ES2576927T3 - Sistemas de RMN y métodos para la detección rápida de analitos - Google Patents

Sistemas de RMN y métodos para la detección rápida de analitos Download PDF

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ES2576927T3 ES11835088.3T ES11835088T ES2576927T3 ES 2576927 T3 ES2576927 T3 ES 2576927T3 ES 11835088 T ES11835088 T ES 11835088T ES 2576927 T3 ES2576927 T3 ES 2576927T3
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Mark John Audeh
Matthew Blanco
James Franklin Chepin
Vasiliki Demas
Rahul Dhanda
Marilyn Lee Fritzemeier
Isaac Koh
Sonia Kumar
Lori Anne Neely
Brian Mozeleski
Daniella Lynn Plourde
Charles William Rittershaus
Parris Wellman
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Abstract

Un método para detectar la presencia de un patógeno en una muestra de sangre entera, comprendiendo el método: (a) proveer una muestra de sangre entera de un sujeto; (b) mezclar la muestra de sangre entera con un agente de lisis de eritrocitos para producir glóbulos rojos destruidos; (c) después de la etapa (b), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descartando una parte o todo el sobrenadante, y resuspender la pella para formar un extracto, lavando opcionalmente la pella antes de resuspender la pella y repetir opcionalmente la etapa (c); (d) someter a lisis las células del extracto para formar un lisado; (e) colocar el lisado de la etapa (d) en un contenedor y amplificar un ácido nucleico en el lisado para formar una solución lisada amplificada que comprende el ácido nucleico diana, en donde el ácido nucleico diana es característico del patógeno que va a ser detectado; (f) después de la etapa (e) mezclar la solución lisada amplificada con de 1x106 hasta 1x1013 partículas magnéticas por mililitro de la solución lisada amplificada para formar una muestra líquida, en donde las partículas magnéticas tienen un diámetro medio de 700 nm a 950 nm, una relajación T2 por partícula que va de 1x109 a 1x1012mM-1s-1, y unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativa las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregación de las partículas magnéticas en la presencia de un ácido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente; (g) colocar la muestra líquida en un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de detección que comprende las partículas magnéticas y el ácido nucleico diana y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una señal producida al exponer la muestra líquida a un campo magnético polarizado creado utilizando uno o más magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (h) exponer la muestra a un campo magnético polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (i) después de la etapa (h) medir la señal de la muestra líquida, en donde la muestra líquida comprende opcionalmente proteínas de sangre entera y oligonucleótidos no diana; y (j) sobre la base del resultado de la etapa (i) detectar el patógeno, en donde opcionalmente el patógeno es bacterias u hongos, y en donde el método es capaz de detectar una concentración de patógenos de 10 células/mL en la muestra de sangre entera, preferiblemente en donde las etapas (a) a (i) son completadas al cabo de 3 horas y/o la etapa (i) se lleva a cabo sin ninguna purificación previa de la solución lisada amplificada.

Description

DESCRIPCION
Sistemas de RMN y metodos para la deteccion rapida de analitos Esta invention muestra ensayos para la deteccion de analitos.
Se han disenado sensores magneticos para detectar interacciones moleculares en una variedad de medios, 5 incluyendo biofluldos, productos alimenticios, y muestras de suero, entre otros medios. Por enlazamiento a las dianas, estos sensores producen cambios en las propiedades de moleculas de agua vecinas (o cualquier molecula de solvente con hidrogenos libres) de una muestra, las cuales pueden ser detectadas por tecnicas de resonancia magnetica (RMN/IRM). Asl, utilizando estos sensores en una muestra llquida, es posible detectar la presencia, y potencialmente cuantificar la cantidad, de un analito una concentration muy baja. Por ejemplo, pueden detectarse 10 moleculas pequenas, ADN, ARN, protelnas, carbohidratos, organismos, metabolitos y patogenos (por ejemplo virus) utilizando sensores magneticos.
En general, los sensores magneticos son partlculas magneticas que se enlazan o de alguna otra manera se unen a su diana molecular previsto para formar aglomerados (agregados). Se cree que cuando las partlculas magneticas se ensamblan en aglomerados y el area transversal efectiva se hace mas grande (y la densidad del numero de 15 aglomerados es mas pequena), las interacciones con el agua u otras moleculas de solventes se alteran, llevando a un cambio en las ratas de relajacion medidas (por ejemplo, T2, Ti, T2*), susceptibilidad, frecuencia de precision, entre otros cambios flsicos. Adicionalmente, la formation de aglomerados puede disenarse para hacer reversible (por ejemplo, por desplazamiento de temperatura, escision qulmica, desplazamiento de pH, etc.), de tal manera que pueden desarrollarse ensayos “de avance” o “reversos” (competitivos e inhibition) para la deteccion de analitos 20 especlficos. Los tipos de ensayos de avance (aglomeracion) y reversos (desaglomeracion) pueden utilizarse para detectar una amplia variedad de materiales biologicamente relevantes. El fenomeno de SRM (conmutacion de resonancia magnetica) fue descrito previamente (vease la Publication de Patente de los Estados Unidos No. 20090029392).
Muchos ensayos diagnosticos requieren sensibilidad en el rango picomolar o subpicomolar. En tales ensayos se 25 emplea una concentracion igualmente baja de partlculas paramagneticas. Como resultado, los eventos de enlazamiento que llevan a la formacion de aglomerados pueden convertirse en una etapa limitante de la velocidad en la termination del ensayo puesto que la frecuencia de colision de los antlgenos, partlculas paramagneticas y aglomerados formados parcialmente es baja en este rango de concentracion (vease Baudry et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103:16076 (2006)). La deteccion actual de agentes infecciosos, acidos nucleicos, moleculas pequenas, 30 agentes y organismos de guerra biologica, y dianas moleculares (biomarcadores) o la combination de dianas moleculares y de inmunoensayo requiere usualmente preparation previa de la muestra, tiempo para analizar la muestra, y pruebas simples para cada uno de los analitos individuales. Hay necesidad de un dispositivo de deteccion de analitos rapido, comercialmente realizable basado en RMN adecuado para uso con nanosensores magneticos que tienen cuatro caracterlsticas y calidades unicas: 1) poca o ninguna preparacion de la muestra, 2) deteccion 35 multiple a traves de tipos moleculares multiples, 3) adquisicion rapida de information de diagnostico y 4) information exacta para tomar decisiones cllnicas en el sitio de atencion.
La US 2009/134869 A1 divulga un metodo para detectar la presencia de un analito en una muestra llquida en donde la presencia o concentracion de los analitos de interes puede detectarse a traves de metodos de relajacion por RMN.
La WO 2009/026164 A1 divulga un metodo basado en resonancia magnetica para medir la viscosidad de un llquido 40 utilizando partlculas de oxido de hierro supermagneticas.
La US 2010/259259 A1 divulga sistemas y metodos para generar imagenes que incluyen preparar un ferrofluido que incluye nanopartlculas magneticas en un portador llquido, posicionar el ferrofluido en una region de campo de un sistema de imagenes por resonancia magnetica, y accionar una velocidad de giro o velocidad lineal de las nanopartlculas magneticas para alterar la susceptibilidad magnetica compleja escalar o tensora del ferrofluido.
45 La US 2007/190543 A1 divulga metodos para detectar un analito diana traslocando una molecula codificada a traves de un nanoporo, en donde la molecula codificada comprende una pluralidad ordenada de regiones de codigo.
La WO 2009/045551 A1 divulga dispositivos, sistemas y tecnicas relacionadas con una plataforma de diagnostico por RMN miniaturizada, basada en chip, para la deteccion cuantitativa y en multicanales rapida de dianas biologicas.
Akira Tsukamoto et al. (Development of a SQUID System Using Field Reversal for Rapidly Detecting Bacteria", IEEE 50 TRANSACTIONS ON APPLIED SUPERCONDUCTIVITY, IEEE Service Center, Los Alamitos, CA, US, vol. 19, no. 3, (2009), pages 853-856) divulga un metodo para la deteccion de patogenos utilizando HTS_SQUID y marcadores magneticos.
Resumen de la invencion
La invencion presenta metodos para la deteccion de analitos.
La invencion se relaciona con un metodo para detectar la presencia de un patogeno en una muestra de sangre entera, comprendiendo el metodo:
5 (a) proveer una muestra de sangre entera de un sujeto;
(b) mezclar la muestra de sangre entera con un agente de lisis de eritrocitos para producir globulos rojos sangulneos destruidos;
(c) despues de la etapa (b), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descargando una parte o todo el sobrenadante, y resuspendiendo la pella para formar un extracto, lavando opcionalmente la pella antes de
10 resuspender la pella y repetir opcionalmente la etapa (c);
(d) someter a lisis las celulas del extracto para formar un lisado;
(e) colocar el lisado de la etapa (d) en un contenedor y amplificar un acido nucleico diana en el lisado para formar unas solucion de lisado amplificada que comprende el acido nucleico diana, en donde el acido nucleico diana es caracterlstico del patogeno que se va a detectar;
15 (f) despues de la etapa (e) mezclar la solucion lisada amplificada con 1 x 106 a 1 x 1013 partlculas magneticas por
mililitro de la solucion de lisado amplificada para formar una muestra llquida, en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio que va de 700 nm a 950 nm, una capacidad de relajacion T2 por partlcula que va de 1 x 109 a 1 x 1012 mM-1s-1, y enlazar unidades estructurales sobre su superficie, siendo operativas las unidades estructurales enlazadas para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia de un acido nucleico 20 diana o un agente de enlazamiento multivalente;
(g) colocar la muestra llquida en un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un soporte que define un pozo para sostener el tubo de deteccion que comprende las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y teniendo una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida por exposicion de la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una
25 secuencia de pulsos de RF;
(h) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de RF;
(i) despues de la etapa (h), medir la senal de la muestra llquida, en donde la muestra llquida comprende opcionalmente protelnas de sangre entera y oligonucleotidos no diana; y
(j) sobre la base del resultado de la etapa (i) detectar el patogeno, en donde opcionalmente el patogeno es bacterias 30 u hongos, y en donde el metodo es capaz de detectar una concentracion de patogenos de 10 celulas/mL en la
muestra de sangre entera,
preferiblemente en donde las etapas (a) a (i) se completan al cabo de 3 horas y/o la etapa (i) se lleva a cabo sin ninguna purificacion previa de la solucion lisada amplificada.
Segun un metodo para detectar la presencia de un analito en una muestra llquida, incluyendo el metodo: (a) poner 35 en contacto una solucion con partlculas magneticas para producir una muestra llquida que incluye desde 1 x 106 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1 x 106 a 1 x 108, 1 x 107 a 1 x 108, 1 x 107 a 1 x 109, 1 x 108 a 1 x 1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o 1 x 1010 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 699 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, o desde 500 a 699 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 108 a 1 x 40 1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1 x 108 a 1 x 109, 1 x 108 a 1 x 1010, 1 x 109 a 1 x 1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o desde 1 x 1010
a 1 x 1012 mM-1s-1), y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo las unidades estructurales de enlazamiento operativas para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del analito o de un agente de enlazamiento multivalente; (b) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo que contiene la muestra llquida que incluye las partlculas magneticas, el agente de 45 enlazamiento multivalente y el analito, y teniendo una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo configurada la bonina de RF para detectar una senal producida por la exposicion de la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una secuencia de pulso RF; (c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulso RF; (d) despues de la etapa (c), medir la senal; y (e) con base en el resultado de la etapa (d), detectar el analito. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente 50 monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y agente de enlazamiento
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multivalente; y/o las partlcuias magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente de bloqueo seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gammaglobulina, lisozima, caselna, peptidasa, y una unidad estructural que porta amina (por ejemplo, amino polietilenglicol, glicina, etilendiamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, de 0.1% a 3% (p/p) de albumina (por ejemplo, desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) de albumina), de 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (por ejemplo, desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% surfactante no ionico), o una combination de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 pg a 100 pg (por ejemplo, 40 pg a 60 pg, 50 pg a 70 pg, 60 pg a 80 pg, o 80 pg a 100 pg), de una o mas protelnas por miligramos de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico. Por ejemplo, el analito puede ser creatinina, la muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de creatinina y las partlculas magneticas pueden incluir una superficie cubierta con anticuerpos de creatinina. En otra realization, el analito puede ser tacrolimus, la muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de tacrolimus, y las partlculas magneticas pueden incluir una superficie cubierta con anticuerpos de tacrolimus. En particular las realizaciones del metodo, etapa (d) incluyen medir la respuesta a relajacion T2 de la muestra llquida, y en donde la aglomeracion creciente en la muestra llquida produce un incremento en la rata de relajacion T2 observada de la muestra. En ciertas realizaciones, el analito es un acido nucleico diana (por ejemplo, acido nucleico diana extraldo de un leucocito, o un patogeno).
Se divulga un metodo para detectar la presencia de un analito en una muestra llquida, incluyendo el metodo (a) poner en contacto una solution con partlculas magneticas para producir una muestra llquida que incluye desde 1 x 106 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1 x 106 a 1x108, 1 x 107 a 1 x 108, 1 x 107 a 1 x 109, 1 x 108 a 1 x 1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o 1 x 1010 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tiene un diametro medio de 700 nm a 1200 nm (e.g., desde 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula de 1 x 109 a 1 x 1012 mM'V (e.g., desde 1x109 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o desde 1x1010 a 1x1012 mM'V), y tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo las unidades de enlazamiento operativas para alterar una agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del analito; (b) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo que contiene la muestra llquida que incluye las partlculas magneticas, el agente de enlazamiento multivalente y el analito, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una serial producida al exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y la secuencia de pulsos RF; (c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos RF; (d) despues de la etapa (c), medir la serial y (e) sobre la base del resultado de la etapa (d), detectar la presencia o concentration de un analito. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y del agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente de bloqueo seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gammaglobulina, lisozima, caselna, peptidasa, y una unidad estructural que porta amina (por ejemplo, amino polietilenglicol, glicina, etilendiamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye ademas un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) de albumina (e.g., desde 0.1% a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) de albumina), desde 0.01 % a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico. Por ejemplo, el analito puede ser creatinina, la muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de creatinina, y las partlculas magneticas pueden incluir una superficie cubierta con anticuerpos de creatinina. En otra realizacion, el analito puede ser tacrolimus, la muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de tacrolimus, y las partlculas magneticas pueden incluir una superficie cubierta con anticuerpos de tacrolimus. En realizaciones particulares del metodo, la etapa (d) incluye medir la respuesta a la relajacion T2 de la muestra llquida, y en donde la aglomeracion creciente en la muestra llquida produce un incremento en la rata de relajacion T2 observada de la muestra. En ciertas realizaciones, el analito es un acido nucleico diana (por ejemplo, un acido nucleico diana extraldo de un leucocito, o un patogeno).
La invention presenta adicionalmente un metodo para detectar la presencia de un patogeno en una muestra de sangre entera, incluyendo el metodo: (a) proveer una muestra de sangre entera de un sujeto; (b) mezclar la muestra de sangre entera con una solucion de agente de lisis de eritrocitos para producir celulas de globulos rojos destruidas; (c) despues de la etapa (b), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante de una pella, descargando una parte o todo el sobrenadante, y resuspendiendo la pella para formar un extracto, opcionalmente lavando la pella (por ejemplo, con regulador TE) antes de resuspender la pella y opcionalmente repetir la etapa (c); (d) someter a lisis las celulas del extracto para formar un lisado; (e) colocar el lisado de la etapa (d) en un tubo de detection y amplificar un acido nucleico diana en el lisado para formar una solucion de lisado amplificada que incluye el acido nucleico diana, en donde el acido nucleico diana es caracterlstico del patogeno que va a ser
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detectado; (f) despues de la etapa (e) agregar al tubo de deteccion desde 1 x 106 a 1 x 1013 de partlcuias magneticas por mililitro de la solucion de lisado amplificada (por ejemplo, desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o 1x1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tiene un diametro medio desde 700 nm a 950 nm, una capacidad de relajacion T2 por partlcula de 1 x 109 a 1x1012 mM'V1 y unidades de enlazamiento sobre su superficie, siendo las unidades de enlazamiento operativas para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia de acidos nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente; (g) colocar el tubo de deteccion en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para sostener el tubo de deteccion que incluye las partlculas magneticas del acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida por la exposicion de la muestra llquida al campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos RF; (h) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos RF; (i) despues de la etapa (h), medir la senal del tubo de deteccion; y (j) sobre la base del resultado de la etapa (i), detectar el patogeno. En ciertas realizaciones, las etapas (a) a (i) se completan al cabo de 4 horas (por ejemplo, al cabo de 3.5 horas, 3.0 horas, 2.5 horas,2 horas, 1.5 horas, o 1 hora). En otra realizacion, la etapa (i) se lleva a cabo sin ninguna purificacion previa de la solucion de lisado amplificada (esto es, la solucion lisada no es fraccionada despues de que se forma). En realizaciones particulares, la etapa (c) incluye lavar la pella antes de resuspender la pella para formar el extracto. En realizaciones particulares la etapa (d) incluye combinar el extracto con perlas para formar una mezcla y agitar la mezcla para formar un lisado. Las partlculas magneticas pueden incluir una o mas poblaciones que tengan una primera sonda y una segunda sonda conjugadas a su superficie, siendo la primera sonda operativa para enlazarse a un primer segmento del acido nucleico diana y siendo la segunda sonda operativa para enlazarse a un segundo segmento del acido nucleico diana, en donde las partlculas magneticas forman agregados en la presencia del acido nucleico diana. Alternativamente, el ensayo puede ser un ensayo de desagregacion en el cual las partlculas magneticas incluyen una primera poblacion que tiene una primera unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie y una segunda poblacion que tiene una segunda unidad de enlazamiento sobre su superficie, e incluyendo la unidad estructural de enlazamiento multivalente una primera sonda y una segunda sonda, operativa a la primera sonda para enlazarse a la primera unidad estructural de enlazamiento y operativa a la segunda sonda para enlazarse una segunda unidad estructural de enlazamiento, siendo operativa las unidades de enlazamiento y la unidad de enlazamiento multivalente para alterar una agregacion de las partlculas magneticas en la presencia de un acido nucleico diana. En ciertas realizaciones las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente de bloqueo seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gammaglobulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural que porta amina (por ejemplo, aminopolietilenglicol, glicina, etilendiamina o aminodextrano). En realizaciones particulares, el lisado incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1 % a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. en todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. El lisado puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico.
La invencion presenta un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico diana en una muestra de sangre entera, incluyendo el metodo: (a) proveer una o mas celulas de una muestra de sangre entera de un sujeto; (b) someter a lisis las celulas de un lisado; (c) amplificar un acido nucleico diana en el lisado para formar una solucion de lisado que comprende el acido nucleico diana; (d) despues de la etapa (c), agregar a un tubo de deteccion la solucion amplificada lisada y desde 1 3 106 a 131013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion lisada amplificada, en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 700 nm a 950 nm y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente; (e) colocar el tubo de deteccion en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que incluye las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (f) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (h) despues de la etapa (f), medir la senal desde el tubo de deteccion; y (i) sobre la base del resultado de la etapa (h), detectar el acido nucleico diana. En realizaciones particulares, el acido nucleico diana es purificado antes de una etapa (d). En realizaciones particulares, la etapa (b) incluye combinar el extracto con perlas para formar una mezcla y agitar la mezcla para formar un lisado. Las partlculas magneticas pueden incluir una o mas poblaciones que tienen una primera sonda y una segunda sonda conjugadas a su superficie, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a un primer segmento del acido nucleico diana y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a un segundo segmento del acido nucleico diana, en donde las partlculas magneticas forman agregados en la presencia del acido nucleico diana. Alternativamente, el ensayo puede ser un ensayo de desagregacion en el cual las partlculas magneticas incluyen una primera poblacion que tiene una primera unidad de enlazamiento sobre su superficie y una segunda poblacion que tiene una segunda unidad estructural de enlazamiento en su superficie, e incluyendo la unidad estructural de enlazamiento multivalente una primera sonda y
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una segunda sonda, siendo operativa la primera sonda en la primera unidad estructural de enlazamiento y siendo operativa la segunda para enlazarse una segunda unidad estructural de enlazamiento, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento y la unidad estructural de enlazamiento multivalente para alterar una agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, el lisado incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1 % a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen opcionalmente una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. El lisado puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico.
La invencion presenta adicionalmente un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico diana en una muestra de sangre entera, incluyendo el metodo: (a) proveer un extracto producido por lisis de los globulos rojos en una muestra de sangre entera de un sujeto, centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descartar todo o una parte del sobrenadante, y resuspender la pella para formar un extracto, lavar opcionalmente la pella (por ejemplo, con un regulador TE)) antes de resuspender la pella y repetir opcionalmente la centrifugacion, descarte y lavado de la etapa (a); (b) someter a lisis las celulas en el extracto para formar un lisado; (c) colocar el lisado de la etapa (b) en un tubo de deteccion y amplificar los acidos nucleicos contenidos para formar una solucion lisada amplificada que incluye desde 40% (p/p) a 95% (p/p del acido nucleico diana (e.g., desde 40 a 60%, desde 60 a 80%, o desde 85 a 95% (p/p del acido nucleico diana) y desde 5% (p/p) a 60% (p/p) de acido nucleico no diana (e.g., desde 5 a 20%, desde 20 a 40%, o desde 40 a 60% (p/p) de acido nucleico no diana); (d) despues de la etapa
(c), agregar al tubo de deteccion de 1 3 106 a 1 3 1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion lisada amplificada, en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 700 nm a 950 nm y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente; (e) colocar el tubo de deteccion en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que incluye las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (f) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (g) despues de la etapa (f), medir la senal desde el tubo de deteccion; y (h) sobre la base del resultado de la etapa (g), detectar el acido nucleico diana, en donde la etapa (g) se lleva a cabo sin ninguna purificacion previa de la solucion lisada amplificada. En realizaciones particulares, la etapa (b) incluye combinar el extracto con perlas para formar una mezcla y agitar la mezcla para formar un lisado. Las partlculas magneticas pueden incluir una o mas poblaciones que tienen una primera sonda y una segunda sonda conjugadas a su superficie, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a un primer segmento del acido nucleico diana y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a un segundo segmento del acido nucleico diana, en donde las partlculas magneticas forman agregados en la presencia del acido nucleico diana. Alternativamente, el ensayo puede ser un ensayo de desagregacion en el cual las partlculas magneticas incluyen una primera poblacion que tiene una primera unidad de enlazamiento sobre su superficie y una segunda poblacion que tiene una segunda unidad estructural de enlazamiento en su superficie, e incluyendo la unidad estructural de enlazamiento multivalente una primera sonda y una segunda sonda, siendo operativa la primera sonda en la primera unidad estructural de enlazamiento y siendo operativa la segunda para enlazarse una segunda unidad estructural de enlazamiento, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento y la unidad estructural de enlazamiento multivalente para alterar una agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, el lisado incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1 % a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1% a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. El lisado puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico.
En una realization preferida, la invencion presenta un metodo para detectar la presencia de un patogeno en una
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muestra de sangre entera como se describio mas arriba, en donde el patogeno es una especia de Candida, en donde dicha amplificacion se hace en la presencia de un cebador de avance y un cebador reverso, cada uno de los cuales es universal para multiples especies de Candida para formar una solucion que incluye un amplicon de Candida; dichas unidades estructurales de enlazamiento son operativas para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia de un amplicon de Candida o un agente de enlazamiento multivalente. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1% a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico. El cebador de avance puede incluir, por ejemplo, la secuencia 5'-GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC-3' (SEQ ID NO. 1). El cebador reverso puede incluir, por ejemplo, la secuencia 5'-GCT TAT TGA TAT GCT TAA GTT CAG CGG gT-3' (SEQ ID NO. 2). En ciertas realizaciones, (i) la especie de Candida es Candida albicans, la primera sonda incluye la secuencia de oligonucleotidos 5'-AcC CAG CGG TTT GAG GGA GAA AC-3' (SEQ ID nO. 3), y la segunda sonda incluye la secuencia de oligonucleotidos 5'-AAA GTT TGA AGA TAT ACG TgG TGG ACG tTa-3' (SEQ ID NO. 4);
(ii) la especie de Candida es Candida krusei y la primera sonda y la segunda sonda incluyen una secuencia de oligonucleotidos seleccionada de: 5'-CGC AcG CGC AAG ATG GAA ACG-3' (SEQ ID NO. 5), 5'-AAG TTC AGC GGG TAT TCC TAC CT-3' (SEQ ID NO. 6), y 5'-AGC TTT TTG TTG TCT CGC AAC ACT CGC-3' (SEQ ID NO. 32);
(iii) la especie de Candida es Candida glabrata, la primera sonda incluye la secuencia de oligonucleotidos: 5'-CTA cCa AAC ACA ATG TGT TTG AGA AG-3' (SEQ ID NO. 7), y la segunda sonda incluye la secuencia de oligonucleotidos: 5'-CCT GAT TTG AGG TCA AAC TTA AAG ACG TCT G-3' (SEQ ID NO. 8); y (iv) la especie de Candida es Candida parapsilosis o Candida tropicalis y la primera sonda y la segunda sonda incluyen una secuencia de oligonucleotidos seleccionada de: 5'-AGT CcT aCc TgA TTT GAG GTCNitIndAA-3' (SEQ ID NO. 9), 5'-CCG NitIndGG GTT TGA GGG AGA AAT-3' (SEQ ID NO. 10), AAA GTT ATG AAATAA ATT GTG GTG GCC ACT AGC (SEQ ID NO. 33), ACC CGG GGGTTT GAG GGA GAA A (SEQ ID NO. 34), AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC GAA (SEQ ID NO. 35), y CCG AGG GTT TGA GGG AGA AAT (SEQ ID NO. 36). En ciertas realizaciones, las etapas
(a) a (h) son completadas al cabo de 4 horas (e.g., al cabo de 3.5 horas, 3.0 horas, 2.5 horas, 2 horas, 1.5 horas, o 1 hora o menos). En realizaciones particulares, las partlculas magneticas incluyen dos poblaciones, una primera poblacion que porta la primera sonda sobre su superficie, y la segunda poblacion que porta la segunda sonda sobre su superficie. En otra realizacion, las partlculas magneticas son una poblacion simple que porta tanto la primera sonda como la segunda sonda sobre la superficie de las partlculas magneticas. Las partlculas magneticas pueden incluir una o mas poblaciones que tienen una primera sonda y una segunda sonda conjugada a su superficie, operativa la primera sonda para enlazarse a un primer segmento del amplicon de Candida y la segunda sonda operativa para enlazarse a un segundo segmento del amplicon de Candida en donde las partlculas magneticas forman agregados en la presencia del acido nucleico diana. Alternativamente, el ensayo puede ser un ensayo de desagregacion en el cual las partlculas magneticas incluyen una primera poblacion que tiene una primera unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie y una segunda poblacion que tiene una segunda unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie, y la unidad estructural de enlazamiento multivalente que incluye una primera sonda y una segunda sonda, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a la primera unidad estructural de enlazamiento y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a la segunda unidad estructural de enlazamiento, siendo las unidades estructurales de enlazamiento y unidad estructural de enlazamiento multivalente operativas para alterar una agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del amplicon de Candida. En realizaciones particulares, el metodo puede producir (i) un coeficiente de variation en el valor T2 de menos de 20% sobre muestras positivas en Candida; (ii) al menos 95% de detection correcta a menos de o igual a 5 celulas/mL en muestras tomadas en 50 muestras individuales de sangre de pacientes saludables; (iii) al menos 95% de deteccion correcta menor de o igual a 5 celulas/mL en muestras seleccionadas en 50 muestras individuales de sangre de pacientes no saludables; y (iv) mas de o igual a 80% de deteccion correcta en muestras de pacientes cllnicamente positivos (esto es, positivos en Candida por otra tecnica, tal como por cultivo celular) comenzando con 2 mL de sangre.
Se divulga un metodo para detectar la presencia de una especie de Candida en una muestra de sangre entera, incluyendo el metodo: (a) proveer un extracto producido por lisis de las celulas de los globulos rojos sangulneos en una muestra de sangre entera de un sujeto; (b) centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descartando una parte o todo el sobrenadante; (c) lavar la pella (por ejemplo, con regulador TE) mezclando la pella con un regulador, agitando la muestra (por ejemplo, por vortex), centrifugando la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descartando una parte o todo el sobrenadante; (d) repetir opcionalmente las etapas (b) y
(c); (e) agitar con perlas la pella para formar un lisado en la presencia de un regulador (por ejemplo, regulador TE);
(f) centrifugar la muestra para formar un sobrenadante que contiene el lisado; (g) amplificar los acidos nucleicos en el lisado de la etapa (f) para formar un amplicon de Candida; y (h) detectar la presencia de amplicon de Candida, en
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donde, el metodo puede producir (i) al menos 95% de detection correcta a menos de o igual a 5 celulas/mL en muestras sembradas en 50 muestras individuales de sangre de pacientes saludables; (ii) al menos 95% de deteccion correcta menor o igual a 5 celulas/mL en muestras sembradas de 50 muestras individuales de sangre de pacientes no saludables; y/o (iii) mayor de o igual a 80% de deteccion correcta en muestras de pacientes cllnicamente positivos (esto es, positivos en Candida por cultivos celulares) comenzando con 2 mL de sangre en la etapa (a).
Se divulga un metodo para detectar la presencia de un patogeno en una muestra de sangre entera, incluyendo el metodo de las etapas de (a) proveer desde 0.05 a 4.0 mL de la muestra de sangre entera (por ejemplo, de 0.05 a 0.25, 0.25 a 0.5, 0.25 a 0.75, 0.4 a 0.8, 0.5 a 0.75, 0.6 a 0.9, 0.65 a 1.25, 1.25 a 2.5, 2.5 a 3.5, o 3.0 a 4.0 mL de sangre entera); (b) colocar un allcuota de la muestra de la etapa (a) en un contenedor y amplificar un acido nucleico diana en la muestra para formar una solution amplificada que incluye el acido nucleico diana, en donde el acido nucleico diana es caracterlstico del patogeno que va a ser detectado; (c) colocar la muestra llquida amplificada en un dispositivo de deteccion; (d) sobre la base del resultado de la etapa (c), detectar el patogeno, en donde el patogeno es seleccionado de bacterias y hongos, y en donde el metodo es capaz de detectar una concentration de patogeno de 10 celulas/mL (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 celulas/mL) en la muestra de sangre entera. El dispositivo de deteccion puede detectar el patogeno a traves de una medicion optica, fluorescente, de masa, densidad, magnetica, cromatografica y/o electroqulmica de la muestra llquida amplificada. En ciertas realizaciones, las etapas (a) a (d) se completan al cabo de 3 horas (por ejemplo, al cabo de 3.2, 2.9, 2.7, 2.5, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, o 1.5 horas o 1 hora). En todavla otras realizaciones, la etapa (c) se lleva a cabo sin ninguna purification previa de la solucion amplificada y/o la muestra llquida de la etapa (c) incluye protelnas de la sangre entera y oligonucleotidos no diana. En ciertas realizaciones, el patogeno se selecciona de bacterias y hongos. El patogeno puede ser cualquier patogeno bacteriano o fungico descrito aqul.
La invention tambien presenta un metodo para detectar la presencia de un patogeno en una muestra de sangre entera, incluyendo el metodo las etapas de: (a) proveer una muestra de sangre entera de un sujeto; (b) mezclar de 0.05 a 4.0 mL de la muestra de sangre entera (e.g., desde 0.05 a 0.25, 0.25 a 0.5, 0.25 a 0.75, 0.4 a 0.8, 0.5 a 0.75, 0.6 a 0.9, 0.65 a 1.25, 1.25 a 2.5, 2.5 a 3.5, o 3.0 a 4.0 mL de sangre entera) con una solucion de agente de lisis de eritrocitos para producir globulos rojos destruidos; (c) despues de la etapa (b), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descartar todo o una parte del sobrenadante, y resuspender la pella para formar un extracto, lavar opcionalmente la pella (por ejemplo, con un regulador TE)) antes de resuspender la pella y opcionalmente repetir la etapa (c); (d) someter a lisis las celulas del extracto para formar un lisado; (e) colocar el lisado de la etapa (d) en un contenedor y amplificar un acido nucleico diana en el lisado para formar una solucion de lisado amplificado que incluye el acido nucleico diana, en donde el acido nucleico diana es caracterlstico del patogeno que va a ser detectado; (f) despues de la etapa (e), mezclar la solucion de lisado amplificada desde 1x106 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion lisada amplificada para formar una muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o 1x1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 700 nm a 950 nm, una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 109 x 1 x 1012 mM'V, y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente; (g) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que incluye las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (h) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (i) despues de la etapa (h), medir la senal de la muestra llquida; y (j) sobre la base del resultado de la etapa (i), detectar el patogeno, en donde donde el patogeno es seleccionado de bacterias y hongos, y en donde el metodo es capaz de detectar una concentracion de patogeno de 10 celulas/mL (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 celulas/mL) en la muestra de sangre entera. En ciertas realizaciones, las etapas (a) a (i) son completadas al cabo de 3 horas (e.g., al cabo de 3.2, 2.9, 2.7, 2.5, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, o 1 o menos horas). En todavla otras realizaciones, la etapa (i) se lleva a cabo sin ninguna purificacion previa de la solucion lisada amplificada, y/o la muestra llquida de la etapa (i) incluye protelnas de sangre entera y oligonucleotidos no diana. En ciertas realizaciones, donde el patogeno es seleccionado de bacterias y hongos. El patogeno puede ser cualquier patogeno bacteriano o fungico descrito aqul. En realizaciones particulares el metodo es capaz de medir una concentracion de patogeno de 10 celulas/mL en la muestra de sangre entera con un coeficiente de variation de menos de 15% (e.g., 10 celulas/mL con un coeficiente de variacion de menos de 15%, 10%, 7.5%, o 5%; o 25 celulas/mL con un coeficiente de variacion de menos de 15%, 10%, 7.5%, o 5%; o 50 celulas/mL con un coeficiente de variacion de menos de 15%, 10%, 7.5%, o 5%; o 100 celulas/mL con un coeficiente de variacion de menos de 15%, 10%, 7.5%, o 5%). En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1% a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde
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La invention adicionalmente presenta un metodo para detectar la presencia de un virus en una muestra de sangre entera, incluyendo el metodo las etapas de: (a) proveer una muestra de plasma de un sujeto; (b) mezclar de 0.05 a 4.0 mL de la muestra de plasma (e.g., desde 0.05 a 0.25, 0.25 a 0.5, 0.25 a 0.75, 0.4 a 0.8, 0.5 a 0.75, 0.6 a 0.9, 0.65 a 1.25, 1.25 a 2.5, 2.5 a 3.5, o 3.0 a 4.0 mL de sangre entera) con un agente de lisis para producir una mezcla que comprende virus destruidos; (c) colocar la muestra de la etapa (b) en un contenedor y amplificar un acido nucleico diana en el filtrado para formar una solution filtrada amplificada que incluye el acido nucleico diana, en donde el acido nucleico diana es caracterlstico del virus que va a ser detectado; (d) despues de la etapa (c), mezclar la solucion filtrada amplificada con desde 1x106 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion filtrada amplificada para formar una muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1 x 108, 1 x 107 a 1 x 108, 13107 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1011, o 1x1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 700 nm a 950 nm, una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 109 a 1 x 1012 mM'V, y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente; (e) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de detection que incluye las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una serial producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (f) exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (g) despues de la etapa (f), medir la serial de la muestra llquida; y (h) sobre la base del resultado de la etapa (g), detectar el virus, en donde el metodo es capaz de detectar menos de 100 copias de virus (e.g., menos de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, o 10 copias) en la muestra de sangre entera. En ciertas realizaciones, las etapas (a) a (g) son completadas al cabo de 3 horas (e.g., al cabo de 3.2, 2.9, 2.7, 2.5, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5 horas, o 1 hora o menos). El virus puede ser cualquier patogeno viral descrito aqul. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1 % a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico. El metodo para monitorizacion puede incluir cualquiera de los metodos de aglomeracion magnetica asistidos descritos aqul. Las partlculas magneticas pueden incluir una o mas poblaciones que tienen una primera sonda y una segunda sonda conjugadas a su superficie, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a un primer segmento del acido nucleico diana y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a un segundo segmento del acido nucleico diana, en donde las partlculas magneticas forman agregados en la presencia del acido nucleico diana. Alternativamente, el ensayo puede ser un ensayo de desagregacion en el cual las partlculas magneticas incluyen una primera poblacion que tiene una primera unidad de enlazamiento sobre su superficie y una segunda poblacion que tiene una segunda unidad estructural de enlazamiento en su superficie, e incluyendo la unidad estructural de enlazamiento multivalente una primera sonda y una segunda sonda, siendo operativa la primera sonda en la primera unidad estructural de enlazamiento y siendo operativa la segunda para enlazarse una segunda unidad estructural de enlazamiento, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento y la unidad estructural de enlazamiento multivalente para alterar una agregacion de las partlculas magneticas en la
presencia del acido nucleico diana.
En cualquiera de los metodos de la invencion en los cuales se lleva a cabo la amplificacion por PCR, el metodo de PCR puede ser PCR en tiempo real para cuantificar la cantidad de un acido nucleico diana presente en una mezcla.
Se divulga un metodo para cuantificar una molecula de acido nucleico diana en una muestra amplificando la 5 molecula de acido nucleico diana (por ejemplo utilizando amplificacion por PCR o isotermica) en una mezcla de reaccion de amplificacion en tubo de deteccion dando como resultado la produccion de amplicones correspondientes a la molecula de acido nucleico objetivo, en donde la mezcla de reaccion de amplificacion incluye (1) una molecula de acido nucleico diana, (2) cebadores de amplificacion marcados con biotina especlficos para la molecula de acido nucleico diana, y (3) partlculas superparamagneticas marcadas con avidina. En este metodo, la amplificacion se 10 lleva a cabo en un dispositivo que incluye un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion incluyendo las partlculas superparamagneticas y la molecula de acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida por la exposicion de la muestra a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF. En este metodo, la amplificacion incluye las siguientes etapas:
15 (a) ejecutar uno o mas ciclos de amplificacion;
(b) exponer la mezcla de reaccion de amplificacion a condiciones que permitan la agregacion o desagregacion de las partlculas superparamagneticas marcadas con avidina,
(c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
(d) despues de la etapa (c), medir la senal desde el tubo de deteccion;
20 (e) repetir las etapas (a)-(d) hasta que se obtenga una cantidad deseada de amplificacion; y
(f) sobre la base del resultado de la etapa (d), cuantificar los amplicones presentes en el ciclo correspondiente de amplificacion.
En este metodo, la cantidad inicial de la molecula de acido nucleico diana en la muestra se determina con base en la cantidad de amplicones en cada ciclo del PCR.
25 Se divulga un metodo para cuantificar una molecula de acido nucleico en una muestra amplificando la molecula de acido nucleico diana (e.g., usando PCR o amplificacion isotermica) en una mezcla de reaccion de amplificacion en un tubo de deteccion en la produccion de amplicones correspondiente a la molecula de acido nucleico diana. En este metodo, la mezcla de reaccion de amplificacion incluye (1) una molecula de acido nucleico diana, (2) cebadores de amplificacion que incluyen un sobrante 5', en donde los cebadores de amplificacion son especlficos para la molecula 30 de acido nucleico diana, y (3) partlculas superparamagneticas marcadas con oligonucleotidos, en donde el marcador oligonucleotido es sustancialmente complementario al sobrante en 5' de los cebadores de amplificacion. En este metodo, la amplificacion se lleva a cabo en un dispositivo que incluye un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que incluye las partlculas superparamagneticas y la molecula de acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal 35 producida al exponer la muestra a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF. En este metodo, la amplificacion incluye despues las etapas de la etapas:
(a) ejecutar uno o mas ciclos de amplificacion;
(b) exponer la mezcla de reaccion de amplificacion a condiciones que permiten la hibridacion de las partlculas superparamagneticas marcadas con oligonucleotidos con el sobrante en 5';
40 (c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
(d) despues de la etapa (c), medir la senal desde el tubo de deteccion;
(e) repetir las etapas (a)-(d) hasta que se obtenga una cantidad deseada de amplificacion; y
(f) sobre la base del resultado de la etapa (d), cuantificar los amplicones presentes en el ciclo correspondiente de amplificacion.
45 En este metodo, la cantidad inicial de la molecula de acido nucleico diana en la muestra se determina con base en la cantidad de amplicones en cada ciclo de amplificacion.
Se divulga un metodo para cuantificar una molecula de acido nucleico en una muestra amplificando la molecula de acido nucleico diana (e.g., usando PCR o amplification isotermica) en una mezcla de reaction de amplification en un tubo de detection en la production de amplicones correspondiente a la molecula de acido nucleico diana. En este metodo la mezcla de reaccion de amplificacion incluye (1) una molecula de acido nucleico diana, (2) cebadores de 5 amplificacion especlficos para la molecula de acido nucleico diana, y (3) partlculas superparamagneticas marcadas con oligonucleotidos, en donde el marcador de oligonucleotido contiene una estructura de horquilla y una portion de la estructura de horquilla es sustancialmente complementaria a una porcion de la secuencia de acidos nucleicos de los amplicones. En este metodo, la amplificacion se lleva a cabo en un dispositivo que incluye un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que incluye las partlculas superparamagneticas y la molecula de acido
10 nucleico diana, y que tiene una bobina de Rf dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para
detectar una senal producida al exponer la muestra a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF. Esta amplificacion de este metodo incluye despues las etapas de:
(a) ejecutar uno o mas ciclos de amplificacion;
(b) exponer la mezcla de reaccion de amplificacion a condiciones que permiten la hibridacion de la porcion de la
15 estructura de horquilla (3) con los amplicones;
(c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
(d) despues de la etapa (c), medir la senal desde el tubo de deteccion;
(e) repetir las etapas (a)-(d) hasta que se obtenga una cantidad deseada de amplificacion; y
(f) sobre la base del resultado de la etapa (d), cuantificar los amplicones presentes en el ciclo correspondiente de
20 amplificacion.
En este metodo, la cantidad inicial de la molecula de acido nucleico diana en la muestra se determina con base en la cantidad de amplicones en cada ciclo de amplificacion.
Se divulga tambien un metodo para cuantificar una molecula de acido nucleico diana en una muestra amplificando la molecula de acido nucleico diana usando PCR en una mezcla de reaccion de amplificacion en un tubo de deteccion 25 dando como resultado la produccion de amplicones correspondientes a la molecula de acido nucleico diana. En este metodo, la mezcla de reaccion de amplificacion incluye (1) una molecula de acido nucleico diana, (2) una polimerasa con actividad de 5'exonucleasa, (3) cebadores de amplificacion especlficos para la molecula de acido nucleico diana, y (4) partlculas superparamagneticas unidas a oligonucleotidos, en donde en donde la union a los oligonucleotidos conecta al menos dos partlculas superparamagneticas y la union con el oligonucleotido es 30 sustancialmente complementaria a una porcion de la secuencia de acidos nucleicos de los amplicones. En este metodo, la amplificacion se lleva a cabo en un dispositivo que incluye un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que incluye las partlculas superparamagneticas y la molecula de acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una 35 secuencia de pulsos de RF. La amplificacion de este metodo incluye despues etapas de:
(a) llevar a cabo uno o mas ciclos de PCR bajo condiciones que permitan la hibridacion de la union al oligonucleotido a un amplicon durante la fase de extension del PCR, en donde durante la fase de extension del PCR, la actividad de 5'exonucleasa de la polimerasa desune las al menos dos partlculas superparamagneticas permitiendo un descenso en la agregacion de las partlculas superparamagneticas;
40 (b) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
(c) despues de la etapa (b), medir la senal desde el tubo de deteccion;
(d) repetir las etapas (a)-(c) hasta que el PCR este completo; y
(e) sobre la base del resultado de la etapa (c), cuantificar los amplicones presentes en el correspondiente ciclo de PCR.
45 En este metodo, la cantidad inicial de la molecula de acido nucleico diana en la muestra se determina con base en la cantidad de amplicones en cada ciclo del PCR.
Se divulga tambien un metodo para cuantificar una molecula de acido nucleico diana en una muestra amplificando la molecula de acido nucleico diana (e.g., usando PCR o amplificacion isotermica) en una mezcla de reaccion de
amplificacion en un tubo de deteccion dando como resultado la production de amplicones correspondiente a la molecula de acido nucleico diana. En este metodo, la mezcla de reaction de amplificacion incluye (1) una molecula de acido nucleico diana, (2) cebadores de amplificacion especificos para la molecula de acido nucleico diana, y (3) particulas superparamagneticas marcadas con una pluralidad de oligonucleotidos, en donde un primer grupo de la 5 pluralidad de oligonucleotidos es sustancialmente complementario a una portion de la secuencia de acidos nucleicos de los amplicones y sustancialmente complementario a un segundo grupo de la pluralidad de oligonucleotidos, en donde el primer grupo de la pluralidad de oligonucleotidos tiene un afinidad de hibridacion menor por el segundo grupo de la pluralidad de oligonucleotidos que para los amplicones. En este metodo, la amplificacion se lleva a cabo en un dispositivo que incluye un soporte que define un pozo para contener el tubo de 10 deteccion que incluye las particulas superparamagneticas y la molecula de acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF. La amplificacion de este metodo incluye despues las etapas:
(a) ejecutar uno o mas ciclos de amplificacion;
15 (b) exponer la mezcla de reaccion de amplificacion a condiciones que permitan la hibridacion preferencial del primer
grupo de la pluralidad de oligonucleotidos con los amplicones permitiendo por lo tanto la desagregacion de las particulas superparamagneticas;
(c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
(d) despues de la etapa (c), medir la senal desde el tubo de deteccion;
20 (e) repetir las etapas (a)-(d) hasta que se obtenga una cantidad deseada de amplificacion; y
(f) sobre la base del resultado de la etapa (d); cuantificar los amplicones presentes en el ciclo correspondiente de amplificacion.
En este metodo, la cantidad inicial de la molecula de acido nucleico diana en la muestra se determina con base en la cantidad de amplicones en cada ciclo de amplificacion.
25 Se divulga un metodo para cuantificar una molecula de acido nucleico en una muestra amplificando la molecula de acido nucleico diana (e.g., usando PCR o amplificacion isotermica) en una mezcla de reaccion de amplificacion en un tubo de deteccion en la produccion de amplicones correspondiente a la molecula de acido nucleico diana. En este metodo, la mezcla de reaccion de amplificacion incluye (1) una molecula de acido nucleico diana, (2) cebadores de amplificacion especificos para la molecula de acido nucleico diana, y (3) superparaparticulas magneticas. En este 30 metodo, la amplificacion se lleva a cabo en un dispositivo que incluye un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que incluye las particulas superparamagneticas y la molecula de acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF. La amplificacion de este metodo incluye despues las etapas de:
35 (a) ejecutar uno o mas ciclos de amplificacion;
(b) exponer la mezcla de reaccion de amplificacion a condiciones que permitan la agregacion o desagregacion de las particulas superparamagneticas,
(c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
(d) despues de la etapa (c), medir la senal desde el tubo de deteccion;
40 (e) repetir las etapas (a)-(d) hasta que se obtenga una cantidad deseada de amplificacion; y
(f) sobre la base del resultado de la etapa (d), cuantificar los amplicones presentes en el ciclo correspondiente de amplificacion.
En este metodo, la cantidad inicial de la molecula de acido nucleico diana en la muestra se determina con base en la cantidad de amplicones en cada ciclo de amplificacion.
45 En cualquiera de los metodos anteriores para cuantificar una molecula de acido nucleico, el tubo de deteccion puede permanecer sellado a lo largo de la reaccion de amplificacion. Las particulas superparamagneticas de estos metodos pueden ser mayores o menores de 100 nm en diametro (por ejemplo, 30 nm en diametro).
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Tambien, en cualquiera de los metodos anteriores de cuantificar una molecula de acido nucleico diana, los metodos pueden incluir adicionalmente aplicar un campo magnetico al tubo de deteccion despues de medir la senal del tubo de deteccion, dando como resultado el secuestro de las partlculas superparamagneticas hacia el lado del tubo de deteccion, y liberar el campo magnetico subsecuente hasta terminar uno o mas ciclos adicionales de amplificacion. Tambien, en cualquiera de los metodos anteriores de cuantificar una molecula de acido nucleico diana, la muestra, por ejemplo puede no incluir moleculas de acido nucleico aisladas antes de la etapa (a) (por ejemplo la muestra puede ser sangre entera o no contener una molecula de acido nucleico diana antes de la etapa (a)).
Se divulga un metodo para monitorizar uno o mas analitos en una muestra llquida derivada de un paciente para el diagnostico, manejo y tratamiento de una condicion medica en un paciente, incluyendo el metodo (a) combinar con la muestra llquida de 1x106 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1 x 109, 1x108 a 1x1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o 1x1010 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro que va de 150 nm a 1200 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), y una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1x108 a 1x1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1 x 108 a 1x109, 1x108 a 131010, 13109 a 131010, 1 3 109 a 1 3 1011, o desde 1 3 1010 a 1 3 1012 mM-1s-1), y en donde las partlculas magneticas tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia de uno o mas analitos o un agente de enlazamiento multivalente; (b) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener la muestra llquida que incluye las partlculas magneticas y el uno o mas analitos, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (c) exponer la muestra al campo magnetico polarizado y a la secuencia de pulsos de RF; (d) despues de la etapa (c), medir la senal; (e) sobre la base del resultado de la etapa (d), monitorizar el uno o mas analitos; y (f) usar el resultado de la etapa (e) para diagnosticar, manejar o tratar la condicion medica. En una realization, el uno o mas analitos incluyen creatinina. En otra realizacion, el paciente esta inmunocomprometido, y el uno o mas analitos incluyen un analito seleccionado de analitos asociados con patogenos, agentes antibioticos, agentes antifungicos, y agentes antivirales, (por ejemplo el uno o mas analitos pueden incluir Candida spp., tacrolimus, fluconazol y/o creatinina). En otra realizacion, el paciente tiene cancer, y el uno o mas analitos son seleccionados de agentes anticancer, y marcadores geneticos presentes en una celula de cancer. El paciente puede tener, o estar en riesgo de, una infection, y el uno o mas analitos incluyen un analito seleccionado de analitos asociados con patogenos, agentes antibioticos, agentes antifungicos y agentes antivirales. El paciente puede tener una condicion inmunoinflamatoria, y el uno o mas analitos incluyen un analito seleccionado de agentes antiinflamatorios y TNF-alfa. El paciente puede tener una enfermedad cardiaca, y uno o mas analitos pueden incluir un marcador cardiaco. El paciente puede tener VIH/SIDA, y el uno o mas analitos pueden incluir CD3, carga viral y AZT. En ciertas realizaciones, el metodo se utiliza para monitorizar la funcion del hlgado del paciente, y en donde el uno o mas analitos son seleccionados de albumina, aspartato transaminasa, alanina transaminasa, fosfatasa alcalina, gamma glutamil transpeptidasa, bilirrubina, alfa fetoprotelna, lactasa deshidrogenasa, anticuerpos mitocondriales y citocromo P450. Por ejemplo, el uno o mas analitos incluyen polimorfismos de citocromo P450, y se evalua la capacidad del paciente para metabolizar un farmaco. El metodo puede incluir identificar el paciente como un metabolizador pobre, un metabolizador normal, un metabolizador intermedio o un metabolizador ultrarrapido. El metodo puede ser utilizado para determinar una dosis apropiada de un agente terapeutico en un paciente (i) administrando el agente terapeutico al paciente; (ii) despues de la etapa (i), obtener una muestra que incluye el agente terapeutico o un metabolito del mismo del paciente; (iii) poner en contacto la muestra con las partlculas magneticas y exponer la muestra al campo magnetico polarizado y la secuencia de pulsos de RF y detectar una senal producida por la muestra; y (iv) sobre la base del resultado de la etapa (iii) determinar la concentration del agente terapeutico como metabolito del mismo. El agente terapeutico puede ser un agente anticancer, agente antibiotico, agente antifungico, o cualquier agente terapeutico descrito aqul. En cualquiera de los metodos anteriores de monitorizacion, la monitorizacion puede ser intermitente (por ejemplo periodica), o continua. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas estan sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente de bloqueo seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gammaglobulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combination de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico. El metodo para monitorizar puede incluir cualquiera de los metodos magneticos de aglomeracion asistida descrito aqul.
Se divulga un metodo para diagnosticar sepsis en un sujeto, incluyendo el metodo (a) obtener una muestra llquida
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derivada de la sangre de un paciente; (b) preparar una primera muestra de ensayo por combination con una portion de la muestra llquida desde 1 3 106 a 1 3 1013 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1 x 107 a 1x109, 1x108 a 1 x 1010, 1x109 a 1 x 1011, o 1 x 1010 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 1200 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), y una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 108 a 1x1012 mM'V (e.g., desde 1x108 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1011, o desde 1 x 1010 a 1x1012 mM-V), y en donde las partlculas magneticas tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, siendo operativas las unidades estructurales de para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia de uno o mas analitos asociados con los patogenos o un agente de enlazamiento multivalente; (c) preparar una segunda muestra de ensayo por combinacion de una porcion de la muestra llquida desde 1 3 106 a 1 3 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1 x 108, 1x107 a 1 x 108, 1 x 107 a 1x109, 1 x 108 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1011, o 1x1010 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 1200 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), y una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 108 a 1 x 1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1x108 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o desde 1 x 1010 a 1 x 1012 mM-1s-1), y en donde las partlculas de campo magnetico tienen unidades estructurales que se enlazan sobre sus superficies, siendo las unidades estructurales de enlazamiento operativas para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia de uno o mas analitos caracterlsticos de sepsis seleccionados de GRO-alfa, protelna del grupo caja 1 de alta movilidad (HMBG-1), receptor de IL-1, antagonista de receptor de IL-1, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, protelna inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de la migration de macrofagos (MIF), osteopontina, RANTES (regulados por activation, expresados por celulas T normales y secretados; o CCL5), TNF-a, protelna reactiva a C (PCR), CD64, protelna 1 quimiotactica de monocitos (MCP-1), protelna de enlazamiento de adenosina desaminasa (ABP-26), oxido nltrico sintetasa inducible (iNOS), protelna de enlazamiento de lipopolisacaridos, y procalcitonina; (d) colocar cada muestra de ensayo en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener la muestra llquida incluyendo las partlculas magneticas y el uno o mas analitos, y tener una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida por la exposition de la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF;
(e) exponer cada muestra de ensayo al campo magnetico polarizado y la secuencia de pulsos de RF; (f) despues de la etapa (e), medir la senal producida por la primera muestra de ensayo y la senal producida por la segunda muestra de ensayo; (g) sobre la base de resultado de la etapa (f), monitorizar el uno o mas analitos de la primera muestra de ensayo y monitorizar el uno o mas analitos de la segunda muestra de ensayo; y (h) usar los resultados de la etapa
(g) para diagnosticar el sujeto. En una realization, el uno o mas analitos asociados con patogenos de la primera muestra de ensayos son derivados de un patogeno asociado con sepsis seleccionados de Acinetobacter baumannii, Aspergillus fumigatis, Bacteroides fragilis, B. fragilis, blaSHV, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni/coli, Candida guilliermondii, C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis, Clostridium pefringens, estafilococo negativo a coagulasa, Enterobacter aeraogenes, E. cloacae, Enterobacteriaceae, Enterococcus faecalis, E. faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Kingella Kingae, Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, Listeria monocitogenes, gen Mec A (MRSA), Morganella morgana, Neisseria meningitidis, Neisseria spp. no-meningitidis, Prevotella buccae, P. intermedia, P. melaninogenica, Propionibacterium acnes, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, S. haemolyticus, S. maltophilia, S. saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, S. maltophilia, Streptococcus agalactie, S. bovis, S. dysgalactie, S. mitis, S. mutans, S. pneumoniae, S. pyogenes, y S. sanguinis. El uno o mas analitos asociados con patogenos pueden ser derivados de cepas resistentes al tratamiento de bacterias, tales como cepas bacterianas resistentes a penicilina, resistentes a meticilina, resistentes a quinolonas, resistentes a macrolidos, y/o resistentes a vancomicina (por ejemplo, Staphylococcus aureus resistentes a meticilina o enterococos resistentes a vancomicina). En ciertas realizaciones, el uno o mas analitos de la segunda muestra de ensayos son seleccionados de GRO-alfa, protelna 1 de grupo de caja de alta movilidad (HMBG-1), receptor de IL-1, receptor de antagonista de IL-1 ,IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, protelna inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de la migracion de macrofagos (MIF), osteopontina, RANTES (regulado por activacion, expresado por celulas T normales y secretado; o CCL5), TNF-a, Protelna C reactiva (CRP), CD64, y protelna 1 quimiotactica de monocitos (MCP-1). En una realizacion particular, el metodo incluye adicionalmente preparar una tercera muestra de ensayo para monitorizar la concentration de un agente antiviral, agente antibiotico, o agente antifungico que circula en la corriente sangulnea del sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto puede ser un sujeto inmunocomprometido, o un sujeto en riesgo de llegar a ser inmunocomprometido. En cualquiera de los metodos anteriores de monitorizacion, la monitorizacion puede ser intermitente (por ejemplo, periodica), o continua. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas estan sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y del agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente de bloqueo seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1% a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una
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Se divulga adicionalmente un metodo para monitorizar uno o mas analitos en una muestra llquida derivada de un paciente para el diagnostico, manejo o tratamiento de sepsis o SIRS en un paciente, incluyendo el metodo: (a) combinar con la muestra llquida desde 1 x 106 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1 x 106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1X1011, o 1x1010 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 1200 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), y una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1x108 a 1 x 1012 mM'V 1 (e.g., desde 1x108 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o desde 1x1010 a 1x1012 mM-V), y en donde las partlculas magneticas tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia de uno o mas analitos o un agente de enlazamiento multivalente; (b) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener la muestra llquida que incluye las partlculas magneticas y el uno o mas analitos, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (c) exponer la muestra al campo magnetico polarizado y a la secuencia de pulsos de RF; (d) despues de la etapa (c), medir la senal; (e) sobre la base del resultado de la etapa (d), monitorizar el uno o mas analitos; y (f) usar el resultado de la etapa (e) para diagnosticar, manejar o tratar la sepsis o SIRS. El metodo puede incluir (i) monitorizar un analito asociado con un patogeno, y (ii) monitorizar un segundo analito caracterlstico de sepsis seleccionado de GRO-alfa, Protelna 1 de grupo caja de alta movilidad (HMBG-1), Receptor de IL-1, Antagonista del receptor de IL-1, IL-1 b, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, protelna inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de la migracion de macrofagos (MIF), osteopontina, RANTES (regulado por activacion, expresado por celulas T normales y secretado; o CCL5), TNF-a, Protelna C reactiva (CRP), CD64, protelna 1 quimiotactica de monocitos (MCP-1), protelna de enlazamiento de la adenosina desaminasa (ABP-26), oxido nltrico sintetasa inducible (iNOS), protelna de enlazamiento a lipopolisacaridos, y procalcitonina. En ciertas realizaciones, el analito asociado con patogenos es derivado de un patogeno asociado con sepsis seleccionado de Acinetobacter baumannii, Aspergillus fumigatis, Bacteroides fragilis, B. fragilis, blaSHV, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni/coli, Candida guilliermondii, C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. Lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis, Clostridium pefringens, Estreptococo negativo a coagulasa, Enterobacter aeraogenes, E. cloacae, Enterobacteriaceae, Enterococcus faecalis, E. faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Kingella Kingae, Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, Listeria monocitogenes, Mec A gene (MRSA), Morganella morgana, Neisseria meningitidis, Neisseria spp. non-meningitidis, Prevotella buccae, P. intermedia, P. melaninogenica, Propionibacterium acnes, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, S. haemolyticus, S. maltophilia, S. saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, S. maltophilia, Streptococcus agalactie, S. bovis, S. dysgalactie, S. mitis, S. mutans, S. pneumoniae, S. pyogenes, y S. sanguinis. El analito asociado con patogeno puede ser derivado de una cepa de bacterias resistente a tratamiento, tal como cepas bacterianas resistentes a penicilina, resistentes a meticilina, resistentes a quinolona, resistentes a macrolidos, y/o resistentes a vancomicina. (e.g., Staphylococcus aureus resistente a meticilina o enterococos resistentes a vancomicina). En realizaciones particulares, el segundo analito se selecciona de GRO-alfa, Protelna 1 de grupo caja de alta movilidad (HMBG-1), Receptor de IL-1, Antagonista del receptor de IL-1, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, protelna inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de la migracion de macrofagos (MIF), osteopontina, RANTES (regulado por activacion, expresado por celulas T normales y secretado; o CCL5), TNF-a, Protelna C reactiva (CRP), CD64, y protelna 1 quimiotactica de monocitos (MCP-1). En una realization particular, el metodo comprende adicionalmente preparar una muestra para un tercer ensayo para monitorizar la concentration de un agente antiviral, agente antibiotico o agente antifungico que circulan en la corriente sangulnea del sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto puede ser un sujeto inmunocomprometido, o un sujeto en riesgo de estar inmunocomprometido. En cualquiera de los metodos anteriores de monitorizacion, la monitorizacion puede ser intermitente (e.g., periodica), o continua. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combination de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico. El metodo para monitorizacion puede incluir cualquiera de los metodos de aglomeracion magnetica asistidos descritos aqul.
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En un aspecto relacionado, se divulga un metodo para asistir en la aglomeracion especlfica de partlcuias magneticas en una muestra llquida, incluyendo el metodo: (i) proveer una muestra llquida que incluye uno o mas analitos y las partlculas magneticas, en donde las partlculas magneticas tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, siendo operativa las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia de uno o mas analitos o un agente de enlazamiento multivalente; (ii) exponer la muestra llquida a un campo magnetico; (iii) retirar la muestra llquida del campo magnetico; y (iv) repetir la etapa (ii).
Se divulga adicionalmente un metodo para asistir en la aglomeracion especlfica de partlculas magneticas en una muestra llquida (i) proveyendo una muestra llquida que incluye uno o mas analitos y las partlculas magneticas, en donde las partlculas magneticas tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia del uno o mas analitos o un agente de enlazamiento multivalente; (ii) aplicar un gradiente de campo magnetico a la muestra llquida durante un tiempo suficiente para producir la concentracion de las partlculas magneticas en una primera porcion de la muestra llquida, estando alineado el gradiente de campo magnetico en una primera direccion con respecto a la muestra llquida; (iii) despues de la etapa (ii), aplicar un campo magnetico a la muestra llquida durante un tiempo suficiente para producir concentracion de las partlculas magneticas en una segunda porcion de la muestra llquida, estando alineado el campo magnetico en una segunda direccion con respecto a la muestra llquida; y (iv) repetir opcionalmente las etapas (ii) y (iii). En ciertas realizaciones, el angulo entre la primera direccion y la segunda direccion con respecto a la muestra llquida esta entre 0° y 180° (por ejemplo, de 0° a 10° 5°a 120° 20° a 60° 30°a 8 0° 45° a 90° 60° a 120° 80° a 135° o de 120° a 180s).
Se divulga un metodo para asistir en la aglomeracion especlfica de partlculas magneticas en una muestra llquida de (i) proveer una muestra llquida que incluye uno o mas analitos y las partlculas magneticas, en donde las partlculas magneticas tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia de uno o mas analitos o un agente de enlazamiento multivalente; (ii) aplicar un gradiente de campo magnetico a la muestra llquida durante un tiempo suficiente para producir la concentracion de las partlculas magneticas en una primera porcion de la muestra llquida; (iii) despues de la etapa (ii), agitar la muestra llquida; y (iv) repetir la etapa (ii). En ciertas realizaciones, la etapa (iii) incluye someter a vortex la muestra llquida, o mezclar la muestra utilizando cualquier metodo descrito aqul.
Se divulga tambien un metodo para asistir en la aglomeracion especlfica de partlculas magneticas en una muestra llquida (i) proveer una muestra llquida que incluye uno o mas analitos y las partlculas magneticas, en donde las partlculas magneticas tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion especlfica de las partlculas magneticas en la presencia de uno o mas analitos o un agente de enlazamiento multivalente; y (ii) exponer la muestra llquida a un campo magnetico gradiente y hacer rotar el campo magnetico gradiente alrededor de la muestra, o hacer rotar la muestra dentro del campo magnetico gradiente. La muestra puede hacerse rotar lentamente. En ciertas realizaciones, la muestra se hace rotar una rata de 0.0333 Hz, o menos (e.g., desde 0.000833 Hz a 0.0333 Hz, desde 0.00166 Hz a 0.0333 Hz, o desde 0.00333 Hz a 0.0333 Hz). En otras realizaciones, el metodo incluye adicionalmente (iii) despues de la etapa (ii), agitar la muestra llquida; y (iv) repetir la etapa (ii).
En cualquiera de los metodos anteriores para asistir en la aglomeracion especlfica la etapa (ii) puede ser repetida de 1 a 100 veces (por ejemplo, repetida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces, desde 10 a 20 veces, o desde 80 a 100 veces). En realizaciones particulares, los uno o mas magnetos que proveen el gradiente de campo magnetico dentro de la muestra llquida tiene una fuerza de campo maxima de 0.01T a 10T (e.g., desde 0.01T a 0.05T, 0.05T a 0.1T, 0.1T a 0.5T, 0.5T a 1T, 1T a 3T, o desde 3T a 10T) y en donde el campo magnetico gradiente varia de 0.1mT/mm a 10T/mm a traves de la muestra llquida (e.g., desde 0.1mT/mm a 0.5mT/mm, 0.3mT/mm a 1mT/mm, 0.5mT/mm a 5mT/mm, 5mT/mm a 20mT/mm, 10mT/mm a 100mT/mm, 100mT/mm a 500mT/mm, 500mT/mm a 1T/mm, o desde 1T/mm a 10T/mm). En ciertas realizaciones de cualquiera de los metodos anteriores para asistir en la aglomeracion especlfica, la etapa (ii) incluye aplicar el gradiente de campo magnetico a la muestra llquida durante un perlodo de 1 segundo hasta 5 minutos (por ejemplo, 1 a 20 segundos, desde 20 a 60 segundos, desde 30 segundos a 2 minutos, desde 1 minutos a 3 minutos, o desde 2 minutos a 5 minutos). En realizaciones particulares, (i) la muestra llquida incluye de 1x105 a 1x1015 del uno o mas analitos por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1x105 a 1x106, 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1x1012, o 1x1011 a 1x1015 analitos por mililitro); (ii) la mezcla llquida incluye desde 1x106 a 1x1013 de las partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o 1x1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro); (iii) las partlculas magneticas tienen una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1x104 a 1x1012 mM' V (e.g., desde 1x104 a 1x107, 1 x 106 a 1x1010, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1 x 109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1010, 1x109 a 1 x 1011, o desde 1x1010 a 1x107 mM-1s-1); (iv) las partlculas magneticas tienen un diametro promedio que va desde 150 nm a 1200 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm); (v) las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; (vi) las partlculas en la muestra llquida exhiben reversibilidad no especlfica en la presencia del uno o mas analitos y agentes de enlazamiento multivalentes; (vii) las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una
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superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caseina, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano); (viii) la muestra liquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1 % a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos; y/o (ix) las particulas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas proteinas por miligramo de las particulas magneticas.
Se divulga un sistema para la deteccion de uno o mas analitos, incluyendo el sistema: (a) una primera unidad que incluye (a1) un magneto permanente que define un campo magnetico; (a2) un soporte que define un pozo para contener una muestra Kquida que incluye particulas magneticas y el uno o mas analitos que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina RF para detectar una senal exponiendo la muestra Kquida a un campo magnetico homogeneo desviado creado utilizando el magneto permanente y una secuencia de pulsos RF; y (a3) uno o mas elementos electricos en comunicacion con la bobina de RF, configurados los elementos electricos para amplificar, rectificar, transmitir y/o digitalizar la senal; y (b) una o mas segundas unidades que incluyen (b1) un magneto permanente adyacente una primera posicion de muestra para contener una muestra liquida y configurado para aplicar un primer campo magnetico gradiente a la muestra liquida. La una o mas segundas unidades pueden incluir adicionalmente un segundo magneto permanente adyacente una segunda posicion de muestra para contener una muestra Kquida y configurado para aplicar un segundo campo magnetico gradiente a la primera muestra, alineado el segundo campo magnetico para aplicar un campo magnetico gradiente a la muestra desde una direccion diferente de la direccion del primer gradiente de campo, y un medio para mover una muestra liquida desde la primera posicion de muestra a la segunda posicion de muestra. En ciertas realizaciones, la una o mas segundas unidades son incapaces de medir una senal (por ejemplo, incapaces de medir una rata de relajacion de RMN), y/o carece de una bobina RF, o un medio para producir un pulso de RF. En ciertas realizaciones, el angulo entre la primera direccion y la segunda direccion con respecto a la muestra liquida esta entre 0° y 180° (e.g., desde 0° a 10° 5° a 120° 20°a 60°, 30°a 80° 45° a 90° 60° a 1 20°, 80°a 135° o desde 120° a 180°). El sistema pu ede incluir
adicionalmente un portador de muestras para contener la muestra liquida y configurada para mover la muestra Kquida desde la primera posicion a la segunda posicion. En realizaciones particulares, el sistema incluye un arreglo de las unas o mas segundas unidades para asistir en la aglomeracion de un arreglo de muestras simultaneamente. Por ejemplo, el arreglo puede ser configurado para hacer rotar uno o mas liquidos de una primera porcion en la cual el campo magnetico es aplicado al lado de una muestra hasta una segunda posicion en la cual el campo magnetico es aplicado al fondo de una muestra. El sistema puede incluir una unidad de cartucho, una unidad de agitacion, una centrifuga o cualquier otro componente de sistema descrito aqui. Por ejemplo, el sistema puede incluir adicionalmente (c) una tercera unidad que incluye un cartucho retirable, dimensionado para facilitar la insercion en y retiro del sistema y que tiene un compartimiento que incluye una o mas poblaciones de particulas magneticas que tienen unidades estructurales de enlazamiento sobre sus superficies, en donde las unidades estructurales de enlazamiento son operativas para alterar una agregacion de las particulas magneticas en la presencia de uno o mas analitos. En realizaciones particulares, el cartucho retirable es un cartucho modular que incluye (i) un modulo de reactivo para contener uno o mas reactivos de ensayo; y (ii) un modulo de deteccion que incluye una camara de deteccion para contener una muestra Kquida que incluye particulas magneticas y uno o mas analitos, en donde el modulo de reactivo y el modulo de deteccion pueden ser ensamblados en el cartucho modular antes de su uso, y en donde la camara de deteccion es retirable del cartucho modular. El cartucho modular puede incluir adicionalmente un modulo de entrada, en donde el modulo de entrada, el modulo de reactivo y el modulo de deteccion pueden ser ensamblados dentro del cartucho modular antes de su uso, y en donde el modulo de entrada es esterilizable. En otra realizacion, el sistema puede incluir adicionalmente un ordenador de sistema con procesador para implementar un protocolo de ensayo y almacenar datos del ensayo, y en donde el cartucho retirable incluye adicionalmente (i) una etiqueta legible que indica el analito que va ser detectado, (ii) una etiqueta legible que indica el protocolo de ensayo que va a ser implementado, (iii) una etiqueta legible que indica un numero de identificacion del paciente, (iv) un marcador legible que indica la posicion de los reactivos de ensayo contenidos en el cartucho, o (v) una etiqueta legible que incluye instrucciones para el procesador programable.
Se divulga un sistema para la deteccion de uno o mas analitos, incluyendo el sistema: (a) una primera unidad que incluye (a1) un magneto permanente que define un campo magnetico; (a2) un soporte que define un pozo para contener una muestra liquida que incluye particulas magneticas y el uno o mas analitos y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra liquida a un campo magnetico polarizado creado usando el magneto permanente y una secuencia de pulsos de RF; y (a3) uno o mas elementos electricos en comunicacion con la bobina de RF, configurados los elementos electricos para amplificar, rectificar, transmitir y/o digitalizar la senal; y (b) una segunda unidad que incluye un cartucho retirable dimensionado para facilitar la insercion en y extraccion desde el sistema, en donde el cartucho retirable es un cartucho modular que incluye (i) un modulo para reactivos para contener uno o mas reactivos de ensayo; y (ii) un modulo de deteccion que incluye una camara de deteccion para contener una muestra Kquida que incluye las particulas magneticas y el uno o mas analitos, en donde el modulo de reactivos y el modulo de deteccion pueden ser ensamblados en el cartucho modular antes de un uso, y en donde la camara de deteccion es retirable del cartucho modular. El cartucho modular puede incluir adicionalmente un modulo de entrada, en donde el modulo
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de entrada, el modulo de reactivos, y el modulo de deteccion pueden ser ensamblados en el cartucho modular antes de un uso, y en donde el modulo de entrada es esterilizable. En ciertas realizaciones, el sistema incluye adicionalmente un sistema de ordenados con procesador para implementar un protocolo de ensayo y almacenamiento de los datos de ensayo, y en donde el cartucho retirable incluye adicionalmente (i) una etiqueta legible que indica el analito que va a ser detectado, (ii) una etiqueta legible que indica el protocolo de ensayo que va a ser implementado, (iii) una etiqueta legible que indica un numero de indicacion del paciente, (iv) una etiqueta legible que indica la posicion de los reactivos de ensayo contenidos en el cartucho, o (v) una etiqueta legible que incluye instrucciones para el procesador programable. El sistema puede incluir una unidad de cartucho, una unidad de agitacion, una centrlfuga, o cualquier otro componente del sistema descrito aqul.
Se divulga una unidad de agitacion para la mezcla automatizada de una muestra llquida en una camara de muestra, incluyendo un motor para proveer una fuerza de impulso rotacional a un eje de motor acoplado a un eje de impulso, teniendo el eje de impulso un primer extremo acoplado al eje del motor y un segundo extremo acoplado una placa que soporta un portamuestras para contener la camara de muestras, incluyendo el eje de extraccion un primer eje coaxial al eje de motor, y un segundo eje que esta desplazado y paralelo al eje de motor, de tal manera que el segundo eje del arbol de empuje, la placa y el portador de muestras son impulsados en una ruta orbital, en donde el motor incluye una marca de Indice y/u otro medio de deteccion de posicion tal como un codificador de posicion optico, magnetico o por resistencia para posicionar la camara de muestras en una posicion predeterminada despues de la mezcla o un sensor que registra la posicion de la muestra a lo largo de su ruta.
Se divulga un sistema para la deteccion de uno o mas analitos, incluyendo: (a) una primera unidad que incluye (a1) un magneto permanente que define un campo magnetico; (a2) un soporte que define un pozo para contener una muestra llquida que incluye partlculas magneticas y el uno o mas analitos y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando el magneto permanente y una secuencia de pulsos de RF; y (a3) uno o mas elementos electricos en comunicacion con la bobina de RF, configurados los elementos electricos para amplificar, rectificar, transmitir y/o digitalizar la senal; y (b) una segunda unidad para la muestra automatizada de una muestra llquida en una camara de muestra, que incluye un motor para proveer fuerza de impulso rotacional a un arbol de motor acoplado a un arbol de impulso, teniendo el arbol de impulso un primer extremo acoplado al arbol del motor y un segundo extremo acoplado a una placa que soporta un portamuestras para sostener una camara de muestras, incluyendo el arbol un primer eje coaxial al arbol del motor, y un segundo eje que esta desplazado y es paralelo al arbol de motor, de tal forma que el segundo eje del arbol de impulso, la placa y el portamuestras sean impulsados en una trayectoria orbital, en donde el motor incluye una marca de Indice y/o otro medio de deteccion de posicion tal como un codificador de posicion optico, magnetico o resistivo para posicionar la camara de muestra en una posicion predeterminada siguiendo la mezcla o un sensor que rastree la posicion de la muestra a lo largo de su trayectoria.
En ciertas realizaciones, el sistema incluye adicionalmente un brazo robotico para colocar la camara de muestras en y, retirar la camara de muestras de, la unidad de agitacion.
Se divulga un sistema para la deteccion de uno o mas analitos, incluyendo el sistema: (a) una primera unidad que incluye (a1) un magneto permanente que define un campo magnetico; (a2) un soporte que define un pozo para contener una muestra llquida que incluye partlculas magneticas y el uno o mas analitos y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando el magneto permanente y una secuencia de pulsos de RF; y (a3) uno o mas elementos electricos en comunicacion con la bobina de RF, configurados los elementos electricos para amplificar, rectificar, transmitir y/o digitalizar la senal; y (b) una centrlfuga que incluye un motor para centrlfuga que incluye un motor para proveer fuerza de impulso rotacional a un arbol de motor, teniendo el arbol de impulso un primer extremo acoplado al motor y un segundo extremo acoplado al rotor de una centrlfuga que soporta un portamuestras para sostener una camara de muestras, en donde el motor incluye una marca de Indice y/o otro medio de deteccion de posicion tal como un codificador de posicion optico, magnetico o resistivo para posicionar la camara de muestra en una posicion predeterminada siguiendo la centrifugacion de la muestra o un sensor que rastree la posicion de la muestra a lo largo de su trayectoria.
Se divulga un sistema para la deteccion de uno o mas analitos, incluyendo el sistema: (a) un portamuestras desechable que define un pozo para contener una muestra llquida y que tiene una bobina de RF contenida dentro del portamuestras desechable y dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando el magneto permanente y una secuencia de pulsos de RF, en donde el portamuestras desechable incluye una o mas conexiones fusionables; y (b) un lector MR que incluye (b1) un magneto permanente que define un campo magnetico; (b2) una bobina de secuencia de pulsos y deteccion de RF; (b3) uno o mas elementos electricos en comunicacion con la bobina de RF, configurados los elementos electricos para amplificar, rectificar, transmitir y/o digitalizar la senal; y (b4) uno o mas elementos electricos en comunicacion con el enlace fusible y configurado para aplicar corriente en exceso al enlace fusible, siendo que el enlace se corte y haga la bobina inoperable despues de un tiempo de vida de trabajo predeterminado. En ciertas realizaciones, el elemento electrico en comunicacion con la bobina de RF esta acoplado
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inductivamente con la bobina de RF.
