BRPI0620287A2 - método para tratar material celulósico, uso do mesmo, preparação de enzima, uso da mesma, polipeptìdeo, uso e método de preparação do mesmo - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA TRATAR MATERIAL CELULóSICO, USO DO MESMO, PREPARAçãO DE ENZIMA, USO DA MESMA, POLIPEPTìDEO, USO E MéTODO DE PREPARAçãO DO MESMO. A presente invenção refere-se à produção de hidrolases de açúcar a partir de material celulósico. O método pode ser usado, por exemplo, para produzir açúcares fermentáveis para a produção de bioetanol a partir de material lignocelulósico. São descritas as enzimas lignocelulósicas e sua produção por tecnologia recombinante, bem como os usos das enzimas e preparações de enzima.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA TRATAR MATERIAL CELULÓSICO, USO DO MESMO, PREPARA- ÇÃO DE ENZIMA, USO DA MESMA, POLIPEPTÍDEO, USO E MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO MESMO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à produção de hidrolisados de açúcar de material celulósico. Mais precisamente a invenção refere-se à produção de açúcares fermentados de material lignocelulósico por conver- são enzimática. Os açúcares fermentados são úteis, por exemplo, na produ- ção de bioetanol ou para outros fins. Especificamente, a presente invenção refere-se a um método para tratar material celulósico com celobioidrolase, endoglicanase, beta-glicosidase, e opcionalmente xilanase, e às prepara- ções de enzimas e aos empregos das mesmas. A invenção refere-se, adi- cionalmente, aos novos polipeptídeos celulósicos, polinucleotídeos codifi- cando os mesmos e aos vetores e células hospedeiras contendo os polinu- cleotídeos. Ainda, adicionalmente, a invenção refere-se aos usos dos poli- peptídeos e a um método de preparação dos mesmos. Antecedentes da Invenção

Os hidrolisados de açúcar podem ser usados para produção mi- 20 crobiana de uma variedade de substâncias químicas finas ou biopolímeros, tais como, ácidos orgânicos, por exemplo, ácido láctico ou etanol ou outros álcoois, por exemplo, n-butanol, 1,3-propanodiol ou poliidroxialcanoatos (PHAs). Os hidrolisados de açúcar podem também servir como matéria- prima para outros processos não microbianos, por exemplo, para enriqueci- mento, isolamento e purificação de açúcares de valor alto ou vários proces- sos de polimerização. Um dos maiores empregos dos hidrolisados de açúcar é na produção dos biocombustíveis. A produção de bioetanol e/ou outras substâncias químicas pode acontecer em um processo integrado em uma refinaria (Wyman 2001).

As fontes limitadas de combustíveis fósseis e as crescentes quantidades de CO2 liberadas dos mesmos e que causam o fenômeno de estufa vêm elevando a necessidade do emprego de biomassa como uma fonte de energia limpa e renovável. Uma tecnologia alternativa e promissora é a produção de biocombustíveis, isto é, etanol, de materiais celulósicos. No setor de transporte, os biocombustíveis estão sendo a única opção, que po- deria reduzir as emissões de CO2 em uma ordem de grandeza. O etanol po- de ser empregado nos veículos e sistemas de distribuição existentes e assim não requer investimentos de infra-estrutura caros. Os açúcares derivados de matérias-primas lignocelulósicas renováveis podem também ser usados co- mo matérias-primas para uma variedade de produtos químicos que podem substituir as substâncias químicas à base de petróleo.

A maior parte dos carboidratos em plantas está na forma de Iig- nocelulose o que consiste essencialmente em celulose, hemicelulose, pecti- na e lignina. Em um processo de lignocelulose-em-etanol, o material Iignoce- lulósico é primeiro pré-tratado tanto química quanto fisicamente, de modo a tornar a fração celulósica mais acessível à hidrólise. A fração celulósica é então hidrolisada para obter açúcares que podem ser fermentados por leve- dura em etanol. A lignina é obtida como co-produto principal que pode ser usado como um combustível sólido.

Os custos de produção do bioetanol são altos e o rendimento de energia é baixo e existem pesquisas constantes para tornar o processo mais econômico. A hidrólise enzimática é considerada a tecnologia mais promis- * sora para conversão da biomassa celulósica em açúcares fermentáveis. Conduto, a hidrólise enzimática é empregada apenas a uma quantidade limi- tada em escala industrial e especialmente quando se emprega material for- temente lignificado, tal como madeira ou resíduo agrícola, a tecnologia não é satisfatória. O custo da etapa enzimática é um de fatores econômicos princi- pais do processo. Foram feitos esforços para aperfeiçoar a eficácia da hidró- lise enzimática do material celulósico (Badger 2002).

A patente US 2002/019 2774 A1 descreve um processo contí- nuo para conversão da biomassa lignocelulósica em produtos combustíveis. Após pré-tratamento por oxidação a úmido ou explosão de vapor, a biomas- sa é parcialmente separada em celulose, hemicelulose e lignina, e é então submetida a hidrólise parcial usando uma ou mais enzimas de carboidrase (EC 3.2). Celluclast®, um produto comercial da Novo Nordisk A/S contendo atividades de celulase e xilanase é fornecido como um exemplo.

A patente US 2004/000 5674 A1 descreve novas misturas de enzima que podem ser empregadas diretamente no substrato de lignocelulo- se, pelo que, os produtos residuais tóxicos formados durante os processos de pré-tratamento podem ser evitados, e a energia pode ser poupada. A mis- tura de enzima sínergística contém uma celulase e uma enzima auxiliar, tal como, celulase, xilanase, ligninase, amilase, protease, lipidase ou glicuroni- dase ou qualquer combinação das mesmas. A celulase é considerada como incluído endoglicanase (EG), beta-glicosidase (BG) e celobioidrolase (CBH). Os exemplos ilustram o uso de uma mistura de Trichoderma xilanase e pre- parações de celulase.

Kurabi e outros (2005) investigaram hidrólise enzimática de ex- plosão de vapor e organossolve etanol-pré-tratado Douglas-fir por novas ce- lulases de fungo comerciais. Eles testaram duas preparações dé Triehoder- ma reesei celulase comerciais e duas preparações novas produzidas por cepas mutantes de Trichoderma sp. e Penicillium sp. A preparação de Tri- choderma sp. mostrou desempenho significativamente melhor que o das outras preparações. Acredita-se que o melhor desempenho foi pelo menos devido em parte a uma atividade de beta-glicosidase significativamente mai- or, o que alivia a inibição da produção de celobioidrolase e endoglicanase.

A Patente US 2004/005 3373 A1 refere-se a um método para conversão de celulose em glicose por tratamento de um substrato lignocelu- lósico tratado com uma mistura enzimática compreendendo celulase e uma celobioidrolase I modificada (CBHI). A CBHI foi modificada por inativação de seu domínio de ligação de celulose (CBD). Vantagens da modificação de CBHI são, por exemplo, melhor recuperação e taxa de hidrolase maior com alta concentração de substrato. A celulase é selecionada do grupo consistin- do em EG, CBH e BG. A CBHI é obtida preferivelmente do Trichoderma.

A Patente US 2005/016 4355 A1 descreve um método para de- gradar o material lignocelulósico com uma ou mais enzimas celulósicas na presença de pelo menos um agente tensoativo. Enzimas adicionais, tais co- mo, hemicelulases, esterase, peroxidase, protease, Iacase ou mistura das mesmas podem também ser usadas. A presença de agente tensoativo au- menta a degradação do material lignocelulósico em comparação à ausência do agente tensoativo. As enzimas celulósicas podem ser qualquer enzima envolvida na degradação da Iignocelulose incluindo CBH1 EG e BG.

Existem inúmeras publicações revelando várias celulases e he- micelulases.

Celobioidrolases (CBHs) são reveladas, por exemplo, no WO 03/000 941, que refere-se às enzimas CBHI obtidas de vários fungos. Não é provida qualquer propriedade fisiológica das enzimas, nem quaisquer exem- plos de seus empregos. Hong e outros (2003b) caracterizam CBHI de Ther- moascus aurantiacus produzidos por levedura. As aplicações da enzima não são descritas. Tuohy e outros (2002) descreve três formas de celobiohidrola- ses de TaIaromyces emersonii.

Endoglicanases da família cel5 (EGs fam 5) são descritas, por exemplo, no WO 03/062 409, que refere-se às composições compreendendo pelo menos duas enzimas termoestáveis para uso em aplicações de alimen- tação. Hong e outros (2003a) descrevem a produção de endo-p-1,4- glicanase termoestáveis de T. aurantiacus em levedura. Nenhuma aplicação é explicada. O WO 01/70998 refere-se às β-glicanases de Talaromyces. Elas também descrevem β-glicanases de Talaromyces emersonii. Aplicações em alimentos, suprimentos, bebidas, cervejaria e detergentes são discutidas. A lignose da Iignocelulose não é mencionada. O WO 08/06 858 descreve beta-1,4-endoglicanase de Aspergillus niger e revela aplicações da enzima em alimentos e suprimentos. O WO 97/12853 revela métodos para classifi- cação de fragmentos de DNA codificando enzimas em bibliotecas de DNAc. A biblioteca de DNAc tem origem em levedura ou fungos, preferivelmente Aspergillus. A enzima é preferivelmente uma celulase. Van Petegem e ou- tros (2002) descrevem a estrutura tridimensional de uma endoglicanase da família cel5 de Thermoascus aurantiacus. Parry e outros 92002) descrevem o modelo de ação de uma endoglicanase da família cel5 de Thermoascus aurantiacus. As endoglucanases da família cel7 (EGs fam 7) são reveladas, por exemplo, no US 5.912.157, que refere-se à endoglicanase de Myceliph- thora e seus homólogos e aplicações da mesma em detergente, têxteis e polpas. A Patente US 6.071.735 revela celulases exibindo alta atividade de endoglicanase em condições alcalinas. Os usos como detergente, na polpa e papel e aplicações têxteis são revelados. O bioetanol não é mencionado. A Patente US 5.763.254 revela enzimas de degradação de celulo- se/hemicelulose e possuindo resíduos de aminoácido conservados em CBD.

Endoglicanases da família cel45 (EGs fam 45) são descritas, por exemplo, na Patente US 6.001.639, que refere-se às enzimas possuindo atividade endoglicanase e possuindo duas seqüências de aminoácido con- servadas. O uso em têxteis, detergentes e aplicações em polpa e papel são geralmente revelados e o tratamento de material lignocelulósico é mencio- nado, porém não são fornecidos exemplos. O WO 2004/053039 refere-se às aplicações detergentes das endoglucanases. A Patente US 5.958.082 des- creve o uso de endoglicanase, especialmente de Thielavia terrestris em apli- cações têxteis. A Patente EP 0495258 refere-se às composições detergen- tes contendo Humicola celulase. A Patente US 5.948.672 descreve a prepa- ração de celulase contendo endoglicanase, especialmente de Humicola e seu emprego em aplicações têxteis e polpa. A hidrólise da Iignocelufose não é mencionada.

Uma pequena quantidade de beta-glicosidade (BG) melhora a hidrólise da biomassa para glicose por hidrólise da celobiose produzida por celobioidrolases. A conversão da celobiose em glicose é geralmente a etapa de limitação de taxa maior. As beta-glicosidades são reveladas, por exem- plo, na Patente US 2005/021 4920, que refere-se ao BG de Aspergillus fumi- gatus. A enzima foi produzida em Aspergillus oryzae e Trichoderma reesei. O uso da enzima na degradação da biomassa ou aplicações detergentes é discutido de modo geral, porém não exemplificado. O WO 02/095 014 des- creve uma enzima de Aspergillus oryzae possuindo atividade de celobiase. O uso na produção de etanol a partir da biomassa é discutido de modo geral, porém não exemplificado. O WO 2005/074656 revela polipeptídeos possuin- do atividade de melhora celulósica derivada, por exemplo, de T. aurantiacus; A. fumigatus·, T. terrestris e T. aurantiacus. O WO 02/26979 revela proces- samento enzimático de material de planta. A Patente US 6.022.725 descreve a clonagem e âmpliação do gene de beta-glicosidade do Trichoderma reesei e a Patente US 6.103.464 descreve um método para detectar o DNA codifi- cando uma beta-glicosidade de um fungo filamentoso. Nenhum exemplo de aplicação é fornecido. ! · .

As xilanases são descritas, por exemplo, no FR2786784, que re- fere-se a uma xilanase estável em calor, útil por exemplo, no tratamento de suprimentos para animais e na fabricação de pães. A enzima é derivada de um fungo termofílico, especificamente do gênero Thermoascus.

A Patente US 6.197.564 descreve enzimas possuindo atividade xilanase e obtidas de Aspergillus aculeatus. Sua aplicação na fabricação de pães é exemplificada. O WO 02/24926 refere-se às xilanases de Talaromy- ces. São fornecidos exemplos de alimentos e de fabricação de pães. O WO 01/42433 revelam xilanase termoestável de Talaromyces emersonii para uso em aplicações de alimentos e suprimentos.

As enzimas celulósicas melhor investigadas e aplicadas mais amplamente de origem de fungos foram derivadas de Trichoderma reesei (a anamorfa da Hypocrea jecorina). Conseqüentemente também, a maioria das • celulases de fungos disponíveis comercialmente é derivada de Trichoderma reesei. Contudo, a maioria das celulases de fungos menos conhecidas não foi aplicada nos processos de importância prática, tais como, na degradação do material celulósico, incluindo lignocelulose.

Existe uma necessidade contínua de novos métodos de degra- dação de substratos celulósicos, especificamente substratos lignocelulósi- cos, e para novas enzimas e misturas de enzimas que melhoraram a eficácia da degradação. Existe também a necessidade de processos e enzimas que trabalhem em temperaturas altas, assim permitindo o emprego de maior con- sistência da biomassa e conduzindo a concentrações maiores de açúcar e etanol. Essa abordagem podem conduzir a economia significativa nos custos de energia e investimentos. A temperatura alta também diminui o risco de contaminação durante a hidrólise. A presente invenção tem como objetivo satisfazer pelo menos partes dessas necessidades. Breve Descrição da Invenção

Foi verificado surpreendentemente que as enzimas celulósicas e especialmente as celobioidrolases obtidas de Thermoascus aurantiacus, A- cremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum são especificamen- te úteis na hidrólise de material celulósico. Além das celobioidrolases, es- ses fungos possuem endoglicanases, beta-glicosidades e xilanases que são muito apropriadas para degradação de material celulósico. As enzimas são cineticamente muito eficazes sobre uma ampla faixa de temperaturas e em- bora elas tenham atividade muito alta em temperaturas altas, elas também são muito eficientes em temperaturas de hidrólise padrão. Isso as torna ex- tremamente bem apropriadas aos vários processos de hidrólise de substrato celulósico realizados em temperaturas convencionais e temperaturas eleva- das.

