ES2576743T3 - Marcador para pronóstico de cáncer de hígado - Google Patents

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Abstract

Un método para estimar el pronóstico de supervivencia general en un paciente con cáncer de hígado que comprende: etapa 1, poner en contacto una muestra biológica recolectada del paciente que tiene cáncer de hígado con una composición que comprende una sustancia para detectar específicamente el nivel de expresión del gen CBS; etapa 2, detectar diferencias en el nivel de expresión de CBS al comparar el resultado del tratamiento de la etapa 1 con un valor de referencia; en donde se pronostica la supervivencia general del cáncer de hígado, y en donde el nivel de expresión de CBS mayor que el valor de referencia indica que el pronóstico de supervivencia general es relativamente bueno.

Description

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DESCRIPCION
Marcador para pronostico de cancer de hlgado Campo Tecnico
La presente descripcion se relaciona con un marcador para pronostico de cancer de hlgado, una composicion para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende una sustancia para detectar el nivel de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado, un kit para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende la composicion para estimar el pronostico de cancer de hlgado, un metodo para estimar el pronostico de cancer de hlgado utilizando el marcador para pronostico de cancer de hlgado, y un metodo para cribar un agente terapeutico para cancer de hlgado utilizando el marcador para pronostico de cancer de hlgado.
Tecnica Antecedente
El cancer tiene el mismo significado que tumor maligno. Significa una afeccion donde la funcion de modular la proliferacion celular esta danada debido a diversas razones y por lo tanto no se controlan las celulas anormales y proliferan en exceso para penetrar en los tejidos y organos circundantes, formando masas y danando los tejidos normales. El cancer que se origina de diversos tejidos en el cuerpo humano pone la vida en peligro debido a su rapido crecimiento, crecimiento infiltrante (que se propaga o penetra), extension (que se mueve lejos de su area original), etc.
Entre los canceres, se conoce el cancer de hlgado como uno de los canceres mas mortales en el mundo. En particular, se reporta que por lo menos unas quinientas mil personas mueren de cancer de hlgado cada ano en Asia y en Africa Subsahariana. El cancer de hlgado se puede clasificar en gran medida en carcinoma hepatocelular que surge de la celula hepatica en si misma y cancer de hlgado metastasico que es el cancer de otros tejidos diseminados en el hlgado. Alrededor de por lo menos 90% del cancer de hlgado es carcinoma hepatocelular, y en general se entiende que el termino cancer de hlgado se refiere a carcinoma hepatocelular.
Se reporta que la mayorla de las causas del cancer de hlgado son por una infeccion aguda o cronica por el virus de hepatitis B o el virus de hepatitis C. Sin embargo, no se ha aclarado todavla el mecanismo molecular dentro de las celulas en relacion con la ocurrencia y el desarrollo de cancer de hlgado. De acuerdo con las investigaciones convencionales, se informa de que en el caso que se muten proto-oncogenes tales como varios genes de factores de crecimiento a oncogenes por diversas razones para ser sobreexpresados o sobre-activados, o en el caso de que se muten genes supresores de tumor tales como protelna Rb o protelna p53 por diversas razones para tener baja expresion o con perdida de funcion, esto puede provocar la ocurrencia y progreso de diversos canceres, que incluyen cancer de hlgado. En particular, con respecto al cancer de hlgado, se ha identificado que los genes, tales como p53 modificado, beta-catenina, AXINI, p21 (WAF1/CIP1) y p27 Kip, etc. estan relacionados a los mismos. Sin embargo, recientemente, se reconoce que la ocurrencia y progreso de la mayorla de tipos de cancer que incluyen cancer de hlgado no solo se debe a genes especlficos, sino que se deben a la interaccion compleja de diversos genes que se relacionan con el ciclo celular, entrega de senal, etc. Por lo tanto, serla necesario conseguir enfocarse solo en la expresion o funcion de los genes individuales o protelna y realizar investigaciones generales sobre diversos genes o protelnas.
El pronostico de cancer de hlgado se refiere a la anticipacion de diversas afecciones del paciente que sufre de cancer de hlgado, tales como posibilidad de una recuperacion completa del cancer de hlgado, posibilidad de recurrencia despues de tratamiento, posibilidad de supervivencia del paciente despues de ser diagnosticado de cancer de hlgado, etc. Este puede variar dependiendo de diversas afecciones tales como gravedad de enfermedad, punto de diagnostico, progreso de tratamiento, etc. El cancer de hlgado se puede tratar de manera eficiente solo cuando diversos metodos de tratamiento se aplican adecuadamente de acuerdo con su pronostico. Por ejemplo, con respecto a los pacientes que se estiman tienen buen pronostico, serla necesario evitar los metodos de tratamiento peligrosos que tienen una posibilidad de provocar efectos secundarios graves en pacientes tales como tratamiento u operaciones qulmicas agresivas, metodos de tratamiento de radiacion, y tratamiento de selection que son relativamente moderados, conservadores y seguros. Por otro lado, con respecto a los pacientes que se estima tiene mal pronostico, el tratamiento u operaciones qulmicas, metodos de tratamiento, tales como tratamiento de radiacion se deben llevar a cabo activamente en un intento de aumentar el perlodo o tasa de supervivencia.
De acuerdo con las investigaciones conducidas hasta ahora, el pronostico de cancer de hlgado que ya ha progresado es extremadamente malo, y muestra un alto Indice fatal de muerte dentro de 6 meses desde el diagnostico, que deja una duration promedio de vida de solo 4 meses. Sin embargo, el cancer de hlgado que tiene un tamano de menos de 3 cm tiene buen pronostico, y se conoce que tiene una tasa de supervivencia del 90% para un ano sin ningun tratamiento particular y despues de cirugla, la tasa de supervivencia de cinco anos es aproximadamente el 40 ~ 50%. Sin embargo, es muy diflcil estimar el pronostico de los pacientes con cancer de hlgado con precision con la tecnologla de la tecnica anterior. Con el fin de estimar el pronostico con precision, se
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requiere un metodo de analisis que clasifica a los pacientes en cada grupo de riesgo. Sin embargo, hasta ahora, se ha determinado que el pronostico solo depende de la etapa de cancer de hlgado patologica cllnica en el momento del diagnostico y el tratamiento quirurgico primario sin un medio para estimar con precision el pronostico de cancer de hlgado. Sin embargo, por desgracia, el pronostico de cada paciente de cancer de hlgado no se puede determinarse con precision solo por la etapa de cancer de hlgado.
La protelna CBS (cistationina beta-sintasa) es una enzima que convierte la homocistelna acistationina, que se conoce por actuar en la ruta de transulfatacion y cumple una funcion importante en el metabolismo de metionina in vivo [J Biol Chem. 1994 May 20;269(20): 14835-40].
La protelna NNMT (nicotinamida N-metiltransferasa) es una enzima que realiza N-metilacion de nicotinamida y piridina, que se conoce que estan involucradas en el metabolismo de diversos farmacos y compuestos xenobioticos [Genomics. 1998 Sep 15; 52 (3): 312-24].
La protelna TKT (transcetolasa) es una enzima que realiza la funcion central en la ruta de las pentosas fosfato no oxidativa, y como un miembro del grupo, TKTL1 (similar a transcetolasa 1), se conoce la TKTL2 (similar a transcetolasa 2) [J Biol Chem. 1993 Ene 15; 268 (2): 1397-404].
La protelna AIFM1 (factor inductor de apoptosis, asociado a mitocondria, 1) es una flavoprotelna tambien conocida como AIF. Se conoce que si ocurre apoptosis, la protelna se mueve al nucleo, provocando aglomeracion de cromosoma y fragmentation, e induce la secretion de citocromo c y caspasa-9 desde la mitocondria [Nature. 1999 Feb 4; 397 (6718): 441-6].
La protelna AKT es la protelna asociada a AKT2, AKT3, y se conoce que cumple una funcion en la entrega de senales del factor de crecimiento a traves de fosfatidilinositol 3-quinasa, es decir, la entrega de senales del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), insulina y factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-l), etc., y cuando se activa, se sabe que las protelnas relacionadas con apoptosis e inactiva las mismas [Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Jul;84(14):5034-7]
La protelna ATG3 (autofagia relacionada con el homologo 3) esta implicada en la union entre el homologo ATG8 humano tal como GATE-16, GABARAP, MAP-LC3 y el llpido. Se ha reportado que los ratones que carecen de ATG3 no forman autofagosoma, y mueren dentro de un dla despues del nacimiento [J Biol Chem. 2002 Abr 19; 277 (16): 13739-44. Epub 2002 1 FEB].
La protelna ATG5 (autofagia relacionada con el homologo 5) esta involucrada con la autofagia. Se conoce la ATG5 por formar un conjugado ATG12- ATG5 a traves de la action de ATG7 y ATG10, y este conjugado de ATG12-ATG5 se mueve a la membrana del autofagosoma para actuar en la union de ATG8 y fosfatidiletanolamina. Se ha reportado que los ratones que carecen de ATG5 no forman autofagosoma y mueren inmediatamente despues del nacimiento, y el corte de ATG5 pueden inducir la secrecion de citocromo c y activar la caspasa en las mitocondrias [Nature 432: 1032-1036 (2004)].
La protelna ATG7 (autofagia relacionada con el homologo 7) esta involucrado con la autofagia. Se ha reportado que, junto con ATG10, la ATG7 forma el conjugado ATG12-ATG5, y junto con ATG3, esta implicadas en la union de ATG8 y fosfatidiletanolamina. Los ratones que carecen ATG7 no forman autofagosoma y mueren inmediatamente despues del nacimiento [J Biol Chem. 2001 Jan 19;276(3):1701-6. Epub 2000 Nov 28].
La protelna ATG12 (autofagia relacionada con el homologo 12) esta involucrada con la autofagia. Se sabe que la AtG12 forma el conjugado ATG12-ATG5 a traves de la accion de ATG7 y ATG10, y este conjugado ATG12-ATG5 se mueve a la membrana del autofagosoma para actuar en la union de ATG8 y fosfatidiletanolamina [J Biol Chem. 1998 Dic 18; 273 (51): 33889-92].
La protelna BAX (protelna X asociada a BCL2) es una del grupo de protelna BCL2, y se conoce que promueve la apoptosis mediante la union con BCL2, y esta involucrada en la perdida de membrana mitocondrial potencial y la secrecion de citocromo c [Cell. 1993 Aug 27;74(4):609-19].
La protelna BCL2 (protelna de linfoma de celulas B 2) es una protelna de membrana de la mitocondria, que inhibe la apoptosis. Se conoce que inhibe la secrecion de citocromo c de la mitocondria, activa la caspasa e inhibe la apoptosis mediante la union con el factor de activation de apoptosis [Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jul;83(14):5214- 8].
La protelna BCL2L1 protelna 1 similar a Bcl-2) es un miembro del grupo de protelnas BCL2, y se sabe que esta colocada en la membrana externa de la mitocondria y esta involucrada con el canal de membrana mitocondrial compartido. Esta presente en dos tipos de isoformas. La forma mas larga, BCL-XL, se conoce que inhibe la apoptosis, y la forma mas corta, BCL-Xs, se conoce que promueve la apoptosis [Cell. 1993 Aug 27;74(4):597-608].
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La protelna BNIP3 (protelna 3 que interactua con BCL2/adenovirus E1B 19kD) se puede unir con la protelna E1B 19 kDa y BCL2, y se conoce que induce apoptosis y autofagia [J Exp Med. 1997 Dic 15; 186 (12): 1975-1983].
La protelna CASP8 (caspasa 8, cistelna proteasa relacionada con apoptosis) es una enzima que cae dentro del grupo de la caspasa, que es una caspasa que actua en la fase inicial del mecanismo de apoptosis mediante FAS. Si se activa a traves de la union con FADD y escision proteolltica, activa varias otras caspasas [Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Dec 10;93(25):14486-91; Biochem J. 1997 Aug 15;326 (Pt 1):1-16]]
Se sabe que protelna CSE1L (segregation cromosomica CSE1 similar a 1) cumple una funcion en enviar de nuevo importin-a desde el nucleo hasta el citoplasma, y de estar involucrada en la apoptosis o la proliferation celular [Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Oct 24;92(22):10427-31].
