ES2580778T3 - Preparaciones de inmunoglobulina que tienen mayor estabilidad - Google Patents

Abstract

Una preparación de inmunoglobulina policlonal líquida estable para su uso en medicina mediante administración subcutánea, donde las inmunoglobulinas se obtienen a partir de plasma sanguíneo humano por fraccionamiento alcohólico, donde la preparación contiene prolina con una concentración de al menos 0.2 M, donde la preparación tiene un pH de 4.6 a 5.0 y donde la preparación no contiene nicotinamida.

Description

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DESCRIPCION

Preparaciones de inmunoglobulina que tienen mayor estabilidad

La presente invencion se refiere a una preparacion de protema con mayor estabilidad, que contiene un estabilizante seleccionado del grupo que consiste de aminoacidos no polares y basicos y tiene un pH de 4.2 a 5.4. La invencion se refiere ademas a una composicion farmaceutica y a un metodo de estabilizacion de preparaciones de protemas.

Las preparaciones de protemas, en particular las preparaciones de inmunoglobulina para inyeccion intravenosa, se han utilizado desde hace bastante tiempo. Las protemas, y la inmunoglobulina en particular, tienden a formar agregados y/o dfmeros y a fragmentarse o desnaturalizarse. Si dichas soluciones se inyectan por via intravenosa, los agregados pueden provocar reacciones secundarias graves inclusive shock anafilactico. Con el fin de evitar la agregacion, la fragmentacion, etc. en dichas soluciones de protemas, y para mejorar su estabilidad, se han intentado una serie de tratamientos en el estado actual de la tecnologfa. Por ejemplo, para mejorar la estabilidad en el almacenamiento, a menudo las preparaciones de IgG intravenosa para uso clmico se liofilizan (liofilizacion), pero dichas preparaciones se deben reconstituir con un diluyente antes de usar. El paso de reconstitucion es incomodo y consume mucho tiempo, y aumenta la probabilidad de contaminacion del producto. Otra manera, bien conocida en el area, de mejorar la estabilidad y el almacenamiento de la inmunoglobulina, es la adicion de excipientes estabilizantes de la protema a la preparacion de IgG. Los excipientes conocidos incluyen azucares, polioles, aminoacidos, aminas, sales, polfmeros y tensioactivos. En el area existen abundantes ejemplos de estrategias de estabilizacion de los productos farmaceuticos de protemas. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 4,499,073 (Tenold) mejora la estabilizacion a traves de la seleccion del pH y la fuerza ionica. JP 54020124 da a conocer la adicion de un aminoacido a una preparacion intramuscular para hacer que el almacenamiento sea estable y seguro. JP 57031623 y JP 57128635 dan a conocer el uso de arginina y/o lisina con NaCl en preparaciones de IgG de 5 a 15% para lograr la estabilidad a largo plazo en una preparacion intramuscular. JP 56127321 da a conocer la adicion a IgG de un alcohol de azucar que funciona mejor que la glucosa utilizada en el pasado para suprimir la agregacion. JP 4346934 da a conocer el uso de baja conductividad (menos de 1 mmho), pH 5.3 a 5.7 y opcionalmente uno o mas estabilizantes como PEG, albumina serica humana y manitol. US 4,439,421 (Hooper) instruye acerca de la adicion de una macromolecula hidrofila, un poliol y otra protema para lograr estabilidad ante la generacion de ACA (actividad anti-complemento). US 5,945,098 (Sarno) da a conocer la estabilizacion de soluciones isotonicas por adicion de aminoacidos (glicina 0.1 a 0.3 M) y detergentes no ionicos (polisorbato) y PEG. US 4,186,192 (Lundblad) da a conocer diversos aditivos, incluidos aminoacidos, sin especificar, sin embargo, el uso de aminoacidos individuales espedficos. Esta divulgacion incluye la estabilizacion de IgG con maltosa y ademas glicina hasta 0.1 M. US 4,362,661 (Ono) da a conocer el uso de aminoacidos neutros y basicos para impartir estabilidad a un producto de IgG al 5%. Todos los documentos mencionados antes dan a conocer preparaciones de IgG de un pH acido pero todavfa relativamente alto, superior a 5.2.