A presente invenção provê um método para tratamento de mate- rial celulósico com celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, pelo que a celobioidrolase compreende uma seqüência de aminoácidos possuin- do pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID Nes: 2, 4, 6 ou 8 ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

A invenção provê adicionalmente, uma preparação de enzima compreendendo celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, onde a celobioidrolase compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID N5S: 2, 4, 6 ou 8 ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

O uso da preparação de enzima para degradar material celulósi- co também é provido, bem como o uso do material em um processo para preparação de etanol a partir de material celulósico.

A invenção também refere-se a um polipeptídeo compreenden- do um fragmento possuindo atividade celulósica e sendo selecionado do grupo consistindo em:

a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá- cido possuindo pelo menos 66% de identidade com relação à SEQ ID N°:4, 79% de identidade com relação à SEQ ID N°:6, 78% de identidade com rela- ção à SEQ ID N°: 12, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°: 14, 72% de identidade com relação à SEQ ID N°: 16, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°:20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N°:22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N-:26;

b) uma variante de a) compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica; e

c) um fragmento de a) ou b) possuindo atividade celulósica.

Um objetivo adicional da invenção é um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo consistindo em:

a) uma seqüência de nucleotídeo das SEQ ID N-: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 ou 25, ou uma seqüência codificando um polipeptídeo da rei- vindicação 35;

b) um filamento complementar de a)

c) um fragmento de a) ou b) compreendendo pelo menos 20 nu- cleotídeos; e

d) uma seqüência que se degenera como resultado do código genético em qualquer uma das seqüências conforme definido em a), b) ou c).

A invenção ainda provê, adicionalmente, um vetor, que compre- ende o polinucleotídeo como uma seqüência heteróloga, e uma célula hos- pedeira compreendendo o dito vetor. Cepas de Escherichia coli possuindo número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667 estão também incluídas na invenção.

Outros objetivos da invenção são preparações enzimáticas compreendendo pelo menos um dos novos polipeptídeos e o uso do dito polipeptídeo ou preparação de enzima no combustível, têxtil, detergente, polpa e papel, alimentos, suprimentos ou indústria de bebidas.

Também é provido um método adicional para preparação de um polipeptídeo compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica e sendo selecionado do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá- cido possuindo pelo menos 66% de identidade com relação à SEQ ID NQ: 4, 79% de identidade com relação à SEQ ID N9: 6, 78% de identidade com re- lação à SEQ ID NQ: 12, 68% de identidade com relação à SEQ ID Ns: 14, 72% de identidade com relação à SEQ ID Ns: 16, 68% de identidade com relação à SEQ ID N9: 20, 74% de identidade com relação à SEQ ID Ne:22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N9: 26;

b) uma variante de a) compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica; e

c) Um fragmento de a) ou b) possuindo atividade celulósica, o dito método compreendendo transformação de uma célula hospedeira com um vetor codificando o dito polipeptídeo, e cultivo da célula hospedeira sob condições que permitem expressão do dito polipeptídeo, e opcionalmente recuperação e purificação do polipeptídeo produzido.

Também ainda é provido um método para tratamento de materi- al celulósico com um meio de cultivo gasto de pelo menos um microorga- nismo capaz de produzir um polipeptídeo conforme definido acima, onde o método compreende reação do material celulósico com o meio de cultura gasto para obter o material celulósico hidrolisado.

Concretizações específicas da invenção são estabelecidas nas reivindicações dependentes.

Outros objetivos, detalhes e vantagens da presente invenção fi- carão claros dos desenhos que se seguem, descrição detalhada e exemplos. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. Dependências de temperatura das atividades de celu- lase e beta-glicosidase nos sobrenadantes das seis cepas de fungos testa- das. O tempo de incubação no ensaio foi de 60 minutos na temperatura da- da, o pH do ensaio era de 5,0 (atividade de MUL) ou 4,8 (CMCase ou BGU). A atividade obtida a 60°C é estabelecida como a atividade relativa de 100%.

A) Thermoascus aurantiacus ALK04239, B) Thermoascus aurantiacus AL- K04242, C) Acremonium thermophilum ALK04245, D) Talaromyces thermo- philus ALKQ4246, E) Chaetomium thermophilum ALK04261, F) Chaetomium thermophilum ALK04265.

Figura 2. Ilustração esquemática dos cassetes de expressão u- sados na transformação dos protoplastos de Trichoderma reesei para produ- ção de proteínas de fungos recombinantes. Os genes recombinantes esta- varrt sob controle do promotor (cbhl prom) de T. reesei (cel7A) e a termina- ção da transcrição foi garantida por emprego da seqüência terminadora T. reesei cbhl (termo cbhl). O gene amdS foi incluído como um marcador de transformação.

Figura 3. A) pH ótimo das preparações de proteína CBH/Cel7 recombinantes do Thermoascus aurantiacus ALK04242, Chaetomium ther- mophilum ALK04265 e Acremonium thermophilum ALK04245 determinado em 4-metilumbeliferil-p-D -lactosídeo (MUL) a 50°C, 10 minutos. Os resulta- dos são fornecidos como média (± SD) de três medições separadas. B) Es- tabilidade térmica das preparações de proteína CBH/Cel7 recombinantes a 15 partir de Thermoascus aurantiacus ALK04242, Chaetomium thermophilum ALK04265 e Acremonium thermophilum ALK04245 determinada no 5- metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL) em pH ótimo por 60 minutos. Os resul- tados são fornecidos como média (± SD) de três medições separadas. Am- bas reações continha BSA (100 μg/mL) como um estabilizador.

Figura 4. Hidrólise de celulose cristalina (AviceI) por celobi- oidrolases recombinantes purificas a 45°C. Concentração do substrato 1% (peso/volume), pH 5,0, concentração de enzima 1,4 μΜ. A) Celobioidrolases abrigando um CBD, B) celobioidrolases (núcleo) sem um CBD.

Figura 5. Hidrólise de celulose cristalina (AviceI) por celobioidro- lases recombinantes purificadas a 70°C. A concentração de substrato 1 % (peso/volume), pH 5,0, concentração da enzima 1,4 μΜ. A) celobioidrolases abrigando um CBD, B) celobioidrolases (núcleo) sem um CBD.

Figura 6.A) A dependência do pH da atividade de EG-40/Cel45A de Acremonium, semelhante a EG-40/Cel45B e de EG-28/Cel5A de Ther- moascus produzidos heterologamente foi determinada com substrato CMC em uma reação de 10 minutos a 50°C. Β) A temperatura ótima de EG- 40/Cel45A de Acremonium, semelhante a EG-40/Cel45B e de EG-28/Cel5A de Thermoascus, foi determinada em pH 5,5, 4,8 e 6,0, respectivamente. A reação contendo CMC como substrato foi realizada por 60 minutos, exceto para EG-28/Gel5A por 10 min. BSA (100 μg/mL) foi adicionado como um estabilizador.

Figura 7.A) A dependência do pH da atividade de BG-101/Cel3A de Acremonium, BG-76/Cel3A de Chaetomium produzidos heterologamente e de BG-81/Cel3A de Thermoascus produzidos heterologamente foi deter- minada com substrato de 4-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo em uma reação de 10 minutos a 50°C. Β) A temperatura ótima de pG-101/Cel3A de Acremo- nium, βG-76/Cel3A Chaetomium, e βG-81/Cel3A de Thermoascus foi deter- minada em pH de 4,5, 5,5 e 4,5, respectivamente. A reação contendo 4- nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo como substrato foi realizada por 60 min, BSA (100 |ag/mL) foi adicionado como um estabilizador.

Figura 8.A) A dependência de pH da atividade da xilanase de XYN-30/XyA710A de Thermoascus produzido heterologamente foi determina- da com substrato de xilana de bétula em uma reação de 10 minutos a 50°C. Β) A temperatura ótima de XYN-30/Xyn10A foi determinada em pH 5,3 em uma reação de 60 minutos, BSA (100 μg/mL) foi adicionado como um estabi- lizador.

Figura 9. Hidrólise de fibra de spruce explodida em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas (MISTURA 1) e enzimas de T. reesei a 55 e 60°C. A dosagem da enzima é fornecida por FPU/ga de matéria seca do substrato, FPU ensaiada a 50°C, pH 5. A hidrólise foi reali- zada por 72 horas em pH 5, com mistura. Os resultados são fornecidos co- mo uma média (±SD) de três medições separadas.

Figura 10. Hidrólise de palha de milho explodido em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas (MISTURA 2) e enzimas de T. reesei a 45, 55 e 57,5°C. A dosagem da mistura foi para "MISTURA 2" de 5 FPU/g de matéria seca do substrato e para enzimas de T. reesei de 5 FPU/g de matéria seca Celluclast suplementada com 100 nkat/g de matéria seca Novozym 188 (a atividade do papel filtro foi ensaiada a 50°C, pH 5). A hidrólise foi realizada por 72 horas em pH 5, com mistura. Os resultados são fornecidos como a média (±SD) de três medições separadas. O substrato continha açúcares de redução solúveis (cerca de 0,7 mg/mL). Esse teor do açúcar de base foi subtraído dos açúcares de redução formados durante a hidrólise.

Figura 11. Hidrólise de palha de milho explodido em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas contendo uma nova xila- nase termofílica de Thermoascus aurantiacus (MISTURA 3) e enzimas de T. reesei a 45, 55 e 60°C. A dosagem da enzima foi para "MISTURA 3" de 5 FPU/g de matéria seca do substrato e para enzimas de T. reesei de 5 FPU/g de matéria seca Celluclast suplementada com 100 nkat/g de matéria seca Novozym 188 (a atividade do papel filtro foi ensaiada a 50°C, pH 5). A hidró- lise foi realizada por 72 horas em pH 5, com mistura. Os resultados sao for- necidos como a média (±SD) de três medições separadas. O substrato con- tinha açúcares de redução solúveis (cerca de 0,7 mg/mL). Esse teor do açú- car de base foi subtraído dos açúcares de redução formados durante a hi- drólise.

Figura 12. Hidrólise de fibra de espruce explodida em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas contendo uma nova xila- nase termofílica XYN-30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus (MISTURA 3) e enzimas de T. reesei a 45, 55 e 60°C. A dosagem da enzima para a "MIS- • TURA 3" foi de 5 FPU/g de matéria seca de substrato e para as enzimas de T. reesei de 5 FPU/g de matéria seca Celluclast suplementada com 100 nkat/g de matéria seca Novozym 188 (a atividade do papel filtro foi ensaiada a 50°C, pH 5). A hidrólise foi realizada por 72 horas em pH 5, com mistura. Os resultados são fornecidos como a média (±SD) de três medições separa- das.

Figura 13. O efeito da glicose na atividade das diferentes prepa- rações de β-glicosidase. O ensaio padrão usando p-nitrofenil-p-D- glicopiranosídeo como substrato foi realizado na presença de glicose na mis- tura de ensaio. A atividade é apresentada como porcentagem da atividade obtida sem glicose.

Figura 14. Atividades de FPU das misturas de enzima em tem- peraturas de 50°C a 70°C, apresentadas como uma porcentagem da ativi- dade sob condições padrão (50°C, 1 hora).

Figura 15. A atividade de celulase relativa de duas cepas diferen- tes de T. reesei crescidas em meio contendo Nutriose não tratada (NO) ou Nu- triose pré-tratada com BG-81/Cel3A (NBG81) como uma fonte de carbono.

Descrição Detalhada da Invenção

A celulose é o maior componente estrutural das plantas superio- res. Ela provê as células da planta com resistência à tensão ajudando as mesmas a resistirem ao estresse mecânico e pressão osmótica. A celulase é um composto β-1,4-glicano de cadeias lineares de resíduos de glicose uni- dos por ligações β-1,4-glicosídicas. A celobiose é a menor unidade de repe- tição da celulose. Nas paredes das células, a celulose é embalada em folhas orientadas de vários modos, que são envolvidas em uma matriz de hemice- lulose e lignina. A hemicelulose é um grupo heterogêneo de polímeros de carboidrato contendo principalmente glicanos, xilanos e mananos diferentes. A hemicelulose consiste em uma estrutura linearcom resíduos ligados em β- 1,4 substituídos por cadeias laterais curtas geralmente contendo acetila, gli- curonila, arabinosila e galactosila. A hemicelulose pode ser ligada quimica- mente à lignina. A lignina é um polímero reticulado e complexo de unidades de p-hidroxifenilpropano substituído de várias formas que provê resistência à parede da célula de modo a suportar o estresse mecânico e também prote- ger a celulose da hidrólise enzimática.

A lignocelulose é uma combinação de celulose e hemicelulose e polímeros de unidades de propanol e lignina. Ela é fisicamente dura, densa e inacessível e o material bioquímico mais abundante na biosfera. Os materi- ais contendo lignocelulose são por exemplo: lascas de madeira dura e ma- deira macia, polpa de madeira, serragem e lixo florestal e industrial de ma- deira; biomassa agrícola como palhas de cereais, polpa de beterraba, palha de milho e cobs, bagaço da cana de açúcar, caules, folhas, cálices, cascas e semelhantes; produtos residuais, tais como, lixo sólido municipal, jornais e lixo produzido por escritórios, resíduo industrial e por exemplo de grãos; co- lheitas de energia dedicada (por exemplo, salgueiro, choupo, gramínea do tipo switchgrass nativa da América do Norte, alpiste, e semelhantes). Exem- plos preferidos são palha de milho, gramínea do tipo "switchgrass" nativa da América do Norte, palha de cereais, bagaço da cana-de-açúcar e materiais derivados de madeira.

"Material celulósico" conforme usado aqui, refere-se a qualquer material compreendendo celulose, hemicelulose e/ou Iignocelulose como um componente significativo. "Material lignocelulósico" significa qualquer materi- al compreendendo lignocelulose. Tais materiais são, por exemplo, materiais de planta tais como, madeira incluindo madeira dura e madeira macia, plan- tas herbáceas, resíduos agrícolas, resíduos de polpa e madeira, papel resi- dual, resíduos da indústria alimentícia e de suprimentos, etc. As fibras têx- teis, tais como, algodão, fibras derivadas de algodão, linho, cânhamo, juta e as fibras celulósicas fabricadas pelo homem como, modal, viscose, Iiocel são exemplos específicos de materiais celulósicos.