La protelna DIABLO (protelna de union a IAP directa con bajo pi) es una protelna colocada en la mitocondria, y si se produce apoptosis, se mueve al citoplasma para unirse con IAP (inhibidor de protelna de apoptosis) para ayudar a la activation de caspasa [Cell. 2000 Jul 7; 102 (1): 43-53].
La protelna DRAM (modulador de autofagia regulado por dano) es una protelna de membrana de lisosoma, y se conoce que esta involucrada en la autofagia controlada por el supresor de tumores p53 y que es esencial en la apoptosis controlada por p53 [Cell. 2006 Jul 14; 126 (1): 121-34].
La protelna E2F (factor de transcription 1 E2F) es un miembro de un factor de transcription del grupo E2F, y se conoce que esta estrechamente involucrada con el control del ciclo celular y supresor de tumores, y promueve el crecimiento celular mediante union a la protelna Rb o induce apoptosis relacionada con p53 [Gene. 1996 Sep 16;173(2):163-9].
La protelna FAS (APO-1, CD95, TNFRSF6) es un miembro del grupo de receptores de TNF. Se conoce que recibe la senal de ligando FAS y compone el DISC (complejo de serialization que induce muerte) junto con FADD (protelna del dominio de muerte asociada a Fas), caspasa 8, y caspasa 10 para inducir la apoptosis [J Biol Chem. 1992 May 25;267(15):10709-15].
La protelna FRAP1 (objetivo mamlfero de rapamicina) tambien se conoce como mTOR. Es conocida por mediar reacciones relacionadas con estres, tales como dano del ADN dentro de las celulas, agotamiento de nutrition, etc., y se conoce que el material compuesto TORC2 que comprende FRAP1 es el objetivo de la detention del ciclo celular y la action inmunosupresora del compuesto FKBP12-rapamicina [Nature. 1994 Jun 30; 369 (6483): 756-8].
La protelna LAMP1 (protelna 1 de membrana asociada lisosomica) tambien se conoce como antlgeno CD107a. Es un tipo de glicoprotelna de membrana, y parece estar involucrada con la propagation de las celulas de cancer [J Biol Chem. 1990 May 5;265(13):7548-51].
La protelna LC3 (protelna 1 similar a cadena ligera 3 de MAP1) es la protelna asociada a microtubulos y esta involucrada en la interaction entre microtubulos y el citoesqueleto. La protelna LC3 es un homologo ATG8 de levadura, y se sabe que se une con fosfatidiletanolamina mediante la accion de varias protelnas de autofagia y componen elo autofagosoma [J Biol Chem. 1994 Apr 15;269(15):11492-7].
La protelna PRKAA1 (protelna quinasa activada con AMP, catalltica, alfa-1) es una subunidad catalltica de AMPK. Este AMPK es una protelna que cumple la funcion de detectar el nivel de energla dentro de las celulas. Se conoce que se activa cuando aumenta la relation de AMP/ATP y cumple una funcion en la limitation de diversas reacciones de bioslntesis [FEBS Lett. 1994 Dec 12;356(1):117-21].
La protelna PTEN (fosfatasa y homologo de tensina) es conocida por ser un supresor tumoral, y se inactiva en varios tipos de canceres. Es a la vez, al mismo tiempo una fosfatasa de protelna y una fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 3- fosfatasa, y se conoce a deteriorarse PI3K-AKT/PKB entrega de senal [Nat Genet. 1997 Apr; 15 (4): 356-62].
La protelna ULK1 (quinasa 1 similar a Unc-51) es una serina/treonina quinasa relacionada con el crecimiento axonal, y tambien conocida como homologo ATG1. Con respecto a la autofagia, se conoce que se fosforila por mTOR [Genomics. 1998 Jul 1;51(1):76-85].
La protelna XIAP (inhibidor ligado a X de la protelna de apoptosis) es un miembro del grupo de IAP, y entre las IAP, tiene un fuerte efecto de inhibition de apoptosis. Se conoce que inhibe la apoptosis e inhibe la actividad de la caspasa traves de union con el factor asociado a receptor del factor de necrosis tumoral TRAF1, TRAF2 [Nature. 1996 Jan 25;379(6563):349-53].
Sin embargo, no se conoce como el nivel de expresion o patron de expresion de las protelnas cambia en detalle en el tejido hepatico, y como las protelnas se pueden utilizar para estimar el pronostico de cancer de hlgado. Ademas,
hasta ahora, no hubo ningun ejemplo del uso de la protelna o genes que codifican la protelna como marcador para pronostico de cancer de hlgado.
Description detallada del objeto tecnico
Es un objeto de la presente descripcion proporcionar un biomarcador que se relaciona con el pronostico de cancer 5 de hlgado para estimar el pronostico de los pacientes con cancer de hlgado con facilidad y precision, y adicionalmente proporcionar un punto de partida importante para el desarrollo de agentes terapeuticos para el cancer de hlgado. De acuerdo con lo anterior, la presente descripcion proporciona un marcador para pronostico de cancer de hlgado, una composition para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende una sustancia para detectar un cambio en el nivel de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado, un kit para 10 estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende la composicion para estimar pronostico de cancer de hlgado, un metodo para estimar el pronostico de cancer de hlgado utilizando el marcador para pronostico de cancer de hlgado, y un metodo para cribar un agente terapeutico para cancer de hlgado utilizando el marcador para pronostico de cancer de hlgado.
Medios para alcanzar el objeto
15 Los presentes inventores compararon el grado de la expresion de genes en tejidos de cancer de hlgado recolectados de una pluralidad de pacientes diagnosticados por tener cancer de hlgado, y se detectaron los genes expresados en una gran cantidad o una pequena cantidad especlficamente de acuerdo con el progreso de cada paciente para descubrir marcadores para el pronostico de cancer de hlgado que se pueden utilizar para estimar el pronostico de cancer de hlgado.
20 El primer aspecto de la presente descripcion se relaciona con un marcador para pronostico de cancer de hlgado que comprende una o una combination de por lo menos dos seleccionados de un grupo que consiste de los siguientes genes:
CBS (cistationina beta-sintasa; NCBI GI: 209862802);
NNMT (nicotinamida N-metiltransferasa; NCBI GI: 62953139);
25 TKT (transcetolasa; NCBI GI: 205277461);
AIFM1 (Factor que induce apoptosis 1, mitocondrial; NCBI GI: 22202627);
AKT1 (protelna quinasa RAC-alfa serina/treonina; NCBI GI: 62241010);
ATG3 (Protelna relacionada con autofagia 3; NCBI GI: 34147490);
ATG5 (Protelna de autofagia 5; NCBI GI: 92859692);
30 ATG7 (Protelna relacionada con autofagia 7; NCBI GI: 222144225);
ATG12 (Protelna relacionada con autofagia 12; NCBI GI: 38261968);
BAX (regulador de apoptosis BAX; NCBI GI: 34335114);
BCL2 (regulador de apoptosis Bcl-2; NCBI GI: 72198188);
BCL2L1 (regulador de apoptosis Bcl-X; NCBI GI: 20336333);
35 BNIP3 (protelna 3 que interactua con protelna de BCL2/adenovirus E1B 19 kDa; NCBI GI: 7669480);
CASP8 (caspasa-8; NCBI GI: 122056470);
CSE1L (Exportina-2; NCBI GI: 29029558);
DIABLO (homologo de Diablo, mitocondrial; NCBI GI: 218505810);
DRAM (Modulador de autofagia regulada por dano; NCBI GI: 110825977);
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E2F1 (Factor de transcripcion E2F1; NCBI GI: 168480109);
FAS (miembro de la superfamilia del receptor de factor de necrosis de tumor 6; NCBI GI: 23510419);
FRAP1 (protelna asociada al complejo de FKBP12-rapamicina; NCBI GI: 206725550);
LAMP1 (glicoprotelna de membrana asociada a lisosoma 1; NCBI GI: 112380627);
LC3[MAP1LC3A] (protelnas asociadas a microtubulos cadena de ligera 1A/1B 3A; NCBI GI: 31563519);
PRKAA1 (subunidad alfa-1 catalltica de quinasa protelna activada por 5'-AMP; NCBI GI: 94557300);
PTEN (Fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa y protelna fosfatasa PTEN de especificidad doble; NCBI GI: 110224474);
ULK1 (quinasa protelna de Serina/treonina ULK1; NCBI GI: 225637564); y XIAP (protelna 4 que contiene repeticiones de IAP baculovirales; NCBI GI: 32528298).
Se puede estimar el pronostico de cancer de hlgado a partir de diversos aspectos. Sin embargo, de forma representativa, se determina desde el aspecto de la posibilidad de recurrencia, posibilidad de supervivencia, y posibilidad de supervivencia sin enfermedad. La investigacion descrita en la presente especificacion se procedio a obtener el perfil de expresion de gen del tejido de cancer de hlgado de una pluralidad de pacientes con cancer de hlgado, detectar los genes que presentan una diferencia significativa en el nivel de expresion pasando a traves de procesamiento de datos estadlsticos teniendo en cuenta los aspectos de posibilidad de recurrencia, posibilidad de supervivencia, posibilidad de supervivencia sin enfermedad todos juntos, y descubrir marcadores que permiten la estimacion del pronostico de cancer de hlgado.
En la presente especificacion, “marcador para pronostico de cancer de hlgado” se refiere a un marcador genico que es el criterio para estimar pacientes que tienen buen o mal pronostico despues de la aparicion de cancer de hlgado. En la presente descripcion, el nivel de expresion de este marcador dentro del tejido de cancer de hlgado de un paciente con buen pronostico es distintivamente alto o bajo en comparacion con el nivel estandar predeterminado experimentalmente. En particular, en la presente descripcion, este marcador tiene un valor p significativamente bajo, cuyo valor se calcula con base en la diferencia de expresion sobre el tejido de cancer de hlgado de pacientes con buen pronostico y mal pronostico. Preferiblemente, el valor p es menor de 0.05.
La presente descripcion hace un analisis al comparar el perfil de expresion genica del tejido de cancer de hlgado de pacientes con buen o mal progreso del tratamiento con el nivel estandar, con respecto a los tejidos de cancer de hlgado de una pluralidad de pacientes que se sabe tienen cancer de hlgado. Por lo tanto, el marcador confirmado como tal puede distinguir especlficamente pacientes con buen o mal pronostico de cancer de hlgado, y por lo tanto esto se puede utilizar de manera util para estimar el pronostico de cancer de hlgado. Ademas, teniendo en cuenta que el marcador confirmado como tal se expresa en una gran cantidad o una pequena cantidad especlficamente en el tejido de cancer de hlgado de pacientes con un pronostico especlfico, la funcion fisiologica del marcador tiene la posibilidad de estar directamente relacionada con la funcion fisiologica que se relaciona con la aparicion y el progreso de cancer de hlgado, en particular, el pronostico de cancer de hlgado. Por lo tanto, este marcador se puede utilizar de manera util como un objetivo en la investigacion de la aparicion y el progreso de cancer de hlgado o el desarrollo de un agente terapeutico contra el cancer de hlgado.
En particular, se descubrio que el marcador para pronostico de cancer de hlgado en el primer aspecto de la presente descripcion se basa en el analisis estadlstico del tejido de cancer de hlgado de una pluralidad sin precedentes de pacientes. Por lo tanto, los marcadores tienen un significado mayor que los marcadores convencionales que se relacionan con el cancer de hlgado descubierto con base en el perfil de expresion genica de tejido de cancer de hlgado de solo algunos pacientes, tienen un alto valor de utilidad cllnica, y tienen mas potencia de estimacion precisa para estimar el pronostico de cancer de hlgado.
El segundo aspecto de la presente descripcion se relaciona con una composicion para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende una sustancia para detectar especlficamente el nivel de expresion, patron de expresion, o ambos del marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto.
