ES2582078T3 - Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 22; y b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica.

Description

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de unidades de p-hidroxifenilpropano diversamente sustituido que proporciona resistencia a la pared celular para soportar la tensión mecánica, y también protege la celulosa de la hidrólisis enzimática.
La lignocelulosa es una combinación de celulosa y hemicelulosa y polímeros de unidades de fenol propanol y lignina. Es físicamente dura, densa y e inaccesible y el material bioquímico más abundante en la biosfera. Los materiales que contienen lignocelulosa son, por ejemplo: virutas de madera dura y de madera blanda, pasta de madera, serrín y residuos industriales de forestales y de madera; biomasa agrícola tal como paja de cereales, pasta de remolacha azucarera, rastrojo y mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, tallos, hojas, cáscaras, cascarillas, y similares; productos de desecho tales como residuos sólidos urbanos, papel de periódico y de oficina de desecho, residuos de la molienda de, p. ej. cereales; cultivos destinados a la producción de energía (p. ej., sauce, chopo, pasto varilla o alpiste arundináceo, y similares). Los ejemplos preferidos son el rastrojo de maíz, el pasto varilla, la paja de cereales, el bagazo de caña de azúcar y los materiales derivados de la madera.
"Material celulósico" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier material que comprende celulosa, hemicelulosa y/o lignocelulosa como componente significativo. "Material lignocelulósico" significa cualquier material que comprende lignocelulosa. Tales materiales son, p. ej. materiales vegetales tales como madera incluyendo madera blanda y dura, cultivos herbáceos, residuos agrícolas, residuos de pasta de celulosa y de papel, papel usado, residuos de la industria alimenticia y de forraje, etc. Las fibras textiles, como el algodón, las fibras derivadas de algodón, lino, cáñamo, yute y fibras celulósicas elaboradas por el hombre como modal, viscosa, liocel son ejemplos específicos de materiales celulósicos.
El material celulósico es degradado en la naturaleza por diversos organismos diferentes, incluyendo bacterias y hongos. La celulosa es degradada típicamente por diferentes celulasas que actúan sucesivamente o simultáneamente. La conversión biológica de celulosa en glucosa requiere generalmente tres tipos de enzimas hidrolíticas: (1) Endoglucanasas que cortan los enlaces glicosídicos beta-1,4 internos; (2) Exocelobiohidrolasas que cortan el disacárido celobiosa del extremo de la cadena polimérica de celulosa; (3) Beta-1,4-glucosidasas que hidrolizan la celobiosa y otros celo-oligosacáridos cortos a glucosa. En otras palabras, los tres principales grupos de celulasas son celobiohidrolasas (CBH), endoglucanasas (EG) y beta-glucosidasas (BG).
La degradación de los sustratos que contienen celulosa más complejos requiere una amplia gama de enzimas diferentes. Por ejemplo la lignocelulosa es degradada por las hemicelulasas, como xilanasas y mananasas. La hemicelulasa es un enzima que hidroliza la hemicelulosa.
Las "enzimas celulolíticas" son enzimas que tienen "actividad celulolítica", lo que significa que son capaces de hidrolizar sustratos celulósicos o derivados de los mismos a sacáridos más pequeños. Por lo tanto, las enzimas celulolíticas incluyen tanto celulasas como hemicelulasas. Celulasas según se utiliza en la presente memoria incluyen celobiohidrolasas, endoglucanasas y beta-glucosidasas.
T. reesei tiene un sistema de celulasa bien conocido y eficaz, que contiene dos CBH, dos EG y BG principales y varias minoritarias. La CBHI de T. reesei (Cel7A) corta el azúcar desde el extremo reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa C-terminal (CBD) y puede constituir hasta 60% de la proteína secretada total. La CBHII de T. reesei (Cel6A) corta el azúcar desde el extremo no reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa N-terminal y pueden constituir hasta 20% de la proteína secretada total. Las endoglucanasas EGI (Cel7B), y EGV (Cel45A) tienen un CBD en su extremo C-terminal, EGII (Cel5A) tiene un CBD N-terminal y EGIII (Cel12A) no tiene ningún dominio de unión a celulosa. La CBHI, CBHII, EGI y EGII también se denominan "celulasas principales de Trichoderma" que comprenden juntas 80-90% de las proteínas secretadas totales. Los expertos en la técnica saben que una enzima puede ser activa sobre diversos sustratos y las actividades enzimáticas se pueden medir utilizando diferentes sustratos, métodos y condiciones. La identificación de las diferentes actividades celulolíticas son comentadas, p. ej., por Van Tilbeurgh et al. 1988.
Además de un dominio/núcleo catalítico que expresa la actividad celulolítica, las enzimas celulolíticas pueden comprender uno o más dominios de unión a celulosa (CBD), también denominados dominios/módulos de unión a carbohidratos (CBD/CBM), que pueden estar localizados en el extremo N o C del dominio catalítico. Los CBD tienen actividad de unión a carbohidratos y median la unión de la celulasa a la celulosa cristalina, pero tienen poco o ningún efecto sobre la actividad hidrolítica de celulasa de la enzima sobre sustratos solubles. Estos dos dominios están conectados típicamente a través de una región conectora flexible y altamente glicosilada.
"Celobiohidrolasa" o "CBH" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a enzimas que escinden la celulosa desde el extremo de la cadena de glucosa y producen principalmente celobiosa. También se denominan 1,4-beta-Dglucanocelobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Hidrolizan los enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos desde los extremos reductores o no reductores de un polímero que contiene dichos enlaces, tales como celulosa, por medio de lo cual se libera celobiosa. Se han aislado dos CBH diferentes de Trichoderma reesei, CBHI y CBHII. Estas tienen una estructura modular que consiste en un dominio catalítico conectado a un dominio de unión a celulosa (CBD). También existen celobiohidrolasas en la naturaleza que carecen de CBD.
"Endoglucanasa" o "EG" se refiere a enzimas que cortan los enlaces glicosídicos internos de la cadena de celulosa. Se clasifican como EC 3.2.1.4. Son 1,4-beta-D-glucano-4-glucanohidrolasas y catalizan la endohidrólisis de los
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Según una realización de la invención, se utiliza un polipéptido celulolítico que tiene una identidad al menos 80, 85, 90, 95 o 99% con la SEQ ID NO: 22 o al menos con su fragmento enzimáticamente activo.
Mediante el término "fragmento enzimáticamente activo" se quiere significar cualquier fragmento de una secuencia definida que tiene actividad celulolítica. En otras palabras un fragmento enzimáticamente activo puede ser la parte de la proteína madura de la secuencia definida, o puede ser solamente un fragmento de la parte de la proteína madura, siempre que tenga todavía actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa o xilanasa.
Las enzimas celulolíticas son preferiblemente enzimas recombinantes, que pueden ser producidas de una manera generalmente conocida. Se aísla un fragmento de polinucleótido que comprende el gen de la enzima, el gen se inserta bajo un promotor fuerte en un vector de expresión, el vector se transfiere en células anfitrionas adecuadas y las células anfitrionas se cultivan en condiciones que provocan la producción de la enzima. Los métodos para la producción de proteínas mediante tecnología recombinante en diferentes sistemas anfitriones son bien conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989; Coen, 2001; Gellissen, 2005). Preferiblemente, las enzimas se producen como enzimas extracelulares que son secretadas al medio de cultivo, a partir del cual se puede recuperar y aislarse fácilmente. Se puede utilizar el medio de cultivo gastado del anfitrión de producción tal cual, o se pueden retirar de allí las células anfitrionas, y/o se puede concentrar, filtrar o fraccionar. También se puede secar.
El polipéptido aislado en el presente contexto puede significar simplemente que las células y los residuos celulares se han retirado del medio de cultivo que contiene el polipéptido. Convenientemente, los polipéptidos se aíslan, p. ej., añadiendo polímeros aniónicos y/o catiónicos al medio de cultivo gastado para mejorar la precipitación de las células, los restos celulares y algunas enzimas que tienen actividades secundarias no deseadas. A continuación el medio se filtra, utilizando un agente de filtración inorgánico y un filtro para retirar los precipitantes formados. Después de esto el producto filtrado se procesa adicionalmente utilizando una membrana semi-permeable para retirar el exceso de sales, azúcares y productos metabólicos.
Según una realización de la invención, el polinucleótido heterólogo comprende un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 16725.