Ademas de prevenir la formacion de agregados de inmunoglobulina, tambien se ha reconocido que la formacion de dfmeros, en particular de IgG, puede ser perjudicial para las preparaciones de IgG para administracion por via intravenosa. Aunque los dfmeros de IgG no son conocidos por causar shock anafilactico, sin embargo se encontro que preparaciones de IgG con un contenido de dfmero elevado, no son tan bien toleradas en inyeccion intravenosa y pueden provocar efectos secundarios indeseados, como fiebre, nauseas y a veces hipotension arterial. Los efectos hipotensores fueron detectados en un modelo de ratas por Bleaker et al (Vox Sanguinis 52, 281-290, 1987), y esto tambien muestra una correlacion aparente con el contenido de dfmero. La formacion de dfmeros no llega a ser un problema cuando la preparacion de IgG se liofiliza poco despues de que se produce. Sin embargo, si la preparacion esta destinada al almacenamiento en forma lfquida no liofilizada, la concentracion de dfmero aumenta con el tiempo de almacenamiento.

La patente de los Estados Unidos N° 5,871,736 (Bruegger et al.) da a conocer preparaciones de inmunoglobulina, particularmente preparaciones lfquidas de IgG para infusion intravenosa que contienen uno o mas estabilizantes anfifflicos para lograr estabilidad ante la formacion de dfmeros. Los estabilizantes anfifflicos incluyen el acido nicotmico y sus derivados, en particular nicotinamida y, principalmente, en conjuncion con los anteriores, aminoacidos que tienen cadenas laterales lipofilas sin carga, por ejemplo, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, prolina y valina. La divulgacion experimental de este documento del estado anterior de la tecnica da a conocer aminoacidos siempre en conjunto con nicotinamida, y las concentraciones dadas a conocer para los aminoacidos son 200 mmol/l para prolina, 80 mmol/l para glicina y 120 mmol/litro para isoleucina.

El rango de pH para las preparaciones dadas a conocer en US 5,871,736 se establece en general como entre 4 y 8, pero la divulgacion real de los ejemplos indica un pH de 5.3.

Aunque la patente de los Estados Unidos recien mencionada da a conocer preparaciones de IgG en las cuales la formacion de dfmero ha sido suprimida en cierta medida, sigue siendo deseable proporcionar preparaciones de protemas, en particular, preparaciones de inmunoglobulina, que presenten una mayor estabilizacion, en particular a temperatura ambiente.

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Los inventores encontraron que se puede lograr un grado de estabilizacion asombrosamente alto de las preparaciones de protema lfquidas, ajustando el pH de la preparacion final a un valor entre 4.2 y 5.4 y agregando como estabilizante, un aminoacido basico o no polar.

La presente invencion proporciona una preparacion de inmunoglobulina policlonal Kquida estable para su uso en medicina mediante administracion subcutanea, donde las inmunoglobulinas se obtienen a partir de plasma sangumeo humano por fraccionamiento alcoholico, donde la preparacion contiene prolina con una concentracion de al menos 0.2 M, donde la preparacion tiene un pH de 4.6 a 5.0 y donde la preparacion no contiene nicotinamida.

Sorprendentemente, se encontro que la adicion de aminoacidos por sf solos, sin otros estabilizantes (como nicotinamida) y el ajuste del pH de la preparacion final aumentan notablemente la estabilidad de esas preparaciones, particularmente a temperatura ambiente. La mayor estabilidad es demostrada por la mejor estabilidad de las preparaciones a temperaturas entre alrededor de 2 °C y alrededor de 40 °C, especialmente a temperatura ambiente que preferentemente vana entre aproximadamente 10 °C, mas preferentemente aproximadamente 15 °C, aun mas preferentemente aproximadamente 20 °C y aproximadamente 30 °C, mas preferentemente 25 °C. La mayor estabilidad de las preparaciones de la invencion tambien es visible a temperaturas superiores entre alrededor de 30 °C y alrededor de 40 ° C, incluida la temperatura corporal de aproximadamente 37 °C. Preferentemente, la mayor estabilidad se define ademas, alternativa o adicionalmente, como mayor tiempo de almacenamiento, menor fragmentacion, menor formacion de agregados, menor formacion de dfmeros y/o menor decoloracion. Mayor tiempo de almacenamiento significa que las preparaciones de la invencion son preferentemente estables durante al menos 30 dfas, preferentemente al menos 60 dfas, mas preferentemente al menos 90 dfas, aun mas preferentemente al menos l20 dfas, muy preferentemente durante aun mas tiempo. Menor agregacion significa preferentemente que las preparaciones muestran un menor porcentaje de agregados (en particular en el caso de Ig) que las preparaciones convencionales. Preferentemente, el contenido de dfmero de las preparaciones es inferior a aproximadamente 12%, preferentemente inferior a aproximadamente 10%, mas preferentemente inferior a aproximadamente 8%. Menor coloracion significa preferentemente que la densidad optica de las formulaciones de la invencion es entre aproximadamente 20% y 60% menor que la de las formulaciones convencionales.