Aqul, el patron de nivel de expresion o la expresion de cada marcador para pronostico de cancer de hlgado se puede detectar por metodos de analisis bioqulmicos generales que confirman el nivel o patron de mARN generado por la transcripcion del gen correspondiente. Como tal un metodo de analisis para confirmar el nivel o patron de mARN, existe RT-PCR, RT-PCR competitivo, RT-PCR en tiempo real, ensayo de proteccion RNasa, transferencia de
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Northern, micromatrices de ADN, etc. Ademas, se puede utilizar cualquier metodo que se lleva a cabo generalmente en la tecnica pertinente.
A traves de los metodos de analisis anteriores, el nivel o patron de mARN en la muestra biologica de un paciente con cancer de hlgado se puede comparar con el nivel estandar, y se detecta la diferencia en el nivel de expresion, patron de expresion o ambos del marcador para pronostico de cancer de hlgado de la presente descripcion de los mismos. Esto permite estimar el pronostico de los pacientes con cancer de hlgado. En la presente especificacion, “muestra biologica” significa una celula, tejido, etc. separada del cuerpo humano en donde se puede detectar el nivel de expresion o patron de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado, o el nivel existente o patron existente de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado. Se puede ejemplificar por la orina, sangre, plasma, suero, etc., pero no se limita particularmente limitado a estos.
El kit para medir el nivel o patron de mARN por RT-PCR comprende un cebador especlfico a mARN del marcador para pronostico de cancer de hlgado de la presente descripcion. En la presente especificacion, “cebador” significa una secuencia de acido nucleico que tiene un grupo 3' hidroxilo libre que se puede unir complementariamente a una plantilla y que permite que la transcriptasa inversa o polimerasa ADN inicie la reproduccion de la plantilla. El cebador es un nucleotido que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de acido nucleico de un gen especlfico, y se puede utilizar un cebador de una longitud de aproximadamente 7 pb ~ 50 pb, preferiblemente de aproximadamente 10 pb ~ 30 pb. Otros kits de RT-PCR pueden incluir un tubo de ensayo u otro recipiente adecuado, solucion de regulador de reaccion, desoxinucleotido (dNTPs), enzimas tales como Taq-polimerasa y transcriptasa inversa, DNAsa, ARNsa supresor, DEPC-agua, agua esteril, etc. de acuerdo con las realizaciones detalladas. El cebador puede iniciar la slntesis de ADN en presencia de un reactivo para la polimerizacion (es decir, ADN polimerasa o transcriptasa inversa) y cuatro nucleosidos de trifosfato diferentes en una solucion reguladora y temperatura adecuada. El cebador puede comprender otras secuencias de bases que no cambian la caracterlstica basica del cebador que actua en el punto inicial de la slntesis de ADN. Se puede sintetizar el cebador qulmicamente utilizando metodos bien conocidos, y la secuencia de acido nucleico se puede transformar utilizando muchos medios bien conocidos en la tecnica pertinente.
La “sustancia para detectar especlficamente el nivel de expresion, patron de expresion, o ambos del marcador para pronostico de cancer de hlgado” en el segundo aspecto de la presente descripcion puede ser cualquier sustancia que se utilizar especlficamente para un marcador correspondiente en un metodo para analizar el nivel de expresion o patron de expresion del marcador correspondiente para pronostico de cancer de hlgado, o una combination de por lo menos dos de las sustancias, y que no se limita a un cebador para el uso de RT-PCR. La caracterlstica tecnica del segundo aspecto de la presente descripcion reside en comparar el nivel de expresion o patron de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado en el tejido de cancer de hlgado de pacientes objeto con cancer de hlgado con el nivel estandar y detectar la diferencia. Por lo tanto, cualquier sustancia que puede detectar dicha diferencia se puede utilizar como una “sustancia para detectar especlficamente el nivel de expresion, patron de expresion, o ambos del marcador para pronostico de cancer de hlgado” y lograr el efecto tecnico objetivo de la presente invention. Tambien, una persona que tenga experiencia comun en la tecnica puede seleccionar y utilizar una sustancia adecuada, se hace referencia al conocimiento comun en la tecnica pertinente de acuerdo con las realizaciones detalladas.
El tercer aspecto de la presente descripcion se refiere a una composition para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende una sustancia para detectar especlficamente el nivel existente, patron existente, o ambos de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto.
Con respecto al nivel de expresion o patron de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado de la presente descripcion, adicionalmente al metodo de detectar el nivel o patron de mARN de acuerdo con la expresion de cada marcador como en el segundo aspecto de la presente descripcion, tambien se puede utilizar el metodo para detection de un nivel existente o patron existente de protelna codificada por cada marcador en la muestra para estimar un nivel de expresion o patron de expresion de cada marcador.
La deteccion especlfica del nivel existente o patron existente de protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado en la presente descripcion significa el proceso de confirmar cuanta protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado de existe la presente descripcion existe en la muestra biologica y que patron que existe. Por ejemplo, un anticuerpo que se une especlficamente a la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado se puede utilizar para el proceso de confirmar el nivel existente o patron existente. En la presente especificacion, “anticuerpo” significa una protelna que se puede unir especlficamente al epltopo de un antlgeno, y es un concepto que incluye anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal y anticuerpo recombinante.
Como un metodo para medir el nivel existente o patron existente de protelna utilizando anticuerpo, existen transferencia de Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), radioinmunoensayo, radioinmunodifusion, inmunodifusion de Ouchterlony, inmunoelectroforesis en cohete, tenido de tejido inmunitario,
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ensayo de inmunoprecipitacion, ensayo de fijacion de complemento, FACS, chips de protelnas, etc. Sin embargo, ademas de lo anterior, se puede utilizar cualquier metodo comunmente utilizado en la tecnica pertinente.
A traves de los metodos de analisis anteriores, se puede comparar el nivel de formacion o patron de formacion del material compuesto de antlgeno-anticuerpo en una muestra biologica de pacientes objeto con cancer de hlgado con el nivel estandar, y se puede determinar el nivel existente o patron existente de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado de la presente descripcion de los mismos, y finalmente, se puede estimar el pronostico de pacientes con cancer de hlgado.
Aqul, “material compuesto de antlgeno-anticuerpo” significa un compuesto de protelna codificada por un marcador para pronostico de cancer de hlgado y un anticuerpo especlfico del mismo. El nivel de formacion o patron de formacion de material compuesto de antlgeno-anticuerpo en general, se puede medir mediante al detectar el tamano y patron de la senal del marcador de detection asociado con un anticuerpo secundario. Dicho marcador de detection se puede ejemplificar por la enzima, sustancia fluorescente, ligando, sustancia luminiscente, nanopartlculas, moleculas redox, radioisotopos, etc., pero no se limita a los mismos. Cuando se utiliza la enzima como un marcador de deteccion, como enzimas que se pueden utilizar, existen IS-gluculonidasa, p-D-glucosidasa, p- D-galacosidasa, ureasa, peroxidasa o fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, hexoquinasa y GDPase, RNasa, glucosa oxidasa, luciferasa, fosfofructoquinasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa, fosfenolpiruvato descarboxilasa, p-latamasa, etc., pero las enzimas no se limitan a estas. Cuando se utiliza una sustancia fluorescente como un marcador de deteccion, como sustancias fluorescentes que se pueden utilizar, existen fluorescelna, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehldo, fluorescamina, etc., pero las sustancias fluorescentes no se limitan a estas. Cuando se utiliza un ligando como un marcador deteccion, como un ligando que se puede utilizar, existen derivados de biotina, etc., pero el ligando no se limita a estos. Cuando se utiliza una sustancia luminiscente como un marcador de deteccion, como sustancias luminiscentes que se pueden utilizar, existenester de acridinio, luciferina, luciferasa, etc., pero las sustancias luminiscentes no se limitan a estas. Cuando se utilizan nanopartlculas como marcador de deteccion, como nanopartlculas que se pueden utilizar, existen oro coloidal, latex tenido, etc., pero las nanopartlculas no se limitan a estas. Cuando se utilizan moleculas redox como marcador de deteccion, como moleculas redox que se pueden utilizar, existen ferroceno, complejos de rutenio, viologeno, quinona, ion de Ti, ion de Cs, diimida, 1,4-benzoquinona, hidroquinona, K4W (CN) 8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-, etc., pero las moleculas redox no se limitan a estas. Cuando se utiliza un radioisotopo como un marcador de deteccion, como radioisotopos que se pueden utilizar, existen 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251, 1311 o 186Re, etc., pero los radioisotopos no se limitan a estos.
En el tercer aspecto de la presente descripcion, “una sustancia para detectar especlficamente el nivel existente, patron existente, o ambos de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado” puede ser cualquier sustancia que se puede utilizar especlficamente para la protelna codificada por el marcador en un metodo de analisis para detectar el nivel existente o el patron existente de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado, pero no se limita necesariamente a anticuerpos. Las caracterlsticas tecnicas del tercer aspecto de la presente descripcion se comparan con el nivel existente o el patron existente de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado en muestras biologicas de pacientes con cancer de hlgado con un valor de referencia y se detectan las diferencias. Por lo tanto, se puede utilizar cualquier sustancia como “una sustancia para detectar especlficamente el nivel existente, el patron existente, o ambos de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado” y puede alcanzar efectos tecnicos que la presente descripcion tiene como objetivo lograr siempre y cuando la sustancia sea capaz de detectar dichas diferencias. Un experto en la tecnica puede seleccionar/clasificar facilmente una sustancia adecuada de acuerdo con realizaciones especlficas basadas en el conocimiento promedio y tecnologlas conocidas en la tecnica.
El cuarto aspecto de la presente descripcion se relaciona con un kit para estimar el pronostico de cancer de hlgado, que comprende la composition para estimar el pronostico de cancer de hlgado del segundo o tercer aspecto de la presente descripcion.
Adicionalmente a una sustancia para detectar especlficamente el nivel de expresion, el patron de expresion, o ambos del marcador para pronostico de cancer de hlgado comprendido en la composicion para estimar el pronostico de cancer de hlgado, o una sustancia para detectar especlficamente el nivel existente , patron existente, o ambos de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado, el kit para estimar el pronostico de cancer de hlgado de la presente invention puede comprender adicionalmente uno o mas tipos de otros ingredientes, soluciones o aparatos, que son adecuados para metodos de analisis del nivel de expresion o patron de expresion de gen o metodos de analisis del nivel existente o patron existente de protelna. Por ejemplo, en el caso del kit de diagnostico para detectar el nivel de expresion o el patron de expresion del gen, el kit e diagnostico puede comprender ingredientes esenciales necesarios para realizar RT-PCr, y ademas de los cebadores respectivos especlficos para mARN de los genes marcadores, este kit de RT-PCR puede comprender, por ejemplo, tubo de ensayo u otro recipiente adecuado, solucion reguladora de reaccion, desoxinucleotido (dNTPs), enzimas tales como Taq-polimerasa y transcriptasa inversa, DNAsa, inhibidor de RNasa, DEPC-agua (DEPCwater), agua esteril , par de cebador especlfico a gen que se utiliza como un grupo de control cuantitativo, de acuerdo con realizaciones
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especlficas. Mientras tanto, en el caso de que el kit de diagnostico sea para detectar el nivel existente o patron existente de la protelna, el kit de diagnostico puede comprender, por ejemplo, ingredientes esenciales necesarios para la realizacion de ELISA. Este kit de ELISA puede comprender ingredientes capaces de detectar anticuerpos unidos, por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado, cromoforos, enzima (por ejemplo, enzima conectada a anticuerpo) y su sustrato, y un anticuerpo especlfico para la protelna del grupo de control cuantitativo. Adicionalmente, de acuerdo a los aspectos especlficos, el kit de diagnostico puede comprender de micromatrices de ADN o micromatrices de protelnas.
