ES2575432T3 - Composición que comprende saponinas - Google Patents

Abstract

Composición que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas, caracterizada por que está sustancialmente libre de taninos, y por que las saponinas no han sido sometidas a lisis alcalina si el extracto de planta consiste en saponinas purificadas.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Composicion que comprende saponinas

[0001] La presente invencion se refiere a una composicion que comprende saponinas. Dicha composicion es particularmente util como enjuague bucal, principalmente en individuos que presentan una sequedad bucal. Del mismo modo es util para la higiene de la piel, de las mucosas, de las unas o del cabello, en el tratamiento de la sequedad cutanea y/o de la sequedad de las mucosas, y en el tratamiento de las micosis, en concreto cutaneas o genitales.

[0002] En la actualidad, los enjuagues bucales se utilizan como antisepticos bucales, como productos de uso regular en la higiene bucodental diaria, o en caso de operacion quirurgica o de infecciones bucodentales.

[0003] Los enjuagues bucales conocidos, denominados antisepticos, contienen diversos ingredientes, principalmente antisepticos de espectro amplio, detergentes de smtesis o principios activos que actuan frente a los smtomas de las infecciones o inflamaciones bucodentales. Los detergentes y los antisepticos, como por ejemplo el etanol, el fenol, la hexetidina, la clorhexidina y los amonios cuaternarios, inhiben el desarrollo o destruyen las bacterias de la biopelmula oral y las Candida, y principalmente C. albicans (Candida albicans), que es el mayor hongo patogeno de la biopelmula y a menudo se asocia con la boca seca. Dichos enjuagues bucales se utilizan tambien en caso de sequedad bucal.

[0004] Sin embargo, dichos enjuagues bucales antisepticos presentan grandes inconvenientes. En efecto, de manera sorprendente, gracias a dos estudios clmicos, las solicitantes han puesto de manifiesto que su uso regular es una causa de la sequedad bucal. Ahora bien, la sequedad bucal favorece las candidiasis orales y las caries dentales. Del mismo modo, las solicitantes han puesto de manifiesto una asociacion entre la sequedad bucal y la colonizacion de las protesis dentales por parte de los hongos.

[0005] Los enjuagues bucales antisepticos del estado de la tecnica unicamente son adecuados en indicaciones muy limitadas, en preoperatorios y posoperatorios, y en infecciones agudas de las mucosas. Por el contrario, no estan adaptados para un uso regular de duracion prolongada. Sin embargo, las solicitantes han puesto de manifiesto que su uso, el cual no debe superar nunca las dos semanas, es a menudo mucho mas largo, incluso diario sin limitacion de duracion. Un uso prolongado desequilibra la biopelmula, principalmente la biopelmula oral. En concreto, han observado un uso iatrogenico superior a las dos semanas en un 34 % de 90 enfermos cronicos (edad media 44 anos), y en un 27 % de 60 personas de edad avanzada hospitalizadas (edad media 85 anos). En concreto, las solicitantes han identificado que la relacion entre la sequedad bucal y los enjuagues bucales antisepticos conocidos proviene del hecho de que dichos enjuagues bucales contienen principios activos que destruyen al mismo tiempo las bacterias de la biopelmula bucodental sana y que alteran los polisacaridos de dicha biopelmula sana, comprendiendo glicoprotemas los polisacaridos. No obstante, dichos polisacaridos tienen la propiedad de fijar un gran numero de moleculas del agua, y garantizan la hidratacion y la viscosidad de la biopelmula.

[0006] Las solicitantes han identificado que los principios activos antimicrobianos utilizados en los enjuagues bucales son esencialmente etanol, taninos, amonios cuaternarios, biguanidas, aceites esenciales e iones bicarbonatos, solos o en combinacion.

[0007] Las solicitantes tambien concluyen a partir de dichos estudios que el fenomeno de la boca seca provocado por los enjuagues bucales antisepticos y otros medicamentos se autoalimenta a causa de dichos tratamientos. En efecto, la proliferacion de las Candida, favorecida por la falta de (proteo)glucanos fisiologicos, provoca una acidificacion del medio bucal. Las Candida producen entonces proteasas activas en medio acido, que hidrolizan la parte proteica de las mucinas y las protemas ricas en prolina de la salina y de la biopelmula oral. La proliferacion de las Candida provoca y mantiene una inflamacion de las mucosas con aumento de la permeabilidad de las mucosas a los medicamentos. En total, la asociacion entre enjuagues bucales antisepticos y candidiasis oral destruye las glicoprotemas de la biopelmula oral por un ataque simultaneo de los glucidos (antisepticos) y de las protemas (proteasas de las Candida).

[0008] Existen tratamientos antifungicos en caso de candidiasis oral, principalmente los polienos y los azoles. Sin embargo, las Candida desarrollan resistencia frente a dichos tratamientos.

[0009] Asimismo, no existe tratamiento antifungico que respete la biopelmula sana de la zona tratada y que no tenga un efecto secundario nocivo para la zona tratada.

[0010] El problema que la invencion se propone resolver consiste en obtener una composicion que no presente los inconvenientes asociados a los enjuagues bucales del estado de la tecnica, y en concreto que pueda usarse de manera regular y prolongada sin provocar sequedad bucal, que sea eficaz contra las candidiasis orales. Mas ampliamente, la invencion se propone proporcionar una nueva composicion que permita luchar contra el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

desarrollo de las candidiasis, en concreto orales, cutaneas y genitales, y/o contra la sequedad bucal en el marco de una higiene regular o de tratamientos farmaceuticos o dermatologicos prolongados, de poco coste.

[0011] La solucion propuesta de la invencion a este problema que se plantea tiene como primer objeto una composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y esta sustancialmente libre de taninos, no habiendo sido sometidas las saponinas a lisis alcalina si el extracto de planta consiste en saponinas purificadas.

[0012] De forma ventajosa, la composicion no comprende taninos; la composicion se presenta en forma de enjuague bucal, dentffrico, gel, crema, leche, polvos, locion, pulverizador, jabon o capsulas, y preferiblemente en forma de enjuague bucal.