En general, las preparaciones de inmunoglobulina de la presente invencion son formulaciones lfquidas que son utiles para inyeccion subcutanea. Dichas preparaciones se pueden almacenar y son estables en forma lfquida y por lo tanto no requieren liofilizacion ni otro tratamiento y pueden ser utilizados facilmente.

La preparacion de inmunoglobulina, en particular una preparacion de anticuerpos, puede ser de cualquier isotipo pero preferentemente IgG, IgA o IgM. Las preparaciones de IgG son particularmente preferidas. Las inmunoglobulinas son policlonales y se pueden aislar de la sangre humana o animal o producir por otros medios, por ejemplo mediante tecnologfa de recombinacion del ADN o tecnologfa del hibridoma. En general, las inmunoglobulinas se obtienen del plasma sangumeo por fraccionamiento con alcohol, que se puede combinar con otras tecnicas de purificacion como cromatograffa, adsorcion o precipitacion. Las inmunoglobulinas se pueden tratar con trazas de enzimas (por ejemplo, pepsina) con el fin de reducir la actividad anticomplementaria o se pueden utilizar enteras.

Las preparaciones se pueden obtener por metodos conocidos en el area, excepto que el pH de la preparacion final se ajusta a un pH relativamente alto pero acido, es decir, en el rango de aproximadamente pH 4.6 a 5.0. Se encontro que este rango de pH es particularmente util para mejorar el almacenamiento de las caractensticas de las preparaciones de inmunoglobulina. Prefiriendose especialmente el pH 4.8.

En el curso del desarrollo de las preparaciones de acuerdo con la presente invencion, tambien se encontro que aumentar la concentracion final del estabilizante permite una sorprendente mejora en las caractensticas de almacenamiento y en la estabilidad de las preparaciones. Por lo tanto, el estabilizante se agrega a una concentracion final de al menos 0.2 M. Preferentemente, la concentracion final es entre 0.2 y 0.4 M, mas preferentemente entre 0.2 y 0.3 M, y muy preferentemente de 0.25 M.

La presente invencion es particularmente util para las preparaciones de inmunoglobulina con una concentracion relativamente alta. La preparacion final de la presente invencion tiene una concentracion de protema de aproximadamente 5 a 25% p/v, preferentemente de aproximadamente 6 a 15% p/v, mas preferentemente de aproximadamente 8 a 12% p/v, muy preferentemente de aproximadamente 10% p/v. La concentracion de protema final dependera de diversos factores, como la via de administracion, el tipo de enfermedad que se va a tratar, etc. Los expertos podran determinar la concentracion de protema optima para la aplicacion prevista. Por ejemplo, para infusion intravenosa, la preparacion final tiene preferentemente una concentracion de protema de aproximadamente 15 a 20% p/v, preferentemente de aproximadamente 8 a 12% p/v. En el caso de IgG para uso intravenoso, es particularmente util 10% p/v, es decir, 100 g de IgG/litro. Para la administracion subcutanea se elige una dosis mayor, por ejemplo de aproximadamente 15 a 20% p/v.