El quinto aspecto de la presente descripcion se relaciona con un metodo para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende la etapa 1, tratar muestras biologicas recogidas de pacientes objeto de cancer de hlgado con la composicion para estimar el pronostico de cancer de hlgado del segundo aspecto; y la etapa 2, detectar diferencias en el nivel de expresion, patron de expresion, o ambos del marcador para pronostico de cancer de hlgado de la reivindicacion 1 al comparar el resultado del tratamiento de la etapa 1 con un valor de referencia. Adicionalmente, el quinto aspecto de la presente descripcion se relaciona con un metodo para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende la etapa 1, tratar muestras biologicas recogidas de pacientes con cancer de hlgado con la composicion para estimar el pronostico de cancer de hlgado del tercer aspecto; y la etapa 2, detectar diferencias en el nivel existente, patron existente, o ambos de la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado de la reivindicacion 1 al comparar el resultado del tratamiento de la etapa 1 con un valor de referencia.
Por ejemplo, en el caso de la deteccion de la diferencia en el nivel de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado que se expresa mucho mas en tejidos con cancer de hlgado de pacientes cuyo pronostico de cancer de hlgado es bueno, si el nivel de expresion del marcador en muestras biologicas de los pacientes objeto de cancer de hlgado es mas alto que un valor de referencia, se puede decir que esto sugiere que el pronostico del cancer de hlgado es relativamente bueno. Mientras tanto, por ejemplo, en el caso de detectar la diferencia en el nivel de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado que se expresa mucho mas en tejidos de cancer de hlgado de los pacientes objeto cuyo pronostico de cancer de hlgado es pobre, si el nivel de expresion del marcador en muestras biologicas de los pacientes objeto con cancer de hlgado es mas alto que un valor de referencia, se puede decir que esto sugiere que el pronostico de cancer de hlgado es relativamente pobre.
Mientras tanto, por ejemplo, en el caso de detectar la diferencia en el nivel existente de protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado que se expresa mucho mas en tejidos de cancer de hlgado de los pacientes cuyo pronostico de cancer de hlgado es bueno, si el actual nivel de protelna codificada por el marcador en muestras biologicas de los pacientes objeto de cancer de hlgado es mas alto que un valor de referencia, se puede decir que esto sugiere que el pronostico de cancer de hlgado es relativamente bueno. Mientras tanto, por ejemplo, en el caso de detectar la diferencia en el nivel existente de protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado que se expresa mucho mas en tejidos de cancer de hlgado de pacientes cuyo pronostico de cancer de hlgado es pobre, si el nivel existente de protelna codificada por el marcador en muestras biologicas de pacientes objeto con cancer de hlgado es mas alto que un valor de referencia, se puede decir que esto sugiere que el pronostico de cancer de hlgado es relativamente pobre.
El sexto aspecto de la presente descripcion se relaciona con un metodo para cribar un agente terapeutico para cancer de hlgado utilizando el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion.
A medida que el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion muestra diferencia notable en los patrones de expresion de acuerdo con el pronostico de los pacientes con cancer de hlgado, se podrla implicar directamente a los genes en las funciones fisiologicas relacionadas con la aparicion o desarrollo de cancer de hlgado, en particular, el pronostico. De acuerdo con lo anterior, la protelna codificada por el marcador se puede utilizar de manera util como una protelna objetivo para estudiar el mecanismo de la aparicion o desarrollo de cancer de hlgado o inventar un agente terapeutico para el cancer de hlgado. Es decir, el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion satisface un requisito previo importante para el desarrollo de un agente terapeutico contra el cancer de hlgado, y por lo tanto el metodo para cribar un agente terapeutico contra cancer de hlgado utilizando este marcador tambien se incluye en el alcance de la presente descripcion.
Como un ejemplo del sexto aspecto de la presente descripcion, existe un metodo para cribar agente terapeutico para el cancer de hlgado que comprende una etapa de comprobacion de si un compuesto de ensayo promueve o inhibe la expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion.
Como el metodo para el cribar un agente terapeutico, por ejemplo, se pueden utilizar RT-PCR, RT-PCR competitivo, RT-PCR en tiempo real, ensayo de proteccion RNasa, transferencia Northern, micromatrices de ADN, SAGE [Analisis Serial de Expresion Genica; Velculescu y et al, Science 270: 484-7], MPSS [secuenciacion de Firma Masivamente Paralela; Brenner et al, PNAS. USA. 97, 1665-1670], etc. Ademas de los metodos anteriores, si es necesario se pueden utilizar diversos metodos conocidos en la tecnica.
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Mientras tanto, como otro ejemplo del sexto aspecto de la presente descripcion, existe un metodo para cribar un agente terapeutico para cancer de hlgado que comprende la etapa 1, unir un compuesto de ensayo a la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion; y etapa 2, comprobar si el compuesto de ensayo promueve o inhibe una actividad fisiologica de dicha protelna. Como el metodo para cribar un agente terapeutico, por ejemplo, se puede utilizar un metodo para fijar los marcadores protelnicos para el diagnostico temprano de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion a una columna de afinidad y ponerlo en contacto con muestras para purificarlos [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], un metodo para utilizar sistema de dos hlbridos, transferencia Western, un metodo de seleccion de alto rendimiento [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001],. Ademas de los metodos anteriores, si es necesario se pueden utilizar varios metodos conocidos en la tecnica.
En el sexto aspecto de la presente descripcion, como compuestos de prueba que se utilizaran para cribado, por ejemplo, se pueden utilizar extractos de tejidos, productos de expresion de genoteca, compuestos sinteticos, peptidos sinteticos, compuestos naturales, etc., pero los compuestos de prueba que se utilizaran para la detection no se limitan a estos.
El septimo aspecto de la presente descripcion se relaciona con un anticuerpo que reconoce especlficamente la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion.
El anticuerpo que reconoce especlficamente el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion es una sustancia representante que detecta especlficamente el nivel existente o el patron existente de protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado, y de acuerdo con lo anterior se puede utilizar de forma util para estimar el pronostico de cancer de hlgado. Adicionalmente, dependiendo de los casos, el anticuerpo puede promover o inhibir especlficamente la actividad de la protelna que cumple una funcion importante en la aparicion o desarrollo de cancer de hlgado, y de acuerdo con lo anterior se puede utilizar como un agente terapeutico contra el cancer de hlgado.
Como se ha encontrado el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion, se puede llevar a cabo facilmente la preparation de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y anticuerpos recombinantes para la protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado al utilizar tecnologlas ampliamente conocidas en la tecnica.
Se pueden preparar anticuerpos policlonales por metodos ampliamente conocidos en la tecnica de inyectar antlgeno de protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion en animales y recolectar la sangre de los animales para obtener suero que comprende anticuerpos. Estos anticuerpos policlonales se pueden preparar de diversos anfitriones de especies de animales, tales como cabras, conejos, ovejas, monos, caballos, cerdos, ganado, perros, etc., y los metodos de preparacion son bien conocidos en la tecnica.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando un procedimiento de hibridoma [Kohler y Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519] o tecnologla de bibliotecas de anticuerpos de fagos [Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991], etc. que es ampliamente conocido en la tecnica. Convencionalmente, un metodo de hibridoma utiliza celulas obtenidas de animales anfitriones que son inmunologicamente adecuados, tal como un raton, a los que se les ha inyectado antlgeno de protelna codificada por el marcador para pronostico de cancer de hlgado del primer aspecto de la presente descripcion, y una estirpe celular de cancer o mieloma como la otra poblacion. Los tejidos obtenidos de estas dos poblaciones se fusionan mediante un metodo ampliamente conocido en la tecnica tal como polietilenglicol, y luego las celulas que producen anticuerpos se proliferan por un metodo de cultivo de tejidos estandar. Despues de obtener una poblacion de celulas homogeneas por subclonacion de acuerdo con una tecnica de dilution limitada, el hibridoma que puede producir anticuerpos deseados se cultiva en cantidad in vivo o in vitro de acuerdo con una tecnica conocida. Un metodo de coleccion de anticuerpos de fagos es un metodo de production de anticuerpos monoclonales al obtener un gen del anticuerpo deseado, que expresa el gen en la forma de la protelna de fusion sobre la superficie de fagos, y de ese modo producir una coleccion de anticuerpos in vitro, y separar los anticuerpos monoclonales deseados de la coleccion. Los anticuerpos monoclonales preparados por el metodo anterior se pueden separar utilizando metodos conocidos, tales como electroforesis en gel, dialisis, precipitation de sales, cromatografla de intercambio ionico, cromatografla de afinidad, etc.
El anticuerpo del septimo aspecto de la presente descripcion comprende fragmentos funcionales de una molecula de anticuerpo, ademas de formas perfectas de dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa. Los fragmentos funcionales de la molecula de anticuerpo se refieren a fragmentos que tienen funciones de union a antlgeno, e incluyen Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, etc.
Efecto de la invencion
De acuerdo con la presente description, un marcador para pronostico de cancer de hlgado, una composition para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende una sustancia para detectar cambios en el nivel de expresion del marcador para pronostico de cancer de hlgado, un kit para estimar el pronostico de cancer de hlgado que comprende la composicion para estimar el pronostico de cancer de hlgado, un metodo para estimar el 5 pronostico de cancer de hlgado utilizando el marcador para pronostico de cancer de hlgado, y un metodo para cribar un agente terapeutico para cancer de hlgado utilizando el marcador para pronostico de cancer de hlgado.
El marcador para pronostico de cancer de hlgado se puede utilizar de forma util para estimation de pronostico correcta y sencilla de pacientes con cancer de hlgado. Adicionalmente, las funciones fisiologicas del marcador pueden estar directamente implicadas en la aparicion o desarrollo de cancer de hlgado. De acuerdo con lo anterior, 10 el marcador se puede utilizar de manera util para estudiar el mecanismo de aparicion o desarrollo de cancer de hlgado o como un objetivo para el desarrollo de un agente terapeutico para cancer de hlgado.
Los marcadores anteriores para pronostico de canceres de hlgado son los que son mas significativa y cllnicamente utiles y capaces de predecir de forma mas correcta la estimacion para pronostico de cancer de hlgado, ya que fueron descubiertos al analizar estadlsticamente tejidos de cancer de hlgado obtenidos a partir de una abundancia 15 de pacientes sin precedentes.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1 a 10 son curvas de Kaplan-Meier ilustradas mediante la medicion de los marcadores de pronostico de cancer de hlgado de la presente descripcion en aspectos de recurrencia, supervivencia general y supervivencia sin enfermedad.
20 Mejores realizaciones para llevar a cabo la invention
En adelante, la presente invencion se explicara en detalle en los ejemplos 1 a 3; los otros ejemplos son ejemplos comparativos.
Los ejemplos solo se describen para ayudar a entender la presente invencion, pero no para limitar el alcance de la presente invencion de ninguna forma.
25 Realizaciones para llevar a cabo la invencion
Ejemplo 1: Extraction de ARN y slntesis de cADN
Se obtienen tejido de cancer de hlgado y tejido normal adyacente recolectado de 120 pacientes con cancer de hlgado cuya ocurrencia de cancer de hlgado se diagnostico y se confirmo su desarrollo. El ARN de cada uno de los tejidos se extrajo y el cADN se sintetizo de acuerdo con los siguientes metodos.
30 El ARN total se extrajo de tejido de cancer de hlgado y tejido normal adyacente utilizando RNeasy Minikit (Qiagen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total del extracto de ARN obtenido se peso utilizando Bioanalizador 2100 (Agilent Technologies, EE.UU.). Se realizo tratamiento con DNasa I en la etapa de extraccion para eliminar el ADN genomico contaminado del extracto de ARN. La muestra que contiene 4 pg de ARN total se incubo con 2 pl de 1 cebador de oligo (dT) 18 pM (Genotech, Corea) en 70^ durante 7 minutos y se enfrio en 35 hielo durante 5 minutos. Una mezcla de enzimas se preparo por separado [en un volumen total de 11 pl al agregar 2 pl de DTT 0.1 M (Duchefa, Palses Bajos), 2 pl de regulador de transcription inversa 10x, 5 pl de dNTP 2 mM, 1 pl de 200 U/pl de transcriptasa inversa MMLV, y 1 pl de 40 U/pl de inhibidor de RNasa (Enzynomics, Corea)]. Despues de agregar la mezcla de enzimas a las muestras que contienen el ARN, se incubaron durante 90 minutos a 42° C, y luego se incubaron a 80° C durante 10 minutos para inactivar la transcriptasa inversa. Las muestras anteriores se 40 llevaron hasta un volumen final de 400 pl al agregar dietilpirocarbonato (DEPC) tratado con agua.