O material celulósico é degradado na natureza por vários orga- nismos incluindo bactérias e fungos. A celulose é tipicamente degradada por diferentes celulases agindo seqüencial ou simultaneamente. A conversão biológica em glicose geralmente requer três tipos de enzimas hidrolíticas: (1) Endoglicanases que cortam as ligações internas beta-1,4-glicosídicas; (2) Exocelobioidrolases que cortam a celobiose de dissacarídeo da extremidade da cadeia de polímero de celulose; (3) Beta-1,4-glicosidases que hidrolisam a celobiose e outros celo-oligossacarídeos curtos em glicose. Em outras pa- lavras, os três maiores grupos de celulases são celobioidrolases (CBH), en- doglicanases (EG) e beta-glicosidases (BG).

A degradação dos substratos contendo celulose mais complexos requer uma ampla faixa de várias enzimas. Por exemplo, a lignocelulose é degrada por hemicelulases, como xilanases e mananases. A hemicelulase é uma enzima que hidrolisa a hemicelulose.

"Enzimas celulósicas" são enzimas possuindo "atividade celuló- sica" que significa que elas são capazes de hidrolisar substratos celulósicos ou derivados dos mesmos em sacarídeos menores. As enzimas celulósicas assim incluem ambas celulases e hemicelulases. As celulases conforme empregado aqui incluem celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase.

T. reesei possui um sistema de celulase eficaz e bem conhecido contendo dois CBH1S, dois principais e vários EG1S e BG's menores. CBHI de T. reesei (Cel7A) corta o açúcar da extremidade de redução da cadeia de celulose, possui um domínio de ligação de celulose C-terminal (CBD) e pode construir até 60% da proteína secretada total. CBHII de T. reesei (Cel6A) corta o açúcar da extremidade de não redução da cadeia de celulose, possui um domínio de ligação de celulose N-terminal e pode constituir até 20% da proteína secretada total. Endoglicanases EGI (Cel7B) e EGV (Cel45A) pos- suem um CBD ém seu C-terminal, EGII (Cel5A) possui um N-terminal CBD e EGIII (Cel12A) não possui um domínio de ligação de celulose. CBHl, CBHII, EGI e EGII são denominados "celulases principais" de Trichoderma compre- endendo em conjunto 8-90% das proteínas secretadas totais. Um versado na técnica tem conhecimento de que uma enzima pode ser ativa em vários substratos e as atividades enzimáticas podem ser medidas usando diferen- tes substratos, métodos e condições. A identificação das diferentes ativida- des celulósicas é revelada, por exemplo, em van Tilberugh e outros, 1988.

Além de um domínio/núcleo catalítico expressando atividade ce- lulósica, as enzimas celulósicas podem compreender um ou mais domínios de ligação de celulose (CBDs), também denominados domínios/módulos de ligação de carboidrato (CBD/CBM), que pode estar localizado tanto no N- quanto C-terminal do domínio catalítico. CBDs possuem atividade de ligação de carboidrato e eles mediam a ligação da celulase à celulose cristalina, po- rém possuem pouco ou nenhum efeito sobre a atividade hidrolítica de celu- lase da enzima nos substratos solúveis. Esses dois domínios são tipicamen- te conectados através de uma região Iigante altamente glicosilada e flexível.

"Celobioidrolase" ou "CBH" conforme usado aqui, refere-se às enzimas que clivam celulose a partir da extremidade da cadeia de glicose e produzem principalmente celobiose. Elas também são denominadas 1,4- beta-D-glicano celobioidrolases ou 1,4-beta-celobiosidases de celulose. Elas hidrolisam as ligações 1,4-beta-D-glicosídicas das extremidades de redução ou não redução de um polímero contendo as ligações, tais como, celulose, pelo que a celobiose é liberada. Duas BCHs diferentes foram isoladas do Tri- choderma reesei, CBHI e CBHII. Elas possuem uma estrutura molecular con- sistindo em um domínio catalítico ligado a um domínio de ligação de celulose (CBD). Existem também celobioidrolases na natureza que não possuem CBD.

"Endoglicanase" ou "EG" refere-se às enzimas que cortam as li- gações glicosídicas internas da cadeia de celulose. Elas são classificadas como EC 3.2.1.4. Elas são 1,4-beta-D-glican 4-glicanoidrolases e catalisam a endoidrólise das ligações 1,4-beta-D-glicosídicas nos polímeros de glicose, tais como, celulose e derivados dos mesmos. Algumas endoglicanases ocor- rendo naturalmente possuem um domínio de ligação de celulose, enquanto outras não. Algumas endoglicanases possuem também atividade de xilase (Bailey e outros, 1993).

"Beta-glicosidase" ou "BG" ou "βG" refere-se às enzimas que degradam pequenos oligossacarídeos solúveis incluindo celobiose em glico- se. Elas são classificadas como EC 3.2.1.21. Elas são beta-D-glicosídeo gli- coidrolases que catalisam tipicamente a hidrólise de resíduos de beta-D- glicose de não redução terminal. Essas enzimas reconhecem oligossacarí- deos de glicose. Substratos típicos são celobiose e celotriose. A celobiose é um inibidor das celobioidrolases, pelo que, a degradação da celobiose é im- portante para superar a inibição do produto final das celobioidrolases.

As xilanases são enzimas que são capazes de reconhecer e hi- drolisar a hemicelulose. Elas incluem ambas enzimas exoidrolíticas e endoi- drolíticas. Tipicamente, elas possuem atividade endo-1,4-beta-xilanase (EC 3.2.1.8) ou beta-D-xilosidase (EC 3.2.1.37) que rompe a helicelulose em xi- lose. "Xilanase" ou "Xin" em conexão com a presente invenção refere-se es- pecialmente a uma enzima classificada como EC 3.2.1.8 hidrolisando polí- meros de xilose do substrato lignocelulósico ou xilana purificada.

Além disso, as celulases podem ser classificadas em várias fa- mílias de glicosil hidrolase de acordo com sua seqüência primária, sustenta- da por análise da estrutura tridimensional de alguns elementos da família (Henrissat 1991, Henrissat e Bairoch 1993, 1996). Algumas glicosil hidrola- ses são enzimas multifuncionais que contêm domínios catalíticos que per- tencem à diferentes famílias de glicosil hidrolase. A família 3 consiste em beta-glicosidases (EC 3.2.1.21) tais como Ta BG-81, At BG-101 e ct BG-76 descritas aqui. A família 5 (anteriormente conhecida como celA) consiste principalmente em endoglicanases (EC 3.2.1.4) tais como Ta EG-28 descrita aqui. A família 7 (anteriormente família celulase celC) contém endoglicana- ses (EC 3.2.1.4) e celobioidrolases (EC 3.2.1.91) tais como, Ct EG-54, Ta CBH, At CBH-A, At CBH-C e ct CBH descritas aqui. A família 10 (anterior- mente celF) consiste principalmente nas xilanases (EC 3.2.1.8) tais como Ta XYN-30 e At XYN-60 descritas aqui. A família 45 (anteriormente celK) con- tém endoglicanases (EC 3.2.1.4) tais como At EG-40 e At semelhante a EG- 40 descritas aqui.

As enzimas celulósicas úteis para hidrólise do material celulósi- co são obtidas de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum. Obtidas de" significa que elas podem ser obti- das das ditas espécies, porém isso não exclui a possibilidade e que elas se- jam obtidas de outras fontes. Em outras palavras, elas podem se originar de qualquer organismo incluindo plantas. Preferivelmente, elas se originam de microorganismos, por exemplo, bactérias ou fungos. A bactéria pode ser, por exemplo, de um gênero selecionado dentre Bacilius, Azospirillum e Strep- tomyces. Mais preferivelmente a enzima se origina de fungos (incluindo fun- gos filamentosos e leveduras), por exemplo de um gênero selecionado do grupo consistindo em Thermoascus, Acremonium, Chaetomium, Achaetomi- um, Thielavia, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fo-mes, Fusa- rium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Myrio- coccum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Po- dospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes e Tri- choderma.

De acordo com uma concretização preferida da invenção as en- zimas podem ser obtidas da cepa Thermoascus aurantiacus ALK04242 de- positada como CBS 116239, cepa ALK04245 depositada como CBS 116240 presentemente classificada como Acremonium thermophilum, ou cepa Chae- tomium thermophilum ALK04265 depositada como CBS 730.95. A celobioidrolase compreende, preferivelmente, uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às

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Essas CBHs possuem uma constante de inibição de celulose vantajosa em comparação aquela da CBH de Trichoderma reesei e elas mostram resultados de hidrólise aperfeiçoados quando se testa vários subs- tratos celulósicos. As SEQ ID Nes: 2 e 4 não compreendem uma CBH. Os resultados de hidrólise especificamente melhorados podem ser obtidos quando um domínio de ligação de celulose (CBH) é anexado a uma CBH que não possui CBD propriamente. O CBD pode ser obtido de um Tricho- derma ou espécies Chaetomium, e é preferivelmente anexado à CBH atra- vés de um ligante. A proteína de fusão resultante contendo uma região de núcleo de CBH anexada a um CBD através de um ligante pode compreender uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID NQS: 28 ou 30. Os polinucleotídeos compreendendo uma seqüência da SEQ ID Ne: 27 ou 29 codificam tais proteínas de fusão.

A endoglicanase pode compreender uma seqüência de aminoá- cido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID Ne: 10, 12, 14 ou 16 ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma. Essas en- doglicanase possuem boa estabilidade termica. A beta-glicosidase pode compreender uma seqüência de ami- noácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N9: 22, 24 ou 26, ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma. Essas be- ta-glicosidases possuem boa resistência com relação à iníbição de glicose que é vantajosa para evitar inibição do produto final durante hidrólise enzi- mática do material celulósico. As beta-glicosidases podem também ser usa- das na preparação da soforose, um indutor de celulase empregado no culti- vo de T. reesei.

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A xilanase pode compreender uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N9: 18 ou

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O termo "identidade" significa a identidade global entre duas se- qüências de aminoácido comparadas uma com a outra a partir do primeiro aminoácido codificado pelo gene correspondente até o último aminoácido. A identidade das seqüências de comprimento pleno é medida por emprego do programa de alinhamento global Needleman-Wunsch da EMBOSS (Europe- an Molecular Biology Open Software Suite; Rice e outros, 2000) pacote de programas, versão 3.0.0, com os seguintes parâmetros: EMBLOSUM62, pe- nalidade de intervalo 10.0, penalidade estendida 0,5. O algoritmo é descrito em Needleman and Wunsch (1970). O versado na técnica está ciente do fato de que, quando se utiliza o algoritmo Needleman-Wunsch, os resultados são comparáveis apenas quando do alinhamento dos domínios correspondentes da seqüência. Conseqüentemente, a comparação, por exemplo, de seqüên- cias de celulase incluindo CBD ou seqüências de sinal com seqüências que não contêm aqueles elementos não pode ser realizada.

De acordo com uma concretização da invenção é empregado um polipeptídeo celulósico possuindo pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade com relação às SEQ ID Nes: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 ou pelo menos com relação aos seus fragmentos enzimaticamente ativos.

O termo "fragmento enzimaticamente ativo" significa qualquer fragmento de uma seqüência definida que possui atividade celulósica. Em outras palavras, um fragmento enzimaticamente ativo pode ser a parte da proteína madura da seqüência definida ou pode ser apenas um fragmento da parte da proteína madura, contanto que ele ainda tenha atividade de ce- lobioidrolase, endoglicanase, beta-glicosidase ou xilanase.

As enzimas celulósicas são preferivelmente enzimas recombi- nantes, que podem ser produzidas de maneira geralmente conhecida. Um fragmento de polinucleotídeo compreendendo o gene da enzima é isolado, o gene é inserido sob um promotor forte em um vetor de expressão, o vetor é transferido para células hospedeiras apropriadas e as células hospedeiras são cultivadas sob condições que provocam a produção da enzima. Os mé- todos para produção de proteína por tecnologia recombinante em diferentes • sistemas de hospedeiro são bem conhecidos na arte (Sambrook e outros, 1989; Coen, 2001; Gellissen, 2005). Preferivelmente, as enzimas são produ- zidas como enzimas extracelulares que são secretadas no meio de cultura, a partir do qual elas podem ser facilmente recuperadas e isoladas. O meio de cultura gasto do hospedeiro de produção pode ser empregado como tal, ou as células hospedeiras podem ser removidas do mesmo, e/ou ele pode ser concentrado, filtrado ou fracionado. Ele também pode ser seco.

Polipeptídeo isolado no presente contexto pode significar sim- plesmente que as células e fragmentos de células foram removidos do meio de cultura contendo o polipeptídeo. Convenientemente, os polipeptídeos são isolados, por exemplo, por adição de polímeros aniônicos e/ou catiônicos ao meio de cultura gasto para melhorar a precipitação das células, fragmentos de células e algumas enzimas que possuem atividades colaterais indeseja- das. O meio é então filtrado usando um agente de filtração inorgânico e um filtro para remover os precipitados formados. Após isso, o filtrado é adicio- nalmente processado usando uma membrana semipermeável para remover o excesso de sais, açúcares e produtos metabólicos.

De acordo com uma concretização da invenção, o polipeptídeo heterólogo compreende um gene semelhante aquele incluído em um micro- organismo possuindo número de acesso DSM 16723, DSM 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

O hospedeiro de produção pode ser qualquer organismo capaz de expressar a enzima celulósica. Preferivelmente, o hospedeiro é uma célu- la microbiana, mais preferivelmente um fungo. Mais preferivelmente, o hos- pedeiro é um fungo filamentoso. Preferivelmente, o hospedeiro recombinante é modificado para expressar e secretar enzimas ceíulósicas como suas ativi- dade principal ou uma de suas atividades principais. Isso pode ser realizado por deleção dos genes secretados homólogos principais, por exemplo, as quatro celulases principais de Trichoderma e por alvejamento dos génes he- terólogos para um local que tenha sido modificado para garantir níveis de produção e expressão altos. Os hospedeiros preferidos para produção de enzimas ceíulósicas são especificamente cepas do gênero Trichoderma ou Aspergillus.

