ES2576746T3

ES2576746T3 - Métodos para prevenir o tratar síndrome metabólico

Info

Publication number: ES2576746T3
Application number: ES10808688.5T
Authority: ES
Inventors: Hazel H. Szeto
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2009-08-12
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2016-07-11
Anticipated expiration: 2030-08-11
Also published as: EP2464371B1; EP3427746A1; CN105031605A; US20110039766A1; CA2770688C; CN102647994A; JP2019104768A; WO2011019809A1; CN107412724A; JP2016041762A; CA2770688A1; HK1247820A1; JP6271785B2; US20160199435A1; EP2464371A4; US20180104304A1; DK2464371T3; EP2464371A1; US20190209641A1; JP2017132782A

Abstract

Péptido D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 o Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 para su uso en el tratamiento o la prevención del síndrome metabólico en un sujeto mamífero.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

DESCRIPCION

Metodos para prevenir o tratar slndrome metabolico Campo tecnico

La presente tecnologla se refiere en general a los metodos de prevencion o tratamiento de slndrome metabolico. En particular, la presente tecnologla se refiere a la administracion de peptidos aromaticos cationicos en cantidades eficaces para prevenir o tratar el slndrome metabolico o afecciones asociadas en sujetos mamlferos.

Antecedentes

Se proporciona la siguiente descripcion para ayudar a la comprension del lector. Ninguna de la informacion proporcionada o referencias citadas se admite como tecnica anterior a la presente invencion.

El slndrome metabolico es un conjunto de trastornos de la salud o riesgos que aumentan la probabilidad de desarrollar enfermedades del corazon, accidente cerebrovascular y diabetes. La condicion tambien se conoce por otros nombres, incluyendo el slndrome X y slndrome dismetabolico. El slndrome metabolico puede incluir cualquiera de una variedad de fenotipos metabolicos subyacentes, incluyendo resistencia a la insulina y/o fenotipos de predisposicion a la obesidad.

El slndrome metabolico se caracteriza a menudo por cualquiera de un numero de trastornos metabolicos o factores de riesgo, que generalmente se consideran mas caracterizado slndrome metabolico cuando mas de uno de estos factores estan presentes en un solo individuo. Los factores incluyen: obesidad central (tejido graso desproporcionado en y alrededor del abdomen), dislipidemia aterogenica (estos incluyen una familia de trastornos de llpidos en la sangre, incluyendo, por ejemplo, trigliceridos altos, colesterol HDL bajo, y el colesterol LDL alto que puede favorecer la acumulacion de placa en el sistema vascular, incluyendo paredes de las arterias), presion arterial alta, resistencia a la insulina o intolerancia a la glucosa (la imposibilidad de utilizar correctamente la insulina o azucar en la sangre), un estado protrombotico cronica (por ejemplo, que se caracteriza por un niveles altos del inhibidor activador del plasminogeno en la sangre), y un estado proinflamatorio cronico (por ejemplo, caracterizada por niveles mas altos que los niveles normales de protelna de alta sensibilidad C-reactiva en la sangre). Las personas con slndrome metabolico tienen un mayor riesgo de enfermedad cardiaca coronaria, otras enfermedades relacionadas con la acumulacion de placa en las paredes arteriales (por ejemplo, accidente cerebrovascular y enfermedad vascular periferica) y diabetes tipo 2.

Las causas subyacentes del slndrome metabolico no estan claras, aunque ciertos efectos de la enfermedad, tales como la obesidad y la falta de actividad flsica son a menudo de naturaleza causal. Teniendo en cuenta los patrones de herencia para el trastorno, tambien parece que existen factores geneticos que subyacen a este slndrome.

Resumen

La presente tecnologla se refiere en general al tratamiento o prevencion del slndrome metabolico y de las afecciones asociadas en mamlferos mediante la administracion de cantidades terapeuticamente eficaces de los peptidos cationicos aromaticos a sujetos en necesidad de los mismos. En realizaciones particulares, los peptidos aromaticos cationicos tratan o previenen el slndrome metabolico mediante la reduccion de la gravedad o la ocurrencia de la dislipidemia, la obesidad central, trastornos de llpidos en la sangre, o resistencia a la insulina.

En un aspecto, la divulgacion proporciona Peptido D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 o Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 para su uso en el tratamiento o la prevencion del slndrome metabolico en un sujeto mamlfero.

En algunas realizaciones, el slndrome metabolico se asocia con la resistencia a la absorcion de la glucosa mediada por insulina, intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia, aumento de colesterol LDL, aumento de VLDL, aumento de los trigliceridos, disminucion de colesterol HDL, aumento de los niveles de inhibidor del activador del plasminogeno-1 e hipertension. En una realizacion ilustrativa, el slndrome metabolico se caracteriza por tres o mas de los siguientes criterios:

(a) obesidad abdominal: circunferencia de cintura > 102 cm en hombres y > 88 cm en mujeres;

(b) hipertrigliceridemia: > 150 mg/dl (1.695 mmol/l);

(c) colesterol HDL bajo: <40 mg/dl (1.036 mmol/l) en hombres y <50 mg/dl (1.295 mmol/l) en mujeres;

(d) presion arterial alta: > 130/85 mm Hg; y

(e) glucosa alta en ayunas: > 110 mg/dl (> 6.1 mmol/l).

En una realizacion ilustrativa, el slndrome metabolico se caracteriza por diabetes, intolerancia a la glucosa, alteracion de la glucosa en ayunas, o resistencia a la insulina ademas de dos o mas de las siguientes anomallas:

(a) presion arterial alta: > 160/90 mm Hg;

5 (b) hiperlipidemia: concentracion de trigliceridos > 150 mg/dl (1.695 mmol/l) y/o colesterol HDL <35 mg/dl (0.9

mmol/l) en hombres y <39 mg/dl (1.0 mmol/l) en mujeres;

(c) obesidad central: relacion cintura-cadera de >0.90 en hombres o >0.85 en mujeres o BMI >30 kg/m2; y

(d) microalbuminuria: velocidad de excrecion urinaria de albumina > 20 pg/min o una relacion albumina con creatinina > 20 mg/g.

10 En una realizacion ilustrativa, el slndrome metabolico se caracteriza por tres o mas de los siguientes criterios:

(a) trigliceridos > 150 mg/dl;

(b) presion arterial sistolica (BP) > 130 mm Hg o presion arterial diastolica > 85 mm Hg o en tratamiento antihipertensivo;

(c) colesterol de lipoprotelnas de alta densidad < 40 mg/dl;

15 (d) azucar en sangre en ayunas (FBS) > 110 mg/dl; y

(e) Indice de masa corporal. > 28.8 kg/m2.

En una realizacion, el slndrome metabolico se trata a traves de la mejora del metabolismo de llpidos en comparacion con el metabolismo de los llpidos del sujeto antes de que se administre el peptido. En una realizacion, la mejora en el metabolismo de los llpidos es la reduccion del nivel de trigliceridos en la sangre en comparacion con el nivel de 20 trigliceridos en la sangre del sujeto antes de que se administre el peptido. En una realizacion, la mejora en el metabolismo de los llpidos es la mejora de la relacion de colesterol HDL/LDL en sangre en comparacion con el colesterol en sangre HDL/LDL del sujeto antes de que se administre el peptido. En una realizacion, el slndrome metabolico es tratado mediante la reduccion de nivel de azucar en sangre en comparacion con el nivel de azucar en la sangre del sujeto antes de que se administre el peptido. En una realizacion, el slndrome metabolico es tratado por 25 una reduccion en el peso corporal en comparacion con el peso corporal del sujeto antes de que se administre el peptido.

En algunas realizaciones, los peptidos aromaticos cationicos se usan para tratar o prevenir las afecciones asociadas con el slndrome metabolico en sujetos mamlferos, que incluyen, pero no se limitan a, obesidad central, dislipidemia, hiperinsulinemia, diabetes tipo II, funcion endotelial vascular anormal, retinopatla, enfermedad arterial coronaria, 30 enfermedad cardiovascular, disfuncion renal, hipertension, hlgado graso, neuropatla, e hiperuricemia. Los ejemplos especlficos de enfermedades cardiovasculares potencialmente causados por slndrome metabolico y afecciones asociadas incluyen infarto de miocardio, accidente cerebrovascular hemorragico o isquemico (infarto cerebral).

Los peptidos aromaticos cationicos se pueden administrar en una variedad de maneras. En algunas realizaciones, los peptidos se pueden administrar por via oral, topica, intranasal, intravenosa, subcutanea, o transdermica (por 35 ejemplo, por iontoforesis).

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre el peso corporal. Los valores son la media ± S.E.M. # P <0.001 frente a comida para ratas normales (NRC) + vehlculo. * P <0.05, ** p <0.01 frente a HFD/STZ + vehlculo. Cuadrados, ratas NRC tratadas con vehlculo, n = 5; triangulos, ratas HFD/STZ tratadas con 40 vehlculo, n = 7; clrculos solidos, ratas HFD/STZ tratadas con SS-31 a 10 mg/kg, n = 7; clrculos abiertos, ratas HFD/STZ tratadas con SS-20 a 10 mg/kg, n = 7.

La figura 2 es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre la glucosa en sangre a las 4 semanas de tratamiento. Los valores son la media ± S.E.M. # P <0.001 frente a HFD/STZ + vehlculo. * P = 0.031, P ** 0.006frente HFD/STZ + vehlculo. Cuadrados, ratas NRC tratadas con vehlculo, n = 5; triangulos, las ratas 45 HFD/STZ tratadas con vehlculo, n = 7; clrculos solidos, ratas HFD/STZ tratadas con SS-31 a 10 mg/kg, n = 7; clrculos abiertos, ratas HFD/STZ tratadas con SS-20 a 10 mg/kg, n = 7.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La figura 3 es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos en gliceridos totales en ratas HFD/STZ mas de 10 semanas de tratamiento.

La figura 4A es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre los trigliceridos en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta despues de 14 semanas de tratamiento. La figura 4B es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre el colesterol total en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta despues de 14 semanas de tratamiento. La figura 4C es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre el colesterol HDL en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta, despues de 14 semanas de tratamiento.

La figura 5A es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre la grasa abdominal en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta despues de 14 semanas de tratamiento. La figura 5B es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos en la grasa subcutanea en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta despues de 14 semanas de tratamiento.

La figura 6 es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos en gliceridos en un modelo de rata STZ del slndrome metabolico.

Descripcion detallada

Se debe apreciar que ciertos aspectos, modos, realizaciones, variaciones y caracterlsticas de la invencion se describen a continuacion en varios niveles de detalle con el fin de proporcionar una comprension sustancial de la presente invencion.

En la practica de la presente invencion, se utilizan muchas tecnicas convencionales en biologla molecular, bioqulmica de protelnas, biologla celular, inmunologla, microbiologla y ADN recombinante. Estas tecnicas son bien conocidas y se explican en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); y Meth. Enzymol., Vols. 154 and 155, Wu & Grossman, and Wu, Eds., respectivamente.

Las definiciones de ciertos terminos que se utilizan en esta especificacion se proporcionan a continuacion. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en la presente invencion generalmente tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto habitual en el arte a la que pertenece esta invencion.

Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "una celula" incluye una combinacion de dos o mas celulas, y similares.

Como se usa en este documento, "aproximadamente" sera entendido por personas con conocimientos ordinarios en la tecnica y variara en cierta medida dependiendo del contexto en donde se utiliza. Si hay usos del termino que no estan claros para las personas de experiencia habitual en la tecnica, dado el contexto en donde se utiliza, "aproximadamente" significara hasta mas o menos el 10% del valor enumerado.

Como se utiliza en este documento, la "administracion" de un agente, farmaco, o peptido a un sujeto incluye cualquier via de introduccion o entrega a un sujeto, un compuesto que funciona de forma satisfactoria. La administracion puede llevarse a cabo por cualquier via adecuada, incluyendo por via oral, intranasal, parenteral (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutanea), o por via topica. La administracion incluye auto- administracion y la administracion, de otro.

Como se utiliza en este documento, el termino "aminoacido" incluye aminoacidos de origen natural y aminoacidos sinteticos, as! como analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de una manera similar a los aminoacidos de origen natural. Los aminoacidos de origen natural son los codificados por el codigo genetico, as! como aquellos aminoacidos que se modifican mas tarde, por ejemplo, hidroxiprolina, g-carboxiglutamato, y O- fosfoserina. Los analogos de aminoacidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura qulmica basica que un acido de origen natural amino, es decir, un a-carbono que esta unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfoxido, metionina metil sulfonio. Tales analogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptldicos modificados, pero

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

conservan la misma estructura qulmica basica que un aminoacido de origen natural. Mimeticos de aminoacidos se refieren a compuestos qulmicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura qulmica general de un aminoacido, pero que funciona de una manera similar a un aminoacido de origen natural. Los aminoacidos pueden ser referidos en este documento por cualquiera de sus comunmente conocidos slmbolos de tres letras o por los slmbolos de una letra recomendados por la Comision de Nomenclatura Bioqulmica IUPAC-IUB.