El anfitrión de producción puede ser cualquier organismo capaz de expresar la enzima celulolítica. Preferiblemente, el anfitrión es una célula microbiana, más preferiblemente un hongo. Lo más preferiblemente, el anfitrión es un hongo filamentoso. Preferiblemente, el anfitrión recombinante se modifica para expresar y secretar enzimas celulolíticas como su actividad principal o una de sus actividades principales. Esto se puede realizar mediante la supresión de los principales genes homólogos secretados, p. ej., las cuatro principales celulasas de Trichoderma y dirigiendo genes heterólogos a un locus que se ha modificado para asegurar altos niveles de expresión y producción. Los anfitriones preferidos para la producción de las enzimas celulolíticas son en particular cepas del género Trichoderma o Aspergillus.
Las enzimas necesarias para la hidrólisis del material celulósico según la invención se pueden añadir en una cantidad enzimáticamente eficaz o bien simultáneamente, p. ej., en forma de una mezcla de enzimas, o bien sucesivamente, o bien como una parte de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). Se puede utilizar cualquier combinación de las celobiohidrolasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o con un fragmento enzimáticamente activo del mismo junto con cualquier combinación de endoglucanasas y beta-glucosidasas. Si el material celulósico comprende hemicelulosa, se utilizan adicionalmente para la degradación hemicelulasas, preferiblemente xilanasas. Las endoglucanasas, beta-glucosidasas y xilanasas se pueden seleccionar entre las descritas en la presente memoria, pero no se limitan a las mismas. Estas pueden ser también por ejemplo preparaciones de enzimas asequibles comercialmente. Además de celulasas y hemicelulasas opcionales se pueden utilizar una o más enzimas, por ejemplo, proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas. Se puede llevar a cabo otro tratamiento enzimático antes, durante o después del tratamiento con celulasa.
El término "preparación de enzima" se refiere a una composición que comprende al menos una de las enzimas deseadas. La preparación puede contener las enzimas en forma al menos parcialmente purificada y aislada. Ésta puede consistir incluso esencialmente en la enzima o enzimas deseadas. Alternativamente, la preparación puede ser un medio de cultivo gastado o producto filtrado que contiene una o más enzimas celulolíticas. Además de la actividad celulolítica, la preparación puede contener aditivos, tales como mediadores, estabilizantes, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes del medios de cultivo. Los aditivos preferidos son tales que se utilizan comúnmente en preparaciones de enzimas destinadas a una aplicación concreta. La preparación de enzima puede estar en forma de líquido, polvo o granulado. Preferiblemente, la preparación de enzima es medio de cultivo gastado. El "medio de cultivo gastado" se refiere al medio de cultivo del anfitrión que comprende las enzimas producidas. Preferiblemente, las células anfitrionas se separan de dicho medio después de la producción.
Según una realización de la invención la preparación de enzima comprende una mezcla de CBH, EG y BG, opcionalmente junto con xilanasa y/u otras enzimas. La CBH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o con un fragmento enzimáticamente activo del mismo, y se puede obtener a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, mientras que EG, BG y xilanasa pueden ser de cualquier origen, incluyendo a partir de dichos
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organismos. Otras enzimas que podrían estar presentes en la preparación son, p. ej. proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas.
Se pueden utilizar mezclas y combinaciones de enzimas para adaptarse a diferentes condiciones del proceso. Por ejemplo, si el proceso de degradación se lleva a cabo a una temperatura alta, se eligen enzimas termoestables. Una combinación de una CBH de la familia 7 con una endoglucanasa de la familia 45, opcionalmente combinadas con una BG de la familia 3 y/o una xilanasa de la familia 10 tuvo un excelente rendimiento de hidrólisis tanto a 45°C, como a temperaturas elevadas.
Las enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei se utilizan convencionalmente a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 40-50°C en la hidrólisis, y a 30-40°C en SSF. La CBH, EG, BG y Xyn obtenibles de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum también son eficientes a estas temperaturas, pero además la mayoría de ellas también funciona extremadamente bien a temperaturas entre 50°C y 75°C, o incluso hasta 80°C y 85°C, tal como entre 55°C y 70°C, p. ej., entre 60°C y 65°C. Para tiempos de incubación cortos las mezclas de enzimas son funcionales incluso hasta 85°C, para la hidrólisis completa se utilizan normalmente temperaturas más bajas.
El método para el tratamiento de material celulósico con CBH, EG y BG y Xyn es especialmente adecuado para la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico. Los azúcares fermentables se pueden fermentar a continuación por medio de levadura en etanol, y utilizar como combustible. También se pueden utilizar como intermedios o materias primas para la producción de diversos productos químicos o elementos esenciales para los procesos de la industria química, p. ej. en la denominada biorrefinería. El material lignocelulósico se puede pretratar antes de la hidrólisis enzimática para desorganizar la estructura de fibra de los sustratos celulósicos y hacer la fracción de celulosa más accesible a las enzimas celulolíticas. Los pretratamientos actuales incluyen procesos mecánicos, químicos o térmicos y sus combinaciones. El material puede ser pretratado por ejemplo mediante explosión de vapor o hidrólisis ácida.
Se encontraron diversos nuevos polipéptidos celulolíticos en Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, y Chaetomium thermophilum. Los nuevos polipéptidos pueden comprender un fragmento que tiene actividad celulolítica y se pueden seleccionar del grupo que consiste en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 66%, preferiblemente 70% o 75%, con la SEQ ID NO: 4, una identidad de 79% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de 78% con la SEQ ID NO: 12, una identidad de 68%, preferiblemente 70% o 75%, identidad con la SEQ ID NO: 14, una identidad de 72%, preferiblemente 75%, con la SEQ ID NO: 16, una identidad de 68%, preferiblemente 70% o 75%, con la SEQ ID NO: 20, una identidad de 74% con la SEQ ID NO: 22 o 24, o una identidad de 78% con la SEQ ID NO: 26.
Los nuevos polipéptidos también pueden ser variantes de dichos polipéptidos. Una "variante" puede ser un polipéptido que se produce naturalmente, p. ej., en forma de una variante alélica dentro de la misma cepa, especie o género, o puede haber sido generado mediante mutagénesis. Puede comprender sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, pero todavía funciona de una manera sustancialmente similar a las enzimas definidas anteriormente, es decir, comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica.
Los polipéptidos celulolíticos se producen normalmente en las células en forma de polipéptidos inmaduros que comprenden una secuencia señal que es escindida durante la secreción de la proteína. También pueden ser procesados adicionalmente durante la secreción, en el extremo N-terminal y/o extremo C-terminal para dar una proteína enzimáticamente activa, madura. Un polipéptido "que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica" significa por lo tanto que el polipéptido puede estar en forma inmadura o madura, preferiblemente está en forma madura, es decir, ha tenido lugar el procesamiento.
Los nuevos polipéptidos pueden ser, adicionalmente, un "fragmento de los polipéptidos o variantes" mencionados anteriormente. El fragmento puede ser la forma madura de las proteínas mencionadas anteriormente, o puede ser solamente una parte enzimáticamente activa de la proteína madura. De acuerdo con una realización de la invención, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80, 85, 90, 95, o 99% con la SEQ ID NO: 22, o con un fragmento celulolíticamente activo del mismo. También puede ser un fragmento del mismo que tiene actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, xilanasa, o beta-glucosidasa. De acuerdo con otra realización de la invención, el polipéptido consiste esencialmente en un fragmento celulolíticamente activo de una secuencia de la SEQ ID NO: 22.
Los nuevos polinucleótidos pueden comprender una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 o 25, o una secuencia que codifica un nuevo polipéptido como se ha definido anteriormente, incluyendo hebras complementarias del mismos. Polinucleótido según se utiliza en la presente memoria se refiere tanto a ARN y ADN, y puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. El polinucleótido también puede ser un fragmento de dichos polinucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos, p. ej. al menos 25, 30 o 40 nucleótidos. También puede tener al menos 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Adicionalmente, el polinucleótido puede ser degenerado como resultado del código genético con respecto a una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente. Esto significa que diferentes codones pueden codificar para el mismo aminoácido.
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Según una realización de la invención el polinucleótido está "comprendido en" la SEQ ID NO: 21, lo que significa que la secuencia tiene al menos parte de la secuencia mencionada. Según otra realización de la invención, el polinucleótido comprende un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 16725.