Se divulga un sistema para la deteccion de creatinina, tacrolimus y Candida, incluyendo el sistema: (a) una primera unidad que incluye (a1) un magneto permanente que define un campo magnetico; (a2) un soporte que define un pozo para contener una muestra llquida que incluye partlculas magneticas y la creatinina, tacrolimus y Candida y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una serial producida al exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando el magneto permanente y una secuencia de pulsos de RF; y (a3) un elemento electrico en comunicacion con la bobina de RF, configurado el elemento electrico para amplificar, rectificar, transmitir y/o digitalizar la serial; y (b) una segunda unidad que incluye un cartucho retirable dimensionado para facilitar la insercion en y extraccion desde el sistema, en donde el cartucho retirable es un cartucho modular que incluye (i) una pluralidad de modulos para reactivos para contener uno o mas reactivos para el ensayo; y (ii) una pluralidad de modulos de deteccion que incluyen una camara de deteccion para contener una muestra llquida incluyendo las partlculas magneticas y la creatinina, tacrolimus y Candida, en donde la pluralidad de modulos de reactivo incluye (i) una primera poblacion de partlculas magneticas que tienen un diametro medio desde 150 nm a 699 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, o desde 500 a 699 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1x108 a 1 x 1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1x108 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o desde 1x1010 a 1 x 1012 mM-1s-1), y anticuerpos de creatinina conjugados su superficie; (ii) un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de creatinina disenados para formar agregados con la primera poblacion de partlculas magneticas en la ausencia de creatinina; (iii) una segunda poblacion de partlculas magneticas que tienen un diametro que va desde 150 nm a 699 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, o desde 500 a 699 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 108 a 1 x 1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1 x 108 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1 3 109 a 1x1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o desde 1x1010 a 1 x 1012 mM-1s-1), y anticuerpos de tacrolimus conjugados sobre su superficie; (iv) un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de tacrolimus disenados para formar agregados con la segunda poblacion de partlculas magneticas en la ausencia de tacrolimus; (v) una tercera poblacion de partlculas magneticas tiene un diametro medio de desde 700 nm a 1200 nm (e.g., desde 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 109 a 1x1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1x108 a 1 x 109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1011, o desde 1 x 1010 a 1x1012 mM-1s-1), y que tiene una primera sonda y una segunda sonda conjugadas a su superficie seleccionadas para formar agregados en la presencia de acido nucleico de Candida, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a un primer segmento del acido nucleico de Candida y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a un segundo segmento del acido nucleico de Candida. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1 % a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01 % a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combination de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico. En otra realization, la mezcla llquida incluye desde 1x106 a 1 x 1013 de las partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o 1x1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro).
Se divulga un metodo para medir la concentration de creatinina en una muestra llquida, incluyendo el metodo: (a) poner en contacto una solution con (i) partlculas magneticas para producir una muestra llquida que incluye desde 1x106 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1 x 106 a 1x108, 1 x 107 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o 1 x 1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 1200 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1x108 a 1x1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1x108 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o desde 1 x 1010 a 1 x 1012 mM-1s-1), y anticuerpos de creatinina, conjugados a su superficie, y (ii) un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de creatinina disenados para formar agregados con las partlculas magneticas en la ausencia de creatinina; (b) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener la muestra llquida que incluye las partlculas magneticas, el agente de enlazamiento multivalente y la creatinina, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (d) despues de la etapa (c), medir la senal; y (e) sobre la base del resultado de la etapa (d), determinando la concentracion de creatinina en la muestra llquida. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento
multivalente; y/o las partlcuias magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) 5 albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas 10 magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico.
Se divulga un agente de enlazamiento multivalente que incluye dos o mas unidades estructurales creatinina enlazadas covalentemente a un armazon. En ciertas realizaciones, el agente de enlazamiento multivalente es un compuesto de formula (I):
15 (A)n-(B) (I)
en donde (A) es
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(B) es un armazon polimerico enlazado covalentemente a cada (A), m es un entero de 2 a 10, y n es un entero de 2 a 50.
20 Se divulga una solucion que incluye desde 1x106 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1 x 109, 1x108 a 1 x 1010, 1 x 109 a 1X1011, o 1x1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 600 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, o desde 500 a 600 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 x 108 a 1 x 1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1x108 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1 x 109 a
25 1x1010, 1 x109 a 1x1011, o desde 1 x 1010 a 1x1012 mM-1s-1), y una superficie que porta conjugado (A) de creatinina,
en donde (A) es seleccionado de:
imagen2
y m es un entero que va de 2 a 10.
Se divulga una solucion que incluye desde 1x106 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion (e.g.,
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desde 1x106 a 1x108, 1 x107 a 1 x 108, 1x107 a 1 x 109, 1x108 a 1x1010, 1 x 109 a 1X1011, o 1x1010 a 1 x 1013
partlcuias magneticas por mililitro), en donde las partlcuias magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 600 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, o desde 500 a 600 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcuia desde 1 x 108 a 1 x 1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1 x 108 a 1 x 109, 1x108 a 1 x 1010, 1x109 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1011, o desde 1x1010 a 1 x 1012 mM-1s-1), y una superficie que porta anticuerpos que tienen afinidad por el conjugado de creatinina:
imagen3
donde (B) es un armazon polimerico.
Se divulga un metodo para medir la concentration de tacrolimus en una muestra llquida, incluyendo el metodo: (a) poner en contacto una solution con (i) partlculas magneticas para producir una solution que incluye desde 1x106 a 1 x 1013 partlculas magneticas por mililitro de la muestra llquida (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o 1x1010 a 1x1013 partlculas magneticas por mililitro), en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 1200 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm), una capacidad de relajacion T2 por partlcula desde 1 3 108 a 1 x 1012 mM-1s-1 (e.g., desde 1x108 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o desde 1x 1010 a 1 x 1012 mM'V1), y anticuerpos de tacrolimus conjugados a su superficie, y (ii) un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de conjugados de tacrolimus disenada para formar agregados con las partlculas magneticas en la ausencia de tacrolimus; (b) colocar la muestra llquida en un dispositivo, incluyendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener la muestra llquida que incluye las partlculas magneticas, el agente de enlazamiento multivalente, y el tacrolimus, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida exponiendo la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF; (c) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (d) despues de la etapa (c), medir la senal; y (e) sobre la base del resultado de la etapa (d), determinar la concentracion de tacrolimus en la muestra llquida. En ciertas realizaciones, las partlculas magneticas son sustancialmente monodispersas; exhiben reversibilidad no especlfica en la ausencia del analito y el agente de enlazamiento multivalente; y/o las partlculas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente bloqueador seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caselna, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano). En realizaciones particulares, la muestra llquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1% a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01 % a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1 % a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combination de los mismos. En todavla otras realizaciones, las partlculas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas protelnas por miligramo de las partlculas magneticas. La muestra llquida puede incluir un agente de enlazamiento multivalente que porta una pluralidad de analitos conjugados a un armazon polimerico.
Se divulga un agente de enlazamiento multivalente que incluye dos o mas unidades estructurales de tacrolimus, que incluyen metabolitos de tacrolimus descritos aqul o compuestos estructuralmente similares para los cuales el anticuerpo tiene afinidad enlazados covalentemente a un armazon. En ciertas realizaciones, el agente de enlazamiento multivalente es un compuesto de formula (II):
(A)n-(B) (II)
en donde (A) es
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(B) es un armazon polimerico enlazado covalentemente a cada (A), y n es un entero de 2 a 50.
Se divulga una solucion que incluye desde 1x106 a 1 x 1013 particulas magneticas por mililitro de la solucion (e.g., desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1 x 109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1X1011, o 1 x 1010 a 1 x 1013 particulas magneticas por mililitro), en donde las particulas magneticas tienen un diametro medio desde 150 nm a 600 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, o desde 500 a 600 nm), una capacidad de relajacion T2 por particula desde 1x108 a 1x1012 mM'V (e.g., desde 1x108 a 1x109, 1 x 108 a 1 x 1010, 1 x 109 a 1x1010, 1 x 109 a 1 x 1011, o desde 1x1010 a 1 x 1012 mM'V), y una superficie que porta anticuerpos que tienen afinidad por el conjugado de tacrolimus:
imagen5
en donde (B) es armazon polimerico.
En una realization de cualquiera de las soluciones anteriores, (i) las particulas magneticas estan sustancialmente monodispersas; (ii) las particulas magneticas exhiben reversibilidad no especifica en plasma; (iii) las particulas magneticas incluyen adicionalmente una superficie cubierta con un agente de bloqueo seleccionado de albumina, gelatina de piel de pez, gamma globulina, lisozima, caseina, peptidasa y una unidad estructural portadora de amina (e.g., amino polipolietileneglicol, glicina, polietilenediamina, o amino dextrano); (iv) la muestra tiquida incluye adicionalmente un regulador, desde 0.1% a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1% a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01% a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01% a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combination de los mismos; y/o (iv) las particulas magneticas incluyen una superficie cubierta con 40 mg a 100 mg (e.g., 40 mg a 60 mg, 50 mg a 70 mg, 60 mg a 80 mg, o 80 mg a 100 mg,) de una o mas proteinas por miligramo de las particulas magneticas. Las soluciones pueden ser usadas en cualquiera de los sistemas o metodos descritos aqui.
Se divulga un cartucho retirable dimensionado para facilitar la insertion en y retiro desde un sistema divulgado aqui, en done el cartucho retirable incluye una o mas camaras para contener una pluralidad de modulos de reactivo para contener uno o mas reactivos de ensayo, en donde los modulos de reactivo incluyen (i) una camara para contener desde 1x106 a 1x1013 particulas magneticas (e.g., desde 1x106 a 1 x 108, 1 x 107 a 1x108, 1x107 a 1 x 109, 1 x 108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, o 1x1010 a 1 x 1013 particulas magneticas) con un diametro medio de desde 100 nm a 699 nm (e.g., desde 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, o desde 500 a 699 nm), una capacidad de relajacion T2 por particula desde 1 x 108 a 1x1012 mm'V1 (e.g., desde 1x108 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1010, 1 x 109 a 1x1011, o desde 1x1010 a 1 x 107 mM'V1), y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficies, siendo operativas las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion especifica de las particulas magneticas en la presencia de uno o mas analitos o un agente de enlazamiento multivalente; y (ii) una camara para contener un regulador. En un aspecto relacionado, se divulga un cartucho retirable dimensionado para facilitar la insercion en y la extraction desde un sistema, en donde el cartucho retirable comprende una o mas camaras para contener una pluralidad de modulos para reactivos para contener uno o mas reactivos para el ensayo, en donde el modulo de reactivos incluye (i) una camara para contener desde 1x106 a 1x1013 particulas magneticas
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Se divuiga un cartucho retirabie dimensionado para faciiitar la insercion en y retiro desde un sistema, en donde el cartucho retirabie inciuye una o mas camaras para contener una piuraiidad de modulos de reactivo para contener uno o mas reactivos de ensayo, en donde el modulo para reactivos inciuye (i) una camara para contener desde 1 x 108 a 1 x 1010 partlcuias magneticas con un diametro medio de desde 100 nm a 350 nm, una capacidad de relajacion T2 por partlcuia desde 5x108 a 1x1010 mM^s-1, y unidades estructuraies de eniazamiento sobre su superficies (por ejempio, anticuerpos, anaiito conjugado), siendo operativas las unidades estructuraies de eniazamiento para aiterar la agregacion especlfica de las partlcuias magneticas en la presencia de uno o mas anaiitos o un agente de eniazamiento muitivaiente; y (ii) una camara para contener un reguiador que inciuye desde 0.1 % a 3% (p/p) albumina (e.g., desde 0.1 % a 0.5%, 0.3% a 0.7%, 0.5% a 1%, 0.8% a 2%, o desde 1.5% a 3% (p/p) albumina), desde 0.01 % a 0.5% de surfactante no ionico (e.g., desde 0.01 % a 0.05%, 0.05% a 0.1%, 0.05% a 0.2%, 0.1% a 0.3%, 0.2% a 0.4%, o desde 0.3% a 0.5% de surfactante no ionico), o una combinacion de ios mismos. En una realizacion, las partlcuias magneticas y el reguiador estan juntos en una camara unica dentro del cartucho.
En cuaiquiera de ios sistemas, kits, cartuchos y metodos divuigados aqul, la muestra ilquida puede inciuir desde 1x108 hasta 1x1010 partlcuias magneticas que tienen un diametro medio que va desde 100 nm hasta 350 nm, una capacidad de reiajamiento T2 por partlcuia que va desde 5x108 hasta 1x1010 mM'V1, y gaiiinas sobre sus superficies (e.g., anticuerpos, anaiito conjugado), siendo operativas las unidades estructuraies de eniazamiento para aiterar la agregacion especlfica de las partlcuias magneticas en la presencia de uno o mas anaiitos o un agente de eniazamiento muitivaiente.
En cuaiquiera de ios metodos de la invention para la detection de un anaiito en una muestra de sangre entera, la destruction de las celulas de globulos rojos puede iievarse a cabo utiiizando un agente de iisis de eritrocitos (esto es, un reguiador de iisis, o un detergente no ionico). Los reguiadores para iisis de eritrocitos que pueden ser utiiizados en ios metodos de la invencion inciuyen soiuciones isotonicas de cioruro de amonio (inciuyendo opcionaimente reguiador de carbonato y/o EDTA) y soiuciones hipotonicas. Aiternativamente, el agente de iisis de eritrocitos puede ser una solution acuosa de detergentes no ionicos (por ejempio, nonii fenoxipoiietoxiietanoi (NP- 40), 4-octiifenoi poiietoxiiado (Triton-X100), Brij-58 o surfactantes no ionicos reiacionados y mezcias de ios mismos). Ei agente para iisis de eritrocitos destruye ai menos aigunas de ias ceiuias de giobuios rojos, permitiendo que una gran fraction de ciertos componentes de la sangre entera (por ejempio, ciertas protelnas de ios globulos rojos) sean separados (por ejempio, como sobrenadante despues de la centrifugation), de ios globulos biancos sangulneos, celulas de ievaduras y/o celulas bacterianas presentes en las muestra de sangre entera. Despues de la iisis de ios eritrocitos y la centrifugacion, la peiia resultante es reconstituida para formar un extracto.
Los metodos de la invencion pueden ser configurados para detectar un panel predeterminado de anaiitos asociados con patogenos. Por ejempio, el panel puede ser un panel fungico de Candida configurado para detectar individuaimente tres o mas de Candida guiiiiermondii, C. albicans, C. giabrata, C. krusei, C. Lusitaniae, C. parapsiiosis, y C. tropicaiis. En otra realizacion, el panel puede ser un panel bacteriano configurado para detectar individuaimente tres o mas de ios Staphylococcus, Enterococcus faecaiis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosa, Staphyiococcus aureus, y Escherichia coii negativos a coaguiasa. En una reaiizacion particuiar, ei panei puede ser un panel viral configurado para detectar individuaimente tres o mas de Citomegaiovirus (CMV), Virus de Epstein Barr, Virus BK, Virus de la Hepatitis B, virus de la Hepatitis C, virus de Herpes simplex (HSV), HSV1, HSV2, virus Respiratorio Sinciciai (RSV), Influenza; Influenza A, Influenza A subtipo H1, Influenza A subtipo H3, Influenza B, Virus 6 de Herpes Humano, Virus 8 de Herpes Humano, Metapneumovirus humano (hMPV), Rinovirus, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3, y Adenovirus. El panel puede ser un panel bacteriano configurado para detectar individuaimente tres o mas de E. coii, CoNS (estafiiococus negativo a coaguiasa), Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, E. faecium, E. faecaiis, y Klebsiella pneumonia. El panel puede ser un panel bacteriano configurado para detectar individuaimente tres o mas de A. fumigates, y A. fiavum. El panel puede ser un panel bacteriano configurado para detectar individuaimente tres o mas de Acinetobacter baumannii, Enterobacter aeraogenes, Enterobacter cioacae, Kiebsieiia oxytoca, Proteus mirabiiis, Serratia marcescens, Staphyiococcus haemoiyticus, Stenotro-phomonas maitophiiia, Streptococcus agaiactie, Streptococcus mitis, Streptococcus pneumonia, y Streptococcus pyogenes. El panel puede ser un panel de meningitis configurado para detectar
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individualmente tres o mas de Streptococcus pneumonia, H. influenza, Neisseria Meningitis, HSV1, HSV2, Enterovirus, Listeria, E. coli, Streptococcus del Grupo B. El panel puede ser configurado para detectar individualmente tres o mas de N. gonnorrhoeae, S. aureus, S. pyogenes, CoNS, y Borrelia burgdorferi. El panel puede ser configurado para detectar individualmente tres o mas de C. Difficile, Toxina A, y Toxina B. El panel puede ser un panel de neumonla configurado para detectar individualmente tres o mas de Streptococcus pneumonia, MRSA, Legionella, C. pneumonia, y Mycoplasma Pneumonia. El panel puede ser configurado para detectar individualmente tres o mas de mutaciones resistentes al tratamiento seleccionadas de mecA, vanA, vanB, NDM-1, KPC, y VIM. El panel puede ser configurado para detectar individualmente tres o mas de H. influenza, N. gonnorrhoeae, H. pylori, Campylobacter, Brucella, Legionella, y Stenotrophomonas maltophilia. El panel puede ser configurado para detectar la carga viral total causada por CMV, EBV, bK Virus, HIV, HBV, y HCV. El panel puede ser configurado para detectar la carga fungica y/o carga bacteriana. La determination de la carga viral puede ser utilizando una curva estandar y midiendo la muestra contra esta curva estandar o algun otro metodo de cuantificacion del patogeno en una muestra. El metodo de medicion cuantitativo puede incluir PCR en tiempo real, PCR competitivo (relation de dos senales competidoras) u otros metodos mencionados aqul. El panel puede ser configurado para detectar la respuesta inmune en un sujeto para monitorizar PCT, MCP-1, CRP, GRO-alfa, protelna de grupo caja 1 de alta movilidad (HMBG-1), receptor de IL-1, receptor del antagonista de IL-1, IL-1 b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, protelna inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de la migration de macrofagos (MIF), osteopontina, RANTES (regulado por activation, expresado por celulas T normales y secretado; o CCL5), Th1, Th17, y/o TNF-a. El panel puede ser configurado para detectar individualmente tres o mas de Ehrlichea, Mycobacterium, Syphillis, Borrelia burgdorferi, Cryptococcus, Histoplasma, y Blastomyces. El panel puede ser un panel de influenza configurado para detectar individualmente tres o mas de Influenza A, Influenza B, RSV, Parainfluenza, Meta-pneumovirus, Rhinovirus, y Adenovirus.
Los metodos de la invention pueden ser configurados para reducir la variabilidad de muestra a muestra determinando una senal de resonancia magnetica antes y despues de la hibridacion. La adicion de nanopartlculas derivadas a la muestra antes de los metodos para potenciar la aglomeracion pueden proveer una llnea base, una senal interna de T2 que puede ser bien sea sustralda o utilizada para modificar la senal de T2 despues del enlazamiento de partlculas derivadas con el analito y aglomeracion. Este metodo puede ser utilizado para determinar o manejar la variabilidad de cartucho a cartucho.
Los terminos “agregacion”, “aglomeracion” y “aglomerado” se utilizan de manera intercambiable en el contexto de las partlculas magneticas descritas aqul y significan el enlazamiento de dos o mas partlculas magneticas una a otra, por ejemplo, a traves de un analito multivalente, una forma multimerica de analito, anticuerpo, molecula de acido nucleico u otra molecula o entidad de enlazamiento. En algunos casos, la aglomeracion de partlculas magneticas es reversible.
Por “analito” se entiende una sustancia o un constituyente de una muestra que va a ser analizado. Los analitos de ejemplo incluyen una o mas especies de uno o mas de los siguientes: una protelna, un peptido, un polipeptido, un aminoacido, un acido nucleico, un oligonucleotido, ARN, ADN, un anticuerpo, un carbohidrato, un polisacarido, glucosa, un llpido, un gas (por ejemplo oxlgeno o dioxido de carbono), un electrolito (por ejemplo, sodio, potasio, cloruro, bicarbonato, BUN, magnesio, fosfato, calcio, amonlaco, lactato), una lipoprotelna, colesterol, un acido graso, una glicoprotelna, un proteoglicano, un lipopolisacarido, un marcador de superficie celular (por ejemplo CD3, CD4, CD8, IL2R O CD35) un marcador citoplasmatico (por ejemplo, CD4/CD8 o CD4/carga viral), un agente terapeutico, un metabolito de un agente terapeutico, un marcador para la detection de un arma (por ejemplo, un arma qulmica o biologica), un organismo, un patogeno, un subproducto de un patogeno, un parasito (por ejemplo, un protozoario o un helminto), un protisto, un hongo (por ejemplo levadura o moho), una bacteria, un actinomiceto, una celula (por ejemplo, una celula completa, una celula tumoral, una celula madre, una celula de globulos blancos, una celula T (por ejemplo, que despliegan CD3, CD4, CD8, IL2R, CD35, u otros marcadores de superficie), u otra celula identificada con uno o mas marcadores especlficos), un virus, un prion, un componente vegetal, un subproducto vegetal, algas, un subproducto de algas, una hormona de crecimiento vegetal, un insecticida, una toxina hecha por el hombre, una toxina ambiental, un componente oleoso y componentes derivados de los mismos. Tal como se utiliza aqul, el termino “molecula pequena” se refiere a un farmaco, medication, medicamento u otro compuesto sintetizado qulmicamente que es contemplado para uso terapeutico humano. Tal como se usa aqul, el termino “biologico” se refiere una sustancia derivada de una fuente biologica, no sintetizada y que esta contemplada para uso terapeutico humano. Un “biomarcador” es una sustancia biologica que puede ser utilizada como indicador de un estado de enfermedad particular o de un estado fisiologico particular de un organismo, en general un biomarcador es una protelna u otro compuesto natural medido en fluidos corporales cuya concentration refleja la presencia o severidad o etapa de un estado de enfermedad o disfuncion, puede ser utilizado para monitorizar el avance terapeutico del tratamiento de una enfermedad o trastorno o disfuncion, o puede ser utilizado como una medida subrogada de una aparicion o progresion cllnica. Tal como se utiliza aqul, el termino “biomarcador metabolico” se refiere una sustancia, molecula, o compuesto que es sintetizado o derivado biologicamente que es usado para determinar el estado de un paciente o la funcion hepatica o renal de un sujeto. Tal como se utiliza aqul, el termino “genotipificacion” se refiere a la capacidad para determinar diferencias geneticas en genes especlficos que pueden o pueden no afectar el fenotipo de un gen especlfico. Tal como se utiliza aqul, el termino “fenotipo” se refiere a la expresion biologica resultante (metabolica o fisiologica) de la protelna definida por el genotipo. Tal como se utiliza
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aqul, el termino “perfil de expresion genetica” se refiere a la capacidad de determinar la rata o cantidad de produccion de un producto genetico o la actividad de la transcripcion genetica en un tejido especlfico, de una forma temporal o espacial. Tal como se utiliza aqul, el termino “analisis proteomico” se refiere a un patron o disposicion de protelnas para identificar diferencias claves en protelna o peptidos en tejidos normales y enfermos. Se describen aqul analitos de ejemplo adicionales. El termino analito incluye adicionalmente componentes de una muestra que son el producto directo de un medio bioqulmico de amplificacion del analito diana inicial, tal como el producto de una reaccion de amplificacion de acidos nucleicos.
Por una molecula de acido nucleico “aislada” se entiende una molecula de acido nucleico que es retirada del ambiente en el cual se presenta naturalmente. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico de origen natural presente en el genoma de una celula o como parte de un banco genetico no esta aislada, pero la misma molecula, separada de la parte remanente del genoma, como resultado, por ejemplo, de un evento de clonacion, amplificacion o enriquecimiento, esta “aislada”. Tlpicamente, una molecula de acido nucleico aislada esta libre de regiones de acido nucleico (por ejemplo regiones de codificacion) con las cuales es inmediatamente contigua, en los extremos 5' o 3', en el genoma de origen natural. Tales moleculas de acido nucleico aisladas pueden ser parte de un vector o una composicion y todavla estaran aisladas puesto que tal vector o composicion no son parte de su ambiente natural.
Tal como se utiliza aqul, “enlazado” significa unido o conectado por enlaces covalentes, enlaces no covalentes y/o enlazado a traves de fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrogeno y/o otras fuerzas intermoleculares.
El termino “partlcula magnetica” se refiere a partlculas que incluyen materiales de susceptibilidad magnetica positiva alta tales como compuestos paramagneticos, compuestos superparamagneticos y magnetita, oxido ferrico gamma, o hierro metalico.
Tal como se utiliza aqul, “reversibilidad no especlfica” se refiere a la estabilidad y robustez coloidal de partlculas magneticas contra agregacion no especlfica en una muestra llquida y puede ser determinada sometiendo las partlculas a las condiciones de ensayo previstas en la ausencia de una unidad estructural aglomerante especlfica (esto es, un analito o un aglomerante). Por ejemplo, la reversibilidad no especlfica puede determinarse midiendo los valores T2 de una solucion de partlculas magneticas antes y despues de la incubacion en un campo magnetico uniforme (definida como <5000 ppm) a 0.45T durante 3 minutos a 37°C. Se considera que las partlculas magneticas tienen reversibilidad no especlfica si la diferencia de los valores T2 antes y despues de someter las partlculas magneticas a las condiciones de ensayo previstas varla en menos de 10% (por ejemplo, varia menos de 9%, 8%, 6%, 4%, 3%, 2% o 1%). Si la diferencia es mayor de 10%, entonces las partlculas exhiben irreversibilidad en el regulador, diluyentes y matriz probados, y puede requerirse manipulacion de la partlcula y propiedades de la matriz (por ejemplo, formulacion del recubrimiento y regulador) para producir un sistema en el cual las partlculas tengan reversibilidad no especlfica. En otro ejemplo, la prueba puede aplicarse midiendo los valores T2 de una solucion de partlculas magneticas antes y despues de la incubacion en un campo magnetico gradiente de 1 Gauss(mm-10000 Gauss/mm.
Tal como se utiliza aqul, el termino “rata de relajacion por RMN” se refiere una medicion cualquiera de los siguiente en una muestra T1, T2, hibrido T1/T2, T1rho, T2rho y T2*. Los metodos de la invencion estan disenados para producir una rata de relajacion por RMN caracterlstica de si un analito esta presente en la muestra llquida. En algunos casos la rata de relajacion por RMN es caracterlstica de la cantidad de analito presente en la muestra llquida.
Tal como se utiliza aqul, el termino “hibrido T1/T2” se refiere a cualquier metodo de deteccion que combine una medicion de T1 y T2. Por ejemplo, el valor de un hibrido T1/T2 puede ser una senal compuesta obtenida a traves de la combinacion de la relacion, o la diferencia entre dos o mas mediciones de T1 y T2 diferentes. El hibrido T1/T2 puede obtenerse, por ejemplo, utilizando una secuencia de pulsos en la cual T1 y T2 se miden alternativamente o se adquieren a manera de intervalos. Adicionalmente, la senal hibrida T1/T2 puede adquirirse con una secuencia de pulsos que mide una rata de relajacion que esta compuesta de ambas ratas o mecanismos de relajacion T1 y T2.
Un “patogeno” significa un agente que produce una enfermedad o malestar a su huesped, tal como un organismo o partlcula infecciosa, capaz de producir una enfermedad en otro organismo, e incluye pero no se limita a bacterias, virus, protozoos, priones, levaduras y hongos o subproductos de patogenos. “Subproductos de patogenos” son aquellas sustancias biologicas que surgen del patogeno que pueden ser nocivas para el huesped o estimular una respuesta inmune del huesped excesiva, por ejemplo, antlgenos patogenos, sustancias metabolicas, enzimas, sustancias biologicas o toxinas.
Por “analito asociado al patogeno” se entiende un analito caracterlstico de la presencia de un patogeno (por ejemplo, una bacteria, hongo o virus) en una muestra. El analito asociado con un patogeno puede ser una sustancia particular derivada de un patogeno (por ejemplo, una protelna, acido nucleico, llpido, polisacarido o cualquier otro material producido por un patogeno) o una mezcla derivada de un patogeno (por ejemplo, celulas enteras, o virus enteros). En ciertos casos, el analito asociado con patogeno es seleccionado por ser caracterlstico del genero, especie o cepa especlfica de patogeno que esta siendo detectada. Alternativamente, el analito asociado con el patogeno es
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seleccionado para establecer una propiedad del patogeno, tal como resistencia una terapia particular. Por ejemplo, el analito asociado con el patogeno puede ser un gen, tal como un gen Van A o un gen Van B, caracterlstico de la resistencia a la vancomicina en un cierto numero de especies bacterianas diferentes.
Por “secuencia de pulsos” o “secuencia de pulsos de RF” se entienden uno o mas pulsos de radiofrecuencia que se aplican una muestra y estan disenadas para medir, por ejemplo ciertas ratas de relajacion por RMN, tales como ecosecuencias de rotacion. Una secuencia de pulsos tambien puede incluir la adquisicion de una senal despues de uno o mas pulsos para minimizar el ruido y mejorar la exactitud en el valor de la senal resultante.
Tal como se utiliza aqul, el termino “senal” se refiere una rata de relajacion por RMN, desplazamiento de la frecuencia, medicion de susceptibilidad, medicion de la difusion o mediciones de correlacion.
Tal como se utiliza aqul, una referencia al “tamano” de una partlcula magnetica se refiere al diametro promedio para una mezcla de las partlculas magneticas segun se determina por microscopla, dispersion de luz, u otros metodos.
Tal como se utiliza aqul, el termino “sustancialmente monodispersa” se refiere una mezcla de partlculas magneticas que tienen una polidispersion en distribucion de tamano segun se determina por la forma de la curva de distribucion de tamano de partlcula en mediciones por dispersion de luz. La FWHM (media maxima de anchura total) de la curva de distribucion de partlcula menor de 25% de la posicion del pico se considera sustancialmente monodispersa. Ademas, solamente un pico deberla ser observado en los experimentos de dispersion de luz y la posicion del pico deberla estar dentro de la desviacion estandar de una poblacion de partlculas monodispersas conocida.
Por “capacidad de relajamiento T2 por partlcula” se entiende la capacidad de relajamiento T2 promedio por partlcula en una poblacion de partlculas magneticas.
Tal como se utiliza aqul, “no fraccionado” se refiere a un ensayo en el cual ninguno de los componentes de la muestra que esta siendo probada son retirados despues de la adicion de partlculas magneticas a la muestra y antes de la medicion de la relajacion por RMN.
A lo largo de la descripcion, cuando se describen unidades y sistemas por tener, incluir, o incluir componentes especlficos, o donde se describen procesos y metodos que tienen, incluyen o incluyen etapas especlficas, se contempla que, adicionalmente, hay unidades y sistemas que consisten esencialmente de, o consisten de, los componentes citados, y que hay procesos y metodos que consisten esencialmente de, o consisten de, las etapas de procesamiento citadas. Debe entenderse que el orden de las etapas u orden de la ejecucion de ciertas acciones carece de importancia, a menos que se especifique otra cosa, en tanto el metodo siga siendo operable. Ademas, en muchos casos pueden llevarse a cabo simultaneamente dos o mas etapas o acciones.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1A es un diagrama especlfico de una unidad de RMN para deteccion de una respuesta de senal de una muestra una secuencia de pulso de RF.
La figura 1B representa una configuration de bobina tlpica que rodea un tubo de muestra para una medicion de una senal de relajacion en una muestra de 20 pL.
Las figura 2A-2E ilustran geometrlas de microbobinas que pueden ser utilizadas en RMN (para excitation y/o deteccion); los disenos incluyen, pero no se limitan una bobina solenoide enrollada (figura 2A), una bobina plana (figura 2B), una bobina solenoide MEMS (figura 2C), una bobina Helmholz MEMS (figura 2D), y una bobina en montura (figura 2E). La fabrication de bobinas litograficas tridimensionales de bobinas bien caracterizadas usadas en la deteccion de RMN tambien esta establecida y puede ser utilizada para estas aplicaciones, Demas et al., “Electronic characterization of lithographically patterned microcoils for high sensitivity NMR detection” J Magn Reson 200:56 (2009).
La figura 3 es un dibujo que representa un ensayo de agregacion. Las partlculas magneticas (puntos) son recubiertas con un agente de enlazamiento (esto es, anticuerpo, oligo, etc.) de tal manera que en la presencia del analito, o del agente de enlazamiento mutivalente, se forman agregados. Los clrculos punteados representan la esfera o portion de difusion del volumen total de fluido que una molecula en solution puede experimentar a traves de su difusion durante una medicion de T2 (el camino exacto recorrido por una molecula de agua es aleatorio, y este dibujo no esta a escala). La agregacion (a mano derecha) elimina porciones de la muestra de las no uniformidades magneticas microscopicas que destruyen la senal T2 del agua, llevando a un incremento de relajacion T2.
Las figura 4A-4E son una serie de graficas que representan la dependencia de la capacidad de relajacion transversa (R2) (figura 4A) o T2 (figuras 4B-4E) sobre el diametro de una partlcula y la agregacion de las partlculas. La figura 4A es una grafica que representa el regimen promedio de movimiento (llnea derecha, lado izquierdo); la R2 (1/T2)
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medida por la secuencia CPMG se incrementa a medida que el tamano de partlcula se incrementa puesto que los pulsos de reenfoque son inefectivos para contrarrestar los efectos de desfase de las partlculas. Puesto que las transiciones del sistema al regimen limitado de visita (llnea oscura, lado derecho), los pulsos de reenfoque comienzan a hacerse efectivos y R2 disminuye a medida que se incrementa el tamano de partlcula. Para campos magneticos homogeneos, la R2* en el regimen de promedio de movimiento coincide con R2 y el R2* alcanza un valor constante en el regimen limitado de visita. En un campo homogeneo, cuando el R2* en menor que R2 de cualquiera de los reglmenes de promedio de movimiento y regimen limitado de visita el sistema esta en el regimen de desfase estatico. El clrculo vaclo representa el R2 de una solucion de partlculas dispersadas al 100% (diametro = 15 nm) y el clrculo solido representa una solucion de partlculas aglomeradas al 100% (diametro = 200 nm). Este es un ejemplo de como interpretar estas curvas para reacciones de aglomeracion. Las condiciones para esta curva son 0.1 mM Fe, Aw=8.85x106, D=2.5x10-5 m2/s y tcp=0.25 ms. La figura 4B es una grafica que representa las mismas curvas de luz y oscuridad representadas en terminos de T2 y diametro, sobre una escala lineal. En esta figura la llnea interrumpida negra representa la T2* medida en un campo magnetico no uniforme donde T2* siempre es inferior a T2* y no refleja el tamano de la partlcula. Los puntos de datos son los mismos tambien. La figura 4C es una grafica que representa el modelo de aglomeracion monodispersa y muestra que T2 seguira la curva a medida que el analito es agregado puesto que el diametro promedio de las partlculas de poblacion cubrira todos los diametros intermedios entre los estados inicial y final. La figura 4D es una grafica que representa el modelo polidisperso y que muestra que T2 hara transicion entre dos puntos sobre esta curva cuando forma aglomerados de tamanos especlficos. La curva de respuesta sera lineal con respecto a la adicion de analito, pero no lineal con respecto a la fraccion de volumen de los aglomerados, debido a la transicion de partlculas entre el estado 1 y el estado 2. La pendiente de la curva de respuesta es directamente proporcional a la sensibilidad del ensayo. La figura 4E es una grafica que muestra los dos reglmenes para la agregacion de partlculas y efectos de T2 con base en el tamano de partlcula y como los ensayos de aglomeracion en los diferentes reglmenes se representan sobre las curvas de T2 versus diametro (i) para el regimen de promedio de movimiento T2 que disminuye cuando las partlculas se aglomeran; y (ii) para el regimen de movimiento de T2 lento se incrementa cuando las partlculas se aglomeran. Bajo las condiciones mostradas en esos modelos, la frontera entre los dos reglmenes es cerca de partlculas de diametro de 100 nm. Cuando las partlculas magneticas pequenas forman agregados por debajo de 100 nm de diametro, el resultado es un descenso en T2 al formarse el agregado. Cuando las partlculas magneticas en o por encima de 100 nm de diametro forman agregados mas grandes, el resultado es un incremento en T2 con la formacion del agregado.
Las figuras 5A-5C son dibujos que representan diferentes formatos de ensayo para los ensayos de la invention. La figura 5A representa un inmunensayo sandwich de aglomeracion en el cual dos poblaciones de partlculas magneticas estan disenadas para enlazarse a dos epltopos diferentes de un analito. La figura 5E representa un inmunoensayo competitivo en el cual el analito en una muestra llquida se enlaza a un agente de enlazamiento multivalente (un anticuerpo multivalente), inhibiendo por lo tanto la agregacion. La figura 5C representa un ensayo de aglomeracion mediado por hibridacion en el cual dos poblaciones de partlculas estan disenadas para enlazarse a la primera y segunda porciones de una diana de acido nucleico, respectivamente.
La figura 6 ilustra un concepto de cartucho modular en secciones que pueden ser empacadas y almacenadas separadamente. Esto se hace, por ejemplo, de tal manera que el modulo de entrada (mostrado elevado con un tubo Vacutainer invertido unido) puede ser esterilazada mientras que el modulo de sostenimiento de reactivo en la mitad no lo es. Esto permite que el componente que contiene reactivos sea el unico componente refrigerado.
Las figura 7A-7F representan un modulo de entrada Vacutainer. La figura 7A lo muestra en la position invertida despues de que el usuario ha retirado el cierre del tubo Vacutainer y colocado el cartucho sobre el. La figura 7B muestra la ruta moldeada que la sangre seguira fuera del Vacutainer y hacia la region de carga de muestra una vez que el cartucho es enderezado hacia arriba. El sello de lamina puede ser el lado inferior de los canales, formando una parte moldeada no costosa con canales cerrados. La figura 7C es una vista en corte que muestra el tubo de ventilation que permite que el aire entre al vial a medida que la sangre sale y llena la region de muestra. Las figuras 7D-7F representan un modulo de entrada para la toma de allcuotas de muestras disenado para hacer interfaz con tubos Vacutainer no tapados, y para generar dos allcuotas de un volumen de muestra que puedan ser utilizadas para llevar a cabo, por ejemplo, un ensayo de Candida. El modulo de entrada tiene dos partes plasticas duras, que se sueldan entre si por via ultrasonica y sellan la lamina para formar una red de canales que permiten formar un camino de flujo hacia el primer pozo con sobreflujo hacia el segundo pozo de muestra. Se utiliza una parte de sello Vacutainer blanda para sellar con el Vacutainer. Tiene un puerto para el flujo de muestra, y un puerto de ventilacion, para permitir que suceda el flujo. La figura 8 representa el modulo de entrada de muestra con el sello de lamina retirado. En la parte superior, puede verse el pequeno puerto de entrada de aire a la izquierda, el pozo de muestra mas grande en el centro y un puerto que los conecta entre si. Este puerto provee un canal a traves del cual el aire puede fluir una vez que se perfora el sello de lamina. Tambien provee un sobreflujo hacia el cuerpo del modulo para permitir que el exceso de sangre drene y no se derrame. Esto mide efectivamente la muestra de sangre hasta el volumen contenido en el pozo de muestra.
Las figura 9A-9C representan un modulo de reactivo. La figura 9A representa el modulo del cartucho que esta previsto para contener los reactivos y consumibles para uso durante el ensayo. Al lado izquierdo estan las allcuotas selladas predispensadas de los reactivos. A la derecha hay un tubo de centrlfuga de fondo conico de 2.8 ml que se
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utiliza para la centrifugacion inicial de la sangre. Los otros orificios pueden ser llenados segun se necesite con viales, tubos de microcentrlfuga y puntas de pipeta. La figura 9B es una vista en corte del modulo de reactivos que muestra los soportes para las puntas de reactivos con allcuotas previamente definidas, incluyendo la caracterlstica en el fondo en la cual se presionan las puntas para proveer un sellamiento. La figura 9C representa tres puntas de pipeta representativas en las cuales pueden ser predispensados los reactivos; y luego se pueden sellar las partes posteriores. Estas puntas son presionadas hacia el soporte de la muestra para proveer un sellamiento.
Las figuras 10A y 10B representan un diseno alternativo del cartucho modular, que muestra un modulo de deteccion con un pozo deprimido para uso en ensayos que requieren PCR. La contaminacion cruzada de productos de PCR es controlada de dos maneras. Primero, los sellos que estan sobre los tubos de deteccion estan disenados para sellar una punta de pipeta a medida que esta penetra. Segundo, el instrumento provee flujo de aire a traves del pozo deprimido por medio de orificios en el pozo para asegurar que ningun aerosol es arrastrado hacia abajo y no se desplaza a traves de la maquina.
La figura 11 representa un modulo de deteccion de cartucho que muestra tubos de deteccion y uno de los orificios utilizados para asegurar que el aire fluya hacia abajo y sobre los tubos durante la utilization de la pipeta para ayudar a evitar el escape de aerosol.
La figura 12 representa una vista inferior del modulo de deteccion, que muestra el fondo de los tubos de deteccion y los dos orificios utilizados para asegurar el flujo de aire. Puede insertarse un filtro opcional aqul para capturar cualquier aerosol llquido y evitar que entre a la maquina. Este filtro podrla tambien ser una lamina de material hidrofobo como Gore-tex que permitira que escape el aire pero no los llquidos.
Las figuras 13A-13C representan un tubo de deteccion. La figura 13A es una vista del tubo de deteccion. El tubo mismo podrla ser un tubo de PCR de 200 microlitros comercial, mientras que la tapa es una parte elastomerica moldeada a la media que provee un sello tipo ornitorrinco resistente a la presion en el interior y un primer sello para la punta de la pipeta desde la parte superior. El sello es as! un tipo de sello para romper, donde un sello se hace antes de que el otro se rompa. La figura 13B representa el componente de sellamiento moldeado personalizado. Notese el orificio circular en el cual se inserta la punta de la pipeta y el sello tipo ornitorrinco por debajo, lo cual provee un segundo sello que resiste la presion desarrollada en el tubo. La figura 13C representa el sello que muestra el tipo ornitorrinco en la parte inferior y el orificio en la parte superior.
Las figuras 14A-14C representan un cartucho para llevar a cabo un ensayo multiplexion. La figura 14A muestra una tira de reactivo para el cartucho. Los orificios ovales son los soportes para los modulos de deteccion y son construidos separadamente y luego colocados en los orificios. Los pozos de deteccion podrlan ser disenados individualmente o estar disponibles comercialmente. La figura 14B muestra el modulo de deteccion para el cartucho representado en la figura 14A. En este ejemplo, el modulo de deteccion contiene dos camaras de deteccion, pero podrlan contener cualquier numero de camaras segun se requiera por el ensayo y segun el sistema de deteccion (el lector MR) este disenado para aceptar. La figura 14C representa un molde alterno para el cartucho multiplex modular. Este cartucho incluye tres modulos de deteccion que son moldeados como parte de la banda de reactivos, y estas porciones son sobresalientes del marco y son procesadas individualmente en otras unidades (esto es, la unidad RMN y/o la unidad de aglomeracion asistida magnetica (MAA)) con el sistema de ensayo.
La figura 15 es un esquema que representa una realization del metodo de aglomeracion asistida magnetica gradiente en ciclo (gMAA). Se colocan dos magnetos en dos posiciones tales que si el tubo de muestra se coloca cerca a la region de fuerte gradiente de campo magnetico producida por el primer magneto, las partlculas magneticas seran arrastradas hacia la direction del gradiente de campo producido por el primer magneto, el tubo de muestra es colocado entonces cerca del segundo magneto produciendo un gradiente de campo, y las partlculas magneticas son arrastradas a la direccion del gradiente de campo producido por el segundo magneto. El ciclo puede ser repetido hasta que la reaction de agregacion alcance un estado de equilibrio (segun se observa por el cambio de rata de relajacion por RMN de la muestra); puede utilizarse un pequeno numero de ciclos tambien. Tambien puede utilizarse una magneto individual usada para producir un gradiente de campo, mientras que para hacer el ciclo del tubo de muestra puede moverse con respecto al gradiente de campo magnetico.
La figura 16 es un esquema que representa una configuration de aglomeracion asistida magnetica homogenea (hMAA). A la izquierda, se muestran las partlculas magneticas como puntos en un estado parcialmente aglomerado. Cuando se exponen a un campo magnetico homogeneo, como se representa al lado derecho, la aglomeracion de las partlculas magneticas se promueve a medida que las partlculas magneticas forman cadenas a lo largo de la direccion del campo producido por la configuracion hMAA. Al lado derecho, los dos magnetos estan representados por barras, para mostrar la formation de un campo de dipolo estandar. El hMMA tambien puede ser utilizado para evaluar la reversibilidad no especlfica de una partlcula magnetica para establecer su utilidad en un ensayo.
La figura 17 representa una unidad MAA del gradiente configurada para aplicar un campo magnetico gradiente al lado y al fondo de una muestra. La configuracion especlfica tiene magnetos con un campo de superficie de aproximadamente 0.7 T, mientras que el gradiente producido es del orden de 0.25 T/mm. Pueden utilizarse unidades
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gMAA similares, cubriendo un rango mucho mas grande de campos y gradientes.
Las figuras 18A-18C representan una unidad MAA de gradiente configurada para aplicar un campo magnetico de gradiente al lado y al fondo de una disposicion de muestras. La figura 18A representa el arreglo de unidad gMAA de 32 magnetos de fondo y 40 magnetos laterales (32 funcionales, usados para balancear los campos magneticos alejados vistos por toda la muestra), cada uno con una fuerza de campo de aproximadamente 0.5 T, usados para asistir en la aglomeracion en un arreglo de muestras simultaneamente. Las figuras 18B-18C representan una vista superior (figura 18B) y una vista lateral (figura 18C) de una configuration para la automatization de una unidad gMAA automatizada en donde una placa de gMAA junto con una configuracion para contener un arreglo de muestras realiza un ciclo entre las posiciones de magneto inferior y lateral mediante un sistema robotico, dentro de un arreglo controlado por temperatura. Los magnetos son estacionarios, mientras que la placa que soporta los tubos de muestra se mueve a traves de una trayectoria predefinida. Una fuerza de campo de ejemplo sobre la superficie de los magnetos individuales es 0.4-0.5 T, con un gradiente del orden de 0.1 T/mm.
Las figura 19A-19B representan una vista superior (figura 19A) y una vista lateral (19B) de una unidad MAA homogenea configurada para aplicar un campo magnetico homogeneo una disposicion de muestras. Pueden utilizarse fuerzas de campo desde 0.2-0.7 T con homogeneidad desde 500 a 5000 ppm a lo largo de la region del tubo de muestra.
La figura 20 es un dibujo de un sistema de vortex que incluye los siguientes componentes: (i) un soporte de muestra, (ii) una placa principal, (iii) cuatro uniones, (iv) riel lineal y sistema de transporte (x2), (v) un soporte para arboles de impulso y rieles, (vi) arbol de acoplamiento e impulso, (vii) una placa de montaje y (viii) un motor de impulso.
La figura 21 es un dibujo de un sistema de vortex compacto que incluye los siguientes componentes: (i) un soporte de muestra, (ii) una placa principal, (iii) dos uniones, (iv) riel lineal y sistema de transporte, (v) un soporte para riel lineal, (vi) soporte para arbol de impulso, (vii) arbol de acoplamiento e impulso, (viii) y una placa de montaje, y (ix) un motor de impulso.
Las figuras 22A y 22B representan porciones de un sistema de vortex. La figura 22A es un dibujo que representa la portion inferior (esto es, el motor de impulso, el acoplamiento y el arbol de impulso) de un sistema de vortex. El motor incluye una marca de Indice y/u otro medio para detection de la position tal como un codificador de position optico, magnetico o por resistencia que permite que el motor encuentre el punto especlfico en su rotation. Estas marcas de Indice se utilizan para retornar el sistema y asegurar de que la muestra pueda ser regresada una posicion conocida despues de mezclar y permitir facil acceso al sistema de vortex mediante accionadores roboticos, y as! estar integrado en un sistema automatizado. En lugar de marcas de Indice, podrlan emplearse conmutadores de regreso externos o sensores de seguimiento de posicion. La figura 22B es un dibujo que representa los mecanismos de gula de un sistema de vortex. La placa principal esta conectada al eje de desplazamiento del arbol de impulso y es libre para rotar. La placa sigue el camino orbital alrededor y dictado por el arbol del motor.
Las figuras 23A-23C son series de dibujos que representan un sistema de vortex que utiliza un impulso por cinta planetaria. La figura 23A es una vista global que muestra el sistema de vortex configurado para un tubo grande. La figura 23B es una vista en section que muestra dos soportes para tubos para tubos pequenos. La figura 23C es una vista general de un sistema de vortex que muestra cuatro tubos y un acercamiento del mecanismo de impulso por cinta planetaria.
La figura 24 es un dibujo que representa los componentes del ensayo competitivo de creatinina del Ejemplo 6. Una partlcula magnetica cubierta con creatinina se utiliza en combination con un anticuerpo de creatinina para formar un sistema de agregacion.
La creatinina presente en una muestra llquida compite con las partlculas magneticas por el anticuerpo, llevando una reduction en la agregacion con el incremento en la concentration de creatinina. El cambio en la agregacion se observa como un cambio en la rata de relajacion T2 de los nucleos de hidrogeno en las moleculas de agua de la muestra llquida. Comparando la rata de relajacion T2 observada de la muestra llquida con una curva estandar, se determina la concentracion de creatinina.
Las figuras 25A-25C son una serie de graficas que muestran la curva de respuesta para ensayos competitivos de creatinina. La figura 25A es una grafica que muestra una curva estandar para el ensayo competitivo de creatinina del Ejemplo 6 que correlaciona la rata de relajacion T2 observada con la concentracion de creatinina en la muestra llquida. La figura 25B muestra la respuesta T2 de una partlcula cubierta con creatinina con dos preparaciones diferentes de anticuerpo. La preparation 1 es preproduccion (con anticuerpo agregado) y la preparation 2 es production purificada (sin anticuerpo agregado presente). La figura 25C muestra la respuesta T2 de una partlcula cubierta con creatinina con anticuerpo no agregado, anticuerpo biotinilado y anticuerpo deliberadamente multimerizado, y confirma la capacidad de aglomeracion incrementada de agentes de aglomeracion multivalentes.
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La figura 26 es una grafica que muestra la aglomeracion especlfica alcanzada, segun se determina mediante las ratas de relajacion T2, con diversos metodos de gMAA como se describe en el Ejemplo 10. En la figura 26 (i) “control” es gMAA (exposicion a magneto + vortex, repeticion) en el cual la posicion relativa de la muestra y la direccion del campo magnetico no cambian con cada ciclo; (ii) “torsion “es gMAA (exposicion magnetica + rotacion sin magneto, repeticion) con un tubo que rota alrededor de 90° con respecto al magneto de gradiente con cada ciclo; (iii) “giro de 180°” es gMAA (exposicion a magneto + retirar tubo de magneto, rotar, colocar de regreso el magneto, repetir) con un tubo que rota cerca de 180° con respecto al magneto de gradiente con cada ciclo; y “retirar 5 veces” es retirar el tubo de magneto 5, descansar 5 segundos (sin rotacion), repetir. Los resultados muestran que la rata a la cual se alcanzan un grado de estado de equilibrio de aglomeracion, y una lectura estable de T2, que es acelerado por la generacion de ciclos entre las dos o mas posiciones a lo largo de un numero de tratamientos de gMAA. Adicionalmente, las combinaciones de gradiente de campo, el campo de ciclo (lateral o inferior) para anular o de campo lateral a inferior, campo (lateral o inferior) al vortex tambien son interacciones que pueden ser utilizadas para gMAA. Los tiempos de exposicion o residencia (bien sea sobre el campo o fuera de el) y el numero de ciclos pueden variarse para optimizar la agregacion asistida para un ensayo especlfico (no mostrado).
La figura 27 es una grafica que muestra la curva de respuesta para el ensayo competitivo de creatinina para muestras procesadas con magneto gMAA alternante lateral-inferior como se describe en el Ejemplo 11.
La figura 28 es un dibujo que representa la arquitectura del ensayo competitivo de tacrolimus del Ejemplo 9.
La figura 29 es una grafica que muestra una curva estandar para el ensayo competitivo de tacrolimus del Ejemplo 9 que correlaciona la rata de relajacion T2 observada para una muestra llquida con la concentracion de tacrolimus en la muestra llquida.
Las figuras 30A-30B son graficas que representan el grado hasta el cual la agregacion asistida por gMAA es dependiente de la temperatura y el tiempo de residencia en el ensayo del Ejemplo 11. La figura 30 A es una grafica que muestra que el grado de agregacion tal como es determinado midiendo la respuesta T2 de la muestra se incrementa con el incremento del tiempo de residencia a temperatura ambiente. La figura 30B es una grafica que muestra que el grado de agregacion tal como se determina midiendo la respuesta T2 de la muestra se incrementa con el incremento del tiempo de residencia de gMAA a 37°C. Como se muestra en las figuras 30A y 30B, el incremento de temperatura y el incremento del tiempo de residencia potencian el grado de agregacion asistida por gMAA segun se observa por los cambios en la T2 observada.
La figura 31 es una grafica que muestra que el grado de agregacion tal como se determina midiendo la respuesta T2 de la muestra se incrementa con el incremento del numero de ciclos de gMAA en el ensayo del Ejemplo 13.
La figura 32 es un dibujo que representa la arquitectura del ensayo sandwich de aglomeracion de Candida del Ejemplo 14.
La figura 33 es una grafica que representa una curva de inhibicion de creatinina (vease Ejemplo 7) para utilizar una partlcula recubierta con anticuerpo y un agente de enlazamiento mutivalente amino-dextrano-creatinina para inducir la aglomeracion compitiendo con cualquier analito diana (creatinina) presente en la muestra para causar la aglomeracion de partlculas. El agente de enlazamiento usado es dextrano de 40 kDa con ~10 creatininas por moleculas de dextranos.
La figura 34 es una grafica que representa la evaluation de los conjugados de Tac-dextrano en cuanto a su capacidad de aglomeracion (vease Ejemplo 8) llevando a cabo una titulacion. Tal como se observa, el peso molecular incrementado de Tac-dextrano da como resultado la senal T2 mejorada.
La figura 35 es una grafica que representa la evaluacion de los conjugados de Tac-dextrano en cuanto a su capacidad de aglomeracion (vease Ejemplo 8) llevando a cabo una titulacion. Tal como se observa, una sustitucion mas alta mejora la senal T2.
La figura 36 es una grafica que representa la evaluacion de conjugados de Tac-BSA en cuanto a su capacidad de aglomeracion (vease Ejemplo 8) llevando a cabo una titulacion similar a la usada para los conjugados de Tac- dextrano. Como se observa, el rendimiento de la aglomeracion varla con la relation de sustitucion de tacrolimus.
La figura 37 es una grafica que representa los resultados de los ensayos de T2 para detectar el anticuerpo anti- biotina utilizando partlculas magneticas preparadas en sangre y en matrices de PBS tal como se describe en el Ejemplo 1.
La figura 38 es una grafica que representa los resultados de los ensayos de T2 para detectar anticuerpo anti-biotina utilizando partlculas magneticas preparadas con (clrculo abierto) y sin (clrculo relleno) un bloque de protelna como se describio en los Ejemplos 8 y 9.
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La figura 39 es una grafica que representa los resultados de los ensayos de T2 para detectar anticuerpo anti-biotina utilizando particulas magneticas preparadas que tienen un bloqueo BSA (diamante, cuadrado, triangulo rellenos de negro), o un bloque FSG (X y circulo de gris claro) como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 40A-40B son esquemas de recubrimiento de particulas provistos.
Las figuras 41A-41B representan resultados de los ensayos de T2 para detectar biotina en un formato de ensayo competitivo descrito en el Ejemplo 4. La figura 41A representa resultados experimentales en regulador; mientras que la figura 41B representa resultados experimentales en sangre lisada.
La figura 42 es un esquema de un sistema que incluye una unidad RMN, un brazo robotico, una unidad hMAA, una unidad gMAA, dos unidades de agitacion como una centrifuga y una pluralidad de bloques de calentamiento.
Las figuras 43A-43D son imagenes que representan diversas unidades de transferencia de fluidos que pueden ser utilizadas en los sistemas.
Las figuras 44A y 44B son esquemas que muestran como un sistema puede ser disenado para regular la temperatura del espacio de trabajo.
Las figuras 45A y 45B son esquemas que representan una unidad de RMN que tiene un alojamiento separado para la regulation de la temperatura en el sitio de la medicion por RMN, y util cuando se requiere un control de temperatura ajustado para la precision de la medicion. La configuration de control de temperatura representada en esta figura es una de muchas maneras diferentes de controlar la temperatura.
La figura 46A es una tabla y la 46B es una grafica que representa la repetibilidad de las mediciones de Candida por los metodos de la invention a lo largo de un periodo de ocho dias. Para determinar la repetibilidad de la medicion de T2 sobre sangre humana entera infectada con C. albicans, llevamos a cabo un estudio de ocho dias en el cual la misma muestra de donante tomada y amplificada fue hibridada a las particulas superparamagneticas (n=3) cada dia y se registraron los valores de T2 resultantes (vease Ejemplo 17). La precision en la medicion se muestra en la figura 46A y en general es estrecha con los CV de todas las mediciones menores de 12%. La repetibilidad observada en el transcurso de los ocho dias se muestra en la figura 46B (valores T2 medios +/- el 95% de intervalos de confidencia medios a partir de las mismas muestras de donante sembradas y amplificadas en el trascurso de los ocho dias) con CV menor de 10% a traves del rango de concentraciones de Candida y 6% para el control negativo.
La figura 47 es un esquema que describe el flujo de trabajo para la detection de un patogeno bacteriano o fungico en una muestra de sangre entera (veanse Ejemplos 14 y 17).
Las figuras 48A y 48B son graficas que representan resultados de muestras de donantes. La figura 48A es una grafica que representa los resultados obtenidos a partir de 16 experimentos disenados para establecer el rendimiento del ensayo en 6 diferentes muestras de sangre de donantes sembradas con un rango de celulas de C. albicans (vease Ejemplo 17). Cada punto de dato es la media +/- el 95% del intervalo de confidencia (n=48). A la concentration de prueba mas baja (10 celulas/mL) se fallo en la deteccion de Candida albicans en 37% de las veces (6 de cada 16 experimentos); sin embargo a 100 celulas/mL se detecto Candida albicans el 100% del tiempo. Esto sugiere que el ensayo puede detectar de manera robusta a concentraciones de C. albicans superiores o iguales a 100 celulas/mL sin inhibition mayor del comportamiento introducido a traves de las muestras de sangre del donante. La figura 48B es una grafica que representa los resultados obtenidos a partir de 7 experimentos disenados para establecer el rendimiento de ensayo en 6 diferentes muestras de sangre del donante sembradas con un rango de celulas de C. crusei (vease Ejemplo 17). Cada punto de dato es la media +/- el 95% de intervalo de confidencia (n=21). No hubo deteccion a 10 celulas/mL en ninguno de los experimentos pero hubo deteccion a 100 celulas/mL para todos los experimentos. Esto sugiere la LOD entre 10 y 100 celulas/mL.
La figura 49 es un diagrama de puntos que muestra los valores T2 medidos para cinco aislados clinicos de C. albicans sembrados en 400 pL de sangre entera a concentraciones que varian de 0 a 1 E4 celulas/mL. Los resultados en la grafica son la media +/- 1SD. Los datos indican que a pesar de la dispersion de los valores T2 absolutos obtenidos entre los diferentes aislados, a 50 celulas/mL todos los valores estan por encima del control que no tiene Candida (3 mediciones replicadas a partir de 20 ensayos independientes, total de 60 reacciones de aglomeracion diferentes).
Las figuras 50A y 50B son graficas ROC de resultados de T2 generados a 10 celulas/mL (figura 50A) y 50 celulas/mL (figura 50B). El area bajo la curva a 10 celulas/mL es 0.72 (95CI=0.56 a 0.88) mientras que a 50 celulas/mL el area bajo la curva es 0.98 (95CI=0.95 a 1.001). El area bajo la curva se usa frecuentemente para cuantificar la exactitud del diagnostico; en este caso nuestra capacidad para discriminar entre un paciente candidemico con una infection de 10 celulas/mL o 50 celulas/mL versus un paciente sin candidemia. A 10 celulas/mL el area bajo la curva es 0.72 lo que significa que si el ensayo de T2 fue llevado a cabo en una persona
escogida aleatoriamente con candidemia a un nivel de infeccion de 10 celulas/mL, hay un 72% de posibilidades de que sus valores T2 sean mas altos que los de una persona sin candidemia. La exactitud cllnica de la prueba es mucho mas alta a 50 celulas/mL con un area bajo la curva a 0.98. De nuevo se indica que una persona con candidemia a este nivel de infeccion, el ensayo de T2 darla un valor mas alto que en una muestra de un paciente sin 5 candidemia el 98% de las veces. Vease el Ejemplo 17.
La figura 51 es una grafica que representa la sensibilidad del ensayo utilizando el termociclo estandar (~3 horas de tiempo total) y un proceso que combina las etapas de fusion/elongacion (~2 horas, 13 minutos de tiempo global). La combinacion de la etapa de fusion y elongacion en el termociclo reduce el TAT del ensayo total a 2.25 horas sin comprometer la sensibilidad del ensayo.
10 La figura 52 es una grafica que representa el cambio en la senal T2 con ciclizacion por PCR (vease Ejemplo 18). Los resultados demuestran que los metodos de la invention pueden ser utilizados para llevar a cabo PCR en tiempo real y proveer information cuantitativa acerca de la cantidad de acido nucleico diana presente en una muestra.
La figura 53 es una serie de fotograflas que muestran un separador magnetico simple/inserto de bloque de PCR.
La figura 54 es una imagen que muestra la cantidad de ADN generada por la amplification de (1) 100 copias de C.
15 albicans genomico amplificado en la presencia de nanopartlculas de sonda sencilla de C. albicans 3'y 5'; las partlculas fueron mantenidas en la pared lateral durante el PCR mediante campo magnetico (2) 100 copias de C. albicans genomico amplificado sin nanopartlculas, y (3) 100 copias de C. albicans genomico amplificado en la presencia de nanopartlculas de sonda sencilla de C. albicans 3'y 5'; sin campo magnetico.
Las figuras 55A-55E son vistas esquematicas de un tubo de muestra que contiene una portion inmovilizada de una
20 espuma metalica magnetizable (sombreada), partlculas magneticas (clrculos), y analito (triangulos), una espuma metalica magnetizable, por ejemplo, hecha de nlquel, puede ser insertada en un conducto e inmovilizada por exposition al calor, con encogimiento del conducto alrededor de la espuma de metal, dando como resultado un sello completado. Una muestra que contiene partlculas magneticas y analitos se introduce entonces en un extremo del conducto (figura 55A). A continuation el conducto es expuesto a un magneto (figura 55B), y las partlculas
25 magneticas son atraldas a la espuma metalica y se atrapan magneticamente dentro de sus poros, o grietas. El diametro promedio de los poros en la espuma metalica esta, por ejemplo, entre 100-1000 micrones. Las moleculas de analito pueden ser llevadas a la espuma metalica a traves del enlazamiento una partlcula magnetica, o el fluido puede ser forzado a traves de la espuma metalica para alcanzar partlculas magneticas atrapadas. Mientras estan atrapadas en la espuma metalica, las partlculas magneticas tienen interacciones potenciadas, puesto que ahora
30 estan confinadas y estan mas cercas a otras partlculas magneticas, y se potencian las formaciones de aglomerado. La espuma magnetica es entonces desmagnetizada (figura 55C), esto es, el campo magnetico de la espuma metalica se hace despreciable. Las partlculas magneticas y los complejos aglomerados de analito permanecen largamente en la espuma metalica, y la difusion de los aglomerados de partlculas magneticas es relativamente baja, aunque ocurre alguna difusion natural del analito hacia dentro y afuera de la espuma metalica (figura 55D).
35 Alternativamente, la espuma metalica magnetizable (cilindro hueco) esta libre flotando en el tubo de muestra con las partlculas magneticas (clrculos) y analito (estrellas). La magnetization y desmagnetizacion de la espuma metalica en flotation libre se utiliza para incrementar la rata de formation de agregados.
La figura 56 A representa una configuration gMAA rotatoria. La gMAA rotatoria puede incluir tres configuraciones para variar las exposiciones al campo magnetico -lateral-inferior; lateral-nulo e inferior-nulo (vease Ejemplo 21).
40 La figura 56B es una grafica que compara la senal T2 como una funcion de diversas configuraciones de gMAA rotatorias para variar las exposiciones del campo magnetico una muestra una concentration del aglomerante dada. La configuracion rotatoria lateral-inferior proveyo la senal T2 mas alta una concentracion de aglomerante dada, seguida por la comparacion de configuracion de placa lateral-inferior. La lateral-nula rotatoria provee senal equivalente a la placa lateral-inferior; y la inferior-nula produce la senal mas baja (vease Ejemplo 21).
45 La figura 57 es una tabla que representa los resultados de T2MR para 32 especlmenes cllnicos que indica que catorce especlmenes son positivos a Candida. La prueba identifica cuatro especlmenes que contienen C. krusei o C. glabrata, siete especlmenes que contienen C. albicans o C.tropicalis, y tres que contienen C. parapsilosis. Una llnea blanca solida indica el umbral de decision (T2=128 mseg) (vease Ejemplo 22).
Description detallada
50 La invencion presenta metodos para la detection rapida de patogenos o acidos nucleicos diana en una muestra de sangre entera. Los metodos de la invencion emplean partlculas magneticas, una unidad de RMN, opcionalmente una o mas unidades MAA, opcionalmente una o mas estaciones de incubation a diferentes temperaturas, opcionalmente uno o mas sistemas de vortex, opcionalmente una o mas centrlfugas, opcionalmente una estacion de manipulation de fluidos, opcionalmente un sistema robotico y opcionalmente uno o mas cartucho modulares. Se
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divulga que los sistemas, dispositivos y metodos de la invencion pueden ser utilizados para probar una muestra biologica (por ejemplo, sangre, sudor, lagrimas, orina, saliva, semen, suero, plasma, fluido cerebroespinal (CSF), heces, fluidos o tejidos vaginales, esputo, aspirado o frotis nasofarlngeo, fluido lacrimal, frotis mucoso o epitelial (frotis bucal), tejidos, organos, huesos, dientes o tumores entre otros). Alternativamente, se divulga que los sistemas, dispositivos y metodos se utilizan para monitorizar una condicion ambiental (por ejemplo, hormona del crecimiento vegetal, insecticidas, toxinas hechas por el hombre o ambientales, secuencias de acidos nucleicos que son importantes para la resistencia/susceptibilidad a insectos, algas y subproductos de algas), como parte de un programa de biorremediacion, para uso en crianza de plantas o animales, o para identificar riesgos ambientales. De manera similar, se describen los sistemas, dispositivos y metodos para ser usados con el fin de detectar y monitorizar guerra biologica o agentes biologicos de combate, tales como ricino, Salmonella typhimurium, toxina de botulinum, aflatoxinas, micotoxinas, Francisella tularesis, viruela, antrax, u otros.
Las partlculas magneticas pueden ser recubiertas con una unidad estructural de enlazamiento (esto es, anticuerpo, oligo, etc.) de tal manera que en la presencia de analito, o de un agente de enlazamiento multivalente, se forman agregados. Los agregados hacen disminuir las porciones de la muestra de no uniformidades magneticas microscopicas que perturban la senal T2 del solvente, llevando un incremento en la relajacion de T2 (vease figura 3).
La medicion de T2 es una medida sencilla de todas las rotaciones en el conjunto, mediciones que duran tlpicamente 1-10 segundos, lo que permite que el solvente se desplace cientos de micrones, una distancia larga con respecto a las no uniformidades microscopicas en la muestra llquida. Cada molecula de solvente muestrea un volumen en la muestra llquida y en la senal T2 es un promedio (senal total neta) de todas las moleculas (rotaciones nucleares) en el solvente en la muestra; en otras palabras, la medicion de T2 es una medicion neta del ambiente completo experimentado por una molecula de solvente, y es una medicion promedio de todas las no uniformidades microscopicas en la muestra.
La rata de relajacion T2 observada para las moleculas de solvente en la muestra llquida esta dominada por las partlculas magneticas, las cuales en la presencia de un campo magnetico forman momentos dipolares magneticos altos. En la ausencia de partlculas magneticas, las ratas de relajacion T2 observadas para una muestra llquida son tlpicamente largas (esto es, T2 (agua) = ~2000 ms, T2 (sangre) = ~1500 ms). A medida que la concentracion de partlculas se incrementa, las no uniformidades microscopicas en la muestra se incrementan y la difusion de solvente a traves de estas no uniformidades microscopicas lleva a un incremento en la incoherencia de la rotacion y a un descenso en el valor T2. El valor T2 observado depende de la concentracion de partlculas en una forma no lineal, y de la capacidad de relajacion por parametro de partlcula.
En los ensayos de agregacion, el numero de partlculas magneticas, y si estan presentes el numero de las partlculas de aglomerante, permanece constante durante el ensayo. La distribucion espacial de las partlculas cambia cuando las partlculas se aglomeran. La agregacion cambia la “experiencia” promedio de una molecula de solvente puesto que la localizacion de la partlcula en los aglomerados es promovida mas que incluso las distribuciones de partlculas. A un alto grado de agregacion, muchas moleculas de solvente no experimentan no uniformidades microscopicas creadas por partlculas magneticas y la T2 se aproxima a la del solvente. A medida que la fraccion de partlculas magneticas agregadas se incrementa en una muestra llquida, la T2 observada es el promedio de la suspension no uniforme de partlculas magneticas agregadas e individuales (no agregadas). Los ensayos de la invencion estan disenados para maximizar el cambio en T2 sin agregacion para incrementar la sensibilidad del ensayo a la presencia de analitos y a diferencias en la concentracion de analito.
El diseno de biosensores de conmutacion de relajacion magnetica (MRSw), es importante considerar los mecanismos de relajacion de las partlculas magneticas. Primero, en el caso de las partlculas superparamagneticas las capacidades de relajacion longitudinales y transversas del solvente (definidas como R1 = 1/T1 y R2 = 1/T2, respectivamente) son una funcion del tamano de partlcula. Adicionalmente, R2 y R2* (donde R2* =1/T2*, R2* =R2+AwF, donde Awf es el desfase debido a la deshomogeneidades de campo) se incrementan con el diametro de partlcula hasta aproximadamente 100 nm, y luego R2 disminuye con el incremento del tamano de partlcula y la R2* alcanza una meseta para campos uniformes (vease figura 4A). Las partlculas superparamagneticas se dividen tlpicamente en categorlas de partlculas magnetizadas fuertemente y partlculas magnetizadas debilmente, con base en la magnitud relativa de la diferencia en frecuencia de precesion entre los nucleos y la superficie de la partlcula y los nucleos distantes de la partlcula, Aw, y el retardo del inter-eco de la secuencia de detection de CPMG, tcp. Aw es esencialmente una medida relativa del efecto del campo magnetico dipolar generado por una partlcula superparamagnetica sobre la frecuencia resonante de los nucleos de hidrogeno en moleculas de agua adyacentes. Cuando el producto AwtCP > 1 entonces las partlculas son clasificadas como fuertemente magnetizadas y cuando AwtCP < 1 entonces las partlculas son clasificadas como debilmente magnetizadas. Para relaxometros tlpicos, tcp no es mas corta que decimas de microsegundos, de tal manera que Aw debe ser menor de 105 para las partlculas que estan dentro del regimen magnetizado debilmente. La mayorla de las partlculas superparamagneticas utilizadas para los ensayos MRSw tienen una superficie de desfase Aw de aproximadamente 1x107, por lo tanto son clasificadas como fuertemente magnetizadas. Esto significa que el retardo inter-eco siempre es mas largo que la cantidad de desfase que ocurre en la superficie de una partlcula.
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Otra caracterlstica de las soluciones de partlcuias superparamagneticas que se utiliza para diferenciar el comportamiento flsico es el tiempo de difusion, o tiempo de viaje, de agua (td) con respecto al tiempo inter-eco de la secuencia de pulsos, tcp. Las soluciones de partlculas estan en el limite de eco largo cuando la td es significativamente menor que tcp. La tD puede ser determinada por la relacion:
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(1),
en donde td es el tiempo que toma para una molecula de agua difundirse a traves de la distancia del radio partlcula, R, y D la constante difusion de agua, 10-9 m2/s. td puede ser considerada como el tiempo que toma para que una molecula de agua pase a un hemisferio de una partlcula, o un tiempo de vuelo. Cuando td es mucho mas grande que tcp, entonces el sistema de partlculas esta dentro del “limite de eco corto”. La secuencia CPMG tipicas tienen limites de eco del orden de cientos de microsegundos a varios miles segundos. Por lo tanto, el “limite de eco corto” no puede ser aproximado a menos que el diametro de partlcula se aproxime a 1000 nm. Los biosensores de MRSw mas comunes estan dentro del “limite de eco largo” puesto que la longitud de los retardos inter-eco (tcp > 0.25 ms) es mas larga que el tiempo que toma para una molecula de agua difundirse pasando la hemiesfera de una partlcula (0.2 - 100 microsegundos).
A medida que el tamano de partlcula de una solucion de partlculas superparamagneticas una concentracion fija de hierro se incrementa hay un incremento inicial en R2, luego una meseta y luego un descenso (figura 4A). El descenso al lado izquierdo de la curva se denomina el regimen de promedio de movimiento, denominandose el regimen en el medio como regimen de desfase estatico, y el regimen a la derecha se denomina la visita limitada o regimen de movimiento lento. Las fronteras entre los regimenes de promedio de movimiento y visita limitada pueden ser determinadas generando graficas tales como la mostrada en la figura 4A, o pueden ser determinadas por la relacion entre Aw y td. Si Awtd < 1, entonces el sistema esta en regimen de promedio de movimiento; si Awtd > 1, entonces el sistema esta en el regimen de visita limitada (tambien denominado el regimen de movimiento lento). A medida que el diametro de las partlculas se incrementa en el regimen de promedio de movimiento los ecos de reenfoque en la secuencia de pulsos CPMG no pueden reenfocar eficientemente la magnetizacion que ha sido desfasada por las partlculas, por lo tanto el incremento en el R2 (o descenso en T2). En otras palabras, los pulsos de reenfoque no pueden compensar el desfase incrementado por las partlculas mas grandes. La region plana de un regimen de desfase estatico es debida al R2 que esta siendo limitado por R2*. El r2 en descenso con diametro creciente en el regimen de visita limitada da como resultado que los pulsos de reenfoque son capaces de reenfocar el desfase causado por las partlculas. Tambien es evidente en la figura 4A que la R2 en el regimen de movimiento lento exhibe una dependencia del retardo inter-eco de la secuencia de eco de rotacion.
En un campo magnetico homogeneo, se puede determinar cual regimen se aplica una muestra comparando R2 con RF2*; los dos valores son identicos en el regimen de promedio de movimiento o de desfase estatico y son diferentes en el regimen de visita limitada. Sin embargo, en casos de campos no homogeneos, tales como los presentes en dispositivos de MR de mesa y portatiles, el T2* es dominado por el gradiente de campo. En efecto, el valor de T2 * medido no es indicativo de la partlcula o estado de tamano de aglomeracion de partlcula (figura 4B).
La forma de la respuesta a R2 como partlculas aglomeradas coincide en general con la tendencia esperada para el incremento del tamano de partlcula promedio. La similitud entre R2 de aglomerados de partlcula y de partlculas esfericas sugiere que se pueden igualar los agregados de partlculas y las formas esfericas. Aunque esta suposicion puede parecer estar en contradiccion con la naturaleza fractal de los aglomerados de partlculas, las formas de los aglomerados de partlculas observadas por la medicion de resonancia magnetica estan determinada por el conjunto de moleculas de agua en difusion que estan en solucion, las cuales pueden ser aproximadas por el radio de hidratacion medido por dispersion luminica.
Los modelos analiticos para R2 pueden ser aplicados a biosensores de relajacion magnetica para ayudar en el diseno de ensayos de biosensor. De manera conveniente, estos modelos predicen de manera exacta la dependencia de R2 en parametros que un disenador de biosensores puede controlar -concentracion de hierro, temperatura, susceptibilidad magnetica y tamano de partlcula. Adicionalmente, estos modelos adicionales permiten la modelacion predictiva de la dependencia de la relajacion de T2 en estos parametros. Los resultados no son completamente cuantitativos, pero las tendencias generales y las curvas de respuesta predichas por estos modelos pueden ser instructivas. Un modelo util es el modelo de intercambio quimico para esferas fuertemente magnetizadas:
(4/9)FrD(Aru,.)2
7 2 ~ 1 + (4/9)2(td/tcp)2a5
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en donde I/T2 es la capacidad de relajacion transversa, V la fraccion de volumen de hierro en solucion, td la difusion o tiempo de vuelo, Aw el desplazamiento de frecuencia en la superficie de una partlcula con respecto a un volumen de solucion, tcp es la mitad del retardo inter-eco en una secuencia CPMG, y a y b son constantes derivadas (a=1.34 y b=0.99). Las ecuaciones 2 y 3 pueden ser utilizadas para generar una curva que describe la dependencia de R2 en los tamanos de partlcula, como lo muestran las llneas clara y oscura en las figuras 4A y 4B (llnea oscura al lado derecho de la curva; llnea clara al lado izquierdo de la curva).
Puede utilizarse una modificacion en la ecuacion 2 para generar una grafica que es mas intuitiva para un desarrollador de ensayos. Esta grafica esta en terminos de T2 y de diametro de partlcula con unidades lineales en vez de unidades logarltmicas (figura 2). Como se discutio mas arriba, los ensayos con biosensor de relajacion magnetica funcionan debido una transicion entre los estados disperso y aglomerado. Para un ensayo de aglomeracion dado, la T2 medida puede seguir uno de los dos caminos en el transcurso de una titulacion de un analito. La poblacion de partlculas dispersa puede aglomerarse de una manera uniforme llevando un incremento en el tamano por medio de partlcula que es proporcional a la cantidad de analito que ha sido agregada. Este tipo de aglomeracion se denomina el modelo monodisperso puesto que llevarla una poblacion intermedia monodispersa de partlculas. En este caso, se esperarla que T2 disminuya a medida que se incrementa el tamano de partlcula en tanto el sistema este dentro del regimen de promedio de movimiento. A medida que el sistema se aproxima y entra al regimen de visita limitada el T2 se incrementarla con el tamano de partlcula (vease figura 4C).