As enzimas necessárias para a hidrólise do material celulósico de acordo com a invenção podem ser adicionadas em uma quantidade en- zimaticamente eficaz tanto simultaneamente por exemplo, na forma de uma mistura de enzimas quanto seqüencialmente ou como parte da sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Qualquer combinação das celobioidrola- ses compreendendo uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID Ngs: 2, 4, 6 óu 8 ou com relação a qualquer fragmento ativo da mesma pode ser empregada em conjunto com qualquer combinação de endoglicanases e beta-glicosidases. Se o material celulósico compreender hemicelulose, hemicelulases, preferivelmente xila- nases são adicionalmente empregadas para a degradação. As endoglicana- ses, beta-glicosidases e xilanases podem ser selecionadas daquelas descri- tas aqui, porém não estão limitadas às mesmas. Elas também podem ser preparações dè enzima comercialmente disponíveis. Além das celuloses e hemicelulases opcionais, uma ou mais outras enzimas podem ser emprega- das, por exemplo, proteases, amilases, Iacases1 lipases, pectinases, estera- ses e/ou peroxidases. Outro tratamento da enzima pode ser realizado antes, durante ou após o tratamento da celulase.

O termo "preparação de enzima" refere-se a uma composição compreendendo pelo menos uma das enzimas desejadas. A preparação po- de conter as enzimas na forma parcialmente purificada e isolada. Ela pode consistir essencialmente em uma enzima ou enzimas desejadas. Alternati- vamente, a preparação pode ser um meio de cultura gasto ou filtrado con- tendo uma ou mais enzimas celulósicas. Além da atividade celuíósica, a pre- paração pode conter aditivos, tais como, mediadores, estabilizadores, tam- pões, conservantes, agentes tensoativos e/ou componentes de meio de cul- tura. Os aditivos preferidos são aqueles que são geralmente usados nas preparações de enzima destinadas a uma aplicação específica. A prepara- ção da enzima pode ser na forma de líquido, pó ou granulado. Preferivel- mente, a preparação da enzima é o meio de cultura gasto. "Meio de cultura • gasto" refere-se ao meio de cultura do hospedeiro compreendendo as enzi- mas produzidas. Preferivelmente, as células hospedeiras são separadas do meio após a produção.

De acordo com uma concretização da invenção a preparação da enzima compreende uma mistura de CBH, EG e BG, opcionalmente em con- junto com xilanase e/ou outras enzimas. A CBH compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID Nes: 2, 4, 6 ou 8 ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma, e pode ser obtida de Thermoascus aurantiacus, Acremoni- um thermophilum, ou Chaetomium thermophilum, considerando-se que EG, BG e xilanase podem ser de qualquer origem incluindo de outros organis- mos. Outras enzimas que podem estar presentes na preparação são, por exemplo, proteases, amilases, lacases, lipases, pectinases, esterases e/ou peroxidases.

Diferentes misturas de enzima e combinações podem ser usa- das para se adequarem à diferentes condições de processo. Por exemplo, se o processo de degradação for realizado em uma temperatura alta, as en- zimas termoestáveis serão escolhidas. Uma combinação de uma CBH da família 7 com uma endoglicanase da família 45, opcionalmente em combina- ção com uma BG da família 3 e/ou uma xilanase da família 10 possui exce- lente desempenho de hidrólise ambas a 45°C e em temperaturas elevadas.

Enzimas celulósicas de Trichoderma reesei são conveniente- mente empregadas em temperaturas na faixa de cerca de 40-50°C na hidró- lise e a 30-40°C em SFF. CBH, EG, BG e Xin obtidas de Thermoascus au- rantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum são efi- cazes nessas temperaturas também, porém além disso, a maioria delas também funciona muito bem em temperaturas entre 50°C e 75°C, ou mesmo até 80°C e 85°C, tais como entre 55°C e 70°C, por exemplo entre 60°C e 65°C. Para tempos de incubação curtos, misturas de enzima são funcionais até mesmo a 85°C, para hidrólise completa temperaturas mais baixas são normalmente empregadas.

O método para tratar material celulósico com CBH, EG, BG e Xin é especialmente apropriado para produção de açúcares fermentados de material lignocelulósico. Os açúcares fermentados podem então ser fermen- tados por levedura em etanol e usados como combustível. Eles também po- dem ser usados como intermediários ou matérias-primas para a produção de várias substâncias químicas ou blocos de construção para os processos da indústria química, por exemplo, na assim chamada biorrefinaria. O material lignocelulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise enzimática, para fragmentar a estrutura da fibra dos substratos celulósicos e tornar a fração de celulose mais acessível às enzimas celulósicas. Os pré-tratamentos cor- rentes incluem processos mecânicos, químicos ou térmicos e combinações dos mesmos. O material pode ser tratado, por exemplo, por explosão de va- por ou hidrólise de ácido. Vários polipeptídeos celulósicos foram encontrados em Thermo- ascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, e Chaetomium thermophilum. Os novos polipeptpídeos podem compreender um fragmento possuindo ati- vidade celulósica e serem selecionados do grupo consistindo em um poli- peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 66%, preferivelmente 70% ou 75% de identidade com relação à SEQ ID N8: 4, 79% de identidade com relação à SEQ ID NQ: 6, 78% de identidade com relação à SEQ ID N9: 12, 68%, preferivelmente 70% ou 75% de identi- dade em relação à SEQ ID N9: 14, 72%, preferivelmente 75% de identidade em relação à SEQ ID N9: 16, 68%, preferivelmente 70% ou 75% de identida- de em relação à SEQ ID N9: 20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N9: 22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N9: 26.

Os novos polipeptídeos também podem ser variantes dos ditos polipeptídeos. Uma "variante" pode ser um polipeptídeo que ocorre natural- mente, por exemplo, como uma variante alélica dentro da mesma cepa, es- pécie ou gênero, ou pode ter sido gerada por mutagênese. Ela pode com- preender substituições, deleções ou inserções de aminoácido, porém ainda funciona de modo substancialmente semelhante às enzimas definidas aci- ma, isto é, ela compreende um fragmento possuindo atividade celulósica.

Os polipeptídeos celulósicos são geralmente produzidos na cé- lula como polipeptídeos imaturos compreendendo uma seqüência de sinal que é cliváda durante a secreção da proteína. Eles também podem ser adi- cionalmente processados durante secreção, na extremidade N-terminal e/ou C-terminal para fornecer uma proteína madura, enzimaticamente ativa. Um polipeptídeo "compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica" significa que o polipeptídeo pode estar tanto na forma imatura quanto madu- ra, preferivelmente está na forma madura, isto é, quando o processamento já aconteceu.

Os novos polipeptídeos podem ser, adicionalmente, um "frag- mento dos polipeptídeos ou variantes" mencionados acima. O fragmento pode ser a forma madura das proteínas mencionadas acima ou pode ser apenas uma parte enzimaticamente ativa da proteína madura. De acordo com uma concretização da invenção, o polipeptídeo possui uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade com relação às SEQ ID N°s: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26 ou com rela- ção a um fragmento celulosicamente ativo da mesma. Pode também ser uma variante do mesmo, ou um fragmento do mesmo possuindo atividade de celobioidrolase, endoglicanase, xilanase ou beta-glicosidade. De acordo com outra concretização da invenção, o polipeptídeo consiste essencialmen- te em um fragmento celulosicamente ativo de uma seqüência das SEQ ID N°s: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26.

Os novos polinucleotídeos podem compreender uma seqüência de nucleotídeo das SEQ ID N°s: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 ou 25, ou uma se- qüência codificando um novo polipeptídeo conforme definido acima, incluindo filamentos complementares do mesmo. Os polinucleotídeos conforme usados aqui referem-se a ambos RNA e DNA podendo ser de filamento simples ou duplo. O polinucleotídeo pode também ser um fragmento dos polinucleotídeos compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleotídeos. De acordo com uma concretização da invenção ele possui pelo menos 100, 200 ou 300 nucleotídeos de comprimento. Adicional- mente, os polinucleotídeos podem ser degenerados como resultado do código genético em qualquer uma das seqüências conforme definido acima. Isso sig- nifica que códons diferentes podem codificar o mesmo aminoácido.

De acordo com uma concretização da invenção o polinucleotí- deo é "compreendido" das SEQ ID N°s: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 ou 25, o que significa que a seqüência possui pelo menos parte da seqüência men- cionada. De acordo com outra concretização da invenção, o polinucleotídeo compreende um gene semelhante ao incluído em um microorganismo possu- indo número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

As novas proteínas/polipeptídeos podem ser preparados con- forme descrito acima. Os novos polinucleotídeos podem ser inseridos em um vetor, que é capaz de expressar o polipeptídeo codificado pela seqüência heteróloga, e o vetor pode ser inserido na célula hospedeira de expressão do dito polipeptídeo. A célula hospedeira é preferivelmente do gênero Tri- choderma ou Aspergillus.

O gene heterólogo codificando os novos polipeptídeos foi intro- duzido em um plasmídeo em uma cepa Escherichia coli possuindo número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

As novas enzimas podem ser componentes de uma preparação de enzima. A preparação de enzima pode compreender um ou mais dos no- vos polipeptídeos e pode estar, por exemplo, na forma de meio de cultura gasto, pó, grânulos ou líquido. De acordo com uma concretização da inven- ção a mesma compreende atividade de celobioidrolase, endoglicanase, be- ta-glicosidade e opcionalmente atividade de xilanase e/ou outras atividades de enzima. A mesma pode compreender, adicionalmente, quaisquer aditivos convencionais.

As novas enzimas podem ser aplicadas em qualquer processo envolvendo enzimas celulósicas, tais como, em combustível, têxteis, deter- gente, polpa e papel, alimentos, indústria de suprimentos ou bebidas, e es- pecialmente na hidrólise de material celulósico para a produção de biocom- bustível compreendendo etanol. Na indústria de polpa e papel, elas podem ser usadas para modificar a fibra celulósica, por exemplo, no tratamento da • polpa kraft, tratamento mecânico da polpa ou papel reciclado.

A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes. Deve ser entendido, contudo, que as concretizações fornecidas na descrição anterior e nos exemplos são para fins ilustrativos e que várias alterações e modificações são possíveis dentro do escopo da invenção. Exemplos

Exemplo 1. Classificação de cepas expressando atividade celulósica e seu cultivo para purificação

Cerca de 25 cepas de fungos da Roal Oy Culture Collection fo- ram testadas quanto a atividade celulósica incluindo beta-glicosidases. Após classificação preliminar seis cepas foram escolhidas para estudos adicionais. Elas eram Thermoascus aurantiacus ALK04239 e ALK04242, Acremonium thermophilum ALK04245, Talaromyces thermophilus ALK04246 e Chaeto- mium thermophilum ALK04261 e ALK04265.

As cepas ALK04239, ALK04242 e ALK04246 foram cultivadas em frascos de agitação a 42°C por 7 dias no meio 3 χ B, que contém g/litro: Celulose Solka Floe 18, grão 18 gasto do destilador, xilana 9 de aveia e es- pelta, CaC032, carne de soja 4,5, (NH4)HPO4 4,5, farelo de trigo 3,0, KH2PO4 1,5, MgSO4 H2O 1,5, NaCI 0,5, KNO3 0,9, goma de alfarroba 9,0, solução de elemento de traço #1 0,5, solução de elemento de traço #2 0,5 e Struktol (Stow, OH, USA) antiespumante 0,5 ml_; o pH foi ajustado para 6,5. Solução de elemento de traço #1 possui g/litro: MnSO4 1,6, ZnS04-7H20 3,45 e CoCI2.6H20 2,0; solução de elemento de traço #2 possui g/litro: Fe- S04.7H20 5,0 com duas gotas de H2SO4 concentrado.

A cepa ALK04261 foi cultivada em frascos de agitação no meio 1 χ B, que possui um terço de cada um dos constituintes do meio 3 χ B (aci- ma, exceto que possui as mesmas concentrações de CaCO3, NaCI e os e- lementos de traço. A cepa foi cultivada a 45°C por 7 dias.

A cepa ALK04265 foi cultivada em frascos de agitação no meio que se segue, g/L: celulose Solka Floe 40, Pharmamedia™ (Traders Protein, Memphis, TN, USA) 10, pó impregnado com milho 5, (NH4)2S04 5 e KH2PO4 15; o pH foi ajustado para 6,5. A cepa foi cultivada a 45°C por 7 dias.

Após o cultivo, as células e outros sólidos foram coletados por centrifugação e o sobrenadante foi recuperado. Para os cultivos de frasco com agitação, os inibidores de protease PMSF (fluoreto de fenilmetil- sulfonila) e pepstatina A foram adicionados a 1 mM e 10 μg/mL, respectiva- mente. Se não forem usadas imediatamente, as preparações serão armaze- nadas em alíquotas a -20°C.

Para a estimativa da atividade térmica das enzimas, foram reali- zados ensaios de preparações de cultivo em frasco de agitação a 50°C, 6Ò°C, 65°C, 70°C e 75°C por 1 hora, na presença de 100 μg albumina de soro bovi- no (BSA)/mL como um estabilizador. Ensaios preliminares foram realizados a 50°C e 65°C em dois valores de pH diferentes (4,8/5,0 ou 6,0) de modo a tor- nar claro qual pH seria mais apropriado ao ensaio de atividade térmica. Todos os sobrenadantes do frasco de agitação foram ensaiados quanto às seguintes atividades:

Atividade semelhante à Celobioidrolase I ('CBHI') e atividade semelhante à éndoglicanase I ('EGI'):

Essas foram medidas em um tampão de acetato de Nas 40 mM com 0,5 mM de MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactosídeo) como o substrato. Glicose (100 mM) foi adicionada para inibir qualquer interferência na ativida- de da beta-glicosidase. 4-metilumbeliferila liberada foi medida a 370 nm. α atividades da 1CBHI' e da 1EGI1 foram distinguidas por medição da atividade na presença e ausência de celobiose (5 mM). A atividade que não é inibida pela celobiose representa a atividade da 1EGI1 e o restante da atividade de MUL representa a atividade da 'CHBI1 (van Tilbeurgh e outros, 1988). O en- saio foi realizado em pH 5,0 ou 6,0 (vide a seguir).

A atividade da endoglicanase (CMCase):

Essa foi ensaiada com 2% (peso/volume) de carboximeticelulo- se (CMC) como o substrato em 50 mM e tampão citrato essencialmente con- forme descrito por Bailey e Nevalainen 1981; Haakana e outros. 2004. Os açúcares de redução foram medidos com o reagente de DNS. O ensaio foi realizado em pH 4,8 ou 6,0 (vide a seguir).