Las nuevas proteínas/polipéptidos se pueden preparar como se ha descrito anteriormente. Los nuevos polinucleótidos se pueden insertar en un vector, que es capaz de expresar el polipéptido codificado por la secuencia heteróloga, y el vector se puede insertar en una célula anfitriona capaz de expresar dicho polipéptido. La célula anfitriona es preferiblemente del género Trichoderma o Aspergillus.
Se ha introducido un gen heterólogo que codifica los nuevos polipéptidos en un plásmido en una cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 16725.
Las nuevas enzimas pueden ser componentes de una preparación de enzima. La preparación de enzima puede comprender uno o más de los nuevos polipéptidos, y puede estar, p. ej. en forma de medio de cultivo gastado, polvo, gránulos o líquido. Según una realización de la invención, comprende actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, y opcionalmente xilanasa y/o otras actividades enzimáticas. Puede comprender adicionalmente cualquier aditivo convencional.
Las nuevas enzimas se pueden aplicar en cualquier proceso que implique enzimas celulolíticas, tal como en la industria de combustibles, textil, detergentes, pasta de celulosa y papel, alimentos, forrajes o bebidas, y especialmente en la hidrólisis de material celulósico para la producción de biocombustible que comprende etanol. En la industria de la pasta de celulosa y el papel se pueden utilizar para modificar la fibra celulósica, por ejemplo, en el tratamiento de pasta kraft, pasta mecánica, o papel reciclado.
La invención se ilustra con los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Escrutinio para determinar las cepas que expresan la actividad celulolítica y su cultivo para la purificación
Se sometieron a ensayo aproximadamente 25 cepas de hongos de la colección de cultivos Roal Oy para determinar la actividad celulolítica incluyendo beta-glucosidasas. Después del escrutinio preliminar se eligieron seis cepas para estudios posteriores. Estas fueron ALKO4239 y ALKO4242 de Thermoascus aurantiacus, ALKO4245 de Acremonium thermophilum, ALKO4246 de Talaromyces thermophilus y ALKO4261 y ALKO4265 de Chaetomium thermophilum.
Las cepas ALKO4239, ALKO4242 y ALKO4246 se cultivaron en matraces oscilantes a 42°C durante 7 días en el medio 3 x B, que contiene g/litro: celulosa Solka Floc 18, bagazo de destilería 18, xilano de espelta de avena 9, CaCO3 2, harina de soja 4,5, (NH4)HPO4 4,5, salvado de trigo 3,0, KH2PO4 1,5, MgSO4·H2O 1,5, NaCl 0,5, KNO3 0,9, goma garrofín 9,0, disolución de elementos traza Núm. 1 0,5, disolución de elementos traza Núm. 2 0,5 y Struktol (Stow, OH, USA ) antiespumante 0,5 ml; el pH se ajustó a 6,5. La disolución de elementos traza Núm. 1 tiene g/litro: MnSO4 1,6, ZnSO4·7H2O 3,45 y CoCl2·6H2O 2,0; la disolución de elementos traza Núm. 2 tiene g/litro: FeSO4·7H2O 5,0 con dos gotas de H2SO4 concentrado.
La cepa ALKO4261 se cultivó en matraces oscilantes en el medio 1XB, que tiene un tercio de cada uno de los componentes del medio 3 x B (anterior), excepto que tiene mismas concentraciones de CaCO3, NaCl y elementos traza. La cepa se cultivó a 45°C durante 7 d.
La cepa ALKO 4265 se cultivó en matraces oscilantes en el siguiente medio, g/I: celulosa Solka Floc 40, Pharmamedia™ (Traders Protein, Memphis, TN, USA) 10, polvo de aguas de infusión de maíz 5, (NH4)2SO4 5 y KH2PO4 15; el pH se ajustó a 6,5. La cepa se cultivó a 45°C durante 7 d.
Después del cultivo las células y otros sólidos se recogieron por centrifugación y se recuperó el sobrenadante. Para los cultivos en matraz oscilante, se añadieron los inhibidores de proteasa PMSF (fluoruro de fenilmetil-sulfonilo) y pepstatina A a 1 mM y 10 µg/ml, respectivamente. Si no se utilizan inmediatamente, las preparaciones se almacenan en alícuotas a -20°C.
Para la estimación de la termoactividad de las enzimas, se realizaron análisis de las preparaciones de cultivo en matraz oscilante a 50°C, 60°C, 65°C, 70°C y 75°C durante 1 h, en presencia de 100 µg de albúmina de suero bovino (BSA)/ml como estabilizador. Se realizaron análisis preliminares a 50°C y 65°C a dos valores de pH diferentes (4,8/5,0 o 6,0) con el fin de aclarar qué pH era el más apropiado para el análisis de termoactividad.
Se analizaron todos los sobrenadantes de los matraces oscilantes para determinar las siguientes actividades:
Actividad de tipo celobiohidrolasa I ('CBHI') y actividad de tipo endoglucanasa I ('EGI'):
Éstas se midieron en tampón de acetato de Na 50 mM con MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido) 0,5 mM como sustrato. Se añadió glucosa (100 mM) para inhibir cualquier actividad de beta-glucosidasa interferente. El 4
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metilumbeliferilo liberado se midió a 370 nm. Las actividades de 'CBHI' y 'EGI' se distinguieron midiendo actividad en presencia y ausencia de celobiosa (5 mM). La actividad que no es inhibida por celobiosa representa la actividad 'EGI' y la actividad MUL restante representa la actividad 'CBHI' (van Tilbeurgh et al, 1988). El análisis se realizó a pH 5,0 o 6,0 (véase más abajo).
Actividad endoglucanasa (CMCasa):
Ésta se analizó carboximetilcelulosa (CMC) al 2% (p/v) como sustrato en tampón de citrato 50 mM esencialmente como describen Bailey y Nevalainen 1981; Haakana et al. 2004. Los azúcares reductores se midieron con el reactivo DNS. El análisis se realizó a pH 4,8 o 6,0 (véase más abajo).
Actividad beta-glucosidasa (BGU):
Ésta se analizó con 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (1 mM) en tampón de citrato 50 mM como describen Bailey y Nevalainen 1981. El 4-nitrofenol liberado se midió a 400 nm. El análisis se realizó a pH 4,8 o 6,0 (véase más abajo).
Las actividades relativas de las enzimas se presentan en la Figura 1. Las actividades relativas se presentaron ajustando la actividad a 60°C como 100% (Figura 1). Todas las cepas produjeron enzimas, que tenían una actividad elevada a altas temperaturas (65°C-75°C).
Para las purificaciones de las proteínas, también se cultivó ALKO4242 en un biorreactor de 2 litros (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 40, harina de soja 10, NH4NO3 5, KH2PO4 5, MgSO4·7H2O 0,5, CaCl2·2H2O 0,05, disolución de elementos traza Núm. 1 0,5, disolución de elementos traza Núm. 2 0,5. La aireación a fue de 1 vvm, control antiespumante con Struktol, agitación a 200-800 rpm y temperatura a 47°C. Se hicieron circular dos lotes, uno a pH 4,7 ± 0,2 (NH3/H2SO4) y el otro con un pH inicial de pH 4,5. El tiempo de cultivo fue de 7 d. Después del cultivo las células y otros sólidos se eliminaron mediante centrifugación.
La cepa ALKO4245 se cultivó en un bioreactor de 2 litros (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 40, polvo de aguas de infusión de maíz 15, bagazo de destilería 5, xilano de espelta de avena 3, goma garrofín 3, (NH4)2SO4 5 y KH2PO4 5. El intervalo de pH fue de 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), aireación a 1 vvm, agitación a 300-600 rpm, control antiespumante con Struktol y temperatura de 42°C. El tiempo de cultivo fue de 4 d. Después del cultivo las células y otros sólidos se eliminaron mediante centrifugación.
Para la purificación de la enzima, se cultivó ALKO4261 en un biorreactor de 10 litros (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 30, bagazo de destilería 10, xilano de espelta de avena 5, CaCO3 2, harina de soja 10, salvado de trigo 3,0, (NH4)2SO4 5, KH2PO4 5, MgSO4·7H2O 0,5, NaCl 0,5, KNO3 0,3, solución de elementos traza Núm. 1 0,5 y disolución de elementos traza Núm. 2 0,5. El intervalo de pH fue de 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), aireación a 1 vvm, agitación a 200-600 rpm, control antiespumante con Struktol y temperatura de 42°C. El tiempo de cultivo fue de 5 d. Se cultivó un segundo lote en condiciones similares excepto que se añadió Solka Floc a 40 g/I y bagazo a 15 g/l. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania). El último sobrenadante se concentró aproximadamente diez veces utilizando el sistema ultrafiltración Pellicon Mini (filtro NMWL de 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).