[0013] La invencion tiene como segundo objeto el uso cosmetico de una composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y que no comprende sustancialmente taninos para la higiene bucal, de la piel, de las mucosas, de las unas y/o del cabello.

[0014] Asimismo, la invencion tiene como objeto una composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y que no comprende sustancialmente taninos, para su aplicacion como medicamento.

[0015] Asimismo, la invencion tiene como objeto una composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y que no comprende sustancialmente taninos, para su aplicacion como medicamento en el tratamiento de la sequedad cutaneas y/o de la sequedad de las mucosas, y en concreto de la sequedad bucal.

[0016] Asimismo, la invencion tiene como objeto una composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y que no comprende sustancialmente taninos, para su aplicacion como medicamento en el tratamiento de las micosis, en concreto de las micosis cutaneas, bucales o anogenitales.

[0017] Asimismo, la invencion tiene como objeto una composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y que no comprende sustancialmente taninos, para su aplicacion como medicamento en el tratamiento de las infecciones bucodentales, principalmente las caries, la periodontitis, la lengua negra vellosa y la halitosis relacionadas con la sequedad bucal.

[0018] Asimismo, la invencion tiene como objeto un procedimiento de obtencion de un extracto de plantas, preferiblemente solidagos (Solidago), comprendiendo dicho extracto saponinas y no comprendiendo sustancialmente taninos, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:

- extraccion de saponinas a partir de plantas, preferiblemente solidagos (Solidago); despues - eliminacion dirigida de los taninos.

[0019] De forma ventajosa, -la etapa de extraccion es una extraccion acuosa, etanolica, metanolica, una extraccion con cloroformo o incluso una extraccion con eter de petroleo; - la etapa de extraccion, en el caso de una extraccion etanolica, metanolica, con cloroformo o con eter de petroleo, viene seguida de una etapa de eliminacion del etanol, del metanol, del cloroformo o del eter de petroleo, por ejemplo por evaporacion; - la etapa de eliminacion dirigida de los taninos se lleva a cabo por precipitacion de los taninos en presencia de proternas, y preferiblemente en presencia de casema.

[0020] La invencion se entendera mejor con la lectura de la siguiente descripcion no limitante y de los dibujos que la acompanan, en los cuales:

- La figura 1 muestra una vista en microscopio de la cepa de referencia C. albicans 4872 en cultivo en agar; a la derecha, el cultivo ha estado en contacto con un extracto de planta que comprende saponinas segun la invencion; a la izquierda, el cultivo ha estado en contacto con un medio sin saponinas;

- La figura 2 muestra una vista en microscopio de la cepa silvestre C. albicans MG 001 en cultivo en agar; a la derecha, el cultivo ha estado en contacto con un extracto de planta que comprende saponinas segun la invencion; a la izquierda, el cultivo ha estado en contacto con un medio sin saponinas;

- La figura 3 muestra una vista en microscopio del efecto de diferentes extractos acuosos de solidagos que comprenden saponinas en la transformacion de las levaduras de la cepa C. albicans ATCC 10231r (forma rugosa); y

- La figura 4 muestra el efecto de diferentes extractos acuosos de solidagos que comprenden saponinas en el tamano de las colonias de C. albicans ATCC 10231r en cultivo en agar.

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

[0021] La composicion segun la invencion presenta las siguientes ventajas:

- tiene un efecto antifungico dirigido sobre las Candida, en concreto C. albicans (Candida albicans), al tiempo que conserva las bacterias de la biopelmula sana, principalmente de la boca, la piel y las mucosas anogenitales;

- crea in vivo un entorno desfavorable para el crecimiento de las Candida, sin erradicarlas pero manteniendolas en forma quiescente no virulenta;

- conserva los glucanos, las protemas y las glicoprotemas, principalmente en la boca y sobre las mucosas, por ejemplo de origen salival y bacteriano. Asf, estando conservadas las bacterias y las protemas y glicoprotemas de la biopelmula, se enfrentan ademas a la invasion de los tejidos causada por las Candida y las bacterias patogenas. Al crear un entorno desfavorable para el crecimiento de las Candida, la composicion favorece las bacterias endogenas, puesto que existe una competencia en la biopelmula mucosa entre las bacterias endogenas y las Candida;

- al conservar los glucanos y las glicoprotemas, reduce el desarrollo de la sequedad bucal, ya que los glucanos y las glicoprotemas contribuyen igualmente a la hidratacion y la viscosidad de la biopelmula, en la boca y sobre las mucosas;

- asimismo, tiene una accion reequilibrante en la biopelmula sana de la zona de aplicacion, principalmente la biopelmula oral, cutanea o urogenital;

- calma e hidrata las pieles sensibles y/o fragiles y no agrede a las pieles y mucosas inflamadas;

- en la boca, permite mantener una biopelmula de poco grosor, de menos de un mm de grosor, limitando de este modo las caries y las periodontitis, y permitiendo que sus principios activos accedan al conjunto de la biopelmula;

- se puede utilizar de forma regular y prolongada, sin efectos secundarios nocivos, gracias a su accion suave, dirigida y diferida sobre las Candida;

- es respetuosa con el medio ambiente puesto que preferiblemente no comprende ni conservantes ni colorantes, ni perfumes de smtesis y es biodegradable;

- no deja color en la zona tratada, principalmente la lengua, los dientes o las protesis tras una aplicacion bucal, y no altera el gusto del usuario tras una aplicacion bucal;

- preferiblemente no comprende terpenos volatiles contenidos en aceites esenciales, que son toxicos, y por tanto no lleva a riesgo alguno de confusion de ideas o de agitacion en los usuarios.

[0022] Los taninos son responsables de una precipitacion de las glicoprotemas de la biopelmula oral, en concreto de las protemas ricas en prolina. Sorprendentemente, las solicitantes han identificado que los taninos comprendidos en las composiciones del estado de la tecnica tienen un efecto agravante en la sensacion de boca seca, a consecuencia de su efecto en la biopelmula asociada a la boca seca. Asf, segun una caractenstica esencial, la composicion segun la invencion esta sustancialmente libre de taninos; es decir, no comprende taninos o solamente como trazas. Por ello, los taninos se eliminan de forma dirigida del extracto de planta. Asf, la ausencia de taninos parece desempenar un papel importante en las ventajas de las composiciones segun la invencion.

