ES2581558T3

ES2581558T3 - Matrices de gelatina elásticas no adhesivas

Info

Publication number: ES2581558T3
Application number: ES05758716.4T
Authority: ES
Inventors: Valerio Ditizio; Frank Dicosmo; Yuehua Xiao
Original assignee: Covalon Technologies Ltd
Current assignee: Covalon Technologies Ltd
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2005-06-15
Publication date: 2016-09-06
Anticipated expiration: 2025-06-15
Also published as: US8361501B2; EA200700589A1; EA012609B1; WO2006034568A1; US8628800B2; EA016776B9; EP1793872A4; US20110097402A1; JP2008514316A; EP1793872A1; US8354123B2; EA200900997A1; CA2580357A1; CA2580357C; US20060068013A1; US20130137780A1; JP5047797B2; EA016776B1; US20110311629A1; NO20071668L

Abstract

Matriz elástica de proteína que comprende; (a) 50-90% en peso de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en colágeno, colágeno desnaturalizado, y mezclas de los mismos; (b) hasta un 40% en peso de uno o más polímeros biocompatibles seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, poli-L-lisina, alginato, chitosán, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, y mezclas de los mismos; y (c) 0,5-5% en peso de uno o más agentes reticulantes, en donde dicha matriz se liofiliza a partir de los componentes (a) a (c) para obtener una matriz que sea no adhesiva para heridas, tejidos, y órganos; y en donde dicha matriz contiene menos del 10% de contenido húmedo.

Description

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DESCRIPCION

Matrices de gelatina elasticas no adhesivas Area de la invencion

espedficamente, la presente y al metodo de realizacion de las mismas. Las matrices pueden estar previstas en una variedad de configuraciones no limitadas a apositos para heridas, barreras para heridas, recubrimiento vascular y de tejidos. Las matrices pueden tambien realizarse para incorporar una variedad de agentes farmaceuticos, qmmicos y otros agentes. Ademas, las matrices elasticas no adhesivas de la presente invencion pueden utilizarse solas o en conjunto con otros materiales.

Antecedentes de la invencion

Las laminas de gelatina, laminas de colageno y esponjas son un grupo de biomateriales que se han utilizado ampliamente en el area medica. Son materiales secos y absorben y retienen grandes cantidades de agua. Este grupo de biomateriales es tanto biocompatible como biodegradable, causando poca o ninguna inflamacion. Estos biomateriales son de utilidad como apositos para heridas, andamios de piel artificial y dispositivos terapeuticos de administracion de farmacos, por los que los biomateriales pueden contener agentes terapeuticos y administrar tales agentes terapeuticos a las celulas y tejidos adecuados, tal como se ejemplifica en la Patente Estadounidense 6,475,516 del solicitante.

Las laminas de gelatina y colageno segun el arte previo son habitualmente inelasticas y pueden presentar propiedades toxicas. Por ejemplo, la patente estadounidense 3,491,760 describe un recubrimiento para heridas multicapa adhesivo, flexible pero inelastico, compuesto de colageno o gelatina que se “espuma” utilizando burbujas de aire, tratado con un plastificante (glicerol), reticulado con una solucion de glutaraldelddo al 4%, y con la pelfcula de gel resultante cubierta con una capa de recubrimiento adherida. Tal como se conoce generalmente, las matrices de colageno y gelatina reticuladas con glutaraldelddo muestran toxicidad residual.

Tambien son conocidos materiales esponjosos de gelatina, tal como Gelfoam™. Estos materiales son absorbibles, esteriles e insolubles al agua, y se utilizan para controlar el sangrado durante la cirugfa y pueden ademas estar previstos en un formato en polvo. El material es no elastico. Otra esponja de gelatina no elastica que se utiliza en la actualidad es Surgifoam™. Gelfilm™ es un material no elastico obtenido a partir de una solucion de gelatina reticulada con formaldetndo.

El colageno hidrolizado, tambien conocido como gelatina, se ha utilizado como un vehfculo para la administracion de agentes terapeuticos cuando se enlaza de forma covalente a la superficie de dispositivos medicos tubulares tales como cateteres y stents, tal como se describe en las patentes estadounidenses con Nos. de publicacion 6,132,765 y 6,228,393 del solicitante. El material esta hidratado y es mmimamente elastico.

Diversas patentes describen materiales de colageno inelastico reticulado tales como por ejemplo las patentes estadounidenses con Nos. de publicacion 4,703,108, 4,970,298, 5,550,187, 5,744,545, y 6,132,765.

Sehal y Vijay (Anal. Biochem. 218: 87-91, 1994) describen un metodo para amidacion mediada por carbodiimida soluble en agua utilizando 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) / N-hidroxi succinimida (NHS). Dicho metodo es conocido para reticular colageno, gelatina y otras protemas. Sin embargo, las matrices resultantes no son elasticas.

En Choi et al. (Biomaterials 20: 409-41, 1999) se describe la fabricacion de piel artificial que contiene gelatina y alginato y esta reticulada con EDC. Una esponja soluble se sumergio en una solucion de acetona:agua (9:1 en volumen) que contema 20-100 mg de EDC, y se reticulo durante 24 h. Esta indicado que el EDC cuando se disuelve en agua se desactiva y pierde rapidamente su habilidad de reticulacion, y por tanto el EDC se disolvio en acetona al 90%. El material de la matriz producida es inherentemente inelastico.

En la industria farmaceutica, las capsulas elasticas de gelatina blanda o “Softgels” se elaboran a partir de una solucion de gelatina que se plastifica con propilenglicol, sorbitol, glicerina u otras mezclas autorizadas. Sin embargo, la gelatina en las capsulas de softgel no esta reticulada para que las capsulas continuen siendo solubles cuando se ingieran. Ademas, las capsulas de softgel carecen de elasticidad y resistencia ante la accion de procesos degenerativos tales como un aumento de la temperatura y una accion enzimatica moderada.