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La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende la preparacion de inmunoglobulina de la presente invencion asf como aditivos farmaceuticamente aceptables. Dichos aditivos pueden ser excipientes, diluyentes como agua, y otras sustancias como sustancias no amortiguadoras, por ejemplo, cloruro de sodio, glicina, sacarosa, maltosa y sorbitol. Dichas composiciones farmaceuticas se administran por via subcutanea. Para administracion intravenosa, se puede utilizar una dosis de aproximadamente 0.2 g, preferentemente de aproximadamente 0.5 g a 2.0 g de inmunoglobulina/kilogramo de peso corporal, al dfa.

Otro aspecto de la presente descripcion es un metodo de estabilizacion de las preparaciones de protema, en particular las preparaciones de inmunoglobulina, que consiste en proporcionar una solucion acuosa de protema y agregarle uno o mas estabilizantes seleccionados del grupo que consiste en aminoacidos basicos y no polares, donde el pH de la solucion se ajusta a un valor de pH de aproximadamente 4.2 a 5.4. El pH se ajusta preferentemente a un valor dentro de los rangos preferidos indicados antes, prefiriendose particularmente el pH 4.8. El metodo comprende, preferentemente, ajustar las concentraciones de protema y las concentraciones de estabilizante y eligiendo el estabilizante o estabilizantes como se menciona anteriormente, prefiriendose particularmente la prolina.

En particular, el metodo comprende los pasos de proporcionar una solucion acuosa de protema con una concentracion de protema de aproximadamente 5 a 25% p/v, ajustar el pH de la solucion entre 4.2 y 5.4, y agregar uno o mas estabilizantes seleccionados del grupo que se enumera anteriormente a la solucion para lograr una concentracion final de estabilizante de 0.2 a 0.4 M a fin de obtener una preparacion de protema estable. Se conocen varios procesos para aislar inmunoglobulinas del plasma humano o de sus fracciones. Las inmunoglobulinas se pueden purificar por ejemplo por fraccionamiento con etanol fno y/o fraccionamiento con acido octanoico y/o procedimientos cromatograficos. Los metodos de purificacion que se prefieren particularmente para los fines de la presente invencion incluyen el fraccionamiento con etanol, seguido de fraccionamiento con acido octanoico, seguido de tratamiento a pH bajo, cromatograffa y nanofiltracion. Al producir inmunoglobulinas para aplicaciones intravenosas, se debe tener especial cuidado de reducir o eliminar los complejos inmunologicos con actividad anti- complemento y proteasas como calicrema o plasminogeno. La protema que se va utilizar en las preparaciones de protema de la presente invencion se lleva a la concentracion deseada entre aproximadamente 5 y 25% p/v por metodos conocidos, por ejemplo por ultrafiltracion. El pH de la preparacion de protema lfquida se ajusta a un pH de 4.2 a 5.4, y el estabilizante se agrega a la solucion a una concentracion final de al menos aproximadamente 0.2 M. Preferentemente la prolina se utiliza como el estabilizante y se agrega preferentemente a una concentracion de aproximadamente 0.2 M a 0.4 M, preferentemente de aproximadamente 0.25 M.

La presente invencion se ilustrara ahora por medio de los ejemplos y las figuras siguientes.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra el contenido de agregados determinado por HPLC para una solucion de IgG al 8% que contiene prolina 0.25 M o glicina 0.25 M.

La figura 2 muestra el contenido de dfmeros determinado por HPLC para una solucion de IgG al 8% que contiene prolina 0.25 M o glicina 0.25 M.

La figura 3 muestra el contenido de fragmentos determinado por SDS PAGE de soluciones de IgG al 8% que contienen prolina 0.25 M o glicina 0.25 M.

La figura 4 muestra la densidad optica (UV 350-500 nm) de dos soluciones de IgG que contienen prolina 0.25 M o glicina 0.25 M.

Ejemplos

Ejemplo 1 Fabricacion de una preparacion de protema de acuerdo con la invencion.

El material de partida para el proceso de fabricacion de Ig intravenosa es un intermediario con licencia del proceso de fraccionamiento con etanol de Kistler Nitschmann. Se trata de una precipitacion de la fraccion de inmunoglobulina del plasma utilizando etanol al 19% a pH 5.8

Las protemas de alto peso molecular, los complejos de lipoprotemas y otros contaminantes se precipitaron usando acido octanoico y despues se separaron por filtracion en presencia de un auxiliar de filtracion. Despues se concentro sobrenadante antes de someterlo a un paso de incubacion a pH bajo.