Como se utiliza en este documento, el termino "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para lograr un efecto terapeutico y/o profilactico deseado, por ejemplo, una cantidad que resulta en la prevencion de, o una disminucion en los slntomas asociados con slndrome metabolico. La cantidad de una composition administrada al sujeto dependera del tipo y gravedad de la enfermedad y de las caracterlsticas del individuo, como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a las drogas. Tambien dependera del grado, gravedad y tipo de enfermedad. El experto en el arte sera capaz de determinar las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores. Las composiciones tambien se pueden administrar en combination con uno o mas compuestos terapeuticos adicionales. En los metodos descritos en este documento, los peptidos aromaticos cationicos se pueden administrar a un sujeto que tiene uno o mas signos de slndrome metabolico. La administration de una cantidad eficaz de los peptidos aromaticos cationicos puede mejorar al menos un signo o slntoma de slndrome metabolico en el sujeto, por ejemplo, peso corporal, acidos grasos libres/insulina/glucosa en ayunas, tolerancia a la glucosa (OGTT), sensibilidad muscular por insulina, marcadores de serialization de la insulina (por ejemplo, Akt-P, IRS-P), los niveles de trigliceridos en suero, niveles de colesterol HDL y LDL, presion arterial, de fibrinogeno o del activador del plasminogeno niveles de inhibidor de suero, los niveles de protelna C-reactiva, funcion mitocondrial (por ejemplo, respiration o emision de H2O2), marcadores de estres oxidativo intracelular (por ejemplo, la peroxidation lipldica, relation GSH/GSSG o actividad aconitasa) y actividad de la enzima mitocondrial. Por ejemplo, una "cantidad terapeuticamente eficaz" de los peptidos aromaticos cationicos se entiende los niveles en los que los efectos fisiologicos del slndrome metabolico son, como mlnimo, mejorados.

Un polipeptido o peptido "aislado" o "purificado" esta sustancialmente libre de material celular u otros polipeptidos contaminantes de la fuente de celula o tejido del que se deriva el agente, o sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros productos qulmicos cuando se sintetiza qulmicamente. Por ejemplo, un peptido aromatico cationico aislado serla libre de materiales que interferirlan con los usos diagnosticos o terapeuticos del agente. Tales materiales que interfieren pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteicos.

Como se utiliza en este documento, el termino "slndrome metabolico" se refiere a una combinacion de trastornos metabolicos o factores de riesgo, que cuando esta presente en un solo individuo, pueden predisponer al individuo a desarrollar enfermedad cardlaca, accidente cerebrovascular, o diabetes.

Como se usa en este documento, los terminos "polipeptido", "peptido" y "protelna" se utilizan indistintamente en este documento para significar un pollmero que comprende dos o mas aminoacidos unidos entre si por enlaces peptldicos o enlaces peptldicos modificados, esto es, isosteros peptldicos. Polipeptido se refiere tanto a cadenas cortas, comunmente se hace referencia como peptidos, glicopeptidos u oligomeros, y a cadenas mas largas, generalmente denominados protelnas. Los polipeptidos pueden contener aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos codificados de gen. Los polipeptidos incluyen secuencias de aminoacidos modificadas ya sea por procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante tecnicas de modification qulmica que son bien conocidos en la tecnica.

El termino "sujeto" como se usa en este documento, se refiere a un miembro de cualquier especie de vertebrados. Los metodos de la materia divulgada en la actualidad son particularmente utiles para los vertebrados de sangre caliente. Aqul se incluye el tratamiento de mamlferos tales como seres humanos, as! como aquellos mamlferos de importancia debido a peligro de extincion, de importancia economica (animales criados en granjas para el consumo humano) y/o de importancia social (animales mantenidos como mascotas o en zoologicos) a los seres humanos. En realizaciones particulares, el sujeto es un humano.

Como se usa en este documento, los terminos "tratar" o "tratamiento" o "que trata" se refieren tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) la condition o trastorno patologico objetivo. Un sujeto es con exito "tratado" para el slndrome metabolico si, despues de recibir una cantidad terapeutica de los peptidos aromaticos cationicos de acuerdo con los metodos descritos en este documento, el sujeto muestra una reduction observable y/o medible o ausencia de uno o mas signos y slntomas de slndrome metabolico. Por ejemplo, el tratamiento puede incluir una reduccion en los niveles de glucosa o de insulina en sangre en ayunas, reduccion en el peso corporal, reduccion en los niveles de trigliceridos en suero o niveles de colesterol HDL y LDL. Tambien se debe apreciar que los diversos modos de tratamiento o prevencion de condiciones medicas que se describen estan destinados a significar "sustancial", que incluye total, pero tambien menos de tratamiento o prevencion total, y en donde se logra algun resultado relevante biologicamente o medicamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Como se usa en este documento, "que previene" o "prevencion" de un trastorno o afeccion se refiere a un compuesto que, en una muestra estadlstica, reduce la aparicion del trastorno o condicion en la muestra tratada con respecto a una muestra de control sin tratamiento, o retrasa el inicio o reduce la gravedad de uno o mas slntomas del trastorno o condicion en relacion con la muestra de control sin tratar.

Slndrome metabolico

El slndrome metabolico (tambien llamado slndrome X) es un slndrome que puede estar asociada con varios criterios tales como la resistencia a la captacion de glucosa estimulada por la insulina, intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia, aumento del colesterol LDL, aumento de los trigliceridos VLDL, disminucion del colesterol HDL, aumento de los niveles de inhibidor del activador del plasminogeno-1 (PAI-1) e hipertension. Otras anomallas metabolicas que se han considerado como parte del slndrome incluyen peso anormal o distribucion del peso, inflamacion, microalbuminuria, hiperuricemia, y anormalidades de fibrinolisis y de coagulacion.

Intolerancia a la glucosa se caracteriza por un estado patologico en el cual el nivel de glucosa en plasma en ayunas es menos de 140 mg por decilitro y la concentracion de glucosa en plasma a los 30, 60, o 90 minutos despues de un ensayo de tolerancia a la glucosa excede 200 mg por decilitro.

La hiperinsulinemia es una condicion en la que el nivel de insulina en la sangre es mas alto de lo normal. La hiperinsulinemia es causada por la sobreproduccion de insulina por el cuerpo y se relaciona con resistencia a la insulina.

La resistencia a la insulina se produce cuando el cuerpo no responde a la insulina fabricada por el pancreas y la glucosa es menos capaz de entrar en las celulas. Los sujetos con resistencia a la insulina pueden o no pueden llegar a desarrollar la diabetes tipo 2. Cualquiera de una variedad de pruebas de uso actual se puede utilizar para determinar la resistencia a la insulina, incluyendo: prueba oral de tolerancia a la glucosa (PTOG), glucosa en sangre en ayunas (FBG), tolerancia a la glucosa normal (NGT), alteracion de la tolerancia a la glucosa (IGT), alteracion de la glucosa en ayunas (IFG), evaluacion del modelo de homeostasis (HOMA), Indice de sensibilidad a la insulina de verificacion cuantitativa (QUICKI) y la prueba de tolerancia a la insulina intravenosa (IVITT). Vease tambien, De Vegt "The 1997 American Diabetes Association criteria versus the 1985 World Health Organization criteria for the diagnosis of abnormal glucose tolerance: poor agreement in the Hoorn Study." Diab Care 1998, 21:1686-1690; Matthews "Homeostasis model assessment: insulin resistance and B-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man." Diabetologia 1985, 28:412-419; Katz "Quantitative Insulin Sensitivity Check Index: A Simple, Accurate Method for Assessing Insulin Sensitivity In Humans." JCE & M, 2000, 85:2402-2410.

La hipertrigliceridemia se define por la concentracion de trigliceridos elevada en sangre. La hiperlipidemia se caracteriza por la presencia de exceso de llpidos en la sangre. Todas las hiperlipidemias (tipos I, 11 b, III, IV y V), excepto el tipo II se caracterizan por niveles elevados de trigliceridos. La hiperlipidemia tipo I se caracteriza por elevaciones severas en los quilomicrones y trigliceridos elevados. Debido a que los quilomicrones tambien contienen una pequena cantidad de colesterol, los niveles de colesterol en suero tambien son bastante altos. La hiperlipidemia tipo IIb es la hiperlipidemia mixta clasica (el colesterol y los trigliceridos altos) causada por elevaciones en tanto la lipoprotelna de baja densidad (LDL) y las lipoprotelnas de muy baja densidad (VLDL). Tipo hiperlipidemia III tambien se conoce como disbetalipoproteinemia, enfermedad eliminacion de restos, o enfermedad de amplia beta. Por lo general, estos pacientes tienen niveles elevados de colesterol total y de trigliceridos y se confunden facilmente con los pacientes con hiperlipidemia tipo IIb. Los pacientes con hiperlipidemia tipo III tienen elevaciones de la lipoprotelna de densidad intermedia (IDL), un remanente de VLDL. Tipo hiperlipidemia IV se caracteriza por elevaciones anormales de VLDL y trigliceridos. los niveles de colesterol en suero son normales. Tipo V hiperlipidemia es la combinacion de los tipos I y IV (elevaciones de ambos quilomicrones y VLDL). Los niveles de colesterol en suero son por lo general elevado, pero los niveles de colesterol LDL son normales. Dada la rareza de la enfermedad de tipo I, cuando se observan niveles elevados de trigliceridos, la causa mas probable es hiperlipidemia tipo V.

Lipoprotelna de muy baja densidad (VLDL) son las lipoprotelnas grandes ricas en trigliceridos que circulan por la sangre donando sus trigliceridos a la grasa y el tejido muscular hasta que los restos de VLDL son modificados y se convierten en LDL. Las lipoprotelnas de alta densidad (HDL) son lipoprotelnas que transportan el colesterol en la sangre; compuesto de una alta proporcion de protelnas y colesterol relativamente pequeno; se cree que los niveles elevados de estar asociado con un menor riesgo de enfermedad cardlaca coronaria y aterosclerosis.

Las personas con slndrome metabolico tienen un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular y de aumento de la mortalidad tanto de enfermedad cardiovascular como de otras causas. Los estudios tambien han encontrado que la agrupacion de factores de riesgo propuestos forma parte del slndrome metabolico puede aumentar el riesgo de enfermedad cardlaca coronaria. Ademas, los componentes del slndrome metabolico son factores de riesgo para la diabetes. El slndrome metabolico se caracteriza a menudo por tres o mas de los siguientes criterios:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1. obesidad abdominal: circunferencia de la cintura > 102 cm en hombres y > 88 cm en mujeres.

2. hipertrigliceridemia: > 150 mg/dl (1.695 mmol/l).

3. colesterol HDL bajo: < 40 mg/dl (1.036 mmol/l) en hombres y <50 mg/dl (1.295 mmol/l) en mujeres.

4. presion arterial alta: > 130/85 mm Hg.

5. niveles altos de glucosa en ayunas: > 110 mg/dl (> 6.1 mmol/l).

6. BMI > 28.8 k/m2.

El slndrome metabolico se puede caracterizar tambien por la diabetes, intolerancia a la glucosa, alteracion de la glucosa en ayunas, o resistencia a la insulina ademas dos o mas de las siguientes anomallas:

1. Presion arterial alta: > 160/90 mm Hg.

2. Hiperlipidemia: concentracion de trigliceridos > 150 mg/dl (1.695 mmol/l) y/o colesterol HDL <35 mg/dl (0.9 mmol/l) en hombres y <39 mg/dl (1.0 mmol/l) en mujeres.

3. Obesidad central: relacion cintura-cadera > 0.90 en hombres o > 0.85 en las mujeres y/o Indice de masa corporal (BMI) > 30 kg/m2.

4. La microalbuminuria: la velocidad de excrecion urinaria de albumina > 90 pg/min o una relacion de albumina- creatinina > 90 mg/g.

Los presentes inventores han descubierto que los peptidos aromaticos cationicos pueden prevenir o tratar el slndrome metabolico en sujetos mamlferos. En algunos casos, el slndrome metabolico puede ser debido a una dieta alta en grasas o, mas generalmente, la sobrealimentacion y la falta de ejercicio. Los peptidos aromaticos cationicos pueden reducir uno o mas signos o slntomas de slndrome metabolico, incluyendo, pero no limitando a, dislipidemia, obesidad central, trastornos de llpidos en sangre, y resistencia a la insulina.