[0023] Segun otra caractenstica, la composicion segun la invencion comprende saponinas y, preferiblemente, un extracto de una planta solidago que las comprende.

[0024] Las saponinas, tambien denominadas saponosidos o glucosidos de saponina, constituyen un amplio grupo de heterosidos complejos que pertenecen a los terpenos cmlicos o a los esteroides. Una saponina procede de la combinacion qmmica de un azucar (glucido) y de un esteroide, de un esteroide alcaloide o de un triterpeno. Determinadas composiciones de la tecnica anterior comprenden saponinas esteroideas o triterpenicas. En el marco de la invencion, las saponinas son preferiblemente no esteroideas.

[0025] Dotadas de propiedades tensioactivas, las saponinas forman espuma en sus soluciones y sirven de detergente, por ejemplo de jabones vegetales. Asimismo, estan indicadas para tratar la hipercolesterolemia, como anticancengenos o adyuvantes en las vacunas. Las saponinas son detergentes, hemoltticas, quelantes del hierro, del cinc y del calcio. Las saponinas se fijan sobre los esteroles membranales, el ergosterol de las celulas fungicas y el colesterol de las celulas humanas. Como las bacterias carecen de esteroles membranales, las saponinas no tienen propiedades antibacterianas en dosis farmacologicas. Sin embargo, pueden encontrarse en dosis mas elevadas, en forma de detergentes.

[0026] Las saponinas estan presentes en numerosos vegetales. En el marco de la invencion, las saponinas se extraen de planta(s) solidago(s). Pueden extraerse de sumidades floridas, hojas y/o de rizomas de planta. Preferiblemente, la planta solidago, tambien denominada vara de oro, es decir del genero S. (Solidago) L. Asteracea, puede elegirse entre una de las 120 especies conocidas, entre las cuales S. virgaurea, S. canadensis, S. microglossa y preferiblemente S. virgaurea L. virgaurea o S. virgaurea L. minuta/alpestris.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

[0027] Los solidagos se cultivan como plantas medicinales. Por ejemplo, S. virgaurea se presenta como diuretica, analgesica, antiinflamatoria, antitumoral, antiaftas y antiulceras, antiseptica y antidiarreica. La infusion de solidago se utiliza tradicionalmente contra las inflamaciones, los problemas digestivos y urinarios y las aftas. No obstante, las composiciones conocidas a base de solidagos comprenden taninos, nocivos para la biopelfcula.

[0028] Numerosos estudios de la tecnica anterior han investigado los efectos antimicrobianos de diversos extractos de solidagos y muestran una eficacia poco concluyente contra las Candida y/o una actividad antibacteriana que la composicion segun la invencion busca evitar. En estos estudios se trata de extractos en los que los taninos no se han eliminado.

[0029] Por ejemplo, un extracto acuoso total de Solidago gigantea Ait. se ha sometido a prueba contra 13 cepas fungicas. No se ha observado ninguna inhibicion para 3 cepas de C. albicans sobre 4 ni para la cepa de C. parapsilosis sometida a prueba (Webster J Ethnopharmacol 2008). Por consiguiente, estos datos disuaden de utilizar un extracto acuoso de solidago contra las Candida.

[0030] Los extractos procedentes de una extraccion metanolica de S. microglossa han mostrado una debil actividad antibacteriana asf como una actividad antifungica contra una cepa de C. albicans (Morel, Fitoterapia 2006). Asimismo, los extractos de las partes aereas de S. virgaurea L. muestran una actividad inhibidora sobre 9 cepas bacterianas (Thiem, Fitoterapia 2002). Estos estudios disuaden de utilizar un extracto procedente de una extraccion metanolica de solidago para conservar las bacterias de la biopelfcula sana.

[0031] Los extractos procedentes de una extraccion etanolica de S. gigantea Ait. y de S. virgaurea L. han estado, respectivamente, activos contra una cepa de C. (Candida) pseudotropicalis y sin efecto contra 11 cepas de Candida sometidas a prueba (Pepeljnjak, Pharmaceutical and Pharmacological Letters 1998). Los extractos de hojas y/o de rafces de S. chilensis resultaron ineficaces en todas las concentraciones sometidas a prueba contra una cepa de C. albicans (Teixeira Duarte, J Ethnopharmacol 2005). Estos datos disuaden de utilizar un extracto procedente de una extraccion etanolica de solidago contra las Candida.

[0032] De forma sorprendente, en el marco de la invencion, las solicitantes han puesto de manifiesto que las saponinas ejercen su efecto antifungico no por medio de una accion fungica o fungistatica como las composiciones de la tecnica anterior, sino de forma mas suave y progresiva al crear un entorno desfavorable para el crecimiento de las Candida. Las solicitantes han observado que las saponinas segun la invencion, sobre un cultivo de Candida, tienen de efecto no la disminucion del numero de colonias (o CFU de «colony forming units»), sino la disminucion significativa del diametro de las colonias y la modificacion de la morfologfa de las Candida. Ello se ha observado, en concreto, con una decoccion, es decir, una infusion o una extraccion acuosa, de solidago (veanse las Tablas 1 a 3 y las Figuras 1 a 4).

[0033] Asf, las composiciones segun la invencion tienen un efecto antifungico retardado, mas suave y que lo tolera mejor la biopelfcula de la zona de aplicacion. Ello se puede explicar por el hecho de que la saponina, detergente no ionico, limita el aporte de lfpidos, cuyas necesidades aumentan en gran medida tras la transformacion de las levaduras Candida en filamentos. Asimismo, las saponinas son hemoltticas y quelantes del hierro. Privan de hierro a las Candida y a las bacterias patogenas hemofilas de la biopelfcula, principalmente oral, principalmente los estreptococos cariogenicos, las Haemophilus y los bacilos Gram negativos asociados a la periodontitis y la halitosis.