La patente WO98/16165 describe una pelfcula elastica con un contenido de humedad del 11 al 16%. Dichas pelfculas comprenden de un 60 a un 95% en peso de gelatina y colageno, por lo cual el colageno esta presente en hasta un 30% en peso. Las pelfculas ademas comprenden de 0,5 a 4% en peso de un agente reticulante y de un 5 a

La presente invencion hace referencia a matrices elasticas no adhesivas. Mas invencion hace referencia a matrices de gelatina elasticas reticuladas no adhesivas,

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un 40% en peso de un plastificante, preferiblemente de polietilenglicol. Las pelmulas se forman combinando gelatina, colageno y le plastificante en una solucion y secando la solucion resultante. Las pelmulas obtenidas de este modo se reticulan a continuacion aplicando el agente reticulante. Las pelmulas reticuladas pueden ser utilizadas para el sellado tisular o para la inhibicion de la adhesion tisular.

Existe la necesidad de producir matrices de gelatina que sean elasticas, y que tengan una resistencia a la traccion considerable, a la vez que no se muestren propensas a endurecerse o a volverse quebradizas.

Resumen de la invencion

La presente invencion proporciona matrices de protema sustancialmente no adhesivas, y elasticas para una variedad de usos clmicos. Mas espedficamente, la presente invencion proporciona matrices de gelatina elasticas sustancialmente no adhesivas, para su uso en una variedad de aplicaciones no limitadas a barreras para heridas, apositos para heridas, apositos quirurgicos, vendajes y en la administracion de farmacos terapeuticos y/o agentes qmmicos. La presente invencion proporciona ademas un metodo novedoso para la realizacion de las matrices de gelatina elasticas no adhesivas de la invencion.

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, el objeto de la misma es una matriz elastica de gelatina no adhesiva segun se define en la reivindicacion independiente 1. La matriz es a la vez no adhesiva y elastica, de forma que sea flexible. La matriz esta liofilizada de forma que no contenga cantidades importantes de disolvente y comprende una mezcla de colageno o colageno no desnaturalizado, polfmeros biocompatibles, un agente o agentes reticulantes y un plastificante opcional.

La matriz de la presente invencion, por tanto, es una matriz elastica de gelatina no adhesiva liofilizada.

La matriz de la presente invencion comprende;

- un mezcla de protema que comprende colageno y/o gelatina y polfmeros biocompatibles que comprenden alginato, polietilenglicol y poli-L-lisina, en donde dichos polfmeros estan reticulados con uno o mas agentes reticulantes y dicha mezcla esta liofilizada. En diversos aspectos, la mezcla puede ademas comprender uno o mas plastificantes.

En diversos aspectos, el colageno puede utilizarse solo o puede utilizarse colageno desnaturalizado, es decir, gelatina utilizada por sf sola o en combinacion.

Tal como se define en la reivindicacion independiente 19, otro aspecto de la presente invencion es un metodo para realizar la matriz elastica de gelatina no adhesiva, donde el metodo comprende:

(a) calentar una solucion proteica;

(b) anadir uno o mas polfmeros biocompatibles a (a);

(c) anadir al menos un agente reticulante a (b);

(d) enfriar (c) y liofilizar.

En algunos aspectos de la invencion, la protema de (a) es gelatina y en otros aspectos es una mezcla de gelatina y colageno. Un plastificante puede anadirse adicionalmente a (b) y/o (c). Ademas, se pueden anadir uno o mas de un agente farmaceutico, qmmico u otro agente antes y/o despues de la reaccion de reticulacion de la etapa (c). Por ejemplo, puede anadirse iones de plata, plata metalica o una sal de plata a la matriz para el tratamiento de quemaduras u otros traumas para minimizar y/o inhibir la infeccion. La matriz puede ser fabricada como un recubrimiento tal como una barrera para heridas, un aposito para heridas, un vendaje vascular y combinaciones de los mismos. La matriz puede ademas ser fabricada como una esponja. La matriz de la invencion puede ademas ser utilizada para reducir la inflamacion cronica, absorber exudados y/o promover un entorno humedo de la herida. La matriz de la invencion puede ademas tener incorporado en la misma un agente qmmico u otro agente que se administre a un tejido deseado, para al menos un tratamiento de entre tratamientos de exfoliacion y de condiciones relacionadas con la edad en mairnferos.

En aspectos de la invencion, la matriz elastica de gelatina no adhesiva puede conformarse alrededor de una red o un soporte fibrilar. Aun en otros aspectos de la invencion, la matriz de gelatina de la invencion puede utilizarse en conjunto con laminas de polfmeros, pelmulas, filamentos o membranas y mallas de silicona, poliuretano, polietileno, Dacron™, nailon, seda, celulosa y mezclas de los mismos.

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En otros aspectos de la presente invencion, la matriz elastica de gelatina no adhesiva puede estar prevista como un dispositivo oclusivo que comprende una estructura oclusiva y la matriz de gelatina sustancialmente no adhesiva, en donde la matriz tiene superficies opuestas de tal manera que una superficie de la matriz este fijada a una superficie de la estructura oclusiva, donde la otra superficie de la matriz esta adaptada para cubrir, y estar en contacto con, el tejido. En dichos aspectos, el dispositivo oclusivo puede ser una pelmula plastica, por ejemplo.