Atividade da beta-glicosidase (BGU):

• Essa foi ensaiada com 4-nitrofenil-p-D-glicopÍranosídeo (1 mM) em 50 mM de tampão citrato conforme descrito por Bailey e Nevalainen 1981. O 4-nitrofenol liberado foi medido a 400 nm. O ensaio foi realizado em pH de 4,8 ou 6,0 (vide a seguir).

As atividades relativas das enzimas são apresentadas na figura í. As atividades relativas foram apresentadas por ajuste da atividade a 60°C como 100% (figura 1). Todas as cepas produziram enzimas que possuíam alta atividade em temperaturas altas (65°C-75°C).

Para purificações da proteína, a ALK04242 também se desen- volveu em um bioreator de 2 litros (Braun Biostat(R) B1Braun, Melsungen, Alemanha) no meio que se segue, g/litro: celulose Solka Floc 40, carne de soja 10, NH4NO3 5, KH2PO4 5, MgS04.7H20 0,5, CaCI2-2H20 0,05, solução de elemento de traço #1 0,5, solução de elemento de traço #2 0,5. A aera- ção foi de 1 wm, controle do antiespumante com Struktol, agitação a 200- 800 rpm e temperatura a 47°C. Duas bateladas foram operadas, uma em pH 4,7 ± 0,2 (NH3/H2SO4) e a outra com pH inicial de 4,5. O tempo de cultivo foi de 7 dias. Após o cultivo as células e outros sólidos foram removidos por centrifugação.

A cepa ALK04245 foi desenvolvida em bioreator de 2 litros (Braun Biostat(R) B, Braun, Melsungen, Alemanha) no meio que se segue, g/litro: celulose Solka Floe 40, pó impregnado com milho 15, grão 5 gasto do destilador, xilaná 3 de aveia e espelta, goma de alfarroba 3, (NH4)2SO4 e KH2PO4. A faixa do pH foi de 5,2±0,2 (NH3ZH2SO4), aeração 1 wm, agitação 300-600 rpm, controle antiespuma com Struktol e a temperatura a 42°C. O tempo de cultivo foi de 4 dias. Após o cultivo as células e outros sólidos fo- ram removidos por centrifugação.

Para purificação da enzima, ALK04261 foi desenvolvida em um bioreator de 10 litros (Braun Biostat(R) ED, Braun, Melsungen, Alemanha) no meio que se segue, g/litro: celulose Solka Floe 30, grão 10 gasto no destila- dor, xilana 5 de aveia e espelta, CaCO3 2, carne de soja 10, farelo de trigo 3,0, (NH4)2SO4 5, KH2PO4 5, MgS04-7H20 0,5, NaCI 0,5, KNO3 0.3, solução de elemento de traço #1 0,5 e solução de elemento de traço #2 0,5. A faixa de pH era de 5,2 ± 0,2 (NH3ZH2SO4), aeração de 1 wm, agitação de 200-600 rpm, controle de antiespumante com Struktol e a temperatura de 42°C. O tempo de cultivo foi de 5 dias. Uma segunda batelada foi desenvolvida sob condições semelhantes, exceto que Solka Floe foi adicionada a 40 gZL e o grão gasto a 15 gZL. Os sobrenadantes foram recuperados por centrifugação e filtração através de filtros Seitz- K 150 and EK (Pall SeitzSchenk Filtersys- tems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha). O último sobrenadante foi concen- trado cerca de dez vezes usando o sistema de ultrafiltração Pellicon mini (filtro NMWL 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).

Para purificação da enzima, ALK04265 também se desenvolveu em um bioreator de 10 litros (Braun Biostat(R) ED, Braun, Melsungen, Ale- manha) no mesmo meio como acima, exceto que KH2PO4 foi adicionado a 2,5 g/L. A faixa de pH era de 5,3 ± 0,3 (NH3/H2SO4), aeração de 0,6 wm, agitação de 500 rpm, controle de antiespumante com Struktol e a temperatu- ra de 43°C. O tempo de cultivo foi de 7 dias. Os sobrenadantes foram recu- perados por céntrifugação e filtração através de filtros Seitz-K 150 and EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha). O último sobrenadante foi concentrado cerca de vinte vezes usando o sistema de ul- trafiltração Pellicon miní (filtro NMWL 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA). Exemplo 2. Purificação e caracterização de celobioidrolases a partir de Acremonium thermophilum ALKO4245 e Chaetomium thermophilum ALKO4265

Acremonium thermophilum ALK04245 e Chaetomium thermo- philum ALK04265 se desenvolveram conforme descrito no Exemplo 1. As celobioidrolases principais foram purificadas empregando a coluna de afini- dade com base em p-aminobenzil 1-tio-p-celobiosídeo, preparada conforme descrito por Tomme e outros, 1988.

Os sobrenadantes de cultura foram primeiro tamponados em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 5,0, contendo 1 mM de δ- gliconolactona e 0,1 M de glicose a fim de retardar a hidrólise do Iigante na presença de β-glicosidases. As celobioidrolases foram eluídas com 0,1 M de lactose e finalmente purificadas por filtração com cromatografia de gel em- pregando colunas Superdex 200 HR 10/30 no sistema AKTA (Amersham Pharmacia Biotech). O tampão empregado na filtração com gel era fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, contendo cloreto de sódio 0,15 M.

Celobioidrolases purificadas foram analisadas por SDS- eletroforese de gel poliacrilamida e a massa molecular de ambas as proteí- nas foi determinada como sendo de aproximadamente 70 kDa, avaliada com base no padrão de massa molecular (Low molecular weight calibration kit, Amersham Biosciences). As celobioidrolases Acremonium e Chaetomium foram denominadas como At Cel7A e Ct Cel7A, respectivamente, seguindo- se o esquema em Henrissat e outros. (1998) (Henrissat, 1991; Henrissat e Bairoch, 1993).

A atividade específica das preparações foi determinada empre- gando 4- metilumbeliferil-β-D-lactosídeo (MUL), 4-metilumbeliferil-β-D- celobiosídeo (MUG2) ou 4-metilumbeliferil-β-D-celotriosídeo (MUG3) como o substrato (van Tilbeurgh e outros, 1988) em 0,05 M tampão de citrato de só- dio pH 5 a 50°C por 10 min. As atividades da endoglicanase e xilanase fo- ram determinadas por procedimentos padrão (de acordo com IUPAC, 1987) empregando carboximetil celulose (CMC) e glicuronoxilana de bétula (Bailey e outros, 1992) como o substratos. A atividade específica contra Avicel foi calculada com base nos açúcares de redução formados em uma reação de 24 horas a 50°C, pH 5,0, com substrato a 1% e dosagem de enzima de 0,25 μΜ. O teor da proteína das preparações de enzima purificadas foi medido de acordo com Lowry e outros, 1951. De modo a caracterizar os produtos finais de hidrólise, açúcares solúveis liberados em experimento de hidrólise de 24 horas, conforme descrito acima, foram analisados por HPLC (Dionex). Celo- bioidrolase I purificada (CBHI/Cel7A) do Trichoderma reesei foi empregada como uma referência.

As atividades específicas das enzimas purificadas e aquela de T.reesei CBHI/Cel7A são apresentadas na Tabela 1. As celobioidrolases At Cel7A e Ct Cel7A possuem atividades específicas maiores contra substratos sintéticos pequenos, quando comparadas à T.reesei CBHI/Cel7A. A ativida- de específica contra Avicel foi claramente maior com as enzimas reveladas aqui. Atividades baixas das preparações da enzima purificada contra xilana e CMC podem tanto ser devidas às proteínas propriamente, quanto pelo me- nos parcialmente às quantidades menores restantes das enzimas de conta- minação. O produto final principal de hidrólise da celulose por todas enzimas purificadas foi celobiose que é típica das celobioidrolases. Tabela 1. Atividades específicas (nkat/mg) das celobioidrolases purificadas e a enzima de referência de T.reese/(50oC, pH 5,0, 24 horas)._

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A estabilidade térmica das celobioidrolases purificadas foi de-

terminada em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença de 0,1% BSA em pH 5,0 por 60 minutos empregando 4-metilumbeliferil-p-D- lactosídeo como o substrato. CBH/Cel7A de C. thermophilum ALK04265 e CBH/Cel7A de A. thermophilum ALK04245 foram estáveis até 65°C e 60°C, respectivamente. A enzima de referência T. reesei (CBHI/Cel7A) reteve 100% da atividade até 55°C. Exemplo 3. Purificação e caracterização de uma endoglicanase a partir de Acremonium thermophilum ALK04245

Acremonium thermophilum ALK04245 foi desenvolvida confor- me descrito no Exemplo 1. O sobrenadante da cultura foi incubado a 70°C por 24 horas, após o que foi concentrado por uItrafiItração. A endoglicanase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófoba e croma- tografia de troca de cátion seguido por filtração com gel. A atividade de en- doglicanase das frações coletadas durante purificação foi determinada em- pregando carboximetil celulose (CMC) como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). O teor da proteína foi medido por Kit de Ensaio BioRad (Bio- Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante de cultura concentrado foi aplicado a uma colu- na de interação hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl FF, equilibrada com 20 mM de tampão fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1 M (NH4)2SO4. As proteínas ligadas foram eluídas com o gradiente linear a partir do tampão acima para 5 mM de fosfato de potássio, pH 6,0. As frações foram coletadas e a atividade de endoglicanase foi determinada conforme descrito acima. A atividade de endoglicanase foi eluída em uma área de condutividade ampla de 120 a 15 mS/cm.

Frações combinadas foram aplicadas a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP XL equilibrada com um gradiente linear de 0 a 0,25 M NaCI no tampão de equilíbrio. A atividade de endoglicanase contendo proteína foi eluída na área de condutividade de 3-7 mS/cm. Cromatografia de troca de cátion foi repetida e o eluato de proteína foi concentrado por liofilização.

A amostra dissolvida foi carregada em uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada com 20 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,0, contendo 0,15 M de NaCI. A fração da proteína principal foi eluída da coluna com o volume de retenção de 13,3 mL. O eluato da proteí- na foi tido como sendo puro por SDS-eletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 40 kDa. A atividade específica da proteína purificada, denominada como At EG-40, a 50°C foi determinada como sendo de 450 nkat/mg (procedimento do IUPAC 1987, empregando CMC como o substrato).

A estabilidade térmica da endoglicanase purificada foi determi- nada em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos empregando carboximetil celulose como o substrato. EG-40/Cel45A de A. thermophilum foi estável até 80°C. As enzimas de referência de EGI (Cel7B) e EGII (Cel5A) T. reesei mantive- ram 100% de atividade até 60°C e 65°C, respectivamente.

Exemplo 4. Purificação de uma endoglicanase a partir Chaetomium thermophilum ALK04261

Chaetomium thermophilum ALK04261 foi desenvolvida confor- me descrito no Exemplo 1. A endoglicanase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de cátion se- guido por filtração com gel. A atividade de endoglicanase das frações cole- tadas durante purificação foi determinada empregando carboximetil celulose (CMC) como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). Sulfato de amônio foi adicionado ao sobrenadante da cultura pa- ra alcançar a mesma condutividade como 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1 M (NH4)2SO4. A amostra foi aplicada a uma coluna de inte- ração hidrófobá HiPrep 16/10 Phenyl FF equilibrada com 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1M (NH4)2SO4. A eluição foi realizada com um gradiente linear de 20 a 0 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, seguido por 5 mM de fosfato de potássio, pH 6,0 e água. As proteínas ligadas foram eluí- das com um gradiente linear de 0 a 6 M de uréia. As frações foram coletadas e a atividade da endoglicanase foi analisada conforme descrito acima. A pro- teína contendo atividade de endoglicanase foi eluída no começo do gradien- te de uréia.

As frações foram combinadas, equilibradas para 16 mM Tris-HCI pH 7,5 (I = 1,4 mS/cm) por coluna 10DG (Bio-Rad) e aplicadas a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF com 20 mM Tris-HCI, pH 7,5. As proteí- nas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 1 M NaCI no tam- pão de equilíbrio. As frações foram coletadas e analisas quanto a atividade de endoglicanase conforme descrito acima. A proteína foi eluída na faixa de 10-20 mS/cm.

A amostra foi equilibrada para 15 mM acetato de sódio, pH 4,5 por coluna 10DG (Bio-Rad) e aplicada a uma coluna de troca de cátion Hi- Trap SP XL equilibrada com 20 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As proteí- nas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 0,4 M de acetato de sódio, pH 4,5. A atividade da endoglicanase foi avaliada na faixa de 1-10 mS/cm. A amostra coletada foi liofilizada.

A amostra foi dissolvida em água e aplicada a uma coluna de fil- tração de gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada com fosfato e sódio 20 mM pH 6,0, contendo 0,15 M de NaCI. As frações foram coletadas e aquelas contendo atividade de endoglicanase foi combinadas. O eluído da proteína foi tido como sendo puro por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida e a massa molecular foi avaliada com base no padrão de massa molecular (pa- drão SDS-PAGE pré-colorido, Faixa Ampla, Bio-Rad) como sendo de 54 kDa. O pl da proteína purificada, denominada como Ct EG-54 foi determina- do com PhastSystem (Pharmacia) como sendo de cerca de 5,5. Exemplo 5. Purificação de uma endoglicanase a partir de Thermoascus aurantiacus ALK04242

Thermoascus aurantiacus ALK04242 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. A endoglicanase pura foi obtida por purificação se- qüencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de ânion seguido por filtração com gel. A atividade de endoglicanase das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando carboximetil celulose (CMC) como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). O teor da proteína foi medido pelo Kit de Ensaio BioRad (Bio-Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de intera- ção hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl equilibrada Com 20 mM de tampão fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,7 M (NH4)2SO4. As proteínas ligadas foram eluídas com 0,2 M (NH4)2SCM (I = 39 mS/cm). As frações contendo atividade de endoglicanase foram combinadas e concentradas por ultrafiltração.

A amostra foi dessalinizada em colunas 10DG (Bio-Rad) e apli- cada a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF equilibrada com 15 mM Tris- HCL, pH 7,0. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 0,4 M NaCI no tampão de equilíbrio. A proteína contendo ativi- dade de endoglicanase foi eluída na área de condutividade de 15-21 mS/cm. Frações coletadas foram combinadas e concentradas como acima.

