43 12 PTTLNLFPQVPR (NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH)

L-IB1 (s12): 44 12 RPTTLNLFPGVP (NH2-RPTTLNLFPGVP-COOH)

L- IB 1 (s 13): 45 12 KRPTTLNLFPQV(NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH)

Nombre peptido/secuencia: SEQ ID NO AA Secuencia Tabla 1 cont.

L-IB1<s14): 46 12 PKRPTTLNLFPG (NH2-PKRPTTLNLFPG-COOH)

L-IB1<s15): 47 12 RPKRPTTLNUFP {NH2-RPKRPTTLNLFP-COQH)

L-IB1<s16): 46 11 NLFPQVPRSQD {NH2-NLFPQVPRSQD-COOH)

L-IB1{s17): 49 11 LNLFPGVPRSG (NH2-LNLFPGVPRSG-COOH)

L- IB1{s18): 50 11 TLNLFPQVPRS {NH2-TLNLFPQVPRS-COOH}

L-IB1<s19): 51 11 TTLNLFPGVPR (NH2-TTLNLFPGVPR-COOH)

l_- IB1{s20): 52 11 PTTLNUFPQVP (NH2-PTTLNLFPQVP-COOH)

L-IB1(s21): 53 11 RPTTLNLFPQV (NH2-RPTTLNLFPGV-COOH}

L-IB 1 (s22): 54 11 KRPTTLNLFPQ (NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH}

L- IB1{s23}: 55 11 PKRPTTLNLFP (NH2-PKRPTTLNLFP-COOH)

L-IB1(s24): 56 11 RPKRPTTLNLF (NH2-RPKRPTTLNLF-COOH)

L- IB1{s25}: 57 10 LFPQVPRSQD (NH2-LFPQVPRSQD-COOH)

L-IB1(s26): 58 10 NLFPQVPRSQ (NH2-NLFPQVPRSQ-COOH)

L-IB1{s27): 59 10 LNLFPQVPRS (NH2-LNLFPQVPRS-COOH)

L-IB1{s28): 60 10 TLNLFPGVPR (NH2-TLNLFPQVPR-GOOH)

L-IB1(s29}: 61 10 TTLNLFPQVP (NH2-TTLNLFPQVP-COOH)

L-IB1{s30): 62 10 PTTLNLFPGV (NH2-PTTLNLFPGV-COOH)

L- IB1{s31): 63 10 RPTTLNLFPQ (NH2-RPTTLNLFPQ-COOH)

L-IB1{s32): 64 10 KRPTTLNLFP (NH2-KRPTTLNLFP-GOOH)

L- IB1{s33): 65 10 PKRPTTLNLF (NH^PKRPTTLNLF-COOH )

L-IB1 (s34): 66 10 RPKRPTTLNL (NH2-RPKRPTTLNL-COOH)

D-l B1(s1): 67 13 GPFLNLTTPRKPR (NH2-GPFLNLTTPRKPR-COOH)

D-IB1(s2): 68 13 VQPFLNLTTPRKP {NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH}

D-IB1 (s3): 69 13 PVQPFLNLTTPRK (NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH)

Nombre peptido/secuencia: SEQ ID NO AA Secuencia Tabla 1 cont.

D-l B1 (s4): 70 13 RPVQPFLNLTTPR (NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH)

D-IB1{s5}: 71 13 SRPVQPFLNLTTP {NHrSRPVQPFLNLTTP-COOH}

D-IB1{s6}: 72 13 QSRPVQPFLNLTT (NH2-QS RPVQPFLNLTT-COOH)

D-l B1 (s7>: 73 13 DGSRPVQPFLNLT {NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH)

D-IB1(s8): 74 12 PFLNLTTPRKPR (NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH)

D-l B1 (s9): 75 12 GPFLNLTTPRKP (NH2-GPFLNLTTPRKP-GOOH)

D-IB1(s10): 76 12 VQPFLNLTTPRK{NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH)

D-l B1 (s 11): 77 12 PVQPFLNLTTPR (NH2-PVGPFLNLTTPR-COOH)

D-IB1 (s12): 78 12 RPVGPFLNLTTP (NH2-RPVGPFLNLTTP-COOH}

0-IB1(s13): 79 12 SRPVQPFLNLTT(NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH)

D-l B1 (s 14): 80 12 QSRPVQPFLNLT (NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH)

D-IB1{s15): 81 12 □QSRPVQPFLNL (NH^DQSRPVQPFLNL-COOH)

D-IB1 (s16): 82 11 FLNLTTPRKPR (NH2-FLNLTTPRKPR-COOH)

D-l B1(s17): 83 11 PFLNLTTPRKP (NH2-PFLNLTTPRKP-COOH)

D-l B1(s18): 84 11 GPFLNLTTPRK (NH2-GPFLNLTTPRK-CCX)H)

D-IB1 (s19): 85 11 VGPFLNLTTPR (NH2-VQPFLNLTTPR-COOH)

D-l B1 (s2Q): 86 11 PVGPFLNLTTP {NH2-PVGPFLNLTTP-COOH)

0-IB1(s21): 87 11 RPVQPFLNLTT (NH2-RPVQPFLNLTT-COOH)

D-l B1(s22): 88 11 SRPVGPFLNLT (NH2-SRPVQPFLNLT-COOH)

□ -IB 1 (s23): 89 11 QSRPVQPFLNL {NH2-QSRPVQPFLNL-COOH}

0-IB1{s24): 90 11 □QSRPVQPFLN (NH2-DQSRPVQPFLN-COOH)

D-l B1 (s25): 91 10 DQSRPVQPFL (NH2-DQSRPVQPFL-COOH)

D-IB1(s26): 92 10 QSRPVQPFLN (NH2-QSRPVQPFLN-COQH)

D-IB1 (s27): 93 10 SRPVQPFLNL (NH2-SRPVQPFLNL-COOH)

Nombre peptido/secuencia: SEQ ID NO AA Secuencia Tabla 1 cont.

D-IB1{s28): 94 10 RPVGPFLNLT (NHj-RPVGPFLNLT-COOH)

D-IB1{s29): 95 10 PVQPFLNLTT (NHz-PVQPFLNLTT-COOH}

D-IB1{s30): 96 10 VQPFLNLTTP (NH2-VQPFLNLTTP-COOH)

D-l B1{s31): 97 10 GPFLNLTTPR (NH2-QPFLNLTTPR-COOH)

D-IB1{s32): 98 10 PFLNLTTPRK {NH2-PFLNLTTPRK-COOH}

D-IB1{s33): 99 10 FLNLTTPRKP {NH2-FLNLTTPRKP-COOH)

D-IB1{s34): 100 10 LNLTTPRKPR (NH2-LNLTTPRKPR-COOH)

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Los especialistas en la tecnica entenderan que una secuencia aquf indicada que esta compuesta exclusivamente por D-aminoacidos esta identificada por el "nombre D". Por ejemplo, la SEQ ID N°: 100 tiene el nombre de secuencia/peptido "D-IB1 (s34)". La secuencia de aminoacidos dada es LNLTTPRKPR. No obstante, todos los aminoacidos son aquf D-aminoacidos.

Los especialistas en la tecnica tambien entenderan que las expresiones "compuesto totalmente por L- aminoacidos"; "compuesto exclusivamente por D-aminoacidos"; "compuesto totalmente por D-aminoacidos" y/o "compuesto exclusivamente por D-aminoacidos" y similares se refieren a secuencias que no han de excluir forzosamente (pero pueden excluir) la presencia de residuos de glicina. La glicina es el unico aminoacido que no es quiral. Por ello, las expresiones "compuesto totalmente por L-aminoacidos"; "compuesto exclusivamente por D-aminoacidos"; "compuesto totalmente por D-aminoacidos" y/o "compuesto exclusivamente por D-aminoacidos" tienen el objetivo de aclarar que donde sea posible se utilizan L- aminoacidos o D-aminoacidos, respectivamente. No obstante, si la presencia de una glicina es necesaria o preferible en una posicion dada de la secuencia de aminoacidos, puede permanecer en dicha posicion. Un buen ejemplo es L-TAT (SEQ ID N°: 5). Dicha secuencia se considera aquf como compuesta exclusivamente por L-aminoacidos, "aunque" dicha secuencia comprende un residuo de glicina no quiral. Del mismo modo, D- TAT (SEQ ID N°: 6) se puede considerar aquf como compuesto exclusivamente por D-aminoacidos, "aunque" dicha secuencia comprende un residuo de glicina no quiral.

Preferentemente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf comprende o consiste en al menos una variante, fragmento y/o derivado de las secuencias de aminoacidos nativas o no nativas arriba definidas de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100. Preferentemente, estas variantes, fragmentos y/o derivados conservan actividad biologica de los (poli)peptidos inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf nativos o no nativos arriba indicados, en particular de secuencias de aminoacidos nativas o no nativas de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100, es decir, uniendo JNK y/o inhibiendo la activacion de al menos un factor de transcripcion activado por JNK, por ejemplo c-Jun, ATF2 o EIk1. La funcionalidad se puede analizar mediante diversos ensayos, por ejemplo ensayos de union del peptido a su molecula diana o mediante metodos biologicos, por ejemplo espectroscopfa, modelizacion informatica, analisis estructural, etc. En particular, un (poli)peptido inhibidor de JNK o variantes, fragmentos y/o derivados del mismo tal como se definen mas arriba se pueden analizar mediante analisis de hidrofilia (vease, por ejemplo, Hopp y Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 3824-3828), que puede emplearse para identificar las regiones hidrofobas e hidrofilas de los peptidos, ayudando asf en el diseno de sustratos para manipulacion experimental, como en experimentos de union, o para sfntesis de anticuerpos. Tambien es posible llevar a cabo un analisis estructural para identificar regiones de un (poli)peptido inhibidor de JNK o de variantes, fragmentos y/o derivados del mismo tal como se dan a conocer aquf, que adoptan motivos estructurales especfficos (vease, por ejemplo, Chou y Fasman, 1974, Biochem 13: 222-223). La manipulacion, la traduccion, la prediccion de estructura secundaria, los perfiles hidrofilos e hidrofobos, la prediccion y representacion grafica de marcos de lectura abiertos y la determinacion de homologfas de secuencia se pueden llevar a cabo utilizando programas de software de ordenador disponibles en la tecnica. Otros metodos de analisis estructural incluyen, por ejemplo, cristalograffa de rayos X (vease, por ejemplo, Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11: 7-13), espectroscopfa de masas y cromatograffa de gases (vease, por ejemplo, METHODS IN PROTEIN SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY) y modelizacion informatica (vease, por ejemplo, Fletterick y Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, En: CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIoLoGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y tambien pueden ser empleados.

Por consiguiente, el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf puede comprender o consistir en al menos una variante de secuencias de aminoacidos (nativas o no nativas) de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100. En el contexto de la presente descripcion que comprende la presente invencion, una "variante de una secuencia de aminoacidos (nativa o no nativa) de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100" consiste preferentemente en una secuencia derivada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100, comprendiendo la variante alteraciones de aminoacidos de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100. Estas alteraciones comprenden normalmente de 1 a 20, preferentemente de 1 a 10 y de forma especialmente preferente de 1 a 5 sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID N°: 1 - 4, 13-20 y 33-100, presentando la variante una identidad de secuencia con cualquier de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100 de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o incluso al menos aproximadamente un 99%.

Si las variantes de secuencias de aminoacidos (nativas y no nativas) de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 1320 y 33-100 tal como se definen mas arriba se obtienen mediante sustitucion de aminoacidos especfficos, dichas sustituciones comprenden preferentemente sustituciones de aminoacidos conservativas. Las sustituciones de aminoacidos conservativas pueden incluir residuos aminoacidos sinonimos con un grupo que tiene propiedades fisicoqufmicas suficientemente similares, de modo que una sustitucion entre miembros del

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grupo conservara la actividad biologica de la molecula (vease, por ejemplo, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864). Para los especialistas es evidente que tambien es posible realizar inserciones y/o deleciones de aminoacidos en las secuencias arriba definidas sin alterar su funcion, en particular si las inserciones y/o deleciones solo implican unos pocos aminoacidos, por ejemplo menos de veinte, preferentemente menos de diez, y no eliminan ni desplazan aminoacidos que son crfticos para la actividad funcional. Ademas, en las variantes dadas a conocer aquf se han de evitar las sustituciones que conducen a treoninas adicionales en posiciones de aminoacidos que son accesibles para una fosforilasa, preferentemente una quinasa, con el fin de evitar la inactivacion del (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf o del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf in vivo o in vitro.

En la Tabla 2 se definen residuos aminoacidos sinonimos preferentes que estan clasificados en los mismos grupos y son normalmente intercambiables mediante sustituciones de aminoacidos conservativas.

TABLA 2

Grupos preferentes de residuos aminoacidos sinonimos

Aminoacido__________________________Residuo sinonimo

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Una forma especffica de una variante de las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100 tal como se dan a conocer aquf es un fragmento de las secuencias de aminoacidos (nativas o no nativas) de acuerdo con las SEQ ID N°: 1, 1-4, 13-20 y 33-100" tal como se dan a conocer aquf, que normalmente esta alterado por al menos una delecion en comparacion con las SEQ ID N° 1-4, 13-20 y 33-100. Preferentemente, un fragmento comprende al menos 4 aminoacidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100, una longitud normalmente suficiente para permitir un reconocimiento especffico de un epftopo de cualquiera de dichas secuencias. De forma especialmente preferente, el fragmento comprende de 4 a 18, de 4 a 15, o de forma totalmente preferente de 4 a 10 aminoacidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100, pudiendo ser el lfmite inferior del intervalo 4, o 5, 6, 7, 8, 9, o 10. En cualquier posicion de las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100, preferentemente en los extremos N-terminales o C-terminales se pueden producir deleciones de aminoacidos.

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Ademas, un fragmento de las secuencias de aminoacidos (nativas o no nativas) de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100, tal como se describe mas arriba, se puede definir como una secuencia que comparte una identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33100 tal como se dan a conocer aquf de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o incluso 99%.

Ademas, los (poli)peptidos/secuencias inhibidoras de JNK tal como se dan a conocer aquf pueden comprender o consistir en al menos un derivado de secuencias de aminoacidos (nativas o no nativas) de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100 tal como se definen mas arriba. En este contexto, un "derivado de una secuencia de aminoacidos (nativa o no nativa) de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100" es preferentemente una secuencia de aminoacidos derivada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100, comprendiendo el derivado al menos un L-aminoacido o D- aminoacido modificado (que forma aminoacido(s) no natural(es)), preferentemente de 1 a 20, de forma especialmente preferente de 1 a 10 y de forma incluso mas preferente de 1 a 5 L-aminoacidos o D- aminoacidos. Los derivados de variantes o fragmentos tambien entran dentro del alcance de la presente invencion.

A este respecto, "un aminoacido modificado" puede ser cualquier aminoacido alterado por ejemplo por glicosilacion diferente en diversos organismos, por fosforilacion o por marcado de aminoacidos especfficos. Dicho marcador se selecciona normalmente entre el grupo de marcadores que comprende:

(i) marcadores radiactivos, es decir, fosforilacion radiactiva o un marcador radiactivo con azufre, hidrogeno, carbono, nitrogeno, etc.;

(ii) tintes colorantes (por ejemplo digoxigenina, etc.);

(iii) grupos fluorescentes (por ejemplo fluorescefna, etc.);

(iv) grupos quimioluminiscentes;

(v) grupos para inmovilizacion sobre una fase solida (por ejemplo His-tag, biotina, strep-tag (etiqueta de fusion), flag-tag, anticuerpos, antfgenos, etc.); y

(vi) una combinacion de dos o mas marcadores mencionados en los puntos (i) a (v).

En este contexto, cuando se indica que una secuencia de aminoacidos tiene una secuencia "que comparte una identidad de secuencia" de al menos, por ejemplo, un 95% con una secuencia de aminoacidos objetivo de la presente invencion, significa que la secuencia de la secuencia de aminoacidos en cuestion es identica a la secuencia objetivo excepto porque la secuencia de aminoacidos en cuestion puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoacidos por cada 100 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos objetivo. Dicho de otro modo, para obtener una secuencia de aminoacidos con una secuencia que presenta al menos una identidad de un 95% con una secuencia de aminoacidos objetivo, hasta un 5% (5 de 100) de los residuos aminoacidos de la secuencia en cuestion pueden ser insertados o sustituidos por otros aminoacidos o pueden ser eliminados.

Para secuencias sin una correspondencia exacta se puede determinar un "% de identidad" de una primera secuencia con respecto a una segunda secuencia. En general, ambas secuencias se pueden comparar y alinear para obtener una correlacion maxima entre ellas. Esto puede incluir la insercion de "huecos" en cualquiera de las dos secuencias o en ambas para aumentar el grado de alineacion. Despues se puede determinar un % de identidad en toda la longitud de cada una de las secuencias comparadas (lo que se denomina alineacion global), que es particularmente adecuado para secuencias con una longitud igual o similar, o en longitudes definidas mas cortas (lo que se denomina alineacion local), que es mas adecuado para secuencias con longitudes desiguales.

En la tecnica son bien conocidos metodos para comparar la identidad y homologfa de dos o mas secuencias, en particular tal como se utilizan aquf. Por ejemplo, para determinar el % de identidad entre dos polinucleotidos y el % de identidad y el % de homologfa entre dos secuencias de polipeptidos se pueden utilizar programas disponibles del Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux y col., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP. El programa BESTFIT utiliza el algoritmo de "homologfa local" (Smith y Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197) y encuentra la mejor region simple de similitud entre dos secuencias. En la tecnica tambien se conocen otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias, por ejemplo la familia de programas BLAST (Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410), accesible a traves de la pagina principal de la NCBI en el sitio web ncbi.nlm.nih.gov), y FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.).