[0034] El extracto de planta que comprende saponinas es preferiblemente un extracto acuoso. Puede provenir de una extraccion acuosa, etanolica, metanolica, una extraccion con cloroformo o con eter de petroleo.

[0035] El extracto de planta segun la invencion no es un aceite esencial. En efecto, las saponinas, sustancias no volatiles, no las aportan los aceites esenciales en las composiciones de la invencion.

[0036] Los estudios de la tecnica anterior se han realizado tambien con extractos de saponinas purificadas; es decir, extractos de plantas a partir de los cuales se han aislado las saponinas, separadas de otros compuestos de los extractos. Asf, una mezcla de saponinas purificadas de S. virgaurea obtenida por extraccion etanolica se muestra inactiva contra 7 cepas de C. albicans sometidas a prueba (Bader, Pharmazie 1987). Unicamente las saponinas que se habfan sometido a una lisis alcalina parcial teman propiedades antifungicas, con un diametro de inhibicion medible contra varias cepas de C. albicans en las pruebas de difusion en agar. Las saponinas lisadas y purificadas estaban generalmente mas activas individualmente que la mezcla de saponinas lisadas (Bader Pharmazie 1987, Bader Pharmazie 1990, Bader 210th National Meeting Chicago 1995, Bader Pharmazie 2000). Estas saponinas purificadas eran glucosidos del acido poligalacico, con un disacarido y un oligosacarido de 4 a 8 residuos ligados en aglicon. La lisis acorta los sacaridos que constituyen las saponinas, y la intensidad del efecto antifungico de dichas saponinas purificadas parece que aumenta cuando se acorta la longitud del oligosacarido que las constituye (Hiller Pharmazie 1987).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0037] Sin embargo, segun una caractenstica preferida de la invencion, la o las saponinas no se han sometido a lisis alcalina, y en concreto cuando la o las saponinas de la composicion segun la invencion se purifican; es decir, cuando se utilizan en la composicion tras haberse separado de otros compuestos del extracto vegetal del que provienen. En efecto, de forma sorprendente, en estas condiciones, las saponinas presentan el efecto antifungico investigado, por el cual no tienen un efecto inhibidor visible pero se oponen a la conversion de los hongos de un estado quiescente a un estado activo, ralentizando u oponiendose a la filamentacion. Esta observacion de las solicitantes va en contra del prejuicio segun el cual unicamente las saponinas purificadas que hayan estado sometidas a una lisis alcalina actuan contra las Candida y segun el cual el efecto antifungico de la saponina mejora tras una lisis alcalina. Cuando las saponinas de la composicion no se purifican, es decir, cuando se utilizan en la composicion con los otros compuestos del extracto de plantas salvo los taninos, pueden haber sufrido lisis alcalina o no. Preferiblemente, no han sufrido lisis alcalina.

[0038] Las composiciones que comprenden un extracto de planta, sustancialmente sin taninos pero con los otros compuestos del extracto, se prefieren porque esos otros compuestos tienen propiedades interesantes. Estos comprenden principalmente aromas y colorantes naturales y no toxicos.

[0039] Las composiciones segun la invencion se presentan preferiblemente en una forma adaptada para una aplicacion topica, en concreto para una aplicacion bucodental, cutanea o genital. Preferiblemente, las composiciones se presentan en forma de:

- enjuague bucal, dentffrico, gel, crema y otras formas galenicas adaptadas para una aplicacion bucodental;

- sales, solucion, pastilla y otras formas galenicas adaptadas para la descontaminacion o la limpieza de las protesis dentales o de otros dispositivos extrafbles utilizados principalmente en odontologfa, estomatologfa o cirugfa maxilofacial;

- gel, crema, leche, polvos, locion, pulverizador, jabon y otras formas galenicas adaptadas para una aplicacion sobre la piel, las unas y/o el cabello;

- gel, crema, leche, capsula, jabon y otras formas galenicas en los medicamentos adaptados para una aplicacion anogenital.

[0040] El extracto puro, tambien denominado solucion madre, corresponde al extracto de planta tras la eliminacion de los taninos, eventualmente tras la eliminacion de los compuestos toxicos eventualmente utilizados para la extraccion.

[0041] Las composiciones segun la invencion, y en concreto los enjuagues bucales, comprenden preferiblemente entre 0,005 y 50 % de extracto (o solucion madre), y preferiblemente entre 1 y 15%, por ejemplo 10% en volumen del volumen total de la composicion.

[0042] La invencion se refiere tambien a los usos de las composiciones segun la invencion.

[0043] Las composiciones segun la invencion pueden utilizarse para la higiene bucodental, de forma regular, o bien en el marco de un tratamiento de las candidiasis bucales, sequedad bucal, caries, periodontitis, la lengua negra vellosa y/o la halitosis. Estas son particularmente indicadas en forma de enjuague bucal.

[0044] Las composiciones segun la invencion pueden utilizarse del mismo modo, de forma regular, para la higiene de la piel, las unas y/o el cabello, de las mucosas anogenitales, principalmente en pediatna o en ginecologfa. Asimismo, pueden utilizarse en el marco de un tratamiento de las micosis o de las candidiasis cutaneas, ungulares, capilares o anogenitales.

[0045] Las composiciones segun la invencion se utilizan preferiblemente como medicamento complementario de un medicamento convencional de la afeccion que se trate.

[0046] Las composiciones segun la invencion pueden estar destinadas ademas a un uso veterinario en las indicaciones anteriores, salvo en los animales de sangre fna, para los cuales las saponinas son toxicas.

[0047] Las saponinas estan presentes en la planta en forma de mezclas complejas. La extraccion y sobre todo la separacion de las saponinas son delicadas a causa de su fuerte polaridad, de su relativa fragilidad y de las diferencias estructurales muy debiles entre los constituyentes.