Ejemplo 2: PCR en tiempo real cuantitativo
Se llevaron a cabo amplificaciones por PCR en tiempo real para cada una de las muestras de cADN obtenido del Ejemplo 1, utilizando PRISM 7900HT (Applied Biosystems, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en los siguientes dos marcadores geneticos:
45 CBS y
NNMT.
El analisis de PCR en tiempo real se realizo en un volumen total de 10 pl que incluyen 5 pl de mezcla maestra de expresion genica Taqman 2x (Applied Biosystems, EE.UU.), 1 pl de cada uno de los cebadores directo e inverso 5 pM, 1 pl de sonda 1 pM (Genotech, Corea), y 2 pl de cADN (en el caso de un grupo de control, la misma cantidad de agua). Las amplificaciones se realizaron con un ciclo de una etapa de disociacion a 95° C durante 10 minutos, 5 seguido de una etapa de disociacion a 95° C durante 15 segundos; y una etapa de slntesis a 60° C durante 1 minuto. Las secuencias de cebador y sonda se disenaron utilizando Primer Express 3.0 (Applied Biosystems, EE.UU.) y todas las secuencias de la sonda se marcaron con FAM en el extremo 5'y con TAMRA en el extremo 3'. Las siguientes secuencias de cebador y sonda en la Tabla 1 a continuation se utilizaron para cada uno de los marcadores:
10 Tabla 1
Marcador
Secuencia (SEQ ID NO)
CABS
F
GTTGG CAAAG TCATCTACAAG CA (1)
R
GGGCGAAGTGGTCCATCTC (2)
P
ACGCTGGGCAGGCTCTCGCAC (3)
NNMT
F
TTGAGGTGATCTCGCAAAGTTATT (4)
R
CTCGCCACCAGGGAGAAA (5)
NNMT
CCACCATGGCCAACAACGAAGGAC (6)
P
F: cebador delantero
R: cebador inverso
P: sonda
La expresion de cada uno de los genes marcadores se midio por triplicado, y luego se estandarizo al sustraer la expresion promedio de 5 tipos de genes de referencia (B2M, GAPDH, HMBS, HPRT1, y SDHA). El CT (el numero de ciclos requeridos para alcanzar un umbral) de cada uno de los marcadores se midio y se calculo el valor ACT (CT de 15 cada uno de los marcadores menos CT promedio de los genes de referencia). El numero de copias de mARN se calculo como 2"APT. Las curvas de calibration se construyeron a partir de los resultados de amplificaciones simultaneas de diluciones en serie de las muestras de cADN.
Ejemplo 3: Analisis estadlstico
En consideration de la expresion normalizada de cada uno de los marcadores obtenidos en el Ejemplo 2, y el 20 progreso de los pacientes que han proporcionado los tejidos de cancer de hlgado, se completaron las curvas de Kaplan-Meier, y luego se realizo analisis de signification.
Con base en el progreso de 120 pacientes que han proporcionado tejidos de cancer de hlgado, para los respectivos casos de recurrencia, supervivencia general y supervivencia sin enfermedad, los pacientes fueron enumerados en el orden ascendente del perlodo. Se calculo la tasa de supervivencia de intervalo (o tasa de recurrencia de intervalo) al 25 dividir el numero de supervivientes (o pacientes con recurrencia) por el numero de pacientes expuestos a riesgo. La tasa de supervivencia acumulada (o tasa de recurrencia acumulada) es la probabilidad condicional, que se calculo al multiplicar la tasa de supervivencia acumulada anterior (o tasa de recurrencia acumulada) por la tasa de supervivencia actual de intervalo (o tasa de recurrencia de intervalo). Las curvas de Kaplan-Meier se construyeron como funciones en etapas con el eje horizontal del tiempo de supervivencia (o perlodo de observation) y el eje 30 vertical de la tasa de supervivencia acumulada (o tasa de recurrencia acumulada).
Para cada uno de los marcadores, se completaron las curvas de Kaplan-Meier con respecto a recurrencia, supervivencia general y supervivencia sin enfermedad. La expresion de cada uno de los marcadores que se midio en el Ejemplo 2 se clasifico en alta expresion y baja expresion con base en referencias estadlsticamente significativas que se determinaron experimentalmente, y los casos de alta expresion y baja expresion para cada uno 35 de los marcadores se separaron el uno del otro para completar las curvas de Kaplan-Meier. Las curvas de Kaplan- Meier terminadas se ilustran en la Figura 1.
Como se puede confirmar a partir de la Figura 1, en las curvas de Kaplan-Meier completadas con respecto a recurrencia, supervivencia general y supervivencia sin enfermedad, cada uno de los marcadores forma curvas donde los casos de alta expresion y baja expresion se distinguen claramente unos de otros. Esto significa que hay notables diferencias en la tasa de recurrencia de intervalo o la tasa de supervivencia de intervalo, y la tasa de recurrencia 5 acumulada o tasa de supervivencia acumulada en base a estas entre los casos en los que cada uno de los marcadores muestra alta expresion y baja expresion, y que, por consiguiente, los patrones de expresion de cada de los marcadores puede ser un Indice que muestra la posibilidad de recurrencia o la posibilidad de supervivencia de los pacientes.
Las pruebas de significacion se realizaron mediante la prueba de rango logarltmico con respecto a cada uno de los 10 marcadores y su combinacion al calcular los valores de observacion y valores esperados en cada punto de recurrencia o muerte para obtener estadlsticas de prueba de Chi cuadrado. De esta manera, se calcularon los valores p y los valores p calculados son como se muestra en la Tabla 2 a continuacion.
Tabla 2
Marcador
Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
CBS
0.52879 0.00221 0.92216
NNMT
0.01694 0.05333 0.01649
CBS_NNMT
0.03441 0.03916 0.03641
15 Como se puede confirmar de la anterior Tabla 2, cada uno de los marcadores o su combinacion muestra valores p suficientemente bajos para ser considerados significativos en terminos de toda recurrencia, supervivencia general y supervivencia libre de enfermedad. En particular, en el caso de la combinacion de dos marcadores, todos los valores p para recurrencia, supervivencia general y supervivencia libre de enfermedad fueron menores de 0.05, lo cual es deseable. Cuando un valor p se hace menor, la significacion estadlstica se hace mayor. Por lo tanto, los valores de p 20 bajos sugieren que la estimacion para el pronostico de cancer de hlgado por cada uno de los marcadores o su combinacion es altamente precisa.
Ejemplo 4: Descubrimiento de un marcador adicional
A excepcion de experimentacion con tejido de cancer de hlgado y tejido normal adyacente obtenido de 185 pacientes de cancer de hlgado, se realizo un experimento de la misma manera que en los Ejemplos 1 a 3, y de este 25 modo se obtuvieron las curvas Kaplan-Meier y valores p al utilizar el siguiente gen como un marcador:
TKT.
Los cebadores y la sonda usados son como se muestran en la siguiente Tabla 3; Las curvas de Kaplan-Meier se muestran en la Fig. 2; y los valores p calculados se muestran en la siguiente Tabla 4.
Tabla 3
Marcador
Secuencia (SEQ ID NO)
TKT
F
GAGGCTGTGTCCAGTGCAGTAG (7)
R
CCACTTCTTGGTACCCGGTTAA (8)
P
CCTGGCATCACTGTCACCCACCTG (9)
F: cebador delantero
R: cebador inverso
P: sonda
30
5
10
15
20
25
30
Marcador
Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
TKT
0.03096 0.00099 0.00546
Como se puede ver en la Fig. 2, en las curvas de Kaplan-Meier completadas con respecto a recurrencia, supervivencia general y supervivencia libre de enfermedad, el marcador anterior forma curvas donde los casos de alta expresion y baja expresion se distinguen claramente unos de otros. Esto significa que existen notables diferencias en la tasa de recurrencia de intervalo o tasa de supervivencia de intervalo o tasa de recurrencia acumulada o tasa de supervivencia acumulada en funcion de estos entre los casos en donde el marcador esta en alta expresion y baja expresion, y que, en consecuencia, el patron de expresion del marcador puede ser un Indice que muestra la posibilidad de recurrencia o la posibilidad de supervivencia de los pacientes.
Como se puede confirmar de la Tabla 4 anterior, el marcador anterior muestra un valor de p menor de 0.05 con respecto a toda la recurrencia, supervivencia general y supervivencia libre de enfermedad, que es deseablemente baja. Cuando un valor de p se hace menor, la signification estadlstica se hace mayor. Por lo tanto, el valor p bajo sugiere que la estimation del pronostico de cancer de hlgado por el marcador es muy precisa.
Ejemplo 5: Descubrimiento de un marcador adicional
A exception de la experimentation con tejido de cancer de hlgado y tejido normal adyacente obtenido a partir de 369 pacientes de cancer de hlgado, se realizo un experimento en la misma forma que en los Ejemplos 1 a 3, y de este modo se obtuvieron las curvas de Kaplan-Meier y los valores de p al utilizar los siguientes 23 genes como marcadores:
AIFM1
AKT1
ATG3
ATG5
ATG7
ATG12
BAX
BCL2
BCL2L1
BNIP3
CASP8
CSE1L
DIABLO
DRAM
E2F1
FAS
LAMP1
LC3[MAP1 LC3A]
PRKAA1 5 PTEN ULK1 y XIAP
Los cebadores y sondas utilizados son como se muestra en la siguiente Tabla 5; Las curvas de Kaplan-Meier son como se muestra en las figuras 3 a 10; y los valores p calculados para cada uno de los marcadores se muestran en 10 la siguiente Tabla 6. Los valores p calculados para combinaciones de cualquiera de los dos tipos de marcadores son como se muestran en las siguientes Tablas 7 a 9.