Descripcion detallada de las realizaciones

La presente invencion consiste en una novedosa matriz elastica sustancialmente no adhesiva de contenido proteico que es biocompatible. En realizaciones de la invencion, la matriz es una matriz elastica de gelatina que mantiene su elasticidad de manera que pueda configurarse en una diversidad de formas, segun se requiera en diversas condiciones clmicas. Como tal, la matriz elastica de gelatina de la invencion es flexible y tiene una variedad de usos clmicos para el tratamiento de una diversidad de condiciones. Ademas, la matriz de la invencion puede configurarse en una variedad de formatos, y utilizarse en conjunto con otros dispositivos o estructuras. La matriz de la invencion tambien puede tener una variedad de agentes farmaceuticos, qmmicos y/u otros agentes incorporados en la matriz, segun se desee, para una diversidad de aplicaciones clmicas. La matriz de gelatina de la invencion es tambien sustancialmente no adhesiva, lo que significa que la matriz sustancialmente no se adhiere a las heridas, tejidos (tales como, pero sin limitarse a, piel, vasos sangumeos y hueso) y a organos. Por ultimo, la matriz de la invencion es absorbente, estable in vivo e in vitro, y puede ser fabricada con la resistencia a la traccion y la elasticidad que se requiera para una aplicacion clmica deseada.

La matriz elastica de la invencion se realiza a partir de una solucion que comprende protema o una mezcla de protemas, un polfmero o polfmeros biocompatibles, un agente o agentes reticulantes, un disolvente o disolventes y, de forma opcional, un plastificante. La protema para su uso en la invencion se selecciona de colageno, colageno desnaturalizado (es decir, gelatina) y mezclas de los mismos que se mezclan adicionalmente junto con uno o mas polfmeros biocompatibles. Se pueden anadir de forma opcional plastificantes. La solucion es liofilizada para eliminar esencialmente cualquier disolvente y proporcionar la matriz elastica de gelatina no adhesiva de la invencion.

Los polfmeros biocompatibles para su uso en la invencion se seleccionan del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), poli-L-lisina, poli-D-lisina, alginato, chitosan, acido hialuronico, sulfato de condroitina y mezclas de los mismos.

En aspectos de la invencion los agentes reticulantes para su uso en la invencion se seleccionan a partir del grupo que consiste en 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), formaldetudo, glutaraldehfdo, poliaziridinas, diglicidil eteres y mezclas de los mismos. En realizaciones, se utilizan EDC y NHS en combinacion como el agente reticulante.

En aspectos de la invencion, el plastificante opcional para su uso en la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en glicerol, propilenglicol, sorbitol y mezclas de los mismos.

En aspectos de la invencion, el disolvente para su uso en la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, isopropanol, dimetilsulfuro (DMS), y mezclas de los mismos. En aspectos de la invencion, el disolvente es agua o si se utiliza ademas con un disolvente organico polar, la relacion del disolvente es habitualmente de aproximadamente 9:1, agua con respecto al disolvente organico polar, en la mezcla final.

La solucion de colageno y/o gelatina junto con el polfmero o polfmeros biocompatibles, el agente o agentes reticulantes, el plastificante o plastificantes opcionales y el disolvente o disolventes, se mezclan y se congelan, y a continuacion se someten a criodesecacion (es decir, se liofilizan). Las matrices producidas de esta manera son sustancialmente no adhesivas y elasticas.

Los rangos para las cantidades de protema (colageno o gelatina), la cantidad de polfmero biocompatible, la cantidad de disolvente y la cantidad de plastificante opcional en la solucion de la composicion y en la composicion final liofilizada son tal como sigue a continuacion:

: % en peso en la composicion inicial % en peso en la matriz de gelatina elastica no adhesiva, liofilizada

Protema - colageno o colageno desnaturalizado (es decir, gelatina): 0,5 -30% 50-90%

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(continuacion)

Polfmero biocompatible: Hasta aproximadamente 10% Hasta aproximadamente un 40% (en aspectos aproximadamente un 10-40%)

Agente reticulante: 0,1 -2% 0,5-5%

Disolvente: 50 - 99% Hasta aproximadamente un 10%

Plastificante (opcional): 0 -5% 0 -10%

*Observar que los rangos proporcionados en la tabla anterior para cada prote'ma, pol'imero biocompatible, agente reticulante, disolvente y plastificante incluye cualquier sub-rango de los rangos detallados.

La matriz elastica de gelatina no adhesiva de la invencion se realiza combinando soluciones de protema, poKmeros biocompatibles y agentes reticulantes en un disolvente adecuado. Las soluciones de los diversos constituyentes de la matriz segun se describe en los ejemplos son acuosas, sin embargo, en aspectos de la invencion el polfmero o polfmeros y el agente o agentes reticulantes pueden ser disueltos en primer lugar en un disolvente organico polar tal como, pero sin limitarse a, metanol, etanol, isopropanol y dimetil sulfoxido (DMSO), y en tal caso, la relacion del disolvente de la mezcla final es habitualmente de 9:1 a favor del agua.

En aspectos de la invencion, las soluciones de la protema y del polfmero biocompatible se mezclan y se incuban durante un periodo de tiempo a una temperatura tal que la protema no se solidifique, es decir que no forme un gel. Las temperaturas de aproximadamente 55°C son adecuadas para dicha incubacion. Si se utilizara polietilenglicol (PEG) como un polfmero biocompatible, el PEG se anade habitualmente a la mezcla y a las soluciones de protemas que se estan incubando. Una solucion del agente reticulante se anade a continuacion y la mezcla resultante se mezcla durante un periodo de tiempo hasta que se forma un gel consistente. El gel se vierte a continuacion en un molde adecuado y se mantiene a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos, y posteriormente se enfna a aproximadamente 4°C durante un periodo de tiempo que se encuentra en el rango de aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 12 horas. La mezcla se lava para eliminar los componentes solubles tales como PEG residual y agente reticulante y se liofiliza durante un periodo de aproximadamente 24 horas o mas hasta que el contenido de humedad final de la matriz elastica de gelatina no adhesiva es menos de aproximadamente un 10%. Un experto en el arte entiende que el contenido de humedad final de la matriz resultante (la matriz liofilizada) puede ajustarse a cualquier valor hasta aproximadamente un 10% en peso de la matriz.