A amostra foi aplicada a uma coluna de filtração de gel Sepha- cryl S-100 HR 26/60, equilibrada com 50 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0, contendo 0,05 M de NaCI. A fração de proteína contendo atividade de endoglicanase foi eluída da coluna com um volume de retenção corres- pondendo a um peso molecular de 16 kDa. As frações coletadas foram com- binadas, concentradas e a filtração do gel foi repetida. O eluído da proteína foi julgado como sendo puro por SDS-eletroforese de gél de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 28 kDa. O pl da proteína purifi- cada, denominada como Ta EG-28, foi determinado em um gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) como sendo de cerca de 3,5. A atividade especí- fica de Ta EG-28 a 50°C foi determinada como sendo de 4290 nkat/mg (pro- cedimento do !UPAC 1987, empregando CMC como o substrato). Exemplo 6. Purificação e caracterização de uma β-giicosidase a partir de Acremoniüm thermophilum ALK04245

Acremoniüm thermophilum ALK04245 foi desenvolvida confor- me descrito no Exemplo 1. A β-glicosidase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de ânion segui- do por filtração com gel. A atividade da β-glicosidase das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando 4-nitrofenil^-D- glucopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko1 1990). O teor da prote- ína foi medido pelo Kit de Ensaio BioRad (Bio-Rad Laboratories) empregan- do albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de intera- ção hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF, equilibrada com 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1 M (NH4)2SO4. As proteínas liga- das foram eluídas com um gradiente linear do tampão de equilíbrio para 5 mM de fosfato de potássio na área de condutividade 137-16 mS/cm. As fra- ções coletadas foram combinadas e concentradas por ultrafiltração.

A amostra foi dessalinizada em colunas 10DG (Bio-Rad) e apli- cada a uma coluna de troca de ânion de HiTrap DEAE FF equilibrada com 10 mM de fosfato de potássio pH 7,0. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear a partir do tampão de equilíbrio para ao mesmo tampão contendo 0,25 M de NaCI na área de condutividade de 1,5-12 mS/cm. Cromatografia de troca de ânion foi repetida como acima, exceto que 4 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, foram usados. As proteí- nas foram eluídas na área de condutividade de 6-9 mS/cm. As frações con- tendo atividade de β-glicosidase foram coletadas, combinadas e concentra- das.

O material ativo da cromatografia de troca de ânion foi aplicado a uma coluna Sephacryl S-300 HR 26/60 equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 6,5 contendo 0,15 M de NaCl. A proteína com atividade de β- glicosidase foi eluída com um volume de retenção correspondendo a um pe- so molecular de 243 kDa. A proteína foi considerada pura por SDS- eletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 101 kDa. O pl da proteína purificada, denominada como At βG- 101, foi determinado em um gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) como estan- do na área de 5,6-4,9. A atividade específica de At βG-101 a 50°C foi deter- minada como sendo de 1.100 nkat/mg (empregando 4-nitrofenil-p-D- glicopiranosídeo como o substrato, Bailey and Linko, 1990).

A estabilidade térmica da β-glicosidase purificada foi determina- da em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos, empregando 4-nitrofenil-β-D- glicopiranosídeo como o substrato. βΘ-101 de A. thermophilum foi estável até 70°C. A enzima de referência Aspergillus (Novozym 188) manteve 100% de atividade até 60°C.

Exemplo 7. Purificação de uma β-glicosidase a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4261

Chaetomium thermophilum ALKO4261 foi desenvolvido confor- me descrito no Exemplo 1. A β-glicosidase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófoba, cromatografia de troca de ânion e de cátion seguido por filtração com gel. A atividade da β-glicosidade das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando 4-nitrofenil-β-D- glicopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko, 1990).

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de intera- ção HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada com 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,8 M (NH4)2SO4. A eluição foi realizada com um gradiente linear do tampão de equilíbrio para 3 mM de fosfato de potás- sio, pH 6,0, seguido por eluição com água e 6 M de uréia. As primeiras fra- ções com atividade β-glicosidase foram eluídas na área de condutividade de 80-30 mS/cm. A segunda atividade da β-glicosidase foi avaliada com 6M uréia. As frações ativadas eluídas por uréia foram agrupadas e dessaliniza- das em colunas 10DG (Bio-Rad) equilibradas com 10 mM de Tris-HCl em pH 7,0.

Após dessalinização, a amostra foi aplicada a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF equilibrada com 15 mM de Tris-HCI1 pH 7,0. A proteína não se ligou à coluna, porém foi eluída durante a alimentação da amostra. Essa fração de fluxo atravessante foi dessalinizada em colunas de 10DG (Bio-Rad) equilibradas com 7 mM de acetato de Na1 pH 4,5.

A amostra da cromatografia de troca de ânion foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP FF equilibrada com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 10 mM a 400 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As frações com atividade de β-glicosidase eluindo na área de condutividade de 6,5-12 mS/cm foram coletadas, dessalinizadas em colunas 10DG (Bio-Rad) equilibradas com 7 mM de acetato de sódio, pH 4,5 e secas por congelamento.

A amostra Iiofilisada foi diluída a 100 μί de água e aplicada a uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HF10/30 equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 4,5, contendo 0,15 M de NaCI. A atividade da β- glicosidase foi eluída em um volume de retenção de 13,64 ml_. Frações cole- tadas foram combinadas, Iiofilisadas e dissolvidas em água. A proteína foi considerada pura por SDS-eletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 76 kDa. A proteína foi denominada como Ct βΘ-76.

Exemplo 8. Purificação e caracterização de uma β-glicosidase a partir 1 de Thermoascus aurantiacus ALK04242

Thermoascus aurantiacus ALK04242 foi desenvolvido conforme descrito no Exemplo .1. A β-glicosidase pura foi obtida por purificação se- qüencial com interação hidrófoba, cromatografia de troca de cátion e ânion seguido por filtração com gel. A atividade da β-glicosidase das frações cole- tadas durante purificação foi determinada empregando 4-nitrofenil^-D- glicopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko, 1990). O teor da prote- ína foi medido pelo Kit de Ensaio BioRad (Bio-Rad Laboratories) empregan- do albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de intera- ção HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada com 20 mM fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,7 M (NH4)2SO4. As proteínas ligadas foram elu- idas com um gradiente linear de 0,2 M (NH4)2SO4 a 5 mM fosfato de potás- sio, pH 6,0. A atividade da β-glicosidase foi eluída durante o gradiente na área de condutividade de 28,0-1,1 mS/cm. Asa frações foram combinadas e concentradas por uItrafiItração.

A amostra foi dessalinizada em colunas de 10DG (Bio-Rad) e aplicada a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF equilibrada com 20 mM de Tris-HCI pH 7,0. A enzima foi eluída com um gradiente linear de 0 a 0,2 M NaCI no tampão de equilíbrio e com eluição retardada por 20 mM de Tris-HCI contendo 0,4 M NaCI. A amostra eluindo na área de condutividade de cerca de 10-30 mS/cm foi concentrada por ultrafiltração e dessalinizada por coluna de 10DG (Bio-Rad).

A amostra foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP XL equilibrada com 9 mM de acetato de sódio, pH 4.5. A enzima foi eluí- da com um gradiente linear de 10 mM a 400 mM de NaAc e por eluição re- tardada empregando 400 mM de NaAc pH 4,5. As proteínas com atividade de β-glicosidase foram eluídas amplamente durante o gradiente linear na área de condutividade de 5,0-11,3 mS/cm.

O material ativo da cromatografia de troca de cátion foi aplicado a uma coluna Sephacryl S-300 HR 26/60 equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,0, contendo 0,15M de NaCI. A proteína com atividade de β- glicosidase foi eluída com um volume de retenção correspondendo a um pe- so molecular de 294 kDa. As frações coletadas foram combinadas, Iiofilisa- das e dissolvidas em água. A proteína foi considerada pura por SDS- eletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 81 kDa representando mais provavelmente a forma monomérica da proteína. O focalização isoelétrica (IEF) foi realizada usando um gel 3-9 pi. Após coloração com prata, uma área ampla acima de pl 5,85 foi colorida além de uma faixa estreita correspondendo a pl 4,55. A atividade específica da proteína purificada denominada como Ta βΘ-81 a 50°C foi determinada como sendo de 600 nkat/mg empregando 4-nitrofenil^-D-glicopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko, 1990).

A estabilidade térmica da β-glicosidase purificada foi determina- da em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos, empregando 4-nitrofenil-p-D- glicopiranosídeo como o substrato. T. aurantiacus βΘ-81 foi estável até 75°C. A enzimá de referência Aspergillus (Novozym 188) manteve 100% de atividade até 60°C.

Exemplo 9. Purificação de uma xilanase a partir de Acremonium ther- mophilum ALK04245

Acremonium thermophilum ALK04245 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. O sobrenadante da cultura foi incubado a 70°C por 24 horas, após o que, foi concentrado por ultrafiltração. A xilanase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófòba e cromatografia de troca de cátion seguido por filtração com gel. A atividade da xilanase foi determina- da empregando uma xilana de bétula como o substrato (procedimento do IU- PAC 1987). A proteína foi ensaiada por Kit de Ensaio BioRad Protein (Bio-Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino, como padrão.

O sobrenadante concentrado da cultura foi aplicado a uma colu- na de interação hidrófòba HiPrep 16/10 Butyl FF equilibrada com 20 mM de tampão fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1M (NH4)2SO4. As proteínas ligadas foram avaliadas com gradiente linear a partir do tampão acima para fosfato de potássio 5mM, pH 6,0. A fração de proteína foi eluída em uma área de condutividade ampla de 120 a 15 mS/cm.

A amostra da coluna de interação hidrófòba foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP XL equilibrada com 8 mM de acetato de sódio, pH 4,5. A proteína não se ligou a essa coluna, mas foi eluída no fluxo atravessante durante a alimentação da amostra. Esse eluído foi concentrado por ultrafiltração. A cromatografia hidrófòba foi repetida conforme descrito acima. As proteínas não ligadas foram coletadas e secas por congelamento.

A amostra dissolvida foi carregada em uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada com 20 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,0, contendo 0,15 M NaCI. A proteína eluída da coluna com o volume de retenção de 11,2 mL foi julgada como sendo pura por SDS- eletroforese de gel de poliacrilamida. A massa molecular da proteína purifi- cada foi avaliada com base no padrão da massa molecular (padrão SDS- PAGE pré-colorido, Faixa Ampla, Bio-Rad) como sendo de 60kDa. A ativida- de específica da proteína, denominada como At XYN-60, a 50°C foi determi- nada como sendo de 1.800 nkat/mg (procedimento do IU-PAC 1987, empre- gando xilana de bétula como o substrato). A atividade relativa foi aumentada em cerca de 1,2 vezes a 60°C e 1,65 vezes a 70°C (10 minutos, pH 5,0) quando comparada a 50°C. As atividade específicas contra MUG2 (4- metilumbeliferil-β-D-celobiosídeo), MUL (4-metilumbeliferil-β-D-lactosídeo) e MUG3 (4-metil-umbeliferil-β-D-celotriosídeo) foram de 54, 33 e 78 nkat/mg (50°C, pH 5,0 10 minutos), respectivamente. Isso está de acordo com o fato de que a família de 10-xilanases também mostra atividade contra os aril gli- copiranosídeos (Biely e outros, 1997).

Exemplo 10. Purificação de uma xilanase a partir de Thermoascus au- rantiacus ALK04242

Thermoascus aurantiacus ALK04242 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. A xilanase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófoba, cromatografia de troca de ânion e cátion seguido por filtração com gel. A atividade da xilanase foi determinada empregando xilana de bétula como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). A proteí- na foi ensaiada por kit de ensaio de Proteína de BioRad (Bio-Rad Laborato- ries) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de intera- ção hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada com 20 mM de tampão de fosfato de potássio pH 6,0, contendo 0,7 M (NH4)2SO4. As proteí- nas ligadas foram eluídas com um protocolo de eluição de duas etapas. A eluição foi realizada por queda da concentração de sal primeiro a 0,2 M (NH4)2SO4 e após isso, foi fornecido um gradiente linear de 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,2 M (NH4)2SO4 a 5 mM de fosfato de potás- sio, pH 6,0. A proteína foi eluída com 0,2 M (NH4)2S04 (I = 39 mS/cm).

A amostra foi dessalinizada em colunas 10DG (Bio-Rad) e apli- cada a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF equilibrada com 15 mM de Tris-HCl, pH 7,0. A proteína não se ligou à coluna de troca de ânion, porém foi eluída no fluxo atravessante. A condutividade da amostra foi ajus- tada para corresponder àquela do acetato de sódio 20 mM, pH 4,5 por adi- ção de água e o pH foi ajustado para 4,5 durante a concentração por ultrafil- tração.

A amostra foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP XL equilibrada com 20 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As proteínas de ligação foram eluídas com gradiente linear a partir do tampão de equilíbrio para o mesmo tampão contendo 1M NaCI. A enzima foi eluída na área de condutividade de 1-7 mS/cm. A amostra foi Iiofilisada e após isso dissolvida em água.

A amostra Iiofilisada foi dissolvida ém água e aplicada a uma co- luna de filtração de gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada com 20 mM de fosfato e sódio pH 7,0, contendo 0,15 M de NaCI. A proteína foi eluída da coluna com um volume de retenção correspondendo a um peso molecular de 26 kDa. A proteína foi julgada como sendo pura por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida. A massa molecular da proteína pura era de 30 kDa con- forme avaliada com base no padrão de massa molecular (padrão SDS- PAGE pré-colorido, Faixa Ampla, Bio-Rad). O pl da proteína purificada, de- nominada como Ta XYN-30 foi determinado com PhastSystem (Pharmacia) como sendo de cerca de 6,8. A atividade específica de TA XYN-30 a 50°C foi determinada como sendo de 4.800 nkat/mg (procedimento do IUPAC 1987, usando xilana de bétula como substrato).

Exemplo 11. Seqüenciamento interno do aminoácido

Os peptídeos internos foram seqüenciados por ionização de ele- troaspersão combinada à espectrometria de massa em série (ESI-MS/MS) empregando instrumento Q-TOF1 (Micromass). A proteína foi primeiro alqui- lada e digerida em peptídeos trípticos. Os peptídeos gerados foram dessali- nizados e parcialmente separados por nanocromatografia de líquidos (fase reversa) antes da aplicação ao instrumento Q-TOF1. As seqüências de pep- tídeo internas para celobioidrolases de Chaetomium thermophilum e Acre- monium thermophilum são mostradas na Tabela 2. Os peptídeos da Chae- tomium CBH foram obtidos após o gene cbh correspondente ser clonado. Os peptídeos determinados de Acromonium CBH não foram utilizados na clona- gem do gene correspondente.