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Luego el pH se ajusto a pH 6.5 y el material se clarifico adicionalmente por filtracion para separar las IgA e IgM precipitadas. Despues la solucion enriquecida en IgG se purifico finalmente en una resina de intercambio anionico, de acuerdo con U.S. 6,093,324, excepto que la carga fue de 150 gramos por litro de resina.

La eliminacion viral se logro utilizando un nanofiltro.

Formulacion: el nanofiltrado se concentro hasta 3% de protema y se diafiltro contra 5 volumenes de agua, seguido de concentracion de la IgG hasta 120 g por litro. Finalmente, el concentrado se estabilizo con L-prolina 250 mM, se diluyo a 100 g de IgG por litro y el pH se mantuvo en 4.8. El granel formulado se filtro a traves de un filtro de membrana de 0.2 pm.

Ejemplo 2 Analisis de las preparaciones de IgG de acuerdo con la invencion.

El concentrado de IgG, purificado del plasma mediante una combinacion de pasos de precipitacion y cromatograffa y el virus inactivado de acuerdo con el ejemplo 1 se fracciono en tres porciones con 260 ml formulados a pH 4.5, 420 ml formulados a pH 4.8 y 260 ml formulados a pH 5.1. Despues las formulaciones se dividieron, una mitad se formulo con glicina 0.25 M y la otra con prolina 0.25 M. La concentracion final de protema fue de 8% p/v. Se

distribuyeron almuotas de 10 ml en viales de vidrio tipo I de 10 ml (tapones de goma tipo I).

Las almuotas se almacenaron a tres temperaturas diferentes, 2 a 8 °C, 26 °C y 45 °C. Las muestras entre 2 y 8 °C se almacenaron en presencia de luz (Phillips TLD 18W/33). Las muestras se incubaron a 26 °C o a 45 °C durante al menos dos meses en la oscuridad. Los resultados se muestran en las figuras 1 a 4.

Agregados

Los niveles de agregados para la IgG formulada con glicina fueron superiores a los de la IgG formulada con prolina en todas las condiciones analizadas.

Se promovio una formacion significativa de agregados mediante la incubacion a 45 °C. Esta fue similar tanto para las formulaciones de prolina como de glicina. El pH bajo promovio la formacion de agregados a 45 °C, donde las

formulaciones de pH 4.5 que conteman 12.2% (prolina) y 16.7% (glicina) se agregaron a los 90 dfas. En

contraposicion, las formulaciones de pH 5.1 que conteman 6.3% (prolina) y 8.3% (glicina) se agregaron a los 90 dfas.

Dfmeros

Los niveles de dfmeros fueron influenciados por el pH, la temperatura y el tipo de excipiente. El pH demostro ser el factor mas importante, observandose mayores niveles de dfmeros a medida que aumentaba el pH de la formulacion. Esto se observo tanto para las formulaciones de glicina como de prolina. Los resultados indican que las formulaciones que contienen prolina son capaces de mantener los niveles de dfmero mas bajos que las formulaciones de glicina equiparables. La temperatura de incubacion modula el equilibrio monomero/dfmero, favoreciendo las temperaturas menores la formacion de dfmeros.

Monomeros y dfmeros

El contenido combinado de monomero/dfmero para todas las formulaciones a 2-8 °C y a 26 °C permanecio superior al 90%. Se observaron niveles menores en soluciones de IgG formuladas con glicina debido al mayor contenido de agregados. La incubacion a 45 °C dio lugar a tres formulaciones que teman niveles inferiores a 90% despues de 60 dfas (85.1% de glicina, pH 4.5, 89.1% de prolina, pH 4.5 y 89.1% de glicina, pH 4.8). Nuevamente, esos resultados resaltan la mayor capacidad de la prolina con respecto a la glicina para conservar la integridad molecular de las moleculas de IgG.