Un tipo diferente de aglomeracion que puede ocurrir es aquel en el cual la adicion de un analito inicia el autoensamblaje de aglomerados, un proceso con energlas similares a la formacion de cristal o a la agregacion fractal. Para este modelo se esperarla un tamano preferido de aglomerados de partlculas que depende de las condiciones de la solucion. Los sistemas que siguen este modelo exhibirlan poblaciones intermedias polidispersas. Se encontrarla una mezcla de partlculas con tamanos discretos. Dadas dos poblaciones discretas, partlculas dispersadas y partlculas aglomeradas, el sistema harla transicion entre el valor T2 de la poblacion monodispersa de inicio de partlculas no aglomeradas y el valor T2 final de las partlculas completamente aglomeradas. Para ambos modelos, la titulacion puede llevar una solucion monodispersa de partlculas aglomeradas. Aunque la energetica, cinetica y termodinamica exactas de la aglomeracion de partlculas dependeran de las caracterlsticas del sistema de ensayo tales como valencia y afinidad de enlazamiento, estos dos modelos son instructivos en el entendimiento de las dependencias y posibles escenarios que se pueden encontrar durante el diseno de un biosensor por MRSw.
Hay dos reglmenes para la aglomeracion de partlculas y T2 los afecta con base en el tamano de partlcula (vease figura 4D, la frontera es tlpicamente cerca de 100 nm de diametro de partlculas). Para cualquier ensayo dado de una muestra llquida el recuento de partlculas para partlculas magneticas de tamano de 250 nm puede ser cercano a 1x107 partlculas, mientras que para partlculas magneticas con tamanos de 30 nm puede ser cercano a 1x1013. Esto se debe a que las partlculas mas pequenas tienen una capacidad de relajacion inferior por partlcula (para el mismo tipo de material), dando como resultado una desventaja en sensibilidad inherente. En un ensayo tlpico de la invention, las partlculas magneticas se seleccionan de tal manera que T2 se incrementa con un incremento en la fraccion de partlculas agregadas.
El ensayo puede ser disenado para cambiar la direction de T2 en la presencia de analito (veanse figuras 5A-5C). Por ejemplo, el ensayo puede ser un inmunoensayo en sandwich aglomerante en el cual dos poblaciones de partlculas magnetica se enlazan a diferentes epltopos de un analito (vease figura 5A); un ensayo comparativo en el cual el analito compite con agentes de enlazamiento multivalentes para inhibir la agregacion de partlculas magneticas (vease figura 5B); o una aglomeracion mediada por hibridacion en la cual dos poblaciones de partlculas magneticas se enlazan una primera y segunda portion de un oligonucleotido (vease figura 5C). Un formato competitivo adicional puede incluir cuando dos unidades estructurales de enlazamiento de partlculas se enlazan sin aglomerante (por ejemplo, los oligonucleotidos de ADN estan disenados de tal manera que dos nanopartlculas tienen dos oligos diferentes y pueden fusionarse entre si y cuando se calientan el analito o el amplicon o el ADN diana compiten o interrumpen la fusion np).
Pueden utilizarse otros formatos para llevar a cabo los ensayos, tales como: (i) una muestra diana puede ser incubada en la presencia de una partlcula magnetica que ha sido cubierta con unidades estructurales de enlazamiento especlficas para un analito diana y un agente de enlazamiento multivalente, en un ensayo de inhibition el enlazamiento del analito a las partlculas magneticas bloquea la aglomeracion de las partlculas magneticas con el agente de enlazamiento multivalente; (ii) una muestra diana puede ser incubada en la presencia de una partlcula magnetica que ha sido cubierta con unidades estructurales de enlazamiento especlficas para un analito diana y un agente de enlazamiento multivalente, en un ensayo de desagregacion el analito esta expuesto a
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un agregado preformado del agente de enlazamiento multivalente y la partlcula magnetica y el analito desplaza el agente de enlazamiento multivalente para reducir la agregacion en la muestra llquida; o (iii) una muestra diana puede ser incubada en la presencia de una partlcula magnetica que ha sido cubierta con unidades estructurales de enlazamiento especlficas para un analito diana y el analito diana en si mismo para formar una poblacion sencilla de autoensamblaje de partlculas magneticas, en un ensayo de inhibicion o un ensayo de desagregacion la presencia del enlazamiento del analito a las partlculas magneticas bloquea la autoaglomeracion de las partlculas magneticas; o (iv) una muestra diana puede ser incubada en la presencia de un agente aglomerante soluble y una partlcula
magnetica cubierta con el analito o un analogo del analito, en un ensayo de inhibicion la presencia del analito se
enlaza al agente de aglomeracion soluble que bloquea la aglomeracion de las partlculas.
Cuando se emplea un agente de enlazamiento multivalente (aglomerante), multiples analitos son enlazados a un portador (por ejemplo, un armazon sintetico simple, o una protelna portadora mas grande o polisacarido, tal como BSA, transferrina o dextrano).
Partlculas magneticas
Las partlculas magneticas descritas aqul incluyen las descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 7,564,245 y la Publicacion de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003-0092029. Las partlculas magneticas estan generalmente en la forma de conjugados, esto es, una partlcula magnetica con una o mas unidades estructurales de
enlazamiento (por ejemplo, un oligonucleotido, acido nucleico, polipeptido o polisacarido) unidas a la misma. La
unidad estructural de enlazamiento produce una interaccion especlfica con un analito diana. La unidad estructural de enlazamiento se enlaza especlficamente a un analito diana seleccionado, por ejemplo, un acido nucleico, polipeptido o polisacarido. En algunos casos, el enlazamiento produce la agregacion de los conjugados, dando resultado un cambio, por ejemplo, un descenso (por ejemplo, en el caso de partlculas magneticas mas pequenas) o un incremento (por ejemplo, en el caso de partlculas magneticas mas grandes), en el tiempo de relajacion giro-giro (T2) de protones de agua adyacentes en una solucion acuosa (o protones en un solvente no acuoso). Alternativamente, el analito se enlaza a un agregado preformado en un ensayo de desagregacion competitiva (por ejemplo, un agregado formado a partir de un agente de enlazamiento multivalente y partlculas magneticas), o compite con un agente de enlazamiento multivalente para unidades estructurales de enlazamiento sobre las partlculas multivalentes en un ensayo de inhibicion (esto es, la formacion de agregados es inhibida en la presencia del analito).
Los conjugados tienen alta capacidad de relajamiento obedeciendo al superparamagnetismo de sus materiales de hierro, oxido metalico u otros ferro o ferrimagneticos. Los compuestos de hierro, cobalto y nlquel y sus aleaciones, elementos de tierras raras tales como gadolinio y ciertos intermetalicos tales como oro y vanadio son ferromagnetos que pueden ser utilizados para producir partlculas superparamagneticas. Las partlculas magneticas pueden ser monodispersas (un cristal individual de un material magnetico, por ejemplo oxido metalico, tal como oxido de hierro superparamagnetico, por partlcula magnetica) o polidispersos (por ejemplo, una pluralidad de cristales por partlcula magnetica). El oxido de metal magnetico tambien puede incluir cobalto, magnesio, zinc, o mezclas de estos metales con hierro. Caracterlsticas y elementos importantes de las partlculas magneticas que son utiles para producir conjugados incluyen: (i) una alta capacidad de relajacion, esto es, fuerte efecto sobre la relajacion del agua (u otro solvente), (ii) un grupo funcional al cual la unidad estructural de enlazamiento puede unirse covalentemente, (iii) un bajo enlazamiento inespeclfico de unidades estructurales interactivas a la partlcula magnetica, y/o (iv) estabilidad en solucion, esto es, las partlculas magneticas permanecen suspendidas en solucion, no se precipitan y/o las nps retienen su capacidad de ser empleadas en el metodo descrito (esto es, las nps tienen una vida util).
Las partlculas magneticas pueden estar enlazadas a las unidades estructurales de enlazamiento a traves de grupos funcionales. En algunas realizaciones, las partlculas magneticas pueden estar asociadas con pollmeros que incluyen grupos funcionales seleccionados, en parte, para potenciar la reversibilidad no especlfica de las partlculas magneticas. El pollmero puede ser un pollmero sintetico, tal como, pero no limitado a, polietilenglicol o silano, pollmeros naturales, o derivados de pollmeros sinteticos o naturales o una combinacion de estos. El pollmero puede ser hidrofllico. En algunas realizaciones, el “recubrimiento” polimerico no es una pellcula continua alrededor del oxido metalico magnetico sino una “malla” o “nube” de cadenas de pollmeros extendidas unidas y circundando el oxido metalico. El pollmero puede incluir polisacaridos y derivados, incluyendo dextrano, pulanano, carboxidextrano, carboximetildextrano, y/o carboximetil dextrano reducido. El oxido metalico puede ser una coleccion de uno o mas cristales que entran en contacto uno con otro, o que estan atrapados individualmente o rodeados por el pollmero.
Alternativamente, las partlculas magneticas pueden estar asociadas con composiciones de grupos funcionales no polimericos. Se describen metodos para sintetizar partlculas magneticas estabilizadas, funcionalizadas sin pollmeros asociados, por ejemplo, en Halbreich et al., Biochimie, 80:379 (1998).
Las partlculas magneticas incluyen tlpicamente mono y policristales de oxidos metalicos de aproximadamente 1-25 nm, por ejemplo, aproximadamente 3-10 nm, o aproximadamente 5 nm de diametro por cristal. Las partlculas magneticas pueden incluir tambien un componente polimerico en la forma de un nucleo y/o recubrimiento, por ejemplo, aproximadamente de 5 a 20 nm de espesor o mas. Las partlculas magneticas pueden ser preparadas de una variedad de maneras. Se prefiere que la partlcula magnetica tenga grupos funcionales que enlacen la partlcula
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magnetica a la unidad estructural de enlazamiento. Pueden hacerse partlcuias magneticas con funcion carboxi, por ejemplo, de acuerdo con el metodo de Gorman (vease Publicacion PCT No. WO00/61191). En este metodo, se sintetiza carboximetildextrano (CM) reducido a partir de dextrano comercial. El CM-dextrano y las sales de hierro se mezclan entre si y luego son neutralizadas con hidroxido de amonio. Las partlculas magneticas con funcion carboxi resultantes pueden ser utilizadas para el acoplamiento de oligonucleotidos con funcion amino. Las partlculas magneticas con funcion carboxi tambien pueden hacerse a partir de partlculas magneticas recubiertas con polisacaridos por reaccion con bromo o acido cloroacetico en base fuerte para unir grupos carboxilo. Ademas, las partlculas con funcion carboxi pueden hacerse a partir de partlculas magneticas con funcion amino convirtiendo los grupos amino a carboxi mediante el uso de reactivos tales como anhldrido succlnico o anhldrido maleico.
El tamano de la partlcula magnetica puede ser controlado ajustando las condiciones de reaccion, por ejemplo, utilizando baja temperatura durante la neutralizacion de sales de hierro con una base tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,262,176. Tambien pueden hacerse materiales con tamano de partlcula uniforme fraccionando las partlculas utilizando centrifugacion, ultrafiltracion, o filtracion por gel, segun se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,492,814.
Tambien pueden sintetizarse partlculas magneticas de acuerdo con el metodo de Molday (Molday, R.S. and D. MacKenzie, “Immunospecific ferromagntic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells”, J. Immunol. Methods, 52:353 (1982)), y tratadas con peryodato para formar grupos aldehldo. Las partlculas magneticas que contienen aldehldo pueden hacerse reaccionar entonces con una diamina (por ejemplo etilendiamina o hexanodiamina), la cual formara una base de Schiff, seguida por reduccion con borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio.
Las partlculas magneticas recubiertas con dextrano pueden hacerse y entrecruzarse con epiclorohidrina. La adicion de amonlaco reacciona con grupos epoxi para generar grupos amina, vease Hogemann, D., et al., Improvement of MRI probes a allow efficient detection of gene expression Bioconjug. Chem., 11:941 (2000), y Josephson et al., “High-efficiency intracelular magnetic labeling with novel superparamagnetic-Tat peptide conjugates”, Bioconjug. Chem., 10:186 (1999). Este material tambien es conocido como un oxido de hierro entrecruzado o “CLIO” y cuando se funcionaliza con la amina se denomina como amina-CLIO o NH2-CLIO. Las partlculas magneticas con funcion carboxi pueden ser convertidas en partlculas magneticas con funcion amino mediante el uso de carbodiimidas y diaminas solubles en agua tales como etilendiamina o hexanodiamina.
Las partlculas magneticas pueden formarse a partir de un ferrofluido (esto es, una suspension coloidal estable de partlculas magneticas). Por ejemplo, la partlcula magnetica puede ser una composition que incluye multiples cristales de oxidos metalicos del orden de unos pocos decimos de nanometros en tamano y se dispersa en un fluido que contiene un surfactante, el cual se adsorbe sobre las partlculas y las estabiliza, o por precipitation, en un medio basico, de una solution de iones metalicos. Ferrofluidos adecuados son vendidos por la companla Liquids Research Ltd. bajo las referencias WHKS1S9 (A, B o C), la cual es un ferrofluido basado en agua que incluye magnetita (Fe3O4), con partlculas de 10 nm de diametro; WHJS1 (A, B o C), la cual es un ferrofluido basado en isoparafina que incluye partlculas de magnetita (Fe3O4) de 10 nm de diametro; y dextrano BKS25, el cual es un ferrofluido basado en agua estabilizado con dextrano, que incluye partlculas de magnetita (Fe3O4) de 9 nm de diametro. Otros ferrofluidos adecuados para uso en los metodos de la invention son ferrofluidos estabilizados con acido oleico disponibles de Ademtech, los cuales inlcuyen cerca de 70% en peso de partlculas de a-Fe2O3 (cerca de 10 nm de diametro), 15% en peso de octano y 15% en peso de acido oleico.
Las partlculas magneticas son tlpicamente una composicion que incluye multiples cristales de oxido metalico y una matriz organica, y que tienen una superficie cubierta con grupos funcionales (esto es, grupos amino o grupos carboxi) para el enlazamiento de las unidades estructurales de union a la superficie de la partlcula magnetica. Por ejemplo, las partlculas magneticas utiles en los metodos de la invencion incluyen las que son comercialmente disponibles en Dynal Seradyn, Kisker, Miltenyi Biotec, Chemicell, Anvil, Biopal, Estapor, Genovis, Thermo Fisher Scientific, JSR micro, Invitrogen, y Ademtech, as! como las descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,101,435; 4,452,773; 5,204,457; 5,262,176; 5,424,419; 6,165,378; 6,866,838; 7,001,589; y 7,217,457.
La avidina o la estreptavidina pueden ser unidas a partlculas magneticas para uso con una unidad estructural de enlazamiento biotinilada, tal como un oligonucleotido o polipeptido (vease, por ejemplo, Shen et al., "Magnetically labeled secretin retains receptor affinity to pancreas acinar cells," Bioconjug. Chem., 7:311 (1996)). De la misma manera, la biotina puede ser unida una partlcula magnetica para uso con una unidad estructural de enlazamiento marcada con avidina. Alternativamente, la unidad estructural de enlazamiento esta unida covalentemente a la superficie de la partlcula magnetica; las partlculas pueden ser cubiertas con moleculas de IgG; las partlculas pueden ser cubiertas con anticuerpos anti his; o las partlculas pueden ser cubiertas con FAbs etiquetados con his.
Los materiales de bajo peso molecular pueden ser separados de las partlculas magneticas por ultrafiltracion, dialisis, separation magnetica u otros medios antes de su uso. Por ejemplo, las unidades estructurales de enlazamiento sin reaccionar y los agentes de enlazamiento pueden ser separados de las partlculas magneticas conjugadas por separacion magnetica o cromatografla por exclusion por tamano. En ciertos casos las partlculas magneticas pueden
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ser fraccionadas por tamano para producir mezcla de partlcuias de un rango de tamano y diametro promedio particulares.
Para ciertas disposiciones divulgadas que requieren alta sensibilidad, la deteccion de un analito utilizando ensayos de relajacion de T2 pueden requerir la seleccion de una partlcula apropiada para permitir una aglomeracion inducida por analito suficientemente sensible. Pueden obtenerse sensibilidades mas altas utilizando partlculas que contienen multiples nucleos de oxido de hierro superparamagneticos (5-15 nm de diametro) dentro de una matriz polimerica mas grande individual o un ensamblaje ferrofluido (100 nm-1200 nm de diametro total, tal como las partlculas que tienen un diametro promedio de 100 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 500 nm, 800 nm, o 1000 nm), o utilizando materiales o partlculas con un momento magnetico mas alto con densidad mas alta, y/o partlculas con un contenido de hierro mas alto. Sin limitarse por la teorla, se postula que estos tipos de partlculas proveen una ganancia de sensibilidad de mas de 100x debido a un numero mucho mas alto de atomos de hierro por partlcula, lo que se considera que lleva a un incremento en la sensibilidad debido al numero disminuido de partlculas presentes en la solucion de ensayo y posiblemente una cantidad mas alta de hierro superparamagnetico afectado por cada evento de aglomeracion.
La capacidad de relajacion por partlcula y tamano de partlcula es un termino util para seleccionar una partlcula optima para ensayos de alta sensibilidad. Idealmente, este termino sera tan grande como sea posible. La relajacion por partlcula es una medida del efecto de cada partlcula sobre el valor T2 medido. Cuanto mayor sea este numero, menor es el numero de partlculas necesarias para provocar una respuesta T2. Adicionalmente, la disminucion de la concentracion de partlculas en la solucion reactiva puede mejorar la sensibilidad analltica del ensayo. La capacidad de relajacion por partlcula puede ser un parametro mas util en cuanto a la densidad del hierro y la capacidad de relajacion pueden variar de partlcula magnetica a partlcula magnetica, dependiendo de los componentes utilizados para hacer las partlculas (vease Tabla 1). La capacidad de relajacion por partlcula es proporcional a la magnetization por saturation de un material superparamagnetico.
Tabla 1.
Diametro hidrodinamico (nm)
# de atomos metalicos por partlcula Capacidad de relajacion por partlcula (mM‘ 1 s-1)
10-30
1.0E+03 - 1.0E+06 1.0E+6 - 1.0E+11
10-50
8.0E+02 - 4.0E+04 1.0E+04 - 4.0E+06
10-50
1.0E+04 - 5.0E+05 1.0E+06 - 1.0E+08
50-100
1.0E+04 - 1.0E+07 1.0E+06 - 1.0E+09
100-200
5.0E+06 - 5.0E+07 5.0E+08 - 8.0E+09
200-300
1.0E+07 - 1.0E+08 3.0E+09 - 1.0E+10
300-500
5.0E+07 - 1.0E+09 7.0E+09 - 5.0E+10
500-800
1.0E+08 - 4.1E+09 1.0E+10 - 5.0E+11
800-1000
5.0E+08 - 5.0E+09 5.0E+10 - 5.0E+11
1000-1200
1.0E+09 - 7.0E+09 1.0E+11 - 1.0E+12
La partlcula base divulgada para uso en los sistemas y metodos puede ser cualquiera de las partlculas comercialmente disponibles identificadas en la Tabla 2.
Tabla 2.
Catalogo No.
Fuente/Descripcion Diametro (pm)
Kisker
MAv-1
Poliestireno, Partlculas magneticas recubiertas con Avidina 1.0-1.9
PMSt-0.6
Poliestireno, Partlculas magneticas recubiertas con estreptavidina 0.5-0.69
PMSt-0.7
Poliestireno, Partlculas magneticas recubiertas con estreptavidina 0.7-0.9
PMSt-1.0
Poliestireno, Partlculas magneticas recubiertas con estreptavidina 1.0-1.4
PMB-1
Poliestireno, Partlculas biotina covalentemente acoplada a BSA 1.0-1.9
PMP-200
Basado en dextrano, Sin recubrimiento, plano 0.2
PMP-1000
Basado en dextrano, Sin recubrimiento, plano 0.10
PMP-1300
Basado en dextrano, Sin recubrimiento, plano 0.13
PMP-2500
Basado en dextrano, Sin recubrimiento, plano 0.25
PMP-1300
Basado en dextrano, Recubierto con NH2- 0.13
PMN-2500
Basado en dextrano, Recubierto con HN2- 0.25
PMC-1000
Basado en dextrano, Recubierto con COOH- 0.10
PMC-1300
Basado en dextrano, Recubierto con COOH- 0.13
PMC-2500
Basado en dextrano, Recubierto con COOH- 0.25
PMAV-1300
Basado en dextrano, Recubierto con avidina 0.13
PMAV-2500
Basado en dextrano, Recubierto con avidina 0.25
PMSA-1000
Basado en dextrano, Estreptococo cubierto con avidina 0.1
PMSA-1300
Basado en dextrano, Estreptococo cubierto con avidina 0.13
PMSA-2500
Basado en dextrano, Estreptococo cubierto con avidina 0.25
PMB-1000
Basado en dextrano, Recubierto con biotina 0.1
PMB-1300
Basado en dextrano, Recubierto con biotina 0.13
PMB-2500
Basado en dextrano, Recubierto con biotina 0.25
PMPA-1000
Basado en dextrano, Recubierto con Protelna 0.1
A
PMPA-1300
Basado en dextrano, Recubierto con Protelna A 0.13
PMPA-2500
Basado en dextrano, Recubierto con Protelna A 0.25
Kisker
PMC-0.1
Basado en dextrano, Funcionalizado con COOH 0.1-0.4
PMC-0.4
Basado en dextrano, Funcionalizado con COOH 0.4-0.7
PMC-0.7
Basado en dextrano, Funcionalizado con COOH 0.7-0.9
PMC-1.0
Basado en dextrano, Funcionalizado con COOH 1.0-1.4
PMN-1.0
Basado en dextrano, Funcionalizado con NH2 1.0-1.4
PMC-0.1
Basado en dextrano, Funcionalizado con COOH 0.1-0.4
Exactitud quimica
ADM01020
Funcionalidad carboxilo 0.2
ADM01030
Funcionalidad carboxilo 0.3
ADM02020
Funcionalidad carboxilo 0.2
ADM02133
funcionalidad carboxilo alta 0.3
ADM02150
Funcionalidad carboxilo 0.5
ADM02220
funcionalidad amino muy alta 0.2
ADM02230
funcionalidad amino muy alta 0.3
ADM02250
Funcionalidad carboxilo 0.5
ADM02030
funcionalidad carboxilo alta 0.3
ADM02110
funcionalidad carboxilo alta 0.1
ADM02120
funcionalidad carboxilo muy alta 0.2
ADM02130
funcionalidad carboxilo muy alta 0.3
ADM02252
Funcionalidad carboxilo 0.5
ADM03120
Funcionalidad estreptavidina 0.2
ADM03121
Funcionalidad estreptavidina 0.2
quimiocelda
1201-5 1
Si-(CH2)3-COOH 0.5
1201-5 1
Si-(CH2)3-COOH 0.75
1201-5 1
Si-(CH2)3-COOH 1.0
1202-5 1
Si-(CH2)3-SO3H 0.5
Kisker
1202-5 1
Si-(CH2)3-SO3H 0.75
1202-5 1
Si-(CH2)3-SO3H 1.0
1205-1
Si-(CH2)3-PO3H2 0.5
1205-1
Si-(CH2)3-PO3H2 0.75
1205-1
Si-(CH2)3-PO3H2 1.0
Estapor
M1-130/12
Poliestireno carboxilado 0.7-1.3
M1-180/12
Poliestireno carboxilado 0.9-1.3
M-180/20
Carboxilado Divinilbenceno 0.8-1.2
M-050/20
Poliestireno carboxilado 0.5-0.7
M-070/40
Poliestireno carboxilado 0.7-1.3
M-070/60
Poliestireno carboxilado 0.7-1.3
M-020/50
Poliestireno carboxilado 0.16-0.24
M-030/40
Poliestireno carboxilado 0.3-0.5
Genovis
AMI-25
Dextrano 80-150
Thermo Fisher
4515-2105
Modificado con carboxilato (MG-CM) 1.0
7815-2104
NeutrAvidina (MG-NA) 1.0
5915-2104
Etreptavidina (MG-SA) 1.0
2415-2105
Modificado con carboxilato (MG-CM) 1.0
4415-2105
Modificado con carboxilato (MG-CM) 1.0
JSR micro
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35
MB 100
Carboxilado 1.1
Invitrogen
354-01
Carboxilado 1
355-00
Activado con tosilo 1
Catalogo No.
Fuente/Descripcion Diametro (pm)
Kisker
650-11
Carboxilado 1
655-11
Activado con tosilo 1
Biopal
M02Q05
Activado con amino 1.5
M02Q05
Activado con biotina 1.5
M02Q05
Activado con estreptavidina 1.5
Se divulga que las partlcuias magneticas para uso en los sistemas y metodos de la invencion pueden tener un diametro hidrodinamico de 10 nm a 1200 nm, y contener un promedio de 8x102 - 1x1010 atomos metalicos por partlcula, y tener una capacidad de relajacion por partlcula de 1x104 - 1x1013 mM'V. Las partlculas magneticas usadas en los sistemas y metodos divulgados pueden ser cualquiera de los disenos, composiciones o fuentes descritas mas arriba, y pueden ser modificadas tal como se ha descrito aqul para uso como un conmutador de resonancia magnetica.
Ademas de la capacidad de relajacion por partlcula, deben abordarse otros varios problemas practicos en la seleccion y diseno de partlculas magneticas para ensayos de alta sensibilidad analltica.
Por ejemplo, el uso de partlculas grandes (esto es, 1000 nm o mayores) puede ser deseado para maximizar el contenido de hierro y la capacidad de relajacion por partlcula. Sin embargo, hemos observado que las partlculas de este tamano tienden a depositarse rapidamente desde la solucion. Hemos observado que el asentamiento de las partlculas no interfiere tlpicamente con el ensayo si se mantienen los tamanos de partlcula magnetica por debajo de 500 nm. Cuando el uso de una partlcula por encima de 500 nm en los ensayos descritos o se emplean partlculas mas pequenas con alta densidad, el asentamiento se monitoriza y se determina el efecto sobre la medicion de T2. Hemos encontrado que un tamano de partlcula magnetica de aproximadamente 100-300 nm es ideal para la estabilidad en terminos de asentamiento, incluso despues de la funcionalizacion (incrementando el diametro hidrodinamico a 300 nm en aproximadamente 50 nm), y para permitir la alta sensibilidad potenciada por una alta capacidad de relajacion por partlcula. La densidad de la partlcula juega ciertamente un papel en la resistencia. Como tal, la densidad relativa de la solucion y las partlculas juega un papel importante en el asentamiento de la partlcula. De acuerdo con lo anterior, una posible solucion a este problema es el uso de partlculas magneticas resistente (esto es, una partlcula hueca o una partlcula que contiene tanto una matriz de baja densidad como un oxido metalico de alta densidad). El asentamiento puede afectar la detection de T2, asl, pueden emplearse aditivos en solucion para cambiar la relation de la partlcula a la densidad de la solucion. La deteccion de T2 puede ser impactada por el asentamiento si hay un porcionamiento significativo del material superparamagnetico a partir del volumen medido de llquido. El asentamiento puede ser establecido diluyendo las partlculas una concentration tal que la absorbancia UV-Vis a 410 nm esta entre 0.6-0.8 unidades de absorbancia y luego monitorizando la absorbancia durante 90 minutos. Si ocurre el asentamiento, la diferencia entre las absorbancias inicial y final dividida por la absorbancia inicial sera mayor de 5%. Si el % de asentamiento esta por encima de 5% entonces la partlcula tlpicamente no es adecuada para uso en ensayos que requieran alta sensibilidad analltica. Las partlculas magneticas usadas en los ensayos de la invencion pueden ser, pero no se limitan a, partlculas magneticas que no se asientan. Un alto asentamiento representa dificultades de manipulation y puede llevar a problemas de reproducibilidad.
Para partlculas magneticas del orden de 100 nm o mayores, los multiples cristales de oxido de hierro superparamagnetico que incluyen tlpicamente el nucleo de la partlcula dan como resultado un momento dipolar neto
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cuando estan en la presencia de campos magneticos externos, esto es, el momento dipolar es una fuerza suficiente para superar el movimiento Browniano. La reversibilidad no especlfica es una medida de la estabilidad coloidal y de la robustez contra agregacion no especlfica. La reversibilidad no especlfica es establecida midiendo los valores T2 de una solucion de partlculas antes y despues de la incubacion en un campo magnetico uniforme (definido como <5000 ppm). Los valores T2 de inicio son tlpicamente 200 ms para una partlcula con una concentracion de Fe de 0.01 mM. Si la diferencia en los valores de T2 despues y antes de la incubacion en el campo magnetico uniforme es menor de 20 ms, las muestras se consideran reversibles. Adicionalmente, 10% es un umbral que permite que las mediciones de partida de T2 reflejen la concentracion de las partlculas del ensayo. Si la diferencia es mayor de 10%, entonces las partlculas exhiben irreversibilidad en el regulador, diluyentes y matriz probados. La reversibilidad de MMA de las partlculas magneticas puede ser alterada como se describe aqul. Por ejemplo, la estabilidad coloidal y la robustez contra la agregacion no especlfica pueden ser influenciadas por las caracterlsticas de superficie de las partlculas, las unidades estructurales de enlazamiento, el regulador de ensayo, la matriz y las condiciones de procesamiento del ensayo. El mantenimiento de la estabilidad coloidal y la resistencia al enlazamiento no especlfico pueden ser alterados por qulmica de conjugacion, metodos de bloqueo, modificaciones de regulador y/o cambios en las condiciones de procesamiento del ensayo.
Hemos observado que un atributo muy importante para ensayos robustos y reproducibles es la monodispersidad en la distribucion de tamano de las partlculas magneticas usadas, una distincion observada en partlculas polidispersas despues del recubrimiento contra partlculas monodispersas antes del recubrimiento. Los lotes polidispersos de partlculas magneticas pueden carecer de reproducibilidad y comprometer la sensibilidad. Las muestras polidispersas tambien pueden presentar problemas en terminos de alcanzar recubrimientos uniformes. Para ciertos ensayos altamente sensibles es deseable que las partlculas magneticas sean sustancialmente monodispersas en distribucion de tamano (esto es, que tengan un Indice de polidispersidad de menos de aproximadamente 0.8-0.9). Alternativamente, los ensayos pueden ser disenados para acomodar el uso de partlculas magneticas polidispersas.
Dado que los ensayos requieren una monitorizacion de un desplazamiento en los estados de aglomeracion de los ensayos de aglomeracion y que la medicion de un cambio en la aglomeracion requiere probablemente una fraccion significativa de partlculas aglomeradas (por ejemplo, considerado como >1-10%), el numero total de partlculas en un ensayo debe minimizarse para permitir la mas alta sensibilidad. Sin embargo, debe estar presente un numero suficiente de partlculas para permitir la utilization del rango dinamico de detection de T2. Hemos encontrado que la mayor sensibilidad se observa cuando el numero de partlculas magneticas (o su equivalente molar) es aproximadamente del mismo orden de magnitud que el numero (o equivalente molar) del analito que esta siendo detectado, y la magnitud del numero (o su equivalente molar) de agentes de enlazamiento multivalentes empleados (esto, en un ensayo de inhibition).
Para muestras proteinaceas tambien puede requerirse modificar la superficie de la partlcula magnetica para reducir el enlazamiento no especlfico de protelnas de fondo a las partlculas magneticas. El enlazamiento no especlfico de partlculas de fondo a las partlculas puede inducir o impedir la aglomeracion de las partlculas, dando como resultado senales falsas y/o carencia falsa de senales. Por ejemplo, en algunos casos la superficie de la partlcula magnetica puede incluir agentes de bloqueo enlazados covalentemente a la superficie de la partlcula magnetica lo cual reduce el enlazamiento no especlfico de las protelnas de fondo. Hay una variedad de agentes que se podlan utilizar para alcanzar el efecto deseado, y en algunos casos, es una combination de agentes que es optima (vease Tabla 3; partlculas, recubrimiento y unidades estructurales de enlazamiento apropiados).
Tabla 3.
NP-COOH:
Partlcula base
Recubrimiento
Aminodextrano
Transferrina
Lisozima
BSA
FSG
BGG
Ovalbumina
Unidad estructural de enlazamiento
Molecula pequena
Amino PEG
Albumina humana
Ninguno Anticuerpo
Amino PEG
BSA
Aminodextrano
NP-amino:
Ninguno Molecula pequena
PEG
NP-SA:
Ninguno Ab biotinilado
Amino PEG biotinilado Anticuerpo
NP-SA:
Amino PEG biotinilado Molecula pequena
NP-antiespecie:
Ninguno Anticuerpo
NP-Ni:
Ninguno Anticuerpo etiquetado con his
As! como hemos encontrado que un bloque de protelna puede ser requerido para alcanzar actividad y sensibilidad en el ensayo, particularmente en muestras proteinaceas (por ejemplo, muestras de plasma o muestras de sangre entera), que es compatible con los resultados en muestras de regulador no proteinaceas. Algunos bloqueadores de 5 protelna usados comunmente que pueden ser utilizados en las preparaciones provistas incluyen, por ejemplo, albumina de suero bovino (BSA), gelatina de piel de pez (FSG), gammaglobulina bovina (BGG), lisozima, caselna, peptidasa y leche en polvo no grasa. En ciertas realizaciones un recubrimiento de partlcula magnetica incluye BSA o FSG. En otras realizaciones, una combinacion de recubrimiento son combinaciones de aquellos recubrimientos de ejemplo que aparecen en la lista de la Tabla 3.
10 Adicionalmente, el enlazamiento no especlfico puede deberse a llpidos u otras moleculas no proteinaceas en la muestra biologica. Para enlazamiento no especlfico mediado por elementos no proteinaceos, pueden seleccionarse cambios en pH y en la fuerza ionica del regulador para potenciar las fuerzas repulsivas de las partlculas, pero no suficiente para limitar los resultados de las interacciones buscadas.
Reactivos de ensayo
15 Los ensayos de la invencion pueden incluir reactivos para reducir el enlazamiento no especlfico a las partlculas magneticas. Por ejemplo, el ensayo puede incluir una o mas protelnas (por ejemplo, albumina, gelatina de piel de pez, lisozima o transferrina); aminas de bajo peso molecular (<500 daltons) (por ejemplo, aminoacidos, glicina, etilamina o mercaptoetanol amina); y/o agentes con superficie activa no ionicos solubles en agua (por ejemplo, polietilenglicol, Tween® 20, Tween® 80, Pluronic® o Igepal®) (vease Tabla 4).
20 Tabla 4.
Agentes bloqueadores
PEG
BSA- Albumina de suero bovino
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Agentes bloqueadores
HSA-Albumina de suero humano
FSG- Gelatina de piel de pez
Lisozima
Transferrina
Glicina u otras moleculas que contienen aminas pequenas
Etilamina
Mercaptoetanol amina
Tween 20
Tween 80
Pluronic
Igepal
Triton X-100
Otros surfactantes/detergentes
El surfactante puede ser seleccionado de una amplia variedad de agentes con actividad superficial no ionicos solubles incluyendo surfactantes que estan disponibles comercialmente en general bajo el nombre comercial IGEPAL de gAf Company. Los surfactantes no ionicos llquidos IGEPAL son compuestos de polietilenglicol p- isooctilfenil eter que estan disponibles en diversas designaciones de peso molecular por ejemplo IGEPAL CA720, IGEPAL CA630, e IGEPAL CA890. Otros surfactantes no ionicos adecuados incluyen los disponibles bajo el nombre comercial TETRONIC 909 de BASF Wyandotte Corporation. Este material es un copollmero de bloque tetrafuncional surfactante que termina en grupos hidroxilo primarios. Surfactantes no ionicos adecuados tambien estan disponibles bajo el nombre comercial VISTA ALPHONIC de Vista Chemical Company y tales materiales son etoxilados que son biodegradables no ionicos derivados de mezclas de alcoholes primarios lineales de diversos pesos moleculares. El surfactante tambien puede ser seleccionado de poloxameros, tales como copollmeros de bloque de poliexietileno- polioxipropileno, tales como los disponibles bajo los nombres comerciales Synperonic PE series (ICI), Pluronic® series (BASF), Supronic, Monolan, Pluracare y Plurodac, surfactantes de polisorbato, tales como Tween® 20 (sorbitan monolaurato PEG-20), y glicoles tales como etilenglicol y polietilenglicol.
Tales surfactantes no ionicos pueden ser seleccionados para proveer una cantidad apropiada de detergencia para un ensayo sin tener un efecto nocivo sobre las reacciones del ensayo. En particular, los surfactantes pueden ser incluidos en una mezcla de reaccion con el proposito de suprimir interacciones no especlficas entre diversos ingredientes de los ensayos de agregacion. Los surfactantes no ionicos se agregan tlpicamente a la muestra llquida antes en una cantidad que va de 0.01% (p/p) a 5% (p/p).
Los surfactantes no ionicos pueden ser usados en combinacion con una o mas protelnas (por ejemplo, albumina, gelatina de piel de pez, lisozima o transferrina) agregados tambien a la muestra llquida antes en una cantidad que va de 0.01% (p/p) a 5% (p/p).
Adicionalmente, los ensayos, metodos y unidades de cartucho pueden incluir componentes reguladores adecuados adicionales (por ejemplo, base Tris, seleccionada para proveer un pH de aproximadamente 7.8 a 8.2 en el medio de reaccion); y agentes quelantes para consumir cationes (por ejemplo, EDTA disodio, acido etilen diamino tetraacetico (EDTA), acido cltrico, acido tartarico, acido glucuronico, acido sacarico o sales adecuadas de los mismos.
Unidades estructurales de enlazamiento
En general, una unidad estructural de enlazamiento es una molecula, sintetica o natural, que se enlaza
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especlficamente o se une de alguna otra manera, por ejemplo, una molecula diana, covalente o no covalentemente, o se hibridiza con ella, o con otra unidad estructural (o, en ciertas realizaciones, con una molecula que induce la agregacion). Por ejemplo, la unidad estructural de enlazamiento puede ser un anticuerpo dirigido hacia un antlgeno o una interaccion protelna-protelna. Alternativamente, la unidad estructural de enlazamiento puede ser un polisacarido que se enlaza una diana correspondiente o a un oligonucleotido sintetico que hibrida a un acido nucleico diana complementario especlfico. En ciertas realizaciones, las unidades estructurales de enlazamiento pueden ser disenadas o seleccionadas para servir, cuando se unen a otra unidad estructural de enlazamiento, como sustratos para una molecula diana tal como una enzima en solucion.
Las unidades estructurales de enlazamiento incluyen, por ejemplo, unidades estructurales de enlazamiento de oligonucleotidos (ADN, ARN, o sustitutos de nucleotidos sustituidos o derivados), unidades estructurales de enlazamiento a polipeptidos, unidades estructurales de enlazamiento a anticuerpos, aptameros, y unidades estructurales de enlazamiento a polisacaridos.
Unidades estructurales oligonucleotido de enlazamiento
En ciertas realizaciones, las unidades estructurales oligonucleotidos, unidos/enlazados a las partlculas magneticas utilizando cualquiera de una variedad de qulmicas, mediante un enlace sencillo, por ejemplo, covalente, por ejemplo en el extremo 3' o 5' de un grupo funcional sobre la partlcula magnetica. Tales unidades estructurales de enlazamiento pueden ser utilizadas en los sistemas, dispositivos y metodos para detectar mutaciones (por ejemplo, SNPs, translocaciones, eliminaciones grandes, eliminaciones pequenas, inserciones, sustituciones) o para monitorizar la expresion genetica (por ejemplo, la presencia de expresion, o cambios en el nivel de la expresion genetica, monitorizacion de transcripcion de ARN), o analisis CHP caracterlstico de la presencia de un patogeno, estado de enfermedad, o la progresion de una enfermedad.
Una unidad estructural de enlazamiento oligonucleotidos puede ser construida utilizando slntesis qulmica. Una unidad estructural de enlazamiento ADN de doble cadena puede ser construida mediante reacciones de ligazon enzimatica utilizando procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, un acido nucleico (por ejemplo, un oligonucleotido) puede ser sintetizado qulmicamente utilizando nucleotidos de origen natural o nucleotidos modificados de manera diversa disenados para incrementar la estabilidad biologica de las moleculas o para incrementar la estabilidad flsica del duplex formado entre las cadenas complementarias, por ejemplo, se pueden usar derivados de fosforotioato y nucleotidos sustituidos con acridina. El acido nucleico tambien puede ser producido biologicamente utilizando un vector de expresion en el cual ha sido subclonado un acido nucleico.
Un metodo utiliza al menos dos poblaciones de partlculas magneticas de oligonucleotidos, cada una con fuertes efectos sobre la relajacion del agua (u otros solventes). A medida que los conjugados de oligonucleotido-partlcula magnetica reaccionan con un oligonucleotido diana, forman agregados (por ejemplo, agregados de partlculas magneticas). Por reposo prolongado, por ejemplo, durante la noche a temperatura ambiente, los agregados forman aglomeraciones grandes (aglomeraciones de tamano de micrones). Usando los metodos, la formation de aglomeraciones grandes puede lograrse mas rapidamente empleando ciclos multiples de aglomeracion asistida magnetica. La resonancia magnetica se utiliza para determinar las propiedades de relajacion del solvente, las cuales se alteran cuando la mezcla de oligonucleotidos magneticos-partlculas magneticas reacciona con un acido nucleico diana para formar agregados.
Ciertas realizaciones emplean una mezcla de al menos dos tipos de partlculas magneticas de oxido metalico magnetico, cada una con una secuencia especlfica de oligonucleotido, y cada una con mas de una copia del oligonucleotido unido, por ejemplo, por via covalente, por partlcula magnetica. Por ejemplo, el protocolo del ensayo puede involucrar preparar una mezcla de poblaciones de conjugados de oligonucleotidos-partlcula magnetica y hacer reaccionar la mezcla con acido nucleico diana. Alternativamente, los conjugados de nucleotido-partlcula magnetica pueden hacerse reaccionar con la diana en una forma secuencial. Ciertas realizaciones presentan el uso de resonancia magnetica para detectar la reaction de los conjugados de oligonucleotidos-partlcula magnetica con el acido nucleico objetivo. Cuando esta presente una diana, los conjugados dispersos se autoensamblan para formar pequenos agregados.
Por ejemplo, las unidades estructurales de enlazamiento oligonucleotidos pueden enlazarse al oxido metalico a traves de union covalente a un pollmero funcionalizado o a oxidos metalicos funcionalizados en superficie no polimericos. En este ultimo metodo, las partlculas magneticas pueden ser sintetizadas de acuerdo con el metodo de Albrecht et al., Biochimie, 80:379 (1998). El acido dimercaptosucclnico es acoplado al oxido de hierro y provee un grupo funcional carboxilo.
En ciertas realizaciones, los oligonucleotidos se unen a partlculas magneticas a traves de un pollmero funcionalizado asociado con el oxido metalico. En algunas realizaciones, el pollmero es hidrofllico. En ciertas realizaciones, los conjugados se hacen utilizando oligonucleotidos que tienen grupos amino, sulfihidrilo o fosfato terminal, y partlculas magneticas de oxido de hierro superparamagneticas que portan grupos amino o carboxi sobre un pollmero hidrofilico. Hay varios metodos para sintetizar partlculas magneticas derivadas con carboxi y amino.
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En una realizacion, los oligonucleotidos se unen una partlcuia a traves de interaccion de enlazamiento ligando- protelna, tal como biotina-estreptavidina, en donde el ligando es unido covalentemente al oligonucleotido y la protelna a la partlcula, o viceversa. Esta metodologla puede permitir una preparacion de reactivo mas rapida.
Pueden usarse otras formas de oligonucleotidos. Por ejemplo, los aptameros son oligonucleotidos de ARN o ADN de cadena sencilla de 15 a 16 bases de longitud que en solucion forman interacciones intramoleculares que pliegan la molecula de acido nucleico lineal en un complejo tridimensional que puede enlazarse con alta afinidad a dianas moleculares especificas; frecuentemente con constantes de equilibrio en el rango de 1 pM a 1 nM, lo cual es similar a algunas interacciones anticuerpos-antlgenos monoclonales. Los aptameros pueden enlazarse especlficamente a otras moleculas de acidos nucleicos, protelnas, compuestos organicos pequenos, moleculas pequenas y celulas (organismos o patogenos).
Unidades estructurales de enlazamiento polipeptidos
En ciertas realizaciones, la unidad estructural es un polipeptido (esto es, una protelna, polipeptido o peptido), unida, utilizando una variedad de qulmicas, mediante un enlace covalente sencillo de tal manera que no afectan la actividad biologica del polipeptido. En una realizacion, la union se hace a traves del grupo tiol del residuo de cistelna reactivo sencillo colocado de tal manera que su modificacion no afecta la actividad biologica del polipeptido. En este aspecto el uso de polipeptidos lineales, con cistelna en el extremo C-terminal o N-terminal provee un tiol sencillo de una manera similar a la cual el alcanotiol suministra un grupo tiol en el extremo 3' o 5' de un oligonucleotido. Pueden utilizarse reactivos de conjugacion bifuncionales similares, tales como SPDP y hacerlos reaccionar con el grupo amino de la partlculas magnetica y el grupo tiol del polipeptido, con cualquier unidad estructural que porta tiol. Los tipos de polipeptidos utilizados como unidades estructurales de enlazamiento pueden ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y secuencias de polipeptidos naturales y sinteticas. Las unidades estructurales de enlazamiento de peptidos tienen un patron de enlazamiento, esto es, una molecula a la cual se enlazan selectivamente.
El uso de peptidos como unidades estructurales de enlazamiento ofrece varias ventajas. El uso de peptidos como unidades estructurales de enlazamiento ofrece varias ventajas. Por ejemplo, los polipeptidos pueden ser manipulados para tener residuos reactivos unicamente, distales de los residuos requeridos para la actividad biologica, para union a la partlcula magnetica. El residuo reactivo puede ser una tiolcisteina, un grupo amino N- terminal, un grupo carboxilo C-terminal o un grupo carboxilo de aspartato o glutamato, etc. Un residuo reactivo individual sobre el peptido se utiliza para asegurar un sitio unico de union. Estos principios de diseno pueden ser seguidos con peptidos sintetizados qulmicamente o polipeptidos producidos biologicamente. Las unidades estructurales de enlazamiento tambien pueden contener secuencias y aminoacidos a partir de polipeptidos o protelnas de origen natural (tipo silvestre). Por ejemplo, el polipeptido natural puede ser una hormona (por ejemplo, una citoquina, un factor de crecimiento), una protelna de suero, una protelna viral (por ejemplo, hemoaglutinina), una protelna de matriz extracelular, una lectina o uno ectodominio de una protelna de superfine celular. Otro ejemplo es una protelna de enlazamiento a ligando, tal como estreptavidina o avidina que enlazan la biotina. En general, la unidad estructural de enlazamiento-partlcula magnetica resultante se utiliza para medir la presencia de analitos en el medio de prueba que reacciona con la unidad estructural de enlazamiento.
Adicionalmente, una unidad estructural de enlazamiento polipeptido puede ser utilizada en una configuracion de reactivo universal, en donde la diana de la unidad estructural de enlazamiento (por ejemplo molecula pequena, ligando o asociado de enlazamiento) es preunida al analito diana para crear un analito marcado que, en la presencia de las partlculas cubiertas de polipeptido, induce la aglomeracion.
Ejemplos de hormonas protelnicas que pueden ser utilizadas como unidades estructurales de enlazamiento incluyen, sin limitacion, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), que enlaza el receptor PDGF; factor de crecimiento I y II (Igf) similar a insulina, el cual enlaza el receptor Igf; factor de crecimiento de nervios (NGF), el cual enlaza el receptor NGF; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el cual enlaza el receptor FGF (por ejemplo un aFGF y bFGF); factor de crecimiento epidermico (EGF) el cual enlaza el receptor EGF; factor de crecimiento de transformacion (TGF, por ejemplo, TGF-a, TGF-p), el cual enlaza el receptor tGF; eritropoyetina, el cual enlaza el receptor de eritropoyetina; hormona de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humana), la cual enlaza al receptor de hormona de crecimiento; y proinsulina, insulina, insulina de cadena A e insulina de cadena B, todas las cuales enlazan al receptor de insulina.
Las unidades estructurales de enlazamiento receptoras son utiles para detectar y generar imagenes de la aglomeracion del receptor sobre la superficie de una celula. Los ectodominios utiles incluyen los de la protelna Notch, protelna Delta, integrinas, cadherinas, y otras moleculas de adhesion celular.
Unidades estructurales de enlazamiento anticuerpos
Otras unidades estructurales de enlazamiento polipeptidos incluyen unidades estructurales de enlazamiento de inmunoglobulina que incluyen al menos un dominio de inmunoglobulina, y tlpicamente al menos dos de tales
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dominios. Un “dominio de inmunoglobulinas” se refiere a un dominio de una molecula de anticuerpo como por ejemplo, un dominio variable o constante. Un “dominio de superfamilia de inmunoglobulinas” se refiere a un dominio que tiene tres estructuras tridimensionales relacionadas con un dominio de inmunoglobulina, pero es una molecula que no es inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina y los dominios de superfamilia de inmunoglobulina incluyen tlpicamente dos laminas p formadas de alrededor de siete cadenas p, y un puente de disulfuro conservado (vease, por ejemplo Williams and Barclay Ann. Rev Immunol., 6:381 (1988)). Las protelnas que incluyen los dominios de las superfamilias Ig incluyen receptores de celula T, CD4, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), y molecula de adhesion intercelular (ICAM).
Un tipo de unidad estructural de enlazamiento de inmunoglobulina es un anticuerpo. El termino “anticuerpo”, tal como se utiliza aqul se refiere una molecula de inmunoglobulina de longitud completa de dos cadenas y una porcion de enlazamiento al antlgeno y fragmentos de la misma, que incluye variantes sinteticas. Un anticuerpo tlpico incluye dos regiones de cadena variable pesada (H) (abreviadas aqul como VH), y dos regiones variables de cadena liviana (L) (abreviadas aqul como VL). Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones de determination de complementareidad” (CDR), intercaladas con regiones que son mas conservadas, denominadas “regiones marco” (FR). La extension de la region marco y de los CDR ha sido definida con precision (vease, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, y Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Cada VH y VL esta compuesto de tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el terminal amino a terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y Fr4.
Un anticuerpo tambien puede incluir una region constante como parte de una cadena liviana o pesada. Las cadenas livianas pueden incluir un gen de region constante kappa o lambda en el termino COOH (denominado CL). Las cadenas pesadas pueden incluir, por ejemplo, una region constante gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; que codifican aproximadamente 330 aminoacidos). Una region constante gamma puede incluir, por ejemplo, CH1, CH2, y CH3. El termino “anticuerpo de longitud completa” se refiere una protelna que incluye un polipeptido que incluye VL y CL, y un segundo polipeptido que incluye Vh, CH1, CH2, y CH3.
El termino “fragmento de enlazamiento a antlgeno” de un anticuerpo, tal como se utiliza aqul, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retiene la capacidad de enlazarse especlficamente una diana. Ejemplos de fragmentos de enlazamiento a antlgeno incluyen pero no se limitan a: (i) una fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente de los dominios VL, VH, cL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab enlazados mediante un puente de disulfuro en la region bisagra; (iii) y el fragmento Fv que consiste de los dominios de VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominio VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544 (1989)), que consiste de un dominio VH; y (vi) una region determinante de complementareidad aislada (CDR). Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, pueden ser unidos, utilizando metodos recombinantes, mediante un enlazante sintetico que les permite constituirse como una cadena de protelna sencilla en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moleculas monovalentes (conocidas como cadena sencilla Fv (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423 (1988); y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879 (1988)). Tales anticuerpos de cadena sencilla tambien son abarcados dentro del termino “fragmento de enlazamiento antlgeno”.
Un anticuerpo de dominio sencillo (sdAb, nanocuerpo) es un fragmento anticuerpo que consiste de un dominio anticuerpo variable monomerico sencillo, y puede tambien ser utilizado en los metodos de la invention. Al igual que un anticuerpo completo, los sdAbs son capaces de enlazarse selectivamente a un antlgeno especlfico. Con un peso molecular de solamente 12-15 kDa, los anticuerpos de dominio sencillo son mucho mas pequenos que los anticuerpos comunes (150-160 kDa) los cuales estan compuestos de dos cadenas de protelna pesada y dos cadenas livianas, e incluso mas pequenas que los fragmentos Fab (~50 kDa, una cadena liviana y la mitad de una cadena pesada) y fragmentos variables de cadena sencilla (~25 kDa, dos dominios variables, uno de una cadena liviana y uno de una cadena pesada).
Unidades estructurales de enlazamiento de polisacaridos
En ciertas realizaciones, la unidad estructural de enlazamiento es un polisacarido, enlazado, por ejemplo, utilizando cualquiera de una variedad de qulmicas, mediante un enlace sencillo, por ejemplo un enlace covalente, en uno de los dos extremos, a un grupo funcional sobre la partlcula magnetica. Los polisacaridos pueden ser sinteticos o naturales. Pueden utilizarse mono, di, tri y polisacaridos como unidad estructural de enlazamiento. Estos incluyen, por ejemplo, glicosidos, N-glicosilaminas, derivados de O-acilo, derivados de O-metilo, osazonas, alcoholes azucares, acidos azucares, fosfatos azucares, cuando se utilizan con la qulmica a la partlcula magnetica.
Un metodo para lograr el enlazamiento es acoplar avidina una partlcula magnetica y hacer reaccionar la avidina- partlcula magnetica con polisacaridos biotinilados comercialmente disponibles, para producir conjugados de polisacaridos-partlcula magnetica. Por ejemplo, los polisacaridos basados en sialilo de Lewis estan disponibles comercialmente como reactivos biotinilados y reaccionaran con avidina-CLIO (vease Syntesome, Gesellschaft fur
medizinische Biochemie mbH.). El tetrasacarido x de Lewis de sialilo (Slex) es reconocido por protelnas tales como Selectinas, las cuales estan presentes sobre la superficie de los leucocitos y funcionan como parte de la cascada inflamatoria para el reclutamiento de leucocitos.
Todavla otras unidades estructurales de direccionamiento incluyen un elemento no proteinaceo, por ejemplo, una 5 modification de glicosilo (tal como un antlgeno de Lewis) u otras moleculas organicas no proteinaceas. Otro metodo
es el acoplamiento covalente de la protelna a la partlcula magnetica.
Otra caracterlstica de los metodos incluye la identification de tipos celulares especlficos, para investigaciones hematologicas o histopatologicas por ejemplo recuentos de celulas CD4/CD3 y celulas tumorales circulantes utilizando cualquiera de las unidades estructurales de enlazamiento descritas mas arriba.
10 Agentes de enlazamiento multivalentes
Los ensayos de la invention pueden incluir un agente de enlazamiento multivalente (i) que portan multiples analitos enlazados a un portador (por ejemplo un armazon sintetico sencillo, o una protelna o polisacarido portador mas grande, tal como BSA, transferrina o dextrano), o epltopos multiples portadores para enlazamiento, por ejemplo, a dos o mas poblaciones de partlculas magneticas para formar un agregado.
15 Cuando se emplea un agente de enlazamiento multivalente, los analitos multiples pueden ser enlazados a un portador (por ejemplo, un armazon sintetico sencillo, o una protelna o polisacarido portador mas grande, tal como BSA, transferrina, o dextrano). Alternativamente, el agente de enlazamiento multivalente puede ser un acido nucleico disenado para enlazarse a dos o mas poblaciones de partlculas magneticas. Tales agentes de enlazamiento multivalentes actuan como aglomerantes y la arquitectura de ensayo esta caracterizada por una competition entre el 20 analito que esta siendo detectado y el agente de enlazamiento multivalente (por ejemplo, en un ensayo de inhibition, ensayo de competicion, o ensayo de desagregacion).
El grupo funcional presente en el analito puede ser utilizado para formar un enlace covalente con el portador. Alternativamente, el analito puede ser derivado para proveer un enlazante (esto es, un espaciador que separa el analito del portador en el conjugado) terminando en un grupo funcional (esto es, un alcohol, una amina, un grupo 25 carboxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo fosfato), el cual se usa para formar el enlace covalente con el portador.
El enlace covalente de un analito y un portador puede ser efectuado usando un enlazante que contiene unidades estructurales reactivas capaces de reaccionar con tales grupos funcionales presentes en el analito y el portador. Por ejemplo, un grupo hidroxilo del analito puede reaccionar con un grupo carboxilo del enlazante, o un derivado activado del mismo, dando como resultado la formation de un ester que enlaza a los dos.
30 Ejemplos de unidades estructurales capaces de reaccionar con grupos sulfhidrilo incluyen compuestos de a- haloacetilo del tipo XCH2CO- (donde X=Br, Cl o I), los cuales muestran reactividad particular por grupos sulfhidrilo, pero que tambien pueden ser utilizados para modificar grupos imidazolilo, tioeter, fenol y amino, como lo describe Gurd, Methods Enzymol. 11:532 (1967). Los derivados de N-maleimida tambien se consideran reactivos hacia grupos sulfhidrilo, pero adicionalmente pueden ser utiles en el acoplamiento a grupos amino bajo ciertas 35 condiciones. Reactivos tales como 2-iminotiolano (Traut et al., Biochemistry 12:3266 (1973)), que introducen un grupo tiol a traves de la conversion de un grupo amino, pueden ser considerados como reactivos de sulfhidrilo si el enlazamiento ocurre a traves de la formacion de puentes disulfuro.
Ejemplos de unidades estructurales reactivas capaces de reaccionar con grupos amino incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes y acilantes. Agentes alquilantes representativos incluyen:
40 (i) compuestos de a-haloacetilo, los cuales muestran especificidad hacia grupos amino en la ausencia de grupos tiol
reactivos y son del tipo XCH2CO- (donde X=Br, Cl o I), por ejemplo, como lo describe Wong, Biochemistry 24:5337 (1979); (ii) derivados de N-maleimida, los cuales pueden reaccionar con grupos amino bien sea a traves de una reaction tipo Michael o a traves de la acilacion por adicion al grupo carbonilo del anillo, por ejemplo, como lo describe Smyth et al., J. Am. Chem. Soc. 82:4600 (1960) y Biochem. J. 91:589 (1964); (iii) haluros de arilo tales 45 como compuestos nitrohaloaromaticos reactivos; (iv) haluros de alquilo, como los descritos, por ejemplo, por McKenzie et al., J. Protelna Chem. 7:581 (1988); (v) aldehldos y cetonas capaces de formar bases de Schiff con grupos amino, siendo estabilizados usualmente los aductos formados a traves de reduction para dar una amina estable; (vi) derivados de epoxi tales como epiclorohidrina y bisoxiranos, los cuales pueden reaccionar con los grupos amino, sulfhidrilo o hidroxilo fenolico; (vii) derivados de s-triazinas que contienen cloro, los cuales son muy 50 reactivos hacia nucleofilos tales como grupos amino, sulfhidrilo e hidroxilo; (viii) aziridinas con base en compuestos de s-triazina detallados mas arriba, por ejemplo, como los descritos por Ross, J. Adv. Cancer Res. 2:1 (1954), los cuales reaccionan con nucleofilos tales como grupos amino por apertura de anillo; (ix) dietil esteres del acido escuarico tal como lo describe Tietze, Chem. Ber. 124:1215 (1991); y (x) eteres de a-haloalquilo, los cuales son agentes alquilantes mas reactivos que los haluros de alquilo normales por la activation causada por el atomo de
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oxlgeno del eter, como lo describe Benneche et al., Eur. J. Med. Chem. 28:463 (1993).
Agentes acilantes reactivos a amino representativos incluyen: (i) isocianatos e isotiocianatos, particularmente derivados aromaticos, los cuales forman derivados de urea y tiourea estables respectivamente; (ii) cloruros de sulfonilo, los cuales han sido descritos por Herzig et al., Biopolimers 2:349 (1964); (iii) haluros de acido; (iv) esteres activos tales como nitrofenilesteres o N-hidroxisuccinimidil esteres; (v) anhldridos de acido tales como mixtos, simetricos, o N-carboxianhldridos; (vi) otros reactivos utiles para la formacion de enlaces amida, por ejemplo, los descritos por M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984; (vii) acilazidas, por ejemplo en donde el grupo azida es generado por un derivado de hidrazida preparado utilizando nitrito de sodio, tal como lo describe Wetz et al., Anal. Biochem. 58:347 (1974); y (viii) imidoesteres, los cuales forman amidinas estables por reaccion con grupos amino, por ejemplo, como lo describe Hunter and Ludwig, J. Am. Chem. Soc. 84:3491 (1962). Los aldehldos y cetonas pueden hacerse reaccionar con aminas para formar bases de Schiff, las cuales pueden ser estabilizadas ventajosamente a traves de la aminacion reductiva. Las unidades estructurales alcoxilamino reaccionan facilmente con cetonas y aldehldos para producir alcoxaminas estables, por ejemplo, como las descritas por Webb et al., Bioconjugate Chem. 1:96 (1990).
Ejemplos de unidades estructurales reactivas capaces de reaccionar con grupos carboxilo incluyen compuestos diazo tales como los diazoacetato esteres y dizoacetamidas, los cuales reaccionan con alta especificidad para generar grupos ester, por ejemplo como lo describe Herriot, Adv. Protein Chem. 3:169(1947). Tambien pueden emplearse reactivos modificadores de carboxilo tales como carbodiimidas, los cuales reaccionan a traves de la formacion de O-acilurea seguida por la formacion del enlace amida.
Sera evidente que los grupos funcionales en el analito y/o el portador, si se desea, pueden ser convertidos en otros grupos funcionales antes de la reaccion, por ejemplo, para conferir reactividad o selectividad adicionales. Ejemplos de metodos utiles para este proposito incluyen la conversion de aminas a carboxilos utilizando reactivos tales como anhldridos dicarboxllicos; conversion de aminas a tioles utilizando reactivos tales como N-acetilhomocisteina tilactona, anhldrido S-acetil mercaptosucclnico, 2-iminotiolano, o derivados de succinimidilo que contienen tiol; conversion de tioles a carboxilos utilizando reactivos tales como a-haloacetatos; conversion de tioles a aminas utilizando reactivos tales como etilenimina o 2-bromoetilamina; conversion de carboxilos a aminas utilizando reactivos tales como las carbodiimidas seguidas por diaminas; y conversion de alcoholes a tioles utilizando reactivos tales como cloruro de tosilo seguido por transesterificacion con tioacetato e hidrolisis al tiol con acetato de sodio.
Los as! llamados enlazantes de longitud cero, que involucran la union covalente directa de un grupo qulmico reactivo del analito con un grupo qulmico reactivo del portador sin introducir material de enlazamiento adicional, si se desea, pueden ser utilizados de acuerdo con la invencion. De la forma mas comun, sin embargo, el enlazante incluira dos o mas unidades estructurales reactivas, como se describio mas arriba, conectadas por un elemento espaciador. La presencia de tal espaciador permite que los enlazantes bifuncionales reaccionen con grupos funcionales especlficos dentro del analito y el portador, dando como resultado un enlace covalente entre los dos. Las unidades estructurales reactivas en un enlazante pueden ser las mismas (enlazantes homobifuncionales) o diferentes (enlazantes heterobifuncionales o, cuando estan presentes varias unidades estructurales reactivas dislmiles, enlazante heteromultifuncional), proveyendo una diversidad de reactivos potenciales que pueden generar enlazamiento covalente entre el analito y el portador.
Elementos espaciadores en el enlazante tlpicamente consisten de cadenas lineales o ramificadas y pueden incluir C1-10 alquilo, un heteroalquilo de 1 a 10 atomos, un C2-10 alqueno, un C2-10 alquino, C5-10 arilo, un sistema clclico de 3 a 10 atomos, o -(CH2CH2O)nCH2CH2-, en el cual n es de 1 a 4.
Tlpicamente, un agente de enlazamiento multivalente incluira 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 15, 50 o 100 (por ejemplo, de 3 a 100, de 3 a 30, de 4 a 25, o de 6 a 20) analitos conjugados. Los agentes de enlazamiento multivalentes son tlpicamente de 10 kDa a 200 kDa en tamano y pueden ser preparados como se describe en los ejemplos.
Analitos
Realizaciones de la invencion incluyen metodos para detectar la presencia de un analito seleccionado de un patogeno, virus o acido nucleico diana en una muestra de sangre entera. Los analitos pueden incluir la identificacion de celulas o tipos celulares especlficos. Los analitos pueden incluir una o mas sustancias y/o metabolitos, marcadores y/o otros indicadores biologicamente activos de sustancias biologicamente activas. Una sustancia biologicamente activa puede ser descrita como una entidad individual o una combinacion de entidades. El termino “sustancia biologicamente activa” incluye sin limitacion, medicaciones; vitaminas, suplementos minerales; sustancias usadas para el tratamiento, prevencion, diagnostico, cura o mitigacion de enfermedad o malestar; o sustancias que afectan la estructura o funcionamiento del cuerpo; o profarmacos, los cuales se hacen biologicamente activos o mas activos despues de que han sido colocados en un ambiente fisiologico predeterminado; o agentes biologicamente toxicos tales como los usados en guerras biologicas incluyendo organismos tales como antrax, ebola, Salmonella typhimurium, virus de Marburg, plaga, colera, Francisella tulariesis (tularemia), brucellosis, fiebre Q, fiebre hemorragica Boliviana, micosis por coccidioides, muermos, Melioidosis, Shigella, fiebre con manchas de las
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Montanas Rocosas, tifo, Psittacosis, fiebre amarilla, encefalitis Japonesa B, fiebre del Valle del Rift, y viruela; toxinas de origen natural que pueden ser utilizadas como armas incluyen ricina, aflatoxina, SEB, toxina de botulinum, saxitoxina, y muchas micotoxinas. Los analitos tambien pueden incluir organismos tales como Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Estreptococo negativo a coagulasa, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Aspergillus fumigates, Bacteroides fragilis, Bacteroides fragilis, blaSHV, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni/coli, Candida guilliermondii, Candida lusitaniae, Clostridium pefringens, Enterobacter aeraogenesl, Enterobacter cloacae, Enterobacteriaceae spp., Haemophilus influenza, Kingella kingae, Klebsiella oxytoca, Listeria monocitogenes, bacterias portadoras del gen Mec A (MRSA), Morganella morgana, Neisseria meningitides, Neisseria spp., non-meningitidis, Prevotella buccae, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Propionibacterium acnes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella enteric, Serratia marcescens, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus maltophilia, Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactie, Streptococcus bovis, Streptococcus dysgalactie, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes, Streptococcus sanguinis, gen Van A, gen Van B. Los analitos tambien pueden incluir organismos virales tales como virus de ADNds (por ejemplo, adenovirus, virus de herpes, virus de viruela); virus ssDNA (+)ADN sentido(e.g., parvovirus); virus dsRNA (e.g., reovirus); virus (+)ssRNA (+)ARN sentido (e.g., picornavirus, togavirus); virus (-)ssRNA (-)ARN sentido (e.g., ortomixovirus, rhabdovirus); virus ssARN-RT (+)ARN sentido con intermediario de ADN en ciclo de vida (e.g., retrovirus); y virus dsDNA-RT (e.g., hepadnavirus).
Las infecciones oportunistas que pueden ser detectadas utilizando los sistemas y metodos de la invencion incluyen, sin limitation, infecciones fungicas, virales, bacterianas, protozoarias, tales como: 1) infecciones fungicas tales como las de Candida spp. (cepas resistentes y no resistentes a farmacos), C. albicans, C. krusei, C. glabrata, y Aspergillus fumigates; 2) infecciones gram negativas, tales como las provocadas por E. coli, Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella pneumonia/oxytoca, y Pseudomonas aeruginosa; y 3) infecciones por gram positivas tales como las causadas por Staphylococcus spp., S. aureus, S. pneumonia, Enterococcus ssp. (E faecalis y E. faecium). La infection puede ser por estafilococcus negativo a coagulasa, Corynebacterium spp., Fusobacterium spp., Morganella morganii, Pneumocystis jirovecii (previamente conocida como Pneumocystis carinii), F. hominis, S. pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, poliomavirus JC poliomavirus (el virus que causa la leucoencefalopatla multifocal progresiva), Acinetobacter baumanni, Toxoplasma gondii, citomegalovirus, Aspergillus spp., Kaposi's Sarcoma, Cryptosporidium spp., Cryptococcus neoformans, y Histoplasma capsulatum.
Se divulga que los ejemplos de amplias categorlas de analitos que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqul incluyen, sin limitacion, las siguientes categorlas terapeuticas: agentes anabolicos, antiacidos, agentes antiasmaticos, agentes anticolesterolemicos y agentes antilipldicos, anticoagulantes, anticonvulsivos, antidiarreicos, antiemeticos, agentes antiinfecciosos, agentes antiinflamatorios, agentes antimaniacos, agentes antinauseas, agentes antineoplasicos, agentes antiobesidad, agentes antipireticos y analgesicos, agentes antiespasmodicos, agentes antitromboticos, agentes antiuricemicos, agentes antianginales, antihistaminas, antitusivos, supresores del apetito, productos biologicos, dilatadores cerebrales, dilatadores de la coronaria, descongestionantes, diureticos, agentes diagnosticos, agentes eritropoyeticos, expectorantes, sedantes gastrointestinales, agentes hiperglicemicos, hipnoticos, agentes hipoglicemicos, resinas para intercambio de iones, laxantes, suplementos minerales, agentes mucollticos, farmacos neuromusculares, vasodilatadores perifericos, psicotropicos, sedantes, estimulantes, agentes tiroidales y antitiroidales, relajantes uterinos, vitaminas y profarmacos.
Mas especlficamente, se divulga que ejemplos de analitos que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistemas y metodos divulgados aqul incluyen, sin limitacion, las siguientes categorlas terapeuticas: analgesicos, tales como farmacos antiinflamatorios no esteroidales, agonistas de opiato y salicilatos; antihistaminas , tales como bloqueadores de Hi y bloqueadores de H2; agentes antiinfecciosos tales como antihelmlnticos, antianaerobicos, antibioticos, antibioticos aminoglicosidos, antibioticos antifungicos, antibioticos de cefalosporina, antibioticos de macrolide, antibioticos miscelaneos de p-lactama, antibioticos de penicilina, antibioticos de quinolona, antibioticos de sulfonamida, antibioticos de tetraciclina, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculosis, antiprotozooarios, antiprotozooarios antimalaria, agentes antivirales, agentes antirretrovirales, escabicidas, y agentes antiinfecciosos urinarios; agentes antineoplasicos, tales como agentes alquilantes, agentes alquilantes de mostaza de nitrogeno, agentes alquilantes de nitrosourea, antimetabolitos, antimetabolitos analogos a la purina, antimetabolitos analogos a la pirimidina, antineoplasicos hormonales, antineoplasicos naturales, antineoplasicos naturales antibioticos, y antineoplasicos naturales de alcaloides vinca; agentes autonomicos, tales como anticolinergicos, anticolinergicos antimuscarlnicos, alcaloides ergot, parasimpatomimeticos, parasimpatomimeticos agonistas colinergicos, parasimpatomimeticos inhibidores de colinesterasa, simpatollticos, simpatollticos bloqueadores alfa, simpatollticos bloqueadores beta, simpatomimeticos y simpatomimeticos agonistas adrenergicos; agentes cardiovasculares, tales como antianginales, antianginales bloqueadores beta, antianginales bloqueadores del canal de calcio, antianginales de nitrato, antiarrltmicos, antiarrltmicos cardiacos de glicosido, antiarrltmicos clase I, antiarrltmicos clase II, antiarrltmicos clase III, antiarrltmicos clase IV, agentes antihipertensores, antihipertensores bloqueadores de alfa, antihipertensivos inhibidores de enzimas por conversion de angiotensina (inhibidor de ACE), antihipertensores bloqueadores beta, antihipertensores bloqueadores del canal de calcio, antihipertensores
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adrenergicos de accion central, agentes antihipertensores diureticos, antihipertensores vasodilatadores perifericos, antilipemicos, antilipemicos secuestrantes de acidos biliares, antilipemicos inhibidores de la HMG-COA reductasa, inotropos, inotropos cardiacos de glicosido, y agentes trombollticos; agentes dermatologicos, tales como antihistaminas, agentes antiinflamatorios, agentes antiinflamatorios de corticosteroides, anestesicos antiprurlticos/locales, agentes antiinfecciosos topicos, antiinfecciosos topicos antifungicos, antiinfecciosos topicos antivirales y antineoplasicos topicos; agentes electrollticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes,, diureticos, diureticos inhibidores de la anhidrasa carbonica, diureticos de bucle, diureticos osmoticos, diureticos para reposicion de potasio, diureticos de tiazida, reemplazantes de electrolitos, y agentes uricosuricos; enzimas, tales como enzimas pancreaticas y enzimas trombollticas; agentes gastrointestinales tales como antidiarreicos, antiemeticos, agentes antiinflamatorios gastrointestinales, agente antiinflamatorios gastrointestinales de salicilato, agentes antiulcera antiacidos, agentes antiulcera gastricos inhibidores de la bomba de acido, agentes antiulcera de la mucosa gastrica, agentes antiulcera bloqueadores de H2, agentes colelitollticos, digestivos, emeticos, laxantes y ablandadores de las heces, y agentes proquineticos; anestesicos generales tales como anestesicos por inhalacion, anestesicos por inhalacion halogenados, anestesicos intravenosos, anestesicos intravenosos de barbiturato, anestesicos intravenosos de benzodiacepina, y anestesicos intravenosos agonistas de opiato; agentes hematologicos, tales como agentes antianemia, agentes antianemia hematopoyeticos, agentes de coagulacion, anticoagulantes, agentes de coagulacion hemostaticos, agentes de coagulacion inhibidores de plaquetas, agentes de coagulacion de enzima trombolltica, y expansores del volumen de plasma; hormonas y modificadores de hormonas, tales como abortifacientes, agentes adrenales, agentes adrenales corticosteroides, androgenos, antiandrogenos, antidiabeticos, agentes antidiabeticos de sulfonilurea, agentes antihipoglicemicos, anticonceptivos orales, anticonceptivos de progestina, estrogenos, agentes de fertilidad, oxitocicos, agentes para la paratiroides, hormonas pituitarias, progestinas, agentes antitiroides, hormonas tiroidales, y tocollticos; agentes inmunobiologicos, tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides y vacunas; anestesicos locales tales como anestesicos locales de amida y anestesicos locales de ester; agentes musculoesqueletales, tales como agentes antiiflamatorios antigota, agentes antiinflamatorios corticosteroides, agentes antiinflamatorios con compuestos de oro, agentes antiinflamatorios inmunosupresores, farmacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAlDs), agentes antiinflamatorios de salicilato, relajantes del armazon muscular, relajantes del armazon muscular bloqueadores neuromusculares, y relajantes del armazon muscular bloqueadores neuromusculares reversos; agentes neurologicos, tales como anticonvulsivos, anticonvulsivos de barbiturato, anticonvulsivos de benzodiacepina, agentes antimigrana, agentes antiparkinsonianos, agentes antivertigo, agonistas de opiato y antagonistas de opiato; agentes oftalmicos, tales como agentes antiglaucoma, agentes antiglaucoma bloqueadores beta, agentes antiglaucoma mioticos, midriaticos, midriaticos agonistas adrenergicos, midriaticos antimuscarlnicos, anestesicos oftalmicos, antiinfecciosos oftalmicos, antiinfecciosos oftalmicos de aminoglicosido, antiinfecciosos oftalmicos de macrolida, antiinfecciosos oftalmicos de quinolona, antiinfecciosos oftalmicos de sulfonamida, antiinfecciosos oftalmicos de tetraciclina, agentes antiinflamatorios oftalmicos, agentes antiinflamatorios oftalmicos de corticosteroides y farmacos antiinflamatorios oftalmicos no esteroidales (NSAlDs); agentes psicotropicos, tales como antidepresivos, antidepresivos heteroclclicos, inhibidores de la monoamina oxidasa (MAOIs), inhibidores de la retoma selectiva de serotonina (SSRIs), antidepresivos triclclicos, antimaniacos, antipsicoticos, antipsicoticos de fenotiazina, ansiollticos, sedantes e hipnoticos, sedantes e hipnoticos de barbiturato, ansiollticos sedantes e hipnoticos de benzodiacepina y psicoestimulantes, agentes respiratorios, tales como antitusivos, broncodilatadores, broncodilatadores agonistas adrenergicos, broncodilatadores antimuscarlnicos, expectorantes, agentes mucollticos, agentes antiinflamatorios respiratorios y agentes antiinflamatorios respiratorios de corticosteroide; agentes de toxicologla tales como antldotos, antagonistas de metales pesados/agentes quelantes, agentes contra el abuso de sustancias, agentes contra el abuso de sustancias disuasivas, y agentes contra el abuso de sustancias por abandono; minerales; y vitaminas, tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.