La matriz elastica de gelatina no adhesiva de la invencion puede estar desarrollada para liberar farmacos en tejidos y organos, incluyendo, pero sin limitarse a, piel, laceraciones tisulares, heridas quirurgicas de la piel, de tejidos y de organos, vasos sangumeos y hueso. En esta realizacion, la matriz puede fabricarse para tener agentes farmaceuticos, qmmicos y/u otros agentes incorporados en la misma. En un aspecto, el agente farmaceutico, qmmico y/u otro agente pueden incorporarse en una cantidad de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 10% en la etapa de formulacion inicial, o de aproximadamente un 1,0% hasta aproximadamente un 25% despues del secado. En otro aspecto, la matriz liofilizada puede sumergirse en una solucion del agente farmaceutico, qmmico y/u otro agente deseado, y despues la matriz puede ser re-liofilizada. Los agentes deseables para su uso en conjunto con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, iones de plata, plata metalica o una sal de plata, clorhexidina, triclosan, povidona yodada, otros metales antimicrobianos tales como cobre, platino, oro, compuestos a base de bismuto, anestesicos tales como lidocama, antibioticos, inmunosupresores, agentes anti-proliferativos, agentes antiinflamatorios, antivirales y combinaciones de los mismos. La seleccion del agente para su uso con la matriz de la invencion dependera de su uso final. Por ejemplo, si se utiliza para el tratamiento de condiciones relacionadas con la edad, puede proporcionarse un agente anti-envejecimiento a la matriz antes y/o despues de la liofilizacion. Un agente anti-envejecimiento de este tipo puede seleccionarse para tratar por ejemplo lmeas de expresion, arrugas y decoloraciones de la piel. En este aspecto, un agente anti-envejecimiento adecuado puede seleccionarse de exfoliantes, Vitamina A, Vitamina C, etc. Si se utiliza para tratar manchas oscuras o decoloracion, un agente tal como la hidroquinona puede resultar adecuado para su incorporacion en la matriz.

La matriz elastica de gelatina no adhesiva de la invencion puede ser fabricada en una variedad de formas tales como una pelmula, lamina, tubo o esponja. La matriz de la invencion puede utilizarse, por ejemplo, pero sin limitarse a ello, como barrera para heridas, aposito para heridas, vendaje vascular y combinaciones de los mismos. La matriz de la invencion puede ademas ser utilizada para reducir la inflamacion cronica, absorber exudados y/o promover un entorno humedo de la herida. La matriz de la invencion puede ademas fabricarse como un dispositivo en conjunto con otros materiales tales como, pero sin limitarse a los mismos, laminas polimericas, pelmulas, filamentos, membranas o mallas de silicona, poliuretano, polietileno, Dacron™, nailon, seda, celulosa y combinaciones de los mismos. Esto puede llevarse a cabo modificando qmmicamente la superficie de estos otros materiales mediante

metodos de irradiacion gamma, tratamiento con plasma o descarga por efecto corona y/o mediante luz UV, de manera que los grupos reactivos se introduzcan en la superficie del material. Los grupos reactivos pueden entonces enlazarse de forma covalente con grupos reactivos complementarios presentes en la matriz elastica no adhesiva de la presente invencion mediante metodos segun lo descrito en la solicitud Internacional del solicitante con N° PCT 5 CA02/00246.

La revelacion anterior describe en general la presente invencion. Puede obtenerse una comprension mas completa mediante la referencia a los siguientes Ejemplos espedficos. Estos Ejemplos se describen unicamente con propositos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invencion. Se contemplan cambios en la forma y la sustitucion de equivalentes segun puedan sugerir las circunstancias o segun resulte conveniente de acuerdo a las 10 mismas. Aunque se han empleado terminos espedficos en la presente patente, tales terminos se entienden en sentido descriptivo y no con propositos de limitacion.

Ejemplos

Sin la intencion de limitarse en su alcance, los siguientes ejemplos se utilizan para ilustrar diversas realizaciones de la invencion.

15 Materiales

La gelatina fue adquirida de Vyse Gelatin Company (5010 North Rose St., Schiller Park, IL60176). La gelatina (300 Bloom) fue obtenida mediante la hidrolisis parcial de colageno de origen porcino: piel, tejidos conjuntivos blancos y huesos de los animales, y procesado para producir una gelatina de calidad farmaceutica. Se adquirio alginato de sodio (sal de sodio) de Macrocystis pyrifera (elevada viscosidad, solucion al 2% a 25°C aprox. 14.000 cps), de 20 Sigma Co. (St. Louis, MO). Se adquirio Polietilenglicol (Media Mn = 3.400), hidrocloruro de 1-[3-(dimetilamino)propil]- 3-etilcarbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) y lactato de plata de Aldrich Co. (Milwaukee, WI53201).

Ejemplo 1 - Aposito de (Gelatina + Alginato + PEG 3400)

Soluciones madre:

Gelatina: 20% (p/v)

25 Alginato: 3,12% (p/v)

PEG 3400: 63% (p/v)

EDC/NHS: 40% (p/v) y 6 % (p/v), respectivamente, (relacion molar: 4/1)

Composicion de la matriz saturada con agua:

30 Gelatina: 10% (p/p)

Alginato: 1,1 % (p/p)

PEG: 7,2% (p/p)

Smtesis de la matriz (por ejemplo, para formar aproximadamente 200 ml de gel):

Se mezclaron soluciones de Gelatina (100 mL) y alginato (71,2 mL) y se incubaron a 55°C durante 30 min. A 35 continuacion se anadieron y mezclaron 30 mL de una solucion de PEG 3400. Despues, se anadio a la mezcla 5 mL de una solucion fresca de EDC/NHS durante el mezclado, durante 30 segundos. Los aproximadamente 200 ml de gel se vertieron en un molde y se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 min, y posteriormente se enfrio a 4°C durante 30 min. La matriz se lavo en agua durante la noche para eliminar los componentes solubles tales como el PEG y el agente reticulante. Finalmente, la matriz fue liofilizada. Habitualmente, 0,32 ml de la mezcla de gel produce 40 1 cm2 del area de superficie de la matriz.