Sin pretender limitar la invencion a un mecanismo de accion particular, se cree que la perdida de la integridad mitocondrial y el vastago de sensibilidad a la insulina de un trastorno metabolico comun, es decir, el estres oxidativo. El exceso de nutricion, especialmente de las dietas altas en grasas puede aumentar especies reactivas del oxlgeno mitocondrial de emision (ROS) y el estres oxidativo en general, lo que lleva a la disfuncion mitocondrial aguda y cronica y el desarrollo del slndrome metabolico. Los peptidos aromaticos cationicos mitigan estos efectos, mejorando as! la funcion mitocondrial en diversos tejidos del cuerpo, mejorando de este modo uno o mas de los factores de riesgo asociados con el slndrome metabolico.

La presente tecnologla se refiere a la reduccion de los slntomas del slndrome metabolico mediante la administracion de ciertos peptidos aromatico-cationicos. Los peptidos aromaticos cationicos son solubles en agua y altamente polar. A pesar de estas propiedades, los peptidos pueden penetrar facilmente las membranas celulares. Los peptidos aromaticos cationicos incluyen por lo general un mlnimo de tres aminoacidos o un mlnimo de cuatro aminoacidos, covalentemente unidos por enlaces peptldicos. El numero maximo de aminoacidos presentes en los peptidos aromaticos cationicos es de unos veinte aminoacidos covalentemente unidos por enlaces peptldicos. Adecuadamente, el numero maximo de aminoacidos es aproximadamente doce, aproximadamente nueve, o aproximadamente seis.

Los aminoacidos de los peptidos aromaticos cationicos pueden ser cualquier aminoacido. Como se utiliza en este documento, el termino "aminoacido" se usa para referirse a cualquier molecula organica que contiene al menos un grupo amino y al menos un grupo carboxilo. Por lo general, al menos un grupo amino esta en la posicion a con respecto a un grupo carboxilo. Los aminoacidos pueden ser de origen natural. Los aminoacidos de origen natural incluyen, por ejemplo, los veinte aminoacidos levogiros (L) mas comunes que se encuentran normalmente en las protelnas de mamlfero, esto es, alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), acido aspartico (Asp), cistelna ( Cys), glutamina (Gln), acido glutamico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano, (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val). Otros aminoacidos de origen natural incluyen, por ejemplo, aminoacidos que se sintetizan en los procesos metabolicos no asociados con la slntesis de protelnas. Por ejemplo, los aminoacidos ornitina y citrulina se sintetizan en el metabolismo de los mamlferos durante la produccion de urea. Otro ejemplo de un aminoacido de origen natural incluye hidroxiprolina (Hyp).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los peptidos contienen opcionalmente uno o mas aminoacidos de origen no natural. De manera optima, el peptido no tiene aminoacidos que son de origen natural. Los aminoacidos de origen no natural pueden ser levogiro (L-), dextrogiro (D-), o mezclas de los mismos. Los aminoacidos no naturales son aquellos aminoacidos que normalmente no son sintetizados en los procesos metabolicos normales en los organismos vivos, y no se producen de forma natural en las protelnas. Ademas, los aminoacidos de origen no natural adecuadamente tampoco son reconocidos por las proteasas comunes. El aminoacido de origen no natural puede estar presente en cualquier posicion en el peptido. Por ejemplo, el aminoacido de origen no natural puede estar en el terminal N, el terminal C, o en cualquier posicion entre el terminal N y el terminal C.

Los aminoacidos no naturales pueden, por ejemplo, comprender grupos alquilo, arilo, o alquilarilo que no se encuentran en los aminoacidos naturales. Algunos ejemplos de aminoacidos no naturales alquilo incluyen acido a- aminobutlrico, acido p-aminobutlrico, acido y-aminobutlrico, acido 8-aminovalerico, y acido e-aminocaproico. Algunos ejemplos de aminoacidos no naturales arilo incluyen acido orto-, meta, y para-aminobenzoico. Algunos ejemplos de los aminoacidos no naturales de alquilarilo incluyen orto-, meta-, y acido para-aminofenilacetico, y acido g-fenil-P- aminobutlrico. Los aminoacidos de origen no natural incluyen derivados de aminoacidos de origen natural. Los derivados de aminoacidos de origen natural pueden ser, por ejemplo, incluir la adicion de uno o mas grupos qulmicos para el aminoacido de origen natural.

Por ejemplo, uno o mas grupos qulmicos se pueden anadir a una o mas de la posicion 2', 3', 4', 5', o 6' del anillo aromatico de un residuo de fenilalanina o tirosina, o la posicion 4', 5', 6', o 7' del anillo benzo de un residuo de triptofano. El grupo puede ser cualquier grupo qulmico que puede ser anadido a un anillo aromatico. Algunos ejemplos de tales grupos incluyen alquilo Ci-C4 no ramificado o ramificado, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, o t-butilo, alquiloxi C1-C4 (esto es, alcoxi), amino, alquilamino C1-C4 y dialquilamino C1-C4 (por ejemplo, metilamino, dimetilamino), nitro, hidroxilo, halo (esto es, fluoro, cloro, bromo, o yodo). Algunos ejemplos especlficos de derivados de origen no natural de aminoacidos de origen natural incluyen norvalina (Nva) y norleucina (Nle).

Otro ejemplo de una modificacion de un aminoacido en un peptido es la formacion de derivados de un grupo carboxilo de un acido aspartico o un residuo de acido glutamico del peptido. Un ejemplo de formacion de derivados es la amidacion con amonlaco o con una amina primaria o secundaria, por ejemplo, metilamina, etilamina, dimetilamina o dietilamina. Otro ejemplo de formacion de derivados incluye esterificacion con, por ejemplo, alcohol metllico o etllico. Otra dicha modificacion incluye la formacion de derivados de un grupo amino de un residuo de lisina, arginina, o histidina. Por ejemplo, dichos grupos amino pueden acilarse. Algunos grupos acilo apropiados incluyen, por ejemplo, un grupo benzoilo o un grupo alcanoilo que comprende cualquiera de los grupos alquilo C1-C4 mencionados anteriormente, tales como un grupo acetilo o propionilo.

Los aminoacidos de origen no natural son preferiblemente resistentes, y mas preferiblemente insensibles, a las proteasas comunes. Los ejemplos de aminoacidos no naturales que son resistentes o insensibles a las proteasas incluyen la forma dextrogira (D-) de cualquiera de los aminoacidos-L de origen natural, as! como aminoacidos L- y/o D- no naturales antes mencionados. Los aminoacidos D no ocurren normalmente en protelnas, a pesar de que se encuentran en ciertos antibioticos peptldicos que se sintetizan por medios distintos de la maquinaria de slntesis de protelna ribosomal normal de la celula. Como se usa en este documento, los D-aminoacidos se consideran aminoacidos de origen no natural.

Con el fin de reducir al mlnimo la sensibilidad de la proteasa, los peptidos deberlan tener menos de cinco, menos de cuatro, menos de tres, o menos de dos L-aminoacidos contiguos reconocidos por las proteasas comunes, independientemente de si los aminoacidos son de origen natural o no. En una realizacion, el peptido tiene solamente D-aminoacidos, y no L-aminoacidos. Si el peptido contiene secuencias sensibles de la proteasa de aminoacidos, al menos uno de los aminoacidos puede ser un D-aminoacido de origen no natural, confiriendo de esta manera resistencia a la proteasa. Un ejemplo de una secuencia sensible a proteasas incluye dos o mas aminoacidos basicos contiguos que son facilmente escindidos por las proteasas comunes, tales como endopeptidasas y tripsina. Los ejemplos de aminoacidos basicos incluyen arginina, lisina e histidina.

Los peptidos aromaticos cationicos deben tener un numero mlnimo de cargas positivas netas a pH fisiologico, en comparacion con el numero total de residuos de aminoacidos en el peptido. El numero mlnimo de cargas positivas netas a pH fisiologico se hara referencia a continuacion como (pm). El numero total de residuos de aminoacidos en el peptido se hara referencia a continuacion como (r). El numero mlnimo de cargas positivas netas se discuten a continuacion son todos a pH fisiologico. El termino "pH fisiologico" tal como se utiliza en este documento se refiere al pH normal en las celulas de los tejidos y organos del cuerpo de un mamlfero. Por ejemplo, el pH fisiologico de un ser humano es normalmente de aproximadamente 7,4, pero el pH fisiologico normal en los mamlferos puede ser cualquier pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.8.

"Carga neta" como se usa en este documento, se refiere al equilibrio del numero de cargas positivas y el numero de cargas negativas llevadas por los aminoacidos presentes en el peptido. En esta memoria descriptiva, se entiende que las cargas netas se miden a pH fisiologico. Los aminoacidos de origen natural que estan cargados positivamente a pH fisiologico incluyen L-lisina, L-arginina y L-histidina. Los aminoacidos de origen natural que estan 5 cargados negativamente a pH fisiologico incluyen acido L-aspartico y acido L-glutamico.

Por lo general, un peptido tiene un grupo amino con carga positiva N-terminal y un grupo carboxilo terminal C cargado negativamente. Las cargas se anulan entre si a pH fisiologico. Como un ejemplo de calculo de la carga neta, el peptido Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-D-Arg tiene una carga negativa de aminoacidos (esto es, Glu) y cuatro aminoacidos cargados positivamente (esto es, dos residuos Arg, uno Lys, y uno His). Por lo tanto, el peptido 10 anterior tiene una carga neta positiva de tres.

En una realizacion, los peptidos aromaticos cationicos tienen una relacion entre el numero mlnimo de cargas positivas netas a pH fisiologico (pm) y el numero total de residuos de aminoacidos (r) en donde 3pm es el numero mas grande que es menor que o igual a r + 1. En esta realizacion, la relacion entre el numero mlnimo de cargas positivas netas (pm) y el numero total de residuos de aminoacidos (r) es la siguiente:

15 Tabla 1. Numero de aminoacidos y cargas positivas netas (3pm < p+1)

(r): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(pm): 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7

En otra realizacion, los peptidos aromaticos cationicos tienen una relacion entre el numero mlnimo de cargas positivas netas (pm) y el numero total de residuos de aminoacidos (r) en donde 2pm es el numero mas grande que es menor que o igual a r + 1. En esta realizacion, la relacion entre el numero mlnimo de cargas netas positivas (pm) y el 20 numero total de residuos de aminoacidos (r) es la siguiente:

Tabla 2. Numero de aminoacidos y cargas positivas netas (2pm < p+1)

(r): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(pm): 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10

En una realizacion, el numero mlnimo de cargas positivas netas (pm) y el numero total de residuos de aminoacidos (r) son iguales. En otra realizacion, los peptidos tienen tres o cuatro residuos de aminoacidos y un mlnimo de una 25 carga neta positiva, preferiblemente, un mlnimo de dos cargas positivas netas y mas preferiblemente un mlnimo de tres cargas positivas netas.

Tambien es importante que los peptidos aromaticos cationicos tienen un numero mlnimo de grupos aromaticos en comparacion con el numero total de cargas positivas netas (pt). El numero mlnimo de grupos aromaticos se hara referencia a continuacion como (a). Los aminoacidos de origen natural que tienen un grupo aromatico incluyen los 30 aminoacidos histidina, triptofano, tirosina y fenilalanina. Por ejemplo, el hexapeptido Lys-Gln-Tyr-D-Arg-Phe-Trp tiene una carga neta positiva de dos (aportado por los residuos de lisina y arginina) y tres grupos aromaticos (contribuido por residuos de tirosina, fenilalanina y triptofano).

Los peptidos aromaticos cationicos tambien deben tener una relacion entre el numero mlnimo de grupos aromaticos

(a) y el numero total de cargas positivas netas a pH fisiologico (pt) en donde 3a es el numero mas grande que es 35 menor que o igual a pt + 1, excepto que cuando pt es 1, a tambien puede ser 1. En esta realizacion, la relacion entre el numero mlnimo de grupos aromaticos (a) y el numero total de cargas positivas netas (pt) es el siguiente:

Tabla 3. Grupos aromaticos y cargas positivas netas (3a < pt+1 o a= pt=1)

(pt): 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(a): 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7

5

10

15

20

25

30

35

En otra realizacion, los peptidos aromaticos cationicos tienen una relacion entre el numero mlnimo de grupos aromaticos (a) y el numero total de cargas positivas netas (pt) en donde 2a es el numero mas grande que es menor o igual a pt + 1. En esta realizacion, la relacion entre el numero mlnimo de residuos de aminoacidos aromaticos (a) y el numero total de cargas positivas netas (pt) es la siguiente:

Tabla 4. Grupos aromaticos y cargas positivas netas (2a < pt+1 o a= pt=1)

(pt): 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(a): 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10

En otra realizacion, el numero de grupos aromaticos (a) y el numero total de cargas positivas netas (pt) son iguales.