Fragmentos de IgG

Los resultados indican que las formulaciones de glicina contienen niveles de fragmentos ligeramente inferiores en comparacion con las de prolina. La temperatura de incubacion y el pH demostraron ser los factores mas importantes que influyen sobre la fragmentacion de IgG. A 45 °C los niveles de fragmentos para las formulaciones de prolina variaron de 5.2% (pH 5.1) a 5.8% (pH 4.5), mientras que en las formulaciones de glicina variaron de 4.3% (pH 5.1) a 4.8% (pH 4.8). A pH elevado (4.8 a 5.1) hubo menos fragmentacion.

Aspecto de la solucion

Se investigaron cuatro parametros principales: claridad, turbidez, partmulas y coloracion visible. Los parametros con aspecto, claridad y turbidez fueron satisfactorios. La coloracion (amarillo/marron) de las soluciones se produjo

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durante el penodo de incubacion y se relaciono tanto con la temperature de incubacion como con la exposicion a la luz. La coloracion de las formulaciones de IgG se controlo usando la prueba de densidad optica (UV 350-500 nm). El aumento del color se asocio con la exposicion a la luz y con mayores temperaturas de incubacion. Las formulaciones de glicina presentaron densidades opticas que fueron entre 25% y 48% superiores a las de las formulaciones de prolina correspondientes. Estos resultados proporcionan prueba adicional de que la prolina es un mejor estabilizante que la glicina en soluciones de IgG. A pH elevado (4.8 a 5.1) hubo menos coloracion que a un pH inferior (4.5).

Ejemplo 3 Estabilidad de las preparaciones de IgG de acuerdo con la invencion (dependencia del pH).

El concentrado de IgG, purificado del plasma mediante una combinacion de pasos de precipitacion y cromatograffa y el virus inactivado segun el ejemplo 1 se fracciono en dos porciones y se formulo con o sin 400 mmol/L de L-prolina a pH 4.2, 4.8, 5.3 y 6.8. La concentracion final de protema fue de l2% p/v. Se distribuyeron almuotas de 10 ml en viales de vidrio y se incubaron a 40 °C durante al menos 3 meses en la oscuridad. Al inicio (tiempo 0) y despues de 90 dfas de incubacion, las muestras se analizaron por HPLC para determinar la presencia de agregados, IgG dimerica y monomerica, mediante fotometna para absorbancia a 350 - 500 nm, mediante SDS PAGE (fragmentos) y anticuerpos espedficos dirigidos contra el antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs). Los resultados presentados en la tabla 1 muestran que la mejor estabilidad de la solucion de IgG se obtiene a un pH acido moderado de 4.8 a 5.3.

Tabla 1: Dependencia del pH de la estabilidad de una preparacion de protema (10%) de acuerdo con la invencion

Aditivo

Ninguno

pH

4.2 4.8 5.3 6.8

Tiempo de incubacion (dfas)

0 90 0 90 0 90 0 90

Agregado (%)

3.5 40.2 1.16 5 1.31 3.1 3.22 2.7

Dfmero (%)

6.5 3.6 10.6 11.1 12.2 13.8 16.4 19.0

Fragmentos %

1.4 2.6 1.3 3.5 1.3 3.6 1.5 3.4

Absorbancia (350 a 500 nm)

0.107 0.159 0.125 0.186 0.156 0.205 0.355 0.936

anti-HBs (IU/ml)

7.0 2.6 6.5 3.5 6.3 3.5 6.3 3.5

-------------------------------------------------------1------------1------------1------------

------------1------------1------------1------------1------------

Aditivo

L-Prolina (400 mMol/L)

pH

4.2 4.8 5.3 6.8

Tiempo de incubacion (dfas)

0 90 0 90 0 90 0 90

Agregado (%)

1.97 26.4 0.82 4.5 0.85 2.5 1.78 2.9

Dfmero (%)

4.3 4 6.4 6.2 7.8 9.5 11.8 13.9

Fragmentos (%)

1.4 2.9 1.3 3.5 1.3 4.0 1.5 3.6

Absorbancia (350 a 500 nm)

0.202 0.234 0.134 0.213 0.125 0.235 0.249 0.55

anti-HBs (IU/ml)