Ejemplo 2 - Aposito de (Gelatina + Alginato + PEG 3400 + Glicerol)

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Solucion madre:

Gelatina: 20% (p/v)

Alginato: 3,12% (p/v)

PEG 3400: 63% (p/v)

EDC/NHS: 40% (p/v) y 6 % (p/v), respectivamente, (relacion molar: 4/1)

Glicerol: 10% (p/v)

Composicion de la matriz saturada con agua:

Gelatina: 10% (p/p)

Alginato: 1,1 % (p/p)

PEG: 7,2% (p/p)

Poli-Lisina: 0,1% (p/p)

Smtesis de la matriz (por ejemplo, 200 ml de gel)

Se mezclaron soluciones de Gelatina (100 mL) y alginato (71,2 mL) y se incubaron a 55°C durante 30 min. A continuacion se anadieron y mezclaron 30 mL de una solucion de PEG 3400. Despues, se anadio a la mezcla 5 mL de una solucion fresca de EDC/NHS durante el mezclado, durante 30 segundos. Los aproximadamente 200 ml de gel se vertieron en un molde y se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 min, y posteriormente se enfrio a 4°C durante 30 min. La matriz se lavo en agua durante la noche para eliminar los componentes solubles tales como el PEG y el agente reticulante. Habitualmente, 0,32 ml de la mezcla de gel produce 1 cm2 del area de superficie de la matriz. La matriz se sumergio en 2,85 l de glicerol al 10% (4,4 ml de glicerol por 1 cm2 de gel). Finalmente, la matriz fue liofilizada.

Ejemplo 3 - Aposito de (Gelatina + Alginato + PEG 3400 + Poli-L-lisina)

Solucion madre:

Gelatina: 20% (p/v)

Alginato: 3,12% (p/v)

PEG 3400: 63% (p/v)

Poli-L-lisina: 2% (p/v)

EDC/NHS: 40% (p/v) y 6 % (p/v), respectivamente, (relacion molar: 4/1)

Composicion de la Gelatina: Alginato: PEG:

Poli-Lisina:

saturada con agua:

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1,1 % (p/p)

7,2% (p/p)

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matriz

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Smtesis de la matriz

Se mezclaron soluciones de gelatina y alginato, como en los ejemplos anteriores. A continuacion, se anadio 10 ml de poli-L-lisina al 2% con mezclado. Se anadieron 30 ml de PEG 3400 a la mezcla y se mezclo. Los procedimientos restantes para producir la matriz final fueron identicos a los ejemplos anteriores.

Ejemplo 4 - Aposito de (Gelatina + Alginato + PEG 3400 + Poli-L-lisina + Glicerol)

Solucion madre:

Gelatina: 20% (p/v)

Alginato: 3,12% (p/v)

PEG 3400: 63% (p/v)

Poli-L-lisina: 2% (p/v)

EDC/NHS: 40% (p/v) y 6 % (p/v), respectivamente, (relacion molar: 4/1)

Glicerol: 10% (p/v)

Composicion de la matriz saturada con agua:

Gelatina: 10% (p/p)

Alginato: 1,1 % (p/p)

PEG: 7,2% (p/p)

Poli-L-lisina: 0,1% (p/p)

Smtesis de la matriz

Se mezclaron soluciones de gelatina y alginato como en los ejemplos anteriores. A continuacion, se anadio 10 ml de poli-L-lisina al 2% con mezclado. Se anadieron 30 ml de PEG 3400 a la mezcla y se mezclo. Los procedimientos restantes para producir la matriz hidratada y lavada fueron identicos a los ejemplos anteriores. Finalmente, la matriz se sumergio en 2,85 l de glicerol al 10% (4,4 ml de glicerol por 1 cm2 de gel) y a continuacion se liofilizo.

Ejemplo 5 - Aposito de (Gelatina + Alginato)

Solucion madre:

Gelatina: 1% (p/v)

Alginato: 1% (p/v)

EDC/NHS: 40% (p/v) y 6 % (p/v), respectivamente, (relacion molar: 4/1)

Composicion de la matriz saturada con agua:

Gelatina: 0,9% (p/p)

Alginato: 0,1 % (p/p)

Smtesis de la matriz (por ejemplo, 200 ml de gel)

Se mezclaron soluciones de gelatina (180 mL) y alginato (20 mL) y se incubaron a 55°C durante 30 min. Despues se anadio 1,4 ml de solucion fresca de EDC/NHS a la mezcla con mezclado durante 1 minuto. La mezcla se vertio en un molde (10 ml por area de 20 cm2), y a continuacion se congelo a -20°C durante la noche. Finalmente, la matriz fue liofilizada.

Las diversas matrices, como en los Ejemplos 1-5, pueden ser vertidas (previamente a la etapa inicial de enfriamiento/congelacion) directamente sobre otros materiales (sin modificacion tal como se detalla anteriormente), tales como, pero sin limitarse a los mismos, laminas polimericas, pelfculas, filamentos, membranas o mallas de silicona, poliuretano, polietileno, Dacron™, nailon, seda, celulosa y combinaciones de los mismos, que pueden o no 5 contener agentes anadidos, tales como agentes terapeuticos, materiales que contienen plata u otros medicamentos para insertar la malla, red o fibras en el interior de las matrices de los ejemplos 1-5.