Tabla 5
Marcado r
Secuencia (SEQ ID NO) Marcad or Secuencia (SEQ ID NO]
BCL2
PRKAA 1
F
CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA (10) F GGCAGTTGCCTACCAT CT CAT AA (46)
R
GCCGGTTGAGGTACTCAGTCA (11) R GCCGAGTCAGGTGATGATCA (47)
P
CCTGGTGGACAACATCGCCCTGT (12) P TCTATTTGGCGACAAGCCCACCTGATT (48)
FAS
ATG3
F
AATGGTGTCAATGAASCCAAAAT (13) F CCATTGAAAATCACCCTCATCTG (49)
R
GT CATACGCTT CTTTCTTT C CAT GA (14) CACCTCAGCATGCCTGCAT (50)
P
T GACAAT GT GCAAGACACAGCAGAACAG R P CACCACCTCCCATGTGTTCAGTTCACC
AA (15)
(51)
BAX
ATG12
F
GGTTGTCGCCCTTTTCTACTTTG (16) F CGACAGCTTCGATTTGAATGAC (52)
R
CAGTTCCGCACCTTGGT (17) R GGAAGCGTCGCAAAGGA (53)
P
CAGCAAACTGGTGCTCAAGGOC CT (18) P TGTAATTGCGTGCCCGTACTCCGGC (54)
BCL2L1
ATG5
F
GATTGCCTTTGTTTTGATGTTTGT (19) F TTTCCTCCACTGCCATCATTAA (55)
R
GGAAAGGi QAACCCAGGTTAGTG (20) R GGCCAAAGGTTTCAGCTTCA (66)
P
CAGAATTGATCATDTCCCCCCACTCTCC P CCTCAGCTGTGACATGAAAGACTTACCGG
(21) (67)
AIFM1
ATG7
F
T GAAGAT CT CAAT GAAGTAGCCAAACT AT (22) F CGGATGAATGAGCCTCCAA (58)
R
CTGCAGTGGGTTTGCCAAT (23) R GGACATTATCAAAGCGTGAAAGAA (59)
P
CAACATTCAT GAAGACT GAAGCCCCACA (24) P TCTTGGGCTTGTGCCTGAGCAGATC (60)
CASP8
BNIP3
F
CCTTCTGATTGATGGTGCTATTTTG (25) F TTCCCCCCAAGGAGTTCCT (61)
Marcado r
Secuencia (SEQ ID NO) Marcad or Secuencia (SEQ ID NO]
BCL2
PRKAA 1
R
GCGGTGAGCCGAGATCAC (26) R CGCTCGTGTTCCTCATGCT (62)
P
CAGAATCTCGCTCTGTCGCCCAGG (27) P ACCCGAAGCGCACGGCCAC (63)
CSE1L
DRAM
F
GCATGATCCTGTAGGTCAAATGG (28) F CAGCCGCCTTCATTATGTCGTA (64)
R
CAGGCGGTAGACAACTTGTGAA (29) R TGGAGGTGTTGTTCCCGTATC (65)
P
AATAACCC CAAAATT CACCTGGCACAGTC A (30) P TGCTCTCCGGCCACSTCAACC (66)
XIAP F R
GACAGGCCATCTGAGACACATG (31) AGCATAGTCTGGCCAGTTCTGAA (32) LAMP1 F R TGCACTCAGATTTAAGCCTTACAAA (67) TCACCACGAGTGACCTTCATG (66)
P
AGACACCATATACCCGACGAACCCTGCC (33) P AAGCCTCTGGCCGTCACACGTAGG (69)
DIABLO
LC3
F
AATCACATTCAGCTGGTGAAACTG (34) F AACCAGCACAGCATGGTGAGT (70)
R
TGCCAGCTTGGTTTCTGCTT (35) R CCTCGTCTTTCTCOTCCTCGTA (71)
P
AAGAGGTGCACCAGCTCTCCCGG (36) P TCCACGCCCATCGCGACA (72)
AKT1
ULK1
F
TCTCGGGTGCATTTGAGAGAA (37) F TCGCGGCCGCATGT (73)
R
ACAGCACAAAAACGTCTTTCCA (38) R AAGGGTCCAGCACTATCAAGAGA (74)
P
CCACGCTGTCCTCTCGAGCGCA (39) P AGCAGGTCCTGCGCGCCTCAAC (75)
PTEN
E2F1
F
TGGCGGAACTTGCAATCC (40) F CTGGACCACCTGATGAATATCTGT (76)
R
GCTGAGGGAACTCAAAGTACATGA (41) R CAATGCTACGAAGGTCCTGACA (77)
P
ATATTCCTC CAATT CAGGACCCACACGAC (42) P CAGCTGCGCCTGCTCTCGGA (78)
FRAP1
F
AGGCCGCATTGTCTCTATCAA (43) F: cebador delantero
R
GCAGTAAATGCAGGTAGTCATGCA (44) R: cebador inverso
P
TGCAATCCAGCTGTTTGGCGCC (45) P: sonda
Marcador
Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
BNIP3
0.02022 0.00354 0.00627
DRAM
0.00669 0.00512 0.00953
LAMP1
0.02721 0.00225 0.02398
LC3
0.01134 0.00003 0.02196
AIFM1
0.00117 0.04046 0.00114
AKT1
0.00042 0.00003 0.00093
BCL2
0.02467 0.00658 0.01477
BCL2L1
0.04975 0.01110 0.04464
FAS
0.00701 0.00000 0.00255
FRAP1
0.02911 0.00421 0.01940
BAX
0.02799 0.10527 0.03650
ULK1
0.05250 0.04146 0.04745
PTEN
0.09680 0.00893 0.07908
CSE1L
0.08817 0.00134 0.05249
XIAP
0.11658 0.03111 0.15221
ATG5
0.12114 0.00880 0.14045
E2F1
0.22181 0.04046 0.14706
DIABLO
0.19717 0.04542 0.24942
ATG3
0.28588 0.39987 0.17641
ATG7
0.06493 0.22432 0.06122
ATG12
0.19654 0.13755 0.26693
CASP8
0.10122 0.15557 0.18655
PRKAA1
0.18647 0.19015 0.32981
Tabla 7
Marcador
Valor P Marcador Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad Recurrencia Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
ATG5_ATG7
0.15663 0.00589 0.19962 BNIP3_DRAM 0.02162 0.00173 0.10550
ATG5_BNIP3
0.04903 0.00536 0.04662 BNIP3_E2F1 0.09158 0.00221 0.02682
ATG5_DRAM
0.00308 0.02402 0.00859 BNIP3 LAMP 1 0.03650 0.00947 0.01819
ATG5_E2F1
0.02165 0.00258 0.02076 BNIP3_LC3 0.00130 0.00004 0.00260
ATG5_LAMP1
0.01654 0.00270 0.02686 BNIP3JJLK1 0.10639 0.01120 0.06007
ATG5_LC3
0.00269 0.00001 0.00045 BNIP3_AIFM1 0.00084 0.00477 0.00111
ATG5_ULK1
0.08370 0.02165 0.02992 BNIP3_AKT1 0.00036 0.00001 0.00067
Marcador
Valor P Marcador Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad Recurrencia Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
ATG5_AIFM1
0.00073 0.00539 0.00031 BNIP3_ATG3 0.02013 0.00371 0.00590
ATG5_AKT1
0.00013 0.00075 0.00025 BNIP3_ATG12 0.02547 0.00127 0.00207
ATG5_ATG3
0.16614 0.01176 0.14048 BNIP3_BAX 0.05882 0.00105 0.04363
ATG5_ATG12
0.14245 0.02291 0.17473 BNIP3_BCL2 0.00632 0.00002 0.00088
ATG5_BAX
0.06603 0.01020 0.07166 BNIP3 BCL2L 1 0.04550 0.00009 0.00475
ATG5_BCL2
0.01846 0.00479 0.00904 BNIP3 CASP 8 0.09283 0.00140 0.04177
ATG5 BCL2L 1
0.01850 0.00474 0.01292 BNIP3_CSE1L 0.05584 0.00007 0.02126
ATG5_CASP8
0.09018 0.02486 0.15403 BMIP3 DIA6L O 0.14797 0.00343 0.06290
ATG5_CSE1L
0.20921 0.00061 0.11020 BNIP3_FAS 0.00484 0.00000 0.00171
ATG5 DIABL O
0.10373 0.00880 0.09206 BNIP3_FRAP1 0.01789 0.00342 0.00838
ATG5_FAS
0.00134 0.00000 0.00066 BNIP3 PRKA A1 0.10235 0.00096 0.00627
ATG5_FRAP1
0.01550 0.00835 0.01724 BNIP3_PTEN 0.01871 0.00504 0.00670
ATG5 PRKAA 1
0.15990 0.02758 0.17648 BNIP3_XIAP 0.07272 0.00671 0.02349
ATG5_PTEN
0.10454 0.02060 0.12330 DRAM_E2F1 0.05933 0.02423 0.03906
ATG5_XIAP
0.07805 0.00032 0.07617 DRAM LAMP 1 0.00436 0.00232 0.01206
ATG7_BNIP3
0.03152 0.00141 0.00392 DRAM_LC3 0.00890 0.00003 0.02502
ATG7_DRAM
0.00669 0.01265 0.01042 DRAM_ULK1 0.02697 0.00201 0.02857
ATG7_E2F1
0.19080 0.05246 0.11006 DRAM_AIFM1 0.01153 0.02446 0.03577
ATG7_LAMP1
0.04615 0.00468 0.04289 DRAM_AKT1 0.00001 0.00000 0.00002
ATG7_LC3
0.01550 0.00017 0.04352 DRAM_ATG3 0.03660 0.04492 0.00895
ATG7_ULK1
0.02772 0.01613 0.01082 DRAM_ATG12 0.02283 0.00308 0.01500
ATG7_AIFM1
0.00031 0.05341 0.00075 DRAM_BAX 0.00026 0.00145 0.00259
ATG7_AKT1
0.00065 0.00003 0.00100 DRAM_BCL2 0.00427 0.00133 0.00233
ATG7_ATG3
0.25700 0.08356 0.30334 DRAM BCL2L 1 0.00017 0.00008 0.00157
ATG7_ATG12
0.10515 0.08168 0.26653 DRAM CASP 8 0.00455 0.00212 0.00859
ATG7_BAX
0.05367 0.03772 0.06089 DRAM_CSE1L 0.06106 0.01159 0.09206
ATG7_BCL2
0.02532 0.00107 0.01848 DRAM DIABL O 0.03026 0.01389 0.04108
ATG7 BCL2L 1
0.04597 0.01275 0.03730 DRAM_FAS 0.00065 0.00000 0.00040
ATG7_CASP8
0.28393 0.03978 0.12008 DRAM FRAP 1 0.00109 0.01182 0.00172
Marcador
Valor P Marcador Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad Recurrencia Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
ATG7_CSE1L
0.08763 0.01256 0.04956 DRAM PRKA A1 0.00917 0.01627 0.03695
ATG7 DIABL O
0.14685 0.26001 0.17462 DRAM_PTEN 0.00755 0.00455 0.02852
ATG7_FAS
0.00569 0.00000 0.00306 DRAM_XIAP 0.01616 0.00099 0.01646
ATG7_FRAP1
0.03716 0.17212 0.03870 E2F1_LAMP1 0.00316 0.00091 0.00459
ATG7 PRKAA 1
0.22418 0.15039 0.06122 E2F1_LC3 0.01172 0.00012 0.03729
ATG7_PTEN
0.22594 0.00809 0.31309 E2F1_ULK1 0.03342 0.00245 0.02811
ATG7_XIAP
0.09661 0.04494 0.13129 E2F1_AIFM1 0.00133 0.00991 0.00212
Tabla 8
Marcador
Valor P Marcador Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad Recurrencia Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
E2F1_AKT1
0.00031 0.00001 0.00035 LC3_FRAP1 0.00151 0.00002 0.00457
E2F1_ATG3
0.10870 0.04951 0.13822 LC3_PRKAA1 0.00463 0.00004 0.02196
E2F1_ATG12
0.16431 0.00762 0.05090 LC3_PTEN 0.00574 0.00006 0.00676
E2F1_BAX
0.02714 0.01489 0.03789 LC3_XIAP 0.00112 0.00000 0.00264
E2F1_BCL2
0.00716 0.00017 0.00361 ULK1_AIFM1 0.00004 0.00271 0.00000
E2F1_BCL2L1
0.03851 0.00511 0.01052 ULK1_AKT1 0.00009 0.00011 0.00017
E2F1_CASP8
0.07422 0.00993 0.09363 ULK1_ATG3 0.08868 0.02385 0.04993
E2F1_CSE1L
0.02619 0.02525 0.02747 ULK1_ATG12 0.03242 0.01312 0.02518
E2F1_DIABLO
0.14033 0.02897 0.29365 ULK1_BAX 0.10828 0.03532 0.07295
E2F1_FAS
0.00084 0.00000 0.00027 ULK1_BCL2 0.01626 0.00077 0.01425
E2F1_FRAP1
0.02063 0.00792 0.01632 ULK1_BCL2L1 0.00284 0.00186 0.00166
E2F1 PRKAA 1
0.02286 0.03169 0.14706 ULK1_CASP8 0.04841 0.02399 0.03932
E2F1_PTEN
0.15150 0.01199 0.07354 ULK1_CSE1L 0.01897 0.01106 0.01575
E2F1_XIAP
0.05458 0.00110 0.02301 ULK1 DIABL O 0.03413 0.03998 0.04386
LAMP1_LC3
0.00212 0.00007 0.00381 ULK1_FAS 0.00271 0.00000 0.00185
LAMP1_ULK1
0.00594 0.01664 0.00165 ULK1_FRAP1 0.00118 0.04037 0.00059
LAMP1 AIFM 1
0.00488 0.00132 0.00362 ULK1 PRKAA 1 0.02697 0.02975 0.02504
LAMP1_AKT1
0.00078 0.00010 0.00176 ULK1_PTEN 0.06942 0.05032 0.04631
LAMP1_ATG3
0.00940 0.00019 0.00482 ULK1_XIAP 0.00151 0.00139 0.00037
Marcador
Valor P Marcador Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad Recurrencia Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