Se divulga que ejemplos de clases de sustancias biologicamente activas de las categorlas anteriores que pueden ser detectadas utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqul incluyen, sin limitacion, farmacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAlDs), analgesicos, tales como diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofen y naproxeno; analgesicos agonistas de opiato, tales como codelna, fentanil, hidromorfona y morfina; analgesicos de salicilato tales como aspirina (ASA)(ASA con recubrimiento enterico); antihistaminas bloqueadoras de Hi, tales como clemastina y terfenadina; antihistaminas bloqueadoras de H2, tales como cimetidina, famotidina, nizadina y ranitidina; agentes antiinfecciosos tales como mupirocina, agentes antinfecciosos antianaerobicos, tales como cloranfenicol y clindamicina; antiinfecciosos antibioticos antifungicos, tales como anfotericina B, clotrimazol, fluconazol y ketoconazol; antiinfecciosos antibioticos de macrolida, tales como azitromicina y eritromicina, antiinfecciosos antibioticos de betalactama miscelaneas, tales como aztreonam e imipenem; antiinfecciosos antibioticos de penicilina tales como naficilina, oxacilina, penicilina G y penicilina V; antiinfecciosos antibioticos de quinolona, tales como ciprofloxacina y norfloxacina; antiinfecciosos antibioticos de tetraciclina tales como doxiciclina, minociclina y tetraciclina; antiinfecciosos antimicobacterianos antituberculosis tales como isoniazida (INH) y rifampin; antiinfecciosos antiprotozoarios tales como atovacuona y dapsona; antiinfecciosos antiprotozoarios antimalaria, tales como cloroquina y pirimetamina; agentes antiinfecciosos antirretrovirales, tales como ritonavirus y zidovudina; agentes antiinfecciosos antivirales, tales como aciclovir, ganciclovir, interferon alfa y rimantadina; agentes antineoplasicos alquilantes, tales como carboplatino y cisplatino; agentes antineoplasicos alquilantes de nitrosourea, tales como carmustina (BCNU); agentes antineoplasicos antimetabolitos, tales como metotrexato; agentes antineoplasicos antimetabolito analogos de la pirimidina, tales como fluorouracil (5-FU) y gemcitabina:
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antineoplasicos hormonales, tales como goserelina, leuprolida y tamoxifen; antineoplasicos naturales, tales como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etoposido (VP-16), interferon alfa, paclitaxel y tretinoina (ATRA); antineoplasicos naturales antibioticos tales como bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina y mitomicina; antineoplasicos naturales de alcaloides vinca, tales como vinblastina y vincristina; agentes autonomicos, tales como nicotina; agentes autonomicos anticolinergicos, tales como benztropina y trihexifenidilo; agentes autonomicos anticolinergicos antimuscarlnicos, tales como atropina y oxibutinina; agentes autonomicos alcaloides ergot, tales como bromocriptina; parasimpatomimeticos agonistas colinergicos, tales como pilocarpina;
parasintomimeticos inhibidores de colinesterasa, tales como piridostigmina; simpatollticos bloqueadores de alfa, tales como prazosin; simpatollticos bloqueadores 9, tales como atenolol; simpatomimeticos agonistas adrenergicos tales como albuterol y dobutamina; agentes cardiovasculares, tales como aspirina (ASA) (ASA con recubrimiento enterico); antianginales bloqueadores i, tales como atenolol y propranolol; antianginales bloqueadores del canal de calcio, tales como nifedipina y verapamil; antianginales de nitrato, tales como dinitrato de isosorbide (ISDN), antiarrltmicos cardiacos de glicosido, tales como digoxina; antiarritmicos clase I, tales como lidocalna, mexiletine, fentoina, procainamida y quinidina; antiarrltmicos clase II, tales como atenolol, metroprolol, propanolol y timolol; antiarrltmicos clase III, tales como amiodarona; antiarrltmicos clase IV, tales como diltiazem y verapamil;
antihipertensivos bloqueadores de alfa, tales como prazosin; antihipertensores inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidor de ACE), tales como captopril y enalapril; antihipertensores bloqueadores beta, tales como atenolol, metoprolol, nadolol y propanolol; agentes antihipertensores bloqueadores del canal de calcio, tales como diltiazem y nifedipina; antihipertensores adrenergicos de accion central, tales como clonidina y metildopa; agentes antihipertensores diureticos, tales como amiloride, furosemida, hidroclorotiazida (HCTZ) y espironolactona; antihipertensores vasodilatadores perifericos, tales como hidralazina y minoxidil; antilipemicos, tales como
gemfibrozil y probucol; antilipemicos secuestrantes de acidos biliares, tales como colestiramina; antilipemicos
inhibidores de HMG-CoA reductasa, tales como lovastatina y pravastatina, inotropos, tales como amrinona, dobutamina y dopamina; inotropos cardiacos de glicosido, tales como digoxina; agentes trombollticos, tales como alteplasa (TPA), anistreplasa, estreptoquinasa y uroquinasa; agentes dermatologicos, tales como colchicina, isotretinoina, metotrexato, minoxidil, tretinoina (ATRA); agentes antiinflamatorios dermatologicos corticosteroides, tales como betametasona y dexametasona; antiinfecciosos topicos antifungicos, tales anfotericina B, clotrimazol, miconazol y nistatina; antiinfecciosos antivirales topicos, tales como aciclovir; antineoplasicos topicos, tales como fluorouracil (5-FU); agentes electrollticos renales, tales como lactulosa; diureticos de bucle, tales como furosemida; diureticos de reposicion de potasio, tales como triamterene; diureticos de tiazida, tales como hidroclorotiazida (HCTZ); agentes uricosuricos, tales como probenecid; enzimas tales como ARasa y ADNasa; enzimas trombollticas, tales como alteplasa, anistreplasa, estreptoquinasa y uroquinasa; antiemeticos, tales como ploclorperazina; agentes antiinflamatorios gastrointestinales de salicilato, tales como sulfasalazina; agentes antiulcera gastrica inhibidores de la bomba de acido, tales como omeprazol; agentes antiulcera bloqueadores de H2, tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidina; digestivos, tales como pancrelipasa; agentes procineticos, tales como eritromicina; anestesicos intravenosos agonistas de opiato, tales como fentanil; agentes antianemia hematopoyeticos, tales como eritropoyetina, filgrastim (G-CSF) y sargramostim (GM-CSF); agentes de coagulacion, tales como factores antihemofllicos 1-10 (AHF 1-10); anticoagulantes, tales como warfarina; agentes de coagulacion de enzima trombollticos, tales como alteplasa, anistreplasa, estreptoquinasa y uroquinasa; hormonas y modificadores de hormonas, tales como bromocriptina; abortifacientes, tales como metotrexato; agentes antidiabeticos, tales como insulina, anticonceptivos orales, tales como estrogeno y progestina; anticonceptivos de progestina, tales como levonorgestrel y norgestrel; estrogenos tales como estrogenos conjugados, dietilestilbestrol (DES), estrogeno (estradiol, estrona y estropipato); agentes de fertilidad, tales como clomifeno, gonadotropina corionica humana (HCG) y menotropinas; agentes paratiroides tales como calcitonina; hormonas de la pituitaria, tales como la desmopresina, goserelina, oxitocina y vasopresina (ADH); progestinas, tales como medroxiprogesterona, noretindrona y progesterona; hormonas de la tiroides, tales como levotiroxina; agentes inmunobiologicos, tales como interferon beta-Ib e interferon gamma-Ib; inmunoglobulinas, tales como inmunoglobulina IM, IMIG, IGIM e inmunoglobulina IV, IVIG, IGIV; anestesicos locales de amida, tales como lidocalna; anestesicos locales de ester, tales como benzocaina y procaina; agentes antiinflamatorios corticosteroides musculoesqueletales, tales como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona y prednisona; inmunosupresores antiinflamatorios musculoesqueletales, tales como azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato; farmacos antiinflamatorios no esteroidales musculoesqueletales (NSAIDs), tales como diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofeno, ketorlac y naproxeno; relajantes musculares esqueletales, tales como baclofen, ciclobenzaprina y diazepam; relajantes musculares esqueletales bloqueadores neuromusculares reversos, tales como piridostigmina; agentes neurologicos, tales como nimodipina, riluzol, tacrina y ticlopidina; agentes anticonvulsionantes, tales como carbamazepina, gabapentina, lamotrigina, fentoina y acido valproico, anticonvulsionantes de barbiturato, tales como fenobarbital y pirimidona; anticonvulsionantes de benzodiacepina, tales como clonazepan, diazepam y lorazepam; agentes antiparkinsonianos, tales como bromocritina, levodopa, carbidopa y pergolide; agentes antivertigo, tales como meclizina; agonistas de opiato, tales como codelna, fentanil, hidromorfona, metadona, y morfina; agonistas de opiato, tales como naloxona; agentes antiglaucoma bloqueadores beta, tales como timolol; agentes antiglaucoma mioticos, tales como pilocarpina; antiinfecciosos oftalmicos de aminoglicosido, tales como gentamicina, neomicina y tobramicina; antiinfecciosos oftalmicos de quinolona, tales como ciprofloxacina, norfloxacina y ofloxacina; agentes antiinflamatorios oftalmicos de corticosteroides, tales como dexametasona y prednisolona; farmacos antiinflamatorios oftalmicos no esteroidales (NSAIDs), tales como diclofenaco; antipsicoticos, tales como clozapina, haloperidol, y risperidona; ansiollticos, sedantes e hipnoticos de benzodiazepina, tales como clonazepam, diazepam, lorazepam, oxazepam, y prazepam; psicoestimulantes, tales como metilfenidato y pemolina; antitusivos, tales como
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codeina; broncodilatadores, tales como teofilina; broncodilatadores adrenergicos agonistas, tales como albuterol; agentes antiinflamatorios respiratorios de corticosteroides, tales como dexametasona; antidotos, tales como flumazenil y naloxona; agonistas de metales pesados/agentes quelantes, tales como penicilamina; agentes contra el abuso de sustancias disuasivast, tales como disulfiram, naltrexona, y nicotina; agentes contra el abuso de sustancias por retiro de bromocriptina; minerales, tales como hierro, calcio y magnesio; compuestos de vitamina B, tales como cianocobalamina (vitamina B12) y niacina (vitamina B3); compuestos de vitamina C, tales como acido ascorbico; y compuestos de vitamina D, tales como calcitriol; beta-glucano recombinante; concentrado de inmunoglobulina bovina; superoxido dismutasa bovina; la formulacion que incluye fluorouracil, epinefrina, y colageno bovino; hirudina recombinante (r-Hir), inmunogeno VIH-1; anticuerpo anti-TAC humano; hormona de crecimiento humana recombinante (r-hGH); hemoglobina humana recombinante (r-Hb); mecasermina humana recombinante (r-IGF-1); interferon beta-la recombinante; lenograstime (G-CSF); olanzapina; hormona estimulante tiroide recombinante (r- TSH); topotecan; aciclovir sodio; aldesleucina; atenolol; sulfato de bleomicina, calcitonina humana; calcitonina de salmon; carboplatino; carmustina; dactinomicina, daunorrubicina HCl; docetaxel; doxorrubicina HCl; epoetina alfa; etoposido (VP-16); fluorouracilo (5-FU); ganciclovir sodio; sulfato de gentamicina; interferon alfa; acetato de leuprolide; meperidina HCl; metadona HCl; metotrexato sodio; paclitaxel; ranitidina HCl; sulfato de vinblastina; y zidovudina (AZT).
Se divulga que ejemplos especificos adicionales de sustancias activas biologicamente de las categorias anteriores que pueden ser detectados usando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqui incluyen, sin limitacion, antineoplasicos tales como inhibidores de androgeno, antimetabolitos, agentes citotoxicos, e inmunomoduladores; antitusivos tales como dextrometorfan, dextrometorfan bromihidrato, noscapina, citrato de carbetapentano, y clorhidrato de clorfedianol; antihistaminicos tales como maleato de clorfeniramina, tartrato de fenindamina, maleato de pirilamina, succinato de doxilamina y citrato de feniltoloxamina; descongestionantes tales como fenilefrina clorhidrato, clorhidrato de fenilpropanolamina, clorhidrato de pseudoefedrina y efedrina; diversos alcaloides tales como fosfato de codeina, sulfato de codeina y morfina; suplementos minerales tales como cloruro de potasio, cloruro de zinc, carbonato de calcio, oxido de magnesio y otras sales de metales alcalinos y metales alcalinoterreos; resinas de intercambio ionico tales como colestiramina; antiarritmicos tales como N-acetilprocainamida; antipireticos y analgesicos tales como acetaminofen, aspirina e ibuprofeno; supresores del apetito tales como fenilpropanolamina clorhidrato o cafeina; expectorantes tales como guaifenesina; antiacidos tales como hidroxido de aluminio e hidroxido de magnesio; agentes biologicos tales como peptidos, polipeptidos, proteinas y aminoacidos, hormonas, interferones o citoquinas, y otros compuestos peptidicos bioactivos, tales como interleucinas 1-18 incluyendo mutantes y analogos, ARNasa, ADNasa, hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) y analogos, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), factor beta de crecimiento trasnformante (TGF-beta), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor alfa y beta de necrosis tumoral (TNF-alfa y beta), factor de crecimiento de nervios (NGF), factor liberador de hormona de crecimiento (GHRF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor homologo de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFHF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de insulina (IGF), factor 2 inhibidor de la invasion (IIF-2), proteinas morfogeneticas de hueso 1-7 (BMP 1-7), somatostatina, timosina-a-1, T-globulina, superoxido dismutasa (SOD), factores de complemento, hGH, tPA, calcitonina, ANF, EPO e insulina; y agentes antiinfecciosos tales como antifungicos, antivirales, antisepticos y anti bioticos.
Se divulga que sustancias biologicamente activas que pueden ser detectadas usando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqui tambien incluyen radiosensibilizadores, tales como metoclopramida, sensamida o neusensamida (manufacturada por Oxigene); profiromicina (hecha por Vion); RSR13 (hecho por Allos); Thymitaq (hecho por Agouron), etanidazol o lobonguane (manufacturados por Nycomed); gadolinio texafrin (hecho por Pharmaciclics); BuDR/Broxine (hecha por NeoPharm); IPdR (hecha por Sparta); CR2412 (hecha por Cell Therapeutic); L1X (hecha por Terrapin); o similares.
Sustancias biologicamente activas que pueden ser detectadas utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqui incluyen medicaciones para el tracto gastrointestinal o sistema digestivo, por ejemplo, antiacidos, supresores de reflujo, antiflatulentos, antidopaminergicos, inhibidores de la bomba de protones, antagonistas del receptor de H2, citoprotectores, analogos de la prostaglandina, laxantes, antiespasmodicos, antidiarreicos, secuestrantes de acidos biliares y opioides; medicaciones para el sistema cardiovascular, por ejemplo, bloqueadores del receptor beta, bloqueadores del canal de calcio, diureticos, glucosidos cardiacos, antiarritmicos, nitratos, antianginales, vasoconstrictores, vasodilatadores, activadores perifericos, inhibidores de ACE, bloqueadores del receptor de angiotensina, bloqueadores alfa, anticoagulantes, heparina, HSGAGs, farmacos antiplaquetas, fibrinoliticos, factores antihemofilicos, farmacos hemostaticos, agentes hipolipemicos, y estatinas; medicaciones para el sistema nervioso central, por ejemplo hipnoticos, anestesicos, antipsicoticos, antidepresivos, antiemeticos, anticonvulsivos, antiepilepticos, ansioliticos, barbituratos, farmacos para el trastorno del movimiento, estimulantes, benzodiazepina, ciclopirrolona, antagonistas de dopamina, antihistaminicos, colinergicos, anticolinergicos, emeticos, canabinoides, antagonistas de 5-HT; medicaciones para el dolor y/o la conciencia, por ejemplo NSAIDs, opioides y huerfanos tales como paracetamol, antidepresivos triciclicos, y anticonvulsionantes; para trastornos musculoesqueletales, por ejemplo, NSAIDs, relajantes musculares y farmaco de anticolesterasa neuromuscular; medicaciones para el ojo, por ejemplo bloqueadores de la neurona adrenergicos, astringentes, lubricantes oculares, anestesicos topicos, simpatomimeticos, parasimpatoliticos, midriaticos, ciclopejicos, antibioticos, antibioticos topicos,
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farmacos tipo sulfa, aminoglicosidos, fluoroquinolonas, antivirales, antifungicos, imidazoles, polienos, NSAIDs, corticosteroides, inhibidores de mastocitos, agonistas adrenergicos, bloqueadores beta, inhibidores/hiperosmoticos de anhidrasa carbonica, colinergicos, mioticos, parasimpatomimeticos, prostaglandina, inhibidores de prostaglandina/agonistas, nitroglicerina; medicaciones para el oldo, nariz y orofaringe, por ejemplo, simpatomimeticos, antihistamlnicos, anticolinergicos, NSAIDs, esteroides, antisepticos, anestesicos locales, antifungicos, cerumenollticos; medicaciones para el sistema respiratorio, por ejemplo, broncodilatores, NSAIDs, antialergicos, antitusivos, mucollticos, descongestionantes, corticosteroides, antagonistas del receptor beta, anticolinergicos, esteroides; medicaciones para los problemas endocrinos, por ejemplo, androgenos, antiandrogenos, gonadotropina, corticosteroides, hormona del crecimiento, insulina, antidiabeticos, hormonas de la tiroides, farmacos antitiroidales, calcitonina, difosfonato, y analogos de la vasopresina; medicaciones para el sistema reproductivo o sistema urinario, por ejemplo, antifungicos, agentes alcalinizantes, quinolonas, antibioticos, colinergicos, anticolinergicos, anticolinesterasa, antiespasmodicos, inhibidor de la 5-alfa reductasa, bloqueadores alfa 1 selectivos y sildenafil; medicaciones para anticoncepcion, por ejemplo, anticonceptivos orales, espermicidas, y anticonceptivos de reserva; medicaciones para obstetricia y ginecologla, por ejemplo, NSAIDs, anticolinergicos, farmacos hemostaticos, antifibrinollticos, terapia de reemplazo de hormonas, regulador oseo, agonistas del receptor beta, hormona estimulante de follculo, hormona luteinizante, acido gamolenico LHRH, inhibidor de la liberacion de gonadotropina, progestogeno, agonista de dopamina, oestrogeno, prostaglandina, gonadorelina, clomifeno, tamoxifen, y dietilestilbestrol; medicaciones para la piel, por ejemplo, emolientes, antiprurlticos, antifungicos, desinfectantes, escabicida, pediculicida, productos de alquitran, derivados de vitamina A, analogos de vitamina D, queratollticos, abrasivos, antibioticos sistemicos, antibioticos topicos, hormonas, agentes para control de la risa, absorbentes exudados, fibrinollticos, proteollticos, bloqueadores solares, antiperspirantes, y corticosteroides; medicaciones para infecciones e infestaciones, por ejemplo, antibioticos, antifungicos, antileproticos, farmacos antituberculosos, antimalaria, antihelmlnticos, amebicidas, antivirales, antiprotozoarios, y antisuero; medicaciones para el sistema inmune, por ejemplo, vacunas, inmunoglobulina, inmunosupresores, interferon, anticuerpos monoclonales; medicaciones para trastornos alergicos, por ejemplo, antialergicos, antihistaminas, y NSAIDs; medicaciones para la nutricion, por ejemplo, tonicos, preparaciones de hierro, electrolitos, vitaminas, farmacos antiobesidad, farmacos anabolicos, farmacos hematopoyeticos, y farmacos en productos alimenticios; medicaciones para trastornos neoplasicos, por ejemplo, drogas citotoxicas, hormonas sexuales, inhibidores de la aromatasa, inhibidores de la somatostatina, interleucinas recombinantes, G-CSF, y eritropoyetina; medicaciones para diagnostico, por ejemplo, agentes de contraste; y medicaciones para cancer (agentes anticancer).
Ejemplos de medicaciones para el dolor (por ejemplo, analgesicos) que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqul incluyen opiodes tales como buprenorfina, butorfanol, dextropropoxifeno, dihidrocodeina, fentanil, diamorfina (herolna), hidromorfona, morfina, nalbufina, oxicodona, oximorfona, pentazocina, petidina (meperidina), y tramadol; acido salicllico y derivados tales como acido acetilsalicllico (aspirina), diflunisal, y etenzamida; pirazolonas tales como aminofenazona, metamizol, y fenazona; anilidas tales como paracetamol (acetaminofen), fenacetina; y otros tales como ziconotida y tetradirocanabinol.
Ejemplos de medicaciones para la presion sangulnea (por ejemplo, antihipertensores y diureticos) que pueden ser detectados usando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqul incluyen agentes antiadrenergicos, tales como clonidina, doxazosina, guanetidina, guanfacina, mecamilamina, metildopa, moxonidina, prazosina, rescinamina, y reserpina; vasodilatores tales como diazoxida, hidralazina, minoxidil, y nitropruside; diureticos de bajo techo tales como bendroflumetiazida, clorotiazida, clortalidona, hidroclorotiazida, indapamide, quinethazone, mersalyl, metolazone, y teobromina; diureticos de alto techo tales como bumetanida, furosemida, y torasemida; diureticos para reposicion de potasio tales como amiloride, eplerenona, espironolactona, y triamterene; y otros antihipertensores tales como bosentan y ketanserin.
Ejemplos de antitromboticos (por ejemplo, trombollticos, anticoagulantes, y farmacos antiplaquetas) que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqul incluyen antagonistas de vitamina K tales como acenocoumarol, clorindiona, dicumarol, difenadiona, polietil biscoumacetato, phenprocoumon, fenindiona, tioclomarol, y warfarina; grupo de la heparina (inhibidores de la agregacion de plaquetas tales como antitrombina III, bemiparina, dalteparina, danaparoid, enoxaparina, heparina, nadroparina, parnaparina, reviparina, sulodexide, y tinzaparina; otros inhibidores de la agregacion de plaquetas tales como abciximab, acido acetilsalicllico (aspirina), aloxiprin, beraprost, ditazol, carbasalate calcio, cloricromen, clopidogrel, dipiridamol, epoprostenol, eptifibatide, indobufen, iloprost, picotamida, prasugrel, ticlopidina, tirofiban, treprostinil, y triflusal; enzimas tales como alteplasa, ancrod, anistreplasa, brinasa, drotrecogina alfa, fibrinolisina, protelna C, reteplasa, saruplasa, estreptoquinasa, tenecteplasa, y uroquinasa; inhibidores directos de la trombina, tales como argatroban, bivalirudin, desirudin, lepirudin, melagatran, y ximelagatran; otros antitromboticos tales como dabigatran, defibrotide, dermatan sulfato, fondaparinux, y rivaroxaban; y otros tales como citrato, EDTA y oxalato.
Ejemplos de anticonvulsivos que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqul incluyen barbituratos tales como barbexaclona, metarbital, polietilfenobarbital, fenobarbital, y primidona; hidantolnas tales como etotoina, fosfenitoina, mefenitoina, y fenitoina; oxazolidinadionas tales como ethadiona, parametadiona, y trimethadiona; succinimidas tales como ethosuximida, mesuximida, y phensuximida; benzodiazepinas tales como clobazam, clonazepam, clorazepato, diazepam, lorazepam, midazolam, y nitrazepam;
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carboxamidas tales como carbamazepina, oxcarbazepina, rufinamida; derivados de acidos grasos tales como valpromida y valnoctamida; acidos carboxilicos tales como acido valproico, tiagabina; analogos de GABA tales como gabapentina, pregabalina, progabide, y givabatrina; monosacaridos tales como topiramate; alcoholes alilicos aromaticos tales como estiripentol; ureas tales como fenacemida y feneturide; carbamatos tales como emylcamato, felbamato, y meprobamato; pirrolidinas tales como brivaracetam, levetiracetam, nefiracetam, y seletracetam; sulfas tales como acetazolamida, etoxzolamida, sultiame, y zonisamida; propionatos tales como beclamida; aldehidos tales como paraldehido; y bromuros tales como bromuro de potasio.
Ejemplos de agentes anticancer que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistema y metodos descritos aqui incluyen acivicina; aclarubicina; acodazol clorhidrato; acronina; adriamicina; adozelesin; aldesleucina; altretamina; ambomicina; ametantrone acetato; aminoglutethimide; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginase; asperlin; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamide; bisantrene clorhidrato; bisnafide dimesilato; bizelesin; bleomicina sulfato; brequinar sodio; bropirimine; busulfan; cactinomicina; calusterone; caracemide; carbetimer; carbopplatino; carmustina; carubicina clorhidrato; carzelesin; cedefingol; chlorambucil; cirolemicina; cisplatino; cladribina; crisnatol mesilato; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; daunorrubicina clorhidrato; decitabina; dexormaplatino; dezaguanine; dezaguanine mesilato; diaziquone; docetaxel; doxorrubicina; doxorrubicina clorhidrato; droloxifene; droloxifene citrato; dromostanolone propionato; duazomicina; edatrexate; eflornithine clorhidrato; elsamitrucin; enloplatino; enpromate; epipropidina; epirubicina clorhidrato; erbulozol; esorrubicina clorhidrato; estramustina; estramustina fosfato sodio; etanidazol; etoposido; etoposido fosfato; etoprine; fadrozol clorhidrato; fazarabina; fenretinide; floxuridina; fludarabina fosfato; fluorouracil; flurocitabina; fosquidone; fostriecin sodio; gemcitabina; gemcitabina clorhidrato; hidroxiurea; idarrubicina clorhidrato; ifosfamida; ilmofosina; interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-n1; interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gamma-I b; iproplatino; irinotecan clorhidrato; lanreotide acetato; letrozol; leuprolide acetato; liarozol clorhidrato; lometrexol sodio; lomustina; losoxantrone clorhidrato; masoprocol; maytansine; mechlorethamina clorhidrato; megestrol acetato; melengestrol acetato; melphalan; menogaril; mercaptopurina; methotrexate; methotrexate sodio; metoprine; meturedepa; mitindomide; mitocarcin; mitocromin; mitogillin; mitomalcin; mitomicina; mitosper; mitotane; mitoxantrone clorhidrato; acido micofenolico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; peplomicina sulfato; perfosfamida; pipobroman; piposulfan; piroxantrone clorhidrato; plicamicina; plomestane; porfimer sodio; porfiromicina; prednimustina; procarbazina clorhidrato; puromicina; puromicina clorhidrato; pyrazofurin; riboprine; rogletimide; safingol; safingol clorhidrato; semustina; simtrazene; sparfosate sodio; esparsomicina; espirogermanio clorhidrato; espiromustina; espiropplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan sodio; tegafur; teloxantrone clorhidrato; temoporfin; teniposido; teroxirone; testolactone; tiamiprina; tioguanina; thiotepa; tiazofurin; tirapazamina; topotecan clorhidrato; toremifene citrato; trestolone acetato; triciribina fosfato; trimetrexate; trimetrexate glucuronato; triptorelin; tubulozol clorhidrato; mostaza de uracilo; rredepa; vapreotide; verteporfin; vinblastina sulfato; vincristine sulfato; vindesine; vindesine sulfato; vinepidina sulfato; vinglicinate sulfato; vinleurosine sulfato; vinorelbine tartrato; vinrosidina sulfato; vinzolidina sulfato; vorozol; zeniplatino; zinostatin; y zorrubicina clorhidrato.
Otras sustancias biologicamente activas que pueden ser detectadas utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqui incluyen los mencionados en Basic and Clinical Pharmacology (LANGE Basic Science), Katzung and Katzung, ISBN 0071410929, McGraw-Hill Medical, 9th edition (2003).
Condiciones medicas
Pueden utilizarse realizaciones de la invencion para monitorizar uno o mas analitos en el diagnostico, manejo y/o tratamiento de un amplio rango de condiciones medicas. Diversas categorias de condiciones medicas incluyen, por ejemplo, trastornos de dolor, alteraciones en temperatura corporal (por ejemplo fiebre); de disfuncion del sistema nervioso (por ejemplo, sincope, mialgias, trastornos de movimiento, insensibilidad, perdida sensorial, delirio, demencia, perdida de memoria o trastornos del sueno); de los ojos, oidos, nariz y garganta; de las funciones circulatoria y/o respiratoria (por ejemplo, dispnea, edema pulmonar, tos, hemoptisis, hipertension, infarto del micoardio, hipoxia, cianosis, colapso cardiovascular, fallo cardiaco congestivo, edema o choque); de funcion gastrointestinal (por ejemplo, disfagia, diarrea, constipacion, sangrado GI, ictericia, ascitis, indigestion, nausea, vomito); de la funcion del tracto renal y urinario (por ejemplo, acidosis, alcalosis, desbalance de fluidos y electrolitos, azotemia, o anormalidades urinarias); de la funcion sexual y reproduccion (por ejemplo, disfuncion erectil, perturbaciones menstruales, hirsutismo, virilizacion, infertilidad, trastornos asociados con el embarazo y mediciones estandar); de la piel (por ejemplo, eczema, psoriasis, acne, rosacea, infeccion cutanea, enfermedades inmunologicas de la piel o fotosensibilidad); de la sangre (por ejemplo, hematologia); de los genes (por ejemplo, trastornos geneticos); de respuesta a farmacos (por ejemplo, respuestas adversas a farmacos); y de nutricion (por ejemplo, obesidad, trastornos en la alimentacion o definicion nutricional). Otros campos medicos con los cuales las realizaciones de la invencion encuentran utilidad incluyen oncologia (por ejemplo, neoplasmas, enfermedades malignas, angiogenesis, sindromes paraneoplasicos o emergencias oncologicas); hematologia (por ejemplo, anemia, hemoglobinopatias, anemias megaloblasticas, anemias hemoliticas, anemia aplasica, mielodisplasia, fallo de la medula osea, policitemia vera, enfermedades mieloproliferativas, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide cronica, enfermedades malignas linfoides, trastornos de las celulas plasmaticas, biologia de transfusion o trasplante); hemostasis (por ejemplo, trastornos de coagulacion y trombosis, o trastornos de las plaquetas y las
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paredes de los vasos); y enfermedades infecciosas (por ejemplo, sepsis, choque septico, fiebre de origen desconocido, endocarditis, picaduras, quemaduras, osteomielitis, abscesos, envenenamiento por alimentos, enfermedad inflamatoria pelvica, bacterianas (por ejemplo, gram positiva, gram negativa, miscelanea (nocardia, actinomicetos, mixtos), micobacteriana, por espiroquetas, rickettsia, o micoplasma); clamidia; infecciones virales (ADN, ARN), fungicas y por algas; infecciones por protozoarios y helmintos; enfermedades endocrinas; enfermedades nutricionales; y enfermedades metabolicas.
Otras condiciones medicas y/o campos con los cuales las realizaciones encuentran utilidad incluyen aquellas mencionadas en Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper et al., ISBN 0071402357, McGraw-Hill Professional, 16th edition (2004), as! como las mencionadas en Robbins Basic Pathology, Kumar, Cotran, y Robbins, eds., ISBN 1416025340, Elsevier, 7th edition (2005).
Pruebas medicas (por ejemplo, pruebas de sangre, pruebas de orina, y/o otras pruebas de tejidos humanos o animales) que pueden llevarse a cabo utilizando diversas realizaciones descritas aqul incluyen, por ejemplo, pruebas de qulmica general (por ejemplo, los analitos incluyen albumina, nitrogeno ureico en sangre, calcio, creatinina, magnesio, fosforo, protelna total y/o acido urico); pruebas electrollticas (por ejemplo, los analitos incluyen sodio, potasio, cloruro y/o dioxido de carbono); pruebas para diabetes (por ejemplo, los analitos incluyen glucosa, hemoglobina A1C, y/o microalbumina); pruebas de llpidos (por ejemplo, los analitos incluyen apolipoprotelna A1, apolipoprotelna B, colesterol, trigliceridos, lipoprotelna de colesterol de baja densidad y/o lipoprotelna de colesterol de alta densidad); definicion nutricional (por ejemplo, los analitos incluyen albumina, prealbumina, transferrina, protelna enlazante de retinol, glicoprotelna alfa1 acida, y/o ferritina); pruebas hepaticas (por ejemplo, los analitos incluyen alanina transaminasa, albumina, fosfatasa alcalina, aspartato transaminasa, bilirrubina directa, gammaglutamil transaminasa, lactato deshidrogenasa, inmunoglobulina A, inmunoglobulina G, inmunoglobulina M, prealbumina, bilirrubina total y/o protelna total); pruebas cardiacas (por ejemplo, los analitos incluyen apolipoprotelna A1, apolipoprotelna B, troponina-1 cardiaca, creatinina quinasa, creatinina quinasa MB isoenzima, cRp de alta sensibilidad, creatinina de masa quinasa MB isoenzima mioglobina, y/o peptido natriuretico procerebro con terminal N); pruebas para anemia (por ejemplo, los analitos incluyen ferritina, folato, homocisteina, haptoglobina, hierro, receptor de transferrina soluble, capacidad enlazante total de hierro, transferrina, y/o vitamina B12); pruebas pancreaticas (por ejemplo, los analitos incluyen amilasa y/o lipasa); nefropatlas (por ejemplo, los analitos incluyen albumina, alfa1-microglobulina, alfa2-macroglobulina, beta2-microglobulina, cistatina C, protelna enlazante de retinol, y/o transferrina); pruebas en huesos (por ejemplo, los analitos incluyen fosfatasa alcalina, calcio y/o fosforo); monitorizacion de marcadores cancerosos (por ejemplo, los analitos incluyen PSA total); pruebas para la tiroides (por ejemplo, los analitos incluyen tiroxina libre, triyodotironina libre, tiroxina, hormona estimulante de la tiroides y/o triyodotironina); pruebas de fertilidad (por ejemplo, los analitos incluyen gonadotropina corionica beta humana); monitorizacion de farmacos terapeuticos (por ejemplo, los analitos incluyen carbamazepina, digoxina, digitoxina, gentamicina, lidocaina, litio, N-acetil procainamida, fenobarbital, fenitoina, procainamida, teofilina, tobramicina, acido valproico, y/o vancomicina); farmacos inmunosupresores (por ejemplo, los analitos incluyen ciclosporina A, sirolimus, y/o tacrolimus); pruebas para actividad de complemento y/o enfermedad autoinmune (por ejemplo, los analitos incluyen complemento C3, complemento C4, inhibidor C1, protelna reactiva C, y/o factor reumatoide); gamopatlas policlonales/monoclonales (por ejemplo, los analitos incluyen inmunoglobulina A, inmunoglobulina G, inmunoglobulina M, cadenas ligeras 1 g tipo kappa y/o lambda, subclases de inmunoglobulina G 1, 2, 3, y/o 4); pruebas para enfermedades infecciosas (por ejemplo, los analitos inlcuyen antistreptolisina O); pruebas para trastornos inflamatorios (por ejemplo, los analitos incluyen glicoprotelna acida alfa1-antitripsina, celuloplasmina, protelna reactiva C y/o haptoglobina); pruebas de alergia (por ejemplo, los analitos incluyen inmunoglobulina E); pruebas para protelna en orina (por ejemplo, los analitos incluyen alfa1-microglobulina, inmunoglobulina G, cadenas livianas 1 g tipo kappa y/o lambda, microalbumina, y/o fluido protelnico urinario/cerebroespinal); pruebas para protelnas-CSF (por ejemplo, los analitos incluyen inmunoglobulina G y/o protelna en fluido urinario/cerebroespinal); pruebas de toxicologla (por ejemplo, los analitos incluyen acetaminofen en suero, barbituratos en suero, benzodiacepinas en suero, salicilato en suero, antidepresivos triclclicos en suero y/o alcohol etllico en la orina); y/o pruebas para farmacos de abuso (por ejemplo, los analitos incluyen anfetamina, cocalna, barbituratos, benzodiacepinas, extasis, metadona, opiato, peniciclidina, tetrahidrocanabinoides, propoxifeno y/o metacualona). Marcadores especlficos para cancer que pueden ser detectados usando los metodos, dispositivos, cartuchos y kits descritos aqul incluyen, sin limitacion, 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1, Abl interactuador 2, Protelna relacionada con actina 2/3 subunidad compleja 1A, Albumina, Aldolasa A, Fosfatasa alcalina, tipo placenta, Alfa 1 antitripsina, Alfa -1-acidoglicoprotelna 1, Alfa -2-HS-glicoprotelna, Alfa lactalbumina, Alfa-2-macroglobulina, Alfa- fetoprotelna (AFP), Angiogenina ribonucleasa familia RNasa A 5, Angiopoyetina 1, Angiopoyetina 2, Antlgeno identificado por anticuerpo monoclonalKi-67, Antileucoprotelnasa 1 (SLPI), Apolipoprotelna A1, ATP7B, p2- microglobulina, Celulas B, CLL/linfoma 2, protelna X asociada a BcL2, BRCA1, BrCA2, BrMS1, transcripto 1 inducido por butirato, CA15.3/CA27-29, Antlgeno de cancer 125, Antlgeno de cancer 15.3, Antlgeno de cancer 19.9, Antlgeno de cancer 602, Antlgeno de cancer 72-4/TAG-72, antlgeno galactotransferasa asociado con cancer, antlgeno de suero asociado con cancer (CASA), antlgeno Carcinoembrionico (CEA), Catenin beta 1, Catepsina D, Catepsina miembro 8, CC quimioquina 4 (HCC-4), CCL21 (citoquina pequena inducible A21), CCL5, CD15, CD24, CD34, CD44, protelna quinasa 5 de division celular, ceruloplasmina, 1 protelna protooncogenica de cancer cervical p40, c-Ets1, Chaparonina con TCP1, subunidad 3, Quimioquina (motivo c-c) ligando 4, citoquina pequena inducible A4 (CCL4, MIP-1-beta), Quimioquina ligando 5, protelna 1 tipo quitinasa 3(YKL-40), Canal intracelular de cloruros 4
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(CLIC4), cadena de Coriogonadotropina beta, Claudin-3, Claudina-4, clusterina, Factor de coagulacion II (protrombina), Factor de coagulacion III, cadema a del Factor de coagulacion XIII, cadena b del Factor de coagulacion XIII, peptido terminal C de colageno I, Factor estimulante de colonias 2, Factor estimulante de colonias 3, Componente de complemento 3, protelna C reactiva, Creatinina quinasa cerebro (CKB), CTD pequena tipo fosfatasa, Ciclina D1, quinasa 6 dependiente de ciclina (CDK 6), inhibidor 1 de quinasa dependiente de ciclina (p21), Ciclooxigenasa -1, Citocromo c oxidasa Va, Citocromo c-1, Desmina, Distroglicano 1, Endoglina, Endotelina 1, (EGFR), Factor de crecimiento epidermico (EGF), Eritropoyetina, E-selectina, EST variante de traslocacion 4 (EST 4), Inductor de metaloproteinasa de la matriz extracelular(EMMPRIN), Ferritina H, Ferritina L, Factor de crecimiento de fibroblastos 2, fibronectina, ligando Fit-3, Fluorodesoxiglucosa-PET (FDG-PET) con CA125, tirosina quinasa 1 relacionada con Fms (VEGFR-1), GADD45A, Geminina, Glifosato N-acetiltransferasa, precursor de Granulin- epitelina (GEP), Factor de diferenciacion de crecimiento 15, Haptoglobina 1, Haptoglobulina -subunidad a, HE4 (protelna epidimis humana), Her2, HER2-neu, hK10, hK11, hK13, hk6, hk7, hK8, HLA clase II Dop, hLMH1, hLMH2, TNF-1P, Gonadotropina corionica humana- subunidad p, Gonadotropina corionica humana (hCG), IGFBP-2, IL-2R alfa (receptor alfa soluble de interleucina 2), inmunoglobulinas, protelna acida inmunosupresora (1AP), Indoleamina 2,3-dioxigenasa, protelna 1 de enlazamiento a factor de crecimiento tipo insulina, protelna 2 de enlazamiento a factor de crecimiento tipo insulina, protelna 3 de enlazamiento a factor de crecimiento tipo insulina, Integrina a-V, Integrina avp6, Molecula de adhesion intercelular, Interferon alfa 1, Interleucina 1 alfa, Interleucina 1 beta, Interleucina 10, Interleucina 12A, Interleucina 16, fragmento inhibidor de Inter-a-tripsina Kallikreina 8, Queratina, Queratina 18, Queratina, tipo I citoesqueletica 19 (citoqueratina 19), Kit de ligando, KRAS, Lactotransferrina, Laminina-p3, Leptilselectina, receptor de hormona liberadora de la hormona luteinizante, protelna de 90k de enlazamiento a Mac-2, factor estimulante de colonias de macrofagos, factor inhibidor de migracion de macrofagos, antlgeno de suero mamario, Mamoglobina B, M-CAM, MIR21, Mesotelina, MMP3, antlgeno de glicoprotelna tipo mucina, Miosina X, factor beta de crecimiento de nervios, Netrina-1, protelna-55 secretora neuroendocrina, defensina 1 de neutrofilos, defensina 3 de neutrofilos, Nm23-H1, protelna 2 de celulas no metalicas, protelna 1 de celulas no metalicas (NM23A), dominio de O-aciltransferasa que contiene 2, OVX1, OX40, P53, Paraoxonase 2, Pcaf, p-glicoprotelna, fosforribosilaminoimidazol carboxilasa, receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, molecula de adhesion celular endotelial de plaquetas (PECAM-1), factor 4 de plaquetas, protelna A de plasma asociado con embarazo, protelna de zona de embarazo, Procol-lys 1,2 oxoglut 5-digoxig 3, Procol-lys 1,2 oxoglute 5-digoxig 1, receptor Progesterona (PR), Prolactina, protelna secretora de la prostata PSP94, antlgeno especlfico de la prostata (PSA), Prostatina, protelna 1 de enlazamiento a Protelna quinasa C, p-selectina, Pirrolina-5-carboxilato reductasa 1, regulador de la senalizacion 12 de protelna G, Reticulocalbina, S-100 cadena alfa, s-adenosilhomocistelna hidrolasa, protelna A amiloide de suero, siete protelnas de dominio transmembrana, factor determinante del sexo Y-caja-4, Sialyl SSEA-1, Citoquina pequena inducible A18 (CCL18, M1P-4), Citoquina pequena inducible A2 (CCL2), Citoquina pequena inducible A3 (CCL3) (protelna 1 -alfa inflamatoria de macrofago, Citoquina pequena inducible B5 (CXCL5), Somatostatina, factor de crecimiento de Somatotropina, antlgeno 1 de carcinoma de celulas escamosas, antlgeno 2 de carcinoma de celulas escamosas, receptores de hormonas esteroidales, Survivina, Syndecan-1, Sinucleina gamma, Tetranectina, Tetraspanina 9, TGF-a, timidina fosforilasa (TP), tiroglobulina (Tg), inhibidor de tejido de metaloproteinasas 2, antlgeno P35B de trasplante especlfico para tejido, activador (tPA) de plasminogeno tipo tejido, topoisomerasa II, receptor de transferencia p90 CD71, factor alfa de crecimiento transformante, factor beta 1 de crecimiento transformante, translocasa de membrana de mitocondria externa, Transtirretina, fragmento de Transtirretina (realbumina), glicoprotelna de trofoblastos, Tropomiosina 1 cadena alfa (alfa-tropomisoina), Tripsina, Tubulina p2, Tubulina p3, miembro 5 de la superfamilia de factor del necrosis tumoral (ligando) (CD154), miembro 6 de superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando) (ligando Fas), factor alfa de necrosis tumoral, factor de receptor p75/p55 de necrosis tumoral, factor de receptor del miembro 6 de superfamilia de necrosis tumoral (fas), protelna 1 asociada al receptor del factor de necrosis tumoral, protelna p53 tumoral, enzima E2C de conjugacion con ubiquitina (enzima conjugadora de ubiquitina), angiostatina urinaria (uAS), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor promotor del crecimiento vascular en musculos lisos (VSGPIF-Spondin), VEGF (165) b, V-erb-b2, protelna enlazante de Vitamina D, protelna C dependiente de Vitamina K, Vitronectina, factor de Von Willebrand, tumor 1 de Wilms (WT-1), protelna 11 de enlazamiento de dominio WW, protelna 1 de enlazamiento de caja X y YKL-40. Vease Polanski et al., Biomarker Insights, 1:1 (2006); Cherneva et al., Biotechnol. & Biotechnol. EQ. 21/2007/2:145 (2007); Alaoui-Jamali et al., J. Zhejiang Science B 7:411 (2006); Basil et al., Cancer Res. 66:2953 (2006); Suh et al., Expert Rev. Mol. Diagn. 10:1069 (2010); y Diamandis, E. P., Molecular and Cellular Proteomics 3:367 (2004).
Otros analitos que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistemas y metodos descritos aqul incluyen los mencionados en Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, Burtis, Ashwood, y Bruns, ISBN 0721601898, Elsevier, 4th edition (2006).
Los metodos de la invencion pueden ser configurados para detectar un panel de combinacion predeterminado de analitos que puede ser utilizado para entender la condicion medica del sujeto. Por ejemplo, un panel de combinacion puede incluir la deteccion de patogenos, agentes terapeuticos usados para tratar los patogenos en sospecha, y un biomarcador potencial para monitorizar el proceso farmacologico terapeutico (eficacia o farmacocinetica), o monitorizar la presencia del patogeno o subproductos del patogeno. Adicionalmente, se podrla prever un panel de tratamiento de la enfermedad configurado para utilizar para la deteccion de una enfermedad o un biomarcador de enfermedad, el nivel de concentracion de un farmaco terapeutico para uso en el tratamiento de la enfermedad
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sospechada, un biomarcador potencial para monitorizar el progreso farmacologico terapeutico (eficacia o farmacocinetica), y un biomarcador de quimica general u otro marcador fisiologico de la enfermedad o efecto del tratamiento. De esta manera, los paneles para la deteccion de analitos pueden utilizarse para informar y guiar hacia una decision medica apropiada.
Por ejemplo, los sistemas y metodos descritos pueden ser utilizados para monitorizar sujetos inmunocomprometidos despues de trasplante alogeneico. En sujetos de trasplante que reciben un organo solido, medula osea, celulas madre hematopoyeticas u otras donaciones alogeneicas, hay necesidad de monitorizar el estado inmune, la funcion de los organos y, si es necesario, identificar rapida y exactamente las infecciones oportunistas. El tacrolimus (tambien FK-506, Prograf, o Fujimicina) es un farmaco inmunosupresor cuyo principal uso es despues del trasplante de organos alogeneicos reducir la actividad del sistema inmune del sujeto y asi disminuir el riesgo de rechazo del organo. Reduce la produccion de interleucina-2 (IL-2) por las celulas T. Tambien se utiliza en una preparacion topica en el tratamiento de dermatitis atopica severa (eczema), uveitis refractaria severa despues de trasplante de medula osea, y la condicion de la piel conocida como vitiligo. Es una macrolida lactona de 23 miembros descubierta en 1984 a partir del caldo de fermentacion de una muestra de suelo Japones que contenia la bacteria Streptomyces tsukubaensis. Tiene propiedades inmunosupresoras similares a la ciclosporina, pero mucho mas potente en volumenes iguales. La inmunosupresion con tacrolimus fue asociada con una rata significativamente inferior de rechazo agudo en comparacion con la inmunosupresion basada en ciclosporina (30.7% versus 46.4%) en un estudio. El rendimiento a largo plazo no ha sido mejorado en el mismo nivel. El tacrolimus normalmente es preescrito como parte de un coctel postrasplante que incluye esteroides, micofenolato e inhibidores del receptor de IL-2. Las dosificaciones se titulan para direccionar los niveles sanguineos. Los efectos laterales pueden ser severos e incluyen infeccion, dano cardiaco, hipertension, vision borrosa, problemas de higado y rinon, ataques, tremores, hipercalemia, hipomagnesemia, hiperglicemia, diabetes mellitus, picazon, insomnio y problemas neurologicos tales como confusion, perdida de apetito, debilidad, depresion, calambres y neuropatia. Ademas el tacrolimus puede incrementar potencialmente la severidad de condiciones fungicas o infecciosas existentes, tales como herpes zoster o infecciones virales de polioma, y ciertas reacciones cruzadas de antibioticos con tacrolimus.
La medicion de la creatinina en suero es una prueba simple y es el indicador mas comunmente utilizado de la funcion renal. Una elevacion en los niveles de creatinina en sangre se observa solamente con dano marcado a los nefrones en funcionamiento. Por lo tanto, esta prueba no es adecuada para detectar una enfermedad renal en etapa temprana. Una estimacion mejor de la funcion renal es dada por la prueba de eliminacion de creatinina. La eliminacion de creatinina puede calcularse exactamente utilizando la concentracion de creatinina en suero y una parte o todas las siguientes variables; sexo, edad, peso y raza tal como lo sugiere la American Diabetes Association sin recoleccion de orina durante 24 horas. Algunos laboratorios calcularan la eliminacion de creatinina si esta escrita en la forma de solicitud de patologia; y, la edad, sexo y peso necesario si estan incluidas en la informacion para el sujeto.
Hay una necesidad de monitorizar los niveles de creatinina y tacrolimus a partir de la misma muestra de sangre de un sujeto puesto que la monitorizacion de la concentracion del farmaco y la funcion renal pueden ayudar y guiar al medico para una terapia optima postrasplante. La terapia de optimization es un balance ajustado para prevenir el rechazo pero tambien para asegurar la funcion inmune con el fin de combatir infecciones oportunistas y los resultados globales en el cumplimiento potenciado del sujeto de la terapia inmunosupresora. En gran parte, los receptores de trasplantes sucumben al rechazo del trasplante, a la enfermedad de injerto versus anfitrion, o a las infecciones oportunistas. En las primeras dos, los agentes inmunosupresores pueden anular o inhibir las reacciones. Sin embargo, si el sujeto tiene una infeccion subyacente, entonces el manejo clinico es un reto. Para un ejemplo especifico, un sujeto de trasplante de corazon, o de pulmon que presente fiebre de origen desconocido entra en una instalacion para el cuidado de la salud. El sujeto es iniciado con antibioticos de amplio espectro hasta que se conocen los resultados de los cultivos. Si la condicion empeora y el cultivo revela una infeccion especifica, por ejemplo una Candida, puede administrarse un antifungico especifico, fluconazol, al sujeto conocido. Sin embargo, este antifungico puede alterar los niveles del agente inmunosupresor dado a casi todos los receptores de trasplantes alogeneicos, tacrolimus. Al probar ambos niveles de tacrolimus y creatinina, el medico suspende el tacrolimus, creyendo que el fluconazol derrotara la infeccion, y de manera rapida. Bajo este regimen, el sujeto puede empeorar y la especie de Candida es resistente a fluconazol, y el sujeto entonces es iniciado con un agente antifungico apropiado. Sin embargo, puesto que el tacrolimus puede ser suspendido, la terapia inmunosupresora no es manejada y el sujeto puede dejar de responder a cualquier terapia adicional y puede sobrevenir la muerte. Asi, si hubiera una prueba para monitorizar simultaneamente la creatinina (funcion renal), los niveles en sangre de tacrolimus y la identification exacta de las infecciones oportunistas, el sujeto anterior podria haber sido salvado.
Los metodos de la invention pueden incluir un sistema automatizado de un metodo de deteccion sencillo, sin preparacion de muestra, multiplex para determinar el nivel de farmaco, la toxicidad o efecto adverso determinante, y la identificacion del patogeno que tiene un papel critico en la definition del sujeto inmunocomprometido. Por ejemplo, un cartucho que tiene portales o pozos que contienen 1) particulas magneticas que tienen anticuerpos especificos para la creatinina cubiertas en su superficie, 2) particulas magneticas que tienen anticuerpos especificos de tacrolimus sobre su superficie, y 3) particulas magneticas que tienen sondas de acidos nucleicos especificas para identificar especies de patogenos podrian ser empleadas para determinar rapidamente y proveer valores de manejo
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cllnico para un sujeto de trasplante dado. Las infecciones oportunistas que pueden ser monitorizadas en tales sujetos, y cualquier otra poblacion de pacientes en riesgo de infeccion incluyen, sin limitacion, infecciones fungicas; Candida (cepas resistentes y no resistentes); infecciones bacterianas con gram negativos, (por ejemplo, E. coli, estenotrofomonas maltophilia, Klebsiella pneumonia/oxytoca, o Pseudomonas aeruginosa); y otras infecciones bacteriana gram positivas (por ejemplo, especies de Staphylococcus: S. aureus, S. pneumonia, E. faecalis, y E. faecium). Otras infecciones oportunistas que pueden ser monitorizadas incluyen staphylococcus negativos a coagulasa, Corynebacterium spp., Fusobacterium spp., y Morganella morganii, y organismos virales, tales como CMV, BKV, EBC, HHV-6, HIV, HCV, HBV, y HAV.
Los sistemas y metodos descritos tambien pueden ser utilizados para monitorizar y diagnosticar pacientes de cancer como parte de una prueba diagnostica multiplex. Una forma especlfica de cancer, el cancer colorrectal, ha demostrado ser una promesa positiva para tratamiento medico personalizado para un tumor solido especlfico. Pueden utilizarse marcadores farmacogeneticos para optimizar el tratamiento de los canceres colorrectales y otros. Existe una variation genetica individual significativa en el metabolismo de farmacos de 5FU, capecitabina, irinotecan, y oxaliplatino que influye tanto en la toxicidad como eficacia de estos agentes. Ejemplos especlficos de marcadores geneticos incluyen UGT1A1*28 que llevan a la conjugation reducida de SN-38, el metabolito activo de irinotecan, dando como resultado una rata incrementada de efectos adverso, especialmente neutropenia. En un grado menor, la toxicidad incrementada de 5-FU es predicha por DPYD*2A. Un numero variable de polimorfismos repetidos en tandem en la region potenciadora de la timidilato sintasa, en combination con un polimorfismo de nucleotidos sencillo C>G, puede predecir una respuesta mas pobre a 5-FU. La eficacia del oxaliplatino es influida por polimorfismos en componentes de sistemas de reparation de ADN, tales como ERCC1 y XRCC1. Los cambios polimorficos en el receptor de factor del crecimiento endotelial predicen probablemente la eficacia del cetuximab. Adicionalmente, el efecto citotoxico mediado por celulas dependiente de anticuerpos del cetuximab puede ser reducido por polimorfismos en los receptores C del fragmento de inmunoglobulina G. Los cambios polimorficos en el gen VEGF y el gen 1 alfa del factor inducible por hipoxia tambien se consideran como participates en la variabilidad del resultado de la terapia. Asl, la identification de tales polimorfismos en sujetos puede ser utilizada para ayudar a los medicos con las decisiones acerca del tratamiento. Por ejemplo, se han desarrollado pruebas geneticas basadas en PCR para ayudar a los medicos con las decisiones acerca de los tratamientos terapeuticos para sujetos con cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), cancer colorrectal (CRC) y cancer gastrico. La expresion de ERCC1, TS, EGFR, RRM1, VeGfR2, HeR2, y la detection de mutaciones en KRAS, EGFR, y bRaF estan disponibles para los medicos con el fin de identificar la option terapeutica optima. Sin embargo, estas pruebas por PCR no estan disponibles en el sitio y asl la muestra debe ser enviada a un laboratorio externo. Frecuentemente se hace biopsia de estos tumores solidos y se preparan muestras FFPE (fijadas en formalina, (tejido) embebido en parafina). Los sistemas y metodos descritos pueden ser usados durante 5-7 dlas para obtener los datos e information y usar las muestras fijadas requeridas para los metodos existentes. Los sistemas y metodos descritos pueden proveer una plataforma sencilla para analizar muestras, sin preparation de las muestras, para tipo de analito multiples, como en cancer para farmacos quimioterapeuticos, genotipificacion, toxicidad y marcadores de eficacia lo que puede revolucionar la practica de la medicina personalizada y proveer una prueba diagnostica rapida y exacta.
Los sistemas y metodos tambien pueden ser utilizados para monitorizar y diagnosticar enfermedades neurologicas, tales como demencia (una perdida de capacidad cognitiva en una persona previamente incapacitada) y otras formas de incapacidad cognitiva. Sin establecer cuidadosamente la historia, el slndrome a plazo corto de delirio (que frecuentemente dura de dlas a semanas) puede confundirse facilmente con la demencia, porque tienen todos los slntomas en comun excepto la duration, y el hecho de que el delirio esta frecuentemente asociado con sobreactividad del sistema nervioso simpatico. Algunas enfermedades mentales, incluyendo la depresion y la psicosis, tambien pueden producir slntomas que deben de ser diferenciados tanto del delirio como de la demencia. Tambien se llevan a cabo pruebas sangulneas de rutina para establecer causas tratables. Estas pruebas incluyen vitamina B12, acido folico, hormona estimulante de la tiroides (TSH), protelna reactiva C, recuento sangulneo completo, electrolitos, calcio, funcion renal y enzimas del hlgado. Las anormalidades pueden sugerir deficiencia de vitaminas, infeccion u otros problemas que producen comunmente confusion o desorientacion en los mayores. El problema se complica por el hecho de que estos causan confusion mas frecuentemente en personas que tienen demencia temprana, de tal manera que la “reversion” de tales problemas puede finalmente ser solo temporal. Las pruebas para alcohol y otros farmacos conocidos por inducir demencia pueden estar indicadas. Los inhibidores de acetilcolinesterasa-Tacrina (Cognex), donepezil (Aricept), galantamina (Razadyne), y rivastigmina (Exelon) son aprobadas por la United States Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de demencia inducida por la enfermedad de Alzheimer. Pueden ser utiles para otras enfermedades similares que producen demencia tales como Parkinson o demencia vascular. Los bloqueadores de N-metil-D-aspartato incluyen memantina (Namenda), la cual es un farmaco representativo de esta clase. Puede utilizarse en combinacion con inhibidores de acetilcolinesterasa. Los inhibidores del deposito de amiloides incluyen minociclina y clioquinolina, los cuales son antibioticos que pueden ayudar a reducir los depositos amiloides en los cerebros de las personas con enfermedad de Alzheimer. La depresion esta asociada frecuentemente con la demencia y en general empeora el grado de incapacidad cognitiva y de comportamiento. Los antidepresivos tratan efectivamente los slntomas cognitivos y de comportamiento de la depresion en sujetos con enfermedad de Alzheimer, pero las evidencias para su uso en otras formas de demencia es debil. Muchos sujetos con demencia experimentan slntomas de ansiedad. Aunque las benzodiacepinas como el diazepam (Valium) han sido utilizadas para tratar la ansiedad en otras situaciones, frecuentemente se evitan porque
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pueden incrementar la agitacion en personas con demencia y probablemente empeoren los problemas cognitivos o son demasiado sedantes. La Buspirona (Buspar) es ensayada inicialmente con frecuencia para ansiedad media a moderada. Hay poca evidencia sobre la efectividad de las benzodiazepinas en la demencia, mientras que hay evidencia para la efectividad de los antipsicoticos (a bajas dosis). La selegilina, un farmaco utilizado primariamente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, parece hacer mas lento el desarrollo de la demencia. Se considera que la selegilina actua como un antioxidante, previniendo el dano por radicales libres. Sin embargo, tambien actua como un estimulante, haciendo diflcil determinar si el retardo en la aparicion de los slntomas de la demencia es debido a la proteccion frente a los radicales libres o a la elevacion general de la actividad cerebral proveniente del efecto estimulante. Tanto los antipsicoticos tlpicos (tales como el haloperidol) como los antipsicoticos atlpicos tales como (risperidona) incrementan el riesgo de muerte en psicosis asociada con demencia. Esto significa que cualquier uso de la medicacion antipsicotica para psicosis asociada con la demencia esta fuera de las recomendaciones y solo deberla ser considerada despues de discutir los riesgos y beneficios del tratamiento con estos farmacos y despues de que hayan fallado otras modalidades de tratamiento. En el Reino Unido alrededor de 144,000 pacientes de demencia son preescritos innecesariamente con farmacos antipsicoticos, alrededor 2,000 sujetos mueren como resultado del consumo de farmacos cada ano. La demencia puede ser categorizada ampliamente en dos grupos: demencias corticales y demencias subcorticales. Las demencias corticales incluyen: la enfermedad de Alzheimer, demencia vascular (tambien conocida como demencia por multinfartos), incluyendo la enfermedad de Binswanger, demencia con cuerpos de Lewy (DLB), demencia persistente inducida por alcohol, slndrome de Korsakoff, encefalopatla de Wernicke, degeneraciones lobulares frontotemporales (FTLD), incluyendo la enfermedad de Pick, demencia frontotemporal (o variante frontal FTLD), demencia semantica (o variante FTLD temporal), afasia no fluida progresiva, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugillstica, enfermedad de Moyamoya, tebestia (frecuentemente confundida con un cancer), atrofia cortical posterior o slndrome de Benson. Las demencias subcorticales incluyen la demencia debido a la enfermedad de Huntington, la demencia debida a hipotiroidismo, demencia debida a la enfermedad de Parkinson, demencia debida a la deficiencia de vitamina B1, la demencia debida a la deficiencia de vitamina B12, la demencia debida a la deficiencia de folato, la demencia debido a slfilis, demencia debida a hematomas subdural, la demencia debida a hipercalcemia, la demencia debida a hipoglicemia, el complejo demencia SIDA, pseudodemencia (un episodio depresivo principal con slntomas cognitivos prominentes), demencia persistente inducida por aubstancia (relacionada con el uso psicoactivo y ausentismo temprano), demencia debida a etiologlas multiples, demencia debida a otras condiciones medicas generales (por ejemplo, fallo renal en etapa terminal, enfermedad cardiovascular, etc.), o demencia no especificada de otra manera (utilizada en casos donde no se satisfacen criterios especlficos). La enfermedad de Alzheimer es una forma comun de demencia. Hay tres companlas que actualmente ofrecen pruebas de diagnostico solamente para investigation de protelnas (Satoris), variantes de empalme (Exonhit), o niveles de expresion de protelnas (Diagenic) en sujetos que sufren de demencia, enfermedad de Lewy Body, o incapacidad cognitiva moderada. Puesto que la demencia esta asociada fundamentalmente con muchas enfermedades neurodegenerativas, la capacidad para probar estas protelnas, como biomarcadores para la enfermedad, junto con niveles de farmacos o metabolitos de farmacos en una plataforma sencilla ayudara a los medicos a ajustar la dosificacion, alterar un regimen, o en general monitorizar la progresion de la enfermedad. Estas pruebas se llevan a cabo corrientemente en localizaciones alejadas del sujeto y del proveedor de salud. Asl, para tener la capacidad de monitorizar los niveles de farmaco y el biomarcador en el mismo sistema de detection, en el sitio se proveera una ventaja enorme para esta enfermedad debilitante y devastadora. El metodo de la invention puede ser multiplex, sin preparation de muestras, con un metodo de deteccion sencillo, un sistema automatizado para determinar el nivel de farmaco, la toxicidad o efectos adversos determinantes y el biomarcador potencial de la progresion de la enfermedad. Por ejemplo, un cartucho que tenga portales o pozos que contengan 1) partlculas magneticas que tengan anticuerpos especlficos para biomarcadores protelnicos decorados en su superficie, 2) partlculas magneticas que tengan anticuerpos especlficos sobre su superficie y 3) partlculas magneticas que tengan sondas especlficas para acidos nucleicos para identificar los niveles de expresion de protelna podrlan emplearse para determinar rapidamente y proveer valores de manejo cllnico para un sujeto con demencia dado.
Los metodos de la invencion tambien pueden ser utilizados para monitorizar y diagnosticar enfermedades infecciosas en un sistema multiplex, automatizado sin preparacion de muestra. Ejemplos de patogenos que pueden ser detectados utilizando los dispositivos, sistemas y metodos de la invencion incluyen por ejemplo, Candida (cepas resistentes y no resistentes), por ejemplo, C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, y C. parapsilosis; A. fumigatus; E. coli, Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella pneumonia/oxytoca, P. aeruginosa; Staphylococcus spp. (e.g., S. aureus o S. pneumonia); E. faecalis, E. faecium, staphylococcus spp. Negativos a coagulasa, Corynebacterium spp., Fusobacterium spp., Morganella morganii, Pneumocystis jirovecii, conocidas previamente como pneumocistis carinii, F. hominis, streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Poliomavirus JC poliomavirus (el virus que produce la leucoencefalopatla multifocal progresiva), Acinetobacter baumanni, Toxoplasma gondii, Citomegalovirus, Aspergillus spp., Kaposi's Sarcoma, cryptosporidium, Cryptococcus neoformans, y Histoplasma capsulatum, entre otros organismos infecciosos de bacterias, levaduras, fungicos, virus, priones, mohos, actinomicetos, protozoarios, paraslticos, protistos y helmlnticos.
Los metodos de la invencion tambien pueden ser utilizados para identificar y monitorizar la patogenesis de la enfermedad en un sujeto, para seleccionar intervenciones terapeuticas, y para monitorizar la efectividad del tratamiento seleccionado. Por ejemplo, para un paciente que tiene o esta en riesgo de una infection viral, los
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metodos de la invencion pueden ser utilizados para identificar el virus infeccioso, la carga viral y para monitorizar el recuento de globulos blancos y/o biomarcadores indicativos del estado de la infeccion. La identidad del virus puede ser utilizada para seleccionar una terapia apropiada. La intervencion terapeutica (por ejemplo, un agente antiviral particular) puede ser monitorizada tambien para correlacionar el regimen de tratamiento con la concentracion circulante de agente antiviral y carga viral para asegurar que el paciente esta respondiendo al tratamiento.
Los metodos de la invencion pueden ser utilizados para monitorizar una infeccion viral en un sujeto, por ejemplo, con un panel viral configurado para detectar citomegalovirus ((CMV), virus de Epstein Barr, virus BK, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de Herpes simplex (HSV), HSV1, HSV2, Virus respiratorio sincicial (RSV), Influenza; Influenza A, Influenza A subtipo H1, Influenza A subtipo H3, Influenza B, Human Herpes Virus 6, Human Herpes Virus 8, Human Metapneumovirus (hMPV), Rhinovirus, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3, y Adenovirus. Los metodos de la invencion pueden ser usados para monitorizar una terapia adecuada para el sujeto con una infeccion viral (e.g., Abacavir, Aciclovir, Aciclovir, Adefovir, Amantadine, Amprenavir, Ampligen, Arbidol, Atazanavir, Atripla, Boceprevir, Cidofovir, Combivir, Darunavir, Delavirdine, Didanosine, Docosanol, Edoxudine, Efavirenz, Emtricitabina, Enfuvirtide, Entecavir, Famciclovir, Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnet, Fosfonet, Ganciclovir, Ibacitabina, Imunovir, Idoxuridina, Imiquimod, Indinavir, Inosine, inhibidor de integrasa, Interferon tipo III, Interferon tipo II, Interferon tipo I, Interferon a, Interferon p, Lamivudine, Lopinavir, Loviride, Maraviroc, Moroxydine, Methisazone, Nelfinavir, Nevirapine, Nexavir, analogos de nucleosidos, Oseltamivir (Tamiflu), Peginterferon alfa-2a, Penciclovir, Peramivir, Pleconaril, Podophyllotoxin, Raltegravir, inhibidor de transcriptasa reversa, Ribavirin, Rimantadine, Ritonavir, Pyramidina, Saquinavir, Stavudine, aceite de arbol del te, Tenofovir, Tenofovir disoproxil, Tipranavir, Trifluridina, Trizivir, Tromantadine, Truvada, Valaciclovir (Valtrex), Valganciclovir, Vicriviroc, Vidarabina, Viramidina, Zalcitabina, Zanamivir (Relenza), o Zidovudine), y para monitorizar la concentracion circulante del agente terapeutico administrado al sujeto.
Los metodos de la invencion tambien pueden ser utilizados para monitorizar pacientes con VIH/SIDA. Cuando los medicos sospechan de una infeccion aguda (por ejemplo, un sujeto con un reporte de comportamiento de riesgo reciente en asociacion con slntomas y signos del slndrome retroviral agudo), se lleva a cabo usualmente una prueba de ARN HIV. Los altos niveles de aRn de HIV detectados en plasma a traves del uso de ensayos de amplificacion sensibles (PCR, bDNA, o NASBA), en combinacion con una prueba de anticuerpo de HIV negativo o indeterminado, soporta el diagnostico de infeccion por HIV aguda. Los resultados de PCR positivos de bajo nivel (<5000 copias/mL) frecuentemente no son diagnostico de infeccion aguda por HIV y deberlan repetirse para excluir un resultado de falso positivo. Los niveles de ARN de HIV tienden a ser muy altos en una infeccion aguda. Sin embargo un valor bajo puede representar cualquier punto de la pendiente ascendente o descendente de la viremia asociada con la infeccion aguda. Los niveles de ARN de HIV en plasma durante la seroconversion no parecen significativamente diferentes en sujetos que tienen slntomas agudos versus aquellos que son asintomaticos. La viremia ocurre aproximadamente 2 semanas antes de la detection de una respuesta inmune especlfica en los sujetos diagnosticados con infeccion por VIH aguda por ARN VIH. Los slntomas de fiebre y similares a resfriado son comunes en la infeccion aguda por HIV pero lo son picazon no especlfica, ulceras mucocutaneas o candidiasis farlngea y meningismo son mas especlficos y deberlan elevar el Indice de pruebas de sospecha que requieren todavla pruebas de antibioticos con inmunoprecipitacion Western de confirmation a 3 a 6 semanas mas tarde.
Los sujetos que pasan por la prueba de VIH que no se sospecha que esten en etapas agudas de infeccion deberlan recibir la prueba de anticuerpos de VIH de acuerdo con el protocolo estandar. Los resultados de las pruebas de anticuerpos que inicialmente son negativas deberlan ser seguidos con pruebas para anticuerpos de VIH a los 3 meses para identificar la infeccion por VIH en individuos que pueden no haber sido seroconvertidos en el momento de la presentation inicial. Los niveles de ARN de VIH en plasma indican la magnitud de la replication del VIH y su rata asociada de destruction de celulas T CD4+ mientras que los recuentos de celulas T CD4+ indican el grado del dano inmune inducido por VIH ya sufrido. La medicion regular periodica de los niveles de ARN de VIH en plasma y del recuento de celulas T CD4+ es necesaria para determinar el riesgo de progresion de la enfermedad en un individuo infectado por VIH para determinar cuando iniciar o modificar los reglmenes de tratamiento antirretrovirales.
A medida que las ratas de progresion de la enfermedad difieren entre individuos, las decisiones sobre el tratamiento deberlan ser individualizadas por el nivel de riesgo indicado por los niveles de ARN de VIH en plasma y recuentos de celulas T CD4+. Las gulas y recomendaciones actuales de la OMS para la terapia para VIH incluyen una combinacion de los siguientes farmacos, AZT (zidovudina), 3TC (lamivudina), ABC (abacavir), ATV (atazanavir), d4T (estavudina), ddI (didanosina), NVP (nevirapina), EFV (efavirenz), FTC (emtricitabina), LPV (lopinavir), RTV (ritonavir), TDF (tenofovir disoproxil fumarato) en reglmenes establecidos. La terapia con farmacos para el VIH es un inicio en sujetos que tienen un recuento de CD4 < 350 celulas/mm3 independiente de los slntomas cllnicos. Al menos uno de los cuatro siguientes reglmenes para sujetos aun no sometidos a tratamiento antirretroviral comienza: 1) AZT + 3TC + EFV, 2) AZT + 3TC + NVP, 3) TDF + 3TC o FTC+EFV, o 4) TDF + 3TC ir FTC + NVP. Estos reglmenes evitan que la d4T (estavudina) limite la toxicidad desfigurante, no placentera y potencialmente amenazante para la vida de este farmaco. El fallo del tratamiento usualmente se determina por la carga viral, un valor persistente de 5,000 copias/ml confirma el fallo del tratamiento. En casos donde la medicion de la carga viral no esta disponible, los criterios inmunologicos (recuentos de celulas CD4) pueden utilizarse para determinar el progreso terapeutico. En casos de fallo del tratamiento, se agregan un inhibidor de proteasa potenciado mas dos
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analogos de nucleosidos al regimen y se considera una terapia antirretroviral de segunda ilnea. El ATV mas una dosis baja de RTV, o LPV con baja dosis de RTV tambien se considera terapia de segunda llnea. Frecuentemente la meta en los casos de fallo de tratamiento es reglmenes temporizados mas simples y dosis fijas.
Para sujetos que fallan los reglmenes de segunda llnea de tratamiento deblan ser mantenidos sobre un regimen tolerado para la duracion. El uso de una terapia antirretroviral de combinacion potente para suprimir la replicacion del VIH por debajo de los llmites de deteccion de los ensayos de ARN de VIH de plasma sensibles limita el potencial para la selection de las variantes de VIH resistentes antirretrovirales, el principal factor limitante de la capacidad de los farmacos antirretrovirales para inhibir la replicacion del virus y retardar la progresion de la enfermedad. Por lo tanto, la supresion maxima alcanzable de la replicacion del VIH deberla ser la meta de la terapia. Los medios mas efectivos para lograr la supresion durable de la replicacion del VIH es la initiation simultanea de combinaciones de farmacos anti VIH efectivos con los cuales el sujeto no ha sido tratado previamente y que no tienen resistencia cruzada con agentes antirretrovirales con los cuales el sujeto haya sido tratado previamente. Cada uno de los farmacos antirretrovirales usados en reglmenes de terapia de combinacion deberlan ser usados siempre de acuerdo con programaciones y dosificaciones optimas. Los farmacos antirretrovirales efectivos disponibles son limitados en numero y mecanismo de action, y se ha documentado la resistencia cruzada entre farmacos especlficos. Por lo tanto, cualquier cambio en la terapia antirretroviral incrementa las restricciones terapeuticas futuras.
La monitorizacion de los sujetos con VIH/SIDA en cuanto a su carga viral, niveles de farmaco, recuentos de celulas CD4 y patrones de toxicidad en un metodo diagnostico de plataforma sencilla proveerla ventajas distintas a un sujeto. Los metodos de la invention pueden ser utilizados en un metodo multiplex, sin preparation de la muestra, sencillo, en un sistema automatizado para determinar el nivel de farmaco, la toxicidad o los determinantes de los efectos adversos, y el biomarcador potencial de la progresion de la enfermedad. Por ejemplo, un cartucho que tenga portales o pozos que contienen 1) partlculas magneticas que tengan anticuerpos especlficos para celulas CD4 decorados sobre su superficie, 2) partlculas magneticas que tengan anticuerpos especlficos del biomarcador de toxicidad sobre su superficie, y 3) partlculas magneticas que tengan sondas especlficas de acidos nucleicos para identificar los niveles de carga viral podrlan emplearse para determinar y proveer rapidamente valores de manejo cllnico para un sujeto dado con VIH/SIDA.
Se divulga que los sistemas y metodos descritos aqul tambien pueden ser utilizados para monitorizar y diagnosticar enfermedades inmunes en un sujeto (por ejemplo enfermedad de Crohn, ileitis, enteritis, enfermedad inflamatoria del intestino, slndrome de intestino irritable, colitis ulcerativa, as! como enfermedad inmune no gastrointestinal). El desarrollo relativamente reciente de los agentes disenados geneticamente tiene el potencial de alterar el tratamiento de una enfermedad inmune radicalmente, y se introdujo el Remicade (tambien conocido como Infliximab, un anticuerpo anti-TNF) como una nueva clase terapeutica con alta eficacia, rapido inicio de su accion, efecto prolongado y tolerancia mejorada. Sin embargo estos agentes son costosos y al menos una tercera parte de los pacientes elegibles no muestra ninguna respuesta util. El hallazgo de un medio para predecir aquellos que van a responder, y anticipar que son relapsos es, por lo tanto, de importancia obvia. Los linfocitos tipo 1 auxiliares T (Th1) orquestan mucha de la information en la enfermedad de Crohn a traves de la production de TNF-alfa, el cual parece jugar un papel de pivote como citoquina proinflamatoria. Ejerce esos efectos a traves de su propia familia de receptores (TNFR1 y TNFR2), cuyo resultado final incluya apoptosis, activation de la protelna quinasa c-Jun N- terminal activada por quinasa/estres (JN/SAPK) y activacion de NF-kappaB. La NF-kappaB activada entra en el nucleo e induce la transcription de genes asociados con la inflamacion, defensa del huesped y supervivencia celular. La region promotora del gen TNF cae entre nucleotidos -1 y -1300, y abarca numerosos sitios polimorficos asociados con sitios de enlazamiento potenciales para diversos factores de transcripcion. Los portadores del alelo 2 de TNF (TNF2) (los cuales contienen un polimorfismo de par de bases sencillo en la position de promotor -308) producen ligeramente mas TNF-alfa en su mucosa intestinal que los no portadores de TNF2. El polimorfismo de TNF tambien parece tener influencia en la naturaleza y frecuencia de las manifestaciones extraintestinales de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD). Se esta investigando una serie de rutas de inhibition de TNF. Mas extensamente evaluado es el uso del remicade. Varios ensayos grandes controlados indican que el remicade tiene un papel en el tratamiento de pacientes con enfermedad de Crohn de moderada a severamente activa y en enfermedad de Crohn fistulante. Estudios pequenos han mostrado asociaciones posibles entre pobre respuesta al remicade y niveles incrementados en mucosa de NF-kappaB activada, calidad de homocigotico para el polimorfismo en el exon 6 de TNFR2 (genotipo Arg196Arg), positividad para anticuerpos citoplasmicos antineutrofilos perinucleares (ANCA), y con la presencia de numeros incrementados de celulas mononucleares de lamina propia que producen interferon-gamma y TNF-alfa. Asl, la monitorizacion de pacientes con la enfermedad de Crohn en cuanto a TNF-alfa y patrones de toxicidad en un metodo diagnostico de plataforma sencilla tendrla ventajas distintivas. El metodo descrito aqul puede ser un sistema automatizado de un metodo de deteccion sencillo, multiplex, sin preparacion de la muestra para determinar el nivel de farmaco, la toxicidad o determinantes de los efectos adversos, y el biomarcador potencial de la progresion de la enfermedad. Por ejemplo, un cartucho que tenga portales o pozos que contengan 1) partlculas magneticas que tengan anticuerpos especlficos anti-TNF-alfa decorados sobre su superficie, 2) partlculas magneticas que tengan anticuerpos especlficos de biomarcador de toxicidad sobre su superficie, y 3) partlculas magneticas que tengan sondas especlficas para identificar marcadores de la progresion de la enfermedad podrlan ser empleados para determinar y proveer rapidamente valores de manejo cllnico para un paciente de enfermedad de Crohn dado.