Los grupos carboxilo, especialmente el grupo carboxilo terminal de un aminoacido terminal C, se amidan preferiblemente con, por ejemplo, amonlaco para formar la amida terminal C. Alternativamente, el grupo carboxilo terminal del aminoacido terminal C puede ser amidado con cualquier amina primaria o secundaria. La amina primaria o secundaria puede, por ejemplo, ser un grupo alquilo, especialmente un alquilo C1-C4 ramificado o no ramificado, o una amina de arilo. De acuerdo con lo anterior, el aminoacido en el terminal C del peptido se puede convertir a un grupo amido, N-metilamido, N-etilamido, N, N-dimetilamido, N, N-dietilamido, N-metil-N-etilamido, N-fenilamido o N- fenil-N-etilamido. Los grupos carboxilato libres de la asparagina, glutamina, acido aspartico y residuos de acido glutamico que no ocurre en el terminal C de los peptidos aromaticos cationicos tambien puede ser amidados dondequiera que se produzcan dentro del peptido. La amidacion en estas posiciones internas puede ser con amonlaco o con cualquiera de las aminas primarias o secundarias descritas anteriormente.

En una realizacion, el peptido aromatico cationico es un tripeptido que tiene dos cargas positivas netas y al menos un aminoacido aromatico. En una realizacion particular, el peptido aromatico cationico es un tripeptido que tiene dos cargas positivas netas y dos aminoacidos aromaticos.

Peptidos aromaticos cationicos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes ejemplos de peptidos:

Lys-D-Arg- Tyr-NH

Phe-D-Arg-His

D-Tyr-Trp-Lys-NH,

Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2

Tyr-His-D-Gly-Met

Phe-Arg-D-Hi s-As p

Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2

Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg

D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg

Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2

Phe-D-Arg-Lys-T rp-Tyr-D-Arg-His

Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2

Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2

Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys

Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2

Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys

5

10

15

20

25

30

Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH2

D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2

Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe

Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe

Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2

Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr

Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys

Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2

Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly

D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2

Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe

His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH2

Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp

Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-Lys-NH2

Un ejemplo de un peptido aromatico cationico es Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (denominado en este documento como "SS-20"). Un ejemplo de otro peptido aromatico cationico es D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31).

Variantes de sustitucion apropiadas del peptido incluyen sustituciones conservadoras de aminoacidos. Los aminoacidos pueden ser agrupados de acuerdo a sus caracterlsticas flsico-qulmicas de la siguiente manera:

(a) aminoacidos no polares: Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G) Cys (C);

(b) aminoacidos acidos: Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q);

(c) aminoacidos basicos: His(H) Arg(R) Lys(K);

(d) los aminoacidos hidrofobos: Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V); y

(e) aminoacidos aromaticos: Phe(F) Tyr(Y) Trp(W) His (H).

Las sustituciones de un aminoacido en un peptido por otro aminoacido en el mismo grupo se conocen como una sustitucion conservadora y pueden preservar las caracterlsticas flsico-qulmicas del peptido original. Por el contrario, las sustituciones de un aminoacido en un peptido por otro aminoacido en un grupo diferente es generalmente mas probable que altere las caracterlsticas del peptido original.

Ejemplos de analogos que activan los receptores mu-opioides incluyen, pero no se limitan a, los peptidos aromaticos cationicos que se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Analogos peptldicos con actividad mu-opiode

Aminoacidos posicion 1: Aminoacidos posicion 2 Aminoacidos posicion 3 Aminoacidos posicion 4 Modificacion Terminal-C

Tvr: D-Arg Phe Lys NH2

Tvr: D-Arg Phe Orn NH2

Tyr: D-Arg Phe Dab NH2

Tvr: D-Arg Phe Dab NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Lys NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Lys-NH(CH2)2-NH-dns NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Lys-NH(CH2)2-NH-atn NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe dnsLys NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Lys NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Ahp NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Orn NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Dab NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Dap NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Ahp(acido 2- aminoheptanoico) NH2

Bio-2'6'Dmt: D-Arg Phe Lvs NH2

3'5'Dmt: D-Arg Phe Lys NH2

3'5'Dmt: D-Arg Phe Orn NH2

3'5'Dmt: D-Arg Phe Dab NH2

3'5'Dmt: D-Arg Phe Dap NH2

Tyr: D-Arg Tvr Lys NH2

Tyr: D-Arg Tyr Orn NH2

Tyr: D-Are Tyr Dab NH2

Tyr: D-Arg Tyr Dap NH2

2'6'Dmt: D-Arg Tyr Lys NH2

2'6'Dmt: D-Arg Tyr Orn NH2

2'6'Dmt: D-Arg Tyr Dab NH2

2'6'Dmt: D-Arg Tyr Dap NH2

2'6'Dmt: D-Arg 2'6'Dmt Lys NH2

2'6'Dmt: D-Arg 2'6'Dmt Orn NH2

2'6'Dmt: D-Arg 2'6'Dmt Dab NH2

2'6'Dmt: D-Arg 2'6'Dmt Dap NH2

3'5'Dmt: D-Arg 3'5'Dmt Arg NH2

3'5'Dmt: D-Arg 3'5'Dmt Lys NH2

3'5'Dmt: D-Arg 3'5'Dmt Orn NH2

3'5'Dmt: D-Arg 3'5'Dmt Dab NH2

Tyr: D-Lys Phe Dap NH2

Tvr: D-Lys Phe Arg NH2

Tyr: D-Lys Phe Lys NH2

Tyr: D-Lys Phe Orn NH2

2'6'Dmt: D-Lys Phe Dab NH2

2'6'Dmt: D-Lys Phe Dap NH2

2'6'Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

2'6'Dmt: D-Lys Phe Lys NH2

3'5'Dmt: D-Lys Phe Orn NH2

3'5'Dmt: D-Lys Phe Dab NH2

3'5'Dmt: D-Lys Phe Dap NH2

3'5'Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

Tyr: D-Lys Tyr Lvs NH2

Tyr: D-Lys Tyr Orn NH2

Tyr: D-Lys Tyr Dab NH2

Tyr: D-Lys Tyr Dap NH2

2'6'Dmt: D-Lys Tvr Lys NH2

2'6'Dmt: D-Lys Tyr Orn NH2

2'6'Dmt: D-Lys Tyr Dab NH2

2'6'Dmt: D-Lys Tyr Dap NH2

2'6'Dmt: D-Lys 2'6'Dmt Lys NH2

2'6'Dmt: D-Lys 2'6'Dmt Orn NH2

2'6'Dmt: D-Lys 2'6'Dmt Dab NH2

2'6'Dmt: D-Lys 2'6'Dmt Dap NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe dnsDap NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe atnDap NH2

3'5'Dmt: D-Lys 3'5'Dmt Lys NH2

3'5'Dmt: D-Lys 3'5'Dmt Orn NH2

3'5'Dmt: D-Lys 3'5'Dmt Dab NH2

3'5'Dmt: D-Lys 3'5'Dmt Dap NH2

Tyr: D-Lys Phe Arg NH2

Tyr: D-Orn Phe Arg NH2

Tyr: D-Dab Phe Arg NH2

Tyr: D-Dap Phe Arg NH2

2'6'Dmt: D-Arg Phe Arg NH2

2'6'Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

2'6'Dmt: D-Orn Phe Arg NH2

2'6'Dmt: D-Dab Phe Arg NH2

3'5'Dmt: D-Dap Phe Arg NH2

3'5'Dmt: D-Arg Phe Arg NH2

3'5'Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

3'5'Dmt: D-Orn Phe Arg NH2

Tyr: D-Lys NH2 Tyr Arg NH2

Tyr: D-Orn Tyr Arg NH2

Tyr: D-Dab Tyr Arg NH2

Tyr: D-Dap Tyr Arg NH2

2'6'Dmt: D-Arg 2'6'Dmt Arg NH2

2'6'Dmt: D-Lys 2'6'Dmt Arg NH2

2'6'Dmt: D-Orn 2'6'Dmt Arg NH2

2'6'Dmt: D-Dab 2'6'Dmt Arg NH2

3'5'Dmt: D-Dap 3'5'Dmt Arg NH2

3'5'Dmt: D-Arg 3'5'Dmt Arg NH2

3'5'Dmt: D-Lys 3'5'Dmt Arg NH2

3'5'Dmt: D-Orn 3'5'Dmt Arg NH2

Mmt: D-Arg Phe Lvs NH2

Mmt: D-Arg Phe Orn NH2

Mmt: D-Arg Phe Dab NH2

Mmt: D-Arg Phe Dap NH2

Tmt: D-Arg Phe Lys NH2

Tmt: D-Arg Phe Orn NH2

Tmt: D-Arg Phe Dab NH2

Tmt: D-Arg Phe Dap NH2

Hmt: D-Arg Phe Lys NH2

Hmt: D-Arg Phe Orn NH2

Hmt: D-Arg Phe Dab NH2

Hmt: D-Arg Phe Dap NH2

Mmt: D-Lys Phe Lvs NH2

Mmt: D-Lys Phe Orn NH2

Mmt: D-Lys Phe Dab NH2

Mmt: D-Lys Phe Dap NH2

Mmt: D-Lys Phe Arg NH2

Tmt: D-Lys Phe Lys NH2

Tmt: D-Lys Phe Orn NH2

Tmt: D-Lys Phe Dab NH2

Tmt: D-Lys Phe Dap NH2

Tmt: D-Lys Phe Arg NH2

Hmt: D-Lys Phe Lys NH2

Hmt: D-Lys Phe Orn NH2

Hmt: D-Lys Phe Dab NH2

Hmt: D-Lys Phe Dap NH2

Hmt: D-Lys Phe Arg NH2

Mmt: D-Lys Phe Arg NH2

Mmt: D-Orn Phe Arg NH2

Mmt: D-Dab Phe Arg NH2

Mmt: D-Dab Phe Arg NH2

Mmt: D-Arg Phe Arg NH2

Tmt: D-Lys Phe Arg NH2

Tmt: D-Orn Phe Arg NH2

Tmt: D-Dab Phe Arg NH2

Tmt: D-Dap Phe Arg NH2

Tmt: D-Arg Phe Arg NH2

Hmt: D-Lys Phe Arg NH2

Hmt: D-Orn Phe Arg NH2

Hmt: D-Dab Phe Arg NH2

Hmt: D-Dap Phe Arg NH2

Hmt: D-Arg Phe Arg NH2

Dab = diaminobutirico Dap = acido diaminopropionico Dmt = dimetiltirosina Mmt = 2' metiltirosina Tmt = N, 2 ', 6'-trimetilti rosina Hmt = 2'-hidroxi, 6'-metiltirosina dnsDap = acido b-dansil-L-a, b diaminopropionico atnDap = acido b-antraniloil-L-a, b-diaminopropionico Bio = biotina

Los ejemplos de analogos que no activan los receptores mu-opioides incluyen, pero no estan limitados a, los peptidos aromaticos cationicos mostrados en la Tabla 6.

Tabla 6. Analogos de peptidos carentes de actividad mu-opiode

Aminoacidos posicion 1: Aminoacidos posicion 2 Aminoacidos posicion 3 Aminoacidos posicion 4 Aminoacidos posicion 5 Aminoacidos posicion 6 Aminoacidos posicion 7 Modification Terminal-C

D-Arg: Dmt Lys Phe NH2

D-Arg: Dmt Phe Lys NH2

D-Arg: Phe Lys Dmt NH2

D-Arg: Phe Dmt Lys NH2

D-Arg: Lys Dmt Phe NH2

D-Arg: Lys Phe Dmt NH2

Phe: Lys Dmt D-Arg NH2

Phe: Lys D-Arg Dmt NH2

Phe: D-Arg Phe Lys NH2

Phe: D-Arg Dmt Lys NH2

Phe: D-Arg Lys Dmt NH2

Phe: Dmt D-Arg Lys NH2

Phe: Dmt Lys D-Arg NH2

Lys: Phe D-Arg Dmt NH2

Lys: Phe Dmt D-Arg NH2

Lys: Dmt D-Arg Phe NH2

Lys: Dmt Phe D-Arg NH2

Lys: D-Arg Phe Dmt NH2

Lys: D-Arg Dmt Phe NH2

D-Arg: Dmt D-Arg Phe NH2

D-Arg: Dmt D-Arg Dmt NH2

D-Arg: Dmt D-Arg Tyr NH2

D-Arg: Dmt D-Arg Ttp NH2

Trp: D-Arg Phe Lys NH2

Trp: D-Arg Tyr Lys NH2

Trp: D-Arg Trp Lys NH2

5

10

15

20

25

30

Aminoacidos position 1: Aminoacidos posicion 2 Aminoacidos posicion 3 Aminoacidos posicion 4 Aminoacidos posicion 5 Aminoacidos posicion 6 Aminoacidos posicion 7 Modification Terminal-C

D-Arg: Trp Lys Phe NH2

D-Arg: Trp Phe Lys NH2

D-Arg: Trp Lys Dmt NH2

D-Arg: Trp Dmt Lys NH2

D-Arg: Lys Trp Phe NH2

D-Arg: Lys Trp Dmt NH2

Cha: D-Arg Phe Lys NH2

Ala: D-Arg Phe Lys NH2

Cha = ciclohexil alanina

Los aminoacidos de los peptidos mostrados en la Tabla 5 y 6 pueden tener ya sea la configuration L- o D-.