LAMP1 ATG1 2
0.02021 0.00089 0.02300 AIFM1_AKT1 0.00002 0.00053 0.00002
LAMP1_BAX
0.01005 0.00146 0.00913 AIFM1_ATG3 0.00113 0.01802 0.00069
LAMP1_BCL2
0.01957 0.00454 0.01225 AIFM1_ATG12 0.00255 0.00589 0.00071
LAMP1 BCL2 L1
0.00162 0.00109 0,00204 AIFM1_BAX 0.00088 0.00603 0.00112
LAMP1 CASP 8
0.01155 0.00654 0.01492 AIFM1_BCL2 0.00951 0.00065 0.00520
LAMP1 CSE1 L
0.00260 0.00167 0.00072 AIFM1 BCL2L 1 0.00031 0.00046 0.00041
LAMP1 DIAB LO
0.00904 0.00243 0.00405 AIFM1 CASP 8 0.00097 0.00310 0.00179
LAMP1_FAS
0.00039 0.00000 0.00028 AIFM1_CSE1L 0.00475 0.01283 0.00686
LAMP1 FRAP 1
0.01773 0.00289 0.01815 AIFM1 DIABL O 0.00186 0.04046 0.00307
LAMP1 PRKA A1
0.01790 0.00020 0.02398 AIFM1_FAS 0.01967 0.00000 0.01279
LAMP1_PTEN
0.02907 0.00122 0.01067 AIFM1 FRAP 1 0.00010 0.03628 0.00013
LAMP1_XIAP
0.01038 0.00164 0.01272 AIFM1 PRKA A1 0.00090 0.02749 0.00114
LC3_ULK1
0.00136 0.00002 0.00296 AIFM1_PTEN 0.00101 0.00867 0.00123
LC3_AIFM1
0.00003 0.00015 0.00063 AIFM1_X1AP 0.00438 0.00388 0.00571
LC3_AKT 1
0.00013 0.00001 0.00006 AKT1_ATG3 0.00037 0.00003 0.00043
LC3_ATG3
0.00560 0.00002 0.00871 AKT1_ATG12 0.00043 0.00037 0.00072
LC3_ATG12
0.00646 0.00003 0.01685 AKT1_BAX 0.00067 0.00074 0.00061
LC3_BAX
0.00250 0.00019 0.00638 AKT1_BCL2 0.00027 0.00001 0.00018
LC3_BCL2
0.00332 0.00078 0.00666 AKT1_BCL2L1 0.00310 0.00025 0.00265
LC3_BCL2L1
0.00485 0.00009 0.01206 AKT1_CASP8 0.00056 0.00005 0.00050
LC3_CASP8
0.02236 0.00005 0.04875 AKT1_CSE1L 0.00014 0.00000 0.00024
-LC3_CSEIL
0.03137 0.00017 0.04571 AKT1 DIABL O 0.00059 0.00004 0.00100
LC3_DIABLO
0.01354 0.00003 0.01930 AKT1_FAS 0.00016 0.00000 0.00012
LC3_FAS
0.00184 0.00000 0.00340 AKT1_FRAP1 0.00068 0.00005 0.00032
Marcador
Valor P Marcador Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad Recurrencia Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
AKT1_PRKAA1
0.00068 0.00001 0.00066 BCL2_PTEN 0.02127 0.00302 0.00809
AKT1_PTEN
0.00071 0.00018 0.00059 BCLS2_XIAP 0.02736 0,00290 0.01938
AKT1_XIAP
0.00116 0.00118 0.00100 BCL2L CASP 8 0.08272 0.01882 0.05650
ATG3_A7G12
0.15445 0.14873 0.25699 BCL2L1 CSE 1L 0.01769 0.00000 0.00700
ATG3_BAX
0.02736 0.04408 0.02059 BCL2L1 DIAB LO 0.01088 0.01110 0.02757
ATG3_BCL2
0.01955 0.01158 0.01094 BCL2L1_FAS 0.00070 0.00000 0.00023
ATG3_BCL2L1
0.03868 0.01520 0.01342 BCL2L1 FRA P1 0.01802 0.01215 0.01427
ATG3_CASP8
0.18048 0.21489 0.10896 BCL2L1 PRK AA1 0.03436 0.00833 0.04360
ATG3_CSE1L
0.09776 0.01335 0.20272 BCL2L1 PTE N 0.04370 0.00257 0.01352
ATG3_DIABLO
0.18448 0.28800 0.06279 BCL2L1_XIAP 0.02829 0.02026 0.03847
ATG3_FAS
0.00701 0.00000 0.00048 CASP8 CSE1 L 0.12292 0.00721 0.05678
ATG3_FRAP1
0.03988 0.08529 0.04513 CASP8 DIAB LO 0.17491 0.18725 0.28080
ATG3_PRKAA1
0.12105 0.24500 0.14597 CASPB_FAS 0.00256 0.00000 0.00136
ATG3_PTEN
0.37245 0.01382 0.23336 CASP8 FRAP 1 0.05703 0.18479 0.03680
ATG3_XIAP
0.04243 0.06838 0.10574 CASP8 PRKA A1 0.12642 0.22765 0.18655
ATG12_BAX
0.03524 0_02723 0.03497 CASP8_PTEN 0.19020 0.23066 0.29905
ATG12_BCL2
0.01507 0.00202 0.01477 CASP8_XIAP 0.21861 0.01829 0.18520
ATG12-BCL2L1
0.03069 0.01334 0.03303 CSE1L DIABL O 0.08685 0.00226 0.13233
ATG12_CASP8
0.03429 0.25396 0.24041 CSE1L_FAS 0.00106 0.00000 0.00045
ATG12_CSE1L
0.12720 0.00375 0.05225 CSE1L FRAP 1 0.02406 0.00218 0.00208
ATG12_DIABLO
0.17794 0.13391 0.16379 CSE1L PRKA A1 0.11173 0.01837 0.05249
ATG12_FAS
0.00629 0.00000 0.00255 CSE1L_PTEN 0.06721 0.00371 0.05229
ATG12_FRAP1
0.01939 0.06615 0.02144 CSE1L_XIAP 4.01878 0.00422 0.02168
ATG12_PRAA1
0.15988 0.07166 0.25753 DIABLO_FAS 0.00946 0.00000 0.00393
ATG12_PTEN
0.02937 0.07228 0.29766 DIABLO FRA P1 0.00193 0.00706 0.00190
ATG12_XIAP
0.1451 0.10198 0.15802 DIABLO PRK AA1 0.39049 0.22100 0.21006
Marcador
Valor P Marcador Valor P
Recurrencia
Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad Recurrencia Supervivencia general Supervivencia libre de enfermedad
BAX_BCL2
0.01443 0.00904 0.01411 DIABLO PTE N 0.18426 0.00785 0.14222
BAX_BCL2L1
0.14757 0.01104 0.48992 DIABLO_XIAP 0,21769 0.03111 0.25563
BAX_CASP8
0.1873 0.34789 0.19927 PAS_FRAP1 0.00603 0.00000 0.00103
BAX_CSE1L
0.00618 0.00328 0.00814 FAS_PRKAA1 0.00750 0.00000 0.00181
BAX_DIABLO
0.07894 0.10527 0.06564 FAS_PTEN 0.00701 0.00000 0.00420
BAX_FAS
0.00177 0.00000 0.00025 FAS_XIAP 0.00366 0.00000 0.00154
BAX_FRAP1
0.01460 0.17898 0.01397 FRAP1 RKAA 1 0.02661 0.19329 0.01940
BAX_PRKAA1
0.05687 0.11741 0.03650 FRAP1_PTEN 0.02321 0.05015 0.01473
BAX_PTEN
0.02200 0.12485 0.04668 FRAP1_XIAP 0.03353 0.03111 0.01147
BAX_XIAP
0.06035 0.02569 0.02866 PRKAA1 PTE N 0.17904 0.00186 0.07802
BCL2 BCL2L1 L1
0.01560 0.00096 0.01055 PRKAA1 XIA P 0.18116 0.02727 0.15221
BCL2_CASP8
0.03785 0.00703 0.01883 PTEN_XIAP 0.03963 0.01364 0.17000
BCL2_CSE1L
0.00982 0.00417 0.00709
BCL2_DIABLO
0.02945 0.00215 0.00896
BCL2_FAS
0.00235 0.00000 0.00069
BCL2_FRAP1
0.02771 0.00437 0.01162
BCL2_PRKAA1
0.00963 4.00180 0.01691
Como se puede confirmar en las figuras. 3 a 10, en las curvas de Kaplan-Meier completadas con respecto a la recurrencia, supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad, cada uno de los marcadores de forma curvas donde los casos de alta expresion y baja expresion se distinguen claramente unos de otros. Esto significa que 5 existen diferencias notables en la tasa de repetition de intervalo o la tasa de supervivencia de intervalo, y la tasa de recurrencia acumulada o tasa de supervivencia acumulada en funcion de estos entre los casos en los que cada uno de los marcadores muestra alta expresion y baja expresion, y que, por consiguiente, los patrones de expresion de cada de los marcadores puede ser un Indice que muestra la posibilidad de recurrencia o la posibilidad de supervivencia de los pacientes.
10 Como se puede confirmar a partir de las Tablas 6 a 9 anteriores, cada uno de los marcadores o todas las combinaciones de dos tipos de marcadores muestran valores p lo suficientemente bajos como para ser considerados significativos en terminos de toda recurrencia, supervivencia general y supervivencia libre de enfermedad. Cuando un valor p se hace menor, la significancia estadlstica se hace mayor. Por lo tanto, los valores p bajos sugieren que la estimation para el pronostico de cancer de hlgado por cada uno de los marcadores o sus
15 combinaciones son exactos. En particular, la mayorla de cada uno de los marcadores o cualquier combination de dos tipos de marcadores muestran los valores p de menos de 0.05, que es deseablemente baja.
Todos los valores de p de combinaciones de tres o mas tipos de marcadores son menores de 0.05, marcadores individuales o combinaciones de dos o mas marcadores que muestran valores p mas bajos, y los correspondientes valores de p son como se muestra a continuation en la Tabla 10.
[Recurrencia]
Numero de marcadores combinados Marcador
Valor P
1
AKT1 0.00300
2
DRAM_AKT 1 0.00041
3
DRAM_ULK1_AKT 1 0.00010
4
DRAM_ULK1_AKT1_CSE1 L 0.00004
5
DRAM_ULK1_KT 1 _AT G12_CSE1 L 0.00002
6
DRAM_E2F1_ULK1_AKT1_CSE1 L_FRAP1 0.00002
7
DRAM_E2F1_ULK1_AKT1_ATG12_CSE1L_FRAP1 0.00001
8
DRAM_E2F1_ULK1_AKT1_ATG3-ATG12_CSE1_FRAP1 0,00001
[Supervivencia General]
Numero de marcadores combinados Marcador
Valor P
1
FAS 0.00000
2
DRAM_FAS 0.00000
3
DRAM_AT G3_FAS 0.00000
4
DRAM_AKT 1_CSE1 L_FAS 0.00000
5
DRAM_AKT1_ATG3_CSE1 L_FAS 0.00000
6
ATG7_DRAM_AKT1_ATG3_CSE1 L_FAS 0.00000
7
ATG7_D RAM_AKT 1 _AT G3_DIABLO_FAS_PRKAA1 0.00000
8
ATG7_DRAM_AKT 1_ATG3_CSE1 L_FAS_PRKAA1_XIAP 0.00000
[Supervivencia libre de enfermedad]
Numero de marcadores combinados Marcador
Valor P
1
AKT1 0.00220
2
DRAM_AKT 1 0.00049
3
DRAM_ULK1_AKT 1 0.00010
4
DRAH_ULK1_AKT1_CSE1 L 0.00003
5
DRAM_E2F1_ULK1_AKT1_CSE1 L 0.00002
6
DRAM_E2F1_ULK1_AKT1_ATG12_CSE1L 0.00002
7
DRAM_E2F1_ULK1_AKT 1_CSE1 L_FRAP1_PRKAA1 0.00001
5
10
15
20
25
30
[Recurrencia]
Numero de marcadores combinados
Marcador Valor P
8
DRAM_E2F1_ULK1_AKT1_ATG12_CSE1L_FRAP1_PRKAA1 0.00001
Como se puede ver de la Tabla 10 anterior, se puede encontrar que, entre mas marcadores de la presente invencion se combinen, mas bajos son los valores p. Esto significa que entre mas marcadores de la presente descripcion se combinen, menores valores p, lo que significa mayor importancia, se muestra, lo que significarla que se alcance precision mejorada en la estimacion para el pronostico basado en las combinaciones de los marcadores.