Tabela 2. Seqüências de peptídeo interno determinadas a partir de Chaeto- mium thermophilum ALK04265 CBH (1-C-4-C) e Acremonium thermophilum ALKO4245 CBH (1-A-4-A)

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I/L = leucina e isoleucina possuem a mesma massa molecular e não podem ser distinguidas na análise de ESI-MS/MS.

Q/K = a massa molecular de glutamina e lisina difere apenas em 0,036 ka e não pode ser distinguida na análise de ESI-MS/MS.

As seqüências de peptídeo interno da endoglucanase purificada, β-glicosidases e xilanases de Acremonium thermophilum ALK04245, Chae- tomium thermophilum ALKO4261 e Thermoascus aurantiacus ALK04242 são listadas nas Tabelas 2, 4 e 5.

Tabela 3: Seqüências de peptídeo interno determinadas a partir das endogli- canases de EG-40 de Aeremonium thermophilum ALKO4245, EG-54 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 e EG-28 de Thermoaseus aurantia- cus ALKO4242

<table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table>

(a l/L = Ieucina e isoleucina possuem a mesma massa molecular e não podem ser distinguidas na análise de ESI-MS/MS.

Q/K = a massa molecular de glutamina e Iisina difere apenas em

0,036 ka e não pode ser distinguida na análise de ESI-MS/MS. Tabela 4: Seqüências de peptídeo interno determinadas a partir das beta- glicosidases de βΘ-101 de Acremonium thermophilum ALK04245, βΘ-76 de

Chaetomium thermophilum ALK04261 e βΘ-81 de Thermoascus aurantiacus ALK04242

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(a l/L = leucina e isoleucina possuem a mesma massa molecular e não podem ser distinguidas na análise de ESI-MS/MS.

Tabela 5: Seqüências de peptídeo interno determinadas a partir das xilana- ses de XYN-60 de Âcremonium thermophilum ALKO4245 e XYN-30 de

Thermoascus aurantiacus ALKO4242

<table>table see original document page 46</column></row><table> Exemplo 12. Construção de bibliotecas genômicas para Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum

As bibliotecas genômicas de Chaetomium thermophilum AL- K04265 e Acremonium thermophilum ALK04245 foram obtidas para vetor Lambda DASH(R)II (Stratagene, USA) de acordo com as instruções do forne- cedor. Os DNAs cromossômicos, isolados pelo método de Raeder e Broda (1985), foram parcialmente digeridos com SaUÒA. Os DNAs digeridos foram fracionados por tamanhos e os fragmentos do tamanho escolhido (-5-23 kb) foram desfosforilados e ligados aos braços do vetor Iambda digerido Bami. As misturas de ligação foram embaladas usando extratos de embalamento Gigapack III Gold de acordo com as instruções do fabricante (Strategene, USA). As titulações das bibliotecas genômicas de Chaetomium thermophi- lum e Acremonium thermophilum foram de 3,6 χ 106 pfu/mL e 3,7 χ 105 pfu/mL e aquelas das bibliotecas ampliadas foram de 6,5 χ 1010 pfu/mL e 4,2 χ 108 pfu/mL, respectivamente.

O kit de vetor Lambda FIX(R) II/Xho I Parcial Fill-in (Stratagene, USA) foi usado na construção das bibliotecas genômicas de Thermoaseus aurantiacus ALK04242 e Chaetomium thermophilum ALK04261 de acordo com as instruções do fornecedor. Os DNAs cromossômicos, isolados pelo método de Raeder e Broda (1985), foram parcialmente digeridos com • Sau3A. Os DNAs digeridos foram fracionados por tamanhos e os fragmentos do tamanho escolhido (-6-23 kb) foram enchidos e ligados aos braços do vetor Lambda FIX II digerido Xhol. As misturas de ligação foram embaladas usando extratos de embalamento Gigapack III Gold de acordo com as ins- truções do fabricante (Strategene, USA). As titulações das bibliotecas genô- micas de ALK04242 e Chaetomium thermophilum ALK04261 foram de 0,2 χ 106 e 0,3 χ 106 pfu/mL e aquelas das bibliotecas ampliadas foram de 1,8 χ 109 e 3,8 χ 109 pfu/mL, respectivamente.

Exemplo 13. Clonagem dos genes de celobioidrolase (cbh/cel7) a partir de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremoni- um thermophilum

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados no isolamento e tratamentos da enzima do DNA (plasmídeos, fragmentos de DNA), nas transformações do E.coli, etc. Os métodos básicos empregados são descritos nos livros de bolso de biologia molecular padrão, por exemplo, Sambrook e outros (1989) e Sambrook and Russell (2001).

As sondas para classificação de bibliotecas genômicas que fo- ram construídas conforme descrito no Exemplo 12, foram ampliadas por PCR usando os DNAs genômicos de Thermoascus aurantiacus ALK04242, Chaetomium thermophilum ALK04265 e Acremonium thermophilum AL- K04245 como gabaritos nas reações. Vários iniciadores testados nas rea- ções de PCR foram designados de acordo com a seqüência de nucleotídeo publicada (WO 03/000941, Hong e outros, 2003b). As misturas de reação da PCR continham 40 mM de Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM de (NH4)2SO4, 0,1% Tri- ton de X-100, 1,5 mM de MgCI2, 0,2 mM de dNTPs, 5 μΜ de cada iniciador e 1 unidade de DNA polimerase Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlândia) e -0,5-1 μg de DNA genômico. As condições para as reações da PCR foram as seguintes: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguido por 30 ci- clos de 1 minuto a 95°C, tanto 1 minuto de recombinação a 62°C (± 8°C gra- diente) para gabaritos de Thermoascus ALK04242 e Chaetomium AL- K04265 ou 1 minuto de recombinação a 58°C (± 6°C gradiente) para gabari- to de Acremonium ALK04245, período de 2 minutos a 72°C e um período final de 10 minutos a 72°C.

Produtos de DNA de tamanhos esperados (calculados das se- qüências cbh publicadas) foram obtidos de todos os gabaritos genômicos usados. Os fragmentos de DNA de tamanhos esperados foram isolados das reações de PCR mais específicas e eles foram clonados para vetor pCR(R) Blunt-TOPO(R) (Invitrogen, USA). As inserções foram caracterizadas por se- qüenciamento e por realização de hibridizações Southern blot em relação aos DNAs genômicos digeridos com várias enzimas de restrição. Os frag- mentos de pCR que foram escolhidos para serem empregados como sondas para classificação das bibliotecas genômicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum são apresentados na Tabela 6. Tabela 6. Iniciadores empregados nas reações de PCR e sondas escolhidas para classificação dos genes cbhíceU a partir das bibliotecas genômicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremoriium ther- mophilum. São' mostrados o DNA de gabarito genômico e as denominações dos plasmideos contendo o fragmento de sonda.

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As seqüências de aminoácido deduzidas de todas essas sondas tinham homologia com relação às Várias seqüências CBH publicadas (pro- grama BLAST, versão 2.2.9 no NCBI, National Center for Biotechnology In- formation; Altschul e outros, 1990) da família 7 da hidrolase de glicosídeo (Henrissat, 1991; Henrissat and Bairoch, 1993).

As inserções dos plasmídeos listados na Tabela 6 foram rotula- das com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha), e as bibliotecas genômicas ampliadas (placas de 2 x 10^5 - 3 x 10^5) foram classificadas com os fragmentos de sonda rotulados. A tempera- tura de hibridização para os filtros era de 68°C e os filtros foram lavados 2 x 5 minutos em temperatura ambiente usando 2 x SCC - 0,1% SDS seguido por 2x15 minutos a 68°C usando 0,1 x SSC - 0,1% SDS com as sondas homólogas empregadas. Várias placas positivas foram obtidas de cada uma das hibridizações. Na classificação das bibliotecas gênomicas da Acremoni- um ALK04245, algumas das placas positivas estavam hibridizando forte- mente em relação à sonda em questão, porém, além disso, houve uma quantidade de placas hibridizando mais fracamente em relação às sondas. Isso sugeriu que outro(s) gene(s) da celobioidrolase pode(m) estar presen- te(s) no genoma empregando reação cruzada. Cerca de quatro a cinco pla- cas hibridizando fortemente foram purificadas a partir das classificações da biblioteca genômica de Thermoascus ALK04242 e Chaetomium ALK04265. No caso de Acremonium thermophilum ALK04245, quatro das seis placas purificadas hibridizaram fracamente pela sonda empregada. Os DNAs do fago foram isolados e caracterizados por hibridizações Southern blot. Os fragmentos de restrição escolhidos hidridizando em relação à sonda foram subclonados no vetor pBluescript II KS+ e as regiões relevantes dos clones foram seqüenciadas.

No total, quatro genes cbhlcel7 foram clonados; um de Thermo- ascus aurantiacus ALK04242, um de Chaetomium thermophilum ALK04265 e dois de Acremonium thermophilum ALK04245 (na fase anterior do traba- lho, essas tinham os códigos At-cbh-C e At-cbh-A, e foram então denomina- das como At ce/7A e At ce/7B, respectivamente). A tabela 7 resume as in- formações com relação às sondas usadas para classificação dos genes, os clones de fago dos quais os genes foram isolados, os fragmentos de restri- ção escolhidos contendo os genes de comprimento pleno com suas regiões promotora e terminadora, as denominações dos plasmídeos e os números de depósito para as cepas de E.colitransportando esses plasmídeos.

Tabela 7. Sondas empregadas para clonagem dos genes cbhlcel7, o clone de fago e os subclones escolhidos, o número dos plasmídeos e o número dos depósitos da cepa de E.coli correspondente

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As informações relevantes com relação aos genes e às seqüên- cias de proteína deduzidas (SEQ ID N°: 1-8) foram resumidos nas Tabelas 8 e 9, respectivamente.

As seqüências de peptídeo das proteínas CBH purificadas da Chaetomium thermophilum ALK04265 e da Acremonium thermophilum AL- K04245 (Tabela 2) foram encontradas das seqüências de aminoácido dedu- zidas dos clones contendo os genes Ct cel7A e At cel7A. Assim, seria con- cluído que foram clonados os genes codificando as proteínas CBH/Cel7 puri- ficadas de Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum. Tabela 8. Resiimo dos genes cbhlcel7 isolados de Thermoascus aurantiacus ALK04242, Chaetomium thermophilum ALK04265 e Acremonium thermo- philum ALKQ4245.

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(a O códon STOP foi incluído.

(b O códon STOP não foi incluído.

Tabela 9. Resumo das seqüências de aminoácido deduzidas das seqüências gênicas ebh/eei7 de Thermoaseus aurantiacus ALK04242, Chaetomium thermophilum ALK4265 e Aeremonium thermophilum ALK04245. ss, se- qüência de sinal.

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(a A previsão com relação à seqüência de sinal foi feita empregando o pro- grama SignaIP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor de NN foi obtido empregando redes neuronais e o valor HMM usando modelos Markov impedidos.

(b O domínio de ligação de celulose (CBD), os aminoácidos da região CBD de C-terminal são indicados (M1 (Met #1) incluídos na numeração) (c A seqüência de sinal prevista não foi incluída. A previsão foi feita empre- gando a ferramenta pl/MW de computador em um servidor ExPASy (Gastei- ger e outros, 2003).

(d O número de seqüências N-X-S/T.

As seqüências de aminoácido deduzidas de Cel7A de Thermo- ascus aurantiacus e Cel7A de Acremonium thermophilum Cel7A (núcleo, sem CBD) eram mais homólogas uma com relação a outra (analisadas por alinhamento global Needleman-Wunsch, Needle EMBOSS 3.0.0, com Matriz EBLOSUM62, Penalidade de intervalo 10.0 e penalidade de extensão 0,5; Needleman and Wunsch, 1970). Além disso, Cel7A úe Acremonium thermo- philum deduzida tinha uma identidade inferior em relação à Cel7A de Chae- tomium thermophilum deduzida. Cel7B de Acremonium thermophilum foi mais distinta das seqüências CBH/Cel7 da invenção.

A seqüência deduzida de Chaetomium Cel7U possuía as maio- res identidades (analisada por alinhamento Needleman-Wunsch global, Ne- edle EMBOSS, vide acima) com relação aos polipeptídeos de Chaetomium thermophilum, Scytalidium thermophilum e Thielavia australiensis CBHI des- critas no WO 03/000941. De modo semelhante, a seqüência da Thermoas- cus aurantiacus Ce 17A deduzida era altamente idêntica à CBHI publicada da Thermoascus aurantiacus (WO 03/000941, Hong e outros, 2003b). Acremo- nium thermophilum Cel7B possuía identidades significativamente inferiores às seqüências publicadas anteriormente, estando mais proximamente rela- cionada ao polipeptídeo CBHI da Oryza sativa. As maiores homologias da seqüência de Cel7A de Acremonium thermophilum foram com relação aos polinucleotídeos da CBHI da Exidia gladulosa e Acremonium thermophilum (WO 03/000941). O alinhamento indica que as seqüências clonadas de Thermoascus aurantiacus ALK04242, Chaetomium thermophilum AL- K04265 e Acremonium thermophilum ALK04245 codificam as proteínas da CBH possuindo alta homologia com relação aos polipeptídeos da família 7 da glicosídeo hidrolase, portanto, essas foram designadas como Cel7A ou Cel7B (Henrissat e outros, 1998).

A comparação das seqüências de aminoácido deduzidas dos genes cbh/cel7 a partir de Thermoascus aurantiacus ALK04242, Chaetomi- um thermophilum ALK04265 e Acremonium thermophiium ALK04245 Thie- Iavia entre si mesmas e adicionalmente às seqüências encontradas nas ba- ses de dados são mostradas na Tabela 10.

Tabela 10. Seqüências de homologia mais alta com relação à seqüências de aminoácido deduzidas dos genes cbh/cei7 a partir de Thermoascus auranti- acus ALK04242, Chaetomium thermophilum ALK04265 e Acremonium thermophilum ALK04245. O alinhamento foi realizado empregando alinha- mento global Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, penalidade de intervalo 10,0, penalidade de extensão 0,5). * Indica uma seqüência de aminoácido derivada de um dos genes da celobioidrolase clonados nesse trabalho. 'Nú- cleo'indica alinhamento sem CBD.