Los (poli)peptidos/secuencias inhibidores de JNK tal como se dan a conocer aquf y se definen mas arriba se pueden obtener o producir mediante metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo por sfntesis qufmica o por metodos de ingenierfa genetica tal como se describe mas abajo. Por ejemplo, un peptido

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correspondiente a una parte de una secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquf que incluye una region deseada de dicha secuencia inhibidora de JNK, o que media en la actividad deseada in vitro o in vivo, se puede sintetizar empleando un sintetizador de peptidos.

El (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf y se define mas arriba se puede modificar ademas mediante un (poli)peptido de trafico, que permite transportar efectivamente el (poli)peptido inhibidor de JNK tal como se da a conocer aquf y se define mas arriba al interior de las celulas. Estos (poli)peptidos inhibidores de JNK modificados se proporcionan y utilizan preferentemente como (poli)peptidos quimericos.

Por consiguiente, de acuerdo con un segundo aspecto, la presente descripcion que comprende la presente invencion proporciona el uso de un (poli)peptido quimerico que incluye al menos un primer dominio y al menos un segundo dominio para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas en un sujeto, comprendiendo el primer dominio del peptido quimerico una secuencia de trafico, mientras que el segundo dominio del (poli)peptido quimerico comprende una secuencia inhibidora de JNK tal como se define mas arriba, preferentemente cualquiera de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-4, 13-20 y 33-100 o un derivado o fragmento de las mismas.

Normalmente, los (poli)peptidos quimericos utilizados de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion tienen una longitud de al menos 25 residuos aminoacidos, por ejemplo de 25 a 250 residuos, de forma especialmente preferente de 25 a 200 residuos, de forma particularmente preferente de 25 a 150 residuos, de 25 a 100 y de forma totalmente preferente de de 25 a 50 residuos aminoacidos.

Como un primer dominio, el (poli)peptido quimerico tal como se da a conocer aquf comprende preferentemente una secuencia de trafico que se selecciona normalmente entre cualquier secuencia de aminoacidos que dirija un peptido (en el que esta presente) a un destino celular deseado. Por tanto, la secuencia de trafico, tal como se da a conocer aquf, dirige normalmente el peptido a traves de la membrana plasmatica, por ejemplo desde el exterior de la celula, a traves de la membrana plasmatica y al interior del citoplasma. Alternativa o adicionalmente, la secuencia de trafico puede dirigir el peptido a un lugar deseado dentro de la celula, por ejemplo al nucleo, ribosoma, retfculo endoplasmatico (RE), a un lisosoma o peroxisoma, por ejemplo combinando dos componentes (por ejemplo un componente para la permeabilidad celular y un componente para la localizacion nuclear), o mediante un solo componente que tiene, por ejemplo, propiedades de transporte a traves de membrana celular y transporte dirigido, por ejemplo intranuclear. La secuencia de trafico puede comprender adicionalmente otro componente que se puede unir a un componente citoplasmatico o cualquier otro componente o compartimento celular (por ejemplo retfculo endoplasmatico, mitocondria, aparato de Golgi, vesfculas lisosomales). Por consiguiente, por ejemplo la secuencia de trafico del primer dominio y la secuencia inhibidora de JNK del segundo dominio pueden estar localizadas en el citoplasma o en cualquier otro compartimento celular. Esto permite determinar la localizacion del peptido quimerico en la celula despues de su absorcion.

Preferentemente, la secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf) tiene una longitud de 5 a 150 secuencias de aminoacidos, de forma especialmente preferente una longitud de 5 a 100 y de forma totalmente preferente una longitud de 5 a 50, 5 a 30 o incluso 5 a 15 aminoacidos.

De forma especialmente preferente, la secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf) puede consistir en una extension de secuencia de aminoacidos continua en el primer dominio. Alternativamente, la secuencia de trafico en el primer dominio puede estar dividida en dos o mas fragmentos, pareciendose todos estos fragmentos a la secuencia de trafico completa y pudiendo estar los mismos separados entre sf por 1 a 10, preferentemente 1 a 5 aminoacidos, con la condicion de que la secuencia de trafico como tal conserve sus propiedades de soporte tal como se da a conocer mas arriba. Estos aminoacidos que separan los fragmentos de la secuencia de trafico se pueden seleccionar, por ejemplo, entre secuencias de aminoacidos que difieren de la secuencia de trafico. Alternativamente, el primer dominio puede contener una secuencia de trafico compuesta por mas de un componente, cada componente con su propia funcion para el transporte de la secuencia inhibidora de JNK de carga del segundo dominio, por ejemplo a un compartimento celular especffico.

La secuencia de trafico tal como se define mas arriba puede estar compuesta por L-aminoacidos, D- aminoacidos o una combinacion de ambos. Preferentemente, las secuencias de trafico (incluidas en el primer domino del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf) pueden comprender al menos 1 o incluso 2, preferentemente al menos 3, 4 o 5, de forma especialmente preferente al menos 6, 7, 8 o 9 y de forma particularmente preferente al menos 10 o mas D-aminoacidos y/o L-aminoacidos, pudiendo estar dispuestos los D-aminoacidos y/o L-aminoacidos en las secuencias de trafico de JNK en forma de bloques, no en forma de bloques o de un modo alternado.

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De acuerdo con una realizacion no reivindicada, la secuencia de trafico del (poli)peptido quimerico tal como se da a conocer aquf puede estar compuesta exclusivamente por L-aminoacidos. De este modo, es preferible que la secuencia de trafico del peptido quimerico no reivindicado tal como se da a conocer aquf comprenda o consista en al menos una secuencia de trafico "nativa" tal como se define mas arriba. En este contexto, el termino "nativa" se refiere a secuencias de trafico no alteradas compuestas totalmente por L-aminoacidos.

De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, la secuencia de trafico del (poli)peptido quimerico tal como se utiliza aquf puede estar compuesta exclusivamente por D-aminoacidos. De forma especialmente preferente, la secuencia de trafico del (poli)peptido quimerico tal como se utiliza aquf puede comprender un peptido retroinverso de las secuencias arriba mostradas.

La secuencia de trafico del primer dominio del (poli)peptido quimerico tal como se utiliza aquf puede obtener de fuentes naturales o se puede producir utilizando tecnicas de ingenierfa genetica o sfntesis qufmica (vease, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2a edicion. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Es posible utilizar fuentes para la secuencia de trafico del primer dominio, incluyendo, por ejemplo, protefnas nativas tales como protefna TAT (descrita, por ejemplo, en las Patentes US N° 5.804.604 y 5.674.980, estando cada una de estas referencias incorporada aquf por referencia), VP22 (descrita, por ejemplo, en el documento WO 97/05265; Elliott y O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), protefnas no virales (Jackson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)), secuencias de trafico derivadas de Antenapedia (por ejemplo secuencia portadora de antenapedia) o de peptidos basicos, por ejemplo peptidos con una longitud de 5 a 15 aminoacidos, preferentemente 10 a 12 aminoacidos, que comprenden al menos un 80%, de forma especialmente preferente un 85% o incluso un 90% de aminoacidos basicos, por ejemplo arginina, lisina y/o histidina. Ademas, aquf se dan a conocer variantes, fragmentos y derivados de una de las protefnas nativas utilizadas como secuencias de trafico. En relacion con las variantes, fragmentos y derivados se remite a la definicion arriba proporcionada para las secuencias inhibidoras de JNK tal como se dan a conocer aquf. Las variantes fragmentos y derivados se definen correspondientemente tal como se expone mas arriba en relacion con las secuencias inhibidoras de JNK tal como se dan a conocer aquf. En particular, en el contexto de la secuencia de trafico, una variante, fragmento o derivado se puede definir como una secuencia que comparte una identidad de secuencia con una de las protefnas nativas utilizadas como secuencias de trafico tal como se define mas arriba de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o incluso un 99%.

En el (poli)peptido quimerico de acuerdo con la presente invencion tal como se define mas arriba, la secuencia de trafico del primer dominio comprende o consiste en una secuencia derivada de la protefna TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)1, en particular algunos de los 86 aminoacidos que componen la protefna TAT o todos ellos.

Para una secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf) se pueden utilizar secuencias parciales de la protefna TAT de longitud completa que forman un fragmento funcionalmente efectivo de una protefna TAT, es decir, un peptido TAT que incluye la region que media en la entrada y absorcion dentro de las celulas. Si una secuencia de este tipo es un fragmento funcionalmente efectivo de la protefna TAT se puede determinar utilizando tecnicas conocidas (vease, por ejemplo, Franked y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 7397-7401 (1989)). Por tanto, la secuencia de trafico en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf se puede derivar de un fragmento o porcion funcionalmente efectiva de una secuencia de protefna Tat que comprende menos de 86 aminoacidos y que muestra una absorcion al interior de las celulas, y opcionalmente una absorcion al interior del nucleo celular. De forma especialmente preferente, esta previsto que las secuencias parciales (fragmentos) de TAT a utilizar como portador para mediar en la penetracion del peptido quimerico a traves de la membrana celular comprendan la region basica (aminoacidos 48 a 57 o 49 a 57) de la TAT de longitud completa.

Preferentemente, la secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoacidos que contiene los residuos TAT 48-57 o 49 a 57, y de forma especialmente preferente una secuencia TAT generica NH2-Xnb- RKKRRQRRR- Xnb-COOH (L-generico-TAT (s)) [SEQ ID N°: 7] y/o XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L-generico-TAT) [SEQ ID N°: 21], teniendo X o Xnb el significado arriba definido. Ademas, la cantidad de residuos "Xnb" en la SEQ ID N°: 8 no esta limitada a la cantidad representada y puede variar tal como se describe mas arriba. Alternativamente, la secuencia de trafico incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf puede comprender o consistir en un peptido que contiene, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos NH2- GRKKRRQRRR-COOH (L-TAT) [SEQ ID N°: 5].

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De forma especialmente preferente, la secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf) puede comprender un peptido D retroinverso de las secuencias arriba presentadas, es decir, la secuencia D retroinversa de la secuencia TAT generica que presenta la secuencia NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH (D-generico-TAT (s)) [SEQ ID N°: 8] y/o

XXXXRRRQRRKKRXXXX (D-generico-TAT) [SEQ ID N°: 22]. Tambien aquf, Xnb es tal como se define mas arriba (representando preferentemente D-aminoacidos). Ademas, la cantidad de residuos "Xnb" en la SEQ ID N°: 8 no esta limitada a la cantidad representada y puede variar tal como se describe mas arriba. De forma especialmente preferente, la secuencia de trafico tal como se da a conocer aquf puede comprender la secuencia D retroinverso NH2-RRRQRRKKRG-COOH (D-TAT) [SEQ ID N°: 6].

Ademas, la secuencia de trafico incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf puede comprender o consistir en variantes de las secuencias de trafico tal como se definen mas arriba. Una "variante de una secuencia de trafico" consiste preferentemente en una secuencia derivada de una secuencia de trafico tal como se define mas arriba, comprendiendo la variante una modificacion, por ejemplo, adicion, delecion (interna) (que conduce a fragmentos) y/o sustitucion de al menos un aminoacido presente en la secuencia de trafico tal como se define mas arriba. Esta o estas modificaciones comprenden normalmente se 1 a 20, preferentemente de 1 a 10 y de forma especialmente preferente de 1 a 5 sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoacidos. Ademas, la variante preferentemente tiene una identidad de secuencia con la secuencia de trafico tal como se define mas arriba, de forma especialmente preferente con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 o 21-22, de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%,90%, 95%, 98% o incluso un 99%.

Preferentemente, tal modificacion de la secuencia de trafico incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf conduce a una secuencia de trafico con estabilidad aumentada o reducida. Alternativamente se pueden disenar variantes de la secuencia de trafico para modular la localizacion intracelular del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf. Cuando se anaden de forma exogena, estas variantes tal como se definen mas arriba se disenan normalmente de modo que conservan la capacidad de la secuencia de trafico para entrar en las celulas (es decir, la absorcion de la variante de la secuencia de trafico en el interior de la celula es esencialmente similar a la de una secuencia de trafico de protefna nativa). Por ejemplo, la alteracion de la region basica considerada importante para la localizacion nuclear (vease, por ejemplo, Dang y Lee, J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber y col., J. Virol. 63: 1181-1187 (1989); y col., J. Virol. 63: 1-8 (1989)) puede resultar en una localizacion citoplasmatica o una localizacion parcialmente citoplasmatica de la secuencia de trafico y, en consecuencia, de la secuencia inhibidora de JNK como componente del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf. Ademas de lo arriba indicado tambien se pueden introducir otras modificaciones en la variante, por ejemplo enlazando por ejemplo colesterol u otras fracciones lipfdicas con la secuencia de trafico para producir una secuencia de trafico con mayor solubilidad de membrana. Cualquiera de las variantes dadas a conocer mas arriba de las secuencias de trafico incluidas en el primer dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf se puede producir utilizando tecnicas normalmente conocidas por los especialistas (vease, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2a edicion. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Como un segundo dominio, el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf comprende normalmente una secuencia inhibidora de JNK seleccionada entre cualquiera de las secuencias inhibidoras de JNK tal como se definen mas arriba, incluyendo variantes, fragmentos y/o derivados de estas secuencias inhibidoras de JNK.

Los dos dominios, es decir, los primeros y segundos dominios del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf, pueden estar unidos formando una unidad funcional. En este contexto se puede aplicar cualquier metodo conocido generalmente en la tecnica para unir los primeros y segundos dominios.

Preferentemente, los primeros y segundos dominios del peptido quimerico tal como se utiliza aquf estan unidos por un enlace covalente. Un enlace covalente tal como se define aquf puede ser, por ejemplo, un enlace peptfdico, que se puede obtener expresando el peptido quimerico tal como se define mas arriba como una protefna de fusion. Las protefnas de fusion, tal como se describen aquf, se pueden formar y utilizar de formas analogas a tecnicas de ADN recombinante estandar o de formas facilmente adaptables a estas, tal como se describe mas abajo. No obstante, los dos dominios tambien pueden estar unidos a traves de cadenas laterales o por una fraccion de enlace qufmico.

El primer y/o el segundo dominio del peptido quimerico tal como se da a conocer aquf pueden estar presentes en una o mas copias en dicho peptido quimerico. Si los dos dominios estan presentes en una sola copia, el primer dominio puede estar unido al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del segundo dominio. Si estan presentes en multiples copias, los primeros y segundos dominios pueden estar dispuestos en cualquier orden posible. Por ejemplo, el primer dominio puede estar presente en el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf en una cantidad de multiples copias, por ejemplo en dos, tres o mas copias, que

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preferentemente estan dispuestas consecutivamente. Entonces, el segundo dominio puede estar presente en una sola copia presente en el extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia que comprende el primer dominio. Alternativamente, el segundo dominio puede estar presente en una cantidad de multiples copias, por ejemplo en dos, tres o mas copias, y el primer dominio puede estar presente en una sola copia. De acuerdo con las dos alternativas, los primeros y segundos dominios pueden ocupar cualquier lugar en una disposicion consecutiva. A continuacion se indican ejemplos de disposiciones: primer dominio - primer dominio - primer dominio - segundo dominio; primer dominio - primer dominio - segundo dominio - primer dominio; primer dominio - segundo dominio - primer dominio - primer dominio; o por ejemplo segundo dominio - primer dominio - primer dominio - primer dominio. Los especialistas entenderan que estos ejemplos solo tienen fines ilustrativos. Por consiguiente, la cantidad de copias y la disposicion pueden variar tal como se ha definido inicialmente.

Preferentemente, los primeros y segundos dominios pueden estar unidos directamente entre si sin ningun enlazante. Alternativamente pueden estar unidos entre si a traves de una secuencia de enlace que comprende de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5 aminoacidos. Los aminoacidos que forman la secuencia de enlace se seleccionan preferentemente entre glicina o prolina como residuos aminoacidos. De forma especialmente preferente, los primeros y segundos dominios pueden estar separados entre si por una bisagra de dos, tres o mas residuos de prolina entre los primeros y los segundos dominios.

El peptido quimerico tal como se define mas arriba y se da a conocer aquf, que comprende al primer un primer y al menos un segundo dominio, puede estar compuesto por L-aminoacidos, D-aminoacidos o una combinacion de ambos. Dentro del mismo, cada dominio (asf como los engarces utilizados) puede estar compuesto por L-aminoacidos, D-aminoacidos o una combinacion de ambos (por ejemplo D-TAT y L-IB1 (s) o L-TAT y D-IB1(s), etc.). Preferentemente, el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf puede comprender al menos 1 o incluso 2, preferiblemente al menos 3, 4 o 5, de forma especialmente preferente al menos 6, 7, 8 o 9, y de forma particularmente preferente al menos 10 o mas D-aminoacidos y/o L- aminoacidos, pudiendo estar dispuestos los D-aminoacidos y/o L-aminoacidos en el peptido quimerico tal como se utiliza aquf en forma de bloques, no en forma de bloques o de un modo alternado.

De acuerdo con una realizacion especffica no reivindicada, el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf comprende o consiste en los peptidos quimericos de L-aminoacidos de acuerdo con el peptido L-TAT-IB generico NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb -RPTTLXLXXXXXXXQD-Xna -Xnb-COOH (L-TAT-IB (generico) (s)) [SEQ ID N°: 10], teniendo X, Xna y Xnb preferiblemente el significado arriba definido. De este modo es preferible que el peptido quimerico no reivindicado tal como se da a conocer aquf comprenda o consista en el peptido quimerico de L-aminoacidos NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH (L-TAT-IB1 (s)) [SEQ ID N°: 9]. Alternativa o adicionalmente, el peptido quimerico no reivindicado tal como se da a conocer aquf comprende o consiste en la secuencia de peptido quimerico de L-aminoacidos GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT (L-TAT-IB1) [SEQ ID N°: 23], o XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX (L-TAT-IB generico) [SEQ ID N°: 24], teniendo X preferiblemente el significado arriba definido, o el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf comprende o consiste en la secuencia de peptido quimerico de L-aminoacidos no RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT- IB1(s1)) [SEQ ID N°: 27], GRKKRRQRRRXncRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s2)) [SEQ ID N°: 28], o RKKRRQRRRXncRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s3)) [SEQ ID N°: 29]. En este contexto, cada X representa normalmente un residuo aminoacido tal como se define mas arriba, de forma especialmente preferente Xnc representa una extension contigua de residuos peptfdicos, seleccionandose cada X independientemente entre sf entre glicina o prolina, por ejemplo una extension de glicina monotonica o una extension de prolina monotonica, siendo n (la cantidad de repeticiones de Xnc) normalmente de 0-5, 5-10, 1015, 15-20, 20-30 o incluso mas, preferentemente 0-5 o 5-10. Xnc puede representar D-aminoacidos o L- aminoacidos.