Los peptidos se pueden sintetizar por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica. Los metodos apropiados para la slntesis qulmica de la protelna incluyen, por ejemplo, los descritos por Stuart and Young in Solid Phase Peptido Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Company (1984), y en Methods Enzymol. 289, Academic Press, Inc, New York (1997).

Usos profilacticos y terapeuticos de peptidos aromaticos cationicos.

General. Los peptidos aromaticos cationicos descritos en este documento son utiles para prevenir o tratar la enfermedad. Especlficamente, la divulgation proporciona para ambos metodos profilacticos y terapeuticos de tratamiento de un sujeto en riesgo de (o susceptible a) slndrome metabolico. El slndrome metabolico se asocia generalmente con la diabetes de tipo II, enfermedad de la arteria coronaria, disfuncion renal, aterosclerosis, obesidad, dislipidemia e hipertension esencial. De acuerdo con lo anterior, los presentes metodos proporcionan la prevention y/o tratamiento de slndrome metabolico o afecciones asociadas en un sujeto mediante la administration de una cantidad eficaz de un peptido aromatico cationico a un sujeto en necesidad del mismo. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar un peptido aromatico cationico en un esfuerzo para mejorar uno o mas de los factores que contribuyen al slndrome metabolico.

En un aspecto, la tecnologla proporciona un metodo de tratamiento o prevencion de los trastornos especlficos asociados con el slndrome metabolico, tales como obesidad, diabetes, hipertension e hiperlipidemia, en un mamlfero mediante la administracion de un peptido cationico aromatico. En ciertas realizaciones, el trastorno especlfico es la obesidad. En ciertas realizaciones, el trastorno especlfico es la dislipidemia (esto es, hiperlipidemia).

Determination del efecto biologico del agente terapeutico a base de peptidos aromaticos cationicos. En diversas realizaciones, ensayos apropiados in vitro o in vivo se llevan a cabo para determinar el efecto de un agente terapeutico a base de peptidos aromaticos cationicos especlfico y si su administracion esta indicada para el tratamiento del slndrome metabolico. En diversas realizaciones, se pueden realizar ensayos in vitro con celulas representativas del tipo (s) implicado en el trastorno del sujeto, para determinar si un agente terapeutico basado en peptido aromatico cationico dado ejerce el efecto deseado sobre el(los) tipo(s) de celula. Los compuestos para uso en terapia se pueden probar en sistemas de modelos animales apropiados incluyendo, pero no limitado a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, y similares, antes de la prueba en sujetos humanos. Del mismo modo, para las pruebas in vivo, cualquiera de los sistemas de modelo animal conocidos en la tecnica se puede utilizar antes de la administracion a sujetos humanos. Las afecciones asociadas con el slndrome metabolico se pueden detectar facilmente mediante la cuantificacion de peso corporal, acidos grasos libres/insulina/glucosa en ayunas, tolerancia a la glucosa (OGTT), niveles de colesterol y trigliceridos, presion arterial, sensibilidad muscular por insulina in vitro,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

marcadores de senalizacion de la insulina (por ejemplo, Akt-P, IRS-P), funcion mitocondrial (por ejemplo, respiracion o emision de H2O2), marcadores de estres oxidativo intracelular (por ejemplo, peroxidacion de llpidos, relacion GSH/GSSG o actividad aconitasa) o actividad de la enzima mitocondrial. Los niveles de acidos grasos libres/insulina/glucosa en ayunas, tolerancia a la glucosa (OGTT), colesterol y trigliceridos se pueden medir utilizando tecnicas de laboratorio cllnico estandar como se puede encontrar en Tietz Textbook of Clinical Chemistry, fourth edition. Burtis CA and Ashwood ER eds., 2005.

En una realizacion, la administracion de un peptido aromatico cationico a un sujeto que presenta una o mas afecciones asociadas con el slndrome metabolico se causar una mejora en una o mas de estas condiciones. Por ejemplo, un sujeto puede presentar al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, o al menos aproximadamente 50% de reduccion en peso corporal en comparacion con el sujeto antes de recibir el peptido aromatico cationico. En una realizacion, un sujeto puede presentar al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, o al menos

aproximadamente 50% de reduccion en el colesterol HDL y/o al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, o al menos aproximadamente 50% de aumento en el colesterol LDL en comparacion con el sujeto antes de recibir el peptido aromatico cationico. En una realizacion, un sujeto puede presentar al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, o al menos aproximadamente 50% de reduccion en trigliceridos sericos. al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, o al menos

aproximadamente 50% de mejora en la tolerancia a la glucosa oral (OGTT). En algunas realizaciones, el sujeto puede mostrar una mejora observable en mas de una afeccion asociada con slndrome metabolico.

Metodos profilacticos. En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para prevenir, en un sujeto, una enfermedad o afeccion asociada con el slndrome metabolico en los tejidos del musculo esqueletico, por

administracion al sujeto de un peptido aromatico cationico que modula una o mas senales o marcadores del

slndrome metabolico, por ejemplo, peso corporal, trigliceridos o colesterol en suero, acidos grasos libres/insulina/glucosa en ayunas,, tolerancia a la glucosa (OGTT), in vitro sensibilidad muscular por insulina, marcadores de senalizacion de la insulina (por ejemplo, Akt-P, IRS-P), funcion mitocondrial (por ejemplo, respiracion o emision de H2O2), marcadores de estres oxidativo intracelular (por ejemplo, peroxidacion lipldica, relacion GSH/GSSG o actividad aconitasa) o actividad de la enzima mitocondrial. El acido graso libre/insulina/glucosa en ayunas, tolerancia a la glucosa (OGTT), niveles de colesterol y trigliceridos, etc. se puede medir utilizando tecnicas de laboratorio cllnico estandar como se puede encontrar en Tietz Textbook of Clinical Chemistry, fourth ed., Burtis C A y Ashwood E R eds., 2005.

Los sujetos con riesgo de slndrome metabolico se pueden identificar, por ejemplo, por cualquiera o una combinacion de ensayos de diagnostico o pronostico como se describe en este documento. En aplicaciones profilacticas, las composiciones farmaceuticas o medicamentos de peptidos aromaticos cationicos se administran a un sujeto susceptible a, o de otra manera en riesgo de una enfermedad o afeccion en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar el comienzo de la enfermedad, incluyendo bioqulmica, histologica y/o slntomas conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios que presentan durante el desarrollo de la enfermedad. La administracion de un peptido cationico aromatico-profilactico puede ocurrir antes de la manifestacion de los slntomas caracterlsticos de la aberracion, tal que se impide una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se retrase su progreso. Dependiendo del tipo de aberracion, por ejemplo, un peptido aromatico cationico que actua para aumentar o mejorar la funcion mitocondrial se puede utilizar para tratar el sujeto. El compuesto apropiado se puede determinar basandose en ensayos de seleccion descritos en este documento.

Metodos terapeuticos. Otro aspecto de la tecnologla incluye metodos para reducir los slntomas asociados con el slndrome metabolico en un sujeto con fines terapeuticos. En aplicaciones terapeuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un sujeto que se sospecha de, o que ya sufre de una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los slntomas de la enfermedad, incluyendo sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Como tal, la invencion proporciona metodos de tratamiento de un individuo aquejado de slndrome metabolico o una enfermedad asociada al slndrome metabolico o trastorno.

La presente divulgacion contempla terapias de combinacion de los peptidos aromaticos cationicos con uno o mas tratamientos para la presion arterial, los niveles de trigliceridos en la sangre, o colesterol alto. El tratamiento para el slndrome metabolico, obesidad, resistencia a la insulina, hipertension arterial, dislipidemia, etc., tambien puede incluir una variedad de otros enfoques, incluyendo perdida de peso y ejercicio, y cambios en la dieta. Estos cambios en la dieta incluyen: mantenimiento de una dieta que limita los carbohidratos a 50 por ciento o menos de las calorlas totales; el consumo de alimentos definidos como los carbohidratos complejos, tal como el pan de grano entero (en vez de blanco), arroz integral (en vez de blanco), azucares que son sin refinar, aumento del consumo de fibra comiendo legumbres (por ejemplo, alubias), granos enteros, frutas y verduras , reducir el consumo de carnes rojas y aves de corral, consumo de grasas "saludables", tales como las de aceite de oliva, aceite de linaza y nueces, limitar

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

la ingesta de alcohol, etc. Ademas, el tratamiento de la presion arterial y los niveles de trigliceridos en la sangre pueden ser controlado por una variedad de medicamentos disponibles (por ejemplo, farmacos de modulacion de colesterol), igual que pueden ser trastornos de la coagulacion (por ejemplo, a traves de la terapia de aspirina) y en general, estados protromboticos o proinflamatorias. Si el slndrome metabolico conduce a la diabetes, hay, por supuesto, muchos tratamientos disponibles para esta enfermedad.

Los modos de administracion y dosis efectiva

Cualquier metodo conocido por los de la tecnica para poner en contacto una celula, organo o tejido con un peptido se pueden emplear. Los metodos apropiados incluyen metodos in vitro, ex vivo, o in vivo. Los metodos in vivo incluyen por lo general la administracion de un peptido aromatico-cationico, tal como los descritos anteriormente, a un mamlfero, preferiblemente un ser humano. Cuando se usa in vivo para terapia, los peptidos aromaticos cationicos se administran al sujeto en cantidades eficaces (esto es, cantidades que han deseado efecto terapeutico). El regimen de dosis y la dosis dependeran del grado de slndrome metabolico en el sujeto, las caracterlsticas del peptido aromatico cationico particular utilizado, por ejemplo, su Indice terapeutico, el sujeto, y la historia del sujeto.

La cantidad eficaz se puede determinar durante los ensayos precllnicos y ensayos cllnicos de metodos familiares para los facultativos y los medicos. Una cantidad eficaz de un peptido util en los metodos de la presente invencion, preferiblemente en una composicion farmaceutica, se puede administrar a un mamlfero en necesidad del mismo por cualquiera de un numero de metodos bien conocidos para la administracion de compuestos farmaceuticos. El peptido se puede administrar sistemica o localmente.

Los peptidos aromaticos cationicos descritos en este documento se pueden incorporar en composiciones farmaceuticas para la administracion, por separado o en combination, a un sujeto para el tratamiento o prevention de un trastorno descrito en este documento. Tales composiciones incluyen por lo general el agente activo y un portador farmaceuticamente aceptable. Como se utiliza en este documento, el termino "portador farmaceuticamente aceptable" incluye solution salina, solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes retardantes de absorcion e isotonicos, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. Los compuestos activos suplementarios tambien se pueden incorporar en las composiciones.

Las composiciones farmaceuticas se formulan por lo general para que sean compatibles con su via de administracion prevista. Los ejemplos de vlas de administracion incluyen administracion parenteral (por ejemplo, intravenosa, intradermica, intraperitoneal o subcutanea), oral, inhalation, transdermica (topica), y transmucosa. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicacion parenteral, intradermica, o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencllico o parabenos de metilo; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como el acido etilendiaminotetraacetico; soluciones reguladoras tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sodico o dextrosa. El pH se puede ajustar con acidos o bases, tales como acido clorhldrico o hidroxido de sodio. La preparation parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de multiples dosis hechos de vidrio o plastico. Para la conveniencia del paciente o medico tratante, la formulation de dosificacion se puede proporcionar en un kit que contiene todo el equipo necesario (por ejemplo, viales de farmacos, viales de diluyente, jeringas y agujas) para un curso de tratamiento (por ejemplo, 7 dlas de tratamiento).

Las composiciones farmaceuticas apropiadas para uso inyectable pueden incluir soluciones acuosas esteriles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, los vehlculos apropiados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solucion salina estandarizada con fosfato (PBS). En todos los casos, una composicion para administracion parenteral debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista una facil capacidad de inyeccion. Debe ser estable en las condiciones de fabrication y almacenamiento y debe preservarse contra la action contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

Las composiciones de peptidos aromaticos cationicos pueden incluir un portador, que puede ser un solvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol llquido, y similares), y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersion y por el uso de surfactantes. Prevencion de la accion de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, tiomerasol, y similares. El glutation y otros antioxidantes pueden ser incluidos para evitar la oxidation. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun lo dispuesto, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehlculo esteril, que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos tlpicos de preparacion incluyen secado al vaclo y liofilizacion, que se puede producir un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Para el proposito de la administration terapeutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos, o capsulas, por ejemplo, capsulas de gelatina. Las composiciones orales tambien se pueden preparar utilizando un portador fluido para su uso como un enjuague bucal. Los agentes de union farmaceuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden ser incluidos como parte de la composicion. Los comprimidos, plldoras, capsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente desintegrante tal como acido alglnico, Primogel, o almidon de malz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administracion por inhalation, los compuestos se pueden administrar en forma de una pulverization de aerosol desde un recipiente presurizado o dispensador que contiene un propulsor apropiado, por ejemplo, un gas tal como dioxido de carbono, o un nebulizador. Tales metodos incluyen los descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6,468,798.