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Los metodos de la invencion tambien pueden ser utilizados para monitorizar y diagnosticar enfermedades e inflamaciones infecciosas en un sistema de preparacion multiplex, automatizados sin preparacion de la muestra. Tales sistemas y metodos podrlan ser utilizados para monitorizar, por ejemplo, bacteriemia, sepsis y/o slndrome de respuesta inflamatoria sistemico (SIRS). La diagnosis temprana es cllnicamente importante en este tipo de infeccion, que si se deja sin tratar, puede llevar a disfuncion organica, hipoperfusion, hipotension, choque refractario (septico) choque/SIRS, y/o slndrome de disfuncion organica multiple (MODS). Para un paciente tlpico, muchas infecciones bacterianas o fungicas son el resultado de incubacion en el momento de la admision una instalacion de cuidado de la salud y se denominan infecciones asociadas al cuidado de la salud (HAI), tambien conocidas como infecciones nosocomiales, adquiridas en hospital o aparecidas en hospital. Las infecciones asociadas al sitio de cuidado de la salud son causadas mas comunmente por patogenos virales, bacterianos y fungicos y comunmente se transmiten a traves de heridas, dispositivos invasivos (cateteres, traqueotomla, intubacion, drenajes quirurgicos) o ventiladores y se encuentran como infecciones del tracto urinario, infecciones de sitios quirurgicos, o en una forma de neumonla. Al cabo de algunas horas despues de la admision, la flora de un paciente comienza a adquirir caracterlsticas de la reserva bacteriana circundante. La mayorla de las infecciones que se hacen qulmicamente evidentes despues de 48 horas de hospitalizacion se consideran como adquiridas en el hospital y los patogenos deberlan ser investigados en todos los pacientes febriles que son admitidos para una enfermedad no febril o aquellos que desarrollan deterioro cllnico no explicado por el diagnostico inicial. El uso mas cuidadoso y selectivo de agentes antimicrobianos, tales como antibioticos, tambien es deseable para hacer disminuir la presion de seleccion para la aparicion de cepas resistentes. Las infecciones que se presentan despues de que el paciente sale del hospital pueden considerarse asociadas con el sitio de cuidado de la salud si los organismos fueron adquiridos durante la estadla en el hospital. Los factores de riesgo relacionados con el paciente para invasion del patogeno colonizador incluyen severidad de la enfermedad, y estado inmunocomprometido subyacente y/o la longitud de la estancia del paciente. Los factores de riesgo para el desarrollo de infecciones en la corriente sangulnea asociadas con cateteres en neonatos incluyen la colonizacion del sitio de distribucion del cateter, colonizacion del sitio de salida, insercion del cateter despues de la primera semana de vida, duracion de la nutricion parenteral y peso al nacer extremadamente bajo (<1000 g) en el momento de la insercion de cateter. En pacientes en el PICU los riesgos, para infecciones en corriente sangulnea asociadas con cateter se incrementan con la neutropenia, tiempo de residencia prolongada del cateter (>7 dlas), uso de CVL colocado percutaneamente (superior a dispositivos tunelados o implantados), y manipulacion frecuente de las llneas. Las infecciones por Candida son patogenos crecientemente importantes en el NICU. Los factores de riesgo para el desarrollo de candidemia en neonatos incluyen edad gestacional menor de 32 semanas, marcadores Apgar de 5 minutos de menos de 5, choque, coagulopatla diseminada intravascular, antes del uso de intrallpidos, administracion en nutricion parenteral, uso de CVL, administracion de bloqueadores de H2, intubacion o longitud de estancia superior a 7 dlas. Los factores de riesgo para el desarrollo de neumonla asociada con ventilador (VAP) en pacientes pediatricos incluyen reintubacion, slndromes geneticos, inmunodeficiencia e inmunosupresion. En neonatos, un episodio previo de la infeccion en la corriente sangulnea es un factor de riesgo para el desarrollo de VAP. Factores de riesgo para el desarrollo de la infeccion en tracto urinario asociada con el sitio de cuidado de la salud de pacientes pediatricos incluye cateterizacion de la vejiga, terapia antibiotica previa, y paralisis cerebral. Entre las categorlas de bacterias mas conocidas por infectar los pacientes inmunocomprimidos estan la MRSA (Staphylococcus aureus resistentes a meticilina), bacterias gram positivas y Helicobacter, la cual es gram negativa. Mientras que hay farmacos antibioticos que pueden tratar enfermedades causadas por la MRSA gram positiva, hay actualmente pocos farmacos efectivos para Acinetobacter. Patogenos comunes en infecciones en corriente sangulnea son Staphylococcus negativos a la coagulasa, Enterococcus y Staphylococcus aureus. Ademas, la Candida albicans y patogenos para la neumonla tales como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, y Haemophilus influenza participan de muchas infecciones. Los patogenos para infecciones del tracto urinario incluyen Escherichia coli, Candida albicans, y Pseudomonnas aeruginosa. Los organismos entericos gram negativos son adicionalmente comunes en infecciones en el tracto urinario. Las infecciones en sitios quirurgicos incluyen Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, y Staphylococcus negativos a la coagulasa. El agente infeccioso puede ser seleccionado de, sin limitacion, patogenos asociados con la sepsis, tales como Acinetobacter baumannii, Aspergillus fumigatis, Bacteroides fragilis, B. fragilis, blaSHV, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni/coli, Candida guilliermondii, C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. Lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis, Clostridium pefringens, Estreptococo negativo a coagulasa, Enterobacter aeraogenes, E. cloacae, Enterobacteriaceae, Enterococcus faecalis, E. faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Kingella Kingae, Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, Listeria monocitogenes, Mec A gene (MRSA), Morganella morgana, Neisseria meningitidis, Neisseria spp. non-meningitidis, Prevotella buccae, P. intermedia, P. melaninogenica, Propionibacterium acnes, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, S. haemolyticus, S. maltophilia, S. saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, S. maltophilia, Streptococcus agalactie, S. bovis, S. dysgalactie, S. mitis, S. mutans, S. pneumoniae, S. pyogenes, y S. sanguinis; o cualquier otro agente infeccioso descrito aqul. En ciertos casos, el metodo y sistema seran disenados para establecer si el agente infeccioso porta un gen Van A o un gen Van B caracterlstico de resistencia a la vancomicina; mecA para resistencia a la meticilina, NDM-1 y ESBL para resistencia mas general a las beta lactamas.
La sepsis o el choque septico son condiciones medicas serias que se caracterizan por un estado inflamatorio general del cuerpo (slndrome de respuesta inflamatoria sistemica o SIRS) y la presencia de una infeccion conocida o sospechada. La sepsis se define como SIRS en la presencia de una infeccion, el choque septico se define como una sepsis con hipotension arterial refractaria o anormalidades de hipoperfusion a pesar de resucitacion de fluidos
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adecuada, y sepsis severa se define como una sepsis con disfuncion de organos, hipoperfusion o hipotension. Ademas de los sintomas relacionados con la infeccion generadora, la sepsis se caracteriza por la presencia de inflamacion aguda presente a lo largo de todo el cuerpo, y por lo tanto, esta asociada frecuentemente con fiebre y leucocitosis o bajo recuento de globulos blancos y temperatura muy por debajo del promedio, y vomitos. Por lo tanto se considera actualmente que la sepsis es la respuesta inmune del huesped una infeccion y se cree que esta respuesta causa la mayoria de los sintomas de la sepsis, dando como resultado consecuencias hemodinamicas y dano en los organos. La SIRS se caracteriza por el compromiso hemodinamico y el desarreglo metabolico resultante. Los sintomas fisicos externos de esta respuesta frecuentemente incluyen un elevado ritmo cardiaco (por encima de 90 pulsaciones por minuto), alta rata respiratoria (por encima de 20 respiraciones por minuto), elevado recuento de WBC (por encima de 12,000) y temperatura corporal elevada o disminuida (por debajo de 36°C (97TF) o por encima de 38°C (100TF)). La sepsis se diferenci a de SIRS por la presencia de un patogeno conocido. Por ejemplo, el SIRS y un cultivo positivo en sangre para un patogeno indican la presencia de sepsis. Sin una infeccion conocida, no es posible clasificar los sintomas anteriores como sepsis, solamente como SIRS. La SIRS causa activacion esparcida de proteinas en fase aguda, afectando el sistema complementario y las rutas de coagulacion, lo cual produce dano a la vasculatura asi como a los organos. Se activan entonces diversos sistemas contrarreguladores neuroendocrinos tambien, complicando frecuentemente el problema. Incluso con tratamiento inmediato agresivo, esto puede avanzar hasta sindrome de disfuncion organica multiple y eventualmente la muerte. El componente del laboratorio del diagnostico de la sepsis puede incluir varios marcadores que se consideran una vez y/o son medidos en serie. Una serie de estudios han examinado el valor de combinar marcadores disponibles actualmente como GRO-alfa, proteina 1 de grupo de caja de alta movilidad (HMBG-1), receptor de IL-1, antagonista de receptor de IL-1, IL-1 b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, proteina inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de migracion de macrofago (MIF), osteopontina, RANTES (celulas T normales, reguladas por activacion, expresadas y secretadas; o CCL5), TNF-a, proteina reactiva C (CRP), CD64, y proteina 1 quimiotactica de monocito (MCP-1). Adicionalmente, los sistemas y metodos pueden ser disenados para monitorizar ciertas proteinas caracteristicas de la sepsis, proteina de enlazamiento de adenosina desaminasa (ABP-26), la oxido nitrico sintetasa inducible (iNOS), proteina de enlazamiento a lipopolisacarido (LBP), y procalcitonina (PCT). La sepsis se trata usualmente en la unidad de cuidados intensivos con fluidos intravenosos y antibioticos. Si el reemplazo de fluidos es insuficiente para mantener la presion sanguinea, pueden usarse medicaciones vasopresoras especificas. La ventilacion mecanica y la dialisis pueden ser necesarias para soportar la funcion de los pulmones y rinones, respectivamente. Para guiar la terapia, pueden colocarse un cateter venoso central y un cateter arterial. Los pacientes en sepsis pueden requerir medidas preventivas para trombosis venosa profunda, ulceras por estres y ulceras por presion, y algunos pacientes pueden beneficiarse del control de los niveles de azucar sanguinea con insulina (direccionandose a la hiperglicemia por estres), corticosteroides en dosis bajas o drotrecogina alfa activada (proteina C recombinante). Para un paciente inmunocomprometido, o un paciente con sospecha de infeccion que puede estar experimentando sepsis o SIRS, tales metodos de la invencion proveen una plataforma de diagnostico para la identification rapida de uno o mas patogenos, o de si los patogenos son o no resistentes a ciertas terapias (para la selection de una terapia antimicrobiana apropiada). La plataforma tal como se describe permite la determination simultanea de los niveles de los factores (por ejemplo, GRO-alfa, Proteina 1 de grupo caja de alta movilidad (HMBG-1), Receptor de IL-1, Antagonista del receptor de IL-1, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL- 13, IL-18, proteina inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de la migracion de macrofagos (MIF), osteopontina, RANTES (regulado por activacion, expresado por celulas T normales y secretado; o CCL5), TNF-a, Proteina C reactiva (CRP), CD64, y proteina 1 quimiotactica de monocitos (MCP-1)) y/o proteinas (e.g., proteina de enlazamiento de la adenosina desaminasa (ABP-26), oxido nitrico sintetasa inducible (iNOS), proteina de enlazamiento a lipopolisacaridos (LBP), y procalcitonina (PCT)) considerados como involucrados en la SIRS, permitiendo la optimization para el tratamiento de la sepsis y el SIRS. Asi, esta plataforma reduce los protocolos empiricos y/o el uso de antimicrobianos no especificos/generales que pueden o pueden no dirigirse al patogeno especifico y/o a la disfuncion del sistema subyacente para un paciente dado. Esta plataforma permite diagnostico rapido y exacto, el cual puede apuntar una terapia efectiva proveyendo un componente clave para la toma de decisiones por parte del medico y reducir la morbilidad y la mortalidad.
Para determinar si un paciente tiene sepsis, es necesario identificar la presencia de un patogeno. Para tratar de la manera mas efectiva a un paciente, la initiation mas temprana de la terapia apropiada es critica. El antimicrobiano y otros tratamientos para la sepsis se basan en la clasificacion de patogenos a niveles multiples, incluyendo la identificacion de un agente como 1) bacteriano, viral, fungico, parasitico o algun otro; 2) gram positivo, gram negativo, levadura o moho, 3) especie, y 4) susceptibilidad.
Cada uno de estos niveles de especificidad mejora el tiempo de iniciacion de una terapia apropiada, y cada etapa avanza hacia la pista que lleva a un estrechamiento de los agentes terapeuticos hasta el conjunto mas especifico. Sin datos de susceptibilidad absolutos, las metodologias empiricas de cuidado se basan en la information disponible acerca del patogeno (cualquiera que sea su nivel) y el patron de frecuencia del patogeno y las tendencias de susceptibilidad en el hospital de otro sitio de cuidado medico. Asi, ciertas categorias de patogenos son supuestas frecuentemente como causantes hasta que mas datos refinen el aparejamiento de patogeno y terapia. Especificamente, estos objetivos caen en la categoria de ESKAPE (el cual es una serie de patogenos resistentes, y la categoria SPACE, la cual es un conjunto de patogenos de alta virulencia que requieren aislamiento de los pacientes.
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Ademas de identificar estos patogenos en tipos de muestra multiples (sangre, tejido, orina, etc), otro metodo para distinguir pacientes sintomaticos, por ejemplo, pacientes con slndrome inflamatorio sistemico, o SIRS, de pacientes septicos, es el uso de biomarcadores que correlacionen bien sea individualmente o a traves de un Indice, la identification de pacientes con una infection. En casos en los que las infecciones no son detectadas debido a la interferencia de la terapia antimicrobiana con el diagnostico, el control del sistema inmune de la terapia, o de alguna otra forma, estos biomarcadores, que pueden ser tipos multiples de analitos (citoquinas, metabolitos, expresion genetica de ADN/ARN, etc.) indicaran infeccion y por lo tanto sepsis.
Para generar la information de diagnostico requerida tanto para la presencia de una infeccion como de algun nivel de identificacion de especie, un panel podrla ser: (i) aglomerados gram positivos (por ejemplo, S. aureus, y CoNS (estafilococo negativo a coagulasa)); (ii) cadenas/pares gram positivos (por ejemplo, Strep spp., mitis, pneumonia spp., agalactiae spp., pyogenes spp., Enterococcus spp.(E. faecium, E. fecalis); (iii) barras gram negativas (por ejemplo, E. coli, Proteus spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp.); (iv) SPACE (por ejemplo, Serratia spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp.); (v) Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas spp.); (vi) ESKAPE (E. faecium, Staphylococcus aureas, Klebsiella spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Enterobacter spp.); y (vii) PanBacterianos (todas las especies bacterianas).
El panel deberla ser usado en conjuncion con un ensayo fungico para cubrimiento total. Las categorlas representan la informacion requerida para una intervention efectiva con la terapia apropiada, dado que cada sitio de cuidado tendra una metodologla derivada emplricamente con base en una respuesta positiva a gram +, gram -, etc. Las especies identificadas en cada categorla representan aquellas que coincidirlan bajo cada encabezamiento, pero no son exhaustivas. Adicionalmente, se incluye un marcador panbacteriano para cubrir cualquier especie que no este cubierta por el metodo de diagnostico empleado para cada categorla. Adicionalmente, la combination de resultados tambien dara una indication de las especies, aunque no completamente, si estan incluidas como se describio mas arriba. Las referencias cruzadas positivas y negativas por categoria permiten un proceso de metodologia de elimination para identificar algunas de las especies, probabilisticamente.
Ademas de los paneles de patogenos, podria llevarse a cabo una prueba en solitario o en compania para biomarcadores que puedan indicar sepsis. Ejemplos de estos marcadores aparecen a continuation, y pueden ser utilizados individualmente o en combinacion: IL-1 p, GROalfa, Proteina 1 de grupo caja de alta movilidad (HMBG-1), Receptor de IL-1, Antagonista del receptor de IL-1, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, proteina inflamatoria de macrofago (MIP-1), factor inhibidor de la migration de macrofagos (MIF), osteopontina, RANTES (regulado por activation, expresado por celulas T normales y secretado; o CCL5), IL-10, GM-CSF, MCP-1, TNF-a, hsCRP, PCT, LFB, y lactato.
Se divulga que los sistemas y metodos descritos aqui tambien pueden ser utilizados para monitorizar y diagnosticar enfermedades cardiacas en un sujeto, tales como un infarto del miocardio. Los marcadores cardiacos o enzimas cardiacas son proteinas que se escapan de las celulas del miocardio lesionadas y se utilizan para establecer lesiones cardiacas. Los marcadores cardiacos incluyen, sin limitacion, las enzimas SGOT, LDH, el subtipo MB de la enzima creatinina quinasa, y troponinas cardiacas (T e I). Las troponinas cardiacas T e I que son liberadas al cabo de 4-6 horas de un ataque de infarto del miocardio (y permanecen elevadas por hasta 2 semanas) tienen especificidad a tejido casi completa y son ahora los marcadores preferidos para establecer danos en el miocardio. Las troponinas elevadas en la determination del dolor en el pecho pueden predecir con exactitud una alta probabilidad de un infarto del miocardio en el futuro cercano. El diagnostico de infarto al micoardio esta basado tipicamente en la historia del sujeto, ECG, y marcadores cardiacos. Cuando ocurre un dano en el corazon, los niveles de los marcadores cardiacos se elevan con el tiempo, la cual es la razon por la cual las pruebas sanguineas se toman a lo largo de un periodo de 24 horas. Puesto que esto niveles de enzimas no se elevan inmediatamente despues de un ataque cardiaco, los pacientes que presentan dolor de pecho se tratan en general con la suposicion de que ha ocurrido un infarto del miocardio y luego se evaluan para un diagnostico mas preciso. Un MI es una emergencia medica que requiere atencion medica inmediata. El tratamiento intenta el salvamento de tanto miocardio como sea posible y evitar complicaciones adicionales, de alli la frase “el tiempo es musculo”. Usualmente se administran oxigeno, aspirina y nitroglicerina tan pronto como sea posible. Asi, en el estado agudo, la monitorizacion de troponina I y T, asi como otros biomarcadores potenciales de isquemia cardiaca, ademas de terapia con farmacos y patrones de toxicidad en un metodo diagnostico de plataforma sencilla tendria ventajas distintivas. Los sistemas y metodos descritos aqui podrian ser utilizados para proveer un sistema automatizado de metodo de detection sencillo, multiplex, sin preparation de muestras para determinar el nivel de farmaco, la toxicidad o determinantes de efectos adversos, y el biomarcador potencial de la progresion de la enfermedad. Por ejemplo, un cartucho que tenga portales o pozos que contengan 1) particulas magneticas que contengan anticuerpos especificos para antitroponina I o troponina T, decorados sobre su superficie, 2) particulas magneticas que tengan anticuerpos especificos biomarcadores de toxicidad sobre su superficie, y 3) particulas magneticas que tengan sondas especificas para identificar marcadores de progresion de la enfermedad podrian ser empleados para determinar y proveer rapidamente valores de manejo clinico para un paciente con infarto de miocardio dado.
Uno o mas cartucho de pozos multiples pueden ser configurados para uso en los metodos de la invention y preparados con al menos una muestra en sangre entera del paciente; las particulas magneticas para detectar cada
uno de los analitos que van a ser detectados (una o mas moleculas pequenas; uno o mas metabolitos de la una o mas moleculas pequenas; biomarcador metabolico tal como el descrito para el panel de funcion hepatica); y reguladores de dilucion y lavado. Las pruebas de funcion del hlgado se hacen en muestras de suero o plasma del paciente y el analisis de sangre en laboratorio de bioqulmica cllnica proporciona datos cruciales concernientes a la 5 condition del hlgado del paciente. Un “panel de funcion hepatica” es una prueba de sangre en donde puede
apuntarse a un nivel bajo o alto de una o mas enzimas hacia enfermedades o danos en el hlgado. Por ejemplo, el panel de funcion hepatica puede incluir uno o mas de los siguientes ensayos de detection de analitos: una o mas moleculas pequenas; uno o mas metabolitos de las una o mas moleculas pequenas; un biomarcador metabolico biologico; genotipificacion, perfil de expresion genetica; y analisis proteomico.
10 Un panel de funcion hepatica puede incluir analisis de una o mas de las siguientes protelnas en una muestra biologica de un paciente o de un sujeto: 1) albumina (el constituyente principal de la protelna total en el hlgado; mientras que el remanente es llamado globulina; la albumina debe estar presente a 3.9 hasta 5.0 g/dL, una hipoalbuminaemia indica pobre nutrition, bajo catabolismo de protelnas, cirrosis o slndrome nefrotico); 2) aspartato transaminasa (AST) (tambien conocida como transaminasa oxaloacetica glutamica en suero o aspartato 15 aminotransferasa, es una enzima en las celulas parenquimales del hlgado y normalmente va de 10 a 34 IU/L; niveles elevados son indicativos de dano agudo en el hlgado; 3) alanina transaminasa (ALT) (tambien conocida como transaminasa piruvica glutamica en suero o alanina aminotransferasa, es una enzima que esta presente en los hepatocitos a niveles entre 8 a 37 IU/L; niveles elevados son indicativos de dano agudo en el hlgado en hepatitis viral o sobredosis de paracetamol; la relation de AST a ALT se utiliza para diferenciar entre las razones del dano al 20 hlgado); 4) fosfatasa alcalina (ALP) (una enzima que esta presente en las celulas que recubren los ductos biliares del hlgado; el rango normal es 44 a 147 IU/L y el nivel se eleva en caso de enfermedades infiltradoras del hlgado, colestasis intrahepatica u obstruction del ducto biliar grande; 5) gamma glutamil transpeptidasa (GGT) (un marcador mas sensible para dano colestatico que la ALP. Es muy especlfica para el hlgado; el rango estandar es de 0 a 51 IU/L; la toxicidad por alcohol tanto aguda como cronica eleva la GGT; la razon de una elevation aislada de ALP 25 puede ser detectada por GGT); 6) bilirrubina total (TBIL) (un incremento en la bilirrubina total puede llevar a ictericia y puede ser atribuida a cirrosis, hepatitis viral, anemias hemollticas o hemorragia interna); 7) bilirrubina directa; 8) tiempo de protrombina (PTT) (el dano en las celulas hepaticas y la obstruccion del flujo biliar puede producir cambios en el tiempo de coagulation de la sangre); 9) prueba de alfa-fetoprotelna (niveles elevados indican hepatitis o cancer); 10) lactato deshidrogenasa; y 11) anticuerpos mitocondriales (si estan presentes pueden indicar hepatitis 30 activa cronica, cirrosis biliar primaria u otros trastornos autoinmunes). Las protelnas descritas mas arriba deberlan ser analizadas en el panel de funcion hepatico usando los metodos de la invention.
Un panel de funcion hepatico adicional puede incluir genotipificacion de enzimas de citocromo P450. La superfamilia de citocromo P450 (CYP) es un grupo grande y diverso de enzimas. La funcion de la mayorla de las enzimas CYP es catalizar la oxidation de sustancias organicas. Los sustratos de las enzimas CYP incluyen intermediarios 35 metabolicos tales como llpidos y hormonas esteroidales, as! como sustancias xenobioticas tales como farmacos y otros agentes qulmicos toxicos. Las CYP son las enzimas principales involucradas en el metabolismo y bioactivacion de los farmacos, participando en cerca del 75% del metabolismo total. La mayor parte de los farmacos sufren biotransformacion y eventualmente son excretados del cuerpo; y muchos requieren activation para formar el compuesto activo. Las enzimas CYP que metabolizan muchas medicaciones incluyen CYP3A4/5 (36%), CYP2D6 40 (19%), CYP2C8/9 (16%), y CYP1A2 (11%).
Las pruebas para genotipificacion de citocromo P450 se utilizan para determinar como un paciente o sujeto metaboliza un farmaco. Los resultados de las pruebas de citocromo p450 pueden utilizarse para dividir los individuos en cuatro tipos principales:
(i) Metabolizadores pobres. Ciertos farmacos son metabolizados mas lentamente de lo normal y la medication 45 tendra una vida media mas larga y posiblemente incremente la probabilidad de que produzca efectos colaterales.
(ii) Metabolizadores normales. Los farmacos seran metabolizados una rata promedio y as! es indicativo de que hay un beneficio del tratamiento y puntos para efectos colaterales menores que en otros individuos que no metabolizan aquellas medicaciones particulares de forma tan efectiva.
(iii) Metabolizadores intermedios. Los farmacos pueden o pueden no ser metabolizados una rata promedio. Al menos 50 un gen involucrado en el metabolismo del farmaco es sospechoso de funcionar anormalmente. Hay entonces una
predisposition a metabolizar ciertos farmacos de manera diferente.
(iv) Metabolizadores ultrarrapidos. Los farmacos son metabolizados mas rapido y mas eficientemente que el promedio. Puesto que la rata metabolica es mas alta que la promedio, algunas medicaciones son inactivadas mas pronto o excretadas mas pronto de lo normal y la medicacion puede no tener la eficacia deseada.
55 Actualmente, la genotipificacion de los genes responsables de estas enzimas a traves de una poblacion han demostrado que las diferencias polimorficas en estas enzimas pueden llevar a variation en eficacia y toxicidad de algunos farmacos. El establecimiento del estado del citocromo P450 en una muestra de paciente puede lograrse
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midiendo la actividad de la enzima de la muestra, o determinando si se presenta una diferencia genetica en uno de los genes de este sistema metabolico en el genoma. La genotipificacion requiere una muestra de celulas representativa del genoma del paciente o sujeto y el analisis busca determinar las diferencias geneticas en estos genes cllnicamente importantes. Alternativamente, la fenotipificacion de enzimas CYP450 (identificacion de estado de los metabolizadores enzimaticos) puede lograrse administrando un sustrato de enzima de prueba a un paciente y monitorizar el sustrato original y las concentraciones de metabolito con el tiempo (por ejemplo, en orina). Sin embargo, la prueba e interpretacion consumen tiempo y son inconvenientes. Como resultado, la fenotipificacion se lleva a cabo a raramente.
A continuacion se presenta una lista de las posibles enzimas metabolicas hepaticas que pueden ser parte de un panel de funcion hepatica.
La CYP2C19 metaboliza varios tipos importantes de farmacos, incluyendo inhibidores de la bomba de protones, diazepan, propanolol, imipramina y amitriptilina. La FDA libero la prueba con “base en los resultados de un estudio llevado a cabo por los fabricantes de cientos de muestras de aDn as! como en un amplio rango de literatura de soporte cuidadosamente revisada”. De acuerdo con la etiqueta de la FDA, “la informacion acerca del genotipo CYP2D6 puede ser utilizada como una ayuda para los medicos en la determination de una estrategia terapeutica y dosis de tratamiento para agentes terapeuticos que son metabolizados por el producto CYP2D6”. Asl, un panel de funcion hepatica que emplea los metodos de la invention, puede ser utilizado para genotipificar muestras de un paciente o un sujeto para establecer el estado del sistema enzimatico del citocromo P450 para luego optimizar la eficacia y seguridad terapeuticas.
La CYP2D6 (citocromo P450 2D6) es la mejor estudiada de las DMEs y actua sobre una cuarta parte de todos los farmacos de prescription, incluyendo los inhibidores de reconsumo de serotonina selectivos (SSRI), antidepresivos tricllicos (TCA), beta bloqueadores tales como Inderal y antiarrltmicos tipo 1A. Aproximadamente 10% de la poblacion tiene una forma de actuation lenta de esta enzima y 7% una forma de actuation superrapida. El treinta y cinco por ciento son portadores de un alelo 2D6 no funcional, que eleva especialmente el riesgo de ADRs cuando estos individuos toman farmacos multiples. Los farmacos que la CYP2D6 metabolizan incluyen Prozac, Zoloft, Paxil, Effexor, hidrocodona, amitriptilina, Claritin, ciclobenzaprina, Haldol, metoprolol, Rithmol, Tagamet, tamoxifen, dextrometorfan, bloqueadores beta, antiarrltmicos, antidepresivos, y derivados de la morfina, incluyendo muchos de los farmacos mas prescritos y los farmacos de difenilhidramina de venta libre (por ejemplo, Allegra, Dytuss, y Tusstat). La CYP2D6 es responsable de la activation del profarmaco codelna en su forma activa y el farmaco es inactivo por lo tanto en metabolizadores lentos CYP2D6.
La CYP2C9 (citocromo P450 2C9) es la ruta primaria de metabolismo para la Cumadina (warfarina). Aproximadamente el 10% de la poblacion son portadores de al menos un alelo para la forma metabolizante lenta de CYP2C9 y pueden ser tratables con 50% de la dosis a la cual son tratados los metabolizadores normales. Otros farmacos metabolizados por CYP2C9 incluyen Amaril, isoniazid, ibuprofeno, amitriptilina, Dilantin, Hizaar, THC (tetrahidrocanabinol), naproxen, y Viagra.
CYP2C 19 (citocromo P450 2C 19) esta asociado con el metabolismo de carisoprodol, diazepam, Dilantin, y Prevacid.
CYP1A2 (citocromo P450 1A2) esta asociado con el metabolismo de amitriptilina, olanzapina, haloperidol, duloxetina, propranolol, teofilina, cafeina, diazepam, clordiazepoxido, estrogenos, tamoxifen, y ciclobenzaprina.
NAT2 (N-acetiltransferasa 2) es una enzima metabolizante de farmacos secundarios que actua sobre isoniazid, procainamida, y Azulfidina. La frecuencia del “acetilador lento” NAT2 en diversas poblaciones del mundo varla del 10% a mas de 90%.
La DPD (Dihidropirimidina deshidrogenasa) es responsable por el metabolismo de Fluorouracilo (5-FU), uno de los farmacos para quimioterapia mas exitoso y ampliamente usados.
Las variaciones de UGT1A1 (UDP-glucuronosiltransferasa) pueden llevar a reacciones severas incluso fatales a la primera dosis de Camptosar (irinotecan).
La 5HTT (transportador de serotonina) ayuda a determinar si las personas respondan probablemente a SSRIs, una clase de medicaciones que incluyen citalopram, fluoxetina, paroxetina, y sertralina, entre otras y frecuentemente se prescribe para depresion o ansiedad.
Las pruebas de genotipificacion para diagnostico para ciertas enzimas de CYP450 estan disponibles ahora. Se ofrecen algunas pruebas como servicios de prueba desarrollados en laboratorios internos, lo que no requiere la aprobacion de la U.S. Food and Drug Administration (FDA) pero que deben satisfacer los estandares de calidad CLIA para pruebas de alta complejidad. La AmpliChip® (Roche Molecular Systems, Inc.) es la unica prueba liberada
por la FDA para genotipificacion de CYP450. La AmpliChip® es un microarreglo que consiste de muchas secuencias de ADN complementarias a los genes de 2 CYP450 y se aplica en cantidades microscopicas en localizaciones ordenadas sobre una superficie solida (chip). El AmpliChip® prueba el ADN de los globulos blancos de un paciente recolectados en una muestra de sangre anticoagulada estandar para 29 polimorfismos y mutaciones para el gen 5 CYP2D6 y 2 polimorfismos para el gen CYP2C 19.
Por lo tanto, un analisis multiplex de una muestra de sangre individual (por ejemplo, una extraccion de sangre sencilla, o cualquier otro tipo de muestra de paciente descrita aqul) de un paciente se divulga para determinar a) estado enzimatico del hlgado, as! como b) el genotipo de las enzimas metabolicas clave para luego ser capaces de disenar reglmenes de farmacoterapia para cuidado terapeutico optimo utilizando los metodos descritos aqul.
10 Los metodos de la invencion pueden incluir uno o mas cartuchos de pozo multiples preparados con al menos una muestra de sangre entera del paciente; partlculas magneticas para detectar cada uno de los analitos que van a ser detectados; anticuerpos del analito; agentes de enlazamiento multivalentes; y/o reguladores de dilucion y lavado para uso en un ensayo multiplex como se describio mas arriba.
Nefrotoxicidad
15 La toxicidad renal es un efecto colateral comun del uso de xenobioticos y la deteccion temprana rapida de las etapas iniciales de la nefrotoxicidad puede ayudar en la toma de decisiones medicas. Los reportes tempranos de deteccion de toxicidad renal sugieren que la expresion incrementada de ARNm en ciertos genes puede ser monitorizada. Sin embargo, otros han sugerido que los marcadores de la toxicidad renal pueden ser detectados en la orina. Estos marcadores incluyen kim-1, lipocalina-2, lipocalina asociada con gelatinasa de neutrofilos (NGAL), timp-1, clusterina, 20 osteopontina, vimentina y heme oxigenasa 1 (HO-1). De manera mas amplia, la deteccion de ADN, iones de metales pesados o niveles BUN en orina puede ser information cllnica util. Asl, los metodos de la presente invencion incluyen tambien la capacidad de detectar estos marcadores de toxicidad renal. Opcionalmente, un panel de funcion hepatica tambien puede incluir uno o dos biomarcadores decisivos de nefrotoxicidad, o viceversa.
Ensayos y metodos basados en no aglomeracion
25 Las partlculas magneticas descritas aqul pueden ser utilizadas en un ensayo que no presenta aglomeracion de partlculas. Por ejemplo, las partlculas magneticas pueden se utilizadas para capturar o concentrar un analito, por ejemplo, pasando una muestra llquida que contiene el analito sobre partlculas magneticas que incluyen unidades estructurales de enlazamiento especlficas para el analito. Algunas ventajas en esta metodologla incluyen a) no se necesita formar aglomerados (los aglomerados pueden ser inherentemente inestables en un cierto tamano, llevando 30 a CVs incrementados); b) el no aglomerar puede no requerir de vortex puesto que las fuerzas de corte de flujo pueden desalojar el enlazamiento no especlfico de partlculas magneticas; c) pueden reducirse las etapas de manejo de fluidos, y d) la miniaturization del ensayo puede favorecer estos metodos no aglomerantes. En general, dos modelos de deteccion basada en superficie incluyen: (i) cambios en la senal T2 que surge de una elimination de partlculas magneticas a partir de una solution y (ii) cambios en la senal de T2 que surgen del enriquecimiento de 35 partlculas magneticas de una superficie.
Las partlculas magneticas derivadas con una unidad estructural de enlazamiento pueden ser mantenidas en position mediante un campo magnetico externo a la vez que la muestra que contiene el analito correspondiente se hace circular despues de las partlculas magneticas “atrapadas” permitiendo capturar y/o concentrar el analito de interes. Las partlculas pueden ser haladas hacia el lado o parte inferior del recipiente de ensayo, o una malla 40 magnetizable o espuma metalica magnetizable con tamano de poro apropiado pueden estar presentes en el recipiente de reaction, creando gradientes magneticos locales muy altos. Una ventaja de tener la malla/espuma metalica en el recipiente de reaccion es que la distancia que cada partlcula magnetica necesita recorrer para quedar “atrapada” o “capturada” puede ser muy corta, mejorando la cinetica del ensayo.
Otro ensayo no aglomerante es tener superficies derivadas con ligandos complementarios a la unidad estructural de 45 enlazamiento presente en la partlcula magnetica y utilizando un formato de captura/eliminacion/flujo exhaustivo. El enlazamiento especlfico de partlculas magneticas una superficie elimina partlculas magneticas de la suspension general de partlculas utilizadas en el ensayo, llevando asl a un cambio en el valor T2 en el volumen de reaccion detectado por el lector MR. La preincubacion de las partlculas con la muestra que contiene el analito puede reducir/inhibir el, enlazamiento/captura/eliminacion de la partlcula magnetica por la superficie derivada en proportion 50 a la concentration de analito en la muestra. Un ejemplo de este tipo de metodologla de ensayo ha sido demostrado utilizando puntas de micropipeta de cromatografla de afinidad PhyNexus. Las PhyTips de 200 ul contienen un volumen de lecho de resina de 20 pl atrapado entre dos fritas. El lecho de resina consiste de perlas de agarosa entrecruzadas de 200 pm derivadas con avidina, protelna A, protelna G, o un analito. Un pipeteador electronico programable puede aspirar y dispensar diversos volumenes a diversas ratas de flujo. Las partlculas magneticas 55 fluyen a traves de los poros creados por el lecho de resina de perlas de agarosa empacadas. Pasando repetidamente la suspension apropiada de partlculas magneticas sobre el lecho de resina atrapada para permitir que ocurran las interacciones productivas entre ellas, es decir, un lecho de resina de perlas de agarosa derivada con
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avidina y partlcuias magneticas derivadas con biotina, algunas de las partlcuias magneticas se eniazaran especlficamente y seran eiiminadas de la suspension de partlcuias. Midiendo el T2 de la suspension de partlcuias antes y despues de la exposicion ai iecho de resina de agarosa, la cantidad de eliminacion de partlcuias puede ser cuantificada.
Otro formato de ensayo no agiomerante es similar ai descrito anteriormente, pero utiiiza espuma metalica magnetizable derivada para reempiazar el iecho de resina. La ventaja de la espuma metalica como sustrato de fase solida es que cuando se coioca en un campo magnetico, la espuma metalica genera gradientes de campo magnetico locales muy altos en distancias muy cortas io cuai puede atraer las partlcuias magneticas derivadas y ponerias en contacto con el asociado de eniazamiento compiementario sobre la espuma metalica y mejorar las oportunidades de una interaccion productiva especlfica. Ai optimizar el tamano de poro y el area superficial de la espuma metalica, la cinetica del ensayo puede desmejorarse notabiemente puesto que las partlcuias necesitan despiazarse distancias mucho mas cortas para encontrar una superficie compiementaria a la cuai unirse. La concentracion de partlcuia en el voiumen de reaccion a traves del fiujo sera reducida inversamente proporcionai a la concentracion de anaiito en la muestra y puede ser cuantificada utiiizando el lector MR. La espuma metalica puede ser nlquei que porta directamente unidades estructuraies etiquetadas con his unidas, o puede ser nlquei tratado con amiiosiiano y unidades estructuraies de eniazamiento eniazadas covaientemente. Este proceso ha sido demostrado utiiizando espuma metalica de nlquei tratada con amiiosiiano con poros de 400 pm cubierta con anticuerpos anticreatinina y se demuestra que eniaza especlficamente partlcuias magneticas derivadas con creatinina.
Para preparar piezas circuiares pequenas de la espuma metalica de nlquei (NMF), el material NMF es incubado con agua desionizada y iuego congeiado. El agua congeiada en las grietas del NMF soporta la espuma de tai manera que no colapsara ni creara bordes diferenciaies. A continuacion, se utiiiza un punzon para crear piezas de tamano uniforme de NMF; un martillo y un punzon (por ejempio, un tubo circular que tiene un borde de corte circular en un extremo) se utiiizan para cortar piezas circuiares, por ejempio, de 2-3 mm de tamano, de la espuma congeiada. Se usa entonces un aiambre para extraer las piezas, las cuaies son secadas en un horno para vidrio. Para derivar las piezas de NMF y preparar para uso en ios dispositivos y metodos descritos aqul, se iievan a cabo las siguientes etapas. Primero, las piezas NMF son iavadas con H2SO4 2M en un sonicador, y la solucion de acido suifurico se utiiiza para iimpiar el NMF y para hacer asperas las superficies de NMF con el fin de ayudar en la union subsecuente de ios grupos amino del amiiosiiano. Las piezas de NMF iavadas con acido son enjuagas entonces con agua desionizada para eiiminar cuaiquier solucion acida residual, y las piezas de NMF son secadas en un horno para vidrio. A continuacion las piezas de NMF son derivadas con amiiosiiano, y se une covaientemente a aminodextrano de 70 kD. El aminodextrano es estrecruzado entonces opcionaimente un giutaraidehldo. Pueden hundirse entonces covaientemente anticuerpos, oligonucleotidos y anaiitos especlficos a ios grupos amino sobre el aminodextrano utiiizando diversas qulmicas, y las piezas de NMF derivadas son incubadas para bioquear el eniazamiento no especlfico. Los bioqueadores comunes inciuyen pero no se iimitan a BSA, ieche desnatada seca, detergentes, ADN de esperma de salmon, entre otros.
Adicionaimente, hay ejempios de ensayos que se dirigirlan a detectar un cambio en propiedades flsicas en una muestra ilquida. Como se describe en casos pendientes, PCT/US2009/062537 (pubiicada como WO2010/051362) y PCT/US2008/073346 (pubiicada como WO2009/026164), la coagulacion de la sangre puede ser determinada por ios metodos presentes descritos aqul. Adicionaimente, pueden detectarse otras propiedades flsicas tales como solidificacion, cambios en densidad y pueden tener usos en determinar el curado de materiaies (composiciones plasticas), cambios en aiimentos y productos aiimenticios con el tiempo, contaminacion de productos encontrados en ia naturaieza y monitorizacion de ciertos fiuidos biologicos tales como orina, como una funcion de la funcion renal.
Las partlcuias magneticas utiiizadas en ios metodos no agiomerantes descritos aqul pueden tener un diametro promedio que va de 10 nm a 1200 nm (por ejempio, desde 10 a 50, 50 a 150, 150 a 250, 200 a 350, 250 a 450, 300 a 500, 450 a 650, 500 a 700 nm, 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o desde 1000 a 1200 nm).
Amplification y detection de acidos nucieicos a partir de muestras compiejas
Los metodos de ia invention pueden inciuir ensayos de deteccion de acidos nucieicos basados en amplificacion iievados a cabo partiendo de muestras compiejas de sangre entera (por ejempio, para analisis de diagnostico, forenses y ambientaies).
La preparation de ia muestra tambien debe retirar o proveer resistencia a inhibidores de PCR comunes encontrados en muestras compiejas (por ejempio, fiuidos corporaies, suero, u otro medio compiejo). Los inhibidores comunes aparecen en ia iista de ia Tabia 5 (vease tambien, Wilson, Appi. Environ. Microbiol., 63:3741 (1997)). Los inhibidores actuan tlpicamente bien sea por prevention de ia iisis ceiuiar, degradation o secuestro de un acido nucieico y/o inhibition de una actividad de poiimerasa. La poiimerasa empieada mas comunmente, Taq, es inhibida por ia presencia de 0.1% de sangre en una reaccion. Muy recientemente, se han disenado poiimerasas Taq mutantes que son resistentes a ios inhibidores comunes (por ejempio, hemogiobina y/o acido humico) encontrados en sangre y suero. (Kermekchiev et ai., Nuci. Acid. Res., 37(5): e40, (2009)). Las recomendaciones del fabricante indican que estas mutaciones permiten ia amplificacion directa de hasta 20% de sangre. A pesar de ia resistencia provista por
las mutaciones, la deteccion de PCR en tiempo real exacta es complicada debido a la detencion de la fluorescencia observada en la presencia de una muestra de sangre (Kermekchiev et al., Nucl. Acid. Res., 37: e40, (2009)).
Tabla 5. Inhibidores de PCR y facilitadores/metodos para superar la inhibicion
Sustrato
Diana Inhibidor Facilitador
Heces
Escherichia coli >103 celulas bacterianas Columna de intercambio ionico
Sustrato
Diana Inhibidor Facilitador
Csf
Treponema pallidum Residuos celulares que producen amplificacion no especlfica Cebadores anidados
Sangre entera
Tejido de mamlfero >4 pl de sangre/100 ml de mezcla de reaccion (hemoglobina) 1-2% de sangre por reaccion
Heces
Rotavirus Dilucion desconocida Fibra de celulosa
Especlmenes cllnicos
Citomegalovirus Componentes no identificados Extraccion con perlas de vidrio
Sangra y tejido humanos
Genes humanos Protelnas de enlazamiento a ADN Proteasa termofllica de cepa Thermus rt44A
Tejido de mamlfero
Geneticos de tejidos mamlferos Variaciones en ciclizador termico Formamida
Tejido de mamlfero
Genetico de tejidos mamlferos Variaciones en ciclizador termico DMSO, glicerol, PEG, solventes organicos
Especlmenes cllnicos
Treponema pallidum Factores desconocidos Diversos metodos fisicoqulmicos especlficos para el sustrato
Muestras forenses de semen
Esperma Errores de genotipificacion; inhibicion de PCR selectiva/total por microorganismos vaginales
Heces
Salmonella enterica Diversos fluidos corporales Separacion inmunomagnetica
Heces
Diversos virus entericos Desconocido Cromatografla de exclusion por tamano, extraccion fisicoqulmica
Especlmenes cllnicos
Virus herpes simplex Inhibidores endogenos, efectos aleatorios Repurificacion, control positivo coamplificado
Heces
Eschericha coli Inhibidores no especlficos, urea, hemoglobina, heparina, fenol, SDS Cebadores adicionales y ciclizadores de reaccion, potenciadores de PCR
Cultivo de tejidos
Citomegalovirus de VIH Polvo de guantes
Sustrato
Diana Inhibidor Facilitador
Suspensiones, biopsias de piel
Mycobacterium leprae Fijadores basados en mercurio, formalina regulada neutra Tiempos de fijacion reducidos, fijacion con etanol
Especlmenes cllnicos
Mycobacterium tuberculosis Inhibidores desconocidos en pus, biopsias de tejido, esputo, fluido pleural Extraccion fisicoqulmica
Tejido de mamlfero
Geneticos de tejido de mamlfero Contaminante desconocido de transcriptasa reversa ADN adicional
Sustrato
Diana Inhibidor Facilitador
Tejido en parafina fijado con formalina
Virus de hepatitis C Complejo de ribonucleotido vanadilo Fenol/extraccion con cloroformo
Aspirados y frotis nasofarlngeos
Bordetella pertussis Inhibidores desconocidos Fenol/extraccion con cloroformo
Celulas sangulneas humanas mononucleares
VIH tipo I Detergentes Aceite mineral
Mancha de sangre
ADN mitocondrial humano Compuesto heme identificado, hemina BSA
Sangre
Diversos Heparina Polimerasas y reguladores alternativos, chelex, espermina, [Mg2+], glicerol, BSA, heparinasa
Esputo
Mycoplasma pneumonia N-acetil-L-cistelna, ditiotreitol, agentes mucollticos
Tejido humano
Genotipificacion HLA- DRB1 Polen, polvo de guantes, ADN impuro, heparina, hemoglobina
Especlmenes cllnicos
Mycobacterium tuberculosis Desconocido Control interno competitivo
Placa dental
Muchos Desconocido Tierra de diatomaceas, isotiocianato de guanidio, etanol, acetona
Tejidos de mamlferos antiguos
Gen de citocromo b Desconocido Acetato de amonio, bromuro de etidio
La amplificacion de ADN o ADNc por reaccion en cadena de polimerasa es una metodologla probada y confiable; sin embargo, tal como se discutio mas arriba, las polimerasas son inhibidas por reactivos contenidos en muestras curadas, incluyendo pero no limitandose a anticoagulantes usados de manera comun y hemoglobina. Se han 5 disenados Taq polimerasas mutantes recientemente para encerrar los inhibidores comunes encontrados en sangre y suero. Polimerasas actualmente disponibles, por ejemplo, HemoKlenTaq™ (New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA) as! como OmniTaq™ y OmniKlenTaq™ (DNA Polimerase Technology, Inc., St. Louis, MO) son mutantes (por ejemplo, mutaciones de truncamiento y/o punto en terminal N), de Taq polimerasa que las hacen capaces de amplificar ADN en presencia de hasta 10%, 20% o 25% en sangre entera, dependiendo del producto y condiciones 10 de reaccion (vease, por ejemplo, Kermekchiev et al. Nucl. Acids Res. 31:6139 (2003); y Kermekchiev et al., Nucl.
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Acid., Res., 37:e40 (2009); y vease la Patente de los Estados Unidos No. 7,462,475). Adicionalmente, Phusion® Blood Direct PCR Kits (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia), incluyen una enzima polimerasa de ADN de fusion unica disenada para incorporar un dominio de enlazamiento de ADN de cadena doble, que permite amplificacion bajo condiciones que son tlpicamente inhibidoras para polimerasas convencionales tales como Taq o Pfu, y permiten la amplificacion de ADN en la presencia de hasta aproximadamente 40% de sangre entera bajo ciertas condiciones de reaccion. Vease Wang et al., Nuc. Acids Res. 32:1197 (2004); y veanse Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,352,778 y 5,500,363. Adicionalmente, Kapa Blood PCR Mixes (Kapa Biosystems, Woburn, MA), proveen una enzima polimerasa de ADN disenada geneticamente que permite la amplificacion directa de sangre entera hasta aproximadamente 20% del volumen de reaccion bajo ciertas condiciones de reaccion. A pesar de estos avances, la deteccion optica directa de amplicones generados no es posible con los metodos existentes puesto que la fluorescencia, absorbancia y otros metodos basados en la luz producen senales que son detenidas por la presencia de sangre. Vease Kermekchiev et al., Nucl. Acid. Res., 37:e40 (2009).
Hemos encontrado que las muestras complejas tales como sangre entera pueden ser amplificadas directamente utilizando aproximadamente 5%, 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 40%, y aproximadamente 45% o mas sangre entera en reacciones de amplificacion, y que los amplicones resultantes pueden ser detectados directamente a partir de la reaccion de amplificacion utilizando mediciones de relajacion por resonancia magnetica (MR) por la adicion de partlculas magneticas conjugadas enlazadas a oligonucleotidos complementarios a la secuencia de acidos nucleicos diana. Alternativamente, las partlculas magneticas pueden ser agregadas a la muestra antes de la amplificacion. Asl, se proveen metodos para el uso de amplificacion de acidos nucleicos en una muestra sucia compleja, hibridacion del amplicon resultante a partlculas paramagneticas, seguida por deteccion directa de conjugado de partlculas magneticas hibridadas y amplicones diana utilizando sistemas de deteccion basados en partlculas magneticas. En realizaciones particulares, la deteccion directa de los conjugados de partlculas magneticas hibridadas y amplicones se hace a traves de mediciones de relajacion MR (por ejemplo, T2, T1, hibrido T1/T2, T2*, etc). Se proveen adicionalmente metodos que son cineticos, con el fin de cuantificar el numero de copias de acido nucleico originales dentro de la muestra (por ejemplo, muestreo y deteccion de acido nucleico en numeros de ciclos predefinidos, comparacion de acidos nucleicos de control interno endogenos, uso de acidos nucleicos de control competitivos homologos seleccionados).
Los terminos “amplificacion” o “amplifica” o derivados de los mismos tal como se utilizan aqul significan uno o mas metodos conocidos en el arte de copiar un acido nucleico diana o de plantilla, incrementando por lo tanto el numero de copias de una secuencia de acidos nucleicos seleccionados. La amplificacion puede ser exponencial o lineal. Una acido nucleico diana o de plantilla puede ser ADN o ARN. Las secuencias amplificadas de esta manera forman una “region amplificada” o “amplicon”. Las sondas cebadoras pueden ser disenadas facilmente por los experimentados en el arte para dirigirse una secuencia de acido nucleico de plantilla especlfica. En ciertas realizaciones preferidas, los amplicones resultantes son cortos para permitir una ciclizacion y generacion de copias rapida. El tamano del amplicon puede variar segun se necesite para proveer la capacidad de discriminar acidos nucleicos diana de acidos nucleicos no diana. Por ejemplo, los amplicones pueden tener menos de aproximadamente 1,000 nucleotidos de longitud. De manera deseable los amplicones tienen de 100 a 500 nucleotidos de longitud (por ejemplo, de 100 a 200, 150 a 250, 300 a 400, 350 a 450, 400 a 500 nucleotidos de longitud).
Mientras que los metodos de ejemplo descritos de aqul en adelante se relacionan con amplificacion utilizando reaccion en cadena de polimerasa (“PCR”), se conocen numerosos otros metodos en el arte para la amplificacion de acidos nucleicos (por ejemplo, metodos isotermicos, metodos de clrculo en enrollamiento, etc.). Los experimentados en el arte entenderan que estos otros metodos pueden ser utilizados bien sea en lugar de, o junto con, los metodos de PCR. Vease, por ejemplo, Saiki, "Amplification of Genomic DNA" in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, Calif., pp 13-20 (1990); Wharam et al., Nucleic Acids Res. 29:E54 (2001); Hafner et al., Biotechniques, 30:852 (2001). Metodos de amplificacion adicionales adecuados para uso con los presente metodos incluyen, por ejemplo, el metodo de reaccion en cadena de polimerasa (PCR), PCR con transcripcion reversa (RT- PCR), reaccion en cadena de ligas (LCR), sistema de amplificacion basado en transcripcion (TAS), amplificacion mediada por transcripcion (TMA), metodo de amplificacion basado en secuencias de acidos nucleicos (NASBA), el metodo de amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), el metodo de amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP), el metodo de amplificacion de acidos nucleicos isotermico e iniciado por cebadores quimericos (ICAN), y el metodo del sistema de amplificacion inteligente (SMAP). Estos metodos, asl como otros son bien conocidos en el arte y pueden ser adaptados para uso en conjuncion con metodos provistos de deteccion de acidos nucleicos amplificados.
El metodo por PCR es una tecnica para hacer muchas copias de una secuencia de ADN de plantilla. El proceso de PCR esta divulgado en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195; 4,683,202 y 4,965,188. Se disena un conjunto de cebadores complementarios a un ADN de plantilla, y se amplifica una region flanqueada por los cebadores por ADN polimerasa en una reaccion que incluye multiples ciclos de amplificacion. Cada ciclo de amplificacion incluye una desnaturalizacion inicial, y hasta 50 ciclos de fusion, elongacion (o extension de cadena) y separacion (desnaturalizacion de cadena). En cada ciclo de la reaccion, la secuencia de ADN entre los cebadores es copiada. Los cebadores pueden enlazarse al ADN copiado asl como a la secuencia de plantilla original, de tal
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manera que el numero total de copias se incrementa exponencialmente con tiempo. El PCR puede llevarse a cabo de acuerdo con Whelan, et al., Journal of Clinical Microbiology, 33:556(1995). Hay disponibles diversos metodos de PCR modificados y son bien conocidos en el arte. Diversas modificaciones tales como el metodo “RP-PCR en el cual el ADN es sintetizado a partir de ARN utilizando una transcriptasa reversa antes de llevar a cabo el PCR; y el metodo “TaqMan PCR”, en el cual solamente un alelo especlfico es amplificado y detectado utilizando una sonda TaqMan marcada con fluorescencia y Taq DNA polimerasa, son conocidos por los experimentados en el arte. El RT- PCR y variaciones del mismo han sido descritos, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos No. 5,804,383; 5,407,800; 5,322,770; y 5,310,652, y las referencias descritas all!; y el PCR TaqMan y los reactivos relacionados para uso en el metodo han sido descritos, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,210,015; 5,876,930; 5,538,848; 6,030,787; y 6,258,569.
El LCR es un metodo de amplificacion de ADN similar al PCR, excepto que utiliza cuatro cebadores en vez de dos y utiliza la enzima ligasa para ligar o unir dos segmentos de ADN. La amplificacion puede llevarse a cabo en un ciclizador termico (por ejemplo, LCx of Abbott Labs, North Chicago, IL). La LCR puede llevarse a cabo, por ejemplo, de acuerdo con Moore et al., Journal of Clinical Microbiology 36:1028 (1998). Los metodos y variaciones de LCR han sido descritos, por ejemplo, en la Publicacion de Solicitud de Patente Europea No. EP0320308, y la Patente de los Estados Unidos No. 5,427,930.
El metodo TAS es un metodo para amplificar especlficamente un ARN objetivo en el cual se obtiene un transcripto a partir de un ARN de plantilla por una etapa de slntesis de ADNc y una etapa de transcripcion de ARN. En la etapa de slntesis de ADNc, una secuencia reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN (esto es, una secuencia de enlazamiento a polimerasa o PBS) se inserta en la copia de ADNc corriente abajo del objetivo o secuencia marcadora para ser amplificada utilizando un cebador de oligonucleotidos de dos dominios. En la segunda etapa la ARN polimerasa se utiliza para sintetizar multiples copias de ARN a partir de la plantilla de ADNc. La amplificacion utilizando TAS requiere solamente unos pocos ciclos porque la transcripcion de ARN dependiente de aDn puede dar como resultado 10-1000 copias para cada copia de plantilla de ADNc. La TAS puede ser ejecutada de acuerdo con Kwoh et al., PNAS 86:1173 (1989). El metodo TAS ha sido descrito, por ejemplo, en la Publicacion de Solicitud Internacional de Patente No. WO1988/010315.
La amplificacion mediada por transcripcion (TMA) es una reaccion de amplificacion isotermica basada en transcripcion que utiliza la transcripcion de ARN por ARN polimerasa y transcripcion de ADN por transcriptasa reversa para producir un amplicon de ARN a partir de un acido nucleico diana. Los metodos TMA son ventajosos puesto que producen de 100 a 1000 copias por amplicon por ciclo de amplificacion, en oposicion a los metodos PCR o LCR que producen solamente dos copias por ciclo. La TMA ha sido descrita, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,399,491. La NASBA es un metodo basado en transcripcion el cual para amplificar especlficamente un ARN objetivo bien sea de una plantilla de ARN o ADN. El NASBA es un metodo usado para la amplificacion continua de acidos nucleicos en una mezcla individual una temperatura. Se obtiene un transcripto a partir de una plantilla de ARN por ARN polimerasa dependiente de ADN utilizando un cebador de avance que tiene una secuencia identica a un ARN objetivo y un cebador reverso que tiene una secuencia complementaria al ARN objetivo en el lado 3' y una secuencia promotora que reconoce la T7 ARN polimerasa en el lado 5'. Se sintetiza adicionalmente un transcripto utilizando el transcripto obtenido como plantilla. Este metodo puede ser llevado a cabo de acuerdo con Heim, et al., Nucleic Acids Res., 26:2250 (1998). El metodo NASBA ha sido descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,130,238.
El metodo SDA es un metodo de amplificacion de acidos nucleicos isotermico en el cual el ADN diana es amplificado utilizando una cadena de ADN sustituida con una cadena sintetizada mediante un ADN polimerasa tipo sustitucion de cadena que carece de actividad de exonucleasa 5'- >3' mediante un intruso de cadena individual generado por una enzima de restriccion como plantilla de la siguiente replication. Un cebador que contiene un sitio de restriction es fusionado a la plantilla, y luego los cebadores de amplificacion son fusionados a secuencias adyacentes 5' (formando un intruso). La amplificacion se inicia una temperatura fija. Las cadenas de ADN recien sintetizadas son introducidas mediante una red de enzimas de restriccion y la amplificacion por polimerasa comienza de nuevo, desplazando las cadenas recien sintetizadas. El SDA puede ser llevado a cabo de acuerdo con Walker, et al., PNAS, 89:392 (1992). Los metodos SDA han sido descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,455,166 y 5,457,027.
El metodo LAMP es un metodo de amplificacion isotermica en el cual se forma siempre un bucle en el extremo 3' de un ADN sintetizado, los cebadores son fusionados dentro del bucle, y la amplificacion especlfica del ADN diana se lleva a cabo isotermicamente. El LAMP puede ser llevado a cabo de acuerdo con Nagamina et al., Clinical Chemistry. 47:1742 (2001). Los metodos LAMP han sido descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,410,278; 6,974,670; y 7,175,985.
El metodo ICAN es un metodo de amplificacion isotermica en el cual la amplificacion especlfica de un ADN diana, se lleva a cabo isotermicamente mediante una reaccion de sustitucion de cadena, una reaccion de intercambio de plantilla y una reaccion de introduction de intruso, utilizando un cebador quimerico que incluye ARN-ADN y ADN polimerasa que tiene una actividad de sustitucion de cadena y ARNasa H. El ICAN puede llevarse a cabo de
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acuerdo con Mukai et al., J. Biochem. 142: 273(2007). El metodo ICAN ha sido descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6,951,722.
El metodo SMAP (MITANI) es un metodo en el cual un acido nucleico diana es sintetizado de manera continua bajo condiciones isotermicas utilizando un primer conjunto que incluye dos clases de cebadores y ADN o ARN como una plantilla. El primer cebador incluido en el conjunto de cebadores incluye, en la region de extremo 3' del mismo, una secuencia (Ac') hibridable con una secuencia (A) en la region extremo 3' de una secuencia de acidos nucleicos diana as! como, en el lado 5' de la secuencia (Ac') antes mencionada, una secuencia (B') hibridable con una secuencia (Bc) complementaria una secuencia (B) existente en el lado 5' de la secuencia (A) antes mencionada en la secuencia de acidos nucleico diana antes mencionado. El segundo cebador incluye, en la region terminal 3' de la misma, una secuencia (Cc') hibridable con una secuencia (C) en la region terminal 3' de una secuencia complementaria a la secuencia de acido nucleico diana antes mencionada as! como una secuencia de retrobucle (D- Dc') que incluye dos secuencias de acido nucleico hibridables una con otra en una cadena identica en el lado 5' de la secuencia (Cc') antes mencionada. El SMAP puede ser llevado a cabo de acuerdo con Mitani et al., Nat. Methods, 4(3): 257 (2007). Los metodos SMAP han sido descritos en las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 2006/0160084, 2007/0190531 y 2009/0042197.
La reaccion de amplification puede ser disenada para producir un tipo especlfico de un producto amplificado, tal como acidos nucleicos que son de doble cadena; de cadena sencilla; de doble cadena con sobrantes 3' o 5'; o de doble cadena con ligandos qulmicos en los extremos 5' y 3'. El producto de PCR amplificado puede ser detectado por: (i) hibridacion del producto amplificado a oligonucleotidos complementarios enlazados una partlcula magnetica en donde se utilizan dos oligonucleotidos diferentes que hibridan al producto amplificado de tal manera que el acido nucleico sirve como una interpartlcula de atadura que promueve la aglomeracion de las partlculas; (ii) detection mediada por hibridacion en donde el ADN del producto amplificado debe ser desnaturalizado primero; (iii) deteccion mediada por hibridacion en donde las partlculas hibridan a sobrantes en 5' y 3' del producto amplificado; (iv) enlazamiento de las partlculas al ligando qulmico o bioqulmico en los terminales del producto amplificado, tal como partlculas funcionalizadas con estreptavidina que enlazan a un producto amplificado funcionalizado con biotina.
Los metodos de la invention pueden ser utilizados para llevar a cabo PCR en tiempo real y proveer information cuantitativa acerca de la cantidad de acido nucleico diana presente en una muestra (vease figura 52 y Ejemplo 18). Los metodo para llevar a cabo PCR en tiempo real cuantitativo se proveen en la literatura (veanse por ejemplo, RT- PCR Protocols. Methods in Molecular Biology, Vol. 193. Joe O'Connell, ed. Totowa, NJ: Humana Press, 2002, 378 pp. ISBN 0-89603-875-0.). El Ejemplo 18 describe el uso de los metodos de la invencion para analisis por PCR en tiempo real de una muestra de sangre entera.
Los metodos de la invencion pueden ser utilizados para llevar a cabo PCR en tiempo real directamente en muestras opacas de sangre entera, utilizando nanopartlculas magneticas modificadas con sondas de captura y separation magnetica. La utilizacion de PCR en tiempo real permite la cuantificacion de un acido nucleico diana sin abrir el tubo de reaccion despues de que la reaccion de PCR ha comenzado.
En una metodologla, pueden utilizarse cebadores marcados con biotina o avidina para llevar a cabo PCR en tiempo real. Estas marcaciones tendrlan unidades estructurales de enlazamiento correspondientes en las partlculas magneticas podrlan tener tiempos de enlazamiento muy rapidos. Esto permite que un producto de doble cadena sea generado y permita tiempos de enlazamiento a partlculas mucho mas rapidos, haciendo disminuir el tiempo utilizado global. La qulmica de enlazamiento seria reversible, evitando que los cebadores permanezcan enlazados a las partlculas. Con el fin de reversar el enlazamiento, la muestra puede ser calentada o ajustado el pH.
En otra metodologla, el PCR en tiempo real puede lograrse a traves de la generation de ADN duplex con sobrantes que pueden hibridar a las partlculas superparamagneticas. Adicionalmente, las sondas de captura LNA y/o fluoradas pueden acelerar los tiempos de hibridacion. Un conjunto de ejemplo de zonas de captura utiles en este metodo se define en la tabla a continuation.
Pan Candida F cola unica
5’- CAT GAT CTG CTG CAG /iSpl8/GG CAT GCC TGT TTG AGC GTC -3' (SEQ ID NO. 19)
Pan Candida R cola unica
5'- GCA GAA CTC CAG ACC /iSpl8/GC TTA TTG ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT -3' (SEQ ID NO. 20)
3'AM universal cola CP
5'- CTG CAG CAG ATC ATG TTT TTT TTT TTT /3AmMO/ -3' (SEQ ID NO. 21)
5'AM universal cola CP
5'- /5AmMC6/TT TTT TTT TTT TGG TCT GGA GTT CTG C -3'
3'AM uni CP Fluorado
5'- CTG /i2FC/AG /i2FC/AG /i2FA/TC /i2FA/TG TTT TTT TTT TTT /3AmMO/ -3' (SEQ ID NO. 22)
5'AM uni CP Fluorado
5’- /5AmMC12/TT TTT TTT TTT TGG T/i2FC/T G/i2FG/A G/i2FU/T CTGC-3’ (SEQ ID NO. 23)
En todavla otra metodologla, las partlcuias estan disenadas para tener una horquilla que sepulta el sitio de enlazamiento al amplicon. El calentamiento de las partlculas una temperatura de fusion mas alta expondrla el sitio de enlazamiento de la horquilla para permitir el enlazamiento a la diana.
5 En otra metodologla, una sonda que hibrida a un amplicon ata dos (o mas) partlculas. La reaccion seria llevada a cabo en la presencia de una polimerasa con actividad de exonucleasa en 5', dando como resultado la escision de la atadura interpartlculas y un cambio subsecuente en T2. La polimerasa es seleccionada para tener actividad de exonucleasa y compatibilidad con la matriz de seleccion (por ejemplo sangre). En esta metodologla, pueden utilizarse partlculas mas pequenas (por ejemplo, CLIO de 30 nm) para reducir el impedimento esterico de la 10 hibridacion a la diana o digestion enzimatica subsecuente durante la polimerizacion (veanse, por ejemplo, Heid et al Genome Research 1996 6: 986-994).
En otra metodologla, pueden sintetizarse dos poblaciones de partlculas para soportar sondas de captura complementarias. En ausencia de amplicon, las sondas de captura hibridan promoviendo la aglomeracion de partlculas. Al generar el amplicon, el amplicon puede competir, hibridar y desplazar las zonas de captura llevando a 15 la desaglomeracion de las partlculas. El metodo puede ser llevado con la presencia o ausencia de nanopartlculas. Las partlculas libres en solucion se aglomeraran y desaglomeraran debido al termociclado (puesto que por ejemplo, el Tm puede estar por debajo de 95°C). El Tm del amplicon que se enlaza una de las sondas de captura inmovilizadas por la partlcula puede ser disenado de tal manera que la interaccion de enlazamiento sea mas favorable que la interaccion de enlazamiento partlcula a partlcula (por ejemplo, el diseno de mutaciones puntuales 20 con las sondas de captura para desestabilizar termodinamicamente los duplex). En esta realization, la concentration de partlculas puede mantenerse, por ejemplo, a niveles bajos o altos. Ejemplos de sondas y cebadores utiles en tales sistemas se definen en la tabla a continuation.
C.albicans ITS2 Reverso P
5'- CCG TCT TTC AAG CAA ACC CAA GTC G -3' (SEQ ID NO. 24)
C.albicans ITS2 de avance P
5'- TTT CTC CCT CAA ACC GCT GG -3' (SEQ ID NO. 25)
C.alb ITS2 CP1
5’- /5AmMC12/TT TTT TTT TTT TTT TGG TTT GGT GTT GAG CAA TAC G -3’ (SEQ ID NO. 26)
C.alb ITS2 CP2
5'- /5AmMC12/TT TTT TTT TTT TCG TAT TGC TCA AC A CCA AAC C -3’ (SEQ ID NO. 27)
C.alb ITS2 Largo CP1
5’- /5AmMC12/TT TTT TTT TTT TTT TAC CGC TGG GTT TGG TGT TGA GCA ATA CG -3’ (SEQ ID NO. 28)
C.alb ITS2 Largo CP2
5’- /5AmMC12/TT TTT TTT TTT TTT TAC CGC TGG GTT TGG TGT TGA GCA ATA CG -3' (SEQ ID NO. 29)
C.alb ITS2 mut 3 CP1
5'- /5AmMC12/TT TTT TTT TTT TGG TTT GGC GTA GAG CCA TAC G -3’ (SEQ ID NO. 30)
C.alb ITS2 mut 4 CP1
5’- /5AmMC12/TT TTT TTT TTT TGG TCT GGC GTA GAG CCA TACG-3’ (SEQ ID NO. 31)
Trabajos previos han demostrado que en algunos casos la presencia de partlculas en la reaccion de PCR podrla
inhibir el PCR. Para estas partlcuias inhibidoras, se preve que las partlculas podrlan ser haladas al sitio del tubo (u otra localizacion dentro del contenedor) para mantenerlas fuera de la solucion durante la reaccion de PCR. Pueden utilizarse metodos para liberar las partlculas de regreso a la suspension con el fin de permitirles hibridar al producto de PCR y luego extraerlas de nuevo de la solucion.
5 En ciertas realizaciones, los metodos de la invencion presentan el uso de enzimas compatibles con sangre entera, por ejemplo, enzima para sangre entera NEB Hemoklentaq, DNAP Omniklentaq, Kapa Biosystems, enzima ThermoFisher Finnzymes Phusion.
Los metodos de la invencion tambien presentan PCR asimetrico cuantitativo en una realizacion preferida. Cualquiera de los metodos de PCR de tiempo real de la invencion, el metodo puede involucrar las siguientes etapas:
10 1. tomar allcuotas de sangre entera en una matriz maestra de PCR preparada que contiene partlculas
superparamagneticas;
2. antes del primer ciclo de PCR, cerrar el tubo hasta que se termine la ciclizacion por PCR;
3. cargar el tubo sobre el ciclizador termico;
4. llevar a cabo “n” ciclos de ciclizacion termica por PCR estandar;
15 5. llevar a cabo una deteccion T2 (la duracion exacta del tiempo y las etapas varlan dependiendo de la metodologla
de diseno bioqulmico y de partlcula descrito mas adelante); y
6. repetir las etapas 4 y 5 hasta que se hallan tomado suficientes lecturas de T2 para una cuantificacion exacta de la concentracion de diana inicial.
Los metodos anteriores pueden ser utilizados con cualquiera de las siguientes categorlas de deteccion de 20 agregacion o desagregacion descritas aqul, incluyendo:
Nombre
Descripcion
Deteccion basada en aglomeracion y separacion magnetica
• Partlculas >100 nm o compatibles con separacion magnetica. • Partlculas retiradas de la solucion durante PCR • T2 se eleva con la generacion de amplicon • Agitacion durante la etapa 5
Deteccion basada en aglomeracion con partlculas >100 nm
• Partlculas >100 nm • Partlculas no inhiben PCR • T2 se eleva con generacion de amplicon • Agitacion durante la etapa 5
Deteccion basada en desaglomeracion y separacion magnetica
• Partlculas >100 nm • Partlculas al lado del tubo durante PCR • T2 cae con la generacion de amplicon • Agitacion durante la etapa 5
Deteccion basada en desaglomeracion con partlculas >100 nm
• Partlculas >100 nm • Partlculas no inhiben PCR • T2 cae con la generacion de amplicon • Agitacion durante la etapa 5
Deteccion basada en aglomeracion con partlculas <100 nm
• Partlculas <100 nm (por ejemplo, partlculas de 30 nm) • T2 cae con la aparicion de amplicon (al menos para ciclos iniciales, T2 puede incrementarse subsecuentemente a medida que se incrementa el tamano del aglomerado) • Tiene potencial para tiempos de hibridacion mucho mas rapidos. • No se requiere agitacion para mantener las partlculas suspendidas • Concentracion de partlculas en rango de nM
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Description
Deteccion basada en desaglomeracion con partlculas <100 nm
• Partlculas <100 nm (por ejemplo, partlculas de 30 nm) • T2 cae se eleva con la aparicion de amplicon • T2 podrla disminuir a medida que el tamano del aglomerado se incrementa por encima de 100 nm • No se requiere agitation para mantener las partlculas suspendidas. • Tiene potencial para tiempos de deteccion mas rapidos. • Concentration de partlculas en el rango de nM
Una variedad de impurezas y componentes de la sangre entera pueden ser inhibidores para la polimerasa y la fusion del cebador. Estos inhibidores pueden llevar a la generacion de falsos positivos y bajas sensibilidades. Para reducir la generacion de falsos positivos y bajas sensibilidades cuando se amplifican y detectan acido nucleicos en muestras complejas, es deseable utilizar una polimerasa estable termicamente no inhibida por las muestras de sangre entera (vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 7,462,475) e incluir uno o mas controles de ensayo de PCR internos (vease Rosenstraus et al. J. Clin Microbiol. 36:191 (1998) y Hoofar et al., J. Clin. Microbiol. 42:1863 (2004)). Por ejemplo, para asegurar que los especlmenes cllnicos son amplificados y detectados exitosamente, el ensayo puede incluir un acido nucleico de control interno que contiene regiones de enlazamiento de cebador identicas a las de la secuencia diana. Como se muestra en los ejemplos, el acido nucleico diana y el control interno pueden ser seleccionados de tal manera que cada uno tenga una region de enlazamiento a sonda unica que diferencie el control interno del acido nucleico diana. El control interno, opcionalmente, se emplea en combination con un control positivo de procesamiento, un control negativo de procesamiento, y un control de reactivos para la determination e identification segura y exacta de un organismo infeccioso, por ejemplo, en una muestra cllnica de sangre entera. El control interno puede ser un control de inhibition que esta disenado para coamplificar el acido nucleico diana que esta siendo detectado. El fallo en el control de la inhibicion interna que va a ser amplificada es evidencia de un fallo de reactivo o de error de proceso. Pueden disenarse cebadores universales de tal manera que la secuencia diana y la secuencia de control interno se amplifica en el mismo tubo de reaction. Asl, utilizando este formato, si el ADN diana es amplificado pero el control interno no lo es se asume entonces que el de ADN diana esta presente en una cantidad proporcionalmente mayor que la del control interno y el resultado positivo es valido puesto que la amplification del control interno es innecesaria. Si, por otro lado, ni el control interno ni la diana son amplificados se asume que ha ocurrido inhibicion de la reaccion de PCR y la prueba para esa muestra particular no es valida. Los ensayos de la invention pueden incluir uno o mas controles de procesamiento positivos en los cuales uno o mas acidos nucleicos diana son incluidos en el ensayo (por ejemplo, cada uno incluido con uno o mas cartuchos) a 3x hasta 5x el llmite de detection. El T2 medido para cada uno de los controles de procesamiento positivos debe estar por encima del umbral predeterminado que indica la presencia del acido nucleico diana. Los controles de procesamiento positivos pueden detectar todos los fallos de reactivos en cada etapa del proceso (por ejemplo, lisis, PCR y deteccion de T2), y pueden ser utilizados para control de calidad del sistema. Los ensayos de la invencion pueden incluir uno o mas controles de procesamiento negativos consistentes de una solution libre de acido nucleico diana (por ejemplo, regulador solo). Las mediciones de T2 para el control de procesamiento negativo deberlan estar por debajo del umbral indicando un resultado negativo mientras que el T2 medido para el control interno esta por encima del umbral de decision indicando un resultado positivo de control interno. El proposito del control negativo es detectar el arrastre de contamination y/o contamination de reactivos. Los ensayos de la invencion pueden incluir uno o mas controles de reactivos. El control de reactivos detectara fallos en los reactivos en la etapa de PCR de la reaccion (esto es, transferencia incompleta de la mezcla principal a los tubos de PCR). Los controles de reactivos tambien pueden detectar fallos graves en la transferencia de reactivos antes de la deteccion de T2.
Control de contaminacion
Uno de los problemas principales en el uso de PCR como herramienta analltica es el riesgo de tener nuevas reacciones contaminadas con productos amplificados anteriores. Fuentes potenciales de contaminacion incluyen a) grandes numeros de organismos diana en especlmenes cllnicos que pueden dar como resultado contaminacion cruzada, b) clones de plasmidos derivados de organismos que han sido analizados previamente y que pueden estar presentes en numeros mayores en el ambiente del laboratorio, y c) amplificacion repetida de la misma secuencia diana que lleva a la acumulacion de productos de amplificacion en el ambiente del laboratorio. Una fuente comun de la acumulacion del amplicon de PCR es la aerosolizacion del producto. Tlpicamente, si ocurre una aerosolizacion no controlada, el amplicon contaminara los reactivos, equipo y sistemas de ventilation del laboratorio. Cuando esto sucede, todas las reacciones seran positivas, y no es posible distinguir entre los productos amplificados de la contaminacion o una muestra positiva verdadera. Ademas de tomar precauciones para evitar o controlar este arrastre de productos antiguos, es necesario incluir una reaccion de referencia de blanco en cada experimento de PCR para verificar cualquier arrastre. Con el fin de asegurarse de que todos los resultados son confiables, no
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deberla haber productos amplificados despues de los ciclos de temperatura. Una contaminacion por arrastre sera visible en el gel de agarosa como bandas tenues. Adicionalmente, tambien es muy importante incluir una muestra positiva. Si, al contrario de lo esperado, la muestra es negativa, ninguno de los resultados puede ser considerado como veroslmil (vease Aslanzadeh et al., Annals of Clin Lab Science, 34:389 (2004)).
Es concebible que los reactivos utilizados para preparar el PCR puedan estar contaminados. Despues de la amplificacion una muestra positiva puede contener 250 ng de producto de PCR en 50 pl. Esto da un total de 3X1011 copias de producto de doble cadena de 600 bp. Una milesima de un microlitro de esta reaccion contendra aproximadamente 8 millones de copias. Si se forma un aerosol muy pequeno e invisible cuando se abre el recipiente de PCR, hay la posibilidad de que este aerosol pueda contener un numero muy grande de productos amplificados. Adicionalmente, las gotitas microscopicas en un aerosol son capaces de flotar durante un largo tiempo en el aire, y si hay turbulencia en el ambiente, pueden ser arrastradas una distancia larga. Considerando el hecho de que solamente una copia es suficiente para crear una reaccion de falso positivo, es obvio que debe tenerse gran cuidado para evitar esta contaminacion por arrastre.
Para abordar el problema de la contaminacion, pueden utilizarse uno o mas de los siguientes protocolos:
(i) Reemplace todos los reactivos y reguladores de reserva con productos qulmicos nuevos y agua nueva que nunca haya estado en contacto con las areas de preparation de muestras y analisis por PCR.
(ii) Divida flsicamente el area de mezcla de reactivos y preparacion de muestras del area de analisis de producto (Kwok & Higuchi, Nature, 339:237 (1989)).
(iii) Las estaciones de trabajo de preparacion de muestras pueden ser limpiadas (por ejemplo, con solution de hipoclorito de sodio al 10%, seguida por elimination de la lejla con etanol). La ruptura oxidativa de los acidos nucleicos evita la reamplificacion de las impurezas en subsecuentes reacciones de PCR.