7.0 2.9 6.5 3.5 6.3 4.0 6.3 3.6

Ejemplo 4 Estabilidad de las preparaciones de IgG de acuerdo con la invencion formuladas con diferentes aditivos

Los concentrados de IgG, purificados del plasma mediante una combinacion de pasos de precipitacion y cromatograffa y el virus inactivado segun el ejemplo 1 se formularon con aditivos de diferentes clases de sustancias (azucares y alcoholes de azucar, aminoacidos y detergentes) a pH 4.2, 4.8, 5.3 y 6.8. La concentracion final de protema fue de 10% p/v. Se distribuyeron almuotas de 10 ml en viales de vidrio y se incubaron a 37 °C o 40 °C durante al menos 3 meses en la oscuridad. Despues de 90 dfas de incubacion la muestra se analizaron por HPLC para determinar agregados, IgG dimerica, monomerica, y fragmentos, mediante fotometna por absorbancia a 350 - 500 nm y mediante ELISA para determinar anticuerpos espedficos dirigidos contra el antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B (anti-HBs).

Los resultados presentados en la tabla 2 muestran que la mejor estabilidad de la solucion de IgG se obtiene a un pH acido moderado de 4.8 o 5.3 con las formulaciones mas favorables que tienen L-prolina.

Tabla 2: Estabilidad de una preparacion de protema (10%) de acuerdo con la invencion, formulada con diferentes aditivos y a diferente pH.

pH 4.2

Temp. de incub.

Aditivo Absorbancia HPLC anti- HBs

350-500 nm Agregados Dfmeros Monomeros Fragmentos

% % % % lU/mL

37 °C

D(-)Manitol (10%) 0.134 3.00 4.19 87.37 5.44 1.63

Sacarosa (10%) 0.271 3.18 3.38 87.87 5.57 1.59

Maltosa (10%) 0.422 5.30 3.83 85.54 5.33 1.42

Glicina (250 mmol/L) 0.177 5.82 3.75 84.64 5.79 1.57

L-Prolina (250 mmol/L) 0.166 5.50 2.98 85.87 5.64 1.70

Polisorbato 80 (0.02%) 0.166 7.03 3.54 83.94 5.49 1.53

Ninguno 0.172 7.83 3.67 83.11 5.39 1.52

O o o

Glicina (400 mmol/L) 0.251 22.06 5.27 68.59 4.08 2.44

L-Prolina (400 mmol/L) 0.231 26.38 3.96 65.77 3.89 2.87

L-Isoleucina (200 mmol/L) 0.257 52.03 2.59 41.25 4.13 1.74

L-Metionina (200 mmol/L) 0.175 37.66 3.32 55.41 3.61 2.44

L-Valina (250 mmol/L) 0.197 29.30 4.40 62.67 3.63 2.66

pH 4.8

Temp. de incub.

Aditivo Absorbancia HPLC anti- HBs

350-500 nm Agregados Dfmeros Monomeros Fragmentos

% % % % lU/mL

37 °C

D(-)Manitol (10%) 0.147 3.45 7.08 86.84 2.62 1.93

Sacarosa (10%) 0.195 0.73 6.07 90.24 2.96 1.66

Maltosa (10%) 0.489 0.97 7.66 88.41 2.96 1.73

Glicina (250 mmol/L) 0.242 1.37 7.05 88.64 2.94 1.94

L-Prolina (250 mmol/L) 0.183 0.99 4.90 91.17 2.94 2.25

Polisorbato 80 (0.02%) 0.166 1.25 7.14 88.75 2.86 1.94

Ninguno 0.165 1.29 7.54 88.30 2.87 1.94

O o o

Glicina (400 mmol/L) 0.241 3.79 10.42 83.47 2.32 3.77

pH 4.8

Temp. de incub.

Aditivo Absorbancia HPLC anti- HBs

350-500 nm Agregados Dfmeros Monomeros Fragmentos

% % % % lU/mL

L-Prolina (400 mmol/L) 0.213 4.47 7.09 85.96 2.48 3.54

L-Isoleucina (200 mmol/L) 0.488 4.88 9.67 83.27 2.18 3.87

L-Metionina (200 mmol/L) 0.174 5.93 7.46 84.08 2.53 3.83

L-Valina (250 mmol/L) 0.207 6.48 9.58 81.53 2.41 3.71

pH 5.3

Temp. de incub.