[0048] Las solicitantes han dispuesto un procedimiento de obtencion de un extracto de plantas, en concreto a partir de plantas solidagos, comprendiendo dicho extracto saponinas. Dicho procedimiento es ventajoso en el sentido de que permite obtener saponinas que no han sido sometidas a lisis alcalina asf como un extracto desprovisto de taninos.

[0049] Dicho procedimiento comprende de manera esencial una etapa de extraccion de diferentes compuestos, entre ellos saponinas, a partir de plantas asf como una etapa de eliminacion dirigida de los taninos.

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

[0050] La etapa de extraccion puede comprender una extraccion acuosa, etanolica, metanolica, una extraccion con cloroformo o incluso una extraccion con eter de petroleo.

[0051] Cuando la extraccion se efectua con etanol, metanol, cloroformo o eter de petroleo, comprende preferiblemente una etapa de eliminacion de etanol, metanol, cloroformo o eter de petroleo, por ejemplo por evaporacion.

[0052] La extraccion acuosa es ventajosa puesto que no necesita una etapa de eliminacion de etanol, metanol, cloroformo o eter de petroleo. Es mas rapida, mas sencilla y menos costosa.

[0053] El procedimiento comprende ademas una etapa de eliminacion dirigida de los taninos. Esta etapa se efectua ventajosamente por precipitacion de los taninos en presencia de protemas, y preferiblemente en presencia de casema. En efecto, la casema es ventajosa puesto que presenta homologfas de secuencia con las principales protemas de la biopelroula sana, con las (glico)protemas protectoras de la biopelroula oral asf como con las protemas salivales. La casema permite eliminar los taninos que presentan la afinidad mas fuerte por las protemas de la biopelroula sana.

[0054] Una forma de realizacion del procedimiento de extraccion acuosa a partir de una planta, preferiblemente solidago, segun la invencion comprende las siguientes etapas:

- preparacion de una decoccion, etapa segun la cual se anade agua destilada esteril a una cantidad de planta (sumidades floridas, hojas y/o rizomas), se lleva la mezcla a ebullicion, se deja que la mezcla se enfne hasta temperatura ambiente y despues se filtra;

- preparacion de una decoccion isotonica, etapa segun la cual se diluye entre dos la decoccion obtenida en la etapa anterior con una solucion de cloruro de sodio a 1,8 %;

- eliminacion de los taninos, etapa segun la cual la decoccion isotonica se acidifica a pH 4 y despues se anade casema para formar los complejos taninos-casema. Tras una suave agitacion, dichos complejos se eliminan por centrifugacion y el sobrenadante se reutiliza.

[0055] Una forma de realizacion mas concreta de un procedimiento de extraccion acuosa a partir de planta, preferiblemente solidago, comprende las siguientes etapas:

1) Preparacion de la decoccion:

Una cantidad de 6g de solidago (Solidago virgaurea virgaurea L.), sumidades floridas y hojas secas y trituradas, se coloca en un vaso de precipitados esteril de 250 mL en el que se anade agua destilada esteril a temperatura ambiente (c.s.p. 100 mL). El vaso de precipitados se recubre de un papel de aluminio esteril. Se coloca en un cristalizador de agua a temperatura ambiente. El conjunto se recubre de un papel de aluminio y se coloca en una placa calefactora. Tras 10 min de ebullicion, el vaso de precipitados se coloca sobre la mesa de trabajo toda la noche. La decoccion que se enfna hasta temperatura ambiente presenta un pH de 5,49. Se filtra en un autoclave de Buchner equipado con un papel de filtro para autoclave en un ambiente esteril (en campana de flujo laminar). A continuacion, la solucion se clarifica por centrifugacion en tubos esteriles y/o si es necesario por filtracion en medio esteril. En esta fase, la decoccion puede dividirse en partes alrouotas y congelarse a -20 °C.

2) Decoccion isotonica (fisiologica):

Se obtiene una decoccion isotonica diluyendo por dos la decoccion propiamente dicha, obtenida en la etapa anterior, por medio de una solucion salina de cloruro de sodio esteril a 1,8% de forma que haya una decoccion final isotonica a 0,9 % de cloruro de sodio.

3) Eliminacion dirigida de los taninos :

La decoccion isotonica se acidifica a pH 4, por ejemplo por medio de acido cttrico. Tras una acidificacion de 750 |jL de decoccion, el volumen final es de 760 jL. La mezcla decoccion-acido cftrico da un volumen final de 760 jL en un tubo de microcentnfuga de 1,5 mL. Se anade casema a la mezcla, que se somete a una agitacion suave durante 1 h a temperatura ambiente. La casema utilizada puede ser, por ejemplo, caseinato de calcio lecitinado alimentario, con un 87 % de protemas mmimo (Protilight IP4, Armor Proteines, Saint Brice en Cogles, Francia). Se forma un complejo taninos-casema, de color marron, visible macroscopicamente y que precipita. La precipitacion maxima de taninos parece estar situada en los 3,5 mg de casema por 760 jL de decoccion. El complejo se elimina por centrifugacion durante 10 min a 10000 g a 20 °C. El sobrenadante, denominado «solucion madre» en el resto del texto, constituye el extracto, la decoccion de solidago tras una eliminacion dirigida de los taninos, y presenta una coloracion mas clara. Puede congelarse a -20 °C para un uso posterior.

4) Verificacion de la presencia de saponinas en la solucion madre:

La presencia de saponinas en la solucion madre se verifica por medio de su poder hemolftico, por ejemplo por difusion en pocillos en agar. Un volumen de 50 jL de solucion madre se deposita en un pocillo de 5 mm de diametro en un agar que comprende sangre, por ejemplo un agar sangre de cordero 5 % Columbia®,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

BioRad® (Marnes-la-Coquette, Francia). La placa de agar se incuba a 37 °C y el diametro de hemolisis se mide cada hora. La solucion madre utilizada para todas las pruebas microbiologicas da un diametro de hemolisis de 8 mm despues de 1 h, de 9 mm despues de 2 h, de 10 mm despues de 3 h, de 10,5 mm despues de 4 h y de 10,6 mm despues de 5 h y 6 h.