(iv) La esterilizacion de los productos de amplificacion asegura que los ensayos de diagnostico subsecuentes no estan comprometidos por el ADN arrastrado, y deben seguir dos criterios aceptados generalmente: (a) el PCR necesita estar expuesto al ambiente despues de que ha habido alguna forma de modification del amplicon, y (b) la modification no debe interferir con el metodo de detection. Por ejemplo, la irradiation UV puede eliminar efectivamente el ADN contaminante (vease Rys et al., J. Clin Microbiol. 3:2356 (1993); y Sarker et al., Nature, 343:27 (1990)), pero la irradiacion de los reactivos para PCR debe tener lugar antes de la adicion de la polimerasa, cebadores y ADN de plantilla. Adicionalmente, esta metodologla puede ser ineficiente porque los grandes numeros de mononucleotidos presentes en la reaccion absorberan mucha de la luz UV (vease Frothingham et al., BioTechniques 13:208 (1992)). La esterilizacion por la luz UV de los productos de amplificacion utiliza la propiedad de la luz UV para inducir los dlmeros de timina y otras modificaciones covalentes del aDn que hacen no amplificable el ADN contaminante. Alternativamente, la incorporation dUTP en los fragmentos amplificados tambien alteraran la composition del producto de tal manera que es diferente de la composition del ADN plantilla (vease Longo et al., Gene 93:125 (1990); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,035,996; 7,687,247; y 5,418,149). La enzima uracil-N- glicosilasa (UNG) se anade junto con la enzima PCR normal a la mezcla de reaccion. La enzima UNG escindira la base de uracilo de las cadenas de ADN antes de la amplificacion, y deja todos los productos antiguos amplificados incapacitados para actuar como plantillas para nuevas amplificaciones, pero no reaccionaran con dUTP no incorporado o nueva plantilla. Esto eliminara muy eficientemente los productos de PCR contaminantes de la reaccion despues de que el recipiente de PCR haya sido cerrado, y as! no es posible una nueva contaminacion. Sin embargo, el uso de dUTP en las reacciones de pCr para evitar el arrastre puede causar problemas cuando los productos se utilizan en un estudio de hibridacion posterior, debido a la baja capacidad del uracilo para actuar en la hibridacion (Carmody et al., Biotechniques 15:692 (1993). El dUTP se incorpora en vez del dTTP. Cuando una sonda rica en T es amplificada con la sustitucion de dTTP en vez de dUTP en la mezcla de reaccion, puede eliminarse una senal de hibridacion posterior con la sonda. Para evitar el descenso en la senal de hibridacion el sitio de enlazamiento de la sonda debe ser escogido con no mas de 25% de T, y sin estiramientos de poli-T. Ademas, el PCR deberla contener concentraciones iguales de dUTP y dTTP y no solamente dUTP. En contraste con el descenso en la senal de hibridacion esta el incremento en la amplificacion de producto cuando se utiliza dUTP, especialmente cuando se seleccionan secuencias diana ricas en AT. Esto se debe probablemente a que la incorporacion de dUTP hace disminuir la refusion de los productos de PCR formados lo que evitarla que los cebadores se fusionen. Si esta metodologla se utiliza para incrementar el rendimiento de producto, los sitios de enlazamiento del cebador deberlan ser seleccionados con un bajo contenido de T, puesto que la primera fusion tambien sera inhibida por la incorporacion de dUTP (Carmody et al., Biotechniques 15:692 (1993)). El UDG labil al calor aislado de BMTU 3346 esta descrito en Schmidt et al., Biochemica 2:13 (1996) (vease tambien la Patente de los Estados Unidos No. 6,187,575). Un gen de uracil-ADN glicosilasa de Psychrobacter sp HJ147 esta descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 7,723,093. Finalmente una uracil-ADN glicolasa de bacalao ha sido descrita (Patente de los Estados Unidos No. 7,037,703).
(v) La digestion por ADNasa despues de PCR puede ser utilizada para reducir la contaminacion. Fue identificada una enzima ADNasa labil al calor que puede ser usada para digerir ADN ds para eliminar cualquier ADN
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contaminante antes de la etapa de amplificacion por PCR del ADN diana. En este caso, el ADN ds es digerido, la
muestra es calentada para inactivar la ADasa y la muestra diana y los reactivos de PCR se agregan al tubo de
reaccion para llevar a cabo la PCR especlfica de la diana (vease la Patente de los Estados Unidos No. 6,541,204).
(vi) La esterilizacion despues de PCR puede ser utilizada para reducir la contaminacion. La incorporacion de un
reactivo fotoqulmico (isopsoraleno) en el producto durante la amplificacion creara una diferencia en composicion entre el ADN plantilla y los productos de PCR amplificados (vease Rys et al., J. Clin Microbiol. 3:2356 (1993). Los compuestos de furocumarina, tales como isopsoraleno y psoraleno, son una clase de reactivos triclclicos planos que son conocidos por intercalarse entre los pares de acidos nucleicos (vease Patente de los Estados Unidos No. 5,532,145). El tratamiento con luz del recipiente de PCR cerrado hara que los productos de PCR formados previamente sean incapaces de actuar como plantillas para amplificacion posterior. Las capacidades de hibridacion del producto no cambian, pero las capacidades de deteccion sobre gel de agarosa pueden disminuir debido al
enlazamiento reducido del EtBr. El isopsoraleno de 25 mg/ml ha demostrado ser ineficaz en la prevencion de la
contaminacion, y a concentraciones de hasta 100 mg/ml, el isopsoraleno puede tener un efecto inhibidor sobre la reaccion de PCR misma (vease la Patente de los Estados Unidos No. 5,221,608). Alternativamente, la hidrolisis del cebador puede ser utilizada para esterilizar una reaccion despues de la amplificacion. La hidrolisis del cebador de la esterilizacion de productos de amplificacion se basa en los cebadores quimericos sintetizados exclusivamente que contienen uno o mas enlaces ribosa en el extremo 3'. Los productos de amplificacion generados que contienen estos residuos ribosa son susceptibles de hidrolisis alcalina en el sitio de la molecula de ribosa. El metodo incluye exponer a NaOH 1M e incubar durante 30 minutos para hidrolizar los productos de amplificacion en los sitios de la ribosa incorporada. Asl, si hay contaminacion por arrastre, el antiguo amplicon habra perdido su primer sitio debido a la hidrolisis de las moleculas de ribosa y el nuevo amplicon tendra los sitios de enlazamiento a cebador. En otra metodologla, la adicion de clorhidrato de hidroxilamina a los tubos de reaccion de PCR despues de la amplificacion es esterilizar los contenidos de la reaccion, y es especialmente efectiva para productos de amplificacion cortos (<100 bp) y ricos en GC. La hidroxilamina reacciona preferencialmente con atomos de oxlgeno a los residuos citosina y crea aductos covalentes que evitan el apareamiento de bases con residuos guanina en reacciones subsecuentes. Asl, el producto de amplificacion modificado es reconocido como diana de amplificacion en reacciones de PCR subsecuentes.
(vii) La prevencion del arrastre por el cambio de la composicion de productos a partir de la plantilla puede reducir la contaminacion. En una metodologla la composicion de ADN del producto de pCR puede ser diferente de la composicion de ADN de la plantilla natural. Se preve que esta composicion alterada hara que los productos de PCR sean sensibles al tratamiento y no alterara el ADN de plantilla. El tratamiento del recipiente de PCR cerrado justo antes de la amplificacion deberla hacer que el producto de PCR contaminante sea incapaz de participar en la amplificacion. Aqul la modificacion tendrla que ser inocua al metodo de deteccion. Los tipos de modificaciones que pueden ser utiles en la distincion del producto de amplificacion contaminante seran evidentes, pero incluyen la introduccion de un ligando, agente de entrecruzamiento, sitio de reconocimiento enzimatico u otra unidad estructural escindible (veanse las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,427,929; 5,650,302; 5,876,976 y 6,037,152.
Uno o mas de los metodos descritos anteriormente pueden ser utilizados en conjuncion con los metodos de la invention para reducir el riesgo de contaminacion y falsos positivos. El arrastre de productos de PCR amplificados antiguos puede ser un riesgo muy serio en el analisis de acidos nucleicos en la plataforma de diagnostico T2 Biosystems. Una manera de evitar esta contaminacion es dividir flsicamente las areas de trabajo de PCR. Alternativas a la separation flsica del metodo de reaccion de PCR incluyen irradiation UV de la mezcla para PCR y la incorporacion de reactivos en el producto de PCR recien formado puede ser utilizada para alterarlo con respecto a la plantilla.
Cinetica de reaccion
La reaccion de las partlculas magneticas y los analitos especlficos para formar agregados puede utilizarse para producir una senal de diagnostico de los ensayos de la invencion. En muchos casos, la incubation de la mezcla de reaccion durante un perlodo de tiempo es suficiente para formar los agregados. Los metodos, kits, cartuchos y dispositivos descritos pueden ser configurados para acortar la cantidad de tiempo necesaria para capturar un analito particular, o producir agregados de partlculas magneticas. A la vez que alterar la concentration global de las partlculas magneticas parecerla ser una metodologla simple indirecta para incrementar las ratas de agregacion, esta metodologla es complicada porque (i) la agregacion no especifica que puede surgir con concentraciones de partlculas magneticas altas, y (ii) la necesidad de producir un cambio de senal observable (esto es, cambio en la senal de relajacion) en respuesta a la agregacion en presencia de una concentracion baja de analitos. La cinetica de reaccion puede ser mejorada, por ejemplo, por agregacion mecanicamente inducida, por agregacion inducida acusticamente, por agregacion inducida por via ultrasonica, por agregacion inducida electrostaticamente, o por atrapamiento de las partlculas magneticas en una portion de la muestra llquida.
Agregacion inducida mecanicamente
La cinetica de la agregacion puede ser incrementada haciendo pasar la solution de partlcula/analito a traves de un
recipiente en el cual hay un estrechamiento de la ruta del flujo de fluido. El estrechamiento potencia las interacciones partlcula-partlcula.
Agregacion inducida por via acustica
La agregacion de partlculas magneticas puede acelerarse aplicando una onda acustica a la muestra (vease 5 Aboobaker et al., Journal of Enviromnental Engineering, 129:427 (2003) y la Patente de los Estados Unidos No. 4,523,682). Por ejemplo, puede utilizarse una camara de flujo con dos transductores en extremos opuestos para generar una onda acustica en la muestra que hace que las partlculas magneticas migren (o sean segregadas) de una manera que incremente la rata de agregacion de las partlculas magneticas.
Agregacion inducida por via ultrasonica
10 La agregacion de partlculas magneticas puede ser acelerada aplicando una onda ultrasonica a la muestra (vease Masudo eta al., Anal. Chem. 73:3467 (2001)). En la presencia de una onda de ultrasonido plana constante las partlculas pueden moverse hacia el nodo de la onda a lo largo del gradiente de fuerza de ultrasonido. Esta metodologla puede ser utilizada para proveer un metodo confiable para ayudar en la reaccion de aglomeracion.
Agregacion inducida electrostaticamente
15 La agregacion de partlculas magneticas puede ser acelerada por interacciones electrostaticas. Las separaciones o movimiento electrostatico de las partlculas magneticas utilizan diferencias inherentes en las caracterlsticas de las cargas de friccion, conductibilidad electrica y constantes dielectricas. Puesto que las partlculas magneticas se comportaran de manera diferente bajo la aplicacion de un campo electrostatico, pueden ocurrir movimiento y colisiones potenciadas. La fuerza electrostatica ejercida sobre las partlculas puede ser proporcional al area 20 superficial disponible para la carga de superficie, de tal manera que las nanopartlculas se moveran tlpicamente en la presencia del campo electrostatico cuando se recubren con materiales variables, tales como dextrano u otros recubrimientos moleculares grandes, y si la nanopartlcula ha unido una de las unidades estructurales de enlazamiento un analito. Las nanopartlculas se cargaran primero y la carga podrla ser pulsada opcionalmente. Vease, por ejemplo, Sinyagin et al., J. Phys. Chern. B 110:7500 (2006); Kretschmer et al., Langmuir 20:11797 25 (2004); Bernard et al., Nanotechnology 18: 235202 (2007); y Costanzo et al., Lab Chip 2005 5:606 (2005).
Atrapamiento
Las partlculas magneticas derivadas con una unidad estructural de enlazamiento pueden ser mantenidas en posicion mediante un campo magnetico externo mientras que la muestra que contiene el analito correspondiente circula pasando las partlculas magneticas “atrapadas” permitiendo la captura y/o concentracion del analito de 30 interes. La captura y/o agregacion puede ser facilitadas por exposicion a un campo magnetico (esto es, MAA o gMAA) como se describe aqul.
Alternativamente, la cinetica de la agregacion de partlculas magneticas puede ser incrementada secuestrando las partlculas magneticas en un compartimiento definido por una membrana porosa, tal como una bolsa de te, lo que permite el flujo de analitos hacia dentro y hacia afuera del compartimiento. El incremento en la concentracion local 35 de partlculas magneticas puede incrementar la cinetica de reaccion entre las partlculas magneticas y los analitos, y la cinetica de agregacion. Despues de mezclar la solucion y las partlculas magneticas durante un perlodo predeterminado de tiempo, las partlculas magneticas son liberadas del compartimiento y se mide la muestra.
En ciertos casos, las partlculas pueden ser llevadas al lado o parte inferior del recipiente de ensayo, o puede estar presente una malla magnetizable o una espuma metalica magnetizable con tamano de poro apropiado en el 40 recipiente de reaccion, creando gradientes magneticos locales muy altos. La espuma metalica genera gradientes de campo magnetico locales muy altos sobre distancias muy cortas que pueden atraer las partlculas magneticas derivadas y ponerlas en contacto con el asociado de enlazamiento complementario sobre la espuma metalica y mejorar las oportunidades de una interaccion productiva especlfica. Una ventaja de tener la malla/espuma metalica en el recipiente de reaccion es que la distancia que cada partlcula magnetica necesita recorrer para ser “atrapada” o 45 “capturada” puede ser muy corta mejorando la cinetica del ensayo. Por ejemplo, a un tubo de reaccion puede agregarse una espuma de malla magnetizable que tiene poros de 100 a 1000 micrones, una muestra llquida, y partlculas magneticas para detectar un analito en la muestra llquida. El tubo de reaccion es expuesto a un campo magnetico par magnetizar la malla. Las partlculas magneticas son atraldas entonces a la malla magnetizada y se atrapan dentro de los poros de la malla. La concentracion de las partlculas magneticas dentro de la malla incrementa 50 la cinetica de reaccion entre las partlculas magneticas y el analito difundiendolo hacia adentro y fuera de la malla (el tubo de reacciones es agitado opcionalmente para acelerar la difusion del analito sobre las partlculas magneticas atrapadas). La malla es entonces desmagnetizada (por ejemplo, calentando la malla o exponiendo la malla a un campo magnetico o alternativo), permitiendo de esta manera la liberacion de las partlculas magneticas complejas al analito. Pueden formarse entonces agregados mas grandes de partlculas magneticas, completando la reaccion.
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En una metodologla analoga, las cineticas de la agregacion de partlculas magneticas pueden ser incrementadas llevando mediante centrifugacion las partlculas magneticas hacia abajo del fondo del tubo de muestra. El incremento en la concentracion local de las partlculas magneticas puede incrementar la cinetica de agregacion. Para facilitar la separacion por centrifugacion las partlculas son, deseablemente, mayores de aproximadamente 30 nm de diametro.
Unidades de RMN
El sistema para llevar a cabo los metodos de la invention puede incluir una o mas unidades de RMN. La figura 1A es un diagrama 100 esquematico de un sistema de RMN para detection de una respuesta de senal de una muestra llquida una secuencia de pulsos de RF apropiada. Un magneto 102 de desviacion establece un campo magnetico Bb 104 desviado a traves de una muestra 106. Las partlculas magneticas estan en estado llquido o liofilizado en el cartucho antes de su introduction a un pozo de muestra (el termino “pozo” tal como se utiliza aqul incluye cualquier indentation recipiente, contenedor o soporte) 108 hasta la introduccion de la muestra 106 llquida en el pozo 108, o las partlculas magneticas pueden ser agregadas a la muestra 106 antes de la introduccion de la muestra llquida en el pozo 108. Una bobina 110 de RF y un oscilador 112 de RF provee una excitation de RF a la frecuencia Larmor la cual es una funcion lineal del campo magnetico Bb desviado. En una realization, la bobina 110 de RF es envuelta alrededor del pozo 108 de muestra. La RF de excitacion crea una distribution sin equilibrio en la rotation de los protones del agua (o protones libres en un solvente no acuoso). Cuando la excitacion de RF es desconectada, los protones “se relajan” a su estado original y emiten una senal RF que puede ser utilizada para extraer information acerca de la presencia y concentracion del analito. La bobina 110 actua como una antena de RF y detecta una senal, la cual basada sobre la secuencia de pulsos de Rf aplicada, sondea diferentes propiedades del material, por ejemplo una relajacion T2. La senal de interes para algunos casos de la tecnologla es la relajacion rotation-rotation (en general 10-2000 milisegundos) y se denomina la relajacion T2. La senal de RF desde la bobina 110 es amplificada 114 y procesada para determinar la respuesta a T2 (tiempo de calda) a la excitacion en el campo Bb desviado. El pozo 108 puede ser un pequeno capilar u otro tubo con nanolitros hasta microlitros de la muestra, incluyendo el analito y una bobina de tamano apropiado enrollada alrededor del mismo (vease figura 1B). La bobina es envuelta tlpicamente alrededor de la muestra y dimensionada de acuerdo con el volumen de muestra. Por ejemplo, para muestra que tiene un volumen de aproximadamente 10 ml, podrla usarse una bobina solenoide de aproximadamente 50 mm de longitud y 10 a 20 mm de diametro; para una muestra que tiene un volumen de aproximadamente 40 pl, podrla usarse una bobina solenoide de aproximadamente 6 a 7 mm de longitud y 3.5 a 4 mm de diametro; y para una muestra que tiene un volumen de aproximadamente 0.1 nl podrla usarse una bobina solenoide de aproximadamente 20 pm de longitud y aproximadamente 10 pm de diametro. Alternativamente, la bobina puede ser configurada como se muestra en cualquiera de las figuras 2A-2E aproximadamente o en la proximidad al pozo. Un sistema de RMN tambien puede contener multiples bobinas de RF para la deteccion de propositos multiplex. En ciertas realizaciones, la bobina de RF tiene una forma conica con las dimensiones de 6 mm x 6 mm x 2 mm.
Las figuras 2A-2E ilustran disenos de microbobina de RMN (bobina RF). La figura 2A muestra una microbobina 200 solenoide envuelta de alrededor de 100 pm de longitud, sin embargo se podrla prever una bobina que tenga 200 pm, 500 pm o hasta 1000 pm de longitud. La figura 2B muestra una bobina 202 “plana” (la bobina no es realmente plana, puesto que la bobina tiene espesor finito), alrededor de 1000 pm de diametro. La figura 2C muestra una bobina 204 solenoide MEMS que define un volumen de aproximadamente 0.02 pL. La figura 2D muestra una configuration de bobina 206 de MEMS de Helmholz esquematica y la figura 2E muestra un esquema de una configuracion de bobina 220 en montura.
Una microbobina 200 solenoide envuelta usada para la deteccion por RMN tradicional se describe en Seeber et al., “Design and testing of high sensitivity micro-receiver coil apparatus for nuclear magnetic resonance and imaging," Ohio State University, Columbus, Ohio. Una microbobina 202 plana usada para deteccion por RMN tradicional esta descrita en Massin et al., "High Q factor RF planar microcoil for micro-scale NMR spectroscopy," Sensors and Actuators A 97-98, 280-288 (2002). Una configuracion 206 de bobina de Helmholtz presenta un pozo 208 para contener una muestra, una capa 210 superior de Si, una capa 212 inferior de Si, y bobinas 214 metalicas depositadas. Un ejemplo de una configuracion 206 de bobina de Helmholtz usada para la deteccion tradicional por RMN esta descrita en Syms et al, "MEMS Helmholz Coils for Magnetic Resonance Spectroscopy," Journal of Micromechanics and Micromachining 15 (2005) S1-S9.
La unidad RMN incluye un magneto (esto es, un magneto superconductor, un electromagneto o un magneto permanente). El diseno del magneto puede ser abierto o parcialmente cerrado, variando desde magnetos en forma de U o C, hasta magnetos con tres o cuatro postes, hasta magnetos completamente encerrados con pequenas aberturas para colocation de la muestra. La clave es la accesibilidad al “punto dulce” del magneto y la estabilidad mecanica (la estabilidad mecanica puede ser un problema cuando se desea una homogeneidad alta de campo). Por ejemplo, la unidad de RMN puede incluir uno o mas magnetos permanentes, conformados cillndricamente y hechos a partir de SmCo, NdFeB, u otros magnetos permanentes de campo bajo que proveen un campo magnetico en el rango de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 1.5 T (por ejemplo, magnetos permanentes adecuados de SmCo y NdFeB estan disponibles en Neomax, Osaka, Japon). Para propositos de ilustracion, tales magnetos permanentes pueden ser un ensamblaje de magneto permanente (PM) dipolo/caja, o un diseno hallbach (vease
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Demas et al., Concepts Magn Reson Part A 34A:48 (2009)). Las unidades de RMN pueden incluir un magneto permanente de aproximadamente 0.5 T de fuerza con una homogeneidad de campo de aproximadamente 20-30 ppm y un punto dulce de 40 pL centrado. Esta homogeneidad de campo permite usar un magneto menos costoso (menos tiempo para la sintonizacion fina del ensamblaje/acunamiento) en un sistema menos proclive a fluctuaciones (por ejemplo desplazamiento de temperatura, estabilidad mecanica con el tiempo, practicamente cualquier impacto es demasiado pequeno para ser visto), movimiento tolerante de objetos ferromagneticos o conductores en el campo de alejamiento (tienen menos de un impacto, por lo tanto se requieren menos escudos), sin comprometer las mediciones del ensayo (las mediciones de relajacion y las mediciones de correlacion no requieren un campo altamente homogeneo).
La configuracion de la bobina puede ser escogida o adaptada para la implementacion especlfica de la tecnologla de micro RMN-MRS, puesto que diferentes configuraciones de bobina ofrecen diferentes caracterlsticas de rendimiento. Por ejemplo, cada una de estas geometrlas de bobina tiene un rendimiento y alineamiento de campos diferentes. La bobina 202 plana tiene un campo RF perpendicular al plano de la bobina. La bobina 200 solenoide tiene un campo de RF por debajo del eje de la bobina, y la bobina 206 de Helmholtz tiene un campo de RF transverso a las dos bobinas 214 rectangulares. Las bobinas 206 de Helmholtz y 220 de montura pueden ser las mas efectivas para el diseno del chip, mientras que la bobina 200 solenoide puede ser la mas efectiva cuando la muestra y las partlculas magneticas MRS son mantenidas en un microtubo.
Los dispositivos de micro RMN pueden ser fabricados enrollando o imprimiendo las bobinas o por tecnicas de fabrication de semiconductores por sistemas micro electromecanicos (MEMS). Por ejemplo, un modulo de bobina enrollada o impresa/pozo para muestra pueden tener aproximadamente 100 pm de diametro, o ser tan grandes como un centlmetro o mas. Una unidad o chip MEMS (llamado as! porque es fabricado en un proceso de semiconductor como un molde sobre un gofre) puede tener una bobina que va desde aproximadamente 10 pm hasta aproximadamente 1000 pm en dimension caracterlstica, por ejemplo. La configuracion de bobina enrollada o impresa/pozo para muestra es denominada aqul como un modulo y la version MEMS es denominada aqul como un chip. Por ejemplo, la muestra 108 llquida puede ser mantenida en un tubo (por ejemplo, un capilar, pipeta o microtubo) con la bobina enrollada alrededor del mismo, o puede ser mantenida en pozos sobre el chip con la bobina de RF circundando el pozo. Alternativamente, la muestra es posicionada para fluir a traves de un tubo, capilar o cavidad de la proximidad de la bobina de RF.
Los componentes basicos de una unidad de RMN incluyen componentes electricos, tales como un circuito de RF sintonizado dentro de un campo magnetico, incluyendo un sensor de RM, electronica reception y transmision que podrla incluir preamplificadores, amplificadores y circuitos de protection, componentes de adquisicion de datos, programadores de pulsos y generadores de pulsos.
Los sistemas que contienen unidades de RMN con bobinas de RF y micropozos que contienen sensores de partlculas magneticas descritas aqul pueden ser disenados para la detection y/o medicion de la concentration de analitos especlficos de interes mediante el desarrollo de un modelo para los fenomenos de agregacion de partlculas y por el desarrollo de un modelo de cadena de senal RF-RMN. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo experimentos para los sistemas de analito/partlcula magnetica de interes caracterizando la flsica de la agregacion de partlculas, incluyendo, por ejemplo, los efectos de afinidades, dimensiones relevantes y concentraciones. Tambien, pueden llevarse a cabo experimentos para caracterizar las senales de RMN (T2, T1, T2*, T2rho, T1rho y/o otras caracterlsticas de senales, tales como senales hibridas T1/T2 y pueden tambien incluir pero no se limitan a difusion, susceptibilidad, frecuencia) como funciones de posible agregacion o elimination y caracterlsticas de partlculas magneticas. Tales caracterlsticas especlficas para el fenomeno de RMS (conmutacion de resonancia magnetica) en un sistema dado pueden ser utilizadas para potenciar la sensibilidad de la deteccion y/o de otra manera mejorar el rendimiento.
El sistema de RMN puede incluir un chip con bobinas de RF y electronica micromaquinadas sobre el mismo. Por ejemplo, el chip puede ser micromaquinado en superficie, de tal manera que las estructuras son construidas sobre la parte superior de un sustrato. Cuando las estructuras se construyen sobre la parte superior de un sustrato y no dentro de el, las propiedades del sustrato no son tan importantes como el micromaquinado en volumen, y los gofres de silicios costosos utilizados en el micromaquinado en volumen pueden ser reemplazados por materiales menos costosos tales como vidrio o plastico. Realizaciones alternativas, sin embargo, pueden incluir chips que son micromaquinados en volumen. El micromaquinado en superficie generalmente comienza con un gofre u otro sustrato y crecen en capas en la parte superior. Estas capas son grabadas selectivamente por fotolitografla y un grabado en humedo que involucra un acido o un grabado en seco que involucra un gas ionizado, o plasma. El grabado en seco puede combinar grabado qulmico con grabado flsico, o bombardeo con iones del material. El micromaquinado en superficie puede involucrar tantas capas como sean necesarias.
En algunos casos la bobina de RF no costosa puede ser integrada en un cartucho desechable y puede ser un componente desechable. La bobina podrla ser colocada de manera tal que permita un contacto electrico con los circuitos sobre la configuracion del rMn fijado o el acoplamiento podrla hacerse inductivamente a un circuito.
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Cuando la medicion de relajacion T2, la exactitud y repetibilidad (precision) seran una funcion de la estabilidad de la temperatura de la muestra segun sea relevante para la calibracion, estabilidad del ensayo, la relacion senal a ruido (S/N), la secuencia de pulsos para reenfoque (por ejemplo, CPMG, BIRD, Tango y similares), as! como factores de procesamiento de senal, tales como acondicionamiento de senales (por ejemplo, amplification, rectification y/o digitalization de las senales de eco), transformation del dominio tiempo/frecuencia, y algoritmos de procesamiento de senal utilizados. La relacion senal a ruido es una funcion del campo magnetico polarizado (Bb), volumen de muestra, factor de llenado, geometrla de la bobina, factor Q de la bobina, ancho de banda de la electronica, ruido del amplificador y temperatura.
Con el fin de entender la precision requerida para la medicion T2, se debe observar una curva de respuesta del ensayo que este a la mano y correlacionar la precision deseada para determinar la concentration de analito y la precision del por ejemplo T2 medible para algunos casos. Luego puede formarse una prediction de error apropiada.
Por ejemplo, pretender una mejora de 10 veces en el llmite de detection de 0.02 ng/mL para troponina (incremento de 10 veces en la sensibilidad) seria necesario discernir un delta-T2 menor de aproximadamente 5.6 milisegundo frente a un T2 tradicional (medido sin MRS) de aproximadamente 100 milisegundos. La relacion senala ruido mlnimo (S/N) necesitarla ser de alrededor 20 para detectar esta diferencia.
Las unidades de RMN para uso en los metodos de la invention pueden ser las descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 7,564,245.
Las unidades de RMN pueden incluir una cabeza de sonda pequena para uso en un relaxometro de resonancia magnetica portatil como se describe en la Publication PCT No. WO09/06148.
Los sistemas pueden ser implantables o parcialmente implantables en un sujeto. Por ejemplo, las unidades de RMN de la invencion pueden incluir bobinas de radiofrecuencia implantables y opcionalmente magnetos implantables como se describe en las Publicaciones PCT Nos. WO09/085214 y WO08/057578.
Los sistemas pueden incluir un contenedor de muestras polimerico para reducir, parcial o completamente, la contribution de la senal de RMN asociada con el contenedor de muestra al parametro de resonancia magnetica nuclear de la muestra llquida como se describe en la Publicacion PCT No. WO09/045354.
Los sistemas pueden incluir un portador de muestras desechable para uso con el lector MR que esta configurado para permitir un numero predeterminado de mediciones (esto es, esta disenado para un numero limitado de usos). El portador de muestras desechables puede incluir ninguno, parte, o todos los elementos de la bobina de deteccion de RF (esto es, tal que el lector de MR carezca de una bobina de deteccion). Por ejemplo, el portador de muestras desechable puede incluir una bobina “lelda” para la deteccion RF que esta acoplada inductivamente una bobina “de levantamiento” presente en el lector MR. Cuando el contenedor de muestra esta dentro del lector MR esta en proximidad cercana con la bobina de levantamiento y puede ser utilizado para medir la senal de RMN. Alternativamente, el portador de muestra desechable incluye una bobina de RF para la deteccion de RF que esta conectada electricamente al lector MR por insertion del contenedor de muestra. Asl, cuando el contenedor de muestra esta insertado en el lector MR se establece la conexion electrica apropiada para permitir la deteccion. El numero de usos disponibles para cada portador de muestras desechable puede ser controlado deshabilitando un fusible de enlace incluido bien sea en el circuito electrico dentro del portador de muestras desechable, o entre el portador de muestras desechable y el lector MR. Despues de que el portador de muestras desechable se utiliza para detectar una relajacion por MRN en una muestra, el instrumento puede configurarse para aplicar corriente en exceso al fusible de conexion, haciendo que el fusible se rompa y haga la bobina inoperable. Opcionalmente, pueden utilizarse multiples fusibles de conexion, trabajando en paralelo, cada uno conectando a un levantamiento en el sistema, y cada uno rompiendose individualmente en cada uso hasta que todos esten rotos y el portador de muestras desechables se haga inoperable.
Unidades de cartucho
Los sistemas para llevar a cabo los metodos de la invencion pueden incluir una o mas unidades de cartucho para proveer un metodo conveniente para colocar todos los reactivos de ensayo y consumibles en el sistema. Por ejemplo, el sistema puede ser personalizado para llevar a cabo una funcion especlfica, o adaptado para llevar a cabo mas de una funcion, por ejemplo, a traves de unidades de cartucho cambiables que contienen arreglos de micropozos con partlculas magneticas personalizadas contenidas en los mismos. El sistema puede incluir un cartucho reemplazable y/o intercambiable que contiene un arreglo de pozos precargados con partlculas magneticas y disenados para la deteccion y/o medicion de concentracion de un analito particular. Alternativamente, el sistema puede ser utilizable con diferentes cartuchos, disenado cada uno para la deteccion y/o mediciones de concentracion de diferentes analitos, o configurado con modulos de cartucho separados para reactivos y deteccion para un ensayo dado. El cartucho puede ser dimensionado para facilitar la insercion en y la eyeccion desde un alojamiento para la preparation de una muestra llquida la cual es transferida a otras unidades en el sistema (esto es, una unidad de
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aglomeracion asistida magnetica, o una unidad RMN). La unidad de cartucho misma podrla hacer interfaz potencialmente de manera directa con las estaciones de manipulacion as! como con los lectores MR. La unidad de cartucho puede ser un cartucho modular que tiene un modulo de entrada que puede ser esterilizado independiente del modulo de reactivos.
Para manipular las muestras biologicas, tales como muestras de sangre, hay numerosos requerimientos competentes para el diseno del cartucho, incluyendo la necesidad de esterilizar el modulo de entrada para evitar contaminacion cruzada y resultados de prueba de falsos positivos, y la necesidad de incluir reactivos en el paquete que no puede ser esterilizados facilmente utilizando tecnicas de esterilizacion terminales estandar como la irradiacion. Un modulo de entrada para separar allcuotas de muestras puede disenarse para hacer interfaz con tubos vacutainer sin tapa, y para tomar en dos allcuotas un volumen de muestra que puede ser utilizado para llevar a cabo, por ejemplo, un ensayo de Candida (vease figura 7D-7F). El vacutainer permite un llenado parcial o completo. El modulo de entrada tiene dos partes plasticas duras, que se sueldan por ultrasonido entre si y lamina sellada para formar una red de canales para permitir un camino de flujo para formar en el primer pozo sobreflujo hacia el segundo pozo de muestra. Se utiliza una parte de sellamiento de vacutainer suave para un sello con el vacutainer, e incluye un cuerpo de flujo de muestra, y un puerto de ventilacion. Para superar la resistencia del flujo una vez que el vacutainer esta cargado e invertido, se necesita alguna presion hidrostatica. Cada vez que una muestra es retirada del pozo de muestra, el pozo sera rellenado por flujo desde el vacutainer.
Un cartucho modular puede proveer un medio simple para controlar la contaminacion cruzada durante ciertos ensayos, incluyendo pero no limitandose a la distribucion de productos PCR en allcuotas de deteccion multiples. Ademas, un cartucho modular puede ser compatible con dispensacion de fluido automatizada y provee una manera de contener reactivos en muy pequenos volumenes para largos perlodos de tiempo (mas alla de un ano). Finalmente, la predispensacion de estos reactivos permite fijar la concentracion y exactitud volumetrica mediante el proceso de manufactura y provee en un punto de cuidado el uso del instrumento que es mas conveniente puesto que puede requerir el uso de pipeta mucho menos preciso.
El cartucho modular divulgado aqul es un cartucho que separado en modulos que puede ser empacados y si es necesario esterilizados separadamente. Tambien pueden ser manejados y almacenados separadamente, as! por ejemplo el modulo de reactivo requiere refrigeracion pero el modulo de deteccion no. La figura 6 muestra un cartucho representativo con un modulo de entrada, un modulo reactivo y un modulo de deteccion que se cierran entre si. En esta realizacion, el modulo de entrada serla empacado separadamente en un paquete esteril y los modulos de reactivo y deteccion serian preensamblados y empacados juntos.
Durante el almacenamiento, el modulo de reactivo podrla ser almacenado en refrigerador mientras que el modulo de entrada podrla ser almacenado en almacenamiento seco. Esto provee la ventaja adicional de que solamente una cantidad muy pequena de espacio en refrigerador o congelador se requiere para almacenar muchos ensayos. En el momento del uso, el operador retirara un modulo de deteccion y abrira el paquete, utilizando potencialmente tecnicas esteriles para prevenir la contaminacion con flora de la piel si se requiere para el ensayo. El tubo vacutainer es destapado entonces y el modulo de entrada invertido es colocado sobre el tubo como se muestra en la figura 7A. Este modulo ha sido disenado para ser facilmente moldeable utilizando herramientas sencillas como se muestra en las figuras 7B y 7C y el tope y el fondo del cartucho son sellados con lamina para prevenir la contaminacion y tambien para cerrar los canales. Una vez que el tubo ha sido resellado utilizando el modulo de entrada, el ensamblaje es girado hacia arriba y cerrado sobre el resto del cartucho. La seccion de entrada incluye un pozo con un sobreflujo que permite usar tubos de muestra con entre 2 y 6 ml de sangre y todavla provee una interfaz profunda constante a la automatizacion del sistema. Se logra esto mediante el sobreflujo mostrado en la figura 8, donde la sangre que fluye por encima del pozo de muestra simplemente cae en el cuerpo del cartucho, evitando la contaminacion.
Las figuras 9A-9C muestran el medio de almacenar con precision reactivos de volumenes pipeteados pequenos. Los reactivos se mantienen en puntas de pipeta que se muestran en la figura 9C. Estas se llenan por automatizacion de manufactura y luego son colocadas en el cartucho para sellar sus puntas en los pozos de ajuste apretado que se muestran en una vista en corte en la figura 9B. Finalmente, se colocan sellos de lamina sobre la parte posterior de las puntas para proveer un sello completo a prueba de vapor de agua. Tambien es posible sellar el modulo completo con un sello que sera retirado por el operador, bien en lugar de o ademas de las laminas antes mencionadas. Este modulo tambien provee almacenamiento para recipientes de reaccion y puntas de pipetas vaclos para uso con el instrumento mientras que el modulo de deteccion provee almacenamiento para viales de PCR tapados de 200 pl utilizados por el instrumento para hacer mediciones finales a partir de los mismos.
Las figuras 10-13C muestran una realizacion alternativa del modulo de deteccion del cartucho el cual esta disenado para proveer control de contaminacion, por ejemplo, durante el pipeteo de productos post-PCR (reaccion en cadena de polimerasa). Esto se requiere porque la amplificacion de billones de veces por PCR representa un gran riesgo de contaminacion cruzada y falsos positivos. Sin embargo, es deseable ser capaz de tomar allcuotas de esta mezcla con seguridad, puesto que los analitos de frecuencia baja habran sido amplificados y habran sido distribuidos para deteccion o identification separadas. Hay tres maneras en las cuales esta portion de cartucho ayuda en el control
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de contamination durante la operation de toma de allcuotas.
Primero, el cartucho contiene un pozo en concavidad para llevar a cabo las operaciones de transferencia como se muestra en las figuras 10A y 10B. En segundo lugar, la maquina provee flujo de aire a traves de este pozo y hacia abajo dentro del cartucho a traves de orificios en el fondo del pozo, como se muestra en la figura 11. La profundidad del pozo es tal que una punta de pipeta permanecera en el flujo de aire y evitara que escape cualquiera aerosol. La figura 12 representa una vista inferior del modulo de detection, mostrando el fondo de los tubos de detection y los dos orificios utilizados para asegurar el aire de flujo. Puede insertarse un filtro opcional aqul para capturar cualquier aerosol llquido y evitar que entre a la maquina. Este filtro tambien podrla ser una lamina de un material hidrofobo tal como Gore-tex que permitira que el aire pero no los llquidos escapen. Finalmente, hay una tapa de sello especial sobre cada tubo de 200 ul para proveer un sello rompible para cada punta de pipeta a medida que entra al recipiente, como se muestra en las figuras 13A-13. Se contempla la punta de pipeta utilizada para tomar allcuotas es almacenada en este pozo del todo, haciendo as! posible que la punta nunca deje la region de flujo de aire controlado.
Alternativamente, el cartucho modular esta disenado para un ensayo multiplex. El reto en los ensayos multiplex es combinar ensayos multiples que tengan requerimientos de ensayo incompatibles (esto es, diferentes tiempos y/o temperaturas de incubation) en un cartucho. El formato de cartucho representado en las figuras 14A-14C permite la combination de diferentes ensayos con requerimientos de ensayo dramaticamente diferentes. El cartucho presenta dos componentes principales: (i) un modulo de reactivo (esto es, la portion de tira de reactivo) que contiene todos los reactivos individuales para el panel de ensayo completo, y (ii) el modulo de deteccion. El modulo de deteccion contiene solamente las partes del cartucho que transportan a traves de la incubacion, y puede portar ensayos sencillos o varios ensayos, segun se requiera. El modulo de deteccion representado en la figura 14B incluye dos camaras de deteccion para un ensayo sencillo, la primera camara de deteccion como control y la segunda camara de deteccion para la muestra. El formato de cartucho es expandible puesto que pueden agregarse ensayos adicionales incluyendo reactivos y un modulo de deteccion adicional.
La operacion del modulo comienza con la insertion por parte del usuario del cartucho entero o una porcion del mismo en el instrumento. El instrumento lleva a cabo el accionamiento del ensayo, tomando allcuotas de los ensayos en las camaras de deteccion separadas. Estas camaras de deteccion individuales son desconectadas entonces de la banda de reactivos y una de otra, y avanzan a traves del sistema separadamente. Puesto que el modulo de reactivos es separado y descartado, la unidad de muestra mas pequena posible viaja a traves del instrumento, conservando el espacio del instrumento interno. Viviendo cada ensayo en su propia unidad, son posibles diferentes tiempos y temperaturas de incubacion a medida que cada ensayo multiplex esta retirado flsicamente de los otros y cada muestra es manipulada individualmente.
Estas unidades de cartucho descritas aqul pueden incluir una o mas poblaciones de partlculas magneticas, bien sea como una suspension llquida o partlculas magneticas secas que son reconstituidas antes del uso. Por ejemplo, las unidades de cartucho pueden incluir un compartimiento que incluye desde 1x106 a 1x1013 partlculas magneticas (por ejemplo, desde 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011, 1x1010 a 1x1012, 1x1011 a 1x1013, o desde 1x107 a 5x108 partlculas magneticas) para probar una muestra llquida sencilla.
Unidades MAA
Los sistemas para llevar a cabo los metodos de la invention pueden incluir una o mas unidades de aglomeracion asistida magneticas (MAA) para acelerar la aglomeracion de las partlculas magneticas, permitiendo que las reacciones del ensayo alcancen su termination (esto es, una lectura estable) mas rapidamente. Los metodos de la invencion utilizan partlculas magneticas funcionalizadas para interactuar con analitos o agentes de enlazamiento multivalentes (con multiples sitios de enlace). La aglomeracion de las partlculas magneticas altera la rata de relajacion rotation-rotation de la muestra cuando se exponen a un campo magnetico con un cambio subsecuente en el tiempo de relajacion T2.
Por ejemplo, puede utilizarse un gradiente de campo para barrer partlculas magneticas (MPs) a traves de la muestra llquida, permitiendo que las partlculas magneticas se unan a un anticuerpo especlfico (partlculas magneticas recubiertas con analito) o a un analito (partlculas magneticas recubiertas con anticuerpos), y luego concentrar las partlculas magneticas en una porcion de la camara de reaction de tal manera que se faciliten las interacciones partlcula-partlcula que llevan a aglomeracion inducida especlfica, ligando/analito. Las partlculas magneticas pueden dejarse difundir opcionalmente en la ausencia de un campo magnetico, por sonicacion, vortex, agitation o por sometimiento a mezcla por ultrasonido para separar las interacciones de partlculas magneticas no especlficas y redistribuir las partlculas magneticas de regreso hacia la muestra llquida. El proceso puede ser repetido para promover aglomeracion especlfica adicional. Esta ciclizacion de partlculas magneticas entre estar dispersadas en la muestra llquida y luego concentradas en el lado o fondo del recipiente de reaccion puede repetirse tantas veces como sea necesario para maximizar la aglomeracion especlfica, y consecuentemente maximizar la senal de ensayo. El estado de aglomeracion de las partlculas magneticas puede determinarse utilizando una medicion de relajacion por RMN.
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El metodo MAA de la invencion puede emplear un campo magnetico gradiente con el fin de promover interacciones magneticas particula-particula rapidas. En un ejemplo, se agregan particulas magneticas recubiertas de analito una solucion con un ligando especifico multimerico-analito y se colocan en un campo magnetico gradiente. El campo magnetico hace que las particulas se concentren en el lado o parte inferior de un recipiente en reaccion (fuerza de campo magnetico mas alta) dando como resultado una interaccion particula-particula potenciada y la subsecuente agregacion. La agregacion se mide observando un cambio, por ejemplo, en la senal T2. Pueden observarse mejoras de 10 a 1000 por ciento en el cambio de senal (por ejemplo desde l0 a 30%, desde 20% a 50%, desde 40% a 80%, desde 50% a 200%, desde 100% a 500%, o desde 500% a 1000% en el cambio de senales).
La MAA homogenea tradicional tiene la ventaja de las fuerzas dipolo-dipolo para ayudar en las interacciones particula-particula mientras que las dipolo de particulas estan alineadas con el campo magnetico de la unidad hMAA a traves de la muestra liquida. En contraste, el MAA en gradiente concentra rapidamente las particulas magneticas a un locus, facilitando por lo tanto grandemente las interacciones particula-particula.
La metodologia MAA de ciclizacion descrita aqui puede acelerar la cinetica de la aglomeracion particula magnetica- analito (i) reduciendo la entropia espacial de la etapa de interaccion de enlazamiento manteniendo la concentracion local de las particulas magneticas, (ii) introduciendo mezcla localizada por transporte mediado por magneto de la pella de posicion a posicion, (iii) reduciendo la ruptura de los aglomerados enlazados especificos reduciendo la necesidad de metodos de dispersion mas energeticos tales como vortex y/o (iv) cambiando la direccion del campo magnetico, produciendo por lo tanto una dispersion y reagregacion local de particulas magneticamente aglomeradas a medida que realinean sus dipolos con la nueva direccion de campo magnetico, y permitiendo que las particulas magneticas dispersadas localmente formen interacciones de enlazamiento especificas que involucren el analito diana.
En un ejemplo, los ensambles de magneto que producen un gradiente de campo magnetico se colocan en dos posiciones con respecto al tubo de ensayo, una en el lado del tubo y otra en el fondo del tubo (configuracion lado- fondo). Alternativamente, la posicion del segundo magneto puede ser localizada en un lado diferente del tubo (configuracion lado-lado). El tubo es movido entonces para asegurar exposition a un magneto seguida por exposition al otro magneto (vease figura 15). Se ha observado que esto tambien produce una potenciacion similar en la aglomeracion.
Una metodologia alternativa es hacer rotar la muestra liquida en un campo magnetico gradiente (o hacer rotar el gradiente de campo magnetico alrededor de la muestra) para efectuar simultaneamente una reorientation de particulas dentro de la pella (con respecto al resto de la muestra liquida) y para barrer la pella a traves de la muestra Kquida. La rata de rotation puede ser lenta para impedir que la pella de particulas magneticas permanezca largamente sostenida en proximidad del magneto de gradiente (en vez de moverse en concierto con el solvente y los analitos en la muestra liquida. Por ejemplo, la rotacion es tipicamente mas lenta que 0.0333 Hz (e.g., desde 0.000833 Hz a 0.0333 Hz, desde 0.00166 Hz a 0.0333 Hz, o desde 0.00333 Hz a 0.0333 Hz), de tal manera que las particulas se retienen adyacentes a la fuente de campo magnetico, mientras que el contenido restante en el tubo rota.
Puede utilizarse un magneto de gradiente sencillo, en donde la muestra puede ser movida alrededor del magneto (o utilizar la misma localization cercana al magneto y alternar con una posicion retirada del campo del magneto sencillo. El magneto podria ser movido a la proximidad o alejado de la muestra.
La muestra puede ser colocada dentro de magnetos de la misma orientation de campo para un efecto de “promediacion de campo” en forma alternante, con el fin de simplificar la fabrication del sistema de gMAA (esto es, eliminar la necesidad de magnetos seleccionados cuidadosamente que generen los mismos perfiles de campo). Por ejemplo una pluralidad de tales magnetos podria ser colocada en una configuracion circular, y las muestras hacerse rotar a traves de una configuracion de carrusel, desde el primer magneto hasta una nula (exposicion de campo magnetica pequena) al segundo magneto etc. El dispositivo gMAA rotatorio puede incluir una placa de base fija a la cual se une un motor electrico, con un cierto numero de magnetos montados alrededor del mismo en un patron circular. Los magnetos estan espaciados de tal manera que hay una interferencia magnetica minima entre las posiciones. Un carrusel capaz de mantener los viales de muestra es unido al arbol del motor de tal manera que rota con el motor, exponiendo las muestras a diferentes orientaciones de campo magnetico de una posicion a la siguiente. Cualquier combination de magnetos orientados al lado, magnetos orientados al fondo y posiciones con muy poco campo residual (nulo) pueden ser usadas. Vease la figura 56 A.
En otro ejemplo, se utiliza un campo homogeneo para acelerar la aglomeracion de particulas magneticas en un ensayo de la invencion. Hemos observado que el hMAA no es efectivo debido a la exposicion a los gradientes de campo en terminos de particulas que se concentran y el barrido de laminas a traves de la muestra, para escalas de tiempo relevantes para las aplicaciones. Sin embargo el hMAA tiene ventajas sobre el metodo de aglomeracion asistida por gradiente de campo. Utilizando hMAA las particulas magneticas no son forzadas a moverse a traves de una localizacion especifica en el tubo (vease figura 16), minimizando el atrapamiento no especifico de particulas dentro de fragmentos de aglomeracion especifico. La agitation despues de hMAA parece minimizar el enlazamiento
no especlfico. El tratamiento con hMAA parece potenciar la aglomeracion inducida por analito incrementando la frecuencia de colision (es un posible resultado de disminuir las entroplas de posicion de partlcula y rotacional debido a la localizacion en un estado ordenado). Las partlculas magneticas pueden ser sometidas subsecuentemente a sonicacion, vortex, agitacion (esto es, adiciones de energla) para interrumpir cualquier interaccion de partlculas no 5 especlficas y redistribuir las partlculas de regreso a la muestra. Una mezcla o agitacion suave adicional durante este proceso incremental potencialmente de manera adicional los eventos de enlazamiento especlficos del analito potenciando la senal de ensayo general. El estado de aglomeracion/aglomerado de las partlculas magneticas puede ser determinado monitorizando cambios en una rata de relajacion por RMN. Tambien es posible hacer rotar la muestra llquida dentro de un campo magnetico homogeneo (o hacer rotar un campo magnetico homogeneo 10 alrededor de la muestra) para acelerar la agregacion de partlculas magneticas en una muestra llquida.
Hemos observado que tiempos mas largos de MAA llevan a cambios incrementados en T2, presumiblemente a partir de una fraccion incrementada de partlculas aglomeradas. Hemos encontrado que la separacion magnetica y resuspension ciclizada llevan a cambios incrementados en T2 e incrementos en la aglomeracion. Todas estas observaciones apuntan hacia un sistema que debe ser llevado a un estado de equilibrio o terminacion (por ejemplo, 15 aglomerado al maximo).
Los sistemas divulgados aqul pueden incluir una o mas unidades MAA. Por ejemplo, la unidad MAA puede ser uno o mas magnetos configurados para aplicar un campo magnetico gradiente en una primera direccion con respecto a la muestra llquida, y, despues de reposicionar la camara de muestras, aplicar un campo magnetico gradiente en una segunda direccion con respecto a la muestra llquida (vease figura 17). Alternativamente, la unidad MAA puede ser 20 un arreglo de magnetos configurado para aplicar un campo magnetico gradiente, por ejemplo, al lado de una muestra llquida, y, despues de reposicionar la camara de muestra, a, por ejemplo el fondo de la muestra llquida (veanse figuras 18A-18C). Los sistemas divulgados aqul pueden incluir una unidad MAA configurada para aplicar un campo magnetico homogeneo una o mas muestras llquidas (veanse figuras 19A y 19B).
Unidades de agitacion
25 Los sistemas para llevar a cabo los metodos de la invencion pueden incluir una o mas unidades de agitacion para interrumpir interacciones de partlculas magneticas no especlficas y redistribuir las partlculas magneticas de regreso a la muestra llquida, o para simplemente agitar el tubo de muestras para mezclar completamente los reactivos del ensayo. Por ejemplo, las unidades de agitacion pueden incluir una estacion de sonicacion, vortex, agitacion o ultrasonido para mezclar una o mas mezclas llquidas. La mezcla puede lograrse por dispensacion por aspiracion u 30 otro movimiento de fluido (por ejemplo, flujo dentro de un canal). Tambien, la mezcla puede ser provista mediante una pipeta vibradora o una pipeta que se mueve a lado y lado dentro del tubo de muestra.
0320 La union de agitacion puede ser un vortex o un vortex compacto cada uno de los cuales puede ser disenado para proveer un movimiento estable a la mezcla de muestra deseada.
El vortex incluye los siguientes componentes: (i) un soporte de muestra, (ii) una placa principal, (iii) cuatro 35 conexiones, (iv) un riel lineal y un sistema de transporte (x2), (v) un soporte para eje y rieles, (vi) acoplamiento y eje,
(vii) una placa de montaje, y (viii) un motor de impulso (vease figura 20).
El vortex compacto incluye los siguientes componentes: (i) un soporte de muestra, (ii) una placa principal, (iii) dos conexiones, (iv) riel lineal y sistema de transporte (x1), (v) un soporte para riel lineal, (vi) soporte para eje, (vii)
acoplamiento y eje, (viii) una placa de montaje y (ix) un motor de impulso (vease figura 21).
40 El principio basico de movimiento para un vortex es como sigue: el eje que incluye un eje coaxial al arbol del motor y uno segundo que esta desplazado y paralelo al eje del motor. Cuando el arbol del motor esta unido al eje (tlpicamente a traves de un acoplamiento helicoidal) y se hacen rotar, el eje desplazado del eje es impulsado en un camino orbital. El desplazamiento tlpico es 1/4 de pulgada para producir un vortex en un tubo de muestra sencillo de 0.2 mL pero esto puede modificarse facilmente para mezclar efectivamente diferentes volumenes de muestra en 45 otras geometrlas de tubo.
Alternativamente, el vortex puede ser de tipo que utiliza un impulso por cinta planetaria (veanse figuras 23A-23C). La figura 23A es una vista global que muestra el vortex configurado para un tubo grande. La figura 23B es una vista en seccion que muestra dos soportes para tubo para tubos pequenos. La figura 23C es una vista global de un vortex que muestra tubos y una vista cercana de un mecanismo de impulso por cinta planetaria.
50 El motor de impulso es tlpicamente un motor servo o por etapas con un codificador. Estos motores tienen una marca “Indice” que permite que el motor encuentre un punto especlfico en su rotacion. Estas marcas de Indice se utilizan para hacer regresar el sistema a su punto de partida, y asegurar que las muestras pueden ser regresadas una posicion conocida despues de la mezcla. Conociendo la posicion exacta de la muestra en la estacion vortex se permite que estos vortex tengan acceso facil por parte de accionadores roboticos y as! ser integrados en un sistema
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automatizado. En lugar de marcas de Indice, podrlan emplearse dispositivos externos de deteccion (vease figura 22A). Estos podrlan ser sensores mecanicos, magneticos, opticos o de otra clase que sean capaces de resolver la posicion de la muestra en cualquier punto a lo largo de la ruta del sistema o en una posicion “inicial” fija. Con el fin de tener acceso a vortex o centrifugas a traves de un soporte/posicionado de muestra robotico, el sistema puede incluir una marca de indice o un conmutador externo para “hacer regresar a su punto inicial” el sistema una posicion fijada despues del recorrido, utilizando un sensor que hace seguimiento al movimiento de la muestra en todo momento, de tal manera que cuando el sistema se detiene el robot sabe la posicion, y utilizando un metodo de “busqueda” que incluye encontrar una muestra despues del recorrido emplearia un sistema de division que sigue la muestra. El mecanismo de guia esta representado en la figura 22B. La placa principal esta conectada al eje desplazado del arbol y esta libre para rotar. La placa sigue la ruta orbital alrededor tal como es dictada por el arbol del motor. Un extremo de una conexion esta conectada a la placa principal, y esta libre para rotar. Por lo tanto de esta manera, la conexion conectada es conectada entonces a la rotacion orbital del arbol. El otro extremo de la conexion esta conectado a un carro del sistema de riel lineal y es libre de rotar. Asi este extremo de la conexion sigue la ruta lineal del riel. Teniendo dos conexiones conectadas tanto al carro y a la placa principal se evita de esta manera que la placa principal rote alrededor de su propio centro. En el vortex, se utilizan dos conexiones en dos lados de la placa principal (4 en total) para balancear y estabilizar el sistema completo.
Dos vortex difieren porque sus requerimientos de uso y diseno. La version compacta esta disenada para ocupar menos espacio y requiere menos durabilidad que esta version porque se trabaja una velocidad menor, limitada por su motor mas pequeno. Por estas razones se utilizan solamente dos conexiones para conectar a un sistema de riel lineal sencillo en el vortex compacto. Esta version necesita ser capaz de velocidades mas altas, y de una utilizacion casi continua debido a la capacidad grande de rendimiento de este sistema. Por estas razones se agrega un segundo carro y conjunto de conexiones para balancear el sistema e incrementar su durabilidad.
Sistemas
Los sistemas para llevar a cabo los metodos de la invencion pueden incluir una o mas unidades RMN, unidades MAA, unidades de cartucho y unidades de agitacion. Tales sistemas pueden incluir adicionalmente otros componentes para llevar a cabo un ensayo automatizado de la invencion, tal como una unidad PCR para la deteccion de oligonucleotidos; una centrifuga, un brazo robotico para suministrar una muestra liquida de unidad a unidad dentro del sistema; una o mas unidades de incubacion; una unidad de transferencia de fluidos (esto es, dispositivos de pipetas) para combinar reactivos de ensayo de una muestra biologica para formar la muestra liquida; un ordenador con un procesador programable para almacenar datos, procesamiento de datos, y para controlar la activacion y desactivacion de las diversas unidades de acuerdo con uno o mas protocolos prefijados; y un sistema de insertion de cartucho para suministrar cartucho prellenados al sistema, opcionalmente con instrucciones al ordenador para identificar los reactivos y el protocolo que se va a utilizar en conjuncion con el cartucho. Vease figura 42.
Los sistemas divulgados aqui pueden proveer un medio efectivo para un alto rendimiento y deteccion en tiempo real de analitos presentes en un ruido corporal de un sujeto. Los metodos de deteccion pueden ser utilizados en una amplia variedad de circunstancias incluyendo identification y/o cuantificacion de analitos que estan asociados con procesos biologicos, condiciones fisiologicas, trastornos o estados de trastornos especificos. Como tales, los sistemas tienen un amplio espectro de utilidad, por ejemplo, en criba de farmacos, diagnosticos de enfermedades, clasificacion filogenetica, identificacion de paternidad y forense, aparicion y recurrencia de enfermedades, respuestas individuales a tratamientos versus bases de poblacion, y monitorizacion de terapias. Los dispositivos y sistemas en materia son tambien particularmente utiles para avanzar estados preclinicos y clinicos de desarrollo de agentes terapeuticos, mejorar el cumplimiento de los pacientes, monitorizar los ADR asociados con un farmaco prescrito, desarrollar medicina individualizada, externalizar pruebas de sangre del laboratorio central al hogar o sobre una base de prescription o monitorizar agentes terapeuticos despues de una aprobacion regulatoria. Los dispositivos y sistemas pueden proveer un sistema flexible para medicina personalizada. El sistema puede ser cambiado o intercambiado junto con un protocolo o instrucciones a un procesador programable del sistema para llevar a cabo una amplia variedad de ensayos tal como se describen aqui. Los sistemas de la invencion ofrecen muchas ventajas de una instalacion de laboratorio contenida en un instrumento automatizado de mesa o de tamano mas pequeno.
Los sistemas pueden ser utilizados para probar simultaneamente analitos que estan presentes en la misma muestra liquida a lo largo de un amplio rango de concentration, y pueden ser utilizados para monitorizar la rata de cambio de concentration de un analito y/o concentracion de marcadores PD o PK a lo largo de un periodo de tiempo en un sujeto individual, utilizados para llevar a cabo analisis de tendencia sobre la concentracion, o marcadores de PD, o PK, sean concentraciones de farmacos a sus metabolitos. Por ejemplo, si la glucosa fuera el analito de interes, la concentracion de glucosa en una muestra en un momento dado asi como la rata de cambio de la concentracion de glucosa durante un periodo dado de tiempo podria ser altamente util en la prevision y prevention, por ejemplo, de eventos hipoglicemicos. Asi, los datos generados con el uso de los dispositivos y sistemas de fluidos objeto pueden ser utilizados para llevar a cabo un analisis de tendencia sobre la concentracion de un analito en un sujeto.
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Por ejemplo, un paciente puede ser provisto con una pluralidad de unidades de cartucho para ser usadas para detectar una variedad de analitos en tiempos predeterminados. Un sujeto, por ejemplo, puede utilizar diferentes unidades de cartucho en diferentes dlas de la semana. En algunas realizaciones el software en el sistema esta disenado para reconocer un identificador sobre el cartucho que instruye al ordenador del sistema para llevar a cabo un protocolo particular para ejecutar el ensayo y/o procesar los datos. Los protocolos en el sistema pueden ser actualizados a traves de una interfaz externa, tal como una conexion USB o una conexion Ethernet, o en algunas realizaciones el protocolo completo puede ser registrado en el codigo de barras unido al cartucho. El protocolo puede ser optimizado segun sea necesario anunciando al usuario con varios avisos (por ejemplo, cambiar la dilucion de la muestra, la cantidad de reactivo provisto en la muestra llquida, alterar un tiempo de incubacion o tiempo de MAA, o alterar los parametros de recoleccion de relajacion por RMN).
Puede llevarse a cabo un ensayo multiplex utilizando una variedad de disenos de sistema. Por ejemplo, un ensayo multiplex puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de las siguientes configuraciones: (i) un arreglo de deteccion con base espacial puede ser utilizado para dirigir las partlculas magneticas una region particular de un tubo (esto es, sin agregacion) e inmovilizar las partlculas en diferentes localizaciones de acuerdo con el analito particular que esta siendo detectado. Las partlculas inmovilizadas son detectadas monitorizando su efecto local sobre el efecto de relajacion en el sitio de inmovilizacion. Las partlculas pueden ser separadas espacialmente por separation gravimetrica en flujo (esto es, las partlculas grandes se depositan mas rapidamente junto con un flujo lento perpendicular a la gravedad para proveer separacion espacial con base en el tamano de partlcula con diferentes poblaciones de tamano de partlculas magneticas marcadas con diferentes dianas). Alternativamente, pueden utilizarse sondas de captura para localizar partlculas magneticas en una region particular de un tubo (esto es, sin agregacion) e inmovilizar las partlculas en diferentes localizaciones (esto es, sobre una superficie, espuma o gel funcionalizados). Opcionalmente, el arreglo fluye a traves del sistema con multiples bobinas y magnetos, siendo cada bobina un detector separado que tiene las partlculas apropiadas inmovilizadas dentro de si, y la presencia del analito detectada con cambios de senal que surgen de la aglomeracion en la presencia del analito. Opcionalmente, una vez que las partlculas estan separas espacialmente, cada analito individual en el ensayo multiplex puede ser detectado deslizando una bobina a traves de la muestra para leer las partlcula ahora espacialmente separadas. (ii) un tubo de microfluido donde la muestra es dividida flsicamente entre varias ramificaciones y una senal separada se detecta en cada ramification, configurada cada ramification para la deteccion de un analito separado en el ensayo multiplex. (iii) Un arreglo de 96 pozos (o menos o mas) donde cada pozo tiene su propia bobina y magneto, y cada pozo esta configurado para deteccion de un analito separado en el ensayo multiplex. (iv) Una aspirador o dispositivo de paso de flujo con multiples bobinas direccionables independientemente dentro de un magneto o dentro de multiples minimagnetos que puede ser utilizado para lecturas secuenciales, siendo cada lectura una reaction separada para la deteccion de un analito separado en el ensayo multiplex. (v) Un aspirador o dispositivo de paso de flujo con multiples pozos independientemente direccionables en una placa dentro de un magneto o dentro de multiples minimagnetos que pueden ser utilizados para lecturas secuenciales utilizando una bobina lateral sencilla que puede atravesar a lo largo de la placa, siendo cada lectura una reaccion separada para la deteccion de un analito separado en el ensayo multiplex. (vi) Un tubo que contiene dos compartimientos leldos simultaneamente, dando como resultado una curva de relajacion que es ajustada entonces utilizando ajuste biexponencial para producir las lecturas separadas para el arreglo multiplex. (vii) Un sistema de microfluido donde cada gotita de llquido se mueve alrededor individualmente, para producir lecturas para el arreglo multiplex. (viii) Mediciones secuenciales que utilizan separacion y resuspension magnetica requieren sondas de enlazamiento novedosas o la capacidad de encenderlas y apagarlas. Este metodo seria usado para analitos de acido nucleico en los cuales el mecanismo de encendido/apagado se basa principalmente en la temperatura de fusion (a temperaturas mas altas los bucles de horquilla se relajan, con desnaturalizacion del enlazamiento de cadena doble), y ocurrira hibridacion a diferentes temperaturas. (ix) Capilares individuales, equipados cada uno con partlculas secas dentro de ellos, permiten una multiplexion rapida de volumenes pequenos para una allcuota pequena. Las partlculas secas son separadas especialmente, y esta separacion espacial permite que el lector MR lea cada tubo capilar independientemente. (x) unidades estructurales de enlazamiento conjugadas a nanopartlculas se colocan en un gel u otro material viscoso que forma una region y una solution viscosa especifica para el analito. El gel o solution viscosa potencia la separacion espacial de mas de un analito en la muestra de partida porque despues de que la muestra se deja interactuar con el gel, el analito diana puede ser difundido facilmente a traves del gel y enlazarse especlficamente una unidad estructural conjugada sobre la nanopartlcula sostenida en el gel o solucion viscosa. La agrupacion o agregacion del analito especlfico, potenciado opcionalmente a traves de uno de los metodos de aglomeracion asistidos magneticos ya descritos, y la deteccion de agrupaciones especlficas de analitos puede llevarse a cabo utilizando un lector de RMN de localization especifica. De esta manera, un arreglo espacial de nanopartlculas puede ser disenado, por ejemplo, como un arreglo 2d. (xi) Las partlculas magneticas pueden ser sembradas y secadas en localizaciones multiples en un tubo y luego cada localizacion puede ser medida separadamente. Por ejemplo, un tipo de partlcula puede ser enlazada una superficie y una segunda partlcula suspendida en solucion, hibridando ambas al analito que va a ser detectado. Pueden formarse agrupaciones en la superficie donde ocurre la reaccion de hibridacion, siendo cada superficie detectable separadamente, (xii) Un arreglo sembrado de acidos nucleicos puede crearse dentro de un tubo de muestra, configurado cada uno para hibridar una primera portion de un arreglo de acidos nucleicos diana. Pueden disenarse partlculas magneticas con sondas para hibridar una segunda porcion del acido nucleico diana. Cada localizacion puede ser medida separadamente. Alternativamente, puede utilizarse un metodo generico o de deteccion para producir un resultado del arreglo de acidos nucleicos. (xiii) Un arreglo de partlculas magneticas para detectar un arreglo de dianas puede ser incluido en una muestra sencilla, configurado
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cada uno (por ejemplo, por tamano o propiedades de relajacion) para proveer una senal de relajacion de RMN distinta con formacion de agregados. Por ejemplo, cada una de las partlculas puede ser seleccionada para producir tiempo de relajacion T2 distintos (por ejemplo, un conjunto de partlculas cubre 10-200 ms, un segundo conjunto de 250-500, un tercer conjunto de 550-1100, y as! sucesivamente). Cada uno puede ser medido como una banda separada de ratas de relajacion. (xiv) Para la deteccion de analitos de diversos tamanos o partlculas magneticas, o agregados de diversos tamanos, una muestra sencilla con multiples analitos y partlculas magneticas puede experimentar separacion en la presencia de un campo magnetico o electrico (esto es, separacion electroforetica de partlculas magneticas recubiertas con analitos), alcanzando las partlculas magneticas y/o agregados separados el sitio de un detector en diferentes momentos, de acuerdo con lo anterior. (xv) El tubo de deteccion podrla estar separado en dos (o mas) camaras que contienen cada una diferente nanopartlcula para deteccion. El tubo podrla ser leldo utilizando el lector y a traves del ajuste de una curva exponencial multiple tal como A*exp(T2_1) + B*exp(T2_2), la respuesta de cada analito podrla ser determinada observando el tamano relativo de las constantes A y B y T2_1 y T2_2. (xvi) Campos magneticos gradientes podrlan ser acunados para formar campos estrechos. Los pulsos de cuna u otros acunamientos basados en RF con un campo especlfico pueden llevarse a cabo para pulsar y recibir senales dentro de una region especlfica. De esta forma se podrla prever una estratificacion de los pulsos de RF dentro de un cuna y las senales de resonancia magnetica especlfica podrlan ser recibidas desde la cuna especlfico. Mientras que este metodo se basa en el acunamiento del campo magnetico gradiente, la multuplexion incluirla entonces, basarse en uno de los otros metodos descritos para obtener diferentes nanopartlculas y para que los aglomerados residan en estas diferentes cunas. As! habrla dos dimensiones, una provista por cunas de campo magnetico y una segunda dimension provista por enlazamiento variable a nanopartlculas para mas de un analito. Las nanopartlculas que tienen dos senales de relajacion de RMN distintas por aglomeracion con un analito pueden ser empleadas en un ensayo multiplex. En estos metodos, la observation de que partlculas pequenas (30-200 nm) producen un descenso en T2 con partlculas de aglomeracion entre tanto grandes (>800 nm) produce un incremento con la aglomeracion. El ensayo de reaction esta disenado como una reaction competitiva, de tal manera que con la adicion de la diana cambia la senal de relajacion de equilibrio. Por ejemplo, si el tiempo de relajacion T2 es mas corto, se estan formando formaciones de aglomerados de analito con partlculas pequenas. Por otro lado, la relation T2 se hace mas larga, se estan formando aglomerados de analito con partlculas mas grande. Es probablemente util cambiar la densidad/viscosidad de la solution con aditivos tales como trehalosa o glucosa o glicerol para asegurarse de que las partlculas grandes permanezcan en solucion. Una nanopartlcula que tiene unidades estructurales de enlazamiento para un analito especlfico cuya senal T2 disminuye por aglomeracion puede ser combinada con una segunda nanopartlcula que tenga una segunda unidad estructural de enlazamiento a un segundo analito para cuya senal T2 hay incremento por aglomeracion. En el caso para el cual se sospeche que la muestra tiene ambos analitos y la reaccion de aglomeracion pueda cancelar uno con otro (la aglomeracion incrementada cancela la aglomeracion disminuida), se podrla prever un ordenamiento del analisis, esto es, la adicion de agentes de enlazamiento competitivos para detectar un enlazamiento competitivo y as! la senal T2 que estarla relacionada con la presencia/ausencia del analito de interes en la muestra. Alternativamente, si la aglomeracion incrementada cancela la aglomeracion disminuida en este formato multiplex, se podrla prever el uso de secuencia de pulso de relajacion o determinantes de relajacion diferentes para identificar la presencia/ausencia o concentration del analito en la muestra. (xvii) Medicion de la precipitation de partlculas. En este metodo, se disenan multiples tipos de partlculas disenadas para capturar diferentes secuencias diana de acido nucleico de tal manera que el tamano de partlculas sea lo suficientemente pequeno que las partlculas enlazadas con analito permanezcan suspendidas en solucion. La adicion secuencial de una secuencia “iniciadora” que es complementaria una secuencia de acidos nucleicos conjugada a un segundo conjunto de partlculas (una partlcula mas grande, que no necesariamente tiene propiedades magneticas) y contiene una secuencia complementaria a la secuencia de ADN diana capturada. Despues de la hibridacion, se formaran aglomerados si la secuencia de ADN diana esta presente, por ejemplo, las nanopartlculas magnetica conjugada con sonda se fusiona una secuencia especlfica sobre el analito diana y la otra partlcula se enlaza a otras secuencias sobre la secuencia de acidos nucleicos diana. Estos aglomerados seran lo suficientemente grandes para precipitar (esta etapa puede requerir una etapa de centrifugation). En la misma reaccion, y simultaneamente, se podrla disenar una partlcula magnetica adicional, una segunda partlcula determinada para la fusion con una segunda secuencia de acidos nucleico para el cual la formacion de los aglomerados de nanopartlcula magnetica-analito-segunda partlcula no precipita. De esta manera la adicion secuencial de partlculas puede dar como resultado una senalizacion diferencial. (xvii) Una posible tecnica de deteccion diferente incluye senales separadas en fase, las cuales podrlan partir de diferentes secuencias de pulso de bobina RF que estan optimizadas para la interaction nanopartlcula-analito conjugada. De forma optima, esto podrla lograrse con multiples bobinas en un arreglo que optimizarla la capacidad de los diferentes pulsos de RF y la deteccion de la senal de relajacion para ser mapeada y diferenciada con el fin de establecer la presencia/ausencia de mas de un analito. La multiplexion tambien puede emplear la caracterlstica unica de la reaccion de aglomeracion nanopartlcula-analito y la subsecuente deteccion de solvente agua en la muestra, la capacidad de los aglomerados para formar diversos “bolsillos” y estos aglomerados coordinados para tener porosidad variable. Por ejemplo, los enlazantes que tienen longitud o estructuras conformacionales variables pueden ser empleados para conjugar la unidad estructural de enlazamiento a la nanopartlcula magnetica. De esta manera, mas de un tipo de aglomerado formado en la presencia de un analito podrla ser disenado con la capacidad de tener diferente flujo de agua solvente, y as! diferencias en la senal de relajacion, a lo largo de la formacion del agregado de nanopartlcula-analito- nanopartlcula. De esta manera, dos o mas disenos de enlazante/unidad estructural de enlazamiento permitirlan la deteccion de mas de un analito en la misma muestra. (xviii) Los metodos de la invention pueden incluir una mezcla fluorada oleosa/acuosa para capturar partlculas en una emulsion. En este diseno se usan un conjunto de partlculas
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de captura hidrofoba y un conjunto de captura acuosa, el conjunto de partlcuias de captura hidrofoba esta disenado para enlazarse y agregarse mas rapidamente en un ambiente hidrofobo, mientras que un conjunto de partlcuias de captura acuosa esta disenado para enlazarse y agregarse en un ambiente acuoso. La introduccion de una muestra que contiene analito que tiene analitos especlficos que se enlazaran bien a las partlcuias hidrofobas o acuosa, y el mezclado subsecuente en el tubo de deteccion que tiene solventes tanto hidrofobos como acuosos, enlazamiento y aglomeracion dara como resultado una separation flsica de los analitos a la fase bien sea acuosa o hidrofoba. La senal de relajacion podrla ser detectada en fase de solution. En el caso de que los analitos y nanopartlculas disenados de esta manera se encuentren flsicamente en una emulsion creada por la mezcla de las fases hidrofoba/acuosa, las curvas de relajacion serlan distinguibles en la fase de emulsion. El tubo de deteccion puede tener un diseno capsular para potenciar la capacidad de mover la capsula a traves de un detector de RM para leer la senal. Adicionalmente, el uso adicional de una etiqueta fluorescente para leer la intensidad de la sonda puede emplearse, esto es, en el caso de dos analitos diferentes en la misma fase acuosa o hidrofoba, la adicion de una etiqueta fluorescente puede ayudar en la determination de la identidad del analito. Este metodo es adecuado en muestras para las cuales hay aislamiento o purification limitados del analito diana del otro material en la muestra porque las senales de resonancia descritas son independientes de la calidad de la muestra. Adicionalmente, la adicion de la etiqueta fluorescente puede ser agregada en concentraciones mucho mas altas que las agregadas usualmente en estudios de fluorescencia tlpicos porque estas etiquetas nunca interferiran con las mediciones de relajacion. En este metodo, las sondas de captura de oligonucleotidos que estan conjugadas a las nanopartlculas magneticas estan disenadas de tal manera que los sitios de endonucleasa de restriction estan localizados dentro de la section fusionada. Despues de la hibridacion los aglomerados de nanopartlculas-analito que forman la muestra, una medicion de relajacion provee una senal de base. La introduccion de una endonucleasa de restriccion especlfica en el tubo de deteccion de la incubation dara como resultado una reduction especlfica de la aglomeracion nanopartlcula/analito despues de que la digestion de restriccion haya ocurrido. Despues de una medicion de relajacion subsecuente, el patron de senal y la digestion de la enzima por la enzima de restriccion, se puede deducir la diana. (xix) En un metodo combinado, una nanopartlcula magnetica es conjugada con dos unidades estructurales de enlazamiento separadas y distintas, esto es, un oligonucleotido y un anticuerpo. Esta nanopartlcula cuando se incuba con una muestra que tiene ambos tipos de analitos en la muestra formara complejos nanopartlcula-analito, y una senal de relajacion T2 de llnea base sera detectable. La adicion subsecuente de una concentration conocida de uno de los analitos puede agregarse para reducir la aglomeracion formada por ese analito especlfico desde la muestra. Despues de la adicion del analito conocido se detecta una senal de relajacion T2 subsecuente y la presencia/ausencia del analito de la muestra puede ser conjeturada. Adicionalmente, un segundo analito puede ser agregado para competir con el analito en la muestra de los aglomerados. De nuevo, despues de la deteccion de la senal de relajacion T2 subsecuente la presencia/ausencia del segundo analito de la muestra puede ser conjeturada. Esto puede repetirse.
En general un ensayo multiplex que emplea los metodos de esta invention puede ser disenado de tal manera que el uso de una nanopartlcula no superparamagnetica para generar aglomerados con analitos de una muestra, reducira el Fe2 + global en el recipiente de deteccion del ensayo y extendera el rango dinamico de tal manera que pueden medirse reacciones multiples en el mismo recipiente de reaction.
La deteccion de acidos nucleicos multiplex puede hacer uso de calidades de hibridacion diferentes de las nanopartlculas magneticas conjugadas y el analito de acido nucleico diana. Por ejemplo, sondas de captura conjugadas a nanopartlculas magneticas pueden ser disenadas de tal manera que la fusion de la nanopartlcula magnetica a la secuencia de acidos nucleicos diana es diferente para mas de una secuencia diana de acidos nucleicos. Los factores para el diseno de estas secuencias sonda-diana diferentes incluye contenido de G-C (tiempo para formar hibrido), concentracion de sal variable, temperaturas de hibridacion, y/o combinaciones de estos factores. Este metodo conllevarla entonces que diversas nanopartlculas magneticas conjugadas con acidos nucleicos interactuen con una muestra de la que se sospecha contiene mas de un analito de acido nucleico diana. Los tiempos de relajacion detectados despues de diversos tratamientos, esto es, calentamiento, adicion de sal, tiempo de hibridacion, permitirlan tener la capacidad de conjetura con una secuencia de acidos nucleicos de que se sospecha esta presente o ausente en la muestra.
Uso de amplicones complementarios para bloquear una reaccion y permitir hibridaciones en serie. En este metodo, se utilizan cebadores de amplification universales para amplificar mas de una secuencia de acidos nucleicos especlfica en la muestra de estargina, formando una reserva de amplicon. El oligonucleotido especlfico conjugado a nanopartlculas magneticas se agrega a la muestra y se toma una medicion de relajacion. La muestra es expuesta entonces una temperatura para fundir la interaction oligonucleotido-analito y la adicion de un oligonucleotido que no esta unido una nanopartlcula magnetica se agrega para competir con cualquier analito que se enlace a la nanopartlcula magnetica. Se agrega entonces una segunda nanopartlcula magnetica que tiene un segundo oligonucleotido conjugado a ella para formar aglomerados con un segundo analito de acido nucleico diana especlfico. Alternativamente, el metodo podrla tener una etapa previa a la adicion de la segunda nanopartlcula magnetica que secuestrarla de manera efectiva la primera nanopartlcula magnetica del recipiente de reaccion, esto es, exponiendo el recipiente de reaccion a un campo magnetico para mover las partlculas a un area que no estarla disponible a la segunda, o subsecuente reaccion.
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Cada uno de los metodos de multiplexion anteriores puede emplear una etapa de congelacion de la muestra para hacer mas lenta la difusion y el tiempo de aglomeracion y alterar as! la medicion del tiempo de relajacion. La disminucion de la difusion y aglomeracion del metodo puede potenciar la capacidad de separar y detectar mas de un tiempo de relajacion. Cada uno de los metodos de multiplexion anteriores puede hacer uso de la adicion secuencial de nanopartlculas conjugadas seguida por la deteccion de relajacion despues de cada adicion. Despues de cada adicion secuencial, la llnea base de relajacion subsecuente se convierte en la nueva llnea base para la ultima adicion y puede ser utilizada para ayudar en la correlation del tiempo de relajacion con presencia/ausencia del analito o concentration del analito en la muestra.