Ejemplo 6 - Degradacion In vitro de la degradacion de la esponja de gelatina por Colagenasa

La degradacion de materiales a base de gelatina reticulante se estudio utilizando colagenasa bacteriana. La colagenasa utilizada en este estudio procedfa de Clostridium (EC 3.4.24.3) y tema una actividad de 362 U/mg solido.

10 Se incubaron muestras (50 mg) a 37 °C en 10 mL de solucion de colagenasa con una concentracion de 15,35 U/mg en tampon de 0,1 M Tris-HCl (pH = 7,4) que contema 0,005 M de CaCl2 y 0,05 mg/mL de azida de sodio. Despues de cada intervalo de incubacion, la muestra se lavo cuidadosamente tres veces con agua desionizada y se liofilizo durante la noche. El grado de degradacion fue expresado como el porcentaje en peso que queda tras la degradacion.

15 La biodegradacion de los apositos a base de gelatina de acuerdo con la presente invencion, fue rapida en presencia de colagenasa, tal como sena de esperar. Para casi todas las matrices, aproximadamente un 80% de la esponja de gelatina se degrado en las primeras 24 horas. La matriz de gelatina que contema gelatina y alginato se mostro menos afectada por la accion de la colagenasa (Tabla 1).

Tabla 1. Biodegradacion de apositos de gelatina en tiempos espedficos (expresada como % del peso restante) en

20 presencia de colagenasa

Matriz de muestra: 0 h 24 h 48 h 72 h

1% Gelatina + Alginato: 100 96 1 75 9 65 ,4

10% Gelatina + PEG + Alginato: 100 21 0 22 2 17 ,4

10% Gelatina + PEG + Alginato + Glicerol: 100 23 3 12 8 21 ,8

10% Gelatina + PEG + Alginato + Glicerol + Poli-L-Lisina: 100 18 4 14 3 14 ,4

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina: 100 16 5 14 8 12 ,6

Ejemplo 7 - Determinacion de la capacidad de absorcion de agua

Para determinar la capacidad de absorcion de agua del aposito, aproximadamente 40 mg del aposito se coloco en un vial de cristal de 20 ml al que se anadio 15 ml de agua o PBS (0,01M, pH =7,4). La muestra se peso despues de 25 la hidratacion durante 5 min a temperatura ambiente y a continuacion se incubo a 37°C durante 4 h y 24 h. La muestra se peso en ambos intervalos de incubacion. La capacidad de absorcion de agua se expresa como la relacion de agua absorbida con respecto al aposito seco (Tabla 2). Las matrices, particularmente sin plastificante, son todas muy absorbentes y pueden empaparse hasta aproximadamente 30-35 veces su peso en agua en aproximadamente 24 horas.

30 Tabla 2. Absorcion de agua en tiempos espedficos, gramos de agua/gramos de matriz (g/g)

Matriz de muestra: 5 min (g/g) 4 h (g/g) 24 h

1% Gelatina + Alginato: 31,6 - 28,7

10% Gelatina + PEG + Alginato: 16,2 27,3 32,1

10% Gelatina + PEG + Alginato + Glicerol: 2,5 10,8 11,7

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina: 9,0 29,9 34,6

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina + Glicerol: 1,8 9,6 10,5

*los valores son en una relacion valor:1.

Ejemplo 8 - Determinacion de la solubilidad en agua

Para determinar la solubilidad en agua del aposito, se coloco una muestra con un peso conocido en un vial de cristal al que se anadio 15 ml de agua. Este se incubo a 40°C durante 24 h y a continuacion se elimino el agua y la muestra 35 se lavo dos veces con agua. La muestra se seco a continuacion en un horno a 100°C a un peso constante y a continuacion se volvio a pesar. La solubilidad en agua se expresa habitualmente como el porcentaje de peso perdido

despues del tratamiento con agua (Tabla 3). Las matrices mostraron una buena solubilidad en agua proporcionando una indicacion de su longevidad clmica. Una solubilidad menor dio como resultado una matriz mas estable a la temperatura corporal. Por tanto, tales matrices pueden ser eliminadas de una herida, por ejemplo, como una unica lamina despues de 24 horas o mas con la minima molestia para el paciente. Mientras que todas las matrices 5 mostraron una buena estabilidad, las que no teman plastificantes resultaron incluso mas estables.

Tabla 3. Estabilidad de materiales a base de gelatina al 10% despues de su incubacion en agua a 40°C durante 24h.

Matriz de muestra: P1 (g) P2 (g) Peso restante (%) Solubilidad en agua (%)

1% Gelatina + Alginato: 0,0315 0,0260 83,4 16,6

10% Gelatina + PEG + Alginato: 0,0335 0,0261 77,9 22,1

10% Gelatina + PEG + Alginato: 0,0308 0,0235 76,3 23,7

10% Gelatina + PEG + Alginato + Glicerol: 0,0448 0,0107 23,9 76,1

10% Gelatina + PEG + Alginato + Glicerol: 0,0443 0,0108 24,4 75,6

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina: 0,0364 0,0305 83,8 16,2

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina: 0.0361 0,0294 81,4 18,6

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina + Glicerol: 0,0504 0,0115 22,82 77,2

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina + Glicerol: 0,0507 0,0124 24,5 75,5

Observar: P1: peso de la muestra original

P2: peso de la muestra seca despues del tratamiento

Peso restante = (P2/P1) x 100% Solubilidad en agua = (1 - P2/P1) x 100%

Ejemplo 9 - Determinacion de las propiedades mecanicas

Se determinaron las propiedades mecanicas para la resistencia a la traccion y elongacion de ruptura de las matrices 10 de gelatina hidratadas (4,5 cm x 1 cm), que se habfan sumergido en una solucion tampon de 0,01M, pH = 7,4 PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizo una celula de carga de 0,5 kg con una tasa de extension de 5 mm/min (Tabla 4). Este ejemplo demuestra que la resistencia a la traccion y la elasticidad de las matrices pueden ajustarse a traves de la variacion de la cantidad y combinacion de componentes de la matriz. Este hecho es valioso para proporcionar matrices para una variedad de aplicaciones clmicas, tales como piel artificial o aposito para 15 heridas.