Para la purificación de la enzima, ALKO4265 también se cultivó en un biorreactor de 10 litros (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Alemania) en el mismo medio que antes, excepto que se añadió KH2PO4 a 2,5 g/I. El intervalo de pH fue de 5,3 ± 0,3 (NH3/H3PO4), aireación a 0,6 vvm, agitación a 500 rpm, control antiespumante con Struktol y temperatura de 43°C. El tiempo de cultivo fue de 7 d. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania). El último sobrenadante se concentró aproximadamente 20 veces utilizando el sistema de ultrafiltración Pellicon Mini (filtro NMWL de 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).
Ejemplo 2. Purificación y caracterización de celobiohidrolasas de Acremonium thermophilum ALKO4245 y Chaetomium thermophilum ALKO4265
Se cultivaron Acremonium thermophilum ALKO4245 y Chaetomium thermophilum ALKO4265 como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las principales celobiohidrolasas se purificaron utilizando una columna de afinidad basada en paminobencil-1-tio-β-celobiósido, preparada como describen Tomme et al.,1988.
Los sobrenadantes del cultivo se tamponaron en primer lugar en tampón de acetato de sodio 50 mM de pH 5,0, que contenía δ-gluconolactona 1 mM y glucosa 0,1 M con el fin de retardar la hidrólisis del ligando en presencia de βglucosidasas. Las celobiohidrolasas se hicieron eluir con lactosa 0,1 M y finalmente se purificaron mediante cromatografía de filtración en gel utilizando columnas Superdex 200 HR 10/30 en el sistema ÄKTA (Amersham Pharmacia Biotech). El tampón utilizado en la filtración de gel fue fosfato de sodio 50 mM de pH 7,0, que contenía cloruro de sodio 0,15 M.
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La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,4 M en el tampón de equilibrado. La proteína que contiene actividad endoglucanasa se hizo eluir en la zona de conductividad de 15-21 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron como antes.
La muestra se aplicó a una columna de filtración en gel Sephacryl S-100 HR 26/60 equilibrada con tampón acetato de sodio 50 mM de pH 5,0, que contenía NaCl 0,05 M. La fracción de proteína que contenía actividad endoglucanasa se hizo eluir de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 16 kDa. Las fracciones recogidas se combinaron, se concentraron y se repitió la filtración en gel. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se consideró que el peso molecular era de 28 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada EG_28 de Ta, en un gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) era de aproximadamente 3,5. Se determinó que la actividad específica de EG_28 de Ta a 50°C era de 4290 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato CMC).
Ejemplo 6. Purificación y caracterización de una β-glucosidasa de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio aniónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de Phenyl Sepharose FF de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado a fosfato de potasio 5 mM en la zona de conductividad de 137-16 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con fosfato de potasio 10 mM de pH 7,0. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 0,25 M en la zona de conductividad de 1,5-12 mS/cm. La cromatografía de intercambio aniónico se repitió como antes, excepto que se utilizó tampón de fosfato de potasio 4 mM de pH 7,2 mM. Las proteínas se hicieron eluir a la zona conductividad de 6-9 mS/cm. Las fracciones que contenían actividad de β-glucosidasa se recogieron, se combinaron y se concentraron.
El material activo de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna HR 26/60 Sephacryl S-300 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 6,5, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína con actividad βglucosidasa se hizo eluir con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 243 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 101 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada A βG_101, en un gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) estaba en la zona de 5,6-4,9. Se determinó que la actividad específica de βG_101 de At a 50°C era de 1100 nkat/mg (utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato, Bailey y Linko, 1990).
La estabilidad térmica de la β-glucosidasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de 0,1 mg/ml de BSA a pH 5,0 durante 60 min utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. La βG_101 de A. thermophilum fue estable hasta 70°C. La enzima de referencia de Aspergillus (Novozym 188) conservó 100% de la actividad hasta 60°C.
Ejemplo 7. Purificación de una β-glucosidasa de Chaetomium thermophilum ALKO4261
Se cultivó Chaetomium thermophilum ALKO4261 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990).
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,8 M. La elución se llevó a cabo con un gradiente lineal desde tampón de equilibrado a fosfato de potasio 3 mM, pH 6,0, seguido de elución con agua y urea 6 M. Las primeras fracciones con actividad β-glucosidasa se hicieron eluir en la zona de conductividad de 80-30 mS/cm. La segunda actividad β-glucosidasa se hizo eluir con urea 6 M. Las fracciones activas eluidas mediante urea se reunieron y se desalaron en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con Tris-HCl 10 pH 7,0.
Después de la eliminación de las sales, la muestra se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM de pH 7,0. La proteína no se unió a la columna, sino que eluyó durante la introducción de la muestra. Esta fracción de flujo directo se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con acetato de Na 7 mM, pH 4,5.
La muestra de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP FF equilibrada con acetato de sodio 10 mM de pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal
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directo durante la introducción de la muestra. Este eluato se concentró mediante ultrafiltración. La cromatografía hidrófoba se repitió como se ha descrito anteriormente. Las proteínas no unidas se recogieron y se liofilizaron.
La muestra disuelta se cargó en la columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. Se estimó que la proteína eluida de la columna con el volumen de retención de 11,2 ml era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se consideró que la masa molecular de la proteína purificada sobre la base de los patrones de masa molecular (patrones SDS-PAGE teñidos previamente, Intervalo Amplio, Bio-Rad) era de 60 kDa. Se determino que la actividad específica de la proteína, denominada XYN_60 de At, a 50°C era de 1800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato xilano de abedul). La actividad relativa aumentó aproximadamente 1,2 veces a 60°C y 1,65 veces a 70°C (10 min, pH 5,0) en comparación con 50°C. Las actividades específicas contra MUG2 (4-metilumbeliferil-β-Dcelobiósido), MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido) y MUG3 (4-metilumbeliferil-β-D-celotriósido) fueron de 54, 33 y 78 nkat/mg (50°C, pH 5,0, 10 min), respectivamente. Esto está de acuerdo con el hecho de que las xilanasas de la familia 10 también muestran actividad contra los arilglucopiranósidos (Biely et al. 1997).
Ejemplo 10. Purificación de una xilanasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALKO4242 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La xilanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguida de filtración en gel. La actividad xilanasa se determinó utilizando como sustrato xilano de abedul (Procedimiento de la IUPAC 1987). La proteína se analizó mediante BioRad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un protocolo de elución de dos etapas. La elución se llevó a cabo dejando caer primero la concentración de sal a (NH4)2SO4 0,2 M y después de eso se aplicó un gradiente lineal de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,2 M a fosfato de potasio 5 mM de pH 6,0. La proteína se hizo eluir con (NH4)2SO4 0,2 M (I = 39 mS/cm).
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. La proteína no se unió a la columna de intercambio aniónico sino que eluyó en el flujo directo. La conductividad de la muestra se ajustó para que correspondiera a la de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 mediante adición de agua y el pH se ajustó a 4,5 durante la concentración mediante ultrafiltración.
La muestra se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 20 mM, pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 1 M. La enzima se hizo eluir en la zona de conductividad de 1-7 mS/cm. La muestra se liofilizó y después de eso se disolvió en agua.
La muestra liofilizada se disolvió en agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína se hizo eluir de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 26 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. La masa molecular de la proteína pura fue de 30 kDa según se evaluó sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE teñidos previamente, Intervalo Amplio, Bio-Rad). Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada XYN_30 de Ta con PhastSystem (Pharmacia) era de aprox. 6,8. Se determinó que la actividad específica de XYN_30 de Ta a 50°C era de 4800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato xilano de abedul).
Ejemplo 11. Secuenciación de aminoácidos internos
Los péptidos internos se secuenciaron mediante ionización por electropulverización combinada con espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS) utilizando un aparato Q-TOF1 (Micromass). La proteína se alquiló primero y se digirió en péptidos trípticos. Los péptidos generados se desalaron y se separaron parcialmente mediante nanocromatografía líquida (de fase inversa) antes de aplicarlos al aparato Q-TOF1. Las secuencias de los péptidos internos para las celobiohidrolasas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se muestran en la Tabla 2. Los péptidos de CBH de Chaetomium se obtuvieron después de haber clonado el correspondiente gen CBH. Los péptidos determinados de CBH de Acremonium no se utilizaron en la clonación del gen correspondiente.