5) Concentracion de la decoccion:

Para facilitar las manipulaciones, la solucion madre puede concentrarse, preferiblemente utilizando membranas filtrantes, por ejemplo por ultrafiltracion.

[0056] Otro modo de realizacion mas concreto de un procedimiento de extraccion acuosa a partir de planta, preferiblemente solidago, comprende las siguientes etapas:

1) Preparacion de la decoccion:

Una cantidad de 6 g de partes aereas de solidago (Solidago virgaurea minuta/alpestris (Walds. & Kit.)), secadas, se coloca en un vaso de precipitados esteril de 250 mL en el que se anade agua destilada esteril a temperatura ambiente (c.s.p. 100 mL). El vaso de precipitados se recubre de un papel de aluminio esteril. Se coloca en un cristalizador de agua a temperatura ambiente. El conjunto se recubre de un papel de aluminio y se coloca en una placa calefactora. Tras 10 min a 100 °C, el vaso de precipitados se coloca sobre la mesa de trabajo toda la noche a temperatura ambiente. La decoccion se filtra en un autoclave de Buchner equipado con un papel de filtro para autoclave en un ambiente esteril (en campana de flujo laminar). A continuacion, la solucion se clarifica por centrifugacion a 2000 g mmimo durante 15 minutos a 20 °C. En esta fase, la decoccion puede dividirse en partes almuotas y congelarse a -20 °C.

2) Eliminacion dirigida de los taninos:

Los taninos se precipitan por adicion de caseinato de calcio lecitinado alimentario, (5 mg, Protilight IP4®, Armor Proteines, Saint Brice en Cogles, France) y se acidifica a pH 4 con 25 pL de tampon citrato 1M por mL de decoccion. Tras 60 minutos de incubacion a temperatura ambiente, y centrifugacion a 2000 g mmimo durante 15 minutos a 20 °C, el sobrenadante, denominado «solucion madre» en el resto del texto, constituye el extracto, la decoccion de solidago tras una eliminacion dirigida de los taninos, se esteriliza en autoclave y puede congelarse a -20 °C para un uso posterior.

3) Decoccion isotonica (fisiologica):

Puede obtenerse una decoccion isotonica por adicion de cloruro de sodio de forma que se obtenga 0,9 % final.

4) Verificacion de la presencia de saponinas en la solucion madre:

La presencia de saponinas en la solucion madre isotonica se verifica por medio de su poder hemolftico, por ejemplo por difusion en pocillos en agar. Un volumen de 50 pL de solucion madre isotonica se deposita en un pocillo de 5 mm de diametro en un agar que comprende sangre, por ejemplo un agar sangre de cordero 5 % Columbia®, BioRad® (Marnes-la-Coquette, Francia). La placa de agar se incuba a 37 °C y el diametro de hemolisis se mide tras 24 h.

[0057] Una forma de realizacion del procedimiento de extraccion etanolica o metanolica a partir de solidago segun la invencion comprende las siguientes etapas:

- maceracion de planta, por ejemplo 1 kg de planta limpia y seca, en etanol o metanol a 50 % en agua, por ejemplo 8 L de etanol (C2H5OH) a 50 % 24 h a 20 °C ;

- evaporacion de la fase etanolica o metanolica, por ejemplo al vacm;

- enjuague, por ejemplo 2 veces, de la fase acuosa restante con n-butanol, preferiblemente con una relacion volumetrica extracto/n-butanol de 2:1;

- evaporacion de la fase butanolica; despues

- eliminacion de los taninos de la fase acuosa, como se ha descrito anteriormente tras una extraccion acuosa.

[0058] En esta forma de realizacion concreta, el etanol puede reemplazarse por metanol por medio de un procedimiento de extraccion metanolica.

Ejemplo 1 - Impacto de las saponinas de S. virgaurea L. virgaurea sobre las Candida

[0059] Las solicitantes han realizado un estado sobre dos cepas de C. albicans, una cepa de referencia CP 4872 (proporcionada por el Instituto Pasteur) y una cepa silvestre MG 001 (extrafda de un paciente).

[0060] Por ello, las dos cepas de C. albicans se han cultivado durante 24 h a 35 °C, en 100 pL de medio lfquido RPMI («Roswell Park Memorial Institute medium») sin extracto de solidago o bien en 50 pL de solucion madre de extracto de solidago obtenido por medio de extraccion acuosa, estando diluida dicha solucion madre a 1/3 en RPMI. Los cultivos de 24 h a 35 °C en medio lfquido se han sembrado en placas de agar (Sabouraud®), incubados a 35 °C durante una noche, despues se han dejado a 20 °C (temperatura ambiente) durante 2 dfas (D1 y D2). Cada condicion se ha duplicado 4 veces, correspondientes a las pruebas n.° 1 a 4.

5

10

15

20

25

30

35

40

[0061] Despues de 1 dfa (D1) a 20 °C, el diametro medio de las colonias de C. albicans se ha medido por morfometna, y el numero medio de las colonias de C. albicans se ha contado manualmente para cada pocillo a partir de diluciones 10-4 o 10-2.

[0062] Los resultados de dichas mediciones se encuentran recogidos en las tablas 1 a 3 a continuacion. Las columnas A corresponden a los cultivos sin extracto de solidago, las colonias B corresponden a los cultivos en presencia de extracto de solidago diluido a 1/3. La fila «Numero» corresponde al numero de colonias en cada pocillo, mientras que la fila «Diametro» corresponde al diametro medio de las colonias, expresado en mm, en cada pocillo.

[0063] El diametro medio se calcula a partir de los diametros medidos en 100 colonias, excepto para las pruebas n.° 3 y 4 con CP4872, condicion A, donde el numero total de colonias fue de 68 y 88 respectivamente.