Ejemplo 6: Validacion cruzada
Se realizo validacion cruzada para combinaciones de marcadores que fueron estadlsticamente significativas en el Ejemplo 5.
369 pacientes de cancer de hlgado se dividieron al azar en dos grupos (grupo positivo: 185 pacientes; grupo de prueba: 184 pacientes). Para el grupo positivo, se establecio experimentalmente un valor inicial que fue considerado estadlsticamente significativo de acuerdo con el mismo metodo que en el Ejemplo 3, y se hizo una clasificacion en alta expresion y baja expresion. Con el valor inicial establecido fijado de este modo, para el grupo de prueba, la exactitud de la estimacion se calculo que estaba en el nivel de p <0.05 o p <0.001 con respecto a la recurrencia, la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad.
Entre los ejemplos representativos que muestran la excelente precision de pronostico con respecto a la recurrencia, supervivencia general y supervivencia libre de enfermedad son las siguientes:
Recurrencia: AIFM1_AKT1_LC3 (77.3% en el nivel de p<0.05)
Supervivencia general: ATG5_DRAM_FAS_XIAP (87.3% en el nivel de p<0.001)
Supervivencia libre de enfermedad: AIFM1_AKT1_LC3 (71.3% en el nivel de p<0.05)
<110> CBSBIOSCIENCE, CO., LTD
<120> MARCADORES PARA PRONOSTICO DE CANCER DE HIGADO <130> Y09KP-027 <160> 78
<170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero CBS <400> 1
gttggcaaag tcatctacaa gca 23
<210>2
5
10
15
20
25
30
<211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso CBS <400>2
gggcgaagtg gtccatctc <210>3 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda CBS <400> 3
acgctgggca ggctctcgca c <210>4 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero NNMT <400> 4
ttgaggtgat ctcgcaaagt tatt <210>5 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso NNMT <400> 5
ctcgccacca gggagaaa
19
21
24
18
5
10
15
20
25
30
<210>6 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda NNMT <400> 6
ccaccatggc caacaacgaa ggac 24 <210>7 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero TKT <400> 7
gaggctgtgt ccagtgcagt ag 22
<210>8 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso TKT <400> 8
ccacttcttg gtacccggtt aa 22
<210>9 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda TKT <400> 9
5
10
15
20
25
30
<210> 10 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero BCL2 <400> 10
catgtgtgtg gagagcgtca a 21
<210> 11 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso BCL2 <400> 11
gccggttcag gtactcagtc a 21
<210> 12 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda BCL2 <400> 12
cctggtggac aacatcgccc tgt 23
<210> 13 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero FAS
5
10
15
20
25
30
aatggtgtca atgaagccaa aat 23
<210> 14 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso FAS <400> 14
gtcatacgct tctttctttc catga 25
<210> 15 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda FAS <400> 15
tgacaatgtc caagacacag cagaacagaa 30
<210> 16 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero BAX <400> 16
ggttgtcgcc cttttctact ttg 23
<210> 17 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
<223> Cebador inverso BAX <400> 17
cagttccggc accttggt <210> 18 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda BAX <400> 18
cagcaaactg gtgctcaagg ccct <210> 19 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero BCL2L1 <400> 19
gattgccttt gttttgatgt ttgt <210> 20 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso BCL2L1 <400> 20
ggaaagggaa cccaggttag tg <210> 21 <211> 29 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
24
24
22
5
10
15
20
25
30
<220>
<223> Sonda BCL2L1 <400> 21
cagaattgat cattttcccc ccactctcc 29 <210> 22 <211> 29 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero AIFM1 <400> 22
tgaagatctc aatgaagtag ccaaactat 29 <210> 23 <211 > 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso AIFM1 <400> 23
ctgcagtggg tttgccaat 19
<210> 24 <211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda AIFM1 <400> 24
caacattcat gaagactgaa gccccaca 28 <210> 25 <211> 25 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero CASP8 <400> 25
ccttctgatt gatggtgcta ttttg 25
<210> 26 <211 > 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso CASP8 <400> 26
gcggtgagcc gagatcac 18
<210> 27 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda CASP8 <400> 27
cagaatctcg ctctgtcgcc cagg 24
<210> 28 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero CSE1L <400> 28
gcatgatcct gtaggtcaaa tgg 23
<210> 29 <211> 22
5
10
15
20
25
30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso CSE1L <400> 29
caggcggtag acaacttgtg aa 22
<210> 30 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda CSE1L <400> 30
aataacccca aaattcacct ggcacagtca 30 <210> 31 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero XIAP <400> 31
gacaggccat ctgagacaca tg 22
<210> 32 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso XIAP <400> 32
agcatagtct ggccagttct gaa 23
<210> 33
5
10
15
20
25
30
<211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda XIAP <400> 33
agacaccata tacccgagga accctgcc 28 <210> 34 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero DIABLO <400> 34
aatcacattc agctggtgaa actg 24
<210> 35 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso DIABLO <400> 35
tgccagcttg gtttctgctt 20
<210> 36 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda DIABLO <400> 36
aagaggtgca ccagctctcc egg 23
5
10
15
20
25
30
<210> 37 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero AKT1 <400> 37
tctcgggtgc atttgagaga a 21
<210> 38 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso AKT1 <400> 38
acagcacaaa aacgtctttc ca 22
<210> 39 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda AKT1 <400> 39
ccacgctgtc ctctcgagcc ca 22
<210> 40 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero PTEN <400> 40
5
10
15
20
25
30
tggcggaact tgcaatcc 18
<210> 41 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso PTEN <400> 41
gctgagggaa ctcaaagtac atga 24
<210> 42 <211> 29 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda PTEN <400> 42
atattcctcc aattcaggac ccacacgac 29 <210> 43 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero FRAP1 <400> 43
aggccgcatt gtctctatca a 21
<210> 44 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso FRAP1
5
10
15
20
25
30
<400> 44
gcagtaaatg caggtagtca tcca 24
<210> 45 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> sonda FRAP1 <400> 45
tgcaatccag ctgtttggcg cc 22
<210> 46 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero PRKAA1 <400> 46
ggcagttgcc taccatctca taa 23
<210> 47 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso PRKAA1 <400> 47
gccgagtcag gtgatgatca 20
<210> 48 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
<223> Sonda PRKAA1 <400> 48
tctatttggc gacaagccca cctgatt 27
<210> 49 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero ATG3 <400> 49
ccattgaaaa tcaccctcat ctg 23
<210> 50 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso ATG3 <400> 50
cacctcagca tgcctgcat 19
<210> 51 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda ATG3 <400> 51
caccacctcc catgtgttca gttcacc 27
<210> 52 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
<220>
<223> Cebador delantero ATG12 <400> 52
cgacagcttc gatttgaatg ac <210> 53 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso ATG12 <400> 53
gggagcgtcg caaagga <210> 54 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda ATG12 <400> 54
tgtaattgcg tccccctact ccggc <210> 55 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero ATG5 <400> 55
tttcctccac tgccatcatt aa <210> 56 <211> 20 <212> ADN
17
25
22
5
10
15
20
25
30
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso ATG5 <400> 56
ggccaaaggt ttcagcttca 20
<210> 57 <211> 29 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda ATG5 <400> 57
cctcagctgt gacatgaaag acttaccgg 29 <210> 58 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero ATG7 <400> 58
cggatgaatg agcctccaa 19
<210> 59 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso ATG7 <400> 59
ggacattatc aaaccgtgaa agaa 24
<210> 60 <211> 25
5
10
15
20
25
30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda ATG7 <400> 60
tcttgggctt gtgcctcacc agatc <210> 61 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero BNIP3 <400> 61
ttccccccaa ggagttcct <210> 62 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso BNIP3 <400> 62
cgctcgtgtt cctcatgct <210> 63 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda BNIP3 <400> 63
acccgaagcg cacggccac <210> 64
25
19
19
5
10
15
20
25
30
<211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero DRAM <400> 64
cagccgcctt cattatctcc ta 22
<210> 65 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso DRAM <400> 65
tggaggtgtt gttcccgtat c 21
<210> 66 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda DRAM <400> 66
tgctctccgg gcacgtcaac c 21
<210> 67 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero LAMP1 <400> 67
tgcactcaga tttaagcctt acaaa 25
5
10
15
20
25
30
<210> 68 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso LAMP1 <400> 68
tcaccacgag tgaccttcat g 21
<210> 69 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda LAMP1 <400> 69
aagcctctgg ccgtcacacg tagg 24
<210> 70 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero LC3 <400> 70
aaccagcaca gcatggtgag t 21
<210> 71 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso LC3 <400> 71
5
10
15
20
25
30
cctcgtcttt ctcctgctcg ta <210> 72 <211> 19 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda LC3 <400> 72
tccacgccca tcgcggaca <210> 73 <211 > 14 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero ULK1
<400> 73
tcgcggccgc atgt
<210> 74
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso ULK1 <400> 74
aagggtccag cactatcaag aga <210> 75 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda ULK1
19
14
23
5
10
15
20
25
<400> 75
agcaggtcct gggcgcctca ac 22
<210> 76 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador delantero E2F1 <400> 76
ctggaccacc tgatgaatat ctgt 24
<210> 77 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador inverso E2F1 <400> 77
caatgctacg aaggtcctga ca 22
<210> 78 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Sonda E2F1 <400> 78
cagctgcgcc tgctctccga 20

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para estimar el pronostico de supervivencia general en un paciente con cancer de hlgado que comprende:
    etapa 1, poner en contacto una muestra biologica recolectada del paciente que tiene cancer de hlgado con una 5 composicion que comprende una sustancia para detectar especlficamente el nivel de expresion del gen CBS;
    etapa 2, detectar diferencias en el nivel de expresion de CBS al comparar el resultado del tratamiento de la etapa 1 con un valor de referencia;
    en donde se pronostica la supervivencia general del cancer de hlgado, y en donde el nivel de expresion de CBS mayor que el valor de referencia indica que el pronostico de supervivencia general es relativamente bueno.
    10 2. Un metodo para estimar el pronostico de supervivencia general en un paciente con cancer de hlgado que
    comprende:
    etapa 1, poner en contacto una muestra biologica recolectada del paciente que tiene cancer de hlgado con una composicion que comprende una sustancia para detectar especlficamente el nivel existente de la protelna codificada por el gen CBS; y
    15 etapa 2, detectar diferencias en el nivel existente de la protelna codificada por el gen CBS al comparar el resultado del tratamiento de la etapa 1 con un valor de referencia;
    en donde se pronostica la supervivencia general del cancer de hlgado, y en donde el nivel existente de la protelna codificada por el gen CBS mayor que el valor de referencia indica que el pronostico de supervivencia general es relativamente bueno.
    20
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EP2420575B1 (en) 2016-03-30

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