Alternativamente, el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf comprende o consiste en peptidos quimericos de D-aminoacidos de los peptidos quimericos de L-aminoacidos dados a conocer mas arriba. Peptidos quimericos D retroinversos de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion son el peptido D-TAT-1B generico NH2-Xnb-Xna-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb- COOH (D-TAT-IB (generico) (s)) [SEQ ID N°: 12]. Aquf, X, Xna y Xnb tienen preferentemente el significado arriba definido (preferiblemente representa D-aminoacidos). De forma especialmente preferente, el peptido quimerico de acuerdo con la presente invencion tal como se define mas arriba comprende o consiste en peptidos quimericos de D-aminoacidos de acuerdo con el peptido TAT-IB1 NH2- DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH (D-TAT-IB1(s)) [SEQ ID N°: 11]. Alternativa o adicionalmente, el peptido quimerico tal como se utiliza aquf comprende o consiste en la secuencia de peptido quimerico de D-aminoacidos TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1) [SEQ ID N°: 25]. Alternativa o adicionalmente, el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf comprende o consiste en la secuencia de peptido quimerico de D-aminoacidos XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX (D-TAT-IB generico) [SEQ ID N°: 26], en la

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que X tienen preferentemente el significado arriba definido, o el peptido quimerico tal como se utiliza aquf comprende o consiste en la secuencia de peptido quimerico de D-aminoacidos

DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s1)) [SEQ ID N°: 30],

DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXncRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1(s2)) [SEQ ID N°: 31], o

DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXncRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s3)) [SEQ ID N°: 32]. Xnc puede tener el significado arriba definido.

Los primeros y segundos dominios del peptido quimerico tal como se define mas arriba pueden estar unidos entre si mediante acoplamiento qufmico o bioqufmico llevado a cabo de cualquier forma adecuada conocida en la tecnica, por ejemplo estableciendo un enlace peptfdico entre los primeros y los segundos dominios, por ejemplo mediante expresion de los primeros y los segundos dominios como una protefna de fusion, o por ejemplo mediante reticulacion de los primeros y los segundos dominios del peptido quimerico tal como se define mas arriba.

Muchos metodos conocidos adecuados para la reticulacion qufmica de los primeros y los segundos dominios del peptido quimerico tal como se define mas arriba no son especfficos, es decir, no dirigen el punto de acoplamiento a ningun sitio particular en el polipeptido de transporte o macromolecula de carga. Como resultado, el uso de agentes de reticulacion no especfficos puede atacar sitios funcionales o sitios con actividad esterica de bloques, volviendo las protefnas conjugadas biologicamente inactivas. Por consiguiente, preferentemente se utilizan metodos de reticulacion que permiten un acoplamiento mas especffico de los primeros y los segundos dominios.

En este contexto, un modo de aumentar la especificidad de acoplamiento es un acoplamiento qufmico directo con un grupo funcional presente una sola vez o pocas veces en el primer dominio o en el segundo dominio a reticular, o en ambos. Por ejemplo, la cistefna, que es el unico aminoacido protefnico que contiene un grupo tiol, esta presente en muchas protefnas solo unas pocas veces. Ademas, por ejemplo, si un polipeptido no contiene ningun residuo lisina, un reactivo de reticulacion especffico para aminas primarias sera selectivo para el extremo amino de dicho polipeptido. La utilizacion con exito de este metodo para aumentar la especificidad de acoplamiento requiere que el polipeptido tenga adecuadamente residuos poco frecuentes y reactivos en areas de la molecula que pueden ser alteradas sin perdida de la actividad biologica de la molecula. Los residuos de cistefna se pueden sustituir cuando estan presentes en partes de una secuencia de polipeptido en las que, en otro caso, su participacion en una reaccion de reticulacion posiblemente interferirfa con la actividad biologica. Cuando se sustituye un residuo de cistefna, normalmente es deseable minimizar los cambios resultantes en el plegado del polipeptido. Los cambios en el plegado del peptido se minimizan cuando la sustitucion es qufmica y estericamente similar a la cistefna. Por estas razones, la cistefna se sustituye preferentemente por serina. Tal como se demuestra mas abajo en los ejemplos, en una secuencia de aminoacidos de polipeptido se puede introducir un residuo de cistefna con fines de reticulacion. Cuando se introduce un residuo de cistefna, es preferible una introduccion en el extremo amino o carboxilo o cerca del mismo. Existen metodos convencionales disponibles para estas modificaciones de secuencias de aminoacidos, produciendose el polipeptido de interes mediante sfntesis qufmica o por expresion de ADN recombinante.

El acoplamiento de los primeros y segundos dominios del peptido quimerico tal como se definen mas arriba y se dan a conocer aquf tambien se puede llevar a cabo mediante un agente de acoplamiento o conjugacion. Existen diversos reactivos de reticulacion intermolecular que pueden emplearse (vease, por ejemplo, Means y Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43). Entre estos reactivos se encuentran, por ejemplo, 3-(2-piridilditio) N-succinimidil propionato (SPDP) o N,N'-(1,3-fenilen)bismaleimida (ambos presentan una alta especificidad por grupos sulfhidrilo y forman enlaces irreversibles); N,N'-etilen- bis(yodoacetamida) u otro reactivo de este tipo que tenga de 6 a 11 puentes de carbono metileno (que son relativamente especfficos en relacion con los grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluor-2,4-dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con grupos amino y tirosina). Otros reactivos de reticulacion adecuados utiles para este fin incluyen: p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona (que forma reticulaciones irreversibles con grupos amino y fenolicos); adipimidato de dimetilo (que es especffico en relacion con los grupos amino); fenol- 1,4disulfonilcloruro (que reacciona principalmente con grupos amino); hexametilenodiisocianato o diisotiocianato, o azofenil-p-diisocianato (que reacciona principalmente con grupos amino); glutaraldehfdo (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y disdiazobencidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).

Los reactivos de reticulacion utilizados para reticular los primeros y los segundos dominios del peptido quimerico tal como se define mas arriba pueden ser homobifuncionales, es decir, pueden tener dos grupos funcionales que experimentan la misma reaccion. Un reactivo de reticulacion homobifuncional preferente es bismaleimidohexano ("BMH"). El BMH contiene dos grupos funcionales de maleimida que reaccionan especfficamente con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones suaves (pH 6,5-7,7). Los dos

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grupos maleimida estan unidos por una cadena hidrocarburo. Por tanto, el BMH es util para una reticulacion irreversible de polipeptidos que contienen residuos cistefna.

Los reactivos de reticulacion utilizados para reticular los primeros y los segundos dominios del peptido quimerico tal como se define mas arriba tambien pueden ser heterobifuncionales. Los agentes de reticulacion heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol, que reticularan dos protefnas que tienen aminas y tioles libres, respectivamente. Ejemplos de agentes de reticulacion heterobifuncionales son 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo ("SMCC"), el ester m-maleimidobenzofl-N-hidroxisuccinimida ("MBS") y 4-(p- maleimidofenil)butirato de succinimida ("SMPB"), una cadena extendida analoga de MBS. El grupo succinimidilo de estos reticulantes reacciona con una amina primaria, y la maleimida reactiva con tiol forma un enlace covalente con el tiol de un residuo cistefna.

Los reactivos de reticulacion adecuados para la reticulacion de los primeros y los segundos dominios del peptido quimerico tal como se definen mas arriba frecuentemente tienen una baja solubilidad en agua. Por tanto, se puede anadir una fraccion hidrofila, como un grupo sulfonato, al reactivo de reticulacion para aumentar su solubilidad en agua. A este respecto, el Sulfo-MBS y el Sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulacion modificados en cuanto a la solubilidad en agua que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invencion.

Del mismo modo, muchos reactivos de reticulacion producen un conjugado que es esencialmente no disociable bajo condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulacion particularmente adecuados para la reticulacion de los primeros y los segundos dominios del peptido quimerico tal como se define mas arriba incluyen un enlace covalente, como disulfuro, que es disociable bajo condiciones celulares. Por ejemplo el reactivo de Traut, ditiobis(succinimidil-propionato) ("DSP") y 3-(2-piridilditio)propionato de N- succinimidilo ("SPDP") son reticulantes disociables bien conocidos. El uso de un reactivo de reticulacion disociable permite que la fraccion de carga se separe del polipeptido de transporte despues de alcanzar el interior de la celula diana. Tambien puede resultar util un enlace directo disulfuro.

Numerosos reactivos de reticulacion, incluyendo los arriba descritos, son comerciales. Los proveedores comerciales facilitan las instrucciones detalladas para su uso. Una referencia general sobre la reticulacion de protefnas y la preparacion de conjugados es: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).

La reticulacion qufmica de los primeros y los segundos dominios del peptido quimerico tal como se define mas arriba puede incluir el uso de brazos espaciadores. Los brazos espaciadores proporcionan flexibilidad intramolecular o ajustan distancias intramoleculares entre fracciones conjugadas y, asf, pueden ayudar a conservar la actividad biologica. Un brazo espaciador puede ser una fraccion de polipeptido que incluye aminoacidos espaciadores, por ejemplo prolina. Alternativamente, un brazo espaciador puede formar parte del reactivo de reticulacion, como en "SPDP de cadena larga" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).

Ademas, es posible utilizar variantes, fragmentos o derivados de uno de los peptidos quimericos dados a conocer mas arriba. Con respecto a los fragmentos y variantes se remite en general a la definicion dada mas arriba de las secuencias inhibidoras de JNK.

En particular, en el contexto de la presente descripcion que comprende la presente invencion, una "variante de un peptido quimerico" preferentemente es una secuencia derivada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, comprendiendo las variantes quimericas alteraciones de aminoacidos de los peptidos quimericos de acuerdo con las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32 tal como se utilizan aquf. Estas alteraciones comprenden normalmente de 1 a 20, preferentemente de 1 a 10 y de forma especialmente preferente de 1 a 5 sustituciones, adiciones y/o deleciones (que conducen a fragmentos) de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, presentando el peptido quimerico alterado tal como se utiliza aquf una identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 9-12 y 23 a 32 de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, o un 95%, 98%, o incluso un 99%. Preferentemente, estas variantes conservan la actividad biologica del primer y el segundo dominio contenidos en el peptido quimerico tal como se utiliza aquf, es decir, la actividad de trafico del primer dominio tal como se da a conocer aquf y la actividad del segundo dominio para la union con JNK y/o la inhibicion de la activacion de al menos un factor de transcripcion activado por JNK.

Por consiguiente, el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf tambien comprende fragmentos de los peptidos quimericos dados a conocer mas arriba, en particular de las secuencias de peptidos quimericos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32. Asf, en el contexto de la presente descripcion que comprende la presente invencion, un "fragmento del peptido quimerico" preferentemente es una secuencia

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derivada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, comprendiendo el fragmento al menos 4 aminoacidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32. Este fragmento incluye preferentemente una longitud suficiente para posibilitar un reconocimiento especffico de un epftopo de cualquiera de dichas secuencias y transportar la secuencia al interior de las celulas, el nucleo u otro lugar preferente. De forma especialmente preferente, el fragmento comprende de 4 a 18, de 4 a 15, o de forma particularmente preferente de 4 a 10 aminoacidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32. Los fragmentos del peptido quimerico tal como se utiliza aquf se pueden definir ademas como una secuencia que comparte una identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 99 a 12 y 23 a 32 de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, o un 95%, 98%, o incluso un 99%.

Por ultimo, el peptido quimerico tal como se da a conocer aquf tambien comprende derivados de los peptidos quimericos dados a conocer mas arriba, en particular de las secuencias de peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32.

Un uso particularmente preferente de la presente invencion es el uso de un (poli)peptido inhibidor de JNK que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N°: 11, o que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90%, 92% o incluso un 95% con la SEQ ID N°: 11, para el tratamiento de la uveitis, por ejemplo para el tratamiento de la uveitis anterior, la uveitis intermedia, la uveitis posterior o la panuveftis. De acuerdo con la presente invencion, el (poli)peptido inhibidor de JNK que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N°: 11, o que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90%, 92% o incluso un 95% con la SEQ ID N°: 11 se puede administrar por ejemplo localmente en el ojo o sistemicamente. No obstante, la presente solicitud tambien describe claramente el uso de otros (poli)peptidos quimericos inhibidores de JNK, es decir, en los que el (poli)peptido inhibidor de JNK no comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N°: 11, para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias, en particular para el tratamiento de la uveitis, por ejemplo para el tratamiento de la uveitis anterior, la uveitis intermedia, la uveitis posterior o la panuveftis.

Ademas, la presente solicitud tambien describe claramente el uso de los (poli)peptidos inhibidores de JNK de la presente invencion, en particular en los que el (poli)peptido inhibidor de JNK utilizado comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N°: 11, o comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que comparte una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 92% o incluso un 95% con la SEQ ID N°: 11, para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias diferentes de la inflamacion de la uvea y/o la retina, por ejemplo para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias no consistentes en uveitis y/o retinitis. Ademas, se ha de senalar que la presente invencion no comprende en particular el tratamiento de la retinopatfa (no inflamatoria).

Ademas, la presente descripcion se refiere al uso de secuencias de acidos nucleicos que codifican secuencias inhibidoras de jNk tal como se definen mas arriba, peptidos quimericos o sus fragmentos, variantes o derivados tal como se definen mas arriba, para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas y no cronicas en un sujeto tal como se definen aquf. Un acido nucleico adecuado preferente que codifica de una secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquf se elige normalmente entre acido nucleico IB1 humano (N° de Acceso GenBank (AF074091), acido nucleico IB1 de rata (N° de Acceso GenBank AF 108959), o IB2 humano (N° de Acceso GenBank AF218778) o de cualquier secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de las secuencias tal como se definen mas arriba, es decir, cualquier secuencia de acuerdo con las SEQ ID N°: 1-26.

Los acidos nucleicos que codifican las secuencias inhibidoras de JNK tal como se utilizan aquf o peptidos quimericos tal como se utilizan aquf se pueden obtener por cualquier metodo conocido en la tecnica (por ejemplo amplificacion PCR utilizando cebadores sinteticos hibridables con los extremos 3' y 5' de la secuencia y/o mediante clonacion a partir de una biblioteca de ADNc o genomica utilizando una secuencia de oligonucleotidos especffica para la secuencia de genes dada).

Adicionalmente, aquf tambien se describen secuencias de acidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con la cadena apropiada que codifica una secuencia inhibidora de JNK (nativa) o peptido quimerico tal como se define mas arriba. Preferentemente, estas secuencias de acidos nucleicos comprenden al menos 6 acidos nucleicos (contiguos) que tienen una longitud suficiente para posibilitar una hibridacion especffica. De forma especialmente preferente, estas secuencias de acidos nucleicos comprenden de 6 a 38, de forma particularmente preferente de 6 a 30, y de forma totalmente preferente de 6 a 20 o de 6 a 10 acidos nucleicos (contiguos).

Las "condiciones rigurosas" dependen de la secuencia y seran diferentes bajo circunstancias diferentes. En general se pueden seleccionar unas condiciones rigurosas de aproximadamente 5°C por debajo del punto de

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fusion termico (TM) para la secuencia especffica con una fuerza ionica y un pH definidos. El TM es la temperature (bajo una fuerza ionica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida en una sonda perfectamente apareada. Normalmente, las condiciones rigurosas seran aquellas en las que la concentracion de sal es al menos aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperature es de al menos aproximadamente 60°C. Otros factores que pueden influir en la rigurosidad de hibridacion (incluyendo, entre otras, la composicion de las bases y el tamano de las cadenas complementarias), son la presencia de disolventes organicos y la magnitud del desapareamiento de bases, siendo mas importante la combinacion de parametros que la magnitud absoluta de cualquiera de ellos.

Las "condiciones de alta rigurosidad" pueden comprender lo siguiente, por ejemplo Paso 1: unos filtros que contienen ADN se tratan previamente durante un tiempo entre 8 horas y a lo largo de una noche a 65°C en tampon compuesto por 6xSSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA, y 500 mg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado. Paso 2: los filtros se hibridan durante 48 horas a 65°C en la mezcla de prehibridacion arriba indicada a la que se anaden 100 mg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado y 5-20 106 cpm de sonda marcada con 32P. Paso 3: los filtros se lavan durante 1 hora a 37°C en una solucion que contiene 2xSSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll, y 0,01% BSA. Despues se lleva a cabo otro lavado en 0,1xSSC a 50°C durante 45 minutos. Paso 4: los filtros se autorradiograffan. En la tecnica se conocen bien otras condiciones de alta rigurosidad utilizables (vease, por ejemplo, Ausubel y col., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Ny; y Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY).

Las "condiciones de rigurosidad moderada" pueden incluir lo siguiente: Paso 1: unos filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 55°C en una solucion que contiene 6xSSC, 5*solucion de Denhardt, 0,5% SDS y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado. Paso 2: los filtros de hibridan durante 18-20 horas a 55°C en la misma solucion con 5-20 106 cpm de sonda marcada con 32P anadida. Paso 3: los filtros se lavan a 37°C durante 1 hora en una solucion que contiene 2xSSC, 0,1% SDS, despues se lavan dos veces durante 30 minutos a 60°C en una solucion que contiene 1xSSC y 0,1% SDS. Paso 4: los filtros se transfieren en seco y se exponen para autorradiograffa. En la tecnica se conocen bien otras condiciones de rigurosidad moderada utilizables (vease, por ejemplo, Ausubel y col., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY).