La administracion sistemica de un compuesto terapeutico como se describe en este documento tambien puede ser por via transmucosa o transdermica. Para administracion por via transmucosa o transdermica, se utilizan penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear, en la formulacion. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, para la administracion transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusldico. La administracion transmucosa puede lograrse a traves del uso de sprays nasales. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en pomadas, balsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la tecnica. En una realization, la administracion transdermica se puede realizar por iontoforesis.

Una protelna o peptido terapeutico se pueden formular en un sistema portador. El vehlculo puede ser un sistema coloidal. El sistema coloidal puede ser un liposoma, un vehlculo de doble capa de fosfollpidos. En una realizacion, el peptido terapeutico se encapsula en un liposoma, manteniendo la integridad del peptido. Como un experto en el arte apreciara, existe una variedad de metodos para preparar liposomas. (Vease Lichtenberg et al., Methods Biochem. Anal., 33:337-462 (1988); Anselem et al., Liposome Technology, CRC Press (1993)). Formulaciones de liposomas pueden retrasar el aclaramiento y aumentar la captation celular (Vease Reddy, Ann. Pharmacother., 34 (7-8):915- 923 (2000)).

El portador tambien puede ser un pollmero, por ejemplo, una matriz de pollmero biodegradable, biocompatible. En una realizacion, el peptido terapeutico puede ser embebido en la matriz polimerica, mientras que se mantiene la integridad de la protelna. El pollmero puede ser natural, tales como polipeptidos, protelnas o polisacaridos, o sintetico, tales como acidos poli a-hidroxi. Los ejemplos incluyen portadores hechos de, por ejemplo, colageno, fibronectina, elastina, acetato de celulosa, nitrato de celulosa, polisacaridos, fibrina, gelatina, y combinaciones de los mismos. En una realizacion, el pollmero es el acido poli-lactico (PLA) o acido co-poli-lactico/glicolico (PGLA). Las matrices polimericas pueden ser preparados y aisladas en una variedad de formas y tamanos, incluyendo microesferas y nanoesferas. Formulaciones polimericas pueden conducir a la duracion prolongada del efecto terapeutico. (Vease Reddy, Ann. Pharmacother., 34 (7-8):915-923 (2000)). Una formulation de pollmero para la hormona de crecimiento humana (hGH) se ha usado en ensayos cllnicos. (Vease Kozarich and Rich, Chemical Biology, 2:548-552 (1998)).

En algunas realizaciones, los compuestos terapeuticos se preparan con portadores que protegeran los compuestos terapeuticos contra la elimination rapida del cuerpo, tal como una formulacion de liberation controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar pollmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhldridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Tales formulaciones se pueden preparar utilizando tecnicas conocidas. Los materiales tambien se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

pueden obtener comercialmente, por ejemplo, de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a celulas especlficas con anticuerpos monoclonales para antlgenos especlficos de celulas) se pueden utilizar tambien como portadores farmaceuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con metodos conocidos para los expertos en el arte, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,522,811.

Los compuestos terapeuticos se pueden formular tambien para mejorar la administracion intracelular. Por ejemplo, sistemas de suministro liposomal son conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, Chonn and Cullis, "Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems," Current Opinion in Biotechnology 6:698-708 (1995); Weiner, "Liposomes for Protelna Delivery: Selecting Manufacture and Development Processes," Immunomethods 4 (3) 201-9 (1994); y Gregoriadis, "Engineering Liposomes for Drug Delivery: Progress and Problems", Trends Biotechnol. 13 (12):527-37 (1995). Mizguchi et al., Cancer Lett. 100:63-69 (1996), describe el uso de liposomas fusogenicos para entregar una protelna a las celulas, tanto in vivo como in vitro.

La dosis, toxicidad y eficacia terapeutica de los agentes terapeuticos se pueden determinar mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la ED50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion). La relacion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el Indice terapeutico y puede expresarse como la relacion LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben altos Indices terapeuticos. Aunque se pueden usar compuestos que presentan efectos secundarios toxicos, se debe tener cuidado para disenar un sistema de administracion que dirija dichos compuestos al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el dano potencial a las celulas no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificacion para uso en seres humanos. La dosificacion de dichos compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada. Para cualquier compuesto usado en los metodos, la dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentration circulante en plasma que incluye el IC50 (esto es, la concentration del compuesto de ensayo que logra una inhibition maxima media de los slntomas) como se determina en cultivo celular. Dicha information se puede utilizar para determinar con mayor precision las dosis utiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografla llquida de alta resolution.

Por lo general, una cantidad eficaz de los peptidos aromaticos cationicos, suficiente para conseguir un efecto terapeutico o profilactico, intervalo de aproximadamente 0.000001 mg por kilogramo de peso corporal por dla a aproximadamente 10.000 mg por kilogramo de peso corporal por dla. Preferiblemente, los intervalos de dosificacion son desde aproximadamente 0.0001 mg por kilogramo de peso corporal por dla a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por dla. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal cada dla, cada dos dlas o cada tres dlas o dentro del rango de 1-10 mg/kg cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas. En una realization, una dosis unica de peptido varla de 0.1-10.000 microgramos por kg de peso corporal. En una realizacion, las concentraciones de peptido aromatico-cationico en un rango de portador desde 0.2 a 2000 microgramos por mililitro suministrado. Un regimen de tratamiento ejemplar implica la administracion una vez al dla o una vez a la semana. En aplicaciones terapeuticas, una dosis relativamente elevada a intervalos relativamente cortos a veces se requiere hasta la progresion de la enfermedad se reduce o termina, y preferiblemente hasta que el sujeto muestra mejora parcial o completa de los slntomas de la enfermedad. A partir de entonces, el paciente se puede administrar un regimen profilactico.

En algunas realizaciones, una cantidad terapeuticamente eficaz de un peptido aromatico cationico se puede definir como una concentracion de peptido en el tejido diana de 10-11 a 10-6 molar, por ejemplo, aproximadamente 10-7 molar. Esta concentracion puede ser entregada por dosis sistemicas de 0.001 a 100 mg/kg o dosis equivalente por area de superficie corporal. El calendario de dosis se optimiza para mantener la concentracion terapeutica en el tejido diana, lo mas preferiblemente mediante la administracion diaria o semanal individual, pero tambien incluyendo la administracion continua (por ejemplo, infusion parenteral o aplicacion transdermica).

En algunas realizaciones, se proporciona la dosis del peptido aromatico-cationica a un nivel de dosis "bajo", "medio" o " alto". En una realizacion, la dosis baja se proporciona desde aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 0.5 mg/kg/h, adecuadamente desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/kg/h. En una realizacion, la mitad de la dosis se proporciona desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.0 mg/kg/h, adecuadamente desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 mg/kg/h. En una realizacion, la dosis alta se proporciona desde aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 mg/kg/h, adecuadamente desde aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2 mg/kg/h.

El experto en el arte apreciara que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo requerido para tratar eficazmente un sujeto, incluyendo, pero no limitado a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Ademas, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de las composiciones terapeuticas descritas en este documento puede 5 incluir un tratamiento unico o un numero de tratamientos.

El mamlfero tratado en los metodos actuales en conformidad puede ser cualquier mamlfero, incluyendo, por ejemplo, animales de granja, tales como ovejas, cerdos, vacas y caballos; los animales de companla, tales como perros y gatos; animales de laboratorio, tales como ratas, ratones y conejos. En una realizacion preferida, el mamlfero es un humano.

10 Ejemplos

La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera.

Ejemplo 1 - Tratamiento del sfndrome metabolico en ratas alimentadas con una dieta alta en grasas

Los efectos de los peptidos aromatico-cationicos en el tratamiento de un sujeto que padece slndrome metabolico se 15 investigaron en un modelo de rata Sprague-Dawley durante un perlodo de cuatro semanas. El ejemplo describe los resultados de tales experimentos.

Modelos in vivo. Un modelo de rata del slndrome metabolico fue establecido por combinacion de 6-semanas HFD y dosis bajas de inyeccion de STZ (40 mg /kg) en ratas SD. Las ratas del mismo lote alimentadas con comida normal (NRC) se utilizaron como control.

20 Grupos de estudio. Grupo A: NRC + PBS s.c. q.d. (Lunes a viernes) *, n=5; Grupo B:HFD + STZ + PBS s.c. q.d. (Lunes a viernes), n=8; Grupo C:HFD + STZ + SS-31 10 mg/kg s.c. q.d. (Lunes a viernes), n=8; Grupo D: HfD + STZ + SS-20 10 mg/kg s.c. q.d. (Lunes a viernes), n=8. El esquema terapeutico se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7. Esquema terapeutico y protocolo experimental

Duracion: Objetivo grupos diabeticos (B, C, D) Grupo de control (A)

1a semana: Aclimatacion Comida normal para ratas

2a-7a semana: Manipulacion de la dieta Dieta alta en grasa Comida normal para ratas

Fin de la 7a semana: Inyeccion de STZ STZ 40 mg/kg, i.p., una vez Solucion reguladora de citrato 2 mL/kg, i.p., una vez

8a - 12a semana: Induction de diabetes Continuar con la dieta alta en grasas Continuar con comida normal para ratas

13a- 22a semana: Tratamiento con peptido Grupo B: PBS 2 mL/kg/dla Grupo C: SS-31 10 mg/kg/dla Grupo D: SS-20 10 mg/kg/dla s.c., 5 dlas por semana Grupo A: PBS 2 mL/kg/dla s.c., 5 dlas por semana

23a semana: Organos y tejidos recogidos

25 Preparacion y administracion de los compuestos de ensayo. SS-31 o SS-20 se disolvio en PBS 0.01 M (pH 7.0). El tratamiento de 10 semanas se administro una vez al dla (5 dlas a la semana) con sitio de inyeccion s.c. alternado. La concentracion de SS-31 y SS-20 fue 5.0 mg/mL. El volumen de inyeccion (0.2 ml/100 g) para cada animal de prueba se ajusto de acuerdo con el peso corporal tomada en el comienzo de cada semana. STZ se disolvio en solucion reguladora de citrato 0.1 M (pH 4.5) a la concentracion de 20 mg/mL. STZ se inyecta por via intraperitoneal.

30 Glucosa en sangre. La glucosa en sangre fue probada por medidor de glucosa en sangre ACCU-CHEK® Advantage™ y tiras reactivas Accu-Chek® de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). Manipulacion de la muestra de sangre. Las muestras de sangre se recogieron por recorte de cola. En algunos casos, cuando el recorte

5

10

15

20

25

30

35

40

de cola no proporciono suficiente volumen, las muestras de sangre se recogieron de seno retro-orbital. Las muestras de sangre recogidas se fijaron a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la coagulacion antes de ser centrifugadas a 1,200 x g durante 10 min. El sobrenadante se recoge y se volvio a centrifugar a 1,200 x g durante otros 5 minutos para generar el suero. Las muestras de suero se dividieron en allcuotas y se almacenaron a -20 °C hasta ser utilizado en el analisis.

Estadlstica: Analisis estadlstico de prueba t y ANOVA de una via se realizo mediante el software de analisis SPSS (Statistical Package for the Social Science).

De acuerdo con el protocolo experimental que se acaba de describir, se demostraron los efectos de los peptidos aromaticos cationicos en las condiciones de tratamiento asociadas con el slndrome metabolico en un modelo de rata SD. Los resultados son los siguientes:

Efectos de SS-31 o SS-20 sobre el peso corporal de las ratas diabeticas. El peso corporal se incremento en un 23.3% en el grupo NRC y la ganancia de peso corporal permanecio tan baja como el 3.6% en ratas de control HFD/STZ durante el perlodo de tratamiento de 10 semanas (Fig. 1). En contraste, las ratas tratadas con SS-31 mostraron una recuperacion gradual en el peso corporal (P <0.05 en la 6a semana y P <0.01 desde la semana 7a a la 10a), que aumento en un 16.3%, a finales de la semana 10a. Las ratas tratadas con SS-20 mostraron una tendencia similar de mejora en el peso corporal (9.0% a finales de la semana 10a).