Tabla 1:

C. albicans CP 4872

Prueba n.°1 Prueba n.°2 Prueba n.°3 Prueba n.°4

A B A B A B A B

Numero

100 100 100 100 68 100 88 100

Diametro mm

1,35 0,90 0,62 0,64 2,40 2,07 3,34 2,24

Desviacion estandar

0,19 0,14 0,10 0,09 0,07 0,12 0,12 0,18

Tabla 2:

C. albicans MG 001

Prueba n.°1 A B

Prueba n.°2 A B Prueba n.°3 A B Prueba n.°4 A B

Numero Diametro mm Desviacion estandar

100 100 1,20 1,05 0,13 0,12 100 100 0,86 0,80 0,12 0,11 100 100 2,58 1,72 0,10 0,05 100 100 2,86 1,74 0,20 0,07

Tabla 3: valores de relevancia («p-value») asociados a las comparaciones de los valores de diametro anteriores

entre la condicion A y la condicion B

zip-value

C. albicans CP 4872 C. albicans MG 001

A/B Prueba n.°1

0,000000 0,000000

Prueba n.°2

0,12772 0,000034

Prueba n.°3

0,000000 0,000000

Prueba n.°4

0,000000 0,000000

[0064] Tras una noche a 35 °C, la presencia de colonias en agar muestra que las Candida han crecido, incluso las procedentes del medio lfquido con solucion madre. Por tanto, las saponinas segun la invencion no tienen un efecto antifungico ni fungicida, en todo caso no inmediato.

[0065] El cultivo en medio lfquido con numeracion de las unidades que forman colonias (o CFU) tampoco ha mostrado un efecto fungicida ni fungistatico de la solucion madre.

[0066] Tras un dfa (D1) de cultivo a 20 °C, no ha habido una disminucion significativa del numero de colonias procedentes del medio lfquido con solucion madre (condicion B, p> 0,05) con respecto a los cultivos procedentes del medio RPMI solo (condicion A) (Tablas 1 y 2). Asimismo, el diametro de las colonias ha disminuido significativamente para la condicion B (p<0,01). Para la prueba n.° 2 con la cepa CP 4872, solamente se manifiesta una diferencia significativa en el D2 (p=0,007239). Por tanto, la solucion madre, y en concreto las saponinas que contiene, no impiden por completo pero ralentizan el crecimiento de los hongos, por un efecto diferido y no inmediato. Esta crea un entorno desfavorable para el crecimiento de las dos cepas de Candida sometidas a prueba y disminuye su potencial de crecimiento.

[0067] Ademas, en el microscopio, el aspecto de las colonias es diferente. En efecto, despues de un dfa a 20 °C, los cultivos trasplantados en agar se observan en microscopio. Las cepas de C. albicans procedentes de las condiciones A han desarrollado numerosos filamentos pseudomiceliales, testigos de un crecimiento activo,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

mientras que las cepas procedentes de las condiciones B se encuentran esencialmente en forma de levaduras pequenas y redondas, de aspecto quiescente, sin o con muy pocos filamentos miceliales, es decir en forma no virulenta.

[0068] La figura 1 muestra una vista con microscopio de la cepa C. albicans 4872 en el D1 (Prueba n.° 3), procedente, en la foto de la izquierda, de un cultivo sin solucion madre (condicion A) y, en la foto de la derecha, procedente de un cultivo con solucion madre (condicion B). La figura 2 muestra una vista con microscopio de la cepa C. albicans MG 001 en el D1 (Prueba n.° 3), procedente, en la foto de la izquierda, de un cultivo sin solucion madre y, en la foto de la derecha, procedente de un cultivo con solucion madre. La solucion madre diluida a 1/3 parece mas activa en la cepa silvestre MG 001 que en la cepa de referencia 4872.

[0069] Las solicitantes han observado del mismo modo que Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Streptococcus mutans crecen en contacto con pocillos que contienen un 50 pl de solucion madre diluida pura o a 1/3. Ello muestra que la solucion madre no ha tenido ningun efecto inhibidor sobre dichas cepas bacterianas. Asimismo, se observa un efecto antifungico similar en la morfologfa de las Candida tras 3 trasplantes que alternan la incubacion en presencia de solucion madre diluida a 1/3 (8 h a 35 °C) y la inoculacion en agar Sabouraud® (16 h a 35 °C y despues 24 h a temperatura ambiente para la ultima placa). Los trasplantes simulan el uso cotidiano del enjuague bucal in vivo.

[0070] Dichas observaciones muestran que las saponinas segun la invencion, y en concreto los extractos de solidago que comprenden saponinas y sin taninos segun la invencion, permiten que las Candida se mantengan en forma quiescente, no virulenta, lo que impide su desarrollo y en concreto su transformacion en una forma patogena, pero no las erradica. Asf, las saponinas segun la invencion tienen un efecto suave y duradero, no agresivo, creando un entorno que desfavorece el crecimiento de las Candida, sin someterlas a lisis y sin los efectos antimicrobianos debidos a los taninos. Ello permite que las composiciones segun la invencion se utilicen de forma prolongada, regular y sin provocar efectos secundarios nocivos.

Ejemplo 2 - Impacto de diferentes extractos acuosos de solidagos, Solidago virgaurea virgaurea y Solidago virgaurea minuta/alpestris que contienen saponinas en C. albicans ATCC 10231

[0071] Las solicitantes han realizado otro estudio sobre nueve cepas silvestres de C. albicans aisladas en el servicio de micologfa del centro hospitalario de Niza y una cepa de referencia ATCC 10231 (aisladas en el laboratorio de Microbiologfa Oral de la Facultad de cirugfa dental, cultivadas en dos formas, lisa y rugosa), lo que hace un total de diez cepas cultivadas.

[0072] Se han observado la transformacion de las levaduras Candida en filamentos (figura 3) y el diametro de las colonias (figura 4) tras 72 h de crecimiento de los inoculos en placas de agar que contienen Sabouraud® / cloranfenicol y despues se han diluido al 0,5 de McFarland con 100 pL de un medio glutamina RPMI («Roswell Park Memorial Institute medium»), enriquecido con glucosa 1M (Invitrogen, Paisley, Reino Unido).

[0073] Tal y como ilustra la figura 3a por medio de marcado con violeta cristal, la incubacion durante 36 h con 50 pL de cloruro de sodio a 0,9 % en el medio provoca la transformacion de las levaduras de Candida en filamentos miceliales.