Por ultimo, las "condiciones de baja rigurosidad" pueden incluir: Paso 1: unos filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 40°C en una solucion que contiene un 35% de formamida, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA, y 500 mg/ml ADN de esperma de salmon desnaturalizado. Paso 2: los filtros se hibridan durante 18-20 horas a 40°C en la misma solucion con la adicion de un 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmon, 10% (peso/volumen) sulfato de dextrano, y 5-20 106 cpm de sonda marcada con 32P. Paso 3: los filtros se lavan durante 1,5 horas a 55°C en una solucion que contiene 2xSSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM y 0,1% SDS. La solucion de lavado se sustituye por solucion fresca y se incuba durante otras 1,5 horas a 60°C. Paso 4: los filtros se transfieren en seco y se exponen para autorradiograffa. En caso necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68°C y se exponen de nuevo a la pelfcula. En la tecnica se conocen bien otras condiciones de baja rigurosidad utilizables (por ejemplo, tal como se emplean para hibridaciones de cruce de especies). Vease por ejemplo Ausubel y col., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

Las secuencias de acidos nucleicos tal como se definen mas arriba pueden emplearse para expresar peptidos, es decir, una secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquf o un peptido quimerico tal como se utiliza aquf para analisis, caracterizacion o uso terapeutico; como marcadores para tejidos donde se expresan preferentemente (bien de forma constitutiva o bien en una etapa particular de diferenciacion o desarrollo de tejidos o en estados de enfermedad) los peptidos correspondientes (tal como se utilizan aquf). Otros usos de estos acidos nucleicos incluyen, por ejemplo, marcadores de peso molecular en analisis basados en electroforesis de gel de acidos nucleicos.

De acuerdo con otra realizacion no reivindicada de la presente descripcion, los vectores de expresion pueden emplearse para los objetivos arriba indicados para la expresion recombinante de una o mas secuencias inhibidoras de JNK y/o peptidos quimericos tal como se definen mas arriba. El concepto "vector de expresion" se utiliza aquf para designar ADN o ARN circular o lineal bicaterario o monocatenario. Ademas, comprende al menos un acido nucleico tal como se define mas arriba que se debe transferir al interior de una celula huesped o al interior de un organismo huesped pluricelular. El vector de expresion tal como se da a conocer aquf comprende preferentemente un acido nucleico tal como se define mas arriba que codifica la secuencia inhibidora de JNK tal como se da a conocer aquf o un fragmento o una variante de la misma. Adicionalmente, un vector de expresion tal como se da a conocer aquf comprende preferentemente elementos apropiados

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para soportar la expresion, incluyendo diversos elementos reguladores, como potenciadores/promotores de fuentes virales, bacterianas, vegetales, de mairnferos y otras fuentes eucariotas que conducen la expresion del polinucleotido insertado en celulas huesped, como elementos lfmite aislantes, LCR (por ejemplo descritos por Blackwood y Kadonaga (1998), Science 281, 61-63) o regiones de union de matriz/supercontigo (por ejemplo descritas por Li, Harju y Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408). En algunos casos, los elementos reguladores son heterologos (es decir, no el promotor genico nativo). Alternativamente, las senales de transcripcion y traduccion necesarias tambien pueden ser suministradas por el promotor nativo para los genes y/o sus regiones flanqueadoras.

Tal como se utiliza aqrn, el termino "promotor" se refiere a una region de ADN que actua controlando la transcripcion de una o mas secuencias de acidos nucleicos tal como se definen mas arriba, y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de union para la ARN-polimerasa dependiente de ADN y de otras secuencias de aDn, que interacciona regulando la funcion promotora. Un fragmento promotor de expresion funcional de un promotor es una secuencia promotora acortada o truncada que conserva la actividad como promotor. La actividad promotora se puede medir mediante un ensayo conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, Wood, de Wet, Dewji, y DeLuca, (1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592596; Seliger y McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141) o comercialmente disponible de Promega®).

Una "region potenciadora" a utilizar en el vector de expresion tal como se define aqrn se refiere normalmente a una region de ADN que actua incrementando la transcripcion de uno o mas genes. Mas espedficamente, el termino "potenciador", tal como se utiliza aqrn es un elemento regulador de ADN que potencia, aumenta, incrementa o mejora la expresion de un gen independientemente de su localizacion y orientacion con respecto al gen a expresar, y que puede potenciar, aumentar, incrementar o mejorar la expresion de mas de un promotor.

Las secuencias promotoras/potenciadoras a utilizar en el vector de expresion tal como se define aqrn pueden emplear secuencias reguladoras vegetales, animales, de insecto o fungicas. Por ejemplo, se pueden emplear elementos promotores/ potenciadores de levaduras y otros hongos (por ejemplo el promotor GAL4, el promotor de la alcohol-deshidrogenasa, el promotor de la fosfoglicerol-quinasa, el promotor de fosfatasa alcalina). Alternativa o adicionalmente pueden incluir regiones de control de transcripcion animales, por ejemplo (i) la region de control del gen de insulina activa dentro de las celulas beta pancreaticas (vease, por ejemplo, Hanahan y col., 1985. Nature 315: 115-122); (ii) la region de control del gen de inmunoglobulina activa dentro de celulas linfoides (vease, por ejemplo, Grosschedl y col., 1984, Cell 38: 647-658); (iii) la region de control del gen de albumina activa dentro del dgado (vease, por ejemplo, Pinckert y col., 1987. Genes and Dev 1: 268-276; (iv) la region de control del gen de la protema basica mielina activa dentro de celulas oligodendrodticas cerebrales (vease, por ejemplo, Readhead y col., 1987, Cell 48: 703-712); y (v) la region de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina activa dentro del hipotalamo (vease, por ejemplo, Mason y col., 1986, Science 234: 1372-1378), y similares.

Adicionalmente, el vector de expresion tal como se define aqrn puede comprender un marcador de amplificacion. Este marcador de amplificacion se puede seleccionar entre el grupo consistente, por ejemplo, en adenosina desaminasa (ADA), dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de multirresistencia a los farmacos (MDR), la ornitina descarboxilasa (ODC) y la resistencia al N-(fosfonacetil)-L-aspartato (CAD).

Ejemplos de vectores de expresion o derivados adecuados en el contexto de la presente descripcion incluyen en particular, por ejemplo, virus humanos o animales (por ejemplo virus Vaccinia o adenovirus); virus de insectos (por ejemplo baculovirus); vectores de levadura; vectores bacteriofagos (por ejemplo fago lambda); vectores plasmfdicos y vectores cosmidos.

La presente solicitud describe adicionalmente una variedad de sistemas de vectores huesped no reivindicados que pueden expresar la o las secuencias de acidos nucleicos codificadoras de peptidos tal como se definen mas arriba. Estos incluyen, de forma no exclusiva: (i) sistemas celulares de mai^eras infectados por el virus Vaccinia, adenovirus y similares; (ii) sistemas celulares de insectos infectados por baculovirus y similares; (iii) vectores de levadura que contienen levadura; o (iv) bacterias transformadas con bacteriofagos, ADN, ADN plasmido o ADN cosmido. Dependiendo del sistema de vector huesped utilizado se puede emplear cualquiera de diversos elementos de transcripcion y traduccion adecuados.

Preferentemente se puede seleccionar una cepa de celulas huesped adecuada para un sistema huesped- vector de este tipo que module la expresion de secuencias de interes insertadas, o que modifique o procese peptidos expresados codificados por las secuencias del modo espedfico deseado. Ademas, la expresion de determinados promotores se puede mejorar en presencia de determinados inductores en una cepa huesped seleccionada, facilitando asf el control de la expresion de un peptido obtenido por ingeniena genetica. Ademas, diferentes celulas huesped poseen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento

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y la modificacion de traduccion y postraduccion (por ejemplo glicosilacion, fosforilacion y similares) de peptidos expresados. Por tanto, se pueden elegir lmeas celulares o sistemas huesped adecuados para asegurar el logro de la modificacion y el procesamiento adecuados del peptido extrano. Por ejemplo, se puede utilizar una expresion de peptido dentro de un sistema bacteriano para producir un peptido de nucleo no glicosilado, mientras que la expresion con celulas de mairnfero asegura una glicosilacion "nativa" de un peptido heterologo.

La presente solicitud describe ademas el uso no reivindicado de antibioticos dirigidos contra las secuencias inhibidoras de JNK y/o peptidos quimericos tal como se describen mas arriba, para preparar una composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas tal como se definen aquL Ademas, se describen medios eficientes para la produccion de anticuerpos espedficos para secuencias inhibidoras de JNK tal como se dan a conocer aqrn, o para peptidos quimericos que contienen una secuencia inhibidora de este tipo, que pueden ser utilizados para este fin.

De acuerdo con la presente descripcion, las secuencias inhibidoras de JNK y/o peptidos quimericos tal como se definen aqrn, asf como fragmentos, variantes o derivados de los mismos, pueden emplearse como inmunogenos para generar anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a estos componentes peptfdicos. Estos anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos policlonales, monoclonales, quimericos, monocatenarios, Fab y una genoteca de expresion de Fab. Espedficamente, la presente solicitud describe anticuerpos para peptidos quimericos o para secuencias inhibidoras de JNK tal como se definen mas arriba. Para la produccion de estos anticuerpos se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la tecnica.

A modo de ejemplo, diversos animales huesped se pueden inmunizar para la produccion de anticuerpos policlonales mediante inyeccion con cualquier peptido quimerico o secuencia inhibidora de JNK tal como se definen mas arriba. De este modo se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica, incluyendo, de forma no exclusiva, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales (por ejemplo, hidroxido de aluminio), sustancias tensioactivas (por ejemplo lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, peptidos, emulsiones en aceite, dinitrofenol, etc.), CpG, polfmeros, Pluronics, y adyuvantes humanos tales como bacilo de Calmette y Guerin, y Corynebacterium parvum.

Para la preparacion de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un peptido quimerico o una secuencia inhibidora de JNK tal como se definen mas arriba se puede utilizar cualquier tecnica que posibilite la produccion de moleculas de anticuerpo mediante un cultivo continuo de lmea celular. Estas tecnicas incluyen, de forma no exclusiva, la tecnica de hibridomas (vease Kohler y Milstein, 1975. Nature 256: 495-497); la tecnica de triomas; la tecnica de hibridomas de celulas B humanas (vease Kozbor y col., 1983, Immunol Today 4: 72) y la tecnica de hibridomas EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (vease Cole y col., 1985. En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). En la practica de la presente invencion se pueden utilizar anticuerpos monoclonales humanos, que se pueden producir mediante el uso de hibridomas (vease Cote y col., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o mediante la transformacion in vitro de celulas B humanas con el virus de Epstein Barr (vease Cole y col., 1985. En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

De acuerdo con la presente invencion es posible adaptar tecnicas para la produccion de anticuerpos monocatenarios espedficos para las secuencias inhibidoras de JNK y/o peptidos quimericos (vease, por ejemplo, la Patente US n° 4.946.778) tal como se define aqrn. Ademas, es posible adaptar metodos para la construccion de genotecas de expresion Fab (vease, por ejemplo, Huse y col., 1989. Science 246: 12751281) con el fin de posibilitar una identificacion rapida y efectiva de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para estas secuencias inhibidoras de JNK y/o peptidos quimericos. Algunos anticuerpos no humanos se pueden "humanizar" mediante tecnicas bien conocidas (vease, por ejemplo, la Patente US n° 5.225.539). Tambien es posible producir fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos para una secuencia inhibidora de JNK y/o peptido quimerico tal como se define aqrn mediante tecnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, (i) un fragmento F(ab')2 producido por digestion de pepsina de una molecula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado por reduccion de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molecula de anticuerpo con papama y un agente reductor; y (iv) fragmentos Fv.

En una realizacion no reivindicada de esta descripcion, metodos que pueden utilizase para el cribado de anticuerpos y que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no de forma exclusiva, el ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA) y otras tecnicas inmunologicas conocidas. Espedficamente, la seleccion de anticuerpos que son espedficos para un epftopo particular de una secuencia inhibidora de JNK y/o peptido quimerico tal como se define aqrn (por ejemplo un fragmento de la misma que incluye normalmente una longitud de 5 a 20, preferentemente de 8 a 18 y de forma especialmente preferente de 8 a 11 aminoacidos) se puede facilitar mediante la generacion de hibridomas que se unen al fragmento de una secuencia inhibidora de JNK y/o peptido quimerico, tal como se define aqrn, que posee un epftopo de este

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tipo. Aquf tambien estan previstos estos anticuerpos que son especfficos para un epftopo tal como se define mas arriba.

Los anticuerpos tal como se definen aquf pueden ser utilizados en metodos conocidos en la tecnica relacionados con la localizacion y/o cuantificacion de una secuencia inhibidora de JNK (y/o correspondientemente a un peptido quimerico tal como se define mas arriba), por ejemplo para su uso en la medida de niveles del peptido dentro de muestras fisiologicas apropiadas, para su uso en metodos de diagnostico o para su uso en la formacion de imagenes del peptido, y similares.

Las secuencias inhibidoras de JNK, peptidos quimericos, acidos nucleicos, vectores, celulas huesped y/o anticuerpos tal como se definen de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion se pueden formular en una composicion farmaceutica que se puede aplicar en la prevencion o el tratamiento de cualquiera de las enfermedades tal como se definen aquf, en particular en la prevencion o el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas tal como se definen aquf. Normalmente, una composicion farmaceutica de este tipo utilizada de acuerdo con la presente divulgacion que comprende la presente invencion incluye como componente activo, por ejemplo: (i) una o mas cualesquiera de las secuencias inhibidoras de JNK y/o peptidos quimericos tal como se definen mas arriba, y/o variantes, fragmentos o derivados de los mismos, en particular secuencias inhibidoras de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o peptidos quimericos de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o secuencias inhibidoras de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprenden una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas; y/o (ii) acidos nucleicos que codifican una secuencia inhibidora de JNK y/o peptido quimerico tal como se definen mas arriba y/o variantes o fragmentos de los mismos; y/o (iii) celulas que comprenden una cualquiera o mas de las secuencias inhibidoras de JNK y/o peptidos quimericos, y/o variantes, fragmentos o derivados de los mismos, tal como se definen mas arriba; y/o (iv) celulas transfectadas con un vector y/o acidos nucleicos que codifican una secuencia inhibidora de JNK y/o peptido quimerico tal como se define mas arriba y/o variantes o fragmentos de los mismos.

Preferentemente, tal composicion farmaceutica utilizada de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion incluye normalmente una cantidad segura y efectiva de un componente tal como se define mas arriba, preferentemente de al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o al menos un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5-8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas con las definiciones arriba proporcionadas, o al menos un acido nucleico codificador de las mismas, o al menos un vector, celula huesped o anticuerpo tal como se definen mas arriba.

La cantidad de una secuencia inhibidora de JNK y un peptido quimerico, respectivamente, en la composicion farmaceutica a administrar a un sujeto puede tener conllevar una dosis muy baja (sin estar limitada a ella). Por tanto, la dosis puede ser mucho menor que la de farmacos peptfdicos conocidos en la tecnica tales como DTS-108 (Florence Meyer-Losic y col., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53). Esto tiene varios aspectos positivos, por ejemplo una reduccion de las reacciones secundarias potenciales y una reduccion de los costes.

Preferentemente, la dosis (por kg de peso corporal) oscila en el intervalo hasta 10 mmol/kg, preferiblemente hasta 1 mmol/kg, de forma mas preferente hasta 100 pmol/kg, de forma incluso mas preferente hasta 10 pmol/kg, de forma todavfa mas preferente hasta 1 pmol/kg, de forma particularmente preferente hasta 100 nmol/kg, y de forma totalmente preferente hasta 50 nmol/kg.

Por tanto, el intervalo de dosis puede oscilar preferentemente entre aproximadamente 1 pmol/kg y aproximadamente 1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg y aproximadamente 0,1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg y aproximadamente 0,01 mmol/kg, entre aproximadamente 50 pmol/kg y aproximadamente 1 pmol/kg, entre aproximadamente 100 pmol/kg y aproximadamente 500 nmol/kg, entre aproximadamente 200 pmol/kg y aproximadamente 300 nmol/kg, entre aproximadamente 300 pmol/kg y aproximadamente 100 nmol/kg, entre aproximadamente 500 pmol/kg y aproximadamente 50 nmol/kg, entre aproximadamente 750 pmol/kg y aproximadamente 30 nmol/kg, entre aproximadamente 250 pmol/kg y aproximadamente 5 nmol/kg, entre aproximadamente 1 nmol/kg y aproximadamente 10 nmol/kg, o una combinacion de dos cualesquiera de estos valores.

Las dosis de un inhibidor de JNK de acuerdo con la SEQ ID N°: 30 pueden ser por ejemplo de aproximadamente 10, 50 o 100 pg/kg.

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En este contexto, la prescripcion de un tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre la dosificacion, etc. cuando se utiliza la composicion farmaceutica arriba descrita, forma parte normalmente de la responsabilidad de los facultativos generales y otros doctores medicos, y normalmente tiene en cuenta la afeccion a tratar, el estado del paciente individual, el sitio de administracion, el metodo de administracion y otros factores conocidos por los facultativos. En REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, edicion 16, Osol, A. (ed), 1980 se pueden encontrar ejemplos de las tecnicas y protocolos arriba mencionados. Por consiguiente, una "cantidad segura y efectiva" tal como se define mas arriba para componentes de las composiciones farmaceuticas tal como se utilizan de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion significa una cantidad de cada uno de estos componentes, o de todos ellos, que es suficiente para inducir significativamente una modificacion positiva de una enfermedad oftalmica inflamatoria cronica o no cronica tal como se define aquf. Sin embargo, al mismo tiempo, una "cantidad segura y efectiva" es suficientemente pequena para evitar efectos secundarios serios, es decir, para posibilitar una relacion prudente entre ventaja y riesgo. La determinacion de estos lfmites esta normalmente dentro del alcance de un juicio medico sensato. Una "cantidad segura y efectiva" de un componente de este tipo variara en relacion con la enfermedad particular a tratar y tambien con la edad y el estado ffsico del paciente a tratar, la gravedad de la enfermedad, la duracion del tratamiento, la naturaleza de la terapia concomitante, del vehfculo farmaceuticamente aceptable particular utilizado, y de factores similares, dentro del conocimiento y la experiencia del medico. Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion se pueden utilizar de acuerdo con la invencion para humanos y tambien con fines medicos veterinarios.