Sondas de captura ocultas. En este metodo de multiplexion, los oligonucleotidos conjugados a las nanopartlculas magneticas estan disenados de tal manera que la estructura secundaria o una sonda secundaria sobre la superficie de la partlcula oculta o cubre la secuencia para hibridacion inicialmente en el recipiente de reaction. Estas secuencias de hibridacion ocultas son expuestas o reveladas luego en el recipiente de muestra espacial o temporalmente durante el ensayo. Por ejemplo, como se menciono mas arriba, la hibridacion puede ser afectada por sal, temperatura y tiempo para hibridar. Asl, en una forma de este metodo, pueden reducirse o relajarse estructuras secundarias o complementarias sobre la sonda de oligonucleotido conjugada a la nanopartlcula magnetica para luego exponer o revelar la secuencia para hibridar a la muestra de acido nucleico diana. Adicionalmente, podrlan reducirse o relajarse estructuras secundarias utilizando un compuesto qulmico, por ejemplo, DMSO. Otro metodo para revelar o exponer selectivamente una secuencia prehibridacion de la nanopartlcula conjugada de oligonucleotido con el analito diana es disenar estructuras de tallo-bucle que tienen un sitio para una endonucleasa de restriction; la digestion subsecuente con una endonucleasa de restriction relajarla la estructura de tallo-bucle para permitir que ocurra la hibridacion. Alternativamente, un corte qulmico de la estructura tallo-bucle, liberando un extremo podrla hacer que la secuencia quedara libre para luego hibridar a la secuencia de acido nucleico diana.
Cuando el arreglo multiplex esta configurado para detectar un acido nucleico diana, el ensayo puede incluir un PCR multiplex para generar diferentes amplicones y luego detectar en serie las diferentes reacciones.
El ensayo multiplex opcionalmente incluye un arreglo logico en el cual las dianas son fijadas por busqueda binaria para reducir el numero de ensayos requeridos (por ejemplo, gram positivos o negativos lleva a pruebas basadas en diferentes especies que solamente serlan llevada a cabo para un grupo o el otro).
Los sistemas pueden adelantar una variedad de ensayos, independientemente del analito que esta siendo detectado a partir de una muestra corporal fluida. Un protocolo dependiente de la identidad de la unidad de cartucho que esta siendo usada puede ser almacenado en el ordenador del sistema. En algunas realizaciones, la unidad de cartucho tiene un identificador (ID) que es detectado o leldo por el ordenador de sistema, o un codigo de barras (1D o 2D) sobre una tarjeta y que suministra entonces information especlfica sobre el ensayo o especlfica sobre el paciente o sujeto que necesita ser seguida o comprobada con la informacion del analisis (por ejemplo, curvas de calibration, protocolos, concentraciones o niveles previos del analito). Cuando se desea, el identificador de la unidad de cartucho se utiliza para seleccionar un protocolo almacenado en el ordenador del sistema, o para identificar la localization de diversos reactivos de ensayo en la unidad de cartucho. El protocolo que va a ser seguido en el sistema puede incluir instrucciones al controlador del sistema para llevar a cabo el protocolo, incluyendo pero no limitandose a un ensayo particular que va a ser ejecutado y a un metodo de deteccion que va a ser llevado a cabo. Una vez que el ensayo se lleva a cabo por parte del sistema, los datos indicativos de un analito en la muestra biologica son generados y comunicados a un ensamblaje de comunicaciones, en donde puede ser transmitido a el dispositivo externo para procesamiento, incluyendo sin limitation, el calculo de la concentracion del analito en la muestra, o procesado por el ordenador del sistema y el resultado presentado en una lectura de pantalla.
Por ejemplo, el identificador puede ser un identificador de codigo de barras con una serie de llneas negras y blancas, las cuales pueden ser leldas por un lector de codigo de barras (u otro tipo de detector) por insertion de la unidad de cartucho. Podrlan usarse otros identificadores, tales como una serie de valores alfanumericos, colores, protuberancias sobresalientes, RFID, o cualquier otro identificador que pueda ser localizado sobre una unidad de cartucho o detectado o leldo por el ordenador del sistema. El detector tambien puede ser un LED que emita luz que puede interactuar con un identificador que refleje la luz y es medido por el ordenador del sistema para determinar la identidad de una unidad de cartucho particular. En algunas realizaciones, el sistema incluye un dispositivo de almacenamiento o memoria con la unidad de cartucho o el detector para transmitir informacion al ordenador del sistema.
Asl, los sistemas pueden incluir un programa de operation para llevar a cabo diferentes ensayos y cartuchos codificados para: (i) reportar al programa de operacion cual ensayo preprogramado ha sido empleado; (ii) reportar al programa operador la configuration de los cartucho; (iii) informar al sistema operador el orden de etapas para llevar a cabo el ensayo; (iv) informar al sistema cual rutina preprogramada emplear; (v) introducir informacion para el usuario con respecto a ciertas variables del ensayo; (vi) registrar un numero de identification del paciente (el numero de identificacion del paciente tambien puede ser incluido en el soporte de vacutainer de la muestra de sangre); (vii) registrar cierta informacion del cartucho (esto es, numero de lote, datos de calibracion, ensayos sobre el cartucho, rango de datos anallticos, fecha de expiration, requerimientos de almacenamiento, muestras especlficas
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aceptables); o (viii) reportar al programa operador cualquier actualizacion o revision (esto es, de tal manera que se presenten nuevas versiones del ensayo sobre actualizaciones del cartucho solamente y no el sistema mas grande, mas costoso).
Los sistemas pueden incluir una o mas unidades de transferencia de fluidos configuradas para adherirse a un brazo robotico (veanse figuras 43A-43C). La unidad de transferencia de fluidos puede ser una pipeta, tal como una pipeta por desplazamiento de aire, con respaldo llquido o de jeringa. Por ejemplo, una unidad de transferencia de fluidos puede incluir un motor en comunicacion con un procesador programable del ordenador del sistema y el motor puede mover la pluralidad de cabezas con base en un protocolo desde el procesador programable. Asl, el procesador programable de un sistema puede incluir instrucciones o comandos y puede operar una unidad de transferencia de fluidos de acuerdo con instrucciones para transferir muestras llquidas bien sea por extraccion (para extraer llquido que esta dentro) o extension (o expeler llquidos) de un piston en un espacio de aire cerrado. Tanto el volumen de aire movido como la velocidad del movimiento pueden ser controlados con precision, por ejemplo, mediante el procesador programable. La mezcla de muestras (o reactivos) con diluyentes (u otros reactivos) puede ser alcanzada aspirando componentes que se van a mezclar en un tubo comun y luego aspirar repetidamente una fraccion significativa del volumen de llquidos combinado hacia arriba y hacia abajo en una punta. La disolucion de los reactivos secos en un tubo puede ser hecha de manera similar.
Un sistema puede incluir una o mas unidades de incubacion para calentar la muestra llquida y/o para controlar la temperatura del ensayo. Puede utilizarse calor en la etapa de incubacion de una reaccion de ensayo para promover la reaccion y acortar la duracion necesaria para la etapa de incubacion. Un sistema puede incluir un bloque de calentamiento configurado para recibir de una muestra llquida por un tiempo predeterminado una temperatura predeterminada. El bloque de calentamiento puede ser configurado para recibir una pluralidad de muestras.
La temperatura del sistema puede ser regulada cuidadosamente. Por ejemplo, el sistema incluye una carcasa mantenida una temperatura predeterminada (esto es, 37°C) utilizando aire controlado en temperatura con agitacion. El calor residual de cada una de las unidades excedera el que puede ser disipado de manera pasiva por simple cierre por conduccion y conveccion al aire. Para eliminar el calor residual, el sistema puede incluir dos compartimientos separados por un piso aislante. El compartimiento superior incluye aquellas porciones de los componentes necesarios para la manipulacion y medicion de las muestras llquidas, mientras que el compartimiento inferior incluye los elementos generadores de calor de las unidades individuales (por ejemplo, el motor para la centrifuga, los motores para las unidades de agitacion, la electronica para cada una de las unidades separadas, y los bloques de calentamiento para las unidades de incubacion. El piso inferior es ventilado entonces y se utiliza enfriamiento por aire forzado para retirar el calor del sistema. Veanse las figuras 44A y 44B.
La unidad de MR puede requerir una temperatura controlada con mayor precision (por ejemplo, ± 0.1°C), y asl puede incluir opcionalmente una carcasa separada en la cual se sople aire calentado una temperatura predeterminada. La carcasa puede incluir una abertura a traves de la cual se inserta y retira la muestra llquida, y hacia afuera de la cual se deja escapar el aire calentado. Veanse figuras 45A y 45B. Pueden utilizarse tambien otras metodologlas de control de temperatura.
Ejemplo 1. Preparacion de partfculas recubiertas
En resumen, se lavo 1 mg de partlculas magneticas carboxiladas sustancialmente no dispersas y se resuspendio en 100 pl de regulador de activacion, MES 10 mM. Se agregaron 30 pl de aminodextrano 10 mg/ml de 10 kDa (Invitrogen) al regulador de activacion y se incubaron sobre un rotador durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para el acoplamiento de los grupos carboxilo a aminas en el dextrano, se agregaron 30 pl de 1-Polietil-3-[3- dimpolietilaminopropiljcarbodiimida Clorhidrato (EDC) 10 mg/ml y se incubo en rotacion durante 2 horas a temperatura ambiente. Las partlculas fueron lavadas del dextrano libre 3x en 1 ml de PBS utilizando separacion magnetica, luego resuspendidas en 1 ml de PBS. Se utilizaron 100 pl de una solucion 100 mM de sulfo-NHS-biotina (invitrogen) para decorar los grupos amino sobre la superficie del dextrano con biotina. Despues de 30 minutos de incubacion, las partlculas fueron lavadas 3x en 1 ml de regulador de activacion. A continuacion, se introdujo un bloque de protelna de 100 pl de 0.5 mg/ml de albumina de suero bovino (BSA) (Sigma) y se introdujeron 30 pl de EDC 10 mg/ml y se incubo durante la noche (Sigma). Las partlculas preparadas fueron lavadas 3x en 1 ml de PBS y resuspendidas hasta la concentracion deseada.
Se ha demostrado que las partlculas preparadas sintetizadas con este protocolo dan resultados similares en los ensayos de T2 para la deteccion de un analito, si las muestras incluyen un regulador o sangre lisada al 20% (vease figura 37). Las variaciones de las preparaciones en donde el aminodextrano prebiotinilado fue conjugado directamente a las partlculas en una etapa tambien han dado como resultado un rendimiento similar en los ensayos de T2 en muestras tanto de sangre como de regulador.
Ejemplo 2. Establecimiento de partfculas preparadas con y sin un bloque de protefna
En resumen, las partlcuias magneticas de aminodextrano cubiertas con biotina, preparadas de acuerdo con el metodo descrito en el ejemplo 1 fueron probadas en PBS y en muestras de sangre lisada al 20% en un ensayo de T2 de titulacion con antibiotina.
El ensayo fue llevado a cabo con el siguiente procedimiento. 50 pL de matriz, bien sea PBS o muestra de sangre 5 lisada al 20%, 50 pL de concentraciones variables de anticuerpo antibiotina, y 50 pL de un anticuerpo secundario de 1.0 pg/ml fueron agregados a un tubo de RMN de 5 mm. Se agregaron entonces 150 pL de partlculas de Fe 0.02 mM a cada tubo (esto es, 2.7x108 partlculas por tubo). Las muestras fueron entonces sometidas entonces a vortex durante 4 segundos e incubadas en un bloque de calentamiento a 37°C durante 2 minutos. Cada muestra fue sometida de nuevo a vortex durante 4 segundos, e incubada durante un minuto adicional en el bloque de 10 calentamiento a 37°C. Despues de la incubacion, cada muestra fue colocada en un Bruker Minispec durante 10 minutos, bajo un campo magnetico. Despues de 10 minutos, la muestra fue retirada del magneto, sometida a vortex durante 4 segundos, e incubada en un bloque de calentamiento a 37°C durante 5 minutos. Despues de 5 mi nutos, cada muestra fue sometida de nuevo a vortex e incubada en un bloque de calentamiento a 37°C durante 1 minuto adicional. Los valores de T2 fueron tomados utilizando el programa Bruker Minispec con los siguientes parametros:
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Ganancia: 75
Tau: 0.25
Tren de eco: 3500
Tren de eco total: 4500
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Se calcularon los valores de A T2: T2 - (T2)0. y los resultados se representan en la Figura 37.
Las partlculas sintetizadas con un bloque de protelna AXN4, dieron rendimiento igual en sangre y regulador (figura 37). La grafica representada en la figura 38 compara las partlculas preparadas con (clrculo abierto) y sin (clrculo relleno) una etapa de bloqueo de protelna. Se ha encontrado as! que el bloque de protelna puede ser necesario para
25 alcanzar similar funcionalidad en matrices de sangre.
Los bloques de protelna adicionales que incluyen pero no se limitan a gelatina de piel de pez tambien han sido exitosos. Las partlculas fueron preparadas de acuerdo con el metodo descrito mas arriba, con la excepcion de que en lugar de utilizar BSA como bloque de protelna, se sustituyo por gelatina de piel de pez (FSG). La grafica representada en la figura 39 muestra los resultados de un ensayo de T2 (como se describe mas arriba) utilizando la 30 titulacion con anticuerpos para partlculas bloqueadas con BSA y comparadas con FSG. Los datos indican que hay poca o ninguna diferencia entre los dos metodos de bloqueo de protelnas (vease figura 39). Sin embargo la BSA mostro ser un bloque mas confiable.
Ejemplo 3. Determinacion de la cantidad de recubrimiento de dextrano
Los intentos para incrementar la densidad del recubrimiento de dextrano sobre las partlculas han demostrado reducir 35 la funcionalidad de las partlculas preparadas en sangre. La preparacion de partlculas descritas en Ejemplo 1 mas arriba que demuestran un rendimiento regulador/sangre casi equivalente utilizo un 10x de exceso de base de dextrano sobre un modelo de llenado de espacio para determinar la cantidad de dextrano para incluir en los experimentos de recubrimiento. En un intento por funcionalizar las partlculas con una fidelidad mayor, el incremento del recubrimiento con dextrano a un exceso de 1000-10000x de dextrano en experimentos de recubrimiento genero 40 partlculas con un recubrimiento de dextrano mas grueso que produjo una respuesta reducida en sangre en comparacion con un regulador. Se concluye que una densidad moderada de dextrano con un bloque de protelna puede ser deseable para producir un recubrimiento de partlcula que funcione bien en ensayos de T2 en la presencia de muestras de sangre (veanse figura 40A y 40 B).
Ejemplo 4. Deteccion de un analito de molecula pequena en muestras de sangre entera
45 Materiales y metodos:
Anticuerpo monoclonal antibiotina de raton de Jackson Immuno Research Labs (200-002-211)
Antirraton de oveja Jackson Immuno Research Labs (515-005-071)
Tween 20
Albumina de suero bovino (Sigma Product #: B4287-256)
IxPBS Tabletas (Sigma P4417)
Analito de biotina PEG FITC 5 Tris HCl 100 mM en dhhO Tween® al 0.1%
EDTA sangre entera lisada 1:5 con regulador 1X Trax
Oxido de hierro superparamagnetico, partlculas recubiertas con COOH
Equipo:
10 Bruker Minispec
Sistema de vortex de velocidad variable (VWR)
Tubos para RMN de 5 mm
Bloque de calentamiento a 37°C con ranuras para tubos de RMN personalizadas
Preparacion de regulador/analito: BSA al 0.1%, Tween® al 0.1% en 1x PBS: Se preparo una solucion de Tween® 20 15 al 10% en peso. En resumen, se preparo Tween® en 1x PBS. Se prepararon 500 mL de solucion de Tween® al 0.2% en peso agregando 10 mL de Tween® al 10% a 490 mL de 1x PBS. Se preparo una solucion al 2% de BSA en solucion de 1x PBS en peso. Se preparo una solucion de BSA al 0.2% agregando 50 mL de BSA al 2% en PBS a 450 mL de 1x PBS. Las diluciones fueron combinadas para hacer un volumen final de 1 L y una concentracion de regulador final de 0.1% de BSA, 0.1% de Tween® en 1x PUBS.
20 Analito PEG-FITC-Biotina: Se prepararon 100 pl de una solucion 0.5 mM a partir de Tris HCl 1mM. Se mezclaron 40 pl de PEG FITC biotina con 40 pl de Tris HCl 0.5 mM, y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se agregaron 70 pl de PEG-FITC-Biotina en Tris HCl 0.5 mM a 630 pl de Tween® 0.1% para hacer una solucion madre de 100 pM. La solucion madre fue mezclada vigorosamente por vortex. Se agregaron 200 pl de solucion 100 pM a 900 pl de Tween® al 0.1% para hacer un analito 20,000 nM. Se prepararon 10 diluciones en 25 serie hasta 0.02 nM
Procedimiento:
Se transfirieron por pipeta 25 pl de analito apropiado y 50 pl de matriz de sangre lisada 1:5 directamente en un tubo de RMN de 5 mm. Las muestras fueron sometidas a vortex durante 4 segundos. Se agregaron 25 pl de anticuerpo antibiotina (0.18 pg/ml diluidos en Tween® 20 al 0.1%, 0.1% de BSA, 1xPBS), seguidos por una incubacion a 37°C 30 durante 15 minutos. Despues de 15 minutos, se agregaron 50 pl de anticuerpo antirraton secundario de 3.0 pg/ml (diluido en Tween al 0.1%, BSA al 0.1%, 1xPBS) y 150 pl de partlculas de Fe de 0.02 mM (2.7x108 partlculas por tubo) al tubo de RMN. La muestra fue sometida a vortex entonces durante 4 segundos e incubado durante 5 segundos a 37°C. La muestra fue colocada en un Bruker Minispec durante 10 minutos, bajo campo magnetico. Despues de 10 minutos, la muestra fue retirada del magneto e incubada durante 5 minutos adicionales. La muestra 35 fue sometida a vortex de nuevo durante 4 segundos e incubada durante 1 minuto adicional. Los valores T2 fueron tomados utilizando el programa de Bruker Minispec con los siguientes parametros:
Barridos: 1
Ganancia: 75
Tau: 0.25
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Tren de eco total: 4500
Ecos imitacion: 2
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Ejemplo 5: Sintesis de partfculas cubiertas con anticuerpos
Partlcuias magneticas recubiertas con aminodextrano preparadas como se describio en el Ejemplo 1 pueden ser funcionalizadas adicionaimente con anticuerpo a traves de un enlace SMCC-SATA (SMCC=succinimidil 4-[N- maleimidompolietil]ciclohexano-1-carboxilato; SATA = N-succinimidil-S-acetiltioacetato). Las partlculas magneticas carboxiladas son conjugadas primero con un aminodextrano de 10 kDa a traves de qulmica de EDC como se describio mas arriba. Las partlculas cubiertas con dextrano son modificadas posteriormente con un exceso de sulfo- SMCC para proveer un grupo funcional maleimida. Los anticuerpos son modificados con el enlazante SATA el cual se enlaza primariamente a las aminas en el anticuerpo. El enlace SATA es controlado para minimizar la sobrefuncionalizacion del anticuerpo la cual puede llevar a entrecruzamiento de las partlculas o afinidad reducida del anticuerpo. Despues de la desacetilacion, el enlazante SATA expone un grupo funcional tiol el cual puede ser utilizado para unirse directamente a las partlculas funcionalizadas con maleimida formando un enlace tioeter. El numero de anticuerpos conjugados a cada partlcula puede ser medido utilizando un ensayo con protelna BCA (Pierce). Los enlazantes que proveen funcionalidad similar al SATA han sido usados exitosamente, tales como SPDP (N-Succinidimil 3-[2-piridilditiol]-propionato).
Tambien pueden prepararse partlculas magneticas recubiertas con anticuerpos utilizando las qulmicas descritas mas arriba, pero con enlace covalente directo a la partlcula carboxilada base. En algunos casos, puede ser necesario agregar recubrimiento adicional a la superficie de la partlcula, tal como dextrano, o un agente bloqueador. Pueden utilizarse qulmicas similares con recubrimientos alternos al aminodextrano, tales como PEG o BSA.
Ejemplo 6. Ensayo de creatinina
En resumen, el ensayo incluye lo siguiente: Una muestra diana se incuba en la presencia de una partlcula magnetica que ha sido cubierta con creatinina, la cual esta enlazada a la superficie de las partlculas magneticas. Las partlculas magneticas cubiertas con creatinina estan disenadas para agregarse en la presencia del anticuerpo de creatinina. Cada una de las partlculas magneticas cubiertas con creatinina y el anticuerpo de creatinina se agrega a la muestra llquida que contiene creatinina, la cual compite con las partlculas magneticas por el anticuerpo de creatinina. Asl, el enlazamiento de la creatinina al anticuerpo bloquea la aglomeracion de las partlculas magneticas, y se marcan niveles bajos de creatinina por la formacion de aglomerados. Estos aglomerados alteran las ratas de relajacion rotacion-rotacion de la muestra cuando se exponen a un campo magnetico y el cambio en los tiempos de relajacion T2 (midiendo un cambio en la senal de resonancia magnetica a partir de las moleculas de agua circundante) puede correlacionarse directamente con la presencia y/o concentracion del analito en la muestra diana.
Anticuerpo de creatinina
Al establecer el programa de generacion de anticuerpo para creatinina, se diseno una molecula de creatinina modificada (COOH-creatinina) y se conjugo a transferrina para inmunizacion en ratones BALB-C y AJ.
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Se generaron treinta y cuatro clones estables que produclan anticuerpo. Estos clones surgieron bien de BALB-C (celulas de bazo) (n=17) o ratones AJ (n=17). Las dos llneas de ratones geneticamente diferentes fueron seleccionadas a partir de las diferencias geneticas conocidas en sus sistemas inmunes. Los criterios y procesos de selection fueron desarrollados para criba e identification de un anticuerpo monoclonal optimo para uso en el ensayo. El proceso de seleccion de anticuerpos incluyo criba para enlazamiento a BSA-creatinina por ELISA, afinidad/sensibilidad/especificidad en anticuerpos por ensayos competitivos por ELISA utilizando creatinina e interferentes potenciales, determination de la capacidad del anticuerpo para ser conjugado a la partlcula magnetica y funcionalidad en un ensayo de conmutacion de relajacion magnetica T2.
Usando los criterios para seleccion de anticuerpos establecidos delineados mas arriba, se identificaron siete
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anticuerpos monoclonales y seleccionaron como candidatos potenciales en el ensayo.
Partlcuias magneticas recubiertas con creatinina
Se lavaron partlculas magneticas carboxiladas sustancialmente monodispersas y se resuspendieron en 100 pl de regulador de acoplamiento (MES 50 mM, pH = 4.75). Se agrego sulfo-NHS (55 pmol en 200 pl de regulador MES) y la mezcla se sometio a vortex. A la mezcla se agrego EDC (33.5 pmol en 200 pl de regulador MES). La solucion fue sometida a vortex brevemente y colocada sobre un mezclador de extremo a extremo durante 1 hora a temperatura ambiente, se dejo depositar y se retiro el sobrenadante. A los solidos resultantes se agrego 1 ml de BSA al 1% en PBS, y de nuevo la mezcla fue sometida a vortex y colocada sobre un mezclador de extremo a extremo durante 1518 horas a temperatura ambiente. Las partlculas se dejaron depositar y se retiro el sobrenadante.
Las partlculas recubiertas con BSA fueron suspendidas en 0.5 mL de PBS-T20 al 0.01% (regulador de fosfato 10 mM, pH = 7.4, NaCl 150 mM, con Tween® 20 al 0.01%). Los grupos carboxilo sin reaccionar fueron sometidos a metil-PEG4-amina (20 pl de 10% v/v en DMSO) como agente bloqueador. La mezcla se sometio a vortex y se coloco sobre un mezclador de extremo a extremo durante 8 horas a temperatura ambiente. Las partlculas resultantes recubiertas con BSA fueron lavadas repetidamente con 0.5 mL de PBS-T20 al 0.01%.
Se combinaron COOH-creatinina (66 pmol), EDC (140 pmol), y NHS (260 pmol) con 300 pl de DMSO seco para formar una pasta, la cual se aclaro a medida que la reaccion se acercaba a su termination. Las partlculas recubiertas con BSA fueron suspendidas en 0.5 mL de PBS-T20 al 0.01% (pH = 8), seguido por la adicion de la solucion de COOH-creatinina activada. La mezcla resultante fue sometida a vortex y colocada en un mezclador de extremo a extremo durante 4 horas a temperatura ambiente. Las partlculas resultantes fueron lavadas 3x cada vez por sonicacion utilizando DMSO:PBS-T20 al 0.01% 1:15 y 1:30 (vol/vol). Las partlculas fueron lavadas entonces 3x cada vez por sonicacion utilizando PBS-T20 al 0.01%. Las partlculas fueron resuspendidas en PBS-T20 al 0.01% (pH = 8), y se agregaron 2 mg de NHSPEG 2K en 200 pl de PBS-T20 al 0.01%. La mezcla fue colocada sobre un mezclador de extremo a extremo durante 12-20 horas a temperatura ambiente. Las partlculas fueron lavadas entonces 3x cada una con sonicacion utilizando PBS-T20 al 0.01% para producir partlculas magneticas conjugadas con creatinina con BSA secuencial, recubrimiento con creatinina, cubierta con PEG y bloque.
Las partlculas recubiertas con creatinina fueron resuspendidas en regulador de ensayo (glicina 100 mM (pH=9.0), NaCl 150 mM, BSA al 1%, ProClin® al 0.05%, y Tween® al 0.05%).
El protocolo de ensayo de creatinina fue llevado a cabo utilizando partlculas conjugadas con creatinina y se genero/completo el anticuerpo de creatinina soluble con detection utilizando la senal de T2. La arquitectura del ensayo competitivo de creatinina se representa en la figura 24.
Las soluciones de partlculas magneticas, anticuerpo y muestra llquida, cuando se indica, fueron sometidas a dilution con un regulador de ensayo que incluye Tris 100 mM pH 7.0, NaCl 800 mM, BSA al 1%, Tween® al 0.1% y ProClin® al 0.05%.
Las partlculas magneticas recubiertas con creatinina fueron diluidas a Fe 0.4 mM (5.48x109 partlculas/ml) en regulador de ensayo, sometidas a vortex exhaustivamente y se dejaron equilibrar durante 24 horas a 4-8°C.
El anticuerpo monoclonal de raton anticreatinina (descrito mas arriba) fue empleado como un agente de enlazamiento multivalente a las partlculas magneticas conjugadas con creatinina. El anticuerpo fue diluido hasta una concentration de 0.8 pg/ml en regulador de ensayo y sometido a vortex exhaustivamente.
Las muestras y los calibradores fueron diluidos a 1 parte de muestra contra 3 partes de regulador de ensayo. El rango de ensayo superior es cerca de 4 mg/dL de creatinina. Para muestras con niveles de creatinina esperados de > 4 mg/dL se llevo a cabo una dilucion de muestra adicional utilizando 1 parte de muestra diluida inicial a 4 partes de regulador de ensayo.
La muestra prediluida, el regulador de ensayo, la partlcula magnetica, y las soluciones de anticuerpos fueron sometidas a vortex cada una. Se agregaron 10 pL de cada solucion a un tubo, y el tubo fue sometido a vortex durante 5 segundos.
El tubo fue sometido entonces a 12 minutos de gMAA, se incubo durante 5 minutos a 37°C, se coloco en el l ector MR (T2 MR, Reader con 2200 Fluke Temperature Controller, con software NDxlient 0.9.14.1/ hardware Version 0.4.13 Build 2, Firmware Version 0.4.13 Build 0) para medir la rata de relajacion T2 de la muestra, y la rata de relajacion T2 de la muestra fue comparada con una curva estandar (vease Figura 25A) para determinar la concentracion de creatinina en la muestra llquida.
Comportamiento de los anticuerpos de creatinina modificados
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Se probaron diferentes anticuerpos de creatinina en el ensayo para establecer el efecto del anticuerpo sobre la aglomeracion. Se observo que el comportamiento de los anticuerpos de creatinina vario en sus caracterlsticas de rendimiento cuando se combina con partlculas magneticas recubiertas con creatinina (vease figura 25B). El analisis en gel de SDS-PAGE de las dos preparaciones revelo una agregacion significativamente potenciada en la preparacion 1, la que se cree surge de un incremento en la valencia de enlazamiento de la creatinina por este anticuerpo, el cual es agregado debido a su proceso de purification. Para comparacion, se multimerizaron otros anticuerpos monoclonales de creatinina (14HO3) biotinilando el anticuerpo y multimerizando el anticuerpo en la presencia de estreptavidina. Fueron probadas entonces las formas monomerica, biotinilada monomerica y multimerizada con partlculas magneticas recubiertas con creatinina para establecer el efecto de la valencia incrementada sobre el tiempo T2. Los resultados se representan en la figura 25C, mostrando que los anticuerpos multimerizados forman aglomerados a concentraciones mucho mas bajas que los anticuerpos no multimerizados. Este potenciamiento de la valencia para la aglomeracion de partlculas tambien ha sido observado utilizando anticuerpos IgM.
Ejemplo 7. Partfcula magnetica recubierta con anticuerpo de creatinina
Utilizando una arquitectura de ensayo alternativa, el ensayo incluye lo siguiente: una muestra diana es incubada en la presencia de (i) una partlcula magnetica que ha sido cubierta con anticuerpo de creatinina; y (II) un agente de enlazamiento multivalente que incluye multiples conjugados de creatinina. Las partlculas magneticas estan disenadas para agregarse en la presencia de la unidad estructural de enlazamiento multivalente pero la agregacion es inhibida por la competition con creatinina en la muestra llquida. Asl, el enlazamiento de la creatinina a la partlcula recubierta con el anticuerpo bloquea la aglomeracion de las partlculas magneticas en la presencia del agente de enlazamiento multivalente, y se marcan bajos niveles de creatinina por la formation de aglomerados. Estos aglomerados alteran las ratas de relajacion rotation-rotation de la muestra cuando se expone a un campo magnetico y el cambio en los tiempos de relajacion T2 (medicion de un cambio en la senal de resonancia magnetica de las moleculas de agua circundante) puede correlacionarse directamente con la presencia y/o concentration del analito en la muestra objetivo.
Partlculas magneticas carboxiladas sustancialmente monodispersas fueron lavadas y resuspendidas en 300 pl de regulador de acoplamiento (MES 50 mM, pH=4.75), y sulfo-NHS (46 pmol) EDC (25 pmol) se agregaron a las partlculas. La solution fue sometida a vortex rapidamente colocada sobre un mezclador de extremo a extremo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las partlculas activadas fueron lavadas con PBS-T20 0.01%, en 1 mL de solucion al 10% p/v de amina-PEG-amina en PBS-T20 al 0.01%. La mezcla fue sometida a vortex y colocada en un mezclador de extremo a extremo durante 2 horas a temperatura ambiente, y luego lavada a 3x con PBS-T20 al 0.01%.
El BSA puede ser sustituido por amina-PEG-amina como qulmica alternativa. Las partlculas magneticas recubiertas con BSA fueron preparadas como se describe en el Ejemplo 6, en la section que describe partlculas magneticas recubiertas con creatinina.
Las partlculas fueron resuspendidas en 260 pl de PBS-T20 al 0.01% y se hizo reaccionar con 198 pl de sulfo SMCC (5 mg/mL en PBS-T20 al 0.01%). La solucion fue sometida a vortex rapidamente y colocada sobre un mezclador de extremo a extremo durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego se lavo 3x con PBS-T20 al 0.01% con EDTA 10 mM para producir partlculas recubiertas con SMCC.
El anticuerpo marcado con SATA fue preparado combinando SATA (30 nmol en DMSO) con anticuerpo (2 nmol en PBS, pH=7.4). La solucion fue colocada sobre un mezclador de extremo a extremo durante 1 hora a temperatura ambiente. Los grupos sulfhidrilo bloqueados sobre el anticuerpo marcado con SATA fueron desprotegidos por tratamiento con regulador de desacetilacion (clorhidrato de hidroxilamina 0.5 M en pH 7.4, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 10 mM) durante 1 hora y purificado a traves de una columna de desalinizacion usando PBS que contenla EDTA 10Mm antes del uso.
Como una alternativa a SATA, puede utilizarse anticuerpo marcado con SPDP. El anticuerpo marcado con SPDP fue preparado agregando SPDP (10 mmol en DMSO) con anticuerpo (2 nmol en PBS, pH 7.4). La solucion fue incubada durante 1 hora a temperatura ambiente y purificada a traves de una columna de desalinizacion. El puente disulfuro de SPDP sobre el anticuerpo marcado con SPDP fue escindido en una reaction con mercaptoetilamina 5 mM e incubado durante 10 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo marcado con SPDP con el puente de disulfuro escindido fue purificado a traves de una columna de desalinizacion antes del uso.
Las partlculas funcionalizadas con SMCC con recubrimiento de PEG o BSA y el anticuerpo modificado con SATA desacetilado fueron combinados y colocados en un mezclador de extremo a extremo durante la noche a temperatura ambiente, lavados con 3x PBS-Tween® 80 al 0.05%, y resuspendidos en PBS-T20 al 0.01% con EDTA al 10 mM. Se agrego un agente bloqueador (m-PEG-SH 2K), la solucion fue colocada en un mezclador de extremo a extremo durante 2 horas, lavada 2x con PBS-Tween® 80 al 0.05%, y resuspendida en PBS- Tween® 80 al 0.05%, BSA al 1% y ProClin® al 0.05% para producir partlculas magneticas recubiertas con anticuerpo.
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Las partlcuias recubiertas con BSA funcionalizadas con SMCC y el anticuerpo marcado con SPDP con puente de disulfuro escindido fueron combinados y colocados sobre un mezclador de extremo a extremo durante 2 horas a temperatura ambiente, lavado 2 veces con PBS-Tween® 20 al 0.01%, EDTA 10 mM EDTA y resuspendidos en PBS- T20 al 0.01%, y EDTA a 10 mM. Se agrego un agente bloqueador, m-PEG-SH 2K (1 pmol), y la solucion fue colocada sobre un mezclador de extremo a extremo durante 2 horas. Se agrego un segundo agente bloqueador, n- etil maleimida (5 pmol). Las partlculas fueron mezcladas durante 15 minutos, lavadas 2 veces con PBS-Tween® 20 al 0.01%, y resuspendidas en pH 9, Tris 100 mM, Tween® 80 al 0.05%, BSA al 1% y ProClin® al 0.05% para producir partlculas magneticas recubiertas con anticuerpo.
El procedimiento delineado mas arriba puede ser utilizado con anticuerpos de creatinina, o los anticuerpos de creatinina pueden ser acoplados directamente a la superficie de las partlculas magneticas carboxiladas a traves de acoplamiento con EDC.
Agentes de enlazamiento multivalentes de creatinina
La COOH creatinina fue conjugada a 3 compuestos de aminodextrano (Invitrogen; PM 10k, 40k, 70k con 6.5, 12, y 24 grupos amino por molecula de dextrano respectivamente) y BSA a traves de acoplamiento con EDC. Los agentes de enlazamiento multivalentes resultantes de BSA-creatinina y amino-dextrano-creatinina pueden ser utilizados en el ensayo de inhibicion competitiva como se describe mas arriba. Se alcanzaron grados de sustitucion entre 2-30 creatininas por unidad estructural de dextrano. Una curva de inhibicion de creatinina de ejemplo se muestra en la figura 33. El agente de enlazamiento usado es dextrano de 40 kDa con ~10 creatininas por moleculas de dextrano.
Ejemplo 8. Preparacion de agentes de enlazamiento multivalentes de tacrolimus.
Los conjugados de tacrolimus fueron preparados utilizando dextrano y BSA. El FK-506 fue sometido a la reaccion de metatesis con olefina utilizando catalizador de segunda generacion de Grubbs en la presencia de acido 4- vinilbenzoico como se representa mas abajo en el esquema 1. La mezcla de producto crudo fue purificada por cromatografla en silica gel en fase normal.
Esquema 1
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Conjugados de dextrano
Los conjugados dextrano-tacrolimus fueron preparados utilizando amino-dextranos de tres pesos moleculares diferentes, cada uno con una sustitucion diferente de grupos amino.
Se combinaron con agitacion 2.78 mL de solucion de EDC (40 mg/mL de clorhidrato de EDC) y 2.78 mL de solucion de sulfo-NHS (64 mg/mL de sulfo-NHS). A esta mezcla se agregaron 0.96 mL de solucion de derivado acido de tacrolimus (C21) (28.8 mg/mL en DMSO) y el contenido se agito durante 30 minutos a temperatura ambiente para formar el derivado acido de tacrolimus (solucion Tac activada 4.6 mM). El tacrolimus activado fue utilizado inmediatamente.
Se disolvieron diversos polimeros de amino-dextrano en regulador de fosfato de sodio 100 mM (pH 8.0) para hacer una solucion de reserva de 9.5 mg/mL.
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La solucion de Tac activada fue agregada gota a gota con agitacion a temperatura ambiente a la solucion de reserva de aminodextrano en las relaciones tabuladas a continuacion. Cada reaccion fue agitada vigorosamente durante al menos 2 horas.
Tabla 6
Reaccion
Aminodextrano p.m. Relacion de amina:Tac Aminodextrano (pL) Volumen Tac (pL) Relacion molar Tac:dextrano estimada
1
70K 1:0.2 1000 70.8 No probada
2
70K 1:0.4 1000 141.6 No probada
3
70K 1:0.8 1000 283.2 4.1
4
70K 1:1.6 1000 566.4 No probada
5
70K 1:3.2 1000 1132.8 No probada
6
70K 1:5 1000 1770 15.8
7
10K 1:0.8 1000 283 1.0
8
10K 1:5 1000 1766 2.2
9
40K 1:0.8 1000 287 2.0
10
40K 1:5 1000 1793 8.2
Los conjugados resultantes de Tac-dextrano fueron purificados usando una dialisis seriada de 5 etapas de cada producto de reaccion (1° - 15% (v/v) DMSO acuoso; 2° - 10% (v/v) metanol acuoso; 3° a 5° - agua de alta pureza; al menos 2 horas para cada etapa; utilizando una membrana de dialisis de 3,500 MWCO para el aminodextrano de 10K PM y una membrana de dialisis 7K MWCO para el aminodextrano de 40K y 70K).
Despues de la purificacion, cada una de las muestras fue liofilizada y se determino el peso seco. Los agentes de enlazamiento multivalentes fueron reconstituidos antes del uso.
Despues de la reconstitucion, las relaciones de sustitucion de tacrolimus fueron estimadas con base en la absorbancia a 254 nm.
Los experimentos fueron llevados a cabo para determinar que tamano de dextrano provela el rendimiento de aglomeracion mas optimo. En resumen 10 pL de MeOH al 10%, BSA al 1% en PBS, regulador pH 6.3, 20 pL de aglomerante de Tac de dextrano, 10K, 40K, 70K, a concentraciones variables, y 10 pL de partlculas recubiertas con anti-tacrolimus en Fe 0.2 mM fueron agregados a un tubo de PCR de 200 pL (2.7x109 partlculas por tubo). La muestra fue sometida a vortex utilizando un mezclador de placa a 2000 rpm durante 2 minutos, precalentada durante 15 minutos a 37°C en una estacion de incubacion, expuesta a un magneto lateral e inferior durante 1 minuto cada vez, repetida por 6 ciclos, sometida a vortex de nuevo durante 2 minutos a 2000 rpm, incubada por 5 minutos en una incubadora a 37°C que contiene el bloque de calenta miento disenado para tubos de PCR, y se leyo el T2 sobre el lector de MR. Los datos indican que las relaciones de peso molecular/sustitucion variada de Tac dextrano puede dar como resultado una senal de T2 mejorada (vease figura 34). Ademas, una sustitucion mas alta tambien dio como resultado una respuesta mejorada (vease figura 35).
Conjugados de BSA
Los conjugados BSA-tacrolimus fueron preparados con grados variables de sustitucion con tacrolimus.
Se combinaron con agitacion 34.5 pL de solucion de NHS (66.664 mg/mL en acetonitrilo) y 552 pL de EDC (6.481 mg/mL en MES 50 mM pH 4.7). Se agregaron 515.2 pL de esta mezcla de EDC NHS gota a gota a 220.8 pL de derivado acido de tacrolimus (C21) en solucion (33.33 mg/mL en acetonitrilo) y el contenido se agito durante 1 hora
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a temperatura ambiente para formar el derivado acido de tacrolimus activado. El tacrolimus activado fue usado inmediatamente.
Se disolvio BSA en solucion salina regulada con fosfato y acetonitrilo para formar una solucion que contenla 5 mg/mL de BSA en acetonitrilo al 40%.
La solucion de Tac activada fue agregada gota a gota con agitacion a temperatura ambiente a la solucion de BSA en las relaciones tabuladas a continuacion. Cada reaccion fue agitada vigorosamente durante al menos 2 horas.
Tabla 7
Reaccion
Relacion de Tac:BSA BSA (pL) Volumen de Tac (pL)
1
5:1 1000 35
2
10:1 1000 70
3
20:1 1000 140
4
30:1 1000 210
5
50:1 1000 350
Los conjugados de Tac-BSA resultantes fueron purificados utilizando una columna de exclusion por tamano PD10 preequilibrada con acetonitrilo al 50%. El eluyente fue recolectado en fracciones de 1 mL y monitorizado por absorbancia a 280 nm para identificar las fracciones que contenlan BSA.
Las fracciones que contenlan BSA fueron combinadas y el acetonitrilo fue retirado bajo vaclo.
Los conjugados de Tac-BSA fueron evaluados en cuanto a la capacidad de aglomeracion llevando a cabo una titulacion similar a la usada para los conjugados de dextrano-tacrolimus. Como se observa el rendimiento de aglomeracion difiere con la relacion de sustitucion con Tac (vease figura 36).
Ejemplo 9. Protocolo de ensayo competitive de tacrolimus (anticuerpo sobre arquitectura de partfcula)
Se desarrollo un ensayo con tacrolimus utilizando partlculas conjugadas con anticuerpo anti-tacrolimus y agente de enlazamiento multivalente de BSA-tacrolimus con deteccion utilizando un lector MR (vease Ejemplo 6). Este ensayo fue disenado para probar muestras de sangre entera que hablan sido extraldas para liberar tacrolimus a partir de los globulos rojos y protelnas de enlazamiento (la extraccion de analito hidrofobo de una muestra puede lograrse, por ejemplo, utilizando la metodologla descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 5,135,875). La arquitectura del ensayo competitivo de tacrolimus se representa en la figura 28.
Soluciones de partlculas magneticas y agente de enlazamiento multivalente fueron sometidos a dilucion, cuando se indica, con un regulador de ensayo que inclula glicina 100 mM pH 9, Tween® 80 al 0.05%, BSA al 1%, NaCl 150 mM, CHAPS al 0.1%.
Una partlcula base con funcionalidad COOH fue modificada por recubrimiento aminado secuencial (PEG o BSA), union covalente de anticuerpo, cubierta de PEG y bloque PEG/protelna (como se describio en los ejemplos anteriores). Las partlculas magneticas recubiertas con anticuerpo fueron diluidas a Fe 0.4 mM (5.48x109 partlculas/ml) en regulador de ensayo, y sometidas exhaustivamente a vortex.
El agente de enlazamiento multivalente fue formado a partir de tacrolimus modificado con COOH conjugado a BSA (como se describio en el Ejemplo 8). El agente de enlazamiento multivalente fue diluido a 0.02 pg/ml en regulador de ensayo, y sometido exhaustivamente a vortex.
La solucion de muestra extralda (10 pL) y la solucion de partlculas magneticas (10 pL) fueron combinadas y sometidas a vortex durante 5 segundos e incubadas a 37°C durante 15 minutos. A esta mezcla se agregaron 20 pL del agente de enlazamiento multivalente y la mezcla resultante fue sometida a vortex durante 5 segundos e incubada a 37°C durante 5 minutos.
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Se prepararon varias muestras como se describio mas arriba. Todas las muestras fueron colocadas en la unidad gMAA durante 1 minuto. Todas las muestras fueron colocadas entonces en una bandeja retirada del campo magnetico. Cada muestra fue sometida a vortex durante al menos 5 segundos y regresada a la bandeja. Todas las muestras fueron colocadas de nuevo en la unidad gMAA durante 1 minuto, seguido por vortex. Este proceso fue remitido 12 veces para cada muestra.
La muestra fue incubada durante 5 minutos a 37°C, colocada en el lector MR (vease Ejemplo 6) para medir la rata de relajacion T2 de la muestra, y la rata de relajacion T2 de la muestra fue comparada con una curva estandar (vease figura 29) para determinar la concentracion de tacrolimus en la muestra llquida.
Anticuerpo de tacrolimus
Se han adelantado diversos programas de desarrollo de anticuerpos para crear un anticuerpo de tacrolimus de alta afinidad que incluye modelos monoclonales de raton tradicionales, estrategias de despliegue de fagos in vitro y modelo de conejo. Se utilizaron derivados C21 de tacrolimus como haptenos para los conjugados inmunogenos y de criba usados en estos programas. Se desarrollo un conjunto de criterios para cribar e identificar un anticuerpo optimo para el uso del ensayo. Los criterios incluyen la capacidad para enlazar conjugados tacrolimus-protelna, la inhibicion de ese enlazamiento en la presencia de niveles nanomolares de tacrolimus libre, exhibiendo todos poca o ninguna afinidad por los metabolitos de tacrolimus (representado mas adelante).
Utilizando los criterios de seleccion de anticuerpos establecidos delineados mas arriba, han sido identificados varios anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos Fab que han sido seleccionados como candidatos potenciales en un ensayo de tacrolimus.
imagen10
HjCu
31-O-desmeti ado
31-O-desmetilado y
una formacion de un nuevo
sistema de amllo entre
carbono 19, 36 y 37
15-O-desmetilado
15.31-O-di-desmeti ado
12-O-hidroxi ado
OCH,
H,CO
13-O-desmetilado
13.31-O-di-desmetilado
13,15-u-di-desmetilado
Ejemplo 10. Aglomeracion asistida por gradiente magnetico lado a lado (gMAA).
Se llevo a cabo una evaluacion de los metodos alternativos y de gMAA utilizando el inmunoensayo de creatinina descrito en el Ejemplo 6 con una muestra que no contenla analito para competir con la aglomeracion especlfica partlcula-anticuerpo.
Se prepararon varias mezclas identicas como se describe en el Ejemplo 6. Todas las muestras fueron colocadas en la unida gMAA durante 1 minuto. Todas las muestras fueron colocadas entonces en una bandeja retirada del campo magnetico. Cada muestra fue sometida a vortex durante al menos 5 segundos y retornada a la bandeja. Todas las muestras fueron colocadas en la unidad gMAA durante 1 minuto. Este proceso fue repetido 12 veces para cada muestra, para obtener mediciones replicadas.
Despues del ultimo ciclo de gMAA, la muestra fue sometida a vortex durante 5 segundos, incubada durante 5 minutos a 37°C, y colocada en el lector MR para medir la rata de relajacion T2 de la muestra.
La agregacion especlfica alcanzada con diversos metodos de gMAA esta representada en la figura 26, en donde (i) “control” es gMAA (exposicion a magneto + vortex, repetido) en la cual la posicion relativa de la muestra y la direccion del campo magnetico no cambian con cada ciclo; (ii) “torsion” es gMAA (exposicion a magneto + rotacion dentro de magneto, repeticion) con tubo rotatorio cerca de 90° con respecto al magneto gradiente con cada ciclo; (iii)
“giro de 180” es gMAA (exposicion a magneto + retiro de tubo de magneto, rotacion, regresar a magneto, repetir) con tubo rotatorio cerca de 180° con respecto al magneto gradiente con cada ciclo: y (iv) “retirar 5 veces” es = retiro del tubo de magneto, 5 segundos de descanso (sin rotacion), repetir.
En la aglomeracion asistida magnetica pulsada (clclica), la muestra llquida es expuesta a campos magneticos de 5 diferentes direcciones en una forma alternante. Como se muestra en la figura 26, la rata a la cual un grado de estado de equilibrio de aglomeracion, y lecturas estables de T2 se alcanzan es acelerada por la ciclizacion entre dos o mas posiciones a lo largo de una serie de tratamientos de gMAA.
Ejemplo 11. Aglomeracion asistida por gradiente magnetico de lado-fondo (gMAA)
Se llevo a cabo una evaluacion de gMAA “lado-fondo” utilizando el inmunoensayo basico de creatinina descrito en el 10 Ejemplo 6. Para esta evaluacion, se diluyo anticuerpo de creatinina a 1 pg/ml y se diluyeron calibradores de suero 1:5 antes del ensayo. Se transfirieron con pipeta 10 pl de calibrador diluido, 10 pl de reactivo de partlculas y 20 pl de reactivo de anticuerpo al pozo de reaccion. El tubo fue precalentado a 37°C durante 5 minutos y luego procesado a traves de gMAA con una exposicion de 60 segundos en el magneto lateral, seguido por 60 segundos en el magneto del fondo. Esto se completo durante un total de 6 ciclos o 12 minutos en total. Se llevo a cabo una mezcla final 15 utilizando un vortex durante 60 segundos antes de la operacion de lectura.
En la figura 27 se muestra una curva estandar para el ensayo competitivo creatinina-creatinina con gMAA alternante lateral-fondo demostrando buena respuesta con la configuracion gMAA lateral-fondo.
Ejemplo 12. Efecto de variar el tiempo de residencia y temperatura en gMAA.
Se llevo a cabo una evaluacion del tiempo de residencia y temperatura en gMAA sobre la aglomeracion asistida.
20 Se probaron las siguientes condiciones para determinar la temperatura y tiempo de residencia mas optimos para el rendimiento de T2: Alteraciones - 6, 12, 24, 48; para cada numero de alteraciones se evaluaron los siguientes tiempos de residencia: 30, 60, 120 segundos. Se evaluo tambien un tiempo de magneto fijo de 6 minutos con los siguientes tiempos de residencia: 30, 60, 120 segundos. Las muestras fueron preparadas agregando 20 pL de concentraciones variadas de protelna A (una protelna diana) y 20 pL de anticuerpo A antiprotelna como 25 recubrimiento en partlculas magneticas a Fe 0.08 mM a un tubo de PCR (1.2x109 partlculas por tubo). Las muestras fueron colocadas en una bandeja de 32 posiciones, sometidas a vortex en un agitador de placa durante 2 minutos a 2000 rpm e incubadas en una estacion de incubacion a 37°C durante 15 minutos. Las muestras fueron expu estas entonces a la residencia antes mencionada y a condiciones de alteracion entre campos magneticos alternantes. Despues del tratamiento de gMAA, las muestras fueron sometidas manualmente durante 5 minutos, incubadas a 30 37°C en un bloque de calentamiento compatible con tubos de PCR, y el T2 fue leldo utilizando el lector MR (vease
Ejemplo 6). Los datos en las figuras 30A y 30B muestran que la respuesta T2 es directamente proporcional a la temperatura y tiempo de residencia. Por lo tanto, la temperatura incrementada y el tiempo de residencia/tiempo total dan como resultado una respuesta T2 mejorada.
Ejemplo 13. Efecto de variar el numero de ciclos gMAA
35 Se llevo a cabo una evaluacion de la variacion del numero de ciclos gMAA usando el sistema y procedimiento del Ejemplo 12.
Se probaron las siguientes condiciones para efectos sobre el comportamiento de T2: Ciclos - 3, 6, 12, 24; para cada ciclo se evaluo el siguiente tiempo de residencia: 30, 60, 120 segundos. Un ciclo consiste de residencia en el lado, seguido por el fondo. 6 ciclos = 12 alteraciones totales. Las muestras fueron preparadas como se describe en el 40 Ejemplo 12. Como se muestra en la Figura 31, el grado de agregacion es directamente proporcional al numero de ciclos gMAA. Tambien se encontro que cuando el tiempo de exposicion al magneto alcanza o excede de 24 minutos, hay un incremento en la agregacion no especlfica que no puede ser dispersada con vortex (no mostrada aqul).
Ejemplo 14. Ensayo con Candida
En el ensayo utilizado para Candida se utilizaron dos grupos de partlculas magneticas para la deteccion de cada 45 especie de Candida. En el primer grupo, se conjugo una sonda de oligonucleotidos de captura de Candida especlfico para la especie a las partlculas magneticas. En el segundo grupo, se conjugo una sonda de oligonucleotidos de captura especlfica para la especie adicional a las partlculas magneticas. Por hibridacion, las dos partlculas hibridaran a dos distintas secuencias especlficas de la especie con la cadena en sentido del acido nucleico diana separado por aproximadamente 10 a 100 nucleotidos. (Alternativamente, los dos oligonucleotidos de 50 captura pueden ser conjugados a un grupo individual de partlculas, dando como resultado partlculas individuales que tienen especificidad tanto por la primera como por la segunda regiones). Las partlculas magneticas cubiertas con oligonucleotidos estan disenadas para agregarse en la presencia de moleculas de acido nucleico de una
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especie particular de Candida. Asl, a diferencia de los ensayos de inhibicion usados para creatinina y tacrolimus, el ensayo para Candida presenta un incremento en la aglomeracion en la presencia de moleculas de acidos nucleicos de Candida diana. La arquitectura del ensayo de aglomeracion mediado por hibridacion se representa en la figura 32.
Se utilizan partlculas magneticas carboxiladas en los ensayos de Candida. Las partlculas magneticas fueron conjugadas a sondas de captura de oligonucleotidos para crear conjugados oligonucleotidos-partlcula. Para cada amplicon diana, se prepararon dos poblaciones de conjugados oligonucleotidos-partlcula. Los conjugados oligonucleotidos-partlcula fueron preparados usando qulmica EDC estandar entre oligonucleotidos aminados y partlculas carboxiladas, o, opcionalmente, acoplando oligonucleotidos biotina-TEG modificados a partlculas de estreptavidina. Las reacciones de acoplamiento fueron llevadas a cabo tlpicamente en una concentracion de partlcula de 1% de solidos.
Las densidades de oligonucleotidos funcionales postconjugacion fueron medidas por hibridacion de complementos marcados con Cy5 a las partlculas, lavando las partlculas tres veces para retirar el oligo no hibridado; y eluyendo por calentamiento a 95°C durante 5 minutos. La cantidad de oligonucleotido marcado con Cy5 cuantificada a traves de espectroscopla de fluorescencia.
Las reacciones de acoplamiento fueron llevadas a cabo a 37°C durante la noche con mezcla continua utilizando un oscilador o un agitador de rodillos. Los conjugados de partlcula resultantes fueron lavados dos veces con un volumen de reaccion 1x de agua Millipore; dos veces con un volumen de reaccion 1x de imidazol 0.1 (pH 6.0) a 37°C durante 5 minutos; tres veces con volumen 1x de reaccion de bicarbonato de sodio 0.1 M a 37°C durante 5 minutos; luego dos veces con volumen de reaccion 1x de bicarbonato de sodio 0.1 M a 65°C durante 30 minutos. Los conjugados de partlculas resultantes fueron almacenados en solidos al 1% en TE (pH 8), Tween®20 al 0.1%.
El panel de especies de Candida detectado incluye C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, y C. parapsilosis. Las secuencias son amplificadas utilizando cebadores universales que reconocen secuencias altamente conservadas dentro del genero Candida. Los oligonucleotidos de captura fueron disenado para reconocer e hibridar a regiones especlficas para la especie dentro del amplicon.
Una allcuota de la muestra de sangre fue sometida primero a lisis como sigue:
(i) Una muestra de sangre entera fue mezclada con un volumen en exceso (1.25x, 1.5x, o 2x) de solucion de lisis hipotonica de cloruro de amonio. La adicion de la solucion de lisis destruye todos los RBC, pero no destruye las celulas de WBC, levadura o bacterias. El material celular fue centrifugado a 9000 rpm durante 5 minutos y se retiro el lisado. Las celulas intactas fueron reconstituidas con 100 pl de TE (tris EDTA, pH=8) hasta un volumen final de aproximadamente 100 pl; y
(ii) A la muestra de aproximadamente 100 pl, se agregaron 120 mg de perlas de 0.5 mm. La muestra fue agitada durante 3 minutos a aproximadamente 3K rpm, formando por lo tanto un lisado.
Una allcuota de cerca de 50 pl del lisado fue sometida entonces a amplificacion por PCR por adicion del lisado una mezcla maestra de PCR que incluye nucleotidos; regulador ((NH4)SO4 5 mM, MgCl2 3.5 mM, glicerol al 6%, Tricina 60 mM, pH=8.7 a 25°C; cebadores (cebador de avance en exceso de 4x (de avance 300 mM; de reverso 0.75 mM) para permitir una produccion de cadena sencilla asimetrica en el producto final; y polimerasa termoestable (HemoKlenTaq (New England Biolabs)). Despues de una incubacion inicial a 95°C durante 3 minutos, la mezcl a es sometida a ciclos de PCR: fusion a 62°C; elongacion a 68°C; 95°C para 40 ciclos. Nota: hay una diferenc ia de 6°C en las temperaturas de fusion y elongacion; la fusion y la elongacion pueden ser combinadas en una etapa sencilla para reducir el tiempo de terminacion de la amplificacion total.
El amplicon de PCR, ahora listo para la deteccion, es combinado con dos poblaciones de partlculas en un ensayo en sandwich.
Los cebadores de PCR y las sondas de captura que pueden ser utilizados en los ensayos con Candida se proveen a continuacion en la Tabla 8.
Cebadores PCR
Pan Candida-PCR cebador de avance
GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC (SEQ ID NO. 1)
Pan Candida-PCR cebador reverso
GCT TAT TGA TAT GCT TAA GTT CAG CGG GT (SEQ ID NO. 2)
Sondas de captura
Candida albicans Sonda #1
ACC CAG CGG TTT GAG GGA GAA AC (SEQ ID NO. 3)
Candida albicans Sonda #2
AAA GTT TGA AGA TAT ACG TGG TGG ACG TTA (SEQ ID NO. 4)
Candida krusei Sonda #1
CGC ACG CGC AAG ATG GAA ACG (SEQ ID NO. 5)
Candida krusei Sonda #2
AAG TTC AGC GGG TAT TCC TAC CT (SEQ ID NO. 6)
Candida krusei Sonda
AGC TTT TTG TTG TCT CGC AAC ACT CGC (SEQ ID NO. 32)
Candida glabrata Sonda #1
CTA CCA AAC ACA ATG TGT TTG AGA AG (SEQ ID NO. 7)
Candida glabrata Sonda #2
CCT GAT TTG AGG TCA AAC TTA AAG ACG TCT G (SEQ ID NO. 8)
Candida parapsilosis/tropicalis Sonda #1
AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC NitInd1 AA (SEQ ID NO. 9)
Candida parapsilosis/tropicalis Sonda #2
CCG NitInd1 GG GTT TGA GGG AGA AAT (SEQ ID NO. 10)
Candida tropicalis
AAA GTT ATG AAATAA ATT GTG GTG GCC ACT AGC (SEQ ID NO. 33)
Candida tropicalis
ACC CGG GGGTTT GAG GGA GAA A (SEQ ID NO. 34)
Candida parapsilosis
AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC GAA (SEQ ID NO. 35
Candida parapsilosis
CCG AGG GTT TGA GGG AGA AAT (SEQ ID NO. 36)
Control de inhibition 5'
GG AAT AAT ACG CCG ACC AGC TTG CAC TA (SEQ ID NO. 37
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Cebadores PCR
Control de inhibition 3'
GGT TGT CGA AGG ATC TAT TTC AGT ATG ATG CAG (SEQ ID NO. 38)
1. Nitlnd es 5' 5-nitroindol, una base que es capaz de fusionarse con cualquiera de las cuatro bases de ADN. 2. Notese que se agregan oligos Ts como espaciadores
Opcionalmente, el ensayo se lleva a cabo en la presencia de una secuencia de control, junto con partlculas magneticas cubiertas con sondas para confirmar la presencia de la secuencia de control.
Ejemplo 15. Metodos no aglomerantes
Este proceso ha sido demostrado utilizando espuma metalica de nlquel tratada con aminosilano con poros de 400 pm cubierta con anticuerpos anticreatinina y que demuestra enlazar especlficamente partlculas magneticas derivadas con creatinina. Una pieza cuadrada de 1 cm de espuma metalica de nlquel (Recemant RCM-Ni-4753.016) fue lavada por incubacion a temperatura ambiente durante 1 hora en HCl 2M, enjuagada exhaustivamente en agua desionizada, y secada a 100°C durante 2 horas. La espuma de nlquel fue tratada entonces con 3- aminopropiltrietoxisilano al 2% en acetona a temperatura ambiente durante la noche. La espuma metalica de nlquel fue lavada entonces extensamente con agua desionizada y secada durante 2 horas a 100°C. La espuma metalica de nlquel tratada con aminosilano fue tratada entonces con glutaraldehldo al 2% en agua durante 2 horas a temperatura ambiente y lavada extensamente con agua desionizada. A continuacion, la espuma metalica fue expuesta a 100 pg/ml de anticuerpo anticreatinina (14H03) (vease ejemplo 6) en PBS durante la noche, lavada extensamente con PBS y tratada con Surmodics Stabilguard para estabilizar y bloquear enlazamiento no especlfico. Se cortaron piezas cuadradas de dos mm de espuma de metal derivado usando una cuchilla de afeitar nueva teniendo cuidado para no danar la estructura de la espuma. Se coloco una pieza de la espuma de metal derivada en un tubo de PCR en 20 pl de regulador de ensayo (glicina 100 mM (pH=9.0), NaCl 150 mM, BSA al 1%, ProClin® al 0.05% y Tween® al 0.05%. Se agregaron 20 microlitros de partlculas de control (que no deberlan enlazarse a la espuma metalica ABX1-11) a Fe 0.2 mM al tubo para llevar el volumen final a 40 ul y la concentracion final de partlculas a Fe 0.1 mM (1x106-1x108 partlculas/tubo). Se preparo tambien un tubo de PCR separado con las mismas partlculas y regulador, sin la espuma metalica. El tubo de PCR que contenla la espuma metalica derivada de las partlculas de control fue colocado en una disposicion gMAA (posicion de halado 6 lateral) durante 1 minuto y retirada tocandola con un desmagnetizador de mano, y colocada de nuevo en la disposicion gMAA por otro minuto, se retiro tocando con un desmagnetizador de mano y se coloco de nuevo en la disposicion gMAA durante otro minuto y se sometio a vortex (tres exposiciones magneticas de 1 minuto). Se retiraron treinta pl de muestra de ambos tubos de PCR, se calentaron a 37°C en un calentador de bloque durante 5 minutos y se leyo el T2 utilizando el lector MR (vease Ejemplo 6). El T2 de la muestra sin espuma dio 39.2, y las muestras del tubo de PCR que contenlan la espuma dieron una lectura de 45.1, demostrando un bajo nivel de perdida de partlculas debida a NSB. La espuma de metal derivada fue desmagnetizada, sometida a vortex y enjuagada en regulador de ensayo. Se coloco en un nuevo tubo de PCR con 20 pl de regulador de ensayo 20 pl de partlculas AACr2-3-4 derivadas con creatinina con una concentracion final de partlcula de Fe 0.1 mM. Un tubo de PCR duplicado sin la espuma de metal derivada tambien fue dispuesto como en el experimento de control. El tubo de PCR con la espuma metalica fue ciclizado dos veces a traves del dispositivo gMAA exactamente como en el experimento de control (3 exposiciones de un minuto con desmagnetizacion despues de cada exposicion, y vortex final). Muestras de treinta pl de ambos tubos fueron retiradas y calentadas a 37°C durante 5 minutos y luego leldas en el lector RM. La muestra del tubo de PCR con la espuma metalica derivada dio lectura de 41.5 y la muestra de tubo de PCR con la espuma metalica derivada con el anticuerpo anticreatinina dio lectura de 324.2, demostrando as! un enlazamiento/perdida especlfica de las partlculas magneticas apropiadas derivadas con creatinina del volumen acuoso leldo por el lector MR.
Ejemplo 16. Deteccion de polimorfismos de nucleotidos sencillos
Hay numerosos metodos mediante los cuales las mediciones de T2 podrlan detectar polimorfismo de nucleotidos sencillos.
La aplicacion mas simple involucrarla la discriminacion de no coincidencias a traves de una ADN ligasa termofllica (Tth ligasa). Este ensayo requerirla la lisis del material de muestra seguida por corte de ADN. Podrlan ligarse adaptadores sobre las sondas de captura de union a partlculas superparamagneticas que flanquean el SNP de tal manera que el extremo 5' de la sonda de captura aminada en 3' serla perfectamente complementario con un alelo SNP particular y el tratamiento subsecuente con Tth ligasa darla como resultado la union de las dos sondas de
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captura unidas a partlcuias. La union por lo tanto asegurarla las partlcuias en un estado aglomerado. Ciclos de hibridacion con fusion repetida darlan como resultado la amplification de senal en casos en donde la amplification de ADN genomico no no es deseada debido al riesgo de desviacion de la amplificacion. La misma sonda de captura aminada en 5' podrla ser utilizada en todos los casos en donde la sonda aminada en 3' podrla ser generada para producir 4 grupos distintos (un A, G, C o T) en el extremo 5'. La detection requerirla division de la muestra en los 4 grupos para determinar cuales nucleotidos estaban presentes en el sitio polimorfico dentro de un individuo particular. Por ejemplo una conmutacion de T2 fuerte en el tubo de deteccion de G solo indicarla que el individuo era homocigotico para G en esa localization de secuencia particular, mientras que una conmutacion en G y A indicarla que el individuo es un heterocigoto para G y A en ese sitio SNP particular. La ventaja de este metodo es que la Tth polimerasa ha demostrado tener capacidad de discrimination superior incluso discriminando falta de coincidencias G-T (una falta de coincidencia permisiva particular y tambien la mas comun) de 1:200 veces contra el complemento correcto. Mientras que las reacciones de deteccion de ligasa as! como los ensayos de ligasa con oligonucleotidos se han empleado en el pasado para definir secuencias de nucleotidos en sitios polimorficos conocidos, toda la amplificacion es requerida bien antes o despues de la union. En este ejemplo particular la senal podrla ser amplificada a traves de un incremento inducido por la union en el tamano del complejo de partlculas aglomeradas resultante y por lo tanto un incremento en los tiempos de relajacion (T2) medidos.
Una modification de este procedimiento podrla incluir la hibridacion de una sonda de captura de union a partlcula que flanquea la hibridacion de una sonda biotinilada. Cuando se forma un duplex perfectamente complementary a traves de la hibridacion de la sonda de union a partlcula, la ligasa en la salida covalentemente la sonda de biotina a la partlcula magnetica. De nuevo las rondas repetidas de desnaturalizacion por calor seguidas por fusion y ligation producirlan una alta proportion de oligos largos biotinilados sobre la superfine de la partlcula magnetica. Un lavado para retirar cualquier sonda libre se llevarla a cabo seguido por la adicion de una segunda partlcula superparamagnetica marcada con estreptavidina. La aglomeracion procederla solamente si las sondas biotiniladas estuvieran ligadas sobre la superficie de la primera partlcula.
Una metodologla de discriminacion de hibridacion podrla ser empleada tambien. En este ejemplo, los complemented de oligonucleotidos aminados adyacentes a los sNp conocidos serlan generados. Estos oligonucleotidos aminados serlan usados para derivar la superficie de una placa de 96 pozos con reaction de deteccion de 1 SNP llevado a cabo por pozo. El ADN genomico serla entonces cortado, ligado a adaptadores y amplificado asimetricamente. Este ADN genomico amplificado seria aplicado entonces a la disposition as! como una sonda de deteccion de SNP biotinilada corta. El ADN genomico amplificado hibridarla a la sonda de captura unida al pozo y la sonda de deteccion de SNP se unirla entonces al ADN genomico atado. El lavado seria llevado a cabo para retirar la sonda de deteccion de SNP. Una partlcula magnetica de estreptavidina (SA) seria agregada entonces a cada pozo. El lavado de nuevo requerirla retirar partlculas de SA libres. La deteccion de T2 seria llevada a cabo directamente dentro de los pozos mediante partlculas superparamagneticas biotiniladas agregadas para producir partlculas aglomeradas atadas a la superficie, o las partlculas magneticas SA podrlan ser eluidas de cada pozo sobre la disposicion e incubadas en reacciones de deteccion con partlculas magneticas biotiniladas.
Finalmente podrla acoplarse una primera reaccion de extension de cebador a la deteccion de T2 para discriminar cual nucleotido esta presente en un sitio polimorfico. En este ensayo, un grupo de didesoxinucleotidos seria empleado con un nucleotido por grupo procesando una biotina (esto es ddA, ddT, ddbiotin-C y/o ddG). Se emplearla una partlcula superparamagnetica que porta una sonda de captura cuya ultima base por hibridacion cae adyacente a un SNP.
El ADN genomico cortado seria dividido e incubado en cuatro reacciones de extension de cebador separadas. Una exoADN polimerasa catalizarla entonces la adicion de un didesoxi complementary al nucleotido presente en el SNP. De nuevo esta reaccion podrla ser ciclizada si se emplea una polimerasa termofllica para asegurar que la mayor parte de las sondas de captura sobre la partlcula seran extendidas. Se llevarla a cabo una separation magnetica seguida por un lavado de las partlculas seguido por incubation con partlculas superparamagneticas de estreptavidina. La aglomeracion seria proporcional al grado de sonda de captura biotinilada sobre la superficie de la primera partlcula. Si dos de los grupos didesoxi generaron una ganancia en T2 (esto es, facilitan la aglomeracion de partlculas), el paciente seria un heterocigoto. Si solamente un grupo produjo un incremento en T2, el paciente seria un homocigoto.
Un metodo final para detectar SNP emplea cebadores de PCR especlficos para el alelo, en los cuales el extremo 3' del primero abarca el SNP. Puesto que se emplean condiciones de amplificacion restrictivas, si la secuencia diana no es perfectamente complementaria al cebador, la amplificacion por PCR estarla comprometida con poco o ningun producto generado. En general, se disenarlan cebadores de avance multiple (uno perfectamente complementary a cada alelo) junto con un cebador reverso sencillo. El amplicon seria detectado usando dos o mas partlculas superparamagneticas enlazadas a sondas de captura para inducir la hibridacion con base en reacciones de aglomeracion. Una ventaja de esta metodologla es que utiliza parte del trabajo ya llevado a cabo en T2 sobre PCR dentro de muestras crudas, y solamente implicarla cebadores disenados para abarcar SNPs conocidos. Una desventaja de esta metodologla es que no puede determinar localizaciones SNP de novo.
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Un metodo adicional que puede ser utilizado es basarse simplemente en las capacidades de discriminacion del entrecruzamiento particula-particula debido a la hibridacion una diana de acido nucleico corto. Las no coincidencias en pares de bases para oligonucleotidos han demostrado desplazar dramaticamente el estado de aglomeracion de las particulas, y la senal T2 medida, debido a las eficiencias en hibridacion reducida que surgen de la presencia de una falta de coincidencia en una base individual.
Ejemplo 17. Panel de diagnostico de Candida
La prueba fue llevada a cabo durante el transcurso de 45 dias. Se cultivaron cepas de referencia de C. albicans y C. krusei asi como de C. albicans y se mantuvieron durante la duracion del estudio.
Materiales:
Nanoparticulas con C. albicans y C. krusei: Se generaron dos poblaciones en particulas para cada especie, portando las particulas covalentemente conjugadas a oligos complementarios a secuencias especificas para la especie dentro de la region ITS2 (vease Ejemplo 14). Las particulas fueron almacenadas a 4-8°C en TE (pH 8), Tween al 0.1% y fueron diluidas a Fe 0.097 mM en regulador de hibridacion de ADN inmediatamente antes del uso.
Cepas de Candida: Los paneles fueron llevados a cabo utilizando cepa de referencia de C. albicans MYA 286 (GenBank FN652297.1), cepa de referencia de C. krusei 23210 (GenBank AY939808.1) y aislados clinicos de C. albicans. Los cinco aislados de C. albicans usados fueron cultivados en YPD a temperatura ambiente. Se seleccionaron colonias individuales, se lavaron 3 veces con PBS, y luego se cuantificaron a traves de hemocitometna para la preparacion de siembras en sangre entera. Las muestras fueron almacenadas como reservas en glicerol congeladas a -80°C.
Sangre humana entera: La sangre humana fue recolectada de donantes saludables e hidratada con K2EDTA y sembrada con celulas de Candida diluidas lavadas en serie a concentraciones que variaban de 1E5 a 5 celulas/mL. Las siembras de celulas preparadas en sangre entera fueron almacenadas en -20°C.
Regulador de lisis de eritrocitos: Un regulador de lisis hipotonico que contenia bicarbonato de potasio 10 mM, cloruro de amonio 155 mM y EDTA 0.1 mM fue esterilizado por filtracion y almacenado a temperatura ambiente antes del uso. Alternativamente puede utilizarse un agente de lisis de eritrocitos, tal como un detergente no ionico (por ejemplo, una muestra de triton-X 100 e igepal, o Rrij-58).
Mezcla maestra para PCR: Se preparo una mezcla maestra que contenia regulador, nucleotidos, cebadores y enzima (20 pl de regulador de reaccion 5x, 22 pL de agua, 2 pL de dNTP 10 mM, 3 pL de cebador de avance 10 pL, 3 pL de cebador reverso 2.5 pM, 10 pL de HemoKlen Taq y 40 pL de lisado agitado con perlas) y se almaceno a temperatura ambiente.
Mezcla maestra de hibridacion de particulas: Se preparo una mezcla maestra consistente de conjugados de nanoparticulas, sales, surfactantes y formamida (78 pL de formamida, 78 pL 20x SSC, 88.3 pL 1xTE + 0.1% Tween, 7.5 pL CP 1 - 3', y 8.2 pL CP 3 - 5') inmediatamente antes del uso.
Perlas de vidrio (0.5 mm), usadas en la lisis mecanica de Candida, fueron lavadas en acido y sometidas a autoclave y almacenadas a temperatura ambiente antes del uso.
Protocolo de PCR:
En la figura 47 se muestra un esquema general del flujo de trabajo para la deteccion de un patogeno (por ejemplo Candida) en una muestra de sangre entera. El protocolo fue como sigue: (i) muestras sembradas de sangre entera humana fueron dejadas en calentamiento a temperatura ambiente (~30 minutos); (ii) se colocaron en cada tubo alicuotas de 1 mL de regulador de lisis de eritrocitos; (iii) cada tubo fue sometido a centrifugacion a 9000 g durante 5 minutos y luego se descarto la sangre lisada; (iv) se colocaron alicuotas de 100 pL de TE filtrado a 0.2 micrones en cada tubo; (v) se agregaron 120 mg de perlas de vidrio lavadas con acido a cada tubo; (vi) cada tubo fue sometido a vortex durante 3 minutos a velocidad maxima (~3000 rpm); (vii) se colocaron alicuotas de 50 pL de muestra lisada en un tubo que contenia mezcla maestra para PCR; (viii) reacciones de ciclos de PCR como sigue: (desnaturalizacion inicial: 95°C, 3 minutos; 30-40 ciclos a 95°C, 20 segundos; 30-40 ciclos a 62°C, 30 segundos; 3040 ciclos a 68°C, 20 segundos; extension final: 68°C, 10 minutos; inmersion final: 4°C; (ix) cada una de las muestras fue centrifugada brevemente despues de la termociclizacion para formar una pella de sangre coagulada; (x) se pusieron alicuotas de 5 pL de mezcla maestra de particulas en el tubo para cada 10 pL de muestra amplificada; (xi) la mezcla resultante fue bien mezclada y la muestra fue desnaturalizada a 95°C durante 3 minutos; (xii) la muestra fue hibridada a 60°C durante 1 hora con agitacion suave; (xiii) la muestra fue diluida entonces a 150 uL con regulador para dilucion de particulas, y equilibrada a 37°C en un bloque de calentamiento durante 1 minuto; y (xiv) el T2 de la muestra fue medido utilizando un lector de MR para T2.
Resultados de la prueba
Repetibilidad de la deteccion de Candida albicans en sangre humana entera: Para determinar la repetibilidad de la medicion de T2 en sangre humana entera infectada con C. albicans, se llevo a cabo un estudio de ocho dias con el mismo donante cuya muestra fue sembrada y amplificada hibridada a las particulas superparamagneticas (n=3) 5 cada dia y se registraron los valores de T2 resultantes.
La precision del procedimiento se muestra en la figura 46A y en general se ajusta con los CV de todas las mediciones menores de 12%. La repetibilidad observada en el transcurso de los ocho dias se muestra en la figura 46B con CVs menores de 10% a traves del rango de concentraciones de Candida y 6% para el control negativo. De manera importante, se aplico una poblacion dos de dos colas de la prueba T de Student para determinar si la 10 diferencia en promedios entre la sangre infectada con Candida a 10 celulas/mL y la sangre del donante saludable era significativa. Los resultados se resumen en la Tabla 9.
Tabla 9. La diferencia en promedio entre sangre infectada con 10 celulas/mL y control negativo es significativa (valor
p <0.0001)
Valor P
<0.0001
^Son promedios significativamente diferentes? (P <0.05)
Si
^Valor P de una o dos colas?
Dos colas
Valor P
<0.0001
t, df
t=40.69 df=23
Numero de pares
24
Promedio de diferencias
287.7
Intervalo de confidencia 95%
273.0 a 302.3
Cuadrado R
0.9863
Influencia de la matriz de muestra sobre la deteccion y reproducibilidad de Candida albicans y Candida krusei: 15 sangre saludable de 6 donantes fue sembrada con un rango de celulas de C. albicans o C. krusei (1E5 celulas/mL a 0 celulas/mL). De la sangre sembrada con Candida albicans, se llevaron a cabo diez y seis experimentos independientes. Cada experimento consistio de amplificacion por PCR de las 1E5 a 0 celulas/mL sembradas en sangre con cada reaccion de amplificacion sometida a tres experimentos replicados de deteccion de T2; asi para C. albicans se registro un total de 48 valores de T2 a cada concentracion probada (vease figure 48A). A la 20 concentracion de prueba mas baja (10 celulas/mL) no se detecto Candida albicans el 37% del tiempo (6 de 16 experimentos); sin embargo a 100 celulas/mL se detecto Candida albicans el 100% de las veces. Esto sugiere que el LOD para C. albicans esta por encima de 10 celulas/mL pero por debajo de 100 celulas/mL. Se probaran mas concentraciones entre 10 CFU a 100 celulas/mL para definir mejor el LOD; sin embargo no esperamos observar efectos mayores de la matriz sobre el rendimiento del ensayo. Esto esta evidenciado por los CVs de las mediciones 25 de T2 que son como sigue: 12.6% a 1E5 celulas/mL en sangre de 6 donantes, 13.7% a 1E4 celulas/mL, 15% a 1E3 celulas/mL, 18% a 1E2 celulas/mL y 6% a 0 celulas/mL. Esto sugiere que el ensayo puede detectar de manera confiable a concentraciones de C. albicans mayores que o igual a 100 celulas/mL sin inhibicion principal del rendimiento introducida a traves de la muestras de sangre de los donantes.