[0074] El fenomeno es incluso mas pronunciado en la figura 3b cuando el medio se acidifica a pH 4.

[0075] En las figuras 3c, 3d y 3e, el cloruro de sodio se reemplaza respectivamente por 50 pL de saponinas de cortezas de Quillaja a 250 mg/mL, de decocciones de extractos acuosos de Solidago virgaurea virgaurea o de Solidago virgaurea minuta/alpestris, obtenidos segun la invencion y que no contienen taninos.

[0076] La figura 3c muestra la erradicacion del alargamiento de las levaduras de Candida por medio de las saponinas a una concentracion elevada de 250 mg/mL induciendo la lisis de las celulas.

[0077] El reemplazo de las solucion de cortezas de cortezas de Quillaja por las decocciones de extractos de solidagos inhibe del mismo modo la transformacion de las levaduras de Candida en filamentos miceliales como los ilustrados en las figuras 3d y 3e.

[0078] Dicha inhibicion guarda relacion con la presencia de saponinas en los extractos de solidagos.

[0079] Dicha inhibicion se ha observado para las diez cepas de C. albicans estudiadas e ilustradas en la figura 3 en C. albicans ATCC 10231r (forma rugosa).

5

10

15

20

25

[0080] Para medir el tamano de las macrocolonias de C. albicans, las colonias obtenidas segun las condiciones de la figura 3 se han trasplantado en placas de agar YEP que contienen agar YEP (agar a 22 g/L con extracto de levadura a 11 g/L, peptona a 22 g/L y glucosa a 20 g/L modificadas o no por la adicion de medio que provoca la desfilamentacion (saponinas o solucion de solidagos). Las placas control sin saponina o decoccion pueden acidificarse o no por medio de tampon citrato. Para obtener las macrocolonias, las placas de agar YEP anteriores en las que se desarrollan las diferentes cepas de C. albicans se pinchan con una pipeta capilar de 25 pm de diametro y se inoculan en nuevas placas de agar YEP modificadas.

[0081] Se observa la disminucion del tamano de las macrocolonias por las condiciones de las figuras 4c, 4d y 4e correspondientes a una incubacion con, respectivamente, las saponinas de cortezas de Quillaja a 250 mg/mL, las decocciones de extractos acuosos de Solidago virgaurea virgaurea o de Solidago virgaurea minuta/alpestris, obtenidas segun la invencion y que no contienen taninos, con respecto a la condicion control de la figura 4b en medio acido.

[0082] El control en medio no acido ilustrado en la figura 4a no muestra tal diferencia segun este experimento.

[0083] Un estudio de este tipo pone de manifiesto la importancia del medio acido en el tamano de las macrocolonias y muestra el efecto de las saponinas en la disminucion del tamano de las macrocolonias.

[0084] Una disminucion del tamano de las colonias de este tipo puede guardar relacion con el efecto de las saponinas en la inhibicion de la transformacion de las levaduras en filamentos miceliales de las C. albicans.

[0085] Estas observaciones confirman que las saponinas segun la invencion, y en concreto los extractos de solidagos que comprenden saponinas y sin taninos segun la invencion, permiten que las Candida se mantengan en forma quiescente, no virulenta, lo que impide su desarrollo y en concreto su transformacion en una forma patogena, pero no las erradica. Asf, las saponinas segun la invencion tienen un efecto suave y duradero, no agresivo, creando un entorno que desfavorece el crecimiento de las Candida, sin someterlas a lisis y sin los efectos antimicrobianos debidos a los taninos. Ello permite que las composiciones segun la invencion se utilicen de forma prolongada, regular y sin provocar efectos secundarios nocivos.

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas, caracterizada por que esta sustancialmente libre de taninos, y por que las saponinas no han sido sometidas a lisis alcalina si el extracto de planta consiste en saponinas purificadas.
2. 2. Composicion segun la reivindicacion 1, caracterizada por que no comprende taninos.
3. 3. Composicion segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizada por que se presenta en forma de enjuague bucal, dentifrico, gel, crema, leche, polvos, locion, pulverizador, jabon o capsulas, y preferiblemente en forma de enjuague bucal.
4. 4. Composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y que no comprende sustancialmente taninos, para su uso cosmetico para la higiene bucal, de la piel, de las mucosas, de las unas o del cabello.
5. 5. Composicion que comprende un extracto de una planta solidago (Solidago) que comprende saponinas y que no comprende sustancialmente taninos, para su uso como medicamento.
6. 6. Composicion segun la reivindicacion 5, para su uso como medicamente en el tratamiento de las sequedad cutaneas y/o de la sequedad de las mucosas, y en concreto de la sequedad bucal.
7. 7. Composicion segun la reivindicacion 5 para su uso como medicamente en el tratamiento de las micosis, en concreto de las micosis cutaneas, bucales o anogenitales.
8. 8. Composicion segun la reivindicacion 5 para su uso como medicamento en el tratamiento de las infecciones bucodentales, principalmente las caries, la periodontitis, la lengua negra vellosa y la halitosis relacionadas con la sequedad bucal.
9. 9. Procedimiento de obtencion de un extracto de plantas, preferiblemente solidagos (Solidago), comprendiendo dicho extracto saponinas y no comprendiendo sustancialmente taninos, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:

   - extraccion de saponinas a partir de plantas, preferiblemente solidagos (Solidago); despues

   - eliminacion dirigida de los taninos.
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, caracterizado por que:

    - la etapa de extraccion es una extraccion acuosa, etanolica, metanolica, una extraccion con cloroformo o incluso una extraccion con eter de petroleo;

    - la etapa de extraccion, en el caso de una extraccion etanolica, metanolica, con cloroformo o con eter de petroleo, viene seguida de una etapa de eliminacion del etanol, del metanol, del cloroformo o del eter de petroleo, por ejemplo por evaporacion;

    - la etapa de eliminacion dirigida de los taninos se lleva a cabo por precipitacion de los taninos en presencia de proternas, y preferiblemente en presencia de casema.