La composicion farmaceutica tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion tambien puede comprender, ademas de una de estas sustancias, un vehfculo farmaceuticamente aceptable (compatible), excipiente, tampon o estabilizador u otros materiales bien conocidos por los especialistas en la tecnica.

En este contexto, la expresion "vehfculo farmaceuticamente aceptable (compatible)" incluye preferentemente la base lfquida o no lfquida de la composicion. El termino "compatible" significa que los constituyentes de la composicion farmaceutica tal como se utiliza aquf se pueden mezclar con el componente farmaceuticamente activo tal como se define mas arriba y con otro componente de modo que no se produce ninguna interaccion que pueda reducir esencialmente la eficacia farmaceutica de la composicion bajo condiciones de uso habituales. Evidentemente, los vehfculos farmaceuticamente aceptables deben tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sean adecuados para ser administrados a una persona a tratar.

Si la composicion farmaceutica tal como se utiliza aquf se suministra en forma lfquida, el vehfculo farmaceuticamente aceptable incluira normalmente uno o mas vehfculos lfquidos farmaceuticamente aceptables (compatibles). La composicion puede comprender como vehfculos lfquidos farmaceuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, agua libre de pirogenos; solucion salina isotonica o soluciones (acuosas) tamponadas, por ejemplo soluciones tamponadas fosfato, citrato, etc., aceites vegetales tales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de teobroma; polioles, por ejemplo polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; acido algfnico, etc. En particular para la inyeccion de la composicion farmaceutica tal como se utiliza aquf se puede emplear un tampon, preferentemente un tampon acuoso.

Si la composicion farmaceutica tal como se utiliza aquf se suministra en forma solida, el vehfculo farmaceuticamente aceptable incluira normalmente uno o mas vehfculos solidos farmaceuticamente aceptables (compatibles). La composicion puede comprender como vehfculos solidos farmaceuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, uno o mas materiales de carga o diluyentes solidos o lfquidos, o tambien se pueden utilizar compuestos de encapsulacion, que sean adecuados para ser administrados a una persona. Ejemplos de estos vehfculos solidos farmaceuticamente aceptables (compatibles) son azucares, como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, como almidon de mafz o almidon de patata; celulosa y sus derivados, como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; sebo; lubricantes solidos, como acido estearico, estearato de magnesio; sulfato de calcio, etc.

La naturaleza concreta del vehfculo farmaceuticamente aceptable (compatible) u otro material puede depender de la via de administracion. Por consiguiente, la seleccion de un vehfculo farmaceuticamente aceptable (compatible) se puede determinar en principio de acuerdo con el modo de administracion de la composicion farmaceutica tal como se utiliza de acuerdo con la invencion. La composicion farmaceutica tal como se utiliza de acuerdo con la invencion se puede administrar, por ejemplo, de forma sistemica. Las vfas de administracion incluyen, por ejemplo, vfas parenterales (por ejemplo por inyeccion) tales como las vfas intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica o transdermica, etc.; vfas enterales tales como la via oral, o vfas rectales, etc.; vfas topicas tales como la via nasal o intranasal, etc.; u otras vfas tales como vfas epidermicas o administracion con parches. Ademas, es particularmente preferente la administracion local sobre/dentro del ojo, por ejemplo la administracion intravftrea, la administracion subconjuntival y/o la instilacion.

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En otro aspecto, las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos, las secuencias de acidos nucleicos o los anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos tal como se definen aquf, por ejemplo una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas, pueden emplearse en el tratamiento de inflamaciones intraoculares, en particular despues de cirugfa oftalmica o trauma. Mientras que el interior del ojo normalmente no es muy propenso a las infecciones e inflamaciones (por ejemplo subsiguientes) debido a su estructura autonoma y aislada, las probabilidades de inflamacion crecen despues de un tratamiento quirurgico de tejido ocular y/o despues de otras lesiones (por ejemplo mecanicas) (trauma). Por consiguiente, los compuestos a utilizar en la presente divulgacion que comprende la presente invencion se pueden emplear en particular para el tratamiento de inflamaciones intraoculares despues de cirugfa o trauma oftalmico y en particular para el tratamiento de heridas y bordes de heridas inflamadas. En particular, en el contexto de las inflamaciones intraoculares (pero no exclusivamente), los inventores contemplan en particular la administracion subconjuntival y/o una sola administracion por infusion intravenosa.

Actualmente, el tratamiento estandar de las inflamaciones oculares es la administracion de (cortico)esteroides en forma de gotas o pomadas oftalmicas. La administracion de corticosteroides se deberfa repetir con frecuencia y no carece de efectos secundarios. Por otro lado, en inflamaciones severas a veces es necesaria la administracion intravenosa o subconjuntival de corticosteroides. Por consiguiente, la presente descripcion que comprende la presente invencion tambien se refiere al uso de las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos, las secuencias de acidos nucleicos o los anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos tal como se definen aquf, por ejemplo una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas, en un metodo de tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas, comprendiendo el metodo la administracion combinada de las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos, las secuencias de acidos nucleicos o los anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos tal como se definen aquf, junto con esteroides (por ejemplo corticosteroides). La administracion combinada incluye la administracion paralela y/o la administracion consecutiva (primero el inhibidor de JNK aquf descrito y despues los (cortico)esteroides o viceversa). Evidentemente, la administracion consecutiva y paralela tambien se pueden combinar, por ejemplo el tratamiento comienza con los inhibidores de JNK aquf descritos y en un momento posterior en el curso del tratamiento se administran paralelamente (cortico)esteroides.

La cantidad adecuada de la composicion farmaceutica a utilizar se puede determinar mediante experimentos rutinarios con modelos animales. Estos modelos incluyen, sin que esto implique ninguna limitacion, los modelos de conejo, oveja, raton, rata, perro y primates no humanos. Las formas de dosificacion unitaria preferentes para inyeccion incluyen soluciones esteriles de agua, solucion salina fisiologica o mezclas de las mismas. El pH de estas soluciones se deberfa ajustar a un valor de aproximadamente 7,4. Los vehfculos adecuados para inyeccion incluyen hidrogeles, dispositivos para la liberacion controlada o retrasada, acido polilactico y matrices de colageno. Los vehfculos farmaceuticamente aceptables adecuados para la aplicacion topica incluyen aquellos que son adecuados para ser utilizados en lociones, cremas, geles y similares. Si los compuestos se deben administrar via peroral, las pastillas, capsulas y similares son la forma de dosificacion unitaria preferente. Los vehfculos farmaceuticamente aceptables para la preparacion de formas de dosificacion unitaria que pueden ser utilizadas para la administracion oral son bien conocidos en el estado anterior de la tecnica. La seleccion de los mismos dependera de consideraciones secundarias tales como sabor, coste y aptitud para almacenamiento, que no son crfticas para los objetivos de la presente invencion, y puede ser realizada sin dificultad por una persona con experiencia en la tecnica.

Las composiciones farmaceuticas para la administracion oral se pueden encontrar en forma de pastillas, capsulas, en polvo o en forma lfquida. Una pastilla puede incluir un vehfculo solido tal como se define mas arriba, como gelatina, y opcionalmente un adyuvante. Las composiciones farmaceuticas lfquidas para la administracion oral pueden incluir en general un vehfculo lfquido tal como se define mas arriba, como agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Tambien pueden incluir solucion salina fisiologica, dextrosa u otras soluciones de sacaridos o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para la inyeccion intravenosa, cutanea o subcutanea, o en el lugar de la dolencia, el ingrediente activo estara en forma de una solucion acuosa parenteral aceptable libre de pirogenos y con un pH, una isotonicidad y una

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estabilidad adecuados. Las personas con un conocimiento tecnico relevante pueden preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehfculos isotonicos tales como Inyeccion de Cloruro de Sodio, Inyeccion de Ringer, Inyeccion de Ringer Lactato. Tambien se pueden incluir conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, segun se requiera. Independientemente de que se trate de un polipeptido, peptido o molecula de acido nucleico, u otro compuesto farmaceuticamente util de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion que deba ser administrado a un individuo, la administracion se lleva a cabo en una “cantidad profilacticamente eficaz” o una “cantidad terapeuticamente eficaz” (segun sea aplicable), siendo esta suficiente para beneficiar al individuo. La cantidad exacta administrada y la velocidad y la evolucion temporal de la administracion, dependeran de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad tratada.

La prevencion y/o el tratamiento de una enfermedad tal como se define aquf incluyen tfpicamente la administracion de una composicion farmaceutica tal como se describe mas arriba. El termino “modular” incluye la supresion de la expresion de JNK en caso de sobreexpresion de la misma en cualquiera de las enfermedades arriba indicadas. Tambien incluye, de forma no exclusiva, la supresion o fosforilacion de c-jun, ATF2 o NFAT4 en cualquiera de las enfermedades arriba indicadas, por ejemplo empleando al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o al menos un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas, como un inhibidor competitivo del sitio de union natural de c-jun, ATF2 y NFAT4 en una celula. El termino “modular” tambien incluye la supresion de complejos heteromericos y homomericos de factores de transcripcion formados, de forma no exclusiva, por c-jun, ATF2 o NFAT4 y sus companeros relacionados, por ejemplo el complejo AP-1, que esta formado por c-jun, AFT2 y c-fos. Cuando una enfermedad oftalmica inflamatoria cronica o no cronica esta asociada a una sobreexpresion de JNK, dichas secuencias inhibidoras de JNK supresoras se pueden introducir en una celula. En algunos casos, “modular” puede incluir el aumento de la expresion de JNK, por ejemplo mediante el uso de un anticuerpo especffico de peptido IB que bloquea la union de un peptido IB con JNK, evitando asf la inhibicion de jNk mediante el peptido relacionado con IB.

La prevencion y/o el tratamiento de un sujeto con la composicion farmaceutica tal como se describe mas arriba se puede llevar a cabo normalmente administrando (in vivo) una cantidad (“terapeuticamente eficaz”) de dicha composicion farmaceutica a un sujeto, pudiendo ser este sujeto por ejemplo cualquier mamffero, por ejemplo un humano, primate, raton, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. El concepto “terapeuticamente eficaz” significa que la cantidad del componente activo de la composicion farmaceutica es suficiente para mejorar la enfermedad oftalmica inflamatoria cronica o no cronica.

Por consiguiente, los peptidos tal como se definen mas arriba, por ejemplo al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o al menos un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas, pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas.

Los peptidos tal como se definen mas arriba y tal como estan incluidos en la composicion farmaceutica de la invencion tambien pueden estar codificados por acidos nucleicos. Esto resulta particularmente ventajoso si los peptidos arriba indicados se administran con fines de una terapia genica. En este contexto, la terapia genica se refiere a una terapia llevada a cabo mediante la administracion de un acido nucleico especffico tal como se define mas arriba a un sujeto, por ejemplo por medio de una composicion farmaceutica tal como se define mas arriba, comprendiendo el o los acidos nucleicos exclusivamente L-aminoacidos. En este caso de la presente descripcion, el acido nucleico produce su(s) peptido(s) codificado(s), que sirve(n) para ejercer un efecto terapeutico mediante la modulacion de la funcion de la enfermedad o afeccion. En la practica de la presente invencion se puede emplear cualquiera de los metodos disponibles en la tecnica relacionados con la terapia genica (vease, por ejemplo, Goldspiel y col., 1993. Clin Pharm 12: 488-505).

En una realizacion no reivindicada, el acido nucleico tal como se define mas arriba y tal como se utiliza para la terapia genica forma parte de un vector de expresion que codifica y expresa uno o mas cualesquiera de los peptidos relacionados con IB tal como se definen mas arriba dentro de un huesped adecuado, es decir, una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°:

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1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas. En una realizacion no reivindicada, un vector de expresion de este tipo incluye un promotor que esta unido operativamente con una o mas regiones codificadoras de una secuencia inhibidora de JNK. El promotor puede ser tal como se define mas arriba, por ejemplo inducible o constitutivo, y opcionalmente especffico de un tejido.

En otra realizacion no reivindicada, una molecula de acido nucleico tal como se define mas arriba se utiliza para una terapia genica en la que las secuencias codificadoras de la molecula de acido nucleico (y cualquier otra secuencia deseada de la misma) tal como se definen mas arriba estan flanqueadas por regiones que promueven la recombinacion homologa en un sitio deseado dentro del genoma, produciendo asf la expresion intracromosomica de estos acidos nucleicos (vease, por ejemplo, Koller y Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935).

La administracion del acido nucleico tal como se define mas arriba a un paciente para una terapia genica, en particular en el contexto de las enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas y no cronicas tal como se definen mas arriba, puede ser directa (es decir, el paciente se expone directamente al acido nucleico o a un vector que contiene acido nucleico) o indirecta (es decir, las celulas se transforman primero con el acido nucleico in vitro y despues se trasplantan al paciente). Estos dos metodos se conocen, respectivamente, como terapia genica in vivo o ex vivo. En una realizacion especffica de la presente invencion, un acido nucleico se administra directamente in vivo, donde es expresado para producir el producto codificado. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquiera de numerosos metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, la construccion del acido nucleico como parte de un vector de expresion de acido nucleico apropiado y la administracion del mismo de modo que se vuelve intracelular (por ejemplo, por infeccion utilizando un vector retroviral defectivo o atenuado u otro vector viral; vease la Patente US N° 4.980.286); inyectando directamente ADN desnudo; utilizando bombardeo de micropartfculas (por ejemplo un "GeneGun"; Biolistic, DuPont); revistiendo los acidos nucleicos con lfpidos; utilizando agentes de transfeccion/receptores de superficie celular asociados; mediante encapsulacion en liposomas, micropartfculas o microcapsulas; mediante su administracion unido a un peptido conocido por entrar en el nucleo; o mediante su administracion unido con un ligando predispuesto para endocitosis mediada por receptor (vease, por ejemplo, Wu y Wu, 1987. J Biol Chem 262: 4429-4432), que puede ser utilizado para "apuntar" a tipos de celulas que expresan especfficamente los receptores de interes, etc.

Un metodo adicional para la terapia genica en la practica de la presente invencion implica la transferencia de un acido nucleico tal como se define mas arriba en celulas en cultivo tisular in vitro mediante metodos tales como electroporacion, lipofeccion, transfeccion mediada por fosfato de calcio, infeccion viral o similares. En general, el metodo de transferencia incluye la transferencia concomitante de un marcador seleccionable para las celulas. Las celulas se disponen despues bajo una presion de seleccion (por ejemplo resistencia a los antibioticos) para facilitar el aislamiento de las celulas que han sido absorbidas y que expresan el gen transferido. Despues, dichas celulas son transferidas a un paciente. En una realizacion especffica no reivindicada, antes de la administracion in vivo de la celula recombinante resultante, el acido nucleico se introduce en una celula por cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, transfeccion, electroporacion, microinyeccion, infeccion con un vector viral o bacteriofago que contiene las secuencias de acidos nucleicos de interes, fusion celular, transferencia genetica mediada por cromosomas, transferencia genetica mediada por microcelulas, fusion de esferoplastos y metodos similares que aseguran que las funciones de desarrollo y fisiologicas necesarias de las celulas receptoras no resultan alteradas por la transferencia. Vease, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993. Meth Enzymol 217: 599-618. La tecnica elegida deberfa posibilitar la transferencia estable del acido nucleico a la celula, de tal modo que la celula puede expresar el acido nucleico. Preferentemente, el acido nucleico transferido es heredable y expresable por la descendencia celular.

En realizaciones no reivindicadas de la presente descripcion, las celulas recombinantes resultantes puede ser suministradas a un paciente por diversos metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, inyeccion de celulas epiteliales (por ejemplo via subcutanea), aplicacion de celulas de la piel recombinantes como un injerto de piel sobre el paciente, e inyeccion intravenosa de celulas sangufneas recombinantes (por ejemplo celulas madre hematopoyeticas o celulas precursoras). La cantidad total de celulas previstas para ser utilizadas depende del efecto deseado, el estado del paciente y similares, y puede ser determinada por los especialistas en la tecnica. Las celulas en las que se puede introducir un acido nucleico con fines de terapia genica incluyen cualquier tipo de celula disponible deseada, y pueden ser xenogenicas, heterogenicas, singenicas o autogenicas. Los tipos de celulas incluyen, de forma no exclusiva, celulas diferenciadas tales como celulas epiteliales, celulas endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, celulas musculares, hepatocitos y celulas sangufneas, o diversas celulas madre o precursoras, en particular celulas musculares cardfacas embrionarias, celulas madre hepaticas (Publicacion de Patente Internacional WO 94/08598), celulas madre neurales (Stemple y Anderson, 1992, Cell 71 : 973-985), celulas madre hematopoyeticas o celulas

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precursoras, por ejemplo tal como se obtienen de medula osea, sangre de cordon umbilical, sangre periferica, hfgado fetal, y similares. Preferentemente, las celulas utilizadas para la terapia genica son autologas para el paciente.