Tabla 4. Propiedades mecanicas de los apositos a base de gelatina

N° de muestra: Resistencia a la traccion (g/cm2) Elongacion de ruptura (%)

1% Gelatina + Alginato: 25,5 53,0

10% Gelatina + PEG: 30,5 126,8

10% Gelatina + PEG + Alginato: 73,8 174,9

10% Gelatina + PEG + Alginato + Glicerol: 83,8 155,4

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina: 111,4 176,3

10% Gelatina + PEG + Alginato + Poli-L-Lisina + Glicerol: 148,8 193,3

Ejemplo 10 - Adicion de Sirolimus a apositos a base de gelatina

Los ejemplos 1-5 estan dirigidos a la fabricacion de un rango de materiales que pueden ser utilizados como soportes 20 para diversos medicamentos, tales como el farmaco antiproliferativo y antiinflamatorio Sirolimus (Rapamicina) para su administracion en la superficie de tejidos y organos. Mientras que el farmaco Sirolimus se utiliza en este ejemplo, se observa que otros farmacos pueden utilizarse tanto solos como en combinacion para ser administrados en la superficie de tejidos y organos.

5

10

15

20

25

30

35

Solucion madre

Gelatina: 1% con respecto a agua Alginato: 1% con respecto a 0,05N de NaOH

EDC/NHS: 400mg/60 mg por 1 ml de 10 mM de solucion salina de Mes (pH=4,5)

Glicerol: 1% (en agua).

La formulacion en la matriz:

Gelatina: 0,9% (p/v)

Alginato: 0,1% (p/v)

Agua

Procedimiento

Preparacion de soluciones madre

Solucion 1: se anadieron 2g de gelatina a 180ml de agua; despues de que la gelatina se hidratara completamente en agua, la mezcla se incubo a 50 °C para disolver la gelatina.

Solucion 2: se anadio 0,2 g de alginato en 20ml de 0,05 N NaOH, y se incubo a 50°C para disolver el alginato. Solucion 3: se anadio 400mg de EDC + 60 mg de NHS en 1ml de 10 mM de una solucion salina de Mes (pH = 4,5). Solucion 4: se anadio 2g de glicerol en 200 ml de agua.

Smtesis de la matriz (por ejemplo, 200 ml de gel)

1. La solucion 1 y la solucion 2 se mezclaron y se incubaron a 55°C durante 30 min. Despues, se anadio a la mezcla

1,379ml de una solucion fresca de EDC/NHS con mezclado durante 1 minuto. La mezcla se vertio en un molde (9 ml 2 ' por 20 cm a, a continuacion se congelo a -20 grados °C durante la noche.

2. El gel reticulado se lavo con agua Milli-Q 4 veces con 500ml por matriz (se refresca el agua cada 1 h); la matriz se somete a recongelacion a temperatura ambiente, se sumerge en 9 ml de glicerol al 1% por 20 cm2 de gel. A continuacion, el gel se congela nuevamente a -20°C y se liofiliza. La matriz puede prepararse como una pelfcula fina.

Carga de sirolimus de las matrices:

La anterior matriz (o cualquiera de las matrices de los ejemplos 1-5), se corto en un cuadrado de 1 x 4 cm. Despues de esto, se anadio 80 ul de solucion del farmaco (1mg/80ul de etanol) en la superficie del material, o el material se sumergio en una solucion del farmaco. Despues de la carga del farmaco en la pelfcula, la pelfcula se dejo secar y la pelfcula con el farmaco cargado se expuso a radiacion gamma durante 8 h (25 KGy).

Estudio de liberacion del farmaco in vitro

Procedimiento:

1. Preparacion de muestras

1) Una matriz (1 x 4 cm) se corto en 3 piezas iguales.

2) Se disuelve 1 mg de farmaco en 90 ul de etanol.

3) Se anade 30ul de farmaco en cada pieza de la matriz de la etapa 1.

4) Se evapora el Etanol.

2. Estudio de liberacion del farmaco

1) Colocar las muestras en tubos de ensayo Falcon de 15 ml.

2) Anadir 5 ml de PBS (10mM, pH=7) a cada tubo.

3) Incubar los tubos a 37°C durante 10 dfas.

5 4) Tomar muestras de 2,5 ml en intervalos de 3 h, 1 d^a, 3 dfas, 5 d^as, 7d^a, 9 dfas, y se reemplazo 2,5 ml de PBS

fresco para las muestras tomadas,

5) Realizar analisis mediante HPLC de las muestras.

Columna: Hypersil ODS, 100 x 2,1 mm

Tasa de flujo: 0,2 ml/min

10 Deteccion: UV, 278nm

Fase movil: 600ml de acetonitrilo y 400 ml de agua

Temperatura: 50°C

Volumen de inyeccion: 10pl

Estandares de Sirolimus: 0ug/ml, 1ug/ml, 2,5ug/ml, 5ug/ml 10ug/ml 15 Analisis: Cada muestra fue inyectada dos veces para su analisis.