Efectos de la SS-31 o SS-20 en la glucosa en sangre de ratas diabeticas. En comparacion con las ratas NRC, la glucosa en sangre en ratas de vehlculos HFD/STZ se mantuvo significativamente mas alta durante el periodo de tratamiento. Las ratas tratadas con SS-31 y SS-20 mostraron un efecto de reduccion de la expresion de glucosa en la sangre en la semana 4 despues del tratamiento del peptido (P <0.05 y P <0.01, respectivamente, frente a las ratas vehlculo HFD/STZ, Fig. 2).

En resumen, estos resultados establecen colectivamente que los peptidos aromaticos cationicos, ya sea para prevenir o compensar la disfuncion metabolica que se desarrolla con sobre nutricion. Como tal, la administracion de los peptidos aromaticos cationicos es util en metodos de prevencion o tratamiento de afecciones asociadas con el slndrome metabolico en sujetos mamlferos.

Ejemplo 2 - Efectos de la SS-20 y SS-31 en el slndrome metabolico

Este estudio se inicio para investigar los efectos de SS-31 y SS-20 en un modelo de slndrome metabolico durante un periodo de 10 semanas. Las ratas fueron alimentadas con una dieta alta en grasas durante 6 semanas y despues se administra una dosis unica de STZ (30 mg/kg). Las ratas se mantuvieron en un HFD hasta 14 semanas despues de la administracion de STZ. Las ratas control alimentadas con comida normal para ratas (NRC) durante 6 semanas, se administraron solucion reguladora citrato sin STZ. Despues de 5 meses, las ratas diabeticas se trataron con SS-31 (10 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg s.c. una vez al dla), SS-20 (10 mg/kg, 3 mg/kg s.c. una vez al dla) o vehlculo (solucion salina) 5 dlas a la semana durante 10 semanas. Los grupos de estudio fueron los siguientes:

Grupo A: HFD/STZ+SS-31 10 mg/kg s.c. q.d. (lunes a viernes.), n=12;

Grupo B: HFD/STZ+ SS-31 3 mg/kg s.c. q.d. (lunes a viernes.), n=12;

Grupo C: HFD/STZ+ SS-31 1 mg/kg s.c. q.d. (lunes a viernes.), n=10;

Grupo D: HFD/STZ+SS-20 10 mg/kg s.c. q.d. (lunes a viernes.), n=10;

Grupo E: HFD/STZ+SS-20 3 mg/kg s.c. q.d. (lunes a viernes.), n=10;

Grupo F: HFD/STZ+ vehlculo s.c. q.d. (lunes a viernes.), n=10;

Grupo G: NRC + vehlculo s.c. q.d. (lunes a viernes.), n=10.

Tabla 8. Horario terapeutico

Duracion: Objetivo Grupos diabeticos A, B, C, D, E, F Grupo de control (G)

1a semana: Aclimatacion Comida normal para ratas

Duracion: Objetivo Grupos diabeticos A, B, C, D, E, F Grupo de control (G)

Fin de la 7a semana: Inyeccion de STZ STZ 30 mg/kg, i.p., una vez Solucion reguladora de citrato 2 mL/kg, i.p., una vez

8a-27a semana: Induccion de diabetes Continuar con la dieta alta en grasas-semana 21a se detiene Continuar con comida normal para ratas

28a-37a semana: Tratamiento con peptido Grupo A: MTP-131 10mg/kg/dla Grupo B: MTP-131 3mg/kg/dla Grupo C: MTP-131 1mg/kg/dla Grupo D: SS-20 10mg/kg/dla Grupo E: SS-20 3mg/kg/dla Grupo F: PBS2mL/kg/dla s.c., 5 dlas por semana Grupo G: PBS 2 mL/kg/dla s.c., 5 dlas por semana

38a semana: Organos y tejidos recogidos

Alimentacion HFD durante 6 semanas, produjo el aumento obvio de peso corporal (452.9 ± 3.8 g en el grupo HFD frente a 425.5 ± 7.1 g; p <0.01) y la administracion de STZ aumento la glucosa en sangre (26.5 ± 0.5 mmol/L en ratas HFD/STZ frente a 9.8 ± 0.5 mmol/L en ratas NRC, P <0.001) e hiperlipidemia (P <0.01), lo que indica un 5 trastorno similar a slndrome metabolico en estos sujetos de prueba. Por lo tanto, el modelo experimental se establecio con exito para el slndrome metabolico.

Durante el perlodo de 10 semanas de tratamiento con peptido, no se encontraron cambios evidentes en el peso corporal y la glucosa en la sangre ni en los grupos SS-31 ni SS-20. La glucosa en sangre del grupo NRC se quedo en un rango normal, mientras que la de los grupos de tratamiento con STZ se mantuvo mayor que 20 mmol/L a lo 10 largo del perlodo de 10 semanas de tratamiento con peptido (Fig. 3).

La figura 3 muestra que el nivel de TG ratas HFD/STZ fue mucho mayor que las ratas NRC antes del tratamiento con peptidos. Despues del tratamiento de 10 semanas con peptidos, el nivel de TG disminuyo en los grupos tratados con SS-20 y SS-31 en comparacion con el grupo HFD/STZ. El nivel de TG de las ratas en los grupos de tratamiento SS-31 y SS-20 se redujo de 3.77 ± 0.38 mM a 1.75 ± 0.33 mM en grupo SS-31 10 mg/kg, desde 4.17 ± 0.88 mM a 15 2.46 ± 0.52 mM en grupo SS-31 3mg/kg, desde 4.17 ± 1.02 mM a 1.97 ± 0.46 mM en grupo SS-20 10mg/kg, desde

4.66 ± 1.40 mM a 2.43 ± 0.47 mM en grupo SS-20 3mg/kg, desde 3.90 ± 0.65 mM a 3.70 ± 1.16 mM en grupo SS-20 3 mg/kg. Pero el nivel de TG de ratas en el grupo HFD/STZ no se redujo (3.90 ± 0,65 mM frente 3.70 ± 1,16 mM). Por lo tanto, SS-31 y SS-20 tienen efectos beneficiosos sobre el metabolismo de los llpidos.

Ejemplo 3 - Efectos de la SS-20 y SS-31 sobre la obesidad inducida por dieta

20 Para analizar los efectos farmacodinamicos de SS-31 y SS-20 contra la obesidad inducida por dieta (DIO) en ratones C57BL/6, los sujetos de prueba fueron alimentados ya sea con una dieta normal o una dieta alta en grasa que tiene la composicion mostrada en Tabla 9.

Tabla 9. Composicion de la dieta

Ingredientes: NRC Dieta alta en grasa (HFD)

% gm: % kcal % gm % kcal

Protelna: 19 20 26 20

Carbohidrato: 67 70 26 20

Grasa (manteca de cerdo): 4 10 35 60

Despues de varios dlas de aclimatacion, los animales fueron pesados y asignados al azar a los siguientes grupos de tratamiento.

Tabla 10. Grupos de Tratamiento

Grupo: Tipo de animal Animal # Tratamiento Dosis Ruta

A: Regular 10 Vehlculo (N/A) s.c.

B: DIO 10 Vehlculo (N/A) s.c.

C: DIO 12 Rosiglitazona 2 mg/kg

D: DIO 12 SS-31 3 mg/kg s.c.

E: DIO 12 SS-31 10 mg/kg s.c.

F: DIO 12 SS-20 3 mg/kg s.c.

G: DIO 12 SS-20 10 mg/kg s.c.

Grupo: Tipo de animal Animal # Tratamiento Dosis Ruta

H: DIO 12 SS-31 + Rosiglitazona 3 mg/kg + 2 mg/kg s.c. + p.o.

I: DIO 12 SS-20 + Rosiglitazona 3 mg/kg + 2 mg/kg s.c. + p.o.

5 A partir del primer dla de tratamiento, los animales de los grupos B a I se cambiaron a HFD. Durante todo el perlodo de tratamiento, las siguientes actividades se llevaron a cabo en dlas especlficos.

Tabla 11. Horario terapeutico

Actividad: Fecha realizada

Medicion del peso corporal: Cada semana desde inicio Dla 1

Recogida de muestras de sangre: Medicion TC Dla 0, 14, 29, 87, 103 (rapido)

: Medicion TG Dla 103 (rapido)

: Medicion HDL Dla 103 (rapido)

: Medicion LDL Dla 103 (rapido)

: Medicion ALT Dla 103 (rapido)

: Medicion de insulina (TBD)

Medicion nivel de la glucosa en sangre: Rapido Dla 8, 22, 93

: Posprandial Dla 87, 99

IPGTT: Dla 36, 100

IPITT: Dla 43, 107

5

10

15

20

25

30

Sacrificio del Animal *: Peso de grasa Dla 23, 109

Peso del hlgado: Dla 23, 109

Medicion de creatinina: Dla 23

peso de los rinones: Dla 109

Otro tejido recogido: Dla 109

* El dla 23, cuatro animales fueron sacrificados desde todos los grupos. Todos los animales restantes fueron sacrificados en el ultimo dla de estudio en la vida (dla 109).

Preparacion y administracion de la dosis. El tratamiento se administro una vez al dla (5 dlas a la semana) con punto de inyeccion alternado. La concentracion de SS-31 y SS-20 en dosis de 3 mg/kg fue de 0.6 mg/ml y la de 10 mg/kg fue de 2 mg/ml. El volumen de tratamiento (0.05 ml/10 g para s.c. y 0.2 ml/10 g para p.o.) para cada animal de prueba se ajusto de acuerdo con su peso corporal tomado en el comienzo de cada semana.

Recogida de muestras de sangre. Las muestras de sangre se recogieron por recorte de cola de acuerdo con Medicilon/MPI Preclinical Research (Shanghai) LLC SOP sobre Blood Collection Techniques. En algunos casos, cuando el recorte de la cola no logro garantizar un volumen suficiente, tambien se recogieron muestras de sangre del seno retro-orbital. Las muestras de sangre recogidas se fijaron a temperatura ambiente durante 1 hora para permitir la coagulacion antes de ser centrifugada a 2,000 x g durante 10 min. Los sobrenadantes se recogieron y centrifugaron a 2,000 x g durante 10 min mas., para generar el suero. Parte de las muestras de suero se utilizo para el analisis de colesterol total (TC) inmediatamente. El resto se almaceno a -20 °C hasta el momento de ser utilizado en el analisis de la insulina

La insulina, trigliceridos (TG) y colesterol total (CT) en suero. Los niveles de insulina en suero se midieron utilizando Kit Rat/Mouse Insulin ELISA de Millipore Corporation (Catalogo # EZRMI-13K, St. Charles, Missouri, USA). Los niveles de TG en suero se midieron por el analizador bioqulmico automatico. La figura 5A es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre los trigliceridos en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta despues de 14 semanas de tratamiento. La figura 5B es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre el colesterol total en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta despues de 14 semanas de tratamiento. La figura 5C es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre el colesterol HDL en un modelo murino de la obesidad inducida por dieta despues de 14 semanas de tratamiento.

IPGTT. IPGTT se realizo de acuerdo con la Prueba de tolerancia a la glucosa Medicilon-MPI Preclinical Research (Shanghai) LLC SOP on Intraperitoneal (IP) con ligeras modificaciones. Los ratones se dejaron en ayuno desde la noche antes de que los niveles de glucosa de referencia evaluados en la manana siguiente. Despues de eso, se le dio una inyeccion IP de 1 g/kg de D-glucosa para cada animal y los niveles de glucosa en sangre fueron medidos los dlas 15, 30, 60 y 120 minutos despues de la inyeccion IP. Los resultados se muestran en la Tabla 12 mas abajo, e indican que SS-20 y SS-31 mejoran significativamente la tolerancia a la glucosa en el modelo de raton obeso.

Tabla 12. Tolerancia a la Glucosa

Grupo: n Semana 5

Comida + vehlculo: 6 1213.6 ± 54.1

DIO = vehlculo: 6 1719.7 ± 56.8###

DIO Rosi @ 2mg/kg: 8 1487.5 ± 44.2*

DIO SS31 @ 3mg/kg: 8 1460.6 ± 64.1 **

Grupo: n Semana 5

DIO SS31 @ 10mg/kg: 8 1584.3 ± 78.3

DIO SS20 @ 3mg/kg: 8 1534.1 ± 53.3 *

DIO SS20 @ 10mg/kg: 8 1494.5 ± 54.4 *

DIO SS31 + Rosiglitazona @ 3mg/kg+2mg/kg: 8 1597.3 ± 54.0

DIO SS20+ Rosiglitazona @ 3mg/kg+2mg/kg: 8 1673.8 ± 63.7

### P < 0.001 frente a Comida + vehlculo

* P < 0.05, ** P < 0.01 frente DIO + vehlculo

La figura 5A es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos sobre la grasa abdominal despues de 14 semanas de tratamiento. La figura 5B es un grafico que ilustra los efectos del tratamiento con peptidos en la grasa subcutanea despues de 14 semanas de tratamiento. Los resultados muestran que el tratamiento con SS-31 o 5 SS-20 es capaz de reducir el Indice de grasa abdominal y el Indice de grasa subcutanea de los sujetos de prueba.