Alternativa y/o adicionalmente, para el tratamiento de enfermedades tal como se mencionan aquf se pueden utilizar terapias de direccion selectiva para suministrar las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos y/o los acidos nucleicos tal como se definen mas arriba mas especfficamente a determinados tipos de celula, mediante el uso de sistemas dirigidos tales como un anticuerpo (una diana) o ligandos especfficos de celulas. Los anticuerpos utilizados para la senalizacion normalmente son especfficos para protefnas de la superficie celular de celulas asociadas con cualquiera de las enfermedades abajo definidas. A modo de ejemplo, estos anticuerpos se pueden dirigir a anticuerpos de superficie celular tales como, por ejemplo, protefnas de superficie asociadas a celulas B tales como protefna MHC de clase II DR, CD18 (cadena beta LFA-1), CD45RO, CD40 o Bgp95, o protefnas de superficie celular seleccionadas, por ejemplo, entre CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138, etc. Los constructos diana se pueden preparar normalmente mediante union covalente de las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos y los acidos nucleicos tal como se definen aquf de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion con un anticuerpo especffico para una protefna de superficie celular o por union con un ligando especffico de una celula. Las protefnas se pueden unir por ejemplo a un anticuerpo de este tipo o se pueden fijar al mismo mediante un enlace peptfdico o por acoplamiento qufmico, reticulacion etc. La terapia diana se puede llevar a cabo despues administrando el constructo diana en una cantidad farmaceuticamente eficiente a un paciente mediante cualquiera de las vfas de administracion tal como se definen mas abajo, por ejemplo via intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y por parches. Preferentemente, las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos o los acidos nucleicos tal como se definen aquf de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion, unidos a los anticuerpos diana o ligandos especfficos de celulas tal como se definen mas arriba, pueden ser liberados in vitro o in vivo, por ejemplo por hidrolisis del enlace covalente, mediante peptidasas o mediante cualquier otro metodo adecuado. Alternativamente, si las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos o los acidos nucleicos tal como se definen aquf de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion se unen a un ligando especffico de celulas pequeno, la liberacion del ligando puede no ser llevada a cabo. Si estan presentes en la superficie celular, los peptidos quimericos pueden entrar en la celula con la actividad de su secuencia de trafico. La direccion selectiva puede ser deseable por diversas razones; por ejemplo, si las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos y los acidos nucleicos tal como se definen aquf de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion son inaceptablemente toxicos o si en otro caso requerirfan una dosis demasiado alta.

En lugar de administrar las secuencias inhibidoras de JNK y/o los peptidos quimericos tal como se definen aquf de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion directamente, estos se podrfan producir en las celulas diana mediante expresion desde un gen codificador introducido en las celulas, por ejemplo desde un vector viral a administrar. El vector viral codifica normalmente las secuencias inhibidoras de JNK y/o los peptidos quimericos tal como se definen aquf de acuerdo con la presente descripcion que comprende la presente invencion. El vector se podrfa dirigir a las celulas especfficas a tratar. Ademas, el vector podrfa contener elementos reguladores que son activados de forma mas o menos selectiva por las celulas diana despues de una regulacion definida. Esta tecnica representa una variante de la tecnica VDEPT (virus-directed enzyme prodrug therapy - terapia de profarmaco enzimatico dirigido a virus), que utiliza protefnas maduras en lugar de sus formas precursoras.

Alternativamente, las secuencias inhibidoras de JNK y/o los peptidos quimericos tal como se definen aquf podrfan ser administrados en una forma precursora mediante el uso de un anticuerpo o un virus. Estas secuencias inhibidoras de JNK y/o los peptidos quimericos se pueden convertir despues en la forma activa mediante un agente de activacion producido en las celulas a tratar o dirigido a las mismas. Este tipo de metodo se conoce a veces como ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy - terapia de profarmaco enzimatico dirigido a anticuerpo) o VDEPT (virus-directed enzyme prodrug therapy - terapia de profarmaco enzimatico dirigido a virus); el primer implica la direccion selectiva del agente de activacion hacia las celulas mediante conjugacion con un anticuerpo especffico de las celulas, mientras que el ultimo implica la produccion del agente de activacion, por ejemplo una secuencia inhibidora de JNK o el peptido quimerico, en un vector mediante expresion de ADN codificador en un vector viral (veanse, por ejemplo, los documentos EP-A-415731 y WO 90/07936).

De acuerdo con otra realizacion no reivindicada, las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos, las secuencias de acidos nucleicos o los anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos tal como se definen aquf, por ejemplo una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ iD N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 y/o un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, y/o una secuencia inhibidora de JNK de

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acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas, pueden emplearse en ensayos (in vitro) (por ejemplo inmunoensayos) para detectar, pronosticar, diagnosticar o controlar diversas condiciones y afecciones seleccionadas entre enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas tal como se definen mas arriba, o para controlar su tratamiento. El inmunoensayo se puede llevar a cabo mediante un metodo que consiste en poner en contacto una muestra derivada de un paciente con un anticuerpo con una secuencia inhibidora de JNK, un peptido quimerico o una secuencia de acidos nucleicos tal como se define mas arriba, bajo condiciones que permiten que se pueda producir una union inmunoespecffica, y a continuacion detectar o medir la cantidad de cualquier union inmunoespecffica con el anticuerpo. En una realizacion especffica no reivindicada, un anticuerpo especffico para una secuencia inhibidora de JNK, un peptido quimerico o una secuencia de acidos nucleicos se puede utilizar para analizar una muestra de tejido o suero de un paciente en cuanto a la presencia de JNK o una secuencia inhibidora de JNK; en cuyo caso un nivel aberrante de JNK es indicativo de una situacion de enfermedad. Los inmunoensayos que pueden ser utilizados incluyen, de forma no exclusiva, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo que utilizan tecnicas tales como Western Blot, radioinmunoensayos (RIA), ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA), inmunoensayos "sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusion de gel, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de fijacion de complemento, ensayos inmunorradiometricos e inmunoensayos de protefna A, etc. Alternativamente se pueden llevar a cabo ensayos (in vitro) para suministrar las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos, las secuencias de acidos nucleicos o los anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos, tal como se definen mas arriba, a celulas diana seleccionadas normalmente, por ejemplo, celulas animales cultivadas, celulas humanas o microorganismos, y para controlar la respuesta celular mediante metodos bioffsicos normalmente conocidos por los especialistas. Las celulas diana normalmente utilizadas pueden ser celulas cultivadas (in vitro) o celulas in vivo, es decir, celulas que componen los organos o tejidos de animales o humanos vivos, o microorganismos hallados en animales o humanos vivos.

La presente solicitud describe adicionalmente el uso de kits para fines diagnosticos o terapeuticos, en particular para el tratamiento, la prevencion o el control de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas o no cronicas tal como se definen mas arriba, incluyendo el kit uno o mas recipientes que contienen secuencias inhibidoras de JNK, peptidos quimericos, secuencias de acidos nucleicos y/o anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos, tal como se definen mas arriba, por ejemplo un anticuerpo de secuencia inhibidora anti-JNK para una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100, para un peptido quimerico de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 9 a 12 y 23 a 32, para una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID N°: 1 a 4 y 13 a 20 y 33-100 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N°: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas dentro de las definiciones arriba proporcionadas, o tal como un anticuerpo de secuencia inhibidora anti-JNK y, opcionalmente, un companero de union marcado para el anticuerpo. El marcador asf incorporado en el anticuerpo puede incluir, de forma no exclusiva, una fraccion quimioluminiscente, enzimatica, fluorescente, colorimetrica o radiactiva. En otra realizacion especffica no reivindicada se proporcionan kits para uso diagnostico en el tratamiento, la prevencion o el control de enfermedades oftalmicas inflamatorias cronicas y no cronicas tal como se definen mas arriba, que incluyen uno o mas recipientes que contienen acidos nucleicos que codifican o, alternativamente, que son el complemento de una secuencia inhibidora de JNK y/o un peptido quimerico tal como se define mas arriba, y opcionalmente tambien se proporciona un companero de union marcado para estos acidos nucleicos. En una realizacion especffica alternativa no reivindicada, el kit se puede utilizar para los fines arriba indicados como un kit que comprende uno o mas recipientes, un par de cebadores de oligonucleotido (por ejemplo, cada 6-30 nucleotidos de longitud) que pueden actuar como cebadores de amplificacion para la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, vease, por ejemplo, Innis y col., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reaccion en cadena de la ligasa, reaccion de sonda cfclica y similares, u otros metodos conocidos en la tecnica utilizados en el contexto con los acidos nucleicos tal como se definen mas arriba. Opcionalmente, el kit puede comprender ademas una cantidad predeterminada de una secuencia inhibidora de JNK purificada tal como se define mas arriba, un peptido quimerico tal como se define mas arriba, o acidos nucleicos que codifican los mismos, para utilizarla como un diagnostico, un patron o un control en los ensayos con los objetivos indicados.

A no ser que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos aquf utilizados tienen el mismo significado comunmente entendido por el experto medio en la materia a la que pertenece esta invencion. En caso de conflicto regira la presente especificacion, incluyendo las definiciones.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1 Eficacia clfnica de la SEQ ID N°: 11 en uveitis inducida por LPS:

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Figura 6

Las puntuaciones clfnicas (expresadas en unidades arbitrarias, A.U.) se evaluaron en el pico de la enfermedad, 24 horas despues (A) inyeccion intravenosa (IV) o (B) inyeccion intravftrea (IVT) del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11. Se llevo a cabo una comparacion con ojos uvefticos no tratados (LPS) y con tratamiento IV/IVT con vehfculo (n = 10 ojos por grupo). Las manifestaciones clfnicas de la uveitis se redujeron despues de (A) inyeccion IV del (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11 (***p < 0,001 frente a LPS; ### p < 0,001 frente a vehfculo) y (B) inyeccion IVT del (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11 (***p < 0,001 frente a LPS; ## p < 0,01 frente a vehfculo) y dexametasona (***p < 0,05 frente a LPS). No se observo ninguna diferencia estadfstica (ns) entre la inyeccion IVT del (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11 y la dexametasona utilizada como control positivo.

Inhibicion de la via de JNK mediante SEQ ID N°: 11 en uveitis inducida por LPS:

Analisis Western-Blot de fosforilacion de c-Jun en complejos de RPE/coroides/esclerotica 24 horas despues de inyecciones IV o IVT de (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11 y vehfculo (n = 2 ojos por grupo) en condiciones de uveitis inducida por endotoxina (EIU). La inhibicion de la fosforilacion de c-Jun mediante el (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11 se visualizo en (A) inmunoelectrotransferencia (pista superior: fosfo c-Jun (Ser63); pista inferior: protefna indicadora de p-tubulina; y se confirmo mediante (B) cuantificacion densitometrica.

Efectos de la SEQ ID N°: 11 en la activacion de la via LPS-ERK:

Se llevo a cabo una inmunohistoqufmica contra fosfo p44/42 MAPK (Erk1/2) (verde) en secciones hidrologicas oculares de ojos de control uvefticos no tratados y animales sometidos a inyeccion IV o IVT (vehfculo o SEQ ID N°: 11) (n = 3 ojos analizados por cada estado; punto temporal: 24 h). Los nucleos (en azul) se tineron con DAPI. El p-Erk1/2 se expresaba fuertemente en el epitelio del iris despues de administracion IVT de vehfculo (A, a) y SEQ ID N°: 11 (B, b), sin ninguna diferencia detectable entre ambas. Unicamente se pudo detectar una ligera senal positiva en celulas gliales de Muller retinales en ojos EIU tratados mediante inyeccion IV del vehfculo (E, e) o de la SEQ ID N°: 11 (F, f) (veanse las flechas). Barra de escala: 100 pm. c: cornea; ir: iris; st: estroma; ep: epitelio; ONH: cabeza de nervio optico; INL: capa nuclear interior; ONL: capa nuclear exterior.

Biodistribucion ocular del (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11 en ojos sanos y uvefticos:

Se llevo a cabo una inmunohistoqufmica contra SEQ ID N°: 11 en secciones histologicas oculares de animales no tratados y animales sometidos a inyeccion IV o IVT (vehfculo o SEQ ID N°: 11) tanto en condiciones de salud (A-L) como en condiciones inflamatorias inducidas por LPS (M-W) (n = 3 ojos analizados por condicion; punto temporal: 24 h). (A-C) La SEQ ID N°: 11 era indetectable en tejidos oculares 24 horas despues de inyeccion IV en ojos sanos. (D-L) Despues de inyeccion IVT en ojos sanos, se detecto SEQ ID N°: 11 en epitelio de iris (D-G), epitelio del cuerpo ciliar (E, J), GCL (H), INL (K), IS (I) y RPE (L). En ojos con uveitis, la SEQ iD N°: 11 se detecto infiltrando celulas inflamatorias despues de inyeccion IV de SEQ ID N°: 11 (M-P), pero no despues de inyecciones IV o IVT de vehfculo (no mostrado) o en ojos con EIU no tratados (V, W). (Q-U) En ojos uvefticos tratados mediante IVT de SEQ ID N°: 11, la distribucion de la SEQ ID N°: 11 era similar a la de los ojos tratados sanos, pero tambien se detecto en celulas inflamatorias residentes migratorias (S-T). Barra de escala: 50 pm. c: cornea; ir: iris; l: cristalino; cb: cuerpo ciliar; st: estroma; ep: epitelio; GCL: capa celular ganglionar; INL: capa nuclear interior; ONL: capa nuclear exterior; RPE: epitelio pigmentario retinal; IS: segmento interior de fotorreceptores; aq. h: humor acuoso.

Reduccion de la infiltracion celular inflamatoria inducida por LP mediante el (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11:

La infiltracion de (A) macrofagos (celulas ED1 inmunopositivas) y (B) leucocitos polimorfonucleares (PMN) se cuantifico en secciones histologicas (n = 6 secciones por grupo) tenidas mediante inmunohistoqufmica (ilustradas en la Figura 6). (A) Las inyecciones intravenosas (IV) (**p < 0,005 frente a LPS) e intravftreas (IVT) (**p < 0,005 frente a LPS; ## p < 0,009 frente a vehfculo) del (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11 redujeron la cantidad de ED1+. (B) El (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11 disminuyo la cantidad de PMN despues de administraciones intravenosas (IV) (**p < 0,005 frente a LPS) e intravftreas (IVT) (**p < 0,005 frente a LPS; ## p < 0,009 frente a vehfculo). No se observo ninguna diferencia estadfstica (ns) entre la inyeccion IVT del (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11 y la dexametasona utilizada como control positivo.

Efecto del (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11 en la expresion de celulas ED1+, leucocitos polimorfonucleares y oxido nftrico sintasa inducible (iNOS) en uveitis inducida por LPS:

La expresion de antfgenos de ED1 e iNOS se analizo mediante inmunoqufmica en criosecciones oculares de ratas uvefticas no tratadas o tratadas (IV o IVT, vehfculo o SEQ ID N°: 11 (n = 3 ojos por condicion; punto temporal: 24 h). Los nucleos se tineron con DAPI. Numerosas celulas inflamatorias que expresaban ED1 (A, D, G, J) y/o iNOS (B, E, H, K)

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Figura 15 Figura 16 Figura 17

infiltraron el segmento anterior (A-I) y el segmento posterior (J-L) de ojos con EIU no tratados. En el iris/cuerpo ciliar se encontro una pequena cantidad de celulas ED1+/iNOS+ (celulas amarillas, paneles c1-2 y f1-2) pero la mayor parte de las celulas iNOS+ eran celulas ED, lo que sugiere que principalmente los PMN producfan iNOS. Las inyecciones IV (M-U) e IVT (no mostrada) de SEQ ID N°: 11 redujeron el infiltrado inflamatorio que expresaba ED1 (M, P, S) e iNOS (N, Q, T). En ojos tratados mediante IV (M-U) e IVT (no mostrado) de la SEQ iD N°: 11 se observo una cantidad reducida de celulas ED1+ (M, P, S) y celulas iNOS+ (N, Q, T). Barra de escala: 50 pm. c: cornea; ir: iris; cb: cuerpo ciliar; ret: retina; ON: nervio optico.

Disminucion de la expresion de iNOS inducida por LPS mediante el (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11:

Analisis RT-PCR de niveles de ARNm de oxido nftrico sintasa inducible (iNOS) en neurorretinas 24 horas despues de inyecciones IV o IVT de la SEQ ID N°: 11 o vehfculo (n = 2 ojos por grupo) en condiciones de EIU. La disminucion de ARNm de iNOS se visualizo en (A) gel de agarosa bajo transiluminador ultravioleta (pista superior: producto de amplificacion de ADNc iNOS 657 bp; pista inferior: producto de amplificacion de ADNc GAPDH 162 bp) y se confirmo mediante (B) cuantificacion densitometrica.

Modulacion de perfiles de quimioquina/citoquina intraocular inducida por LPS despues de administracion intravenosa (IV) del (poli)peptido de SEQ ID N°: 11:

Se llevo a cabo un analisis multiplex en fluidos oculares recogidos 6 h, 24 h y 48 h despues de la induccion de EIU. Se realizo una comparacion entre ratas uvefticas de control no sometidas a inyeccion o ratas tratadas por IV con el (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11 (n = 10 ojos analizados por punto temporal y por condicion). Los resultados de ratas tratadas por inyeccion IV de vehfculo no se han representado para una mayor claridad. Los valores P de analisis estadfsticos estan indicados en cada grafico (p). La inyeccion iv del (poli)peptido de SEQ ID N°: 11 disminuyo la produccion de quimioquinas (A) y redujo la produccion de citoquinas proinflamatorias y Th1 en puntos temporales especfficos (B). Los niveles de IFN-y e IL-10 no se han representado a 48 h porque estaban por debajo de los niveles detectables.

Modulacion de perfiles de quimioquina/citoquina intraocular inducida por LPS despues de administracion intravftrea (IVT) del (poli)peptido de SEQ ID N°: 11:

Se llevo a cabo un analisis multiplex en fluidos oculares recogidos 6 h, 24 h y 48 h despues de la induccion de EIU. Se realizo una comparacion entre ratas tratadas mediante inyeccion ivt del vehfculo y el (poli)peptido de la SEQ ID N°: 11 (n = 10 ojos analizados por punto temporal y por condicion). Los valores P de analisis estadfsticos estan indicados en cada grafico (p). No se observo ningun cambio significativo en la expresion de quimioquinas entre inyecciones ivt de vehfculo o inyecciones ivt de SEQ ID N°: 11, excepto una disminucion de MCP-1 (A). La inyeccion ivt del (poli)peptido de SEQ ID N°: 11 indujo pocos cambios en la expresion de citoquinas: niveles menores de TNF-a, IL-6 e IL-2 a las 6 horas, un nivel menor de IL-2 y un nivel mayor de IL-13 a las 24 horas (B).