Cada punto de datos es la media de 6 replicas de ensayos.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Matriz elastica de protema que comprende;

(a) 50-90% en peso de una o mas protemas seleccionadas del grupo que consiste en colageno, colageno desnaturalizado, y mezclas de los mismos;

(b) hasta un 40% en peso de uno o mas polfmeros biocompatibles seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, poli-L-lisina, alginato, chitosan, acido hialuronico, sulfato de condroitina, y mezclas de los mismos; y

(c) 0,5-5% en peso de uno o mas agentes reticulantes,

en donde dicha matriz se liofiliza a partir de los componentes (a) a (c) para obtener una matriz que sea no adhesiva para heridas, tejidos, y organos; y

en donde dicha matriz contiene menos del 10% de contenido humedo.
2. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz adicionalmente comprende uno o mas plastificantes.
3. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicho agente reticulante se selecciona del grupo que consiste en 1-[3- (dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), formaldehudo, glutaraldehfdo, poliaziridinas, diglicidil eteres y mezclas de los mismos.
4. Matriz segun la reivindicacion 3, en donde dicho agente reticulante es una mezcla de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3- etil carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS).
5. Matriz segun la reivindicacion 3, en donde dicho agente reticulante es diglicil eter.
6. Matriz segun la reivindicacion 2, en donde dicho plastificante se proporciona en una cantidad de hasta el 10% en peso de dicha matriz.
7. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz comprende adicionalmente uno o mas agentes farmaceuticos o qrnmicos.
8. Matriz segun la reivindicacion 7, en donde dichos uno o mas agentes farmaceuticos o qrnmicos se seleccionan del grupo que consiste en un antibiotico, antiviral, clorhexidina, triclosan, povidona yodada, metales antimicrobianos, compuestos a base de bismuto, inmunosupresores, agentes antiproliferativos, agentes antiinflamatorios, anestesicos, agentes anti-envejecimiento y mezclas de los mismos.
9. Matriz segun la reivindicacion 8, en donde dicho metal antimicrobiano se selecciona del grupo que consiste en iones de plata, plata metalica, sal de plata, cobre, platino, oro y mezclas de los mismos.
10. Matriz segun la reivindicacion 8, en donde dicho anestesico es lidocama.
11. Matriz segun la reivindicacion 7, en donde dichos uno o mas agentes farmaceuticos o qrnmicos se proporciona en una cantidad del 1% al 25% en peso de dicha matriz.
12. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz se proporciona como una pelfcula, lamina, tubo o esponja.
13. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz se proporciona junto con un material seleccionado del grupo que consiste en laminas polimericas, pelfculas polimericas, membranas de silicona, poliuretano, polietileno, tereftalato de polietileno, nailon, seda, celulosa y combinaciones de los mismos.
14. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz se proporciona como un aposito para heridas, barrera para heridas, recubrimiento de tejidos y/o recubrimiento vascular.
15. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz es para reducir la inflamacion cronica.
16. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz es para absorber exudados.

5

10

15

20

25

30

35
17. Matriz segun la reivindicacion 1, en donde dicha matriz es para promover un entorno humedo.
18. Matriz segun la reivindicacion 8, en donde dicho agente farmaceutico es sirolimus.
19. Metodo para la realizacion de una matriz elastica de gelatina no adhesiva, donde el metodo comprende:

(a) mezclar colageno, colageno desnaturalizado, o una combinacion de los mismos en una solucion y calentar dicha solucion;

(b) anadir uno o mas polfmeros biocompatibles a (a);

(c) anadir al menos un agente reticulante a (b);

(d) enfriar (c); y

(e) liofilizar el resultado de (d) para formar la matriz de protema elastica no adhesiva.
20. Metodo segun la reivindicacion 19, en donde uno o mas polfmeros biocompatibles se seleccionan del grupo que consiste en polietilenglicol, poli-L-lisina, alginato, chitosan, acido hialuronico, sulfato de condroitina, y una combinacion de los mismos.
21. Metodo segun la reivindicacion 19 o 20, en donde al menos un agente reticulante se selecciona del grupo que consiste en 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), formaldel'ndo, glutaraldehndo, una poliaziridina, un diglicidil eter, y una combinacion de los mismos.
22. Metodo segun la reivindicacion 21, en donde dicho al menos un agente reticulante es diglicil eter.
23. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en donde la composicion pre-liofilizada (d) comprende un 0,5-30% en peso de colageno o colageno desnaturalizado; hasta un 10% en peso de uno o mas polfmeros biocompatibles; 0,1-2% en peso de dichos uno o mas agentes reticulantes; y de un 50% a un 99% en peso de disolvente.
24. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en donde la matriz de protema elastica no adhesiva comprende:

- un 50-90% en peso de colageno, colageno desnaturalizado, o una combinacion de los mismos;

- hasta un 40% en peso de polietilenglicol, poli-L-lisina, alginato, chitosan, acido hialuronico, sulfato de condroitina, o una combinacion de los mismos; y

- un 0,5-5% en peso de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), formaldel'ndo, glutaraldehndo, una poliaziridina, un diglicidil eter, o una combinacion de los mismos.
25. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en donde uno o mas plastificantes se anade a (b) y/o a (c).
26. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, en donde uno o mas agentes farmaceuticos o qrnmicos puede anadirse antes y/o despues de la etapa (c).
27. Metodo segun la reivindicacion 26, en donde dichos uno o mas agentes farmaceuticos o qrnmicos se selecciona del grupo que consiste en un antibiotico, antiviral, clorhexidina, triclosan, povidona yodada, metales antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, agentes antiproliferativos, compuestos a base de bismuto, inmunosupresores, anestesicos, agentes anti-envejecimiento y mezclas de los mismos.
28. Metodo segun la reivindicacion 27, en donde dicho metal antimicrobiano se selecciona del grupo que consiste en iones de plata, plata metalica, sal de plata, cobre, platino, oro y mezclas de los mismos.
29. Metodo segun la reivindicacion 27, en donde dicho anestesico es lidocama.
30. Metodo segun la reivindicacion 27, en donde dicho agente farmaceutico es sirolimus.
31. Metodo segun la reivindicacion 26, en donde dichos uno o mas agentes farmaceuticos o qmmicos se proporcionan en una cantidad del 0,1% al 10% en peso de dicha matriz.