Aditivo Absorbancia HPLC anti- HBs

350-500 nm Agregados Dfmeros Monomeros Fragmentos

% % % % lU/mL

37 °C

D(-)Manitol (10%) 0.179 1.39 10.49 85.62 2.50 1.84

Sacarosa (10%) 0.185 0.61 8.46 88.36 2.57 1.88

Maltosa (10%) 0.516 0.76 11.04 85.51 2.69 1.70

Glicina (250 mmol/L) 0.263 0.98 9.09 87.59 2.34 1.92

L-Prolina (250 mmol/L) 0.195 0.78 7.34 89.58 2.30 2.20

Polisorbato 80 (0.02%) 0.196 0.94 9.56 86.94 2.56 1.91

Ninguno 0.177 0.93 10.13 86.40 2.53 1.90

O o o

Glicina (400 mmol/L) 0.336 2.82 12.75 82.43 2.00 3.92

L-Prolina (400 mmol/L) 0.235 2.49 9.54 85.90 2.07 4.02

L-Isoleucina (200 mmol/L) 0.275 4.14 11.06 82.76 2.04 3.73

L-Metionina (200 mmol/L) 0.207 3.21 9.67 84.42 2.71 3.58

L-Valina (250 mmol/L) 0.253 4.26 12.00 81.30 2.44 3.93

pH 6.8

Temp. de incub.

Aditivo Absorbancia HPLC anti- HBs

350-500 nm Agregados Dfmeros Monomeros Fragmentos

% % % % lU/mL

37 °C

D(-)Manitol (10%) 0.300 4.94 12.14 80.25 2.67 1.61

Sacarosa (10%) 0.270 0.95 12.19 84.16 2.70 1.89

Maltosa (10%) 1.008 5.96 16.81 74.46 2.77 1.34

Glicina (250 mmol/L) 0.807 1.19 12.34 84.39 2.08 1.87

L-Prolina (250 mmol/L) 0.328 1.10 10.89 85.87 2.14 1.90

Polisorbato 80 (0.02%) 0.308 1.50 13.85 81.74 2.92 1.60

Ninguno 0.344 1.40 13.68 81.91 3.00 1.73

o o O

Glicina (400 mmol/L) 1.063 3.00 16.61 78.08 2.32 3.72

L-Prolina (400 mmol/L) 0.550 2.89 13.95 80.69 2.47 3.61

L-Isoleucina (200 mmol/L) 0.840 4.47 15.38 77.77 2.38 3.87

L-Metionina (200 mmol/L) 0.687 2.96 13.68 79.79 3.57 3.66

L-Valina (250 mmol/L) 1.083 4.62 15.16 75.33 4.89 3.13

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Una preparacion de inmunoglobulina policlonal Kquida estable para su uso en medicina mediante administracion subcutanea, donde las inmunoglobulinas se obtienen a partir de plasma sangumeo humano por fraccionamiento alcoholico, donde la preparacion contiene prolina con una concentracion de al menos 0.2 M, donde la preparacion tiene un pH de 4.6 a 5.0 y donde la preparacion no contiene nicotinamida.
2. 2. La preparacion de la reivindicacion 1, donde la prolina es L-prolina.
3. 3. La preparacion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde esta tiene un pH de 4.8.
4. 4. La preparacion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde esta contiene prolina con una concentracion final de 0.2 a 0.4 M.
5. 5. La preparacion de la reivindicacion 4, que contiene prolina a una concentracion final de 0.25 M.
6. 6. La preparacion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde su concentracion de protema es entre 5 y 25% p/v.
7. 7. La preparacion de la reivindicacion 6, donde su concentracion de protema es entre 15 y 20% p/v.
8. 8. La preparacion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde esta es una preparacion de inmunoglobulina IgG, IgA o IgM.
9. 9. La preparacion de la reivindicacion 8, donde esta es una preparacion de inmunoglobulina G.
10. 10. Una composicion farmaceutica que comprende la preparacion de inmunoglobulina de una de las reivindicaciones precedentes y aditivos farmaceuticamente aceptables.