Muestra la secuencia de ADNc de IB1 de rata y su secuencia de aminoacido prevista (SEQ ID N°: 102).

Muestra la secuencia de protefnas IB1 de rata codificada por el lfmite exon-intron del donante de empalme genico rIB1 (SEQ ID N°: 103).

Muestra la secuencia de protefnas IB1 de Homo sapiens (SEQ ID N°: 104).

Muestra la secuencia de ADNc de IB1 de Homo sapiens (SEQ ID N°: 105).

Muestra la puntuacion clfnica mediante lampara de hendidura 24 horas despues de la induccion de EIU y administracion subconjuntival del peptido de la SEQ ID N°: 11. Media + SD. **p < 0,01 frente a vehfculo.

Muestra la cantidad de celulas de PMN infiltrados 24 horas despues de la induccion de EIU y administracion subconjuntival de la SEQ ID N°: 11 (1,8 pg). Media + SD.

Muestra el nivel de ARNm iNOS/GAPDH en retinas despues de administracion subconjuntival de un inhibidor de JNK de acuerdo con la SEQ ID N°: 11 (1,8 pg). Media + SD.

Muestra un analisis Western Blot de fosforilacion de c-Jun en RPE (epitelio pigmentario retinal) 24 horas despues de la administracion subconjuntival de 1,8 pg de un inhibidor de JNK de acuerdo con SEQ ID N°: 11. Los resultados se obtuvieron mediante cuantificacion densitometrica.

EJEMPLOS Ejemplo 1:

Soluciones y productos

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En Polypeptide Laboratories (Francia) se produjo un (poli)peptido inhibidor de JNK todo-D-retroinverso de SEQ ID N°: 11, que se purifico por cromatograffa liquida de alta resolucion (High Performance Liquid Chromatography - HPLC). Este compuesto se analizo en cuanto a su identidad mediante espectrometrfa de masas y en cuanto a su pureza mediante RP-HPLC (Polypeptide Laboratories, Francia). Una vez liofilizado, el polvo se guardo a 2-8°C. Un dfa antes del experimento, el polvo de (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 se disolvio bajo condiciones esteriles a una concentracion de 10 pM en solucion salina (NaCl 0,9%, VErsol®, Aguettant) en un vial de vidrio desactivado de National Scientific (NSC) (NSC-C4015-S1) y se guardo a 4°C hasta su uso.

Para cada experimento, una fraccion recien disuelta del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 se guardo a -20°C y su concentracion de confirmo mediante analisis por cromatograffa liquida de alta resolucion (HPLC).

Como control positivo para la actividad antiinflamatoria sobre EIU.10 se utilizo fosfato sodico de dexametasona 4 mg/ml (Soludecadron; Laboratoire Roussel, Paris, Francia).

Animales

Se emplearon ratas hembra de 7 semanas de edad con un peso de 175 g (Elevage Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) y manipularon de acuerdo con la Declaracion de la ARVO para el uso de animales en investigacion oftalmica y visual. Las ratas fueron anestesiadas con inyeccion intramuscular de ketamina (88 mg/kg) (Virbac, Francia) y Largactil (0,6 mg/kg) (Sanofi-Aventis, Francia) antes de una inyeccion intravenosa u ocular.

Inyecciones

Para la inyeccion intravenosa (iv), 100 ml de solucion salina (NaCl 0,9%) o del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 (20 mg/kg en solucion salina) se inyectaron en una vena caudal utilizando una aguja 25G conectada con una jeringuilla de 1 ml (Becton Dickinson, Francia). Para la inyeccion intravftrea (ivt), 5 ml de solucion salina o del (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11 (0,2 mg/inyeccion en solucion salina) se inyectaron en ambos ojos utilizando una aguja desechable 30G (jeringuilla BD-microfine, nm Medical, Asniere, Francia). La dosis iv de 20 pg/kg (es decir, 3,5 pg/rata en ratas con un peso de 175 g) se eligio de acuerdo con estudios que muestran que el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 es activo cono dosis muy bajas en otros modelos. Para las inyecciones intravftreas, los inventores utilizaron la dosis minima empleada en la administracion directa en el ofdo despues de un trauma acustico agudo en pacientes. Esto corresponde a un 5% de la dosis inyectada via intravenosa. Inmediatamente despues del tratamiento intravenoso o intravftreo, se indujo una uveitis inducida por endotoxina (EIU) mediante una inyeccion simple en la planta de la pata de 100 pl de solucion salina esteril libre de pirogenos que contenfa 200 pg de LPS (lipopolisacaridos de Salmonella typhimurium, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia). Al final de los experimentos, es decir, 6, 24 o 48 horas despues de la provocacion con LPS, las ratas fueron anestesiadas mediante inyeccion intraperitoneal de pentobarbital (30 mg/kg) (Sanofi-Aventis, Francia) antes de extraerles sangre mediante puncion intracardfaca. Las ratas fueron sacrificadas con una dosis letal de pentobarbital y ambos ojos fueron enucleados.

Toma de muestras

En primer lugar se tomaron y reunieron humores acuosos y vftreos de cada ojo enucleado. Los fluidos oculares se centrifugaron inmediatamente y las fracciones libres de celulas se recogieron y congelaron a - 20°C antes de su analisis mediante ensayo Multiplex. Las muestras de sangre se coagularon primero a temperatura ambiente durante 2 horas y despues a 4°C durante la noche. El suero se recogio y se centrifugo y el sobrenadante claro se recogio y se congelo a -20°C antes del analisis Multiplex.

A los ojos enucleados se les diseccionaron cuidadosamente retinas y complejos de RPE/coroides/esclerotica, que se sometieron a congelacion instantanea y se guardaron a -80°C hasta su utilizacion para analisis RT- PCR y Western-Blot.

Para la inmunohistoqufmica se tomaron globos oculares y se fijaron durante 1 hora a temperatura ambiente en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contenfa un 4% de paraformaldehfdo antes de enjuagarlos durante la noche en PBS. El dfa siguiente, las muestras se incorporaron y congelaron en compuesto de temperatura optima de corte (OCT) (Tissue-Tek®, Sakura Finetek, Zoeterwoude, Holanda) y se guardaron a -80°C. Despues se realizaron secciones anteroposteriores congeladas de ojos (10 pm de espesor) a nivel del nervio optico utilizando un criostato (Leica CM 3050S, Rueil-Malmaison, Francia) y se montaron sobre portaobjetos super-frost para analisis inmunohistoqufmico.

Diseno experimental

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En un primer paso del experimento 70 ratas se distribuyeron aleatoriamente en 14 grupos experimentales con 5 ratas por grupo. A cada grupo se le indujo una uveitis y las ratas fueron sacrificadas 6 horas (4 grupos), 24 horas (6 grupos) y 48 horas (4 grupos) despues de una provocacion con LPS. Para cada momento analizado (es decir, a las 6 horas, 24 horas y 48 horas), las ratas tratadas mediante inyeccion intravenosa o intravitrea de vehiculo (NaCl 0,9%) o del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 se compararon con ratas uveiticas de control no tratadas. A las 24 horas se utilizaron dos grupos adicionales tratados mediante inyeccion intravenosa de vehiculo e inyeccion intravitrea de dexametasona. La inflamacion ocular clfnica se registro unicamente a las 24 horas (vease la seccion Puntuacion de Uveitis Inducida por Endotoxina (EIU)). En cada momento se utilizaron fluidos intraoculares de cada ojo (n = 10 por grupo) y suero de cada animal (n = 5 por grupo) para Ensayo Multiplex de Quimioquina/Citoquina.

Tambien se recogieron retinas y complejos de RPE/coroides/esclerotica a las 24 horas para analizar los niveles de iNOS y ARNm mediante RT-PCR y el estado de fosforilacion de c-Jun mediante Western-Blot. Solo se recogieron tejidos de ojos tratados por inyeccion iv (intravenosa) de vehiculo, inyeccion iv del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11, inyeccion ivt (intravitrea) de vehiculo e inyeccion ivt del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 (n = 2 ojos por condicion tomados de ratas diferentes). Los ojos se seleccionaron de modo que su puntuacion clfnica de EIU fuera representativa de la media del grupo experimental al que pertenecfan, es decir, 3 en el caso de los ojos tratados mediante inyeccion iv e ivt de vehiculo y 2 en el caso de los ojos tratados mediante inyeccion iv o ivt del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11.

Un segundo grupo de experimentacion se diseno para evaluar el efecto antiinflamatorio del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 a nivel celular y tisular, asf como la biodistribucion de esta molecula 24 horas despues de su administracion. Las ratas se distribuyeron de forma aleatoria en 11 grupos experimentales. Seis grupos de ratas con uveitis: ratas uveiticas no tratadas, ratas sometidas a inyeccion intravenosa de NaCl o el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 y ratas sometidas a inyeccion intravitrea de vehiculo, el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 o dexametasona. Los 5 grupos adicionales sin uveitis eran: ratas sanas no tratadas, ratas tratadas con NaCl iv o el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 IV y ratas sometidas a inyeccion ivt de NaCl o el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11. En cada grupo se tomaron tres ojos de ratas diferentes y se utilizaron para inmunohistoqufmica.

Se ha de senalar que para los analisis clfnicos e histologicos se utilizo dexametasona como tratamiento de referencia.

Puntuacion de uveitis inducida por endotoxina (EIU)

Los animales fueron examinados con una lampara de ranura a las 24 horas, el pico clfnico de la enfermedad en nuestros experimentos. La intensidad de la inflamacion ocular clfnica se puntuo en una escala del 0 al 5 para cada ojo tal como se ha descrito anteriormente 10: el grado (0) indica sin inflamacion; el grado (1) indica la presencia de una vasodilatacion minima del iris y la conjuntiva, pero sin observacion de manchas o celulas en la camara anterior (AC); el grado (2) indica la presencia de una vasodilatacion moderada del iris y la conjuntiva, pero sin manchas o celulas evidentes en la AC; el grado (3) indica la presencia de una vasodilatacion intensa del iris, manchas y menos de 10 celulas por campo de lampara de hendidura en el AC; el grado (4) indica la presencia de signos clfnicos mas graves que los del grado 3, con mas de 10 celulas en la AC con o sin formacion de un hipopion; el grado (5) indica la presencia de una reaccion inflamatoria intensa, formacion de fibrina en la AC y aislamiento total de la pupila. La evaluacion clfnica se llevo a cabo de forma enmascarada.

Analisis Western-Blot

Se sometieron a congelacion instantanea complejos de RPE/coroides/esclerotica y neurorretinas (2 por grupo experimental) inmediatamente despues de la diseccion y se guardaron a -80°C hasta su utilizacion. Los tejidos se homogeneizaron en 500 pl de tampon de lisis (MOPS SDS Running Buffer, Invitrogen, Cergy- Pontoise, Francia) complementado con coctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Meylan, Francia) (una tableta para 50 ml). Despues de anadir LDS Sample Buffer (Invitrogen) y calentar durante 5 minutos a 100°C, unas cantidades iguales de protefnas se sometieron a electroforesis en un gel NuPAGE 4-12% Bis- Tris (Invitrogen) utilizando MOPS SDS Running Buffer. Las bandas obtenidas se electrotransfirieron despues sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell II BioScience, Dassel, Alemania).

Se llevaron a cabo analisis Western-blot para analizar el efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en las tres vfas de la protefna quinasa activada por mitogeno (MAPK). Para analizar la via JNK se incubaron secuencialmente transferencias con un anticuerpo primario fosfo-c-Jun (Ser63) de conejo (o anticuerpo fosfo-c-Jun (Ser73)) y un anticuerpo secundario unido a IgG HRP anticonejo de acuerdo con las

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instrucciones del fabricante (PhosphoPlus c-Jun (Ser63) II y c-Jun (Ser73) antibody kit (9260) comprado en Cell Signaling Technology (Ozyme, St Quentin Yvelines, Francia)). Las bandas se visualizaron utilizando el ECL Western Blotting Detection Reagents Kit (Amersham Biosciences, Orsay, Francia). Despues, las transferencias se deshibridaron y se rehibridaron sucesivamente con un anticuerpo primario (D-10) (sc-5274) antitubulina de raton (dilucion 1:400) y un anticuerpo secundario de IgG antirraton de cabra conjugado con HRP (sc-3697) (dilucion 1:5000) (ambos adquiridos en Santa Cruz Biotechnology (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines Cedex, Francia)). La intensidad de banda relativa para fosfo c-Jun (Ser 63 o Ser73) se calculo en comparacion con la correspondiente a la tubulina despues de analisis de densitometrfa (ImageJ software).

Para analizar las vfas ERK y p38 MAPK, se incubaron secuencialmente transferencias con un anticuerpo primario de conejo fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (4370) (o anticuerpo de conejo fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (9215)) y un anticuerpo secundario de IgG (H+L) anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa de rabano (PI-1000 - Vector Laboratories, Clinisciences, Montrouge, Francia) en una dilucion 1:5000. Despues, las transferencias se deshibridaron y se rehibridaron sucesivamente con un p44/42 MAPK (Erk1/2) (4695) de conejo (o anticuerpo p38 MAP Kinase (9212) de conejo) y el mismo anticuerpo secundario que mas arriba. Los anticuerpos primarios se adquirieron en Cell Signaling Technology (Ozyme, St Quentin Yvelines, Francia) y todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante.

Inmunohistoqufmica

Para caracterizar el infiltrado celular, las secciones se sometieron a doble tincion con ED1 e iNOS. En pocas palabras, despues de una permeabilizacion con un 0,1% de TritonX-100 en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos, los especfmenes se aclararon y saturaron durante 30 minutos con leche desnatada al 5% en PBS. Despues se incubaron durante la noche a 4°C con los dos siguientes anticuerpos primarios: una antimacrosialina CD68 monoclonal de raton 1:50 (clon ED1), dirigida contra un antfgeno citoplasmico en monocitos de rata, macrofagos y celulas dendrfticas (adquiridas en Serotec Ltd. (Oxford, UK)) y un anti-iNOS de conejo policlonal (1/75e; Transduction Laboratories, Lexinton, FY). Despues del lavado, las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal (mAb) secundario antirraton de burro conjugado (rojo) Alexa Fluor 594 y un mAb secundario anticonejo de cabra conjugado (verde) Alexa Fluor 488, cada uno en una dilucion 1:250 (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia). Para cada paso, los anticuerpos se diluyeron en leche desnatada al 1% TritonX100. En cada serie de tinciones se incluyeron diferentes controles: controles negativos sin anticuerpos primarios y controles de isotipo mediante incubacion con inmunoglobulina (Ig) de suero de raton o conejo normal en lugar de anticuerpos primarios. Despues de tenir los nucleos con DAPI (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia), las secciones se montaron en PBS/glicerol (1/1) y se observaron mediante fotomicroscopfa de fluorescencia (FXA, Microphot, Nikon, Melville, USA). Se obtuvieron micrograffas digitalizadas utilizando una camara digital (Spot, BFI Optilas, Evry, Francia). Las celulas positivas ED1 y las celulas polimorfonucleares, identificadas por la forma de sus nucleos tenidos con DAPI, se cuantificaron en secciones histologicas. El analisis se llevo a cabo en 3 ojos por grupo experimental, con 2 secciones diferentes por ojo a nivel de la cabeza del nervio optico. Los resultados se expresaron como la media + error estandar de la media (SEM).

Tambien se llevo a cabo una inmunotincion del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en ojos sanos y uvefticos para estudiar su biodistribucion ocular despues de una administracion sistemica o local. En pocas palabras, las secciones se permeabilizaron tal como se describe mas arriba antes de incubarlas secuencialmente con una IgG de raton purificada anti-SEQ ID N°: 11 y una IgG secundaria anticonejo de cabra conjugada (rojo) Alexa 594 (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) diluida 1:100 y 1:250 en PBS respectivamente. La inmunotincion de ojos no tratados sanos y uvefticos se utilizo como control negativo. Los nucleos se tineron con DAPI antes del montaje y la observacion.

La inmunotincion de p-Erk1/2 se llevo a cabo para evaluar el efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en la via ERK despues de administracion iv o ivt. Las secciones se permeabilizaron tal como se describe mas arriba y se incubaron en solucion de bloqueo que contenfa un 0,1% de Triton X-100 y un 10% de FCS (fetal calf serum - suero bovino fetal) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron a lo largo de la noche a 4°C con anticuerpo primario anti-fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) de conejo (4370) adquirido en Cell Signaling Technology (Ozyme, St Quentin Yvelines, Francia) y diluido 1:400 en solucion de bloqueo. Despues de aclararlas tres veces en PBS, las secciones se incubaron con un mAb secundario anticonejo de cabra conjugado (verde) Alexa Fluor 488 (diluido 1:300 en solucion de bloqueo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los nucleos se tineron con DAPI antes del montaje y observacion.