Tabla 2. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de CBH (1_C -4_C) de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y de CBH (1_A -4_A) de Acremonium thermophilum ALKO4245.
Péptido
Secuencia
Péptido 1_C
T P S T N D A N A G F G R
Péptido 2_C
V A F S N T D D F N R
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I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS, Q/K = la masa molecular de la glutamina y la lisina difiere solo en 0,036 Da y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS.
Las secuencias de péptidos internos de las endoglucanasas, β-glucosidasas y xilanasas purificadas de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242 se enumeran en la Tabla 3, la Tabla 4 y la Tabla 5.
Tabla 3. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de las endoglucanasas EG_40 de Acremonium thermophilum ALK04245, EG_54 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 y EG_28 de Thermoascus aurantiacus ALK04242.
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10 (a I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS, Q/K = la masa molecular de la glutamina y la lisina difiere solo en 0,036 Da y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS.
Tabla 4. Secuencias de péptidos internos determinados a partir de las beta-glucosidasas βG_101 de Acremonium thermophilum ALK04245, βG_76 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 y βG_81 de Thermoascus aurantiacus
15 ALKO4242.
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Proteína
Péptido Secuencia(a
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Péptido 2 V V V G D D A G N P C
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Péptido 3 A F V S Q L T L L E K
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Péptido 4 G T D V L/I Y T P N N K
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Péptido 5 Q P N P A G P N A C V L/I R
βG_76 de Ct
Péptido 1 E G L F I D Y R
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Péptido 2 P G Q S G T A T F R
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Péptido 3 E T M S S N V D D R
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Péptido 4 I A L V G S A A V V
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Péptido 5 M W L C E N D R
imagen22
Péptido 6 Y P Q L C L Q D G P L G I R
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Péptido 7 E L N G Q N S G Y P S I
βG_81 de Ta
Péptido 1 T P F T W G K
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Péptido 2 L C L Q D S L P G V R
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Péptido 3 G V D V Q L G P V A G V A P R
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Péptido 4 V N L T L E
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Péptido 5 F T G V F G E D V V G
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Péptido 6 N D L P L T G Y E K
(a I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS
Tabla 5. Secuencias de péptidos internos determinados a partir de las xilanasas XYN_60 de Acremonium thermophilum ALK04245 y XYN_30 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Proteína
Péptido Secuencia
XYN_60 de At
Péptido 1 Y N D Y N L E Y N Q K
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Péptido 2 F G Q V T P E N
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Péptido 3 V D G D A T Y M S Y V N N K
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Péptido 4 K P A W T S V S S V L A A K
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Péptido 5 S Q G D I V P R A K
XYN_30 de Ta
Péptido 1 V Y F G V A T D Q N R
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Péptido 2 N A A I I Q A D F G Q V T P E N S M K
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Péptido 3 G H T L V W H S Q L P S W V S S I T D K
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Péptido 4 N H I T T L M T R
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Péptido 5 A W D V V N E A F N E D G S L R
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Péptido 6 L Y I N D Y N L D S A S Y P K
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Péptido 7 A S T T P L L F D G N F N P K P A Y N A I V Q D L Q Q
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Péptido 8 Q T V F L N V I G E D Y I P I A F Q T A R
5 Ejemplo 12. Construcción de bibliotecas genómicas para Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum
Se prepararon las bibliotecas genómicas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum
ALKO4245 para el vector Lambda DASH®II (Stratagene, USA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los
ADN cromosómicos, aislados por el método de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau 3A. Los 10 ADN digeridos también se fraccionaron por tamaños y los fragmentos del tamaño seleccionado (≈ 5-23 kb) se
desfosforilaron y se ligaron a los brazos del vector lambda digerido con BamHI. Las mezclas de ligación se
empaquetaron utilizando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del
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fabricante (Stratagene, USA). Los títulos de las bibliotecas genómicas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum fueron de 3,6 x 106 pfu/ml y 3,7 x 105 pfu/ml y los de las bibliotecas amplificadas fueron de 6,5 x 1010 pfu/ml y de 4,2 x 108 pfu/ml, respectivamente.
Se utilizó Lambda FIX® II/Xho I Partial Fill-In Vector Kit (Stratagene, USA) en la construcción de las bibliotecas genómicas para Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALKO4261 de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los ADN cromosómicos, aislados mediante el método de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau3A. Los ADN digeridos se fraccionaron por tamaños y los fragmentos del tamaño seleccionado (≈ 6-23 kb) se rellenaron y se ligaron a los brazos del vector Lambda FIX II digerido con XhoI. Las mezclas de ligación se empaquetaron utilizando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene, USA). Los títulos de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALKO4261 fueron de 0,2 x 106 y 0,3 x 106 pfu/ml y los de las bibliotecas amplificadas fueron de 1,8 x 109 y 3,8 x 109 pfu/ml, respectivamente.
Ejemplo 13. Clonación de los genes de celobiohidrolasa (CBH/cel7) de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum
Se utilizaron los métodos de biología molecular convencionales en el aislamiento y los tratamientos con enzima del ADN (plásmidos, fragmentos de ADN), en las transformaciones de E. coli, etc. Los métodos básicos utilizados se describen en los manuales de biología molecular convencionales, p. ej., Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).
Las sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas que se habían construido como se ha descrito en el Ejemplo 12 se amplificaron mediante PCR utilizando los ADN genómicos de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 como moldes en las reacciones. Varios cebadores sometidos a ensayo en reacciones de PCR se diseñaron de acuerdo con la secuencia de nucleótidos publicada (documento WO 03/000941, Hong et al., 2003b). Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, cada cebador 5 mM y 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y ≈0,5-1 µg del ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, o bien 1 min de recocido a 62°C (gradiente de ± 8°C) para los moldes de Thermoascus ALKO4242 y Chaetomium ALKO4265 o 1 min de recocido a 58°C (gradiente de ± 6°C) para el molde de Acremonium ALKO4245, 2 min de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min.
Los productos de ADN de los tamaños esperados (calculados a partir de las secuencias de CBH publicadas) se obtuvieron de todos los moldes genómicos utilizados. Los fragmentos de ADN de los tamaños esperados se aislaron de las reacciones de PCR más específicas y se clonaron en el vector pCR® Blunt-TOPO® (Invitrogen, USA). Los insertos se caracterizaron mediante secuenciación y llevando a cabo hibridaciones de transferencia Southern para los ADN genómicos digeridos con varias enzimas de restricción. Los fragmentos de PCR, que se eligieron para ser utilizados como sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6. Cebadores utilizados en las reacciones de PCR y sondas seleccionadas para el escrutinio de los genes CBH/cel7 de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum. Se muestran el ADN molde genómico y el nombre del plásmido que contiene el fragmento sonda.
Gen
Cebador directo Cebador inverso ADN molde Fragmento (kb) Plásmido
cbh de Ta
TCEL11 atgcgaactggcgttgggtcc TCEL12 gaatttggagctagtgtcgacg Thermoascus ALKO4242 0,8 kb pALK1633
cbh de Ct
TCEL7 cgatgccaactggcgctggac TCEL8 ttcttggtggtgtcgacggtc Chaetomium ALKO4265 0,8 kb pALK1632
cbh de At
TCEL13 agctcgaccaactgctacacg TCEL4 accgtgaacttcttgctggtg Acremonium ALKO4245 0,7 kb pALK1634
Las secuencias de aminoácidos deducidas de todas estas sondas tenían homología con varias secuencias publicadas de CBH (programa BLAST, versión 2.2.9 del NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul. et al, 1990), de la familia 7 de glicósido hidrolasas (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993).