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Se llevo a cabo el mismo experimento utilizando una cepa de referenda de C. krusei. En este caso se llevaron a cabo 7 experimentos independientes puesto que la sangre sembrada remanente estaba reservada para analisis de cultivo de sangre. No hubo deteccion a 10 celulas/mL en ninguno de los experimentos pero hubo deteccion a 100 celulas/mL para todas las ejecuciones de experimentos. Esto sugiere el LOD entre 10 y 100 celulas/mL. De nuevo una titulacion de concentraciones celulares entre 100 y 10 celulas/mL sera necesaria para una mejor definicion del LOD. Las CVs de las mediciones a traves del campo de concentraciones fue: 10.5% a 1E5, 9% a 1E4, 12% a 1E3, 20% a 1E2, 6.4% a 10, y 5.2% a 0 celulas/mL. Los resultados se muestran en la figura 48B.
Determinacion preliminar de limite de deteccion: Se sembraron cinco aislados cllnicos de Candida albicans en 6 diferentes muestras de sangre de donantes a concentraciones de 1E4, 1 E3, 5E2, 1E2, 50, 10, 5, y 0 celulas/mL. Cada aislado fue sembrado en un mlnimo de dos diferentes muestras de sangre de donantes. Las reacciones de amplificacion fueron detectadas a traves de una medicion de T2 con los resultados representados graficamente en la figura 49. Es importante anotar que no se eliminaron datos por causas dentro de este estudio. No se detecto C. albicans el 50% de las veces a 5 celulas/mL o 10 celulas/mL; sin embargo a 50 celulas/mL se detecto C. albicans en el 95% de las veces. Estos datos fueron generados usando diferentes aislados cllnicos. Cada aislado contiene un numero diferente de repeticiones de ADNr y el numero de estas repeticiones puede variar tanto como 4 veces de cepa a cepa (esto es ~50 unidades a 200 unidades). Puesto que los numeros de copias diana introducidos variaran ligeramente de cepa a cepa y ciertamente de especie a especie, habra diferencias sutiles en los valores T2 absolutos observados a numeros celulares muy bajos (esto es 10 celulas/mL). Con base en este estudio muy preliminar, los datos sugieren un corte de 10 celulas/mL; sin embargo esta determinacion no puede hacerse en ausencia de las formulaciones finales de reactivos as! como del instrumento/cartucho. Sugiere que definir el intervalo de C5-C95 sera diflcil porque a 10 celulas/mL cada reaccion contiene solo 4 celulas. La titulacion a numeros de celulas inferiores a este es un reto con este volumen de introduccion de sangre. Utilizando la distribution de Poisson para calcular el numero de reacciones que contendrlan 0 celulas a 10 celulas/mL hay indication que solamente el 2% de las reacciones no contendrlan celulas; sin embargo a 5 celulas/mL, el 13% de las reacciones no contendran celulas de Candida, a 2 celulas/mL, ~el 37% de las reacciones no contendrlan celulas de Candida. Para incrementar la sensibilidad del ensayo a 95% a 10 celulas/mL, podrlamos incrementar la cantidad de lisado agregado a las reacciones de PCR de 40 pL a 50 pL e incrementar la cantidad de sangre del paciente de 400 pL a 800 pL/reaccion.
Determinacion preliminar de sensibilidad/especificidad: Inicialmente, la cuantificacion de las unidades formadoras de colonia de Candida introducida fue llevada a cabo utilizando un hemocitometro; sin embargo en este caso el operador conto celulas hijas adheridas como celulas separadas. Puesto que nuestros datos se reportan en unidades formadoras de colonia/mL y no en celulas/mL, las adhesiones no deberlan ser cuantificadas. Debido a este error, hay pocas celulas/mL de Candida presentes en las diversas concentraciones de siembra y nuestra sensibilidad a 10 celulas/mL fue solamente de 90%, mientras que nuestra especificidad fue del 100%. A 25 celulas/mL o mayor observamos 100% de sensibilidad y 100% de especificidad. En todos los casos, los viales de cultivo de sangre inoculados con celulas de Candida fueron positivos a cultivo en sangre en el dla 8. Deberla notarse que los parametros habituales para cultivos de sangre es incubation durante 5 dlas; sin embargo necesitamos extender este tiempo de incubacion puesto que muchos de nuestros inoculos requirieron >5 dlas de incubacion. Como ejemplo, la Tabla 10 muestra el tiempo desde la inoculation a cultivo positivo registrado para cuatro diferentes aislados cllnicos de C. albicans inoculados en cultivos de sangre.
Los resultados de las mediciones de T2 llevados a cabo en allcuotas de 800 pL a partir de estas muestras de sangre entera sembradas se muestran en la Tabla 10B. En todos los casos fuimos capaces de detectar 25 celula/mL, o mas, sin embargo fuimos incapaces de detectar el aislado cllnico C3 a 12 celulas/mL. Es importante anotar que las CFU fueron cuantificadas a traves de hemocitometrla y no un contador Coulter para este experimento de comparacion de metodo particular. En total se inocularon 51 botellas de cultivo de sangre con aislados cllnicos de Candida albicans cuantificados por hemocitometrla y 35 viales de cultivo de sangre negativos fueron incluidos en el experimento. Los resultados para inoculos mayores de 25 celulas/mL se muestran en la tabla de contingencia de la Tabla 11.
Tabla 10A. Tiempo de resultados positivos en cultivo de sangre para 4 aislados cllnicos diferentes de Candida albicans
Aislado de C. albicans
100 CFU/mL 25 CFU/mL 12 CFU/mL 0.0 0.0
C1
161 horas+/-12 161 horas+/-12 161 horas+/-12 192 horas 192 horas
C2
40 horas +/- 12 65 horas +/- 12 47.5 horas 192 horas 192 horas
Aislado de C. albicans
100 CFU/mL 25 CFU/mL 12 CFU/mL 0.0 0.0
C3
69.5 horas 161 horas+/-12 161 horas+/-12 192 horas 192 horas
C4
40 horas +/- 12 43 horas 47.5 horas 192 horas 192 horas
*Nota: todos los viales negativos en cultivo de sangre fueron negativos y descartados a t=8 dlas
Tabla 10B. Valores T2 obtenidos siguiendo amplificacion por PCR y deteccion de T2 sobre el precultivo en muestras de sangre sembradas in vitro mostradas mas arriba (tiempo de ensayo ~3 horas).
Aislado de C. albicans
100 CFU/mL 25 CFU/mL 12 CFU/mL 0.0 0.0
C1
739.0 409.0 632.5 112.7 112.8
C2
983.2 1014.5 997.6 117.4 114.8
C3
912.7 510.5 113.3 116.2 112.0
C4
807.6 741.2 665.2 119.1 115.9
Valores T2 (en msegundos) son la media n=3 con CV menor de 10% para mediciones de replicados
Tabla 11. Tabla de contingencia usada para calcular sensibilidad/especificidad a >25 celulas/mL de C. albicans
Positivo
51 (verdadero positivo) 0 (falso negativo) 51 (TP+FN)
Negativo
0 (falso negativo) 35 (verdadero positivo) 35 (FN+TN)
Total
51(TP+FN) 35 (FN+TN) 86 (N)
Sensibilidad estimada=100x[TP/(TP+FN)]= 100% (95% de confidencia intervalo= 93 a 100%) Especificidad estimada=100x[TN/(FP+TN)]= 100% (95% de confidencia intervalo= 90 a 100%)
La estandarizacion de la cuantificacion de CFU a mejorado la sensibilidad y reproducibilidad del ensayo. Los 5 resultados preliminares de 27 botellas de cultivo de sangre se muestran en la Tabla 12. Estos resultados preliminares indican que se obtiene 100% de sensibilidad y especificidad a 10 celulas/mL o mayor. Se han empezado adicionalmente comparaciones de metodo utilizando C. krusei. Los resultados preliminares (de 36 viales) se muestran en la Tabla 13. Los resultados indican que hay una sensibilidad/especificidad de 88%/100% a 10 celulas/mL, o mayor y 100% de sensibilidad/100% de especificidad a 33 celulas/mL o mayor para Candida Krusei.
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Otro cambio importante que fue instituido antes de las nuevas comparaciones de acuerdo de cultivo en sangre fue el empleo de una partlcula de microsonda. En este caso la reacciones de aglomeracion T2 para la deteccion de C. albicans fueron llevadas a cabo utilizando partlculas multifuncionales de albicans/parapsilosis/tropicalis mientras que se detecto C. krusei utilizando las partlculas multifuncionales de glabrata/krusei.
Tabla 12. Tabla de contingencia usada para calcular sensibilidad/especificidad a >10 celulas/mL de C. albicans
Positivo
18 (verdadero positivo) 0 (falso positivo) 18 (TP+FP)
Negativo
0 (falso negativo) 6 (verdadero negativo) 6(FN+TN)
Total
18(tp+fn) 6 (FN+TN) 24 (N)
Sensibilidad estimada=100x[TP/(TP+FN)]= 100% (95% de confidencia intervalo= 81.4 a 100%) Especificidad estimada=100x[TN/(FP+TN)]= 100% (95% de confidencia intervalo= 54 a 100%)
Tabla 13. Tabla de contingencia para calcular sensibilidad/especificidad a >10 celulas/mL de Candida krusei
Positivo
24 (verdadero positivo) 0 (falso positivo) 24 (TP+FP)
Negativo
3 (falso negativo) 9 (verdadero negativo) 12(FN+TN)
Total
27 (TP+FN) 9(FP+TN) 36 (N)
Sensibilidad estimada=100x[TP/(TP+FN)]= 89% (95% de confidencia intervalo= 71 a 98%) Especificidad estimada=100x[TN/(FP+TN)]= 100% (95% de confidencia intervalo= 66 a 100%)
Establecimiento preliminar de la exactitud cllnica: La exactitud cllnica se define como la capacidad de discriminar entre dos o mas estados cllnicos, por ejemplo Candidemia versus no Candidemia. Las graficas de caracterlstica del operador receptor (ROC) describen el rendimiento de la prueba graficamente ilustrando la relacion entre sensibilidad (fraccion de verdadero positivo) y especificidad (fraccion de verdadero negativo). La exactitud cllnica (pares sensibilidad/especificidad) se representa para el espectro entero de niveles de decision. Utilizando los datos generados a partir de las muestras de sangre entera sembradas con los aislados cllnicos de 10 celulas/ml y 50 celulas/mL, se generaron dos graficas de ROC como se muestra en las figuras 50A y 50B. El area bajo la curva se utiliza frecuentemente para cuantificar la exactitud del diagnostico; en este caso nuestra habilidad para discriminar entre un paciente candidemico con una infeccion de 10 celulas/mL o 50 celulas/mL versus un paciente sin candidemia. A 10 celulas/mL el area bajo la curva es 0.72 lo que significa que si el ensayo de T2 fue llevado a cabo en una persona escogida aleatoriamente con candidemia a un nivel de infeccion de 10 celulas/mL, hay una oportunidad de 72% de que su valor T2 sea mas alto que el de una persona sin candidemia. La exactitud cllnica de la prueba es mucho mas alta a 50 celulas/mL con el area bajo la curva a 0.98. De nuevo con la indicacion de que en una persona con candidemia a este nivel de infeccion, el ensayo de T2 darla un valor mas alto que una muestra de un paciente sin candidemia al 98% de las veces. Esta es una exactitud cllnica excelente para niveles de infeccion de 50 celulas/mL. Las graficas de ROC no fueron preparadas para las muestras de 100 celulas/mL superiores puesto que el area se trasladarla a 100% de exactitud diagnostica cllnica. La exactitud cllnica final se determina a partir de muestras de pacientes reales sobre la plataforma cllnica.
Tiempo de evolucion del ensayo: Las etapas de ensayo primario con tiempos estimados son: (i) lisis hipotonica/centrifugacion/agitacion con perlas (8 minutos); (ii) pCr (120 minutos); (iii) hibridacion de amplicon a partlculas (30 minutos); (iv) hMAA (10 minutos); y (v) transferencia y lectura (10 segundos). El tiempo del
procesamiento para el ensayo se estima en ~178 minutos (aproximadamente 3 horas), excluyendo la preparacion de reactivos y equipos. Este es el flujo de trabajo utilizado para la cuantificacion; sin embargo se ha demostrado que el siguiente flujo de trabajo modificado con etapas de PCR e hibridacion mas cortas producen la misma sensibilidad de deteccion (vease figura 51) (si bien con una reduction en la cantidad de amplicon generado a partir de algunas 5 especies de Candida (esto es, glabrata) y por lo tanto un delta T2 mas pequeno entre enfermos y normales): (i) lisis hipotonica/centrifugacion/agitacion con perlas (8 minutos); (ii) PCR (70 minutos); (iii) hibridacion de amplicon a partlculas (30 minutos); (iv) hMAA (10 minutos); y (v) transferencia y lectura (10 segundos). Este flujo modificado genera un TAT de 133 minutos o 2 horas y 13 minutos (y esto es sin migration a un termociclador mas rapido).
Conclusiones
10 Estas pruebas demuestran un ensayo de diagnostico molecular basado en T2 actual para Candidemia con la siguiente metrica: (i) deteccion de Candida albicans en sangre entera a un rango que varia de 5-1E5 celulas/mL (5- log); (ii) deteccion de Candida krusei en sangre entera a un rango que varia de 10 celulas/mL a 1E5 celulas/mL; (iii) sensibilidad/especificidad de 100%/100% a >25 celulas/mL; (iv) exactitud de diagnostico de mas de 98% para concentraciones >50 celulas/mL; (v) compatibilidad de ensayo con sangre entera (sin efectos mayores de matriz 15 observados usando doce muestras de sangre de donantes diferentes); (vi) repetibilidad de mediciones de T2 (menos de 12% dentro del mismo dla y menos de 13% a lo largo de ocho dlas); y (vii) tiempo de evolution del ensayo total reducida a 2 horas 3 minutos.
Se han probado volumenes de entrada mas altos de sangre humana y se ha encontrado que la lisis hipotonica eficiente se logra con estos volumenes de sangre mas altos; adicionalmente se ha incrementado la reproducibilidad 20 de la deteccion a 10 celulas/mL.
La contamination fue observada en 2 muestras de las 50 titulaciones. Para reducir los problemas de contamination, las etapas de PCR pueden ser separadas de las etapas de deteccion. Adicionalmente, pueden utilizarse metodos qulmicos/bioqulmicos para hacer que los amplicones sean inamplificables. Por ejemplo, pueden incorporarse uracilos en el producto de PCR, y puede llevarse a cabo una incubation pre-PCR con uracil N-glicosilasa.
25 Las ventajas de los metodos de la invention incluyen la capacidad de probar muestras de sangre entera sin separar protelnas y acidos nucleicos no diana de la muestra. Puesto que no se incurre en perdidas de acidos nucleicos diana a traves de la purification de ADN (por ejemplo, corriendo columnas Qiagen despues de la lisis y antes de la amplification da como resultado >10x de perdidas en sensibilidad, y el uso de sangre entera interfiere con los metodos de deteccion optica a concentraciones por encima de 1%), la variabilidad y las desviaciones de muestra a 30 muestra (que pueden ser introducidas por la purificacion de ADN) son minimizadas y se maximiza la sensibilidad.
Mas del 10% de los pacientes en choque septico son portadores de Candida; este es el tercer patogeno mas prevalente despues de S. aureus y E. coli, y hay una rata de mortalidad de aproximadamente del 50% para pacientes en choque septico infectados con Candida. La Candida es la cuarta causa de infecciones adquiridas en el hospital. La identification rapida de estos pacientes es crltica para seleccionar reglmenes de tratamiento apropiado.
35 Ejemplo 18. Ensayo viral
El ADN genomico de CMV fue sembrado en muestras de sangre de donantes saludables libres de CMV, 40 pL de esta sangre sembrada fue llevada en allcuota a un volumen total de reaction de PCR de 100 pL. La amplificacion fue llevada a cabo utilizando una ADN polimerasa termofilica compatible con sangre entera (T2 Biosystems, Lexington, MA) y cebadores universales de ejemplo que fueron disenados como sigue: secuencia especifica 40 extremo-enlazante C6-CMV de 24 unidades siendo las secuencias exactas las siguientes:
5'-CAT GAT CTG CTG GAG TCT GAC GTT A-3' (SEQ ID NO. 11, sonda de cola universal #1) 5'-GCA GAT CTC CTC AAT GCG GCG-3' (SEQ ID NO. 12, sonda de cola universal #2) 5'-CGT GCC ACC GCA GAT AGT AAG-3' (SEQ ID NO. 13, CMV US8 cebador de avance) 5'-GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG-3' (SEQ ID NO. 14, CMV US8 cebador de reversa)
45 Los cebadores fueron disenados de tal manera que las sondas de captura (esto es, el acido nucleico que decora la particula magnetica) se fusionaria a la region de la unidad 10 (las unidades 10 son diferentes del extremo 5' o 3'). La concentration de cebador final en el tubo de reaccion fue de 300 nM y la mezcla maestra de PCR que incluia (NH4)2SO4 5 mM, MgCl2 3.5 mM, glicerol al 6%, Tricina a 60 mM (pH 8.7)). Se utilizaron cinco tubos de reaccion de muestra separados. Las reacciones del ciclo de PCR siguieron una desnaturalizacion inicial a 95°C durante 3 50 minutos, y cada ciclo consistio de 95°C, 20 segundos; 55°C, 30 segundo; y 68°C, 20 segundos. A 30, 33, 36, 39, y 42 ciclos los tubos de reaccion fueron retirados y mantenidos a 4°C. Una vez que todas las muestras estaban listas, se separaron alicuotas de 5 pL de mezcla maestra de particulas (6xSSC, formamida al 30%, Tween al 0.1%) en el tubo por cada 10 pL de la muestra amplificada. La mezcla resultante fue bien mezclada y la mezcla desnaturalizada a 95°C durante 3 minutos; la muestra fue hibridada a 45°C durante 1 hora con agitation suave; la muestra fue
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entonces diluida a 150 |jL con regulador de dilucion de partlcuias (PBS, Tween al 0.1%, BSA al 0.1%), colocada en un magneto hMAA controlado en temperatura durante 10 minutos, y equilibrado a ST'S en un bloque de calentamiento durante 1 minuto: y el tiempo de relajacion T2 para cada una de las cinco muestras separadas fue medido utilizando un lector de MR de T2 (vease figura 52).
Los cebadores fueron disenados para permitir que las partlculas magneticas cubiertas con sondas de captura para fusionarse a la region de 10 unidades (10 unidades son diferentes a los extremos 5' o S'), proveyendo partlculas con una arquitectura universal para la agregacion con cebadores de amplificacion especlficos.
Los resultados provistos en la figura 52 muestran que los metodos de la invencion pueden ser utilizados para llevar a cabo PCR en tiempo real y proveer informacion cuantitativa acerca de cantidad de acido nucleico diana presente en una muestra de sangre entera.
Ejemplo 19. PCR en tiempo real
Los resultados previos mostraron que cuando hay presentes partlculas en la reaccion de PCR la produccion de amplicon fue inhibida. Se genero la hipotesis de que moviendo las partlculas al lado del tubo de reaccion durante la termociclizacion se permitira la produccion de amplicon. Se diseno un separador magnetico simple/inserto de bloque de PCR (figura 53) para mantener las nanopartlculas sobre las paredes laterales durante la reaccion de PCR, minimizando as! la interferencia y la exposicion de las partlculas a los componentes de reaccion de PCR. Al retirar el campo magnetico, las partlculas pueden ser resuspendidas completamente en la mezcla de reaccion.
En un experimento, se probo la rata a la cual las partlculas serian secuestradas al lado del tubo y retornadas a la solucion. En este experimento, 100 jL de la mezcla de partlculas de C. albicans (S' y 5') en 1x TE (~50 msegundos de llnea base T2 desaglomerada) sufrieron tres veces el proceso de aglomeracion/desaglomeracion a 95°C. Esto fue seguido por el siguiente protocolo
1. vortex, incubacion a 37°^ durante 1 minuto, medi cion de T2;
2. calentamiento a 95°^ durante 5 minutos sobre el inserto de PCR magnetico;
3. incubacion a 37°^ durante 1 minuto, medicion de T2;
4. vortex 15 segundos, incubacion a 37°^ durante 1 minuto, medicion de T2; y
5. ir a la etapa 2.
Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 14 a continuacion.
Ciclo #
1 2 3 4
Tubo 1
147.1 150.8 154.9 140.9 T2 desaglomerado
2198.6 1965.6 2161.4 T2 aglomerado a 95°C
% incremento T2
1494.2 1303.5 1395.1 Promedio % 1397.6
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Ciclo #
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Tubo 2
143.5 147.4 150.4 144.2 T2 desaglomerado
2240.7 2141.3 2086.5 T2 aglomerado a 95°C
% incremento T2
1561.4 1452.9 1386.9 Promedio % 1467.1
Como se muestra en la Tabla 14, la aglomeracion de nanopartlculas completamente reversibles se demostro a 95°C al utilizar el separador magnetico probado. Las partlculas son estables a 95°C durante al menos 3 ciclos de aglomeracion/desaglomeracion.
A continuacion se probo la eficiencia de PCR en la presencia de nanopartlculas en la solucion de reaccion. El PCR fue llevado a cabo bajo dos condiciones: (1) las partlculas estan completamente dispersas en solucion; y (2) las nanopartlculas estan concentradas en las paredes laterales del tubo de prueba de PCR utilizando el inserto magnetico.
Se disenaron tres reacciones de PCR (con nanopartlculas concentradas en la pared del tubo de prueba; completamente dispersas en solucion; y sin nanopartlculas) usando ADN genomico de C. albicans como material de partida. La amplificacion exitosa del aDn diana fue validada utilizando electroforesis en gel. Se utilizaron partlculas Seramag cubiertas con sonda de captura.
Se disenaron reacciones de PCR asimetricas (4:1) utilizando mezcla de PCR prehecha y sin copias de ADN genomico de C. albicans como material de partida. Se agrego mezcla de partlculas de captura de C. albicans (3' y 5') en 1x TE a las reacciones (1) y (3) (llnea base ~150 msegundos). La reaccion de control (2) no tenia nanopartlculas agregadas (figura 54).
No se observo diferencia en la formacion de productos en PCR cuando habla nanopartlculas presentes en solucion (dispersada en solucion o concentradas sobre las paredes laterales del tubo mediante campo magnetico) durante la reaccion de PCR. Sin embargo, las nanopartlculas modificadas con zonas de captura no interfieren con el PCR. Se generaron cantidades comparables de producto en las reacciones con y sin nanopartlculas presentes en solucion como fue evidenciado por la electroforesis en gel. Tambien la concentracion magnetica de las nanopartlculas sobre las paredes laterales del tubo durante el proceso de PCR no tiene efecto sobre el PCR.
Ejemplo 20. Controles internos para C. albicans
Una variedad de impurezas y componentes de la sangre entera pueden ser inhibidores para la fusion de la polimerasa y el cebador. Estos inhibidores pueden llevar a la generacion de falsos positivos y bajas sensibilidades. Para asegurar que los especlmenes cllnicos son amplificados y detectados exitosamente, el ensayo puede incluir un acido nucleico de control interno que contiene regiones de enlazamiento al cebador identicas a los de la secuencia diana. El acido nucleico diana y el control interno se seleccionan de tal manera que cada uno tiene una region de enlazamiento unica a la sonda que diferencia el control interno del acido nucleico diana. El control interno puede ser un control de inhibicion que esta disenado para coamplificar con el acido nucleico diana que esta siendo detectado. El fallo del control de inhibicion interno para ser amplificado se evidencia de un fallo de reactivo o error de proceso. Pueden disenarse cebadores universales de tal manera que la secuencia diana y la secuencia de control interno son amplificadas en el mismo tubo de reaccion. Asl, al usar este formato, si el ADN diana es amplificado pero el control interno no lo es se asume entonces que el ADN diana esta presente en una cantidad proporcionalmente mayor que el control interno y el resultado positivo es valido puesto que la amplificacion del control interno es innecesaria. Si, por el otro lado, ni el control interno ni la diana son amplificados se asume entonces que ha ocurrido inhibicion de la reaccion de PCR y que la prueba para esa muestra particular no es valida.
La secuencia de Candida albicans ya amplificada y detectada fue examinada para su uso en la generacion de un control interno. Las secuencias de cebador universal fueron retiradas extremo 5' y 3'. La secuencia interna residual fue sometida a un generador de secuencias aleatorio y se genero una secuencia aleatoria. Las secuencias del cebador universal fueron reemplazadas en los extremos y la secuencia de control interno completa fue clonada en pCR2.1-TOPO y se verifico la secuencia.
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Al disenar estos controles internos, los siguientes criterios y caracterlsticas para uso en ensayos de PCR fueron empleados: 1) el ADN diana y de control interno compartieron los mismos cebadores; 2) el ADN de control interno y la diana son facilmente distinguibles (esto es, diferentes sondas de captura); 3) las eficiencias de amplificacion sobre la diana y el control interno han sido probadas y son aceptables; 4) la fuente del control interno es un ADN plasmido que porta la secuencia de control interno clonada; 5) el control interno es detectado por hibridacion dependiente de la secuencia; 6) el plasmido de control interno esta altamente purificado; 7) la concentracion del control interno es determinada por titulacion; 8) el plasmido de control interno es agregado a la mezcla de PCR para asegurar una distribucion igual a todos los tubos de PCR; 9) se ha determinado la cantidad de control interno en los tubos de reaccion de ensayo es de 100-1000 copias/reaccion y esta concentracion ha sido determinada como la cantidad mas baja que todavla provoca una amplificacion a traves de la senal. Vease Hoofar et al., J. Clin. Microbiol. 42:1863 (2004).
El control de inhibicion interno para el ensayo de Candida fue disenado para coamplificar con los cebadores de PCR Pan Candida y contiene una secuencia de intervention unica de longitud y composition en bases similar a la de las especies de Candida. La secuencia de intervencion fue desarrollada aplicando un algoritmo de aleatorizacion de secuencia a la secuencia del amplicon de C. albicans. Cuatro secuencias aleatorizadas fueron entonces caracterizadas termodinamicamente y bioinformaticamente. Se llevo a cabo una busqueda de nucleotidos megaBLAST para cada secuencia utilizando tanto las bases de datos genomicas humanas + transcripto as! como la base de datos nr. No se identificaron alineamientos significativos con las cuatro secuencias de interrogation en ninguna base de datos. Cada secuencia fue sometida entonces a analisis UNAfold para determinar el grado de estructura secundaria presente en la concentracion de hibridacion de cation monovalente (600 mM) una temperatura de 60 grados centlgrados. Se excluyeron dos secuencias en este punto debido a la presencia de tallos extensivos bajo estas condiciones de hibridacion. Dos fueron caracterizadas posteriormente para determinar si las sondas de captura podrlan ser disenadas complementarias a los extremos 5' y 3' de la cadena amplificada en exceso lo que seria impedido por tramos poli-G, y tienen bajas probabilidades de formar homo y heterodlmeros. Una secuencia satisfizo todos los criterios y fue ordenada como un oligonucleotido sintetico purificado PAGE y su respectivo complemento de IDT Technologies (Coralville, IA). La secuencia del control interno que sera amplificada en exceso es:
5- GGC ATG CCT GTT TGA GCG TCC TGC ATC ATA CTG AAA TAG ATC CTT CGA CAA CCT CGG TAC ACT GGG AAC AAG GCC TCA AAC ATT GAT GCT CGA CTA CAC GTA GGG CAATGC GTC TTG CTA GAA GCG AAA TCT GTG GCT TGC TAG TGC AAG CTG GTC GGC GTA TTA TTC CAA CCC GCT GAA CTT AAG CAT ATC AAT AAG CA-3 (SEQ ID NO. 15)
La secuencia complementaria fusionada es:
5- GCT TAT TGA TAT GCT TAA GTT CAG CGG GTT GGA ATA ATA CGC CGA CCA GCT TGC ACT AGC AAG CCA CAG ATT TCG CTT CTA GCA AGA CGC ATT GCC CTA CGT
GTA GTC GAG CAT CAA TGT TTG AGG CCT TGT TCC CAGTGT ACC GAG GTT GTC GAA GGATCT ATT TCA GTA TGA TGC AGG ACG CTC AAA CAG GCATGC CA -3 (SEQ ID NO. 16)
5 uM del duplex fusionado en 2x SSC fue enviado a SeqWright para subclonar y secuenciar. Los duplex fusionados contenlan sobrantes de adenosina 3' para facilitar la donation a un vector de donation TA. Este constructo fue clonado en PCR2.1-TOPO. Por transformation, se seleccionaron 5 clones y se secuenciaron para confirmar la presencia del inserto correcto. Por verification del inserto clonado correcto, el ADN de plasmido minipreparado fue digerido con EcoRV y Hindlll y el inserto fue subclonado en pBR322. A partir de esta transformacion, se seleccionaron 5 transformantes y el inserto fue verificado a traves de secuenciacion. Dos huespedes de E. coli que portaban el pBR322-IC fueron congelados en glicerol al 30% + LB amp. Se llevo a cabo una maxipreparacion de plasmido utilizando el Qiagen y produjeron ~1 mg de ADN de plasmido purificado.
Las sondas de captura fueron disenadas para hibridar anidadas a las secuencias de cebador de PCR de Pan Candida. Una sonda de captura aminada en 3' con un enlazante T-9 fue disenada para complementareidad con el extremo 5' de la cadena amplificada en exceso. Una sonda de captura aminada en 5' con un enlazante C12 T-9 fue disenada complementaria al extremo 3' de la cadena amplificada en exceso. Estas secuencias se muestran a continuacion:
GGT TGT CGA AGG ATC TAT TTC AGT ATG ATG CAG-TTT TTT TTT-3'Amino (SEQ ID NO. 17)
5'Amino-C12-TTT TTT TTT- TGG AAT AAT ACG CCG ACC AGC TTG CAC TA (SEQ ID NO. 18)
Las temperaturas de fusion predichas (Allawi, 1997) fueron 75 y 78°C, respectivamente.
Ejemplo 21. gMAA rotatorio.
Se disenaron tres configuraciones de gMAA rotatorias prototipo, construidas y probadas con comparacion a la gMAA convencional basada en placa (vease la figura 56A). Las tres configuraciones inclulan exposiciones a campo 5 magnetico variables-lado-fondo; lado-nula y fondo-nula. La gMAA basada en placa utilizada para la comparacion es la lado-fondo estandar. Se evaluo el rendimiento funcional del ensayo (enlazamiento y aglomeracion no especlficos) utilizando el sistema de ensayo de aglomeracion de creatinina. Las partlculas derivadas con anticuerpo de creatinina fueron mezcladas con suero diluido 1:5 y aglomerante de creatinina dextrano. El aglomerante fue probado a 6 concentraciones para proveer una curva de calibration. Cada nivel de concentration fue probado en triplicado. El T2 10 de las muestras sin aglomerante fue medido antes y despues del gMAA para establecer enlazamiento no especlfico. Se llevo a cabo gMAA a temperatura ambiente para un total de 12 minutos con 1 minuto de residencia en las estaciones de magneto.
Con respecto al enlazamiento no especlfico, todas las configuraciones rotatorias produjeron resultados aceptables (<10% diferencia) y fueron comparables a la gMAA de placa convencional.
15 Con respecto a la formation de agregados, todos los dispositivos gMAA rotatorios produjeron agregacion. La configuracion lado-fondo rotatoria proveyo la senal T2 mas alta una concentracion de aglomerante dada, seguida por la configuration de placa lado-fondo de comparacion. La configuration lado-nula rotatoria provee una senal equivalente a la placa de lado-fondo; y la fondo-nula produce la senal mas baja (vease figura 56B).
Ejemplo 22. Ensayo de Candida y datos clfnicos
20 Una prueba de diagnostico molecular rapida, exacta y reproducible fue desarrollada para la detection de cinco especies de Candida directamente en sangre humana con un llmite de deteccion (LOD) de 10 celulas/mL y un tiempo de resultado de menos de 2 horas. El rendimiento cllnico del ensayo fue determinado utilizando 32 especlmenes cllnicos ciegos y en este estudio se observo una concordancia de 100% positivo y 100% negativo en cultivos de sangre mientras que se identificaba exactamente la especie de Candida causante en un 100% de las 25 muestras de pacientes candidemicos. Aplicamos adicionalmente el ensayo a especlmenes de sangre extraldos de pacientes positivos por Candida y se observo un descenso en la deteccion de Candida concordante con el transcurso del tiempo del tratamiento antifungico. Este metodo diagnostico es rapido, apropiado para la automatization, y ofrece a los medicos la oportunidad de detectar multiples patogenos humanos con especlmenes biologicos complejos.
30 Relaxometro de resonancia magnetica
Se diseno un sistema de resonancia magnetica (MR) compacto y se construyo para mediciones de relajacion T2 precisas con el fin de llevar a cabo el ensayo previsto bajo las condiciones descritas. Este sistema se mantuvo a 37°C a traves de control de temperatura y contiene un magneto permanente de samario cobalto de aproximadamente 0.5 T, correspondiente una frecuencia de protones de operation de 22-24 MHz. Todos los 35 componentes MR estandar: sonda de radiofrecuencia, preamplificador de ruido bajo y electronica transmisora, tablero de espectrometrla, as! como el hardware de control de temperatura estan empacados en el sistema. El sistema utiliza entrada de energla AC estandar y se conecta a un ordenador externo a traves de Ethernet. Una interfaz de usuario grafica amigable permite que s usuarios definan los parametros experimentales.
El sistema ha sido disenado para aceptar muestras en tubos de PCR estandar de 0.2 ml. La electronica as! como la 40 bobina fueron optimizados para mejorar la precision de la medicion de los volumenes de muestra aplicables, permitiendo alcanzar un rendimiento en barrido simple para ejecutar CVs en T2 de menos de 0.1%. La variabilidad de instrumento a instrumento esta por debajo de 2% con requerimientos de tolerancia mlnimos sobre los componentes del sistema y sin calibracion.
Conjugation y caracterizacion del sensor de nanopartlculas
45 Partlculas superparamagneticas de oxido de hierro carboxiladas de 800 nm, consistentes de numerosos nanocristales de oxido de hierro embebidos en una matriz polimerica que incluye un diametro de partlcula total de 800 nm (vease Demas et al., New J. Phys. 13:1 (2011)), fueron conjugadas a oligonucleotidos de ADN aminados utilizando qulmica de carbodiimida estandar. Las nanopartlcuals derivadas de ADN fueron almacenadas a 4°C en 1x Tris-EDTA (pH 8), Tween-20 al 0.1%. La concentracion en hierro de los conjugados de nanopartlculas fue medida 50 disolviendo la partlcula con HCl 6 M seguido por la adicion de clorhidrato de hidroxilamina y 1,10 O-fenantrolina y deteccion espectrofotometrica subsecuente como lo describe Owen et al., J. Immunol Methods, 73:41 (1984). Las partlculas derivadas con oligonucleotidos fueron sometidas entonces una prueba de comportamiento funcional llevando a cabo reacciones de aglomeracion inducidas por hibridacion utilizando dianas de oligonucleotidos
sinteticas diluidas identicas en secuencia a las secuencias ITS2 fungicas de las cinco diferentes especies de Candida dentro de un regulador de hibridacion de fosfato de sodio 4xSSPE (NaCI 600 mM, fosfato de sodio 40 mM, EDTA 4 Mm). La reversibilidad de la reaccion de aglomeracion fue confirmada sometiendo las reacciones aglomeradas una etapa de desnaturalizacion por calor a 95°C, llevando a cabo una medicion T2, e hibridacion 5 repetida a 60°C seguida por una segunda medicion de T2.
Diseno de la sonda de captura de cebador de PCR y nanopartlcula
Los cebadores de PCR Pan Candida universales fueron disenados complementarios a secuencias de ARNr 5.8S y 26S que amplifican la region espaciadora 2 transcrita de intervencion (ITS2) del genoma de Candida. Se diseno un par de sondas de captura de oligonucleotidos complementarias a las secuencias anidadas en los extremos 5' y 3' 10 respectivamente del producto de PCR amplificado asimetricamente. La sonda de captura que hibrida al extremo 5' del amplicon fue aminada en 3' mientras que la sonda de captura que hibrida al extremo 3' del amplicon fue aminada en 5'. Se agrega un enlazante poli-T (n=9 a 24) entre el grupo amino y la primera base de nucleotidos de la secuencia de sonda de captura. Los cebadores si son los de captura de PCR purificados por HPLC fueron procurados por IDT Technologies (Coraville, IA).
15 Diseno del control de inhibicion
Se diseno un control de inhibicion de PCR para coamplificar con las especies de Candida y monitorizar los factores dentro de los especlmenes de sangre entera que inhiben la amplificacion por PCR. Se diseno una plantilla sintetica que contiene 30 secuencias de flanqueo de nucleotidos identicas en secuencia a las regiones 5.8S y 26S del operon ARNr de Candida. La secuencia interna dentro de esta plantilla consiste de un amplicon de C. albicans revuelto 20 aleatoriamente. Las sondas de captura fueron disenadas complementarias a la cadena amplificada en exceso dentro de las reacciones de PCR asimetricas de Candida. Los ultrameros de oligonucleotidos sinteticos fueron procurados por IDT (Coraville, IA) identicos en secuencia al control de inhibicion. Los oligonucleotidos fueron fusionados una concentracion de 5 pm en 2xSSC y clonados en pBR322 digeridos con HindII/EcoRV (NEB, Ipswich, MA) usando metodos estandar. La transformation fue llevada a cabo a traves de electroporation de 1 pL de la reaccion de 25 ligation en celulas k12 de E. coli electrocompetentes y los transformantes fueron sembrados sobre placas de agar Luria Bertani (LB) que contenlan 100 pg/mL de ampicilina. Se seleccionaron dos colonias resistentes a la ampicilina y se cultivaron en 2 mL de medio LB ampicilina. Se llevaron a cabo minipreparaciones de plasmido por mapeo con enzima de restriction para confirmar los clones contenidos en el inserto correcto. La secuenciacion didesoxi de Sanger fue llevada a cabo entonces (SeqWright, Houston, TX) para confirmar la donation del control y se llevaron a 30 cabo maxipreparaciones de ADN sobre clones que portaban insertos correctos. Las titulaciones del control de inhibicion en la presencia de concentraciones crecientes de todas las 5 especies de Candidas fueron llevadas a cabo para determinar la concentracion mas baja de control de inhibicion que podrla ser detectada reproduciblemente. La confirmation de la funcion del control de inhibicion fue demostrada llevando a cabo reacciones de PCR en la presencia de titulaciones de interferentes de PCR conocidos (SDS, heparina, etanol) y 35 demostrando que la amplificacion del control estaba inhibida.
Cultivo de Candida y preparation de muestras sembradas in vitro
MYA-2876, ATCC 2001, ATCC 24210, ATCC 66029, y ATCC 22019 fueron las cepas de referencia de laboratorio C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, y C. parapsilosis (ATCC, Manassas, VA) utilizadas para preparar especlmenes de sangre entera sembrados in vitro. Las levaduras fueron cultivadas sobre placas de agar levadura 40 peptona dextrosa (YPD) e incubadas a 25°C. Se selecci onaron colonias individuales y se suspendieron en solution salina regulada con fosfato (PBS). Las especies fueron verificadas a traves de secuenciacion ITS2 en Accugenix (Newark, Delaware). Las celulas fueron sometidas entonces una centrifugation a baja velocidad (3000 g durante 2 minutos) y lavadas tres veces con PBS fresco. Una allcuota de las celulas lavadas con PBS fue diluida entonces en diluyente ISOTON II (Beckman Coulter, Brea, CA) dentro de una Accuvette de 20 mL y las celulas fueron 45 cuantificadas sobre un Multisizer 4 Coulter Counter (Beckman Coulter, Brea, CA) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Las celulas fueron diluidas entonces en serie a concentraciones que variaban de 500 a 5 celulas/100 pL de regulador de PBS. Se obtuvo sangre humana fresca de donantes saludables por recoleccion esteril en tubos vacutainer K2EDTA (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ) de ProMedX. Tlpicamente se sembraron cinco mililitros de sangre humana con 100 pL de celulas de Candida cuantificadas. Las muestras de sangre entera sembradas son 50 utilizadas inmediatamente en el ensayo.
PCR de sangre entera
Se llevo a cabo la lisis de eritrocitos con 1 mL de la muestra de sangre entera utilizando los metodos descritos previamente (vease Bramley et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 241:752 (1971) y Wessels Jm, Biochim Biophys Acta., 2:178 (1973)), una centrifugacion a baja velocidad se lleva a cabo y el sobrenadante fue 55 retirado y descartado. Cien uL de regulador Tris EDTA (TE) pH 8.0 que contenla 1500 copias del control de inhibicion fue agregado entonces a las pellas recolectadas y la suspension fue sometida a lisis mecanica (vease Garver et al., Appl. Microbiol., 1959. 7:318 (1959); Hamilton et al., Appl. Microbiol., 10: 577 (1962); y Ranhand, J.M.,
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Appl. Microbiol., 28:66 (1974)). Cincuenta pL del lisado fueron agregados entonces a 50 pL de una mezcla maestra de PCR asimetrica que contenla un desoxinucleotido, cebadores de PCR y una ADN polimerasa termofllica compatible con sangre entera (T2 Biosystems, Lexington, MA). Se llevo a cabo la termociclizacion utilizando los siguientes parametros de ciclo:desnaturalizacion por calor a 95°C durante 5 minutos, 40 ciclos consist entes de una etapa de desnaturalizacion por calor de 30 segundos a 95°C, una segunda etapa de fusion a 62°C durante 20 segundos, y una etapa de elongacion a 62°C durante 30 segundos, y una extension final a 68°C durante 1 0 minutos.
Ensayos de aglomeracion inducida por hibridacion
Quince microlitros de la reaccion de amplification resultante fueron separados en allcuotas en tubos de PCR de 0.2 mL de pared delgada e incubados en un regulador de hibridacion de fosfato de sodio (4xSSPE) con pares de nanopartlculas derivadas con oligonucleotidos una concentration de hierro final de 0.2 mM por reaccion. Las reacciones de hibridacion fueron incubadas durante 3 minutos a 95°C seguidas por incubation durante 30 minutos a 60°C en un dispositivo de incubacion con agitation una velocidad de agitation de 1000 rpm (Vortemp, LabNet International). Las muestras hibridadas fueron colocadas entonces en un bloque de calentamiento a 37°C para equilibrar la temperatura a la del lector de MR durante 3 minutos. Cada muestra es sometida entonces una etapa de vortex de 5 segundos (3000 rpm) e insertada en el lector MR para la medicion de T2.
Protocolo de recoleccion de muestras de pacientes con Candida
Los descartes de especlmenes de sangre que han sido extraldos en vacutainers K2EDTA (BD) el mismo dla como especlmenes extraldos para cultivo en sangre (T=0) fueron obtenidos del laboratorio de hematologla cllnica del Massachusetts General Hospital (MGH) o del Houston University Hospital. Los especlmenes fueron recolectados y catalogados de pacientes que tenlan resultados positivos en cultivos de sangre. Las muestras fueron almacenadas dentro del vacutainer original a -80°C y la recoleccion de especlmenes ciega fue embarcada durante la noche en hielo seco a T2 Biosystems. Los protocolos de recoleccion de muestras cllnicas fueron revisados por los Human Research Committees apropiados.
Analisis estadlstico
Para cada especie, el llmite de detection fue determinado con el uso de la modelacion Probit. Para cada especie, se calcularon el nivel de deteccion a 90% e intervalos de fiducia al 95%. Cada senal T2 bruta fue transformada en T2_mseg sobre la llnea base del ensayo. Se utilizo SAS v. 9.1.3 (Cary, NC) en los calculos estadlsticos para el analisis del llmite de deteccion, concordancia de los especlmenes sembrados con cultivo, sensibilidad y especificidad en los especlmenes cllnicos y ensayos seriados para medir la elimination de Candida.
Concordancia de la deteccion por MR de T2 de Candida con cultivo de sangre
El estandar de oro actual para el diagnostico de Candida es cultivo de sangre. Se prepararon especlmenes de sangre entera de donantes saludables sembrado in vitro utilizando cepas de referencia de laboratorio para C. albicans y C. krusei y aislados cllnicos de C. albicans a concentraciones de 0,33, y 100 celulas/mL. Se inocularon viales de cultivo de sangre BACTEC pediatricos (BACTEC Peds Plus/F vials, Beckton Dickenson) con una allcuota de los especlmenes sembrados in vitro evaluados por T2MR. Los viales para cultivo de sangre inoculados con celulas de Candida fueron positivos por cultivo de sangre en el dla 8 en todos los casos. En total se inocularon 133 botellas de cultivo de sangre fueron inoculadas con 90 muestras de sangre sembradas con Candida (inoculo de 33 celulas/mL) o 43 muestras de sangre negativas. Se observo noventa y ocho por ciento de concordancia positiva y 100% de concordancia negativa entre T2MR y los cultivos de sangre.
Datos de especlmenes cllnicos
Se obtuvieron de pacientes especlmenes de sangre entera K2 EDTA para probar el comportamiento cllnico del ensayo de Candida T2MR. Los pacientes presentaban slntomas de septicemia y se extrajo sangre para cultivo. Las muestras de sangre fueron almacenadas a 4°C en el laboratorio de hematologla y seleccionadas para T2MR si el resultado fue cultivo positivo para Candida, cultivo de sangre positivo para bacteriemia o cultivo de sangre negativo que representara mejor el espectro de muestras que serian analizadas en la plataforma. Catorce de las muestras eran de pacientes candidemicos, ocho de pacientes bacteremicos y diez de pacientes negativos en el cultivo sangulneo. La figura 57 muestra los valores T2 medidos para todas las 32 muestras de pacientes. Se llevo a cabo una reaccion de PCR sencilla utilizando 1 mL de cada especimen. Se agregaron 750 copias del control de inhibition interno a cada reaccion de PCR. Entre las muestras negativas para Candida la senal de control interno (IC) promedio fue 279 ms con un CV entre los 18 especlmenes negativos de Candida de 25%. En ningun caso la senal de IC estuvo por debajo del umbral de decision (128 ms, 5 desviaciones estandar agregadas a las T2 promedio medidas en reacciones de deteccion negativa de Candida) sugiriendo que todos los negativos eran verdaderos negativos y no estaban presentes sustancias inhibidoras con las muestras de sangre entera. Las reacciones de deteccion fueron multiplexadas con base en las gulas de IDSA, de tal manera que tres resultados fueron reportados
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como sigue: C. albicans o C tropicalis positivo; C.krusei o C. glabrata positiva; y C. parapsilosis positiva. El T2 promedio medido en los especlmenes negativos de Candida es 114 ms, la CV para estas mediciones fue 2.4%, y el umbral de decision (calculado por la adicion de cinco veces la desviacion estandar medida en las reacciones de deteccion negativas de Candida mas el T2 promedio medido en especlmenes negativos de Candida) fue 128 ms. En especlmenes positivos para Candida, la senal IC fue suprimida debido a la competicion por los reactivos de amplificacion. En casos de C. albicans alta, se observo la misma reactividad cruzada para la deteccion con las partlculas de C. parapsilosis (por ejemplo, muestra de paciente #3) sin embargo esta senal no esta significativa por encima del corte (20 ms) y no lleva una diferencia en la terapia antifungica puesto que tanto C. albicans como C. parapsilosis son susceptibles a fluconazol.
El T2MR identifico exitosamente catorce muestras de C. albicans, C. parapsilosis, o C. krusei las cuales fueron confirmadas positivas por cultivo de sangre seguido por la tarjeta bioqulmica Vitek 2. Adicionalmente, la deteccion fue especlfica para Candida spp., puesto que las muestras de pacientes bacteremicos con Escherichia coli, Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, coagulasa negativa de Staphylococcus, o Streptococcus alfa hemolltico permanecieron negativas.
Las pruebas extraldas en serie fueron probadas de dos pacientes que exhibieron slntomas que sugerlan candidemia, tales como fiebre persistente despues de recibir antibioticos para demostrar la utilidad del ensayo en la monitorizacion de la eliminacion de Candida. Las extracciones de sangre para T2MR ocurrieron el mismo dla de las extracciones de sangre para el cultivo sangulneo. Cultivos para seguimiento fueron extraldos entonces a lo largo del transcurso de nueve dlas para el paciente A y en el transcurso de cinco dlas para el paciente B. La figura 3 muestra los resultados obtenidos con el metodo T2MR para ambos pacientes. El paciente A tenia sangre extralda para cultivo (t=0), fue diagnosticado con candidemia y recibio la administracion intravenosa de micafungina (C. glabrata) al dla siguiente a traves de cultivo sangulneo (t=1). Los especlmenes de sangre entera fueron probados con T2MR en t=0 dlas, t=3 dlas, t=7 dlas, t=8 dlas, t=9 dlas. Los valores de T2MR obtenidos fueron 320 ms a t=0, 467 ms a t=3, 284 ms a t=7, 245 ms a t=8, y 117 ms (por debajo del corte) para t=9. Extracciones de cultivos sangulneos subsecuentes en los dlas 3 y dla 8 tomaron 24 y 48 horas para dar cultivo positivo, respectivamente. Una serie de especlmenes de extraccion seriada fueron obtenidos del paciente B. Se detecto correctamente la C. albicans con T2MR en el dla 0 (T2=426 ms). El cultivo sangulneo resulto positivo en el dla 2 con identification subsecuente de C. albicans. Dos dlas despues de que el paciente recibio la administracion de micafungina, fue evidente un descenso agudo en T2MR de C. albicans (T2=169 ms) y tres o mas dlas despues de que se inicio el tratamiento antifungico no se observo C. albicans detectable. Todas las pruebas fueron completadas en un tiempo de procesamiento total de 2 horas, utilizando un termociclador PCR de bloque rapido y un procedimiento de termociclizacion de tres etapa que no fue optimizado en cuanto a velocidad.
Conclusiones
Hemos desarrollado y validado un ensayo de Candida T2MR en sangre entera capaz de detectar las especies cllnicamente importantes de Candida que resaltan las ventajas de la deteccion no optica para eliminar la purification de analitos permitiendo as! tiempos de analisis mas rapidos y resultados mas reproducibles. Se utilizo PCR asimetrico para amplificar especlficamente la region ITS2 del genoma de Candida directamente sangre entera para alcanzar sensibilidades de deteccion cllnicamente relevantes. Se desarrollo un metodo de deteccion de T2 en el cual dos grupos de nanopartlculas derivadas con oligonucleotidos hibridan a cada extremo del amplicon de cadena sencilla. Los amplicones sirven as! como uniones interpartlcula e inducen la aglomeracion de nanopartlculas que generan un cambio medible y reproducible en la relaxometrla (T2) rotation-rotation de los protones en las moleculas de agua. Hemos construido e implementado adicionalmente un control de inhibition interna para monitorizar los inhibidores de PCR que pueden estar presentes en las muestras de pacientes.
El ensayo fue evaluado utilizando cepas de referencia y aislados cllnicos cuantificados por Coulter Counter y sembrados en sangre entera de donantes saludables. La repetibilidad del ensayo fue medida utilizando sangre sembrada con C. albicans (misma muestra, mismo operador, mismo instrumento) en el transcurso de 10 dlas y observamos CVs menores de 12.8% (n=30) en el rango de respuesta dinamico completo (0 a 1E5 celulas/mL). La sensibilidad analltica y el llmite de deteccion de < 10 celulas/mL fueron medidos para C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, y C. parapsilosis y >10 celulas/mL con 92.5% detectados a 10 celulas/mL para C. glabrata. Aunque no esta demostrado, una causa posible de los LoD mas alto observados en C. glabrata puede ser que el numero de copias del operon de ADNr es reducido en C. glabrata en comparacion con las otras especies de Candida spp investigadas puesto que es sabido que C. glabrata existe en la naturaleza como un haploide mientras que las otras especies de Candida son diploides. La concordancia con el estandar de oro para el diagnostico de Candida fue alta con el 98% de concordancia positiva y 100% negativa observada para 133 muestras de C. albicans y C. krusei sembradas in vitro. Debe anotarse que el tiempo hasta el resultado fue de 2 horas para la prueba T2 de Candida mientras que el tiempo para obtener resultado positivo en el cultivo de sangre es tlpicamente dos dlas para C. albicans y ~1 dla (1824 horas) para Candida krusei.
Los 32 especlmenes cllnicos son similares a los resultados de los cultivos de sangre. Los T2 medidos estaban por encima de un corte establecido en cinco desviaciones estandar de los valores T2 medidos en los especlmenes
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negativos de Candida agregados a su promedio. En este caso el umbral fue 128 ms (n=54). En ningun caso se observo inhibicion de la reaccion de PCR, puesto que el control interno fue detectado en todas las 32 reacciones con una senal IC reducida observada en pacientes positivos de Candida y un CV de 25% (T2 medio de 279 ms) en los especlmenes negativos a Candida (n=18). El ensayo es especlfico para la deteccion de Candida y no se observo reactividad cruzada con ninguno de los especlmenes bacteremicos (n=8). Los especlmenes positivos en Candida fueron identificados con exactitud, las Candida spp., causantes fueron identificadas con exactitud y todo dentro de un tiempo de respuesta de 2 horas.
El potencial de este ensayo para proveer una deteccion rapida de la eliminacion de Candida despues de la administracion de terapia antifungica tambien fue demostrado. Se hizo extraccion a dos conjuntos de muestras de pacientes y se sometieron a T2MR (figura 3). Se observaron senales T2 de moderadas a altas para C. glabrata en un paciente A en el dla 0 y en el dla 3 con agentes antifungicos administrados en el dla 1. Se observo un descenso en la senal de C. glabrata en los dlas subsecuentes sin ninguno detectable despues de ocho dlas de tratamiento antifungico. Una senal fuerte de C. albicans fue medida para el paciente B en el dla 0, y se observo una declinacion aguda (delta T2 de 306 ms) en la senal T2 un dla despues de la administracion antifungica sin ninguna senal detectable despues de dos dlas de tratamiento antifungico. Aunque son preliminares, estos datos sugieren que la prueba podrla ser utilizada para monitorizar la efectividad del tratamiento y la eliminacion de Candida en forma de tiempo real.
En conclusion hemos desarrollado una prueba sensible y especlfica para el diagnostico de candidemia causada por las cinco especies de Candida mas comunmente encontradas. Los resultados cllnicos tempranos fueron alentadores y muestran que un diagnostico e identificacion de especies rapidos son alcanzables y podrlan no solamente facilitar un tratamiento temprano con el antifungico apropiado sino tambien proveer un medio para monitorizar la eliminacion de Candida. Anticipamos que este metodo de T2MR basado en nanopartlculas puede ser aplicado ampliamente al diagnostico de enfermedades en una variedad de tipos de especlmenes y patogenos.
Ejemplo 23. Ensayo de tacrolimus utilizando Fab.
El ensayo de tacrolimus es un inmunoensayo competitivo homogeneo llevado a cabo utilizando una muestra de sangre entera con EDTA extralda para liberar tacrolimus de las celulas de los globulos rojos y protelnas enlazantes. Un componente clave del ensayo es la alta afinidad del anticuerpo de tacrolimus, un metodo confiable de extraccion y una mejora en los sistemas reguladores seleccionados para promover la agregacion especlfica y minimizar la agregacion no especlfica. Esta version del ensayo utiliza un Fab monovalente recombinante con alta afinidad por tacrolimus.
El ensayo de tacrolimus fue establecido utilizando calibradores de sangre entera, controles de sangre entera comercial, muestras sembradas y muestras de pacientes.
Los reactivos del ensayo incluyeron: (a) partlcula de 244 nm conjugada con BSA secuencial, y un anticuerpo Fab monovalente y bloqueado con mPEG-tiol + NEM (la partlcula es diluida a Fe 0.2 mM en regulador de ensayo); (b) tacrolimus C22 modificado conjugado a BSA en tacrolimus una relacion de entrada de BSA de 10:1 (diluida a 600 ng/ml en regulador de ensayo); (c) regulador de ensayo de glicina 100 mM pH 9.0, BSA al 1%, Tween 80 al 0.05%, NaCl 150 mM, y Proclin al 0.05%; y (d) reactivo de extraccion de MeOH al 70%, ZnSO4 60 mM en dH20.
Se prepararon calibradores de sangre entera utilizando Sigma FK506 Stock 1 mg/ml en MeOH al 100%. La sangre entera con EDTA fue sembrada a niveles variables con la solucion de tacrolimus. La sangre sembrada fue incubada a 37°C con mezcla suave y luego almacenada durante la noche a 4°C antes de tomar allcuotas y congelar. Los niveles de diana fueron 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, y 250 ng/ml de tacrolimus. Los calibradores fueron suministrados a un laboratorio externo para la asignacion de valor mediante el ensayo Architect Tacrolimus. Las muestras fueron probadas por espectroscopla de masas. Los resultados muestran una correlacion de 0.9998 para el valor teorico versus la asignacion de valor real.
Los controles de calidad consistieron en 3 niveles de Controles de Matriz Inmunosupresora UTAK. Las muestras de pacientes fueron obtenidas de pacientes de trasplante en terapia de tacrolimus.
El protocolo de prueba fue como sigue:
(i) Permitir que todas las muestras, calibradores, QC y reactivos se equilibren a temperatura ambiente mezclando por inversion suave.
(ii) Transferir con pipeta 200 pL de muestra, calibrador, o material QC en un tubo de microcentrlfuga de 1.5 mL. Agregar 200 pL de reactivo de extraccion y someter a vortex durante 30 segundos. Permitir que la muestra incube durante 2 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 5 minutos a 10,000 rpm. Transferir el sobrenadante limpio a un tubo limpio y preparar una dilucion 2.5x utilizando regulador de ensayo.
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(iii) Transferir con pipeta 10 pL del extracto diluido y 10 pL de partlcuias diluidas al tubo de reaccion, mezclar con vortex e incubar durante 15 minutos a 37°C. Transferir con pipeta 20 pL de conjugado BSA-tac en el tubo de reaccion, mezclar con vortex e incubar durante 15 minutos a 37°C. Llevar a cabo gMAA durante 6 ciclos (12 minutos). Mezclar con vortex, incubar durante 5 minutos a 37°C y leer en el lector T2 a 37°C.
Los calibradores fueron probados en triplicado para cada prueba (6 lecturas en total). Los datos individuales leldos fueron ajustados con un modelo 5PL utilizando GraphPad Prism 5 para Windows, version 5.02, GraphPad Software, San Diego California Estados Unidos. El calibrador 0 fue introducido como 0.01 ng/ml y utilizado en el modelo de curva. Las curvas de calibracion resultantes (Analisis de Calibracion) fueron utilizadas para retrocalcular la concentracion de tacrolimus para todos los calibradores, siembras en sangre entera, QC y muestras de pacientes contenidos en el analisis.
Ademas, se obtuvo una curva de Calibracion Maestra ajustando los datos a traves del estudio completo de 3 dlas (n=18) para cada calibrador. Todas las muestras fueron retrocalculadas utilizando la Curva Maestra y los niveles de tacrolimus resultante fueron comparados con los obtenidos utilizando el Analisis de Calibracion.
Se probo en triplicado un panel de reproducibilidad consistente en 13 miembros (9 calibradores, 3 controles y 1 muestra de sangre entera sembrada) con dos analisis por dla para un total de 18 replicados. Los calibradores fueron almacenados a -80°C mientras que los controles y la siembra en sangre entera fueron almacenados a 4-8°C durante la duracion del estudio.
Las concentraciones de la muestra fueron predichas utilizando la curva de calibracion del analisis as! como la curva maestra en GraphPrism. Se calcularon la precision dentro del analisis, dentro del dla, dla a dla y total mediante ANOVA utilizando MiniTab15.
Los datos predichos utilizando el metodo de Calibracion de Analisis mostraron imprecision total <25%CV a traves de un rango de concentracion de tacrolimus de ~3-210 ng/ml.
La sensibilidad analltica fue calculada por el metodo 2SD. Se determino la desviacion estandar de 18 replicados del calibrador 0. El nivel de tacrolimus en el T2 maximo (aslntota maxima del ajuste de curva) -2SD fue calculada entonces y se predijo la concentracion utilizando la Curva de Calibracion Maestra. La sensibilidad analltica es 0.8 ng/ml.
Durante el desarrollo y criba del anticuerpo de tacrolimus, se evaluo la especificidad del anticuerpo contra cinco metabolitos de tacrolimus. La inhibicion por ELISA fue llevada a cabo con cada uno de los 5 metabolitos y comparada para tacrolimus libre para cinco clones madurados con afinidad y siete clones con maduracion de afinidad adicional por clonacion cruzada. Los datos para los dos clones cruzados y un anticuerpo RUO monoclonal murlnico del estado del arte se muestran a continuacion. La unica reactividad cruzada observada fue una ligera reactividad del metabolito 15-O-desmetilo.
Se tabula a continuacion un resumen del comportamiento del ensayo de tacrolimus.
Requerimiento
Resultados
Rango reportable:
~3.5 - 200 ng/ml con base en calibrador %CV<30% y 90-110% de recuperacion. ~2 a > 200 ng/ml con base en calibrador %CV<30% y 85-115% de recuperacion.
Sensibilidad analltica (2SD):
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Resuitados
Precision
@ 2.8 ng/mi: 22% CV
@ 6.9 ng/mi: 14% CV
@ 14.6 ng/mi: 4% CV
Tiempo hasta el resuitado:
56 minutos
Tipo de especimen:
Sangre entera
Pretratamiento:
El proceso de extraction basado en soiventes demostro funcionaiidad de uso pianeada sobre el instrumento
Voiumen de muestra:
200 pL
Ejemplo 24. Preparacion de nanopartfculas para deteccion de analitos de acido nucleico.
Preparacion de partlcuias de sonda individuales: Partlcuias superparamagneticas de oxido de hierro carboxilado de 800 nm, consistentes de numerosos nanocristaies de oxido de hierro embebidos en una matriz polimerica inciuyendo un diametro de partlcuia total de 800 nm (vease Demas et al., New J. Phys. 13:1 (2011)) fueron iavados utiiizando una rejiiia magnetica antes del uso. Las partlcuias magneticas fueron resuspendidas en 66 pL de agua iibre de nucieasa, 20 pL de reguiador MES 250 mM pH 6, y 4 pL de sonda aminada (obtenida de IDT), una concentracion de 1 mM por mg de partlcuia por preparar. Se prepararon una partlcuia de sonda aminada en 3' y una partlcuia de sonda aminada en 5' (por ejemplo, la sonda para C. parapsiiosis). La sonda fue agregada a la partlcuia y la suspension fue sometida a vortex utiiizando un sistema de vortex equipado con un soporte de espuma para sostener el tubo. El aparato para vortex fue fijado una veiocidad que mantiene las partlcuias bien suspendidas sin saipicar. Se disolvio entonces N-etil-N'-(3-dimpolietilaminopropil) carbodiimida ciorhidrato (EDC) en agua e inmediatamente se agrego a la mezcia en vortex de partlcuia-sonda. El tubo fue cerrado e incubado entonces con rotacion en una incubadora a 37°C durante 2 horas. El tubo fue coiocado entonces en una gradiiia magnetica y se retiro el fiuido de reaccion. Las partlcuias fueron iavadas con una serie de iavados (125 pL/mg por partlcuia) como sigue: agua, agua, imidazoi 0.1 M, pH 6.0, con una incubacion de 5 minutos con rotacion a 37°C, agua, bicarbonato de sodi o 0.1 M, pH 8.0 con una incubacion de 5 minutos con rotacion a 37°C, agua. Las partlcuias fueron sometidas entonces a estres por caior durante 1 hora a 60-65°C en bicarbonato d e sodio 0.1 M pH 8.0 con rotacion. Despues del estres por caior, el bicarbonato fue retirado coiocando el tubo en una gradiiia magnetica. Las partlcuias fueron resuspendidas entonces en un reguiador de aimacenamiento (Tris-EDTA, Tween 20 ai 0.1%) y sometidas a vortex. El reguiador de aimacenamiento fue retirado y se agregaron 100 pi finales de reguiador de aimacenamiento a la preparacion de partlcuias. Las partlcuias fueron aimacenadas a 2-8°C, cuantificadas usando una prueba de hierro para determinar la concentracion de hierro de las partlcuias, iuego probadas de nuevo contra un acido nucleico diana (por ejemplo, titulacion de oiigo ITS2 de C. parapsiiosis). En el ensayo de Candida, las partlcuias se diiuyen en 8x SSPE supiementada con azida de sodio ai 0.09% como conservante.
Preparacion de partlcuias de sonda duaies: Para la preparacion de una partlcuia de sonda dual, el procedimiento es el mismo anterior, excepto que se mezcian volumenes iguaies de una segunda sonda (por ejemplo, C. albicans aminada en 3') y la primera sonda (por ejemplo, C. tropicaiis aminada en 3') antes de la adicion a las partlcuias magneticas. de la misma manera, se mezciaron volumenes iguaies de sondas aminadas en 5' antes de la adicion a las partlcuias magneticas.
Ejemplo 25. Mejoras en el ensayo de Candida.
El ilmite de deteccion para el ensayo de Candida del Ejemplo 22 fue mejorado iavando la peiia. Se combinaron 2.0 mL de sangre entera con 100 pL de reguiador de iisis de eritrocitos TRAX (esto es, una mezcia de nonii fenoxi- poiietoxiietanoi (NP-40) y 4-octilfenol poiietoxiiato (Triton-X100)) y se incubo durante aproximadamente 5 minutos. La muestra fue centrifugada durante 5 minutos a 6000 g y el sobrenadante resuitante fue retirado y descartado. Para
lavar la pella, la pella fue mezclada con 200 pL de regulador Tris EDTA (TE) pH 8.0 y sometida a vortex. La mezcla fue centrifugada de nuevo durante 5 minutos a 6000 g y el sobrenadante resultante fue retirado y descartado. Despues de la etapa de lavado la pella fue mezclada con 100 pL de regulador TE y sometida a agitacion con perlas (por ejemplo tal como perlas de vidrio de 0.5 mm, perlas de silica de 0.1 mm, perlas de silica de 0.7 mm, o una 5 mezcla de perlas de diferentes tamanos) con agitacion vigorosa. La muestra fue centrifugada de nuevo. Se agregaron entonces 50 pL del lisado resultante a 50 pL de una mezcla maestra para PCR asimetrico que contenia desoxinucleotidos, cebadores para PCR y una ADN polimerasa termofilica compatible con sangre entera (T2 Biosystems, Lexington, MA). Los ensayos de aglomeracion inducidos por termociclizacion e hibridacion fueron llevados a cabo como se describe en el Ejemplo 22 para producir valores de T2 caracteristicos de la presencia de 10 Candida en la muestra de sangre. El ensayo puede producir (i) un coeficiente de variacion en el valor T2 de menos de 20% sobre muestras positivas en Candida; (ii) al menos 95% de deteccion correcta a menos de o igual a 5 celulas/mL en muestras sembradas en 50 muestras individuales de sangre de pacientes saludables; (iii) al menos 95% de deteccion correcta en menos que o igual a 5 celulas/mL en muestras sembradas en 50 muestras individuales de sangre de pacientes no saludables; y/o (iv) mayor que o igual a 80% de deteccion correcta en 15 muestras de pacientes clinicamente positivos (esto es, positivos para Candida por otra tecnica, tal como por ejemplo cultivo celular), partiendo con 2 mL de sangre.

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
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    30
    35
    40
    45
    1. Un metodo para detectar la presencia de un patogeno en una muestra de sangre entera, comprendiendo el metodo:
    (a) proveer una muestra de sangre entera de un sujeto;
    (b) mezclar la muestra de sangre entera con un agente de lisis de eritrocitos para producir globulos rojos destruidos;
    (c) despues de la etapa (b), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descartando una parte o todo el sobrenadante, y resuspender la pella para formar un extracto, lavando opcionalmente la pella antes de resuspender la pella y repetir opcionalmente la etapa (c);
    (d) someter a lisis las celulas del extracto para formar un lisado;
    (e) colocar el lisado de la etapa (d) en un contenedor y amplificar un acido nucleico en el lisado para formar una solucion lisada amplificada que comprende el acido nucleico diana, en donde el acido nucleico diana es caracterlstico del patogeno que va a ser detectado;
    (f) despues de la etapa (e) mezclar la solucion lisada amplificada con de 1x106 hasta 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion lisada amplificada para formar una muestra llquida, en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio de 700 nm a 950 nm, una relajacion T2 por partlcula que va de 1x109 a 1x1012mM'1s'1, y unidad estructural de enlazamiento sobre su superfine, siendo operativa las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia de un acido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente;
    (g) colocar la muestra llquida en un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que comprende las partlculas magneticas y el acido nucleico diana y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF;
    (h) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
    (i) despues de la etapa (h) medir la senal de la muestra llquida, en donde la muestra llquida comprende opcionalmente protelnas de sangre entera y oligonucleotidos no diana; y
    (j) sobre la base del resultado de la etapa (i) detectar el patogeno, en donde opcionalmente el patogeno es bacterias u hongos, y en donde el metodo es capaz de detectar una concentracion de patogenos de 10 celulas/mL en la muestra de sangre entera,
    preferiblemente en donde las etapas (a) a (i) son completadas al cabo de 3 horas y/o la etapa (i) se lleva a cabo sin ninguna purificacion previa de la solucion lisada amplificada.
  2. 2. Un metodo para detectar la presencia de un virus en una muestra de sangre entera, comprendiendo el metodo:
    (a) proveer una muestra de plasma de un sujeto;
    (b) mezclar de 0.05 a 4.0 mL de la muestra de plasma con un agente de lisis para producir una mezcla que comprende virus destruidos;
    (c) colocar la muestra (b) en un contenedor y amplificar un acido nucleico diana en el filtrado para formar una solucion filtrada amplificada que comprende el acido nucleico diana, en donde el acido nucleico diana es caracterlstico del virus que va a ser detectado;
    (d) despues de la etapa (c) mezclar la solucion filtrada amplificada con 1x106 hasta 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion filtrada amplificada para formar una muestra llquida, en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio de 700 nm a 950 nm, una relajacion T2 por partlcula que va de 1x109 hasta 1x1012mM'1s'1, y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativa las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente;
    (e) colocar la muestra llquida en un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un soporte que define un pozo para
    5
    10
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    40
    contener el tubo de deteccion que comprende las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada a la bobina de rF para detectar una senal producida por la exposicion de la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF;
    (f) exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
    (g) despues de la etapa (f) medir la senal desde la muestra llquida; y
    (h) sobre la base del resultado de la etapa (g) detectar el virus,
    en donde el metodo es capaz de detectar menos de 100 copias de virus en la muestra de sangre entera, preferiblemente en donde las etapas (a) a (g) son completadas al cabo de 3 horas.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde se mezclan de 0.05 a 4.0 mL de la muestra de sangre entera con dicho agente de lisis de eritrocitos para producir dichos globulos rojos destruidos.
  4. 4. Un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico diana en una muestra de sangre entera, comprendiendo el metodo:
    (a) proveer una o mas celulas de una muestra de sangre entera de un sujeto;
    (b) someter a lisis dichas celulas para formar un lisado;
    (c) amplificar un acido nucleico en el lisado para formar una solucion de lisado amplificada que comprende el acido nucleico diana;
    (d) despues de la etapa (c) agregar a un tubo de deteccion la solucion de lisado amplificada y de 1x106 hasta 1x1013 partlculas magneticas por mililitro de la solucion lisada amplificada, en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio que va desde 700 nm a 950 nm, y unidades estructurales de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativa las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana o un agente de enlazamiento multivalente;
    (e) colocar el tubo de deteccion en un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que comprende las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y teniendo una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida por la exposicion de la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una secuencia de pulsos de RF;
    (f) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
    (h) despues de la etapa (f), medir la senal del tubo de deteccion; y
    (i) sobre la base del resultado de la etapa (h) detectar el acido nucleico diana, preferiblemente
    en donde dicho acido nucleico diana es purificado antes de la etapa (d).
  5. 5. Un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico diana en una muestra de sangre entera, comprendiendo el metodo:
    (a) proveer un extracto producido por la lisis de globulos rojos en una muestra de sangre entera de un sujeto, centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y una pella, descartar una parte o todo el sobrenadante, y resuspender la pella para formar un extracto, lavando opcionalmente la pella antes de resuspender la pella y repetir opcionalmente las etapa de centrifugacion, descarte y resuspension;
    (b) someter a las celulas a lisis en el extracto para formar un lisado, que comprende opcionalmente combinar el extracto con perlas para formar una mezcla y agitar la mezcla para formar un lisado;
    (c) colocar el lisado de la etapa (b) en un tubo de deteccion y amplificar acidos nucleicos en la misma para formar una solucion lisada amplificada que comprende el acido nucleico diana;
    (d) despues de la etapa (c), agregar al tubo de deteccion de 1x106 hasta 1x1013 partlcuias magneticas por mililitro de la solucion lisada amplificada, en donde las partlculas magneticas tienen un diametro medio que va de 700 nm a 950 nm, y unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie, siendo operativa las unidades estructurales de enlazamiento para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del acido nucleico diana o un
    5 agente de enlazamiento multivalente;
    (e) colocar el tubo de deteccion en un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un soporte que define un pozo para contener el tubo de deteccion que comprende las partlculas magneticas y el acido nucleico diana, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pozo, configurada la bobina de RF para detectar una senal producida al exponer la muestra llquida a un campo magnetico polarizado creado utilizando uno o mas magnetos y una
    10 secuencia de pulsos de RF;
    (f) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF;
    (g) despues de la etapa (f) medir la senal desde el tubo de deteccion; y
    (h) sobre la base del resultado de la etapa (g) detectar el acido nucleico diana, en donde la etapa (g) se lleva a cabo sin ninguna purification previa de la solucion lisada amplificada.
    15 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dichas partlculas magneticas comprenden una
    o mas poblaciones que tienen una primera sonda y una segunda sonda conjugada a su superficie, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a un primer segmento del acido nucleico diana y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a un segundo segmento del acido nucleico diana, en donde las partlculas magneticas forman agregados en la presencia del acido nucleico diana.
    20 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dichas partlculas magneticas comprenden una
    primera poblacion que tiene una primera unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie y una segunda poblacion que tiene una segunda unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie, y comprendiendo dicha unidad estructural de enlazamiento multivalente una primera sonda y una segunda sonda, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a dicha primera unidad estructural de enlazamiento y siendo operativa la segunda 25 sonda para enlazarse a dicha segunda unidad estructural de enlazamiento, siendo operativas las unidades
    estructurales de enlazamiento y la unidad estructural multivalente para alterar una agregacion de las partlculas
    magneticas en la presencia del acido nucleico diana.
  6. 8. El metodo de la revindication 1, en donde dicho patogeno es una especie de Candida, dicha amplification sucede en la presencia de un cebador de avance y un cebador reverso, cada uno de los cuales es universal a
    30 multiples especies de Candida para formar una solucion que comprende un amplicon de Candida; dichas unidades
    estructurales de enlazamiento son operativas para alterar la agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del amplicon de Candida o de un agente de enlazamiento multivalente;
    preferiblemente
    i) donde el cebador de avance comprende la secuencia de oligonucleotidos 5'-GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC- 3' 35 y/o el cebador reverso comprende la secuencia de oligonucleotidos 5'-GCT TAT TGA TAT GCT TAA GTT CAG CGG
    GT-3', o
    ii) en donde:
    (a) la especie de Candida es Candida albicans, y en donde la primera sonda comprende la secuencia de
    oligonucleotido 5'-ACC CAG CGG TTT GAG GGA GAA AC-3' y la segunda sonda comprende la secuencia de
    40 oligonucleotido 5'-AAA GTT TGA AGA TAT ACG TGG TGG ACG TTA-3';
    (b) en donde la especie de Candida es Candida krusei, y en donde la primera sonda y la segunda sonda comprenden una secuencia de oligonucleotidos seleccionada de: 5'-CGC ACG CGC AAG ATG GAA ACG-3', 5'-AAG TTC AGC GGG TAT TCC TAC CT-3', y 5'-AGC TTT TTG TTG TCT CGC AAC ACT CGC-3';
    (c) en donde la especie de Candida es Candida glabrata, y en donde la primera sonda comprende la secuencia de
    45 oligonucleotido 5'-CtA CCA AAC ACA ATG TGT TTG AGA AG-3' y la segunda sonda comprende la secuencia de
    oligonucleotido 5'-CCT GAT TTG AGG TCA AAC TTA AAG ACG TCT G-3'; o
    (d) en donde la especie de Candida es Candida parapsilosis o Candida tropicalis, y en donde la primera sonda y la segunda sonda comprenden una secuencia de oligonucleotidos seleccionada de: 5'-AGT CCT aCc TGA TTT GAG GTCNitIndAA-3', 5'-CCG NitIndGG GTT TGA GGG AGA AAT-3', 5'-AAA GTT ATG AAATAA ATT GTG GTG GCC
    50 ACT AGC-3', 5'-ACC CGG GGGTTT GAG GGA GAA A-3', 5'-AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC GAA-3', y 5'-CCG
    AGG GTT TGA GGG AGA AAT-3'.
  7. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde
    i) las etapas (a) a (h) son completadas al cabo de 3 horas, o
    ii) las partlculas magneticas comprenden dos poblaciones, una primera poblacion que porta la primera sonda sobre 5 su superficie, y la segunda poblacion porta la segunda sonda sobre su superficie, o
    iii) dichas partlculas magneticas comprenden una o mas poblaciones que tienen una primera sonda y una segunda sonda conjugadas a su superficie, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a un primer segmento del amplicon de Candida y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a un segundo segmento del amplicon de Candida, en donde las partlculas magneticas forman agregados en la presencia del amplicon de Candida, o
    10 iv) dichas partlculas magneticas comprenden una primera poblacion que tienen una primera unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie y una segunda poblacion que tiene una segunda unidad estructural de enlazamiento sobre su superficie, y dicha unidad estructural de enlazamiento multivalente comprende una primera sonda y una segunda sonda, siendo operativa la primera sonda para enlazarse a dicha primera unidad estructural de enlazamiento y siendo operativa la segunda sonda para enlazarse a dicha segunda unidad estructural de 15 enlazamiento, siendo las unidades estructurales de enlazamiento y la unidad de enlazamiento multivalente operativas para alterar una agregacion de las partlculas magneticas en la presencia del amplicon de Candida.
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