Evaluacion de la expresion de iNOS en tejidos oculares utilizando PCR semicuantitativa

Para este analisis se utilizaron dos ojos por grupo. Inmediatamente despues de la diseccion, las retinas extrafdas de cada ojo se sometieron a congelacion instantanea por separado y se guardaron a -80°C hasta su uso. Despues se extrajo ARN total de tejidos (RNeasy minikit, Qiagen, Courtaboeuf, Francia) de acuerdo

con las instrucciones del fabricante. Se llevo a cabo una transcripcion inversa en 1 pg de ARN total en un volumen total de 20 pl utilizando Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para amplificar GApDH y ADNc iNOS, se llevo a cabo una reaccion en cadena de polimerasa (PCR) en un volumen total de 25 pl que contenfa 2 pl de producto de 5 reaccion de primera cadena, 0,4 pM cebador directo y 0,4 pM cebadores inversos, 0,4 pM dNTP Mix, 1,5 mM MgCl2, 1X tampon PCR y 2,5 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia). Los cebadores espedficos para GAPDH (directo: 5'-ATGCCCCCATGTTTGTGATG-3'; inverso: 5'-AT-

GGCATGGACTGTGGTCAT-3') e iNOS (directo: 5'-TTTCTCTTCAAAGTCAAATCCTACCA-3'; inverso: 5'- TGT- GTCTGCAGATGTGCTGAAAC-3') se obtuvieron de Invitrogen. Despues de una desnaturalizacion 10 inicial (3 minutos a 94°C) se llevaron a cabo de 30 a 32 ciclos de PCR de desnaturalizacion (30 s, 94°C), apareamiento (1 min, 58°C (GAPDH) y 52°C (iNOS)) y alargamiento (1 a 2 min, 72°C) en un Crocodile III (Appligene Oncor). El ciclo final se completo mediante 5 minutos de alargamiento a 72°C. Los fragmentos de PCR (162 bp para GAPDH y 657 bp para iNOS) se analizaron mediante electroforesis en 2,5% gel de agarosa y se visualizaron mediante tincion con bromuro de etidio bajo luz UV. La intensidad de banda relativa 15 para iNOS se calculo en comparacion con la de GAPDH despues de analisis de densitometrfa (ImageJ software).

Ensayo multiplex de quimioquina/citoquina

Se sometieron a analisis de perlas multiplex fluidos intraoculares (diluidos para obtener un volumen final de 25 pl) y suero (25 pl de dilucion 1:5). Este metodo utiliza microesferas como soporte solido para 20 inmunoensayos 12 y permite la titulacion de una mayor cantidad de citoquinas con sensibilidad aumentada que lo que ocurre en el caso del ELISA 13. Para cada muestra se cuantificaron simultaneamente diecisiete analitos utilizando el kit Cytokine/Chemokine-17plex de rata (Milliplex Map Kit, Millipore, Saint-Quentin-en- Yvelines, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante: quimioquinas MCP-1/CCL2, MIP-1a/CCL3, RANTES/CCL5, IP-10/CXCL10 (protefna-10 inducible por IFN) y GRO/KC; mediadores proinflamatorios IL-1, 25 IL-18 y TNF-Th1/Th2/Th17 citoquinas IL-2 e IFN- / IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 / IL-17. El ensayo se llevo a cabo en una placa de filtro de 96 pocillos y se generaron curvas estandar para cada citoquina con un Rat Cytokine Standard suministrado en el kit. Todos los pasos de incubacion se llevaron a cabo bajo agitacion orbital media y en la oscuridad para proteger las perlas de la luz. La adquisicion y analisis de datos se llevo a cabo con el manager software version 4.1 (Bioplex; Bio-Rad) con cuatro o cinco parametros logfsticos para 30 curvas estandar. Los umbrales de deteccion para los tres analitos se estimaron alrededor de 1 a 10 pg/ml.

Analisis estadfsticos

Los resultados numericos se expresaron como la media + error estandar de la media (SEM). Los datos se compararon utilizando el Mann-Whitney U-test no parametrico. P < 0,05 se considero estadfsticamente significativo.

35 Resultados

El (poli)peptido inhibidor de JNK todo-D-retroinverso de SEQ ID N°: 11 redujo significativamente la uveitis inducida por endotoxinas (EIU). El (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 redujo significativamente las puntuaciones clinicas de EIU despues de una inyeccion intravenosa (IV) de 20 pg/kg (2,0 + 0,1) en comparacion con ojos uveiticos no tratados (3,2 + 0,1, p < 0,001) y vehiculo IV (3,2 + 0,1, p < 0,001) (Figura 40 1A). De modo similar, las puntuaciones clinicas disminuyeron significativamente despues de administracion

intravftrea de 0,2 pg/inyeccion del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 (2,2 + 0,2) en comparacion con ojos uveiticos no tratados (3,2 + 0,1, p < 0,001) y vehiculo IVT (3,0 + 0,1, p < 0,01) (Figura 1B). El efecto de la inyeccion ivt del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en los signos clfnicos de la EIU no era estadfsticamente diferente del observado despues de ivt de dexametasona (1,8 + 0,4), lo que sugerfa que el 45 (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 era tan eficiente como la dexametasona para la reduccion de la EIU cuando se administra en este punto temporal (Figura 1B).

Eficacia del (poli)peptido de SEQ ID N°: 11 resultante de la inhibicion de la via de JNK

Para determinar si el efecto clfnico del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 estaba relacionado con su modo de accion, es decir, su capacidad para interferir con la senalizacion de JNK 6, se analizo el 50 estado de fosforilacion de c-Jun en tejidos oculares mediante Western-Blot. La fosforilacion de c-Jun en

residuos Ser63 (Figura 2A) y Ser73 se redujo en extractos de RPE/coroides 24 horas despues de la inyeccion intravenosa o intravftrea del (poli)peptido inhibidor de JNK de la SEQ ID N°: 11. En la neuorretina, el fosfo c- Jun solo se pudo detectar debilmente. En RPE/coroides se pudo observar una disminucion aproximadamente a una tercera parte de la fosforilacion de c-Jun despues de administracion iv (0,28 + 0,01 frente a 0,77 + 0,26 55 en iv de vehiculo) o ivt (0,35 + 0,08 frente a 0,79 + 0,25 en ivt de vehiculo) del (poli)peptido inhibidor de JNK

de SEQ ID N°: 11 (Figura 2B). La capacidad del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 para

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bloquear la actividad de quinasas c-jun NH2-terminales (JNK) en los tejidos oculares demostro la actividad intraocular espedfica del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11.

Para determinar si el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 podna tener algun efecto en las otras vfas MAPK se evaluo el estado de fosforilacion de Erk1/2 y p38. Mientras que se detectaron Erk1/2 y p38 en complejos de RPE/coroides en niveles similares en todos los grupos, la fosforilacion de estos dos MAPK no se pudo detectar mediante analisis western-blot (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que la JNK es la via de MAPK predominantemente activada en RPE/coroides durante EIU. Utilizando analisis histoqmmicos, realizados sin ninguna amplificacion de senal, hemos descubierto una senal de p-Erk1/2 intensa en celulas inflamatorias que se infiltran en los segmentos anterior y posterior del ojo en los ojos tratados con LPS de control y solucion salina (Figuras 3C, 3D). El efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 administrado via intravenosa o intravttrea no pudo ser evaluado en esas celulas, ya que la infiltracion practicamente no existfa en los ojos tratados. Sin embargo, en la neurorretina, en la que se pudo detectar p-Erk1/2 localizado en celulas gliales Muller retinales (RMG) en los ojos de control y tratados con solucion salina (Figura 3E), no se observo ningun efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 administrado por cualquiera de las dos vfas (Figura 3F). De forma interesante, en el iris se observo una senal de p-Erk1/2 intensa en el epitelio de los ojos sometidos a inyeccion de control y de solucion salina (Figura 3A) sin ningun efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 tratado en la senal de p-Erk1/2 en estas celulas (Figura 3B), lo que sugiere rotundamente que el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 no parece actuar directamente sobre la fosforilacion de p-Erk1/2 durante EIU en nuestro modelo, al menos en celulas residentes.

Distribucion diferencial del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en tejidos oculares despues de administraciones iv e ivt

Se llevo a cabo una inmunohistoqmmica en secciones histologicas para evaluar la biodistribucion del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en tejidos oculares 24 horas despues de administracion sistemica (iv) o local (ivt) tanto en ojos sanos como en condiciones uvefticas (Figura 4). No se observo ninguna infiltracion de celulas inflamatorias en ojos sanos despues de iv o ivt del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 ni despues del vehfculo. En los ojos de control no tratados y en los ojos tratados con vehfculo no se detecto ninguna inmunorreactividad contra el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11, lo que demostraba la especificidad de la senal observada en los ojos tratados con el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11. Mientras que no se observo ninguna senal en ojos normales despues de inyeccion sistemica (iv) (Figura 4 A-C) con la dosis utilizada, el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 estaba distribuido practicamente en todos los tejidos oculares de ratas normales despues de administracion ivt (Figura 4 D-L). De forma interesante, una acumulacion del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 se detecto principalmente en el iris/epitelio del cuerpo ciliar (paneles G y J) y en el epitelio pigmentario retinal (panel L). La penetracion del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 tambien se detecto en el estroma del iris (panel G) y en la retina neural en la capa celular ganglionar (GCL, panel H), la capa nuclear interior (INL, panel K) y el segmento interior (IS, panel I) de celulas fotorreceptoras (PR). En todos los tipos de celulas, el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 se acumulaba dentro del citoplasma. En el endotelio de la cornea y en la capsula del cristalino se observo una tincion ocasional.

En condiciones uvefticas, la tincion con (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 no se detecto en tejidos oculares ni en celulas inflamatorias de infiltracion de ojos no tratados (Figura 4, paneles V-W). La iv o ivt de vehfculo dio resultados similares a los obtenidos con ojos no tratados. En ojos con EIU tratados mediante inyeccion de (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11, no se detecto en tejidos oculares, pero ocasionalmente habfa celulas inflamatorias de infiltracion inmunopositivas en el iris (panel O) y en el humor acuosos (panel P) En ojos uvetticos tratados mediante inyeccion ivt, el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 se hallaba en su mayor parte en tejidos oculares como en los ojos sanos y en celulas residentes que se movilizan y participan activamente en los procesos inflamatorios de condiciones patologicas tales como celulas microgliales (paneles S-T).

La administracion de (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 produjo una reduccion significativa de la infiltracion de celulas en los tejidos oculares

Para caracterizar adicionalmente el efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en la uveitis, las celulas inflamatorias infiltradas se cuantificaron en tejidos oculares (Figura 5) mediante numeracion en secciones histologicas inmunotenidas con anticuerpos ED1 e iNOS (Figura 6). Veinticuatro horas despues de la provocacion con LPS, la cantidad de celulas positivas ED1 habfa disminuido significativamente en ojos tratados con inyeccion iv del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 (137 + 7) (Figura 5A, Figura 6M, P, S) en comparacion con los ojos uvefticos (LPS) no tratados (187 + 13, p < 0,005) (Figura 5A, Figura 6A, D, G, J) o los ojos sometidos a inyeccion de vehfculo. Similarmente, la ivt del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 redujo significativamente la infiltracion de celulas positivas ED1 (93 + 8) en comparacion con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

los ojos sometidos a inyeccion ivt de vehfculo (175 + 15, p < 0,009) y los ojos uvefticos no tratados (p < 0,005) (Figura 5A).El efecto reductor del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en la infiltracion de celulas positivas ED1 (93 + 8) no diferfa del inducido por dexametasona (79 + 15), lo que sugiere que los dos tratamientos tienen una eficacia similar en relacion con este parametro.

La cantidad de celulas polimorfonucleares (PMN) (Figura 5B) tambien se redujo significativamente 24 horas despues de la administracion iv del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 (60 + 6) en comparacion con los ojos de control (237 + 15, p < 0,005), y despues de la inyeccion ivt del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 (40 + 5) en comparacion con la inyeccion ivt del vehfculo (152 + 31, p < 0,009) y ojos uvefticos de control (p < 0,005). De nuevo, el efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en la infiltracion de tejido ocular PMN no diferfa significativamente del de la dexametasona (42 + 11).

El (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 reduce la expresion de iNOS.

Dado que la iNOS (oxido nftrico sintasa inducible) se ha descrito como un mediador clave en la patogenesis de la uveitis, 14, 15 el efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en su expresion se investigo tanto a nivel de protefna como a nivel de ARNm.

Tal como muestra la Figura 6, la cantidad de celulas positivas iNOS se redujo en ojos tratados con inyeccion del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 iv (Figura 6N, Q, T) o ivt en comparacion con los ojos de control (paneles B, E, H, K). Entre las celulas positivas iNOS observadas en ojos de control, una pequena cantidad eran ED1 + celulas, mientras que la mayor parte de ellas eran ED1, lo que sugiere que en su mayor parte los PMN producen iNOS (recuadros c. f. i). En ojos de las ratas tratadas con inhibidor de JNK, las unicas celulas que segufan expresando iNOS eran celulas positivas ED1 intratisulares localizadas en la rafz del cuerpo ciliar (recuadro r2).

El efecto del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en la expresion de iNOS se confirmo mediante RT-PCR en tejidos oculares (Figura 7). Los niveles de ARNm de iNOS disminuyeron de 1,02 + 0,21 a 0,40 + 0,11 despues de iv del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 y de 1,18 + 0,05 a 0,27 + 0,09 en ojos tratados mediante inyeccion itv. Tambien se realizaron comparaciones con iv o ivt de vehfculo, respectivamente.

Perfiles de quimioquina/citoquina en medios oculares de ojos tratados con el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11

Para evaluar el efecto del tratamiento en la produccion de mediadores proinflamatorios y antiinflamatorios se dosificaron quimioquinas y citoquinas mediante analisis multiplex en medios oculares (Figuras 8 y 9) y sueros.

Entre las 17 quimioquinas/citoquinas analizadas, algunas estaban por debajo de niveles detectables tanto en ojos de control como en ojos tratados: IP-10, IL-5, IL-17. Otras no diferfan en los ojos tratados frente a los ojos no tratados en ninguno de los puntos temporales analizados: IL-18, IL-4, IL-1U. En el suero, aunque algunas citoquinas tendfan a cambiar despues de la administracion IV del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 (reduccion de MIP-1 a e IL-2) o despues de ivt (reduccion de IL-2), esto no era estadfsticamente significativo. Para las otras quimioquinas/citoquinas, su perfil era diferente en fluidos oculares de ojos tratados con administracion iv del (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en comparacion con la administracion ivt. De hecho, cuando el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 se inyecto sistemicamente en el momento de la provocacion con lPs, indujo una reduccion significativa de MCP-1, MIP-1 a y RANTES a las 6 y las 24 horas (Figura 8A). El GRO/KC tambien se habfa reducido significativamente a las 6 horas. Las citoquinas Th1 tales como TNF-a, IL-6 e INF-y se reducfan significativamente en diferentes puntos temporales, mientras que la IL-10 tendfa a aumentar a las 6 horas en ojos tratados (pero no significativamente), lo que sugerfa un cambio hacia un perfil Th2 (Figura 8B). No se observo ninguna diferencia estadfstica entre ojos de ratas sometidas a inyeccion iv de vehfculo y ojos de control uvefticos no tratados.

Cuando se inyecto el (poli)peptido inhibidor de JNK de SEQ ID N°: 11 en el cuerpo vftreo en el momento de la provocacion con LPS, los perfiles de quimioquina/citoquina no son muy diferentes de los de ojos sometidos a inyeccion de vehfculo (Figura 9). Sin embargo, es interesante senalar que la ivt del vehfculo tenia un efecto marcado en el perfil de citoquina en comparacion con los ojos de control uvefticos no tratados. A las 6 horas se detecto una tendencia a una disminucion de MCP-1, TNF-a, IL-6, IL-2, y a las 24 horas se detecto una disminucion notable de IL2 y un aumento de IL-13, lo que sugerfa de nuevo un cambio hacia un perfil Th2.

Ejemplo 2:

Administracion subconjuntival de la SEQ ID N°: 11

Claims

REIVINDICACIONES
2.
3.

10
4.
5.

15
6.

20
7.

25 8.
9.

30 10.

35

(Poli)peptido quimerico que comprende un (poli)peptido inhibidor de JNK para su uso en el tratamiento de la uveftis, comprendiendo o consistiendo el (poli)peptido quimerico en toda la secuencia de D-aminoacidos de SEQ ID N°: 11, o en un fragmento o una variante de la misma que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90% con toda la secuencia de D-aminoacidos de SEQ ID N°: 11.

(Poli)peptido quimerico para su uso segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el (poli)peptido quimerico consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 11.

(Poli)peptido quimerico para su uso segun la reivindicacion 1 o 2 en el tratamiento de la uveftis anterior, intermedia o posterior.

(Poli)peptido quimerico para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el (poli)peptido inhibidor de JNK se une a quinasa c-jun amino terminal (JNK).

(Poli)peptido quimerico para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el (poli)peptido inhibidor de JNK inhibe la activacion de al menos un factor de transcripcion dirigido a JNK cuando el (poli)peptido inhibidor de JNK esta presente en una celula que expresa JNK, seleccionandose el factor de transcripcion dirigido a JNK preferentemente entre el grupo consistente en c-Jun, ATF2 y Elk1, y/o altera un efecto de JNK cuando el peptido esta presente en una celula que expresa JNK.

Composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de la uveftis que incluye un (poli)peptido quimerico que comprende o consiste en toda la secuencia de D-aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID N°: 11, o en un fragmento o una variante que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90% con toda la secuencia de D-aminoacidos de la SEQ ID N°: 11.

Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 6, que adicionalmente contiene un vetftculo, excipiente, tampon o estabilizador farmaceuticamente aceptable.

Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 7, caracterizada porque el vetftculo es un vetftculo ftquido, preferentemente una solucion salina isotonica o una solucion acuosa tamponada.

Composicion farmaceutica para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, estando prevista la composicion farmaceutica en el tratamiento de la uveftis anterior, intermedia o posterior.

Composicion farmaceutica para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, estando prevista la composicion farmaceutica para ser administrada por una via de administracion seleccionada entre el grupo consistente en vfas parenterales, incluyendo las vfas intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, transdermica; vfas enterales, incluyendo las vfas oral, rectal; vfas topicas, incluyendo las vfas nasal, intranasal; otras vfas, incluyendo vfas epidermicas o administracion con parches; y administracion local en el ojo, en particular administracion intravftrea, administracion subconjuntival y/o instilacion.