Los insertos de los plásmidos enumerados en la Tabla 6 se marcaron con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania), y las bibliotecas genómicas amplificadas (2 x 105 -3 x 105 placas) se escrutaron con los fragmentos sonda marcados. La temperatura de hibridación para los filtros fue de 68°C y los filtros se lavaron 2 x 5 min a RT utilizando 2 x SSC -SDS al 0,1% seguido de 2 x 15 min a 68°C utilizando 0,1 x SSC
-SDS al 0,1% con las sondas homólogas utilizadas. Se obtuvieron varias placas positivas a partir de cada una de las hibridaciones. En el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium ALKO4245, algunas de las placas positivas hibridaron fuertemente con la sonda en cuestión, pero, además, hubo una cantidad de placas que hibridaron más débilmente con las sondas. Esto sugirió que otro u otros genes de celobiohidrolasa podrían estar 5 presentes en el genoma, causando una reacción cruzada. Se purificaron de cuatro a cinco placas que hibridaron fuertemente a partir de los escrutinios de las bibliotecas genómicas de Thermoascus ALKO4242 y Chaetomium ALKO4265. En el caso de Acremonium thermophilum ALKO4245, cuatro de las seis placas purificadas hibridaron débilmente con la sonda utilizada. Los ADN de fagos se aislaron y se caracterizaron mediante hibridaciones de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción seleccionados que hibridaron con la sonda se subclonaron con
10 el vector pBluescript II KS+ y se secuenciaron las regiones relevantes de los clones.
En total, se clonaron cuatro genes cbh/cel7; uno de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, uno de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y dos de Acremonium thermophilum ALKO4245 (en la fase temprana del trabajo, estos tenían los códigos At_cbh_C At_cbh_A y, a continuación, se denominaron At cel7 A y cel7B de At, respectivamente). La Tabla 7 resume la información sobre las sondas utilizadas para los escrutinios de los genes, los clones de fagos a
15 partir de los cuales se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contenían los genes completos con sus regiones promotoras y terminadoras, los nombres de los plásmidos, y los números de depósito DSM para las cepas de E. coli que portaban estos plásmidos.
Tabla 7. Sondas utilizadas para la clonación de los genes cbhlcel7, el clon de fago y los subclones seleccionados, el número de plásmido y el número de depósito de la correspondiente cepa de E. coli.
Gen
Sonda utilizada en el escrutinio Clon de fago Fragmento subclonado en pBluescript II Número de plásmido Núm. de depósito de E. coli
Cel7A de Ta
pALK1633 F12 XbaI de 3,2 kb pALK1635 DSM 16723
Cel7A de Ct
pALK1632 F36 PvuI -HindIII de 2,3 kb pALK1642 DSM 16727
cel7B de At
pALK1634 F6 EcoRI de 3,1 kb pALK1646 DSM 16728
Cel7A de At
pALK1634 F2 XhoI de 3,4 kb pALK1861 DSM 16729
20
La información relevante sobre los genes y las secuencias de proteínas deducidas (SEQ ID NO: 1-8) se resumen en la Tabla 8 y la Tabla 9, respectivamente.
Las secuencias de péptidos de las proteínas CBH purificadas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 (Tabla 2) se encontraron partir de las secuencias de aminoácidos deducidas
25 de los clones que contenían los genes Cel7A de Ct y Cel7A de At. Por lo tanto, se pudo concluir que los genes que codificaban las proteínas CBH/Cel7 purificadas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se habían clonado.
Tabla 8. Resumen de los genes cbh/cel7 aislados de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245.
Gen Cbh
Longitud con intrones (pb)(a Región codificante (pb)(b Núm. de intrones Longitudes de los intrones (pb) SEQ ID NO:
Cel7A de Ta
1439 1371 1 65 1
Cel7A de Ct
1663 1596 1 64 7
cel7B de At
1722 1377 3 134, 122, 87 3
Cel7A de At
1853 1569 4 88, 53, 54, 86 5
(a Está incluido el codón de PARADA. (b No está incluido el codón de PARADA.
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Tabla 9. Resumen de las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de los genes cbhlcel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK4265 y Acremonium thermophilum ALK04245. ss, secuencia señal.
Proteína CBH
Núm. de aa Longitud de ss NN/HMM(a CBD Cterminal (b PM pronosticado (Da, no incluida ss)(c pl pronosticado (no incluida ss) Supuestos sitios de N-glicosilación (d SEQ ID NO:
Cel7A de Ta
457 17/17 NO 46873 4,44 2 2
Cel7A de Ct
532 18/18 SI, T497 a L532 54564 5,05 3 8
Cel7B de At
459 21/21 NO 47073 4,83 2 4
Cel7A de At
523 17/17 SI, Q488 a L523 53696 4,67 4 6
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen. et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y el valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov.
(b Se indican el dominio de unión a celulosa (CBD), los aminoácidos de la región CBD C-terminal (M1 (se incluye en la numeración la Met Núm. 1))
(c No se incluyó la secuencia señal pronosticada. La predicción fue hecha utilizando la herramienta Compute pl/MW del servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003).
(d Número de secuencias NXS/T.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de Cel7A de Thermoascus aurantiacus y Cel7A de Acremonium thermophilum (núcleo, sin el CBD) eran muy homólogas entre sí (analizadas mediante el alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS 3.0.0 Needle, con Matrix EBLOSUM62, Penalización por Hueco 10,0 y Penalización por extensión 0,5; Needleman y Wunsch, 1970). Además, la Cel7A de Acremonium thermophilum deducida tenía una identidad menor con la Cel7A de Chaetomium thermophilum deducida. La Cel7B de Acremonium thermophilum fue muy distinta de las secuencias de CBH/Cel7 de la invención.
La secuencia de Cel7A de Chaetomium deducida poseía las identidades más altas (analizadas mediante alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS Needle, véase más arriba) con los polipéptidos de CBHI de Chaetomium thermophilum, Scytalidium thermophilum y Thielavia australiensis describos en el documento WO 03/000941. Del mismo modo, la secuencia de Cel7A de Thermoascus aurantiacus deducida era altamente idéntica a la de CBHI publicada de Thermoascus aurantiacus (documento WO 03/000941, Hong et al., 2003b). Cel7B de Acremonium thermophilum tenía identidades significativamente inferiores a las secuencias previamente publicadas, estando más estrechamente relacionada con el polipéptido de CBHI de Oryza sativa. Los mayores homologías de la secuencia de Cel7A de Acremonium thermophilum deducida fueron con los polinucleótidos de CBHI de Exidia gladulosa y Acremonium thermophilum (documento WO 03/000941). El alineamiento indica que las secuencias clonadas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 codifican las proteínas CBH que tienen alta homología con los polipéptidos de la familia 7 de glicósido hidrolasas, por lo tanto, éstas se denominaron Cel7A o Cel7B (Henrissat et al. 1998).
La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes CBH/cel 7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 y Thielavia entre sí, y adicionalmente con las secuencias encontradas en las bases de datos, se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Secuencias con una homología más alta con las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes CBH/cel 7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK04265 y Acremonium thermophilum ALK04245. El alineamiento se realizó utilizando el alineamiento global Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, Penalización por huevo 10,0, Penalización por extensión 0,5). * indica una secuencia de aminoácidos derivada de uno de los genes celobiohidrolasa clonados en este trabajo. 'Central' indica el alineamiento sin el CBD.
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
*Thermoascus aurantiacus Cel7A
100,0
Thermoascus aurantiacus, AY840982
99,6
Thermoascus aurantiacus, AX657575
99,1
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
Thermoascus aurantiacus, AF421954
97,8
Talaromyces emersonii, AY081766
79,5
Chaetomidium pingtungium, AX657623
76,4
Trichophaea saccata, AX657607
73,4
*Acremonium thermophilum Cel7A (núcleo)
70,6
Emericella nidulans, AF420020 (núcleo)
70,4
*Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
66,4
*Chaetomium thermophilum Cel7A
100,0
Chaetomium thermophilum, AY861347
91,9
Chaetomium thermophilum, AX657571
91,7
Scytalidium thermophilum, AX657627
74,7
Thielavia australiensis, AX657577
74,6
Acremonium thermophilum, AX657569
72,3
Exidia glandulosa, AX657613
68,0
*Acremonium thermophilum Cel7A
66,9
*Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
66,4
Exidia glandulosa, AX657615
60,8
Chaetomium pingtungium, AX657623
60,7
*Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
60,2
*Acremonium thermophilum Cel7B
100,0
Oryza sativa, AK108948
66,1
Exidia glandulosa, AX657615
65,0
Acremonium thermophilum, AX657569 (núcleo)
64,8
Thermoascus aurantiacus, AX657575
64,8
*Acremonium thermophilum Cel7A
64,6
*Thermoascus aurantiacus Cel7A
64,4
Trichophaea saccata, AX657607
63,6
*Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
60,2
*Acremonium thermophilum Cel7A
100,0
Exidia glandulosa, AX657613
77,9
Exidia glandulosa, AX657615
77,9
Acremonium thermophilum, AX657569
77,5
Thielavia australiensis, AX657577
71,0
*Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
70,6
Scytalidium thermophilum, AX657627
67,5
Chaetomium thermophilum, AX657571
67,5
Chaetomium pingtungium, AX657623
67,3
*Chaetomium thermophilum Cel7A
66,9
*Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
64,6
Ejemplo 14. Producción de proteínas CBH/Cel7 recombinantes en Trichoderma reesei 24
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Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus (Cel7A de Ta), Chaetomium thermophilum (Cel7A de Ct) y Acremonium thermophilum (Cel7A de At, Cel7B de At; en la fase inicial del trabajo estas proteínas tenían los códigos temporales CBH_C de At y CBH_A de At, respectivamente). Los plásmidos de expresión construidos se enumeran en la Tabla 11. Los genes cbhlcel7 recombinantes, incluyendo sus propias secuencias señal, se fusionaron exactamente con el promotor de cbh1 (cel7A) de T. reesei mediante PCR. La terminación de la transcripción se garantizó por medio del terminador de cel7A de T. reesei y el gen marcador amdS de A. nidulans se utilizó para la selección de los transformantes como describen Paloheimo et al. (2003). Los casetes de expresión lineal (Fig. 2), se aislaron de las cadenas principales del vector después de la digestión con EcoRI y se transformaron en protoplastos A96 y A98 de T. reesei (ambas cepas tienen suprimidos los genes que codifican las cuatro celulasas principales CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A). Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993), seleccionando con acetamida como única fuente de nitrógeno. Los transformantes se purificaron sobre placas de selección a través de conidios individuales antes de su esporulación sobre PD.