Ejemplo 4 Efectos de SS-31 y SS-20 sobre el sfndrome metabolico en Modelo de Diabetes STZ

El objetivo de este estudio fue explorar el efecto protector de SS-31 o SS-20 contra las complicaciones diabeticas inducidas por estreptozotocina (STZ) y slndrome metabolico en ratas Sprague-Dawley macho.

Modelos de rata de diabetes de tipo 1 se establecieron mediante la administracion de altas dosis de STZ (30 mg/kg). 10 Las ratas del mismo lote alimentado con comida normal se utilizan como control normal. Los grupos de estudio incluyeron: Grupo A: STZ+SS-31 10 mg/kg s.c. q.d. (M.-F.), n=11; Grupo B: STZ+SS-20 10 mg/kg s.c. q.d. (M.-F.), n=11; Grupo C: STZ+ vehlculo s.c. q.d. (M.-F.), n=10; Grupo D: NRC + vehlculo s.c. q.d. (M.-F.), n=10. El esquema terapeutico se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13. Horario terapeutico

Duracion: Objetivo Grupos diabeticos (A, B, C) Grupo de control (D)

1a-3a semana: Aclimatacion Comida normal para ratas

Fin de la 3a semana: Inyeccion de STZ STZ 65 mg/kg, i.p., una vez Solucion reguladora de citrato 2 mL/kg, i.p., una vez

4a-18a semana: Induccion de diabetes Comida normal para ratas

19a-28a semana: Tratamiento con peptido Grupo A:MTP-131 10mg/kg/dla Grupo B:SS-20 10 mg/kg/dla Grupo C: Solucion salina 2 mL/kg/dla s.c., 5 dlas por semana Grupo D: Solucion salina 2 mL/kg/dla s.c., 5 dlas por semana

29a semana: Organos y tejidos recogidos

15

Los compuestos se disolvieron en solucion salina. El tratamiento se administra una vez al dla (5 dlas a la semana) con punto de inyeccion que sea alterno. La concentracion de SS-31 y SS-20 en dosis de 10 mg/kg es de 5 mg/ml. El volumen de tratamiento (0.2 ml/100 g para s.c.) para cada animal de prueba se ajusto de acuerdo con su peso corporal tomada en el comienzo de cada semana. STZ se disolvio en solucion reguladora de citrato 0.1 M (pH 4.5) a 20 la concentracion de 20 mg/mL. STZ se inyecto por via intraperitoneal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La figura 6 muestra que el nivel de TG en grupos SS-31 y SS-20 aumento menos que el grupo STZ/Solucion salina despues del tratamiento con peptidos durante 2 semanas o 4 semanas. Se indica que SS-31 y SS-20 tienen efectos en la regulacion del metabolismo de los llpidos.

Ejemplo 5 - Prevencion y tratamiento del sfndrome metabolico por peptidos aromaticos cationicos en el modelo de rata Zucker

Para demostrar adicionalmente la prevencion del slndrome metabolico, por una parte, y el tratamiento de slndrome metabolico por el contrario, los peptidos aromaticos cationicos de la invencion se ensayan en la rata Zucker grasa (fa/fa), un modelo de slndrome metabolico inducido por la dieta. En comparacion con el modelo de rata Sprague- Dawley alimentada 6 semanas con alto contenido de grasa (como se usa en el Ejemplo 1), las ratas Zucker obesas desarrollan un grado mucho mayor de obesidad y resistencia a la insulina.

En primer lugar, para examinar los efectos de los peptidos aromaticos cationicos en la prevencion del slndrome metabolico, ratas Zucker jovenes (~ 3-4 semanas de edad) se les administra un peptido aromatico cationico (por ejemplo, SS-20 o SS-31) durante aproximadamente 6 semanas. A medida que estas ratas jovenes que aun no presentan signos o slntomas de slndrome metabolico; que proporcionan un modelo util para evaluar la eficacia de los metodos de la prevencion del slndrome metabolico. SS-31 o SS-20 (1.0 a 5.0 mg/kg peso corporal) se administra a las ratas via i.p. o administracion oral (esto es, agua de bebida o alimentacion forzada).

Se preve que la administracion SS-31 va a atenuar o prevenir los slntomas del slndrome metabolico, que normalmente se desarrolla en ratas Zucker grasas (fa/fa). Los resultados medidos incluyen peso corporal, acidos grasos libres/insulina/glucosa en ayunas, tolerancia a la glucosa (PTOG), sensibilidad muscular por insulina in vitro (incubacion), marcadores de senalizacion de la insulina (Akt-P, IRS-P), estudios de la funcion mitocondrial en fibras permeabilizados (respiracion, emision de H2O2), marcadores de estres oxidativo intracelular (peroxidacion lipldica, relacion GSH/GSSG, actividad aconitasa) y actividad de la enzima mitocondrial. Se hace una comparacion entre las ratas de control y ratas fa/fa administrados con SS-31. Los controles incluyen ratas fa/fa y de tipo salvaje no administrados SS-31. La prevencion con exito de slndrome metabolico por los peptidos aromaticos cationicos de la invencion se indica por una reduccion en uno o mas de los marcadores asociados con el slndrome metabolico enumerados anteriormente.

En segundo lugar, para examinar los efectos de los peptidos aromaticos cationicos de la invencion en el tratamiento del slndrome metabolico, ratas Zucker (~ 12 semanas de edad) se administran con SS-31 durante aproximadamente 6 semanas. Como estas ratas muestran signos de la obesidad y el slndrome metabolico, proporcionan un modelo util para evaluar la eficacia de los metodos de tratamiento de la resistencia a la insulina. sS-31 (1.0 - 5.0 mg/kg de peso corporal) se administra a las ratas via i.p. o administracion oral (esto es, agua o alimentacion forzada de bebida).

Se preve que la administracion SS-31 va a mejorar o reduce el slndrome metabolico, que normalmente se desarrolla en estas ratas Zucker grasas mayores (fa/fa). Los resultados medidos incluyen el peso corporal, acidos grasos libres/insulina/glucosa en ayunas, tolerancia a la glucosa (PTOG), sensibilidad muscular por insulina in vitro (incubacion), marcadores de senalizacion de la insulina (Akt-P, el IRS-P), estudios de la funcion mitocondrial en fibras permeabilizados (respiracion, emision H2O2), marcadores de estres oxidativo intracelular (peroxidacion lipldica, relacion GSH/GSSG, actividad aconitasa) y actividad de la enzima mitocondrial. Se hace una comparacion entre las ratas de control y las ratas fa/fa administradas con SS-31. Los controles incluyen ratas de tipo salvaje y fa/fa no administradas con SS- 31. El exito del tratamiento de slndrome metabolico por los peptidos aromaticos cationicos de la invencion se indica por una reduccion en uno o mas de los marcadores asociados con el slndrome metabolico enumerados anteriormente.

Equivalentes

La presente invencion no debe ser limitada en terminos de las realizaciones particulares descritas en esta solicitud, que pretenden ser simples ilustraciones de aspectos individuales de la invencion. Muchas modificaciones y variaciones de esta invencion se pueden hacer sin apartarse de su esplritu y alcance, como sera evidente para los expertos en el arte. Los metodos funcionalmente equivalentes y aparatos dentro del alcance de la invencion, ademas de los enumerados en este documento, seran evidentes para los expertos en el arte a partir de las descripciones anteriores. Tales modificaciones y variaciones se pretenden que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente invencion esta limitada solamente por los terminos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que tienen derecho tales reivindicaciones. Se debe entender que esta invencion no se limita a metodos particulares, reactivos, compuestos de composiciones o sistemas biologicos, que pueden, por supuesto, variar. Se debe entender tambien que la terminologla usada en este documento es para el proposito de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante.

Ademas, cuando se describen caracterlsticas o aspectos de la divulgacion en terminos de grupos Markush, los expertos en el arte reconoceran que la divulgacion tambien se describe de este modo en terminos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.

Tal como se comprendera por un experto en el arte, por cualquiera y todos los fines, en particular en terminos de 5 proporcionar una descripcion escrita, todos los intervalos revelados en este documento tambien abarcan cualquier y todos los subintervalos y combinaciones de subintervalos posibles de los mismos. Cualquier rango enumerado se puede reconocer facilmente como suficientemente descrito y permitiendo al mismo rango se descomponga en al menos iguales medios, tercios, cuartos, quintos, decimos, etc. Como un ejemplo no limitante, cada rango discutido en este documento se puede descomponer facilmente en un tercero inferior, tercero medio y tercero superior, etc. 10 Como tambien se comprendera por un experto en el arte todo el lenguaje tal como "hasta", "al menos", "mayor que", "menor que", y similares, incluye el numero recitado y se refiere a intervalos que se pueden romper posteriormente hacia abajo en subintervalos como se discutio anteriormente. Finalmente, como se entendera por un experto en el arte, un intervalo incluye cada miembro individual. Asl, por ejemplo, un grupo que tiene de 1-3 celulas se refiere a grupos que tienen 1, 2, o 3 celulas. Del mismo modo, un grupo que tiene 1-5 celulas se refiere a grupos que tienen 15 1, 2, 3, 4, o 5 celulas, y asl sucesivamente.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Peptido D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 o Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 para su uso en el tratamiento o la prevencion del slndrome metabolico en un sujeto mamlfero.
2. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el slndrome metabolico esta asociado con resistencia a la absorcion de glucosa mediada por la insulina, intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia, aumento de colesterol LDL, aumento de VLDL, aumento de trigliceridos, disminucion de colesterol HDL, aumento de los niveles de inhibidor del activador del plasminogeno-1 (PAI-1) o hipertension.
3. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el slndrome metabolico se caracteriza por tres o mas de los siguientes criterios:

(a) obesidad abdominal: circunferencia de cintura > 102 cm en hombres y > 88 cm en mujeres;

(b) hipertrigliceridemia: > 150 mg/dl (1.695 mmol/1);

(c) colesterol HDL bajo: < 40 mg/dl (1.036 mmol/l) en hombres y < 50 mg/dl (1.295 mmol/l) en mujeres;

(d) presion arterial alta: > 130/85 mm Hg; y

(e) glucosa alta en ayunas: >110 mg/dl (> 6.1 mmol/l).
4. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el slndrome metabolico se caracteriza por diabetes, intolerancia a la glucosa, alteracion de la glucosa en ayunas, o resistencia a la insulina ademas de dos o mas de las siguientes anomallas:

(a) presion arterial alta: > 160/90 mm Hg;

(b) hiperlipidemia: concentracion de trigliceridos: >150 mg/dl (1.695 mmol/l) y/o colesterol HDL <35 mg/dl (0.9 mmol/l) en hombres y <39 mg/dl (1.0 mmol/l) en mujer;

(c) obesidad central: relacion cintura-cadera de> 0.90 en hombres o > 0.85 en mujeres o BMI > 30 kg/m2; y

(d) microalbuminuria: velocidad de excrecion de albumina urinaria > 20 mg/min o una relacion albumina con creatinina: > 20 mg/g.
5. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el slndrome metabolico se caracteriza por tres o mas de los siguientes criterios:

(a) trigliceridos > 150 mg/dl;

(b) presion arterial sistolica (BP) >130 mm Hg o presion arterial diastolica >85 mmHg o en tratamiento antihipertensivo;

(c) colesterol de lipoprotelnas de alta densidad < 40 mg/dl;

(d) azucar en sangre en ayunas (FBS) > 110 mg/dl; y

(e) Indice de masa corporal > 28.8 kg/m2.
6. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el slndrome metabolico se trata a traves de la mejora del metabolismo de llpidos en comparacion con el metabolismo de los llpidos del sujeto antes de que se administre el peptido.
7. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la mejora en el metabolismo de los llpidos es la reduction del nivel de trigliceridos en la sangre en comparacion con el nivel de trigliceridos en la sangre del sujeto antes de que se administre el peptido.
8. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la mejora en el metabolismo de los llpidos es la mejora de la relacion de colesterol HDL/LDL en sangre en comparacion con el colesterol en sangre HDL/LDL del sujeto antes de que se administre el peptido.
9. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el slndrome metabolico es tratado mediante la reduccion de nivel de azucar en sangre en comparacion con el nivel de azucar en la sangre del sujeto antes de que se administre el peptido.
10. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el slndrome metabolico es tratado por una 5 reduccion en el peso corporal en comparacion con el peso corporal del sujeto antes de que se administre el peptido.
11. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el sujeto es un humano.
12. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el peptido se administra antes de la aparicion de la diabetes tipo II.
13. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el peptido se formula para ser administrado 10 por via oral, por via sistemica, por via intravenosa, subcutanea, o intramuscular.
14. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el mamlfero se controla para el tratamiento o prevencion del slndrome metabolico.