Tabla 11. Casetes de expresión construidos para producir las proteínas CBH/Cel7 de Thermoascus aurantiacus ALK04242 (Cel7A de Ta), Chaetomium thermophilum ALKO4265 (Cel7A de Ct), y Acremonium thermophilum ALKO4245 (Cel7A de At, Cel7B de At) en Trichoderma reesei. La estructura general de los casetes de expresión fue la descrita en la Fig. 2. Los genes cbhlcel7 clonados se fusionaron exactamente con el promotor cbh1/cel7A de T. reesei.
CBH/Cel7
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a terminador de cel7A(b
Cel7A de Ta
pALK1851 9,0 kb 245 pb (XbaI)
Cel7A de Ct
pALK1857 9,2 kb 240 pb (HindIII)
Cel7B de At
pALK1860 9,4 kb 361 pb (EcoRI)
Cel7A de At
pALK1865 9,5 kb 427 pb (EcoRV)
(a El casete de expresión para la transformación de T. reesei se aisló de la cadena principal del vector utilizando la digestión con EcoRI.
(b Número de nucleótidos de la región terminadora de cbh1/cel7A genómico después del codón de parada. El sitio de restricción en el extremo 3' , utilizado en la escisión del fragmento de gen genómico, se incluye en el paréntesis.
La producción de CBH/Cel7 de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 días a 28°C en un medio inductor de celulasa a base de complejo de lactosa (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2PO4 al 5%. La actividad celobiohidrolasa se analizó utilizando sustrato de 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurghet al., 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron utilizando transferencias Southern en las que se incluyeron varios productos digeridos genómicos y el casete de expresión respectivo se utilizó como sonda. Se analizó la expresión heteróloga de las proteínas Cel7A de Ta, Cel7A de Ct, Cel7A de At y Cel7B de At mediante SDS-PAGE con la posterior tinción de Coomassive. Las conclusiones de que no se pudiera detectar ninguna actividad celobiohidrolasa o la producción de proteína heteróloga en SDS-PAGE para los transformantes de Cel7B de At que contenía el casete de expresión integrado, sugieren que Cel7B de At es producida por debajo de los niveles de detección en Trichoderma utilizando el diseño experimental descrito.
Las preparaciones de enzima CBH/Cel7 recombinante se caracterizaron en términos de pH óptimo y de estabilidad térmica. El pH óptimo de las proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum, y Acremonium thermophilum se determinó en el tampón universal de McIIvaine dentro de un intervalo de pH de 3,0-8,0 utilizando 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) como sustrato (Fig. 3A). El pH óptimo para las enzimas Cel7A de Ct y Cel7A de At se encuentra en 5,5, por encima del cual la actividad comienza a disminuir gradualmente. El pH óptimo de Cel7A de Ta bruta recombinante se encuentra en 5,0 (Fig. 3A). La estabilidad térmica de las enzimas Cel7 recombinantes se determinó midiendo la actividad MUL en tampón universal de McIIvaine, al pH óptimo con un tiempo de reacción de 1 h. Como se muestra a partir de los resultados Cel7A de Ta y Cel7A de Ct conservaron más de 60% de sus actividades a 70°C, mientras que Cel7A de At demostró claramente ser menos estable a las temperaturas más altas (≥65°C) (Fig. 3B).
Los transformantes de CBH/Cel7 seleccionados se cultivaron biorreactores de laboratorio a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con un pH de control de 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).
Ejemplo 15. Producción de las proteínas de fusión Cel7A + CBD de Thermoascus aurantiacus recombinante en T. reesei
Se fusionó Cel7A de Thermoascus aurantiacus (AF478686, Hong et al., 2003b; SEQ ID NO: 1) con el conector y CBD de CBHI/Cel7A de Trichoderma reesei (AR088330, Srisodsuk et al. 1993) (= CBD de Tr), seguido de la
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20
25
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45
50
55
producción de la proteína de fusión (SEQ ID NO: 28 que corresponde al ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27) en T. reesei como se describe en FI20055205/US 11/119526; presentado el 29 de Abril 2005. Además, Cel7A de Thermoascus aurantiacus se fusionó con el conector y el CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum (SEQ ID NO: 7) (CBD de Ct). Para ello, se sintetizaron la secuencia codificante del conector y el CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:
5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTC-GACCGTCCCTGGCCTTGAC-3' (secuencia directa)
y
5'-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGG-AACTG-3' (secuencia inversa).
La mezcla de reacción de PCR contenía 1 x tampón de reacción de DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), Mg2+ 15 mM, dNTP 0,2 mM, 2 µM de cada cebador, 0,6 unidades de ADN polimerasa DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), y aproximadamente 75 ng/30 µl de ADN molde, que contenía el gen cel7A completo de Chaetomium thermophilum. Las condiciones para la reacción de PCR fueron las siguientes: 2 min. de desnaturalización inicial a 98°C, seguido de 30 ciclos de 30 seg. a 98°C, 30 seg. de recocido a 68°C (gradiente de ± 4°C), 30 segundos de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min. El fragmento de ADN específico en la reacción de PCR se obtuvo a un intervalo de temperatura de recocido entre 64°C a 68,5°C. El fragmento CBD sintetizado de Chaetomium thermophilum se ligó después del gen cel7A de Thermoascus aurantiacus dando como resultado un punto de unión de GPIGST entre los dominios. El fragmento amplificado por PCR del plásmido se confirmó mediante secuenciación (SEQ ID NO: 29). El gen fusión cel7A construido se fusionó exactamente al promotor de cbh1 (cel7A) de T. reesei. La terminación de la transcripción se aseguró por medio del terminador de cel7A de T. reesei y se utilizó el gen marcador amdS de A. nidulans para la selección de los transformantes como se describe en Paloheimo et al. (2003).
El casete de expresión lineal se aisló de la cadena principal del vector después de la digestión con NotI y se transformó en protoplastos A96 de T. reesei. Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993), con la selección de acetamida como única fuente de nitrógeno. Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de conidios individuales antes de la su esporulación sobre PD.
Se analizó la producción Cel7A + CBD (SEQ ID NO. : 28 y 30) de Thermoascus aurantiacus de los transformantes a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 días en un medio inductor de celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con 5% de KH2PO4 a pH 5,5. La actividad de celobiohidrolasa se analizó utilizando sustrato de 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurgh et al., 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron utilizando transferencias Southern en las que se habían incluido diversos productos digeridos genómicos y el casete de expresión se utilizó como sonda. Los análisis de SDS-PAGE mostraron que las enzimas Cel7A + CBD de Thermoascus aurantiacus recombinante se habían producido en forma de proteínas de fusión estables en T. reesei.
El transformante seleccionado que producía la proteína de fusión Cel7A de Ta + CBD de Tr (SEQ ID NO: 28) también se cultivó en un biorreactor 2 litros a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con control de pH a 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).
Ejemplo 16. Comparación de las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de celobiosa de celobiohidrolasas recombinantes purificadas
Las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de la celobiosa se determinaron a partir de las celobiohidrolasas producidas de manera heteróloga en T. reesei (Ejemplos 14 y 15). Las enzimas se purificaron como se describe en el Ejemplo 2. Las concentraciones de proteína de las enzimas purificadas se midieron mediante su absorción a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molar teórico, que se evaluó a partir de las secuencias de aminoácidos (Gill y von Hippel, 1989).
Las constantes cinéticas (valores Km y kcat) y la constante de inhibición de celobiosa (Ki) para CBHI/Cel7A de Tr, CBH/Cel7A de Ta, CBH/Cel7A de At y CBH/Cel7A de Ct, se midieron utilizando CNPLac (2-Cloro-4-nitrofenil-β-Dlactósido) como sustrato a la temperatura ambiente (22°C) en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 5,7. Para la determinación de la constante de inhibición (Ki), se utilizaron ocho concentraciones de sustrato diferentes (31 a 4000 µM) en presencia de un intervalo de cinco concentraciones de inhibidor (0-100 µM o 0-400 µM), que agrupen el valor de Ki. Todos los experimentos se realizaron en placas de microtitulación y el volumen de reacción total fue de 200 µl. Las tasas iniciales se midieron en cada caso mediante control continuo de la liberación del anión de cloronitrofenolato (CNP, 2-cloro-4-nitrofenolato) a través de mediciones a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación Varioscan (ThermoLabsystems). Los resultados se calcularon a partir de la curva patrón de CNP (de 0 a 100 µM). Las concentraciones de enzima utilizadas fueron: CBHI/Cel7A de Tr 2,46 µM, CBH/Cel7A de Ta 1,58 µM, CBH/Cel7A de Ct 0,79 µM y CBH/Cel7A de At 3 µM. Las constantes Km y kcat se calcularon a partir del ajuste
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La secuencia de la proteína de la endoglucanasa aislada Thermoascus aurantiacus es completamente idéntica a la de la EGI publicada de T. aurantiacus (AF487830, Tabla 18). La homología más próxima se encontró en una secuencia de β-glucanasa de Talaromyces emersonii (AX254752, identidad de 71,1%).

Tabla 18. Comparación de las endoglucanasas EG_40, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium thermophilum, EG_54/Cel7B de Chaetomium thermophilum y EG_28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus con sus contrapartes homólogas. Este alineamiento se realizó utilizando el programa de Needle del paquete de programas EMBOSS. *Indica una endoglucanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
Acremonium thermophilum EG_40
100,0
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
77,3
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
75,3
Neurospora crassa, hipotético XM_324477
68,9
Humicola grisea var thermoidea, EGL3, AB003107
67,5
Humicola insolens EG5, A23635
67,3
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
57,9
*Acremonium thermophilum de tipo EG_40
53,7
Acremonium thermophilum de tipo EG_40
100,0
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
66,9
Magnaporthe grisea 70-15 hipotético, XM_363402
61,9
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
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*Acremonium thermophilum EG_40
56,8
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
53,7
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52,8
Chaetomium thermophilum EG_54
100,0
Melanocarpus albomyces Cel7A, AJ515704
70,6
Humicola grisea var thermoidea EGI, D63516
68,8
Humicola insolens EGI, AR012244
67,7
Myceliophthora thermophila EGI, AR071934
61,7
Fusarium oxysporum var lycopercisi EGI, AF29210
53,5
Fusarium oxysporum EGI, AR012243
52,6
Thermoascus aurantiacus EG_28
100,0
Thermoascus aurantiacus EG, AX812161
100,0
Thermoascus aurantiacus EGI, AY055121
99,4
Talaromyces emersonii β-glucanasa, AX254752
71,1
Talaromyces emersonii EG, AF440003
70,4
Aspergillus niger EG, A69663
70,1
Aspergillus niger EG, A62441
69,9
Aspergillus niger EG, AF331518
69,6
Aspergillus aculeatus EGV, AF054512
68,5
Ejemplo 19. Producción de endoglucanasas recombinantes en Trichoderma reesei
10 Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes EG_40/Cel45A, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium, y EG_28/Cel5A de Thermoascus como se ha descrito en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 19) se aislaron de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de
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Tabla 24 Comparación de las β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. La alineación se ha realizado mediante el programa Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una β-glucosidasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
*Acremonium thermophilum βG_101
100,0
Magnaporthe grisea β-glucosidasa, AY849670
73,1
Neurospora crassa hipotética, XM_330871
71,1
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
65,2
*Thermoascus aurantiacus βG_81
62,2
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
59,5
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
58,9
Aspergillus oryzae, AX616738
58,2
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
57,2
*Chaetomium thermophilum βG_76
40,9
Chaetomium thermophilum βG_76
100,0
Neurospora crassa, hipotética XM_324308
76,9
Magnaporthe grisea, hipotética XM_364573
70,2
Trichoderma viridae BGI, AY368687
65,8
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
41,2
*Acremonium thermophilum βG_101
40,9
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
40,0
*Thermoascus aurantiacus βG_81
39,9
*Thermoascus aurantiacus βG_81
100,0
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
73,2
Aspergillus oryzae, AX616738
69,5
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
68,0
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
65,7
*Acremonium thermophilum βG_101
62,2
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
57,9
*Chaetomium thermophilum βG_76
39,9
5
Ejemplo 21. Producción de beta-glucosidasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes βG_101/Cel3A de Acremonium, de βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_81/Cel3A de Thermoascus como se describe en el Ejemplo
14. Se aislaron casetes de expresión lineales (Tabla 25) de la cadena principal del vector mediante digestión con 10 enzimas de restricción, se transformaron en T. reesei A96 o A33 (ambas cepas tienen suprimidos los genes que codifican las cuatro celulasas principales CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A) y los transformantes se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 14.
Tabla 25. Casetes de expresión construidos para la producción de β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum, y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus en 15 Trichoderma reesei. La estructura esquemática de los casetes de expresión se describe en la Figura 2.
β-glucosidasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
βG_101 de At
pALK1933 NotI de 10,5 kb 300 pb (HindIII)
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Tabla 28. Comparación de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. El alineamiento se realizó utilizando el programa de Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una xilanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
* Thermoascus aurantiacus XYN_30
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, P23360
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, AF127529
99,4
Aspergillus niger xilanasa, A62445
69,7
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR137844
69,9
Aspergillus terreus fam 10 xyn, DQ087436
65,0
Aspergillus sojae, XynXl AB040414
63,8
Penicillium chrysogenum xilanasa, AY583585
62,5
*Acremonium thermophilum XYN_60
100,0
Humicola grisea XYL I, AB001030
67,1
Magnaporthe grisea 70-15, hipotética XM_364947
63,8
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR149839
53,7
Talaromyces emersonii xilanasa, AX403831
51,8
Gibberella zeae xilanasa, AY575962
51,4
Magnaporthe grisea XYL5, AY144348
48,5
Talaromyces emersonii, AX172287
46,9
5
Ejemplo 23. Producción de xilanasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes XYN_60/Xyn10A de Acremonium y XYN_30 /Xyn10A de Thermoascus como se ha descrito en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 29) se aislaron de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de restricción, se
10 transformaron en T. reesei A96, y los transformantes se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 14.

Tabla 29. Casetes de expresión construidos para la producción de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/ Xyn10A de Thermoascus aurantiacus en Trichoderma reesei. Las estructuras esquemáticas de los casetes de expresión se describen en la Figura 2.
Xilanasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
XYN_60 de At
pALK1912 9,0 kb 150 pb (BamHI)
XYN_30 de Ta
pALK1913 9,3 kb ninguno
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló de cadena principal del vector mediante 15 digestión con EcoRI.
(b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que está incluido en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
Se analizó la producción de xilanasa de los transformantes a partir de los sobrenadantes de cultivo de cultivos en
20 matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y la actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante de cultivo como la liberación de azúcares reductores de xilano de abedul (1% p/v) a 50°C en tampón citrato 50 mM de pH 5,3 como describen Bailey y Poutanen 1989. También se analizó la producción de la proteína recombinante del sobrenadante de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Además, la expresión de ambas xilanasas se determinó mediante análisis de
25 transferencia Western con anticuerpos anti-XYN_30 o anti-XYN_60 como se ha descrito en el Ejemplo 19. Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el casete de expresión como sonda.
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