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Exemplo 14. Produção de proteínas recombinantes de CBH/Cel7 Tri- choderma reesei

Plasmídeos de expressão foram construídos para produção das proteínas CBH/Cel7 recombinantes a partir de Thermoascus aurantiacus (Ta Cel7A), Chaetomium thermophilum (Ct Cel7A) e Acremonium thermophi- Ium (At Cel7A, At Cel7B; na fase anterior do trabalho essas proteínas tinham os códigos temporários At CBH-C e At CBH-A, respectivamente). Os plas- mídeos de expressão construídos são listados na Tabela 11. Os genes c- bh/cel7 recombinantes, incluindo suas próprias seqüências de sinal foram exatamente fundidos no promotor de T. reesei cbhl (cel7A) pela PCR. O término da transcrição foi garantido pelo terminador de T. reesei cel7A e o gene marcador A. nidulans amdS foi empregado para seleção dos transfor- mantes conforme descrito em Paloheimo e outros. (2003). Os cassetes de expressão lineares (figura 2) foram isolados das estruturas do vetor após digestão com EcoRI e foram transformados em T. reesei A96 e A98 (ambas cepas tinham os genes codificando as quatro celulases maiores C- BHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A deletada). As transforma- ções foram realizadas como em Penttilá e outros (1987) com as modifica- ções descritas em Karhunen e outros (1993), selecionando com acetamida como uma única fonte de nitrogênio. Os transformantes foram purificados nas placas de seleção através de conidia simples antes da esporulação dos mesmos em PD.

Tabela 11. Cassetes de expressão construídos para produzir proteínas de CBH/Cel7 de Thermoascus aurantiacus ALK04242 (Ta Cel7A), Chaetomium thermophilum ALK04265 (Ct Cel7A), e Acremonium thermophilum AL- K04245 (At Ce 17 A, At Cel7B) no Trichoderma reesei. A estrutura total dos cassetes de expressão era conforme descrito na figura 2. Os genes cbh/cel7

<table>table see original document page 55</column></row><table>

(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da es- trutura de vetor por emprego de digestão de EcoRI. (b O número de nucleotídeos da região terminadora cbh1/cel7A genômica após o códon STOP. O sítio de restrição na extremidade 3' usado na excisão do fragmento gênico genômico é incluído entre parênteses.

A produção de CBH/Cel7 dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura dos cultivos do frasco de agitação (50 mL). Os transformantes se desenvolveram por 7 dias a 28°C em um meio de indução de celulose à base de Iactose complexo (Joutsjoki e outros, 1993) tamponado com 5% KH2PO4. A atividade da celobioidrolase foi ensaiada empregando substrato de 4-metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL) de acordo com van Tilbeurgh e outros, 1988. Os genótipos dos transformantes escolhi- dos foram confirmados por emprego de Southern blots onde várias digestões genômicas foram incluídas e o respectivo cassete de expressão foi usado como uma sonda. A expressão heteróloga das proteínas Ta Cel7A, Ct Cel7A, At Cel7A e At Cel7B foi analisada por SDS-PAGE com coloração Co- omassive subseqüente. A verificação de que nenhuma atividade de celobioi- drolase ou produção de proteína heteróloga em SDS-PAGE seria detectada pelos tranformantes de At Cel7B contendo cassete de expressão integrado, sugere que At Cel7B é produzida abaixo dos níveis de detecção nó Trieho- derma usando o projeto experimental descrito.

As preparações da enzima CBH/Cel7 recombinante foram ca- racterizadas em termos de pH ótimo e estabilidade térmica. O pH ótimo das proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus, Chaeto- mium thermophilum e Acremonium thermophilum foi determinado no tampão universal Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 3,0-8,0 empregando 4- metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL) como um substrato (Fig 3A). O pH óti- mo para as enzimas Ct Cel7A e At Cel7A é de 5,5, acima do que a atividade começa a cair gradualmente. O pH ótimo de Ta Cel7A bruta recombinante é de 5,0 (Figura 3A). A estabilidade térmica das enzimas Cel7 recombinantes foi determinada por medição da atividade de MUL no tampão universal Mcll- vaine no pH ótimo com tempo de reação de 1 hora. Conforme mostrado dos resultados Ta Cel7A e Ct Cel7A mantiveram mais de 60% de suas ativida- des a 70°C, considerando-se que At Cel7A mostrou ser claramente menos estável em temperaturas maiores (≥ 65°C) (figura 3B).

Os tranformantes de CBH/Cel7 foram cultivados em bioreatores de laboratório a 28°C no meio indicado acima por 3-4 dias com controle do pH 4,4 ± 0,1 (NH3/H3PO4) para obter material para os testes de aplicação. Os sobrenadantes foram recuperados por centrifugação e filtração através dos filtros Seitz-K 150 e EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha).

Exemplo 15. Produção das proteínas de fusão recombinantes Cel7A+CBD de Thermoascusaurantiacusem T.reesei

Cel7A de Thermoascus aurantiacus (AF478686, Hong e outros,

2003b; SEQ ID N°: 1) foi fundida ao Iigante e CBD da CBHI/Cel7A do Trieho- derma reesei (AR088330, Srisodsuk e outros, 1993) (= Tr CBD) seguido por produção da proteína de fusão (SEQ ID N°: 28 correspondendo ao ácido nu- cléico da SEQ ID N°: 27) na T. reesei conforme descrito em FI20055205/US 11/119,526; depositado em 29 de abril de 2005. Além disso, Cel7A de Ther- moaseus aurantiacus foi fundida ao Iigante e CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum (SEQ ID N°:7) (Ct CBD). Para essa finalidade, a seqüência de codificação do ligante e o CBD da Cel7A da Chaetomium thermophilum foram sintetizados por PCR empregando os iniciadores que se seguem:

5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTCGACCGTCCCTGGCCTTGAC-3' (seqüência a frente) e

5'-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGGAACTG -3' (seqüência reversa)

A mistura de reação da PCR continha tampão de reação 1 x DyNAzyme® EXT (Finnzymes, Finlândia), 15 mM de Mg2+, 0,2 mM de dNTPs, 2 μΜ de cada iniciador, 0,6 unidades de DNA polimerase DyNAzy- me® EXT (Finnzymes, Finlândia), e aproximadamente 75 ng/30 μL de gaba- rito DNA, contendo gene de eel7A de comprimento pleno de Chaetomium thermophilum. As condições para a reação da PCR foram como se segue: desnaturação inicial de dois minutos a 98°C, seguido por 30 ciclos de 30 se- gundos a 98°C, recombinação por 30 segundos a 68°C (gradiente de ± 4°C), extensão de 30 segundos a 72°C e uma extensão final a 72°C por 10 minu- tos. O fragmento de DNA específico na região da PCR foi obtido na faixa de temperatura de recombinação de 64°C a 68,5°C. O fragmento do CBD sinte- tizado de Chaetomium thermophilum foi ligado após o gene de cel7A de Thermoascus aurantiacus resultando em um ponto de junção de GPIGST entre os domínios. O fragmento ampliado da PCR no plasmídeo foi confir- mado por seqüenciamento (SEQ ID N°: 29). O gene cel7A de fusão constru- ído foi exatamente fundido no promotor de cbhl (cel7A) de T. reesei. A ter- minação da transcrição foi garantida por cel7A de T. reesei e o gene marca- dor de A.niduians amdS foi usado para seleção dos transformantes como descrito em Palóheimo e outros. (2003).

O cassete de expressão linear foi isolado da estrutura do vetor após digestão de Notl e foi reformado nos protoplastos de T. reesei A96. As transformações foram realizadas como em Penttilá e outros (1987) com mo- dificações descritas em Karhunen e outros (1993), selecionando com aceta- mida como uma fonte de nitrogênio única. Os transformantes foram purifica- dos nas placas de seleção através de conidia simples antes da esporulação os mesmos em PD,

A produção de Cel7+CBD de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID N°: 28 e 30) dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura dos cultivos do frasco de agitação (50 mL). Os transformantes se de- senvolveram por 7 dias em um meio de indução de celulose à base de lacto- se complexo (Joutsjoki e outros, 1993) tamponado com 5% KH2PO4 e pH 5,5. A atividade da celobioidrolase foi ensaiada empregando substrato de 4- metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL) de acordo com van Tilbeurgh e outros, 1988. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram confirmados por emprego de Southern blots onde várias digestões genômicas foram incluídas e o respectivo cassete de expressão foi usado como uma sonda. A análise SDS-PAGE mostrou que as enzimas Cel7A+CBD de Thermoascus aurantia- cus recombinante foram produzidas como proteínas de fusão estáveis em T. reesei.

O transformante escolhido produzindo a proteína de fusão Ta Cel7A+Tr CBD (SEQ ID N°: 28) foi também cultivado em bioreator de 2 litros a 28°C no meio indicado acima por 3-4 dias com controle de pH de 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtenção do material para os testes de aplicação. Os so- brenadantes foram recuperados por centrifugação e filtração através de fil- tros Seitz-K 150 e EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuzna- ch, Alemanha).

Exemplo 16. Comparação das constantes de inibição de Michaelis- Menten e de inibição de celobiose das celobioidrolases recombinantes purificadas

As constantes de inibição de Michaelis-Menten e de celobiose foram determinadas das celobioidrolases produzidas heterologamente em T. reesei (Exemplos 14 e 15). As enzimas foram purificadas conforme descrito no Exemplo 2. As concentrações de proteína das enzimas purificadas foram medidas por sua absorção em 280 nm usando um coeficiente de extinção molar teórico, que foi calculado das seqüências de aminoácidò (Gill e von Hippel, 1989).

As constantes cinéticas (valores Km e kcat) e constante de inibi- ção de celobiose (Ki) para Tr CBHI/Cel7A, Ta CBH/Cel7A, At CBH/Cel7A e ct CBH/Cel7A, foram medidas empregando CNPLac (2-cloro-4-nitrofenil-p-D- lactosídeo) como o substrato em temperatura ambiente (22°C) em 50 mM de tampão fosfato de sódio, pH 5,7. Para determinação da constante de inibição • (Ki), oito concentrações de substrato diferentes (31-4.000 μΜ) na presença de uma faixa de cinco concentrações de inibidor (0-100 μΜ ou 0-400 μΜ) que sustentavam o valor de Ki foram empregadas. Todos os experimentos foram realizados em placas de microtitulação e o volume de reação total foi de 200 μL. As taxas iniciais foram medidas, em cada caso, por monitora- mento contínuo da liberação do ânion de cloro-nitrofenolato (CNP, 2-cloro-4- nitrofenolato) através de medições a 405 nm empregando leitor de placa de microtitulação Varioscan (Thermolabsystems). Os resultados foram calcula- dos da curva padrão de CNP (de 0 a 100 μΜ). As concentrações de enzima usadas foram: Tr CBHI/Cel7A 2,46 μΜ, Ta CBH/Cel7A 1,58 μΜ, Ct C- BH/Cel7A 0,79 μΜ e At CBH/Cel7A 3 μΜ. As constantes Km e kcat foram calculadas do ajuste da equação de Michaelis-Menten empregando o pro- grama da Origin. Gráficos Lineweaver-Burk, regráficos (inclinação LWB ver- sus [Glc2; celobiose]) e gráficos Hanes foram empregados para distinguir entre inibição competitiva e do tipo mista e para determinar as constantes de inibição (Ki).

Os resultados das medições de cinética são mostrados na Tabe- la 12 e Tabela 13. Conforme pode ser visto, Ct CBH/Cel7A possui claramen- te o número de rotações maior (kcat) e CNPLac e também a constante de especificidade (kcat/Km) é maior se comparada à CBHI/Cel7A de T.reesei. A celobiose (Glc2) é um inibidor competitivo para todas as celulases medidas e a Tr CBHI/Cel7A (usada como um controle) possui a inibição mais forte (isto é, o valor Ki mais baixo) por celobiose. A At CBH/Cel7A possui constante de inibição superior a sete vezes em comparação àquela da Tr CBHI/Cel7A. Esses resultados indicam que todas as três célobioidrolases poderiam traba- lhar melhor em hidrólise de celulose devido à inibição diminuída da celobiose quando comparada a celobioidrolase I de Cel7A da Trichoderma reesei.

Tabela 12. Comparação das constantes de inibição da celobiose de quatro GH celobioidrolases da família 7, medida em 50 mM de CNPLac em tampão to de sódio, pH 5,7 a 22°C.

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Tabela 13. Comparação das constantes cinéticas de Michaelis-Menten de 20 Cel7A de celobioidrolase da Chaetomium thermophilum para CBHI/Cel7A de T. reesei medida em CNPLac em 50 mM de tampão fosfato de sódio, pH 5,7, a 22°C.

<table>table see original document page 60</column></row><table> Exemplo 17. Hidrólise de celulose cristalina (Avicel) por celobioidrola- ses recombinantes

As celobioidrolases recombinantes purificadas Ct Cel7A, Ta Cel7A, Ta Ce17A+Tr CBD, Ta Cel7A+ Ct CBD, At Cel7A bem como a versão de núcleo da Ct Cel7A (vide a seguir) foram testadas em quantidades equi- molares em hidrólise de celulose cristalina em duas temperaturas, 45°C e 70°C; Tr Cel7A de T. reesei purificada e sua versão de núcleo (vide abaixo) foram usadas como uma comparação. Os ensaios de hidrólise da celulose cristalina (Ph 101, Avicel; Fluka, Bucsh, Suíça) foram realizados em uma escala de tubo de 1,5 mL, 50 mM de acetato de sódio, pH 5,50. Avicel foi agitado a 45°C ou a 70°C com a solução da enzima (1,4 μΜ) e o volume fi- nal da mistura de reação era de 325 μL. A hidrólise foi seguida até 24 horas retirando amostras em seis pontos de tempo diferentes e parando a reação por adição de 163 μL de reagente de parada contendo 9 vol de étanol a 94% e 1 vol de 1M glicina (pH 11). A solução foi filtrada através de uma unidade de filtração Millex GV13 0,22 μm (Millipore, Billerica, MA, USA). A formação de açúcares de redução solúveis no sobrenadante foi determinada por mé- todo para-hidroxibenzóico-hidrazida ácida (PAHBAH) (Lever, 1972) empre- gando uma curva padrão de celobiose (50 a 1.600 μΜ de celobiose). Uma solução de 0,1 M PAHBAH fabricado (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, USA) em 0,5 M NaOH (100 μL) foi adicionada a 150 μL da amostra filtrada e fervi- da por 10 minutos, após o que a solução foi resfriada em gelo. A absorção das amostras a 405 nm foi medida.

As versões de núcleo das celobioidrolases abrigando um CBD em sua forma nativa foram obtidas como se segue: Ct Cel7A e Tr Cel7A fo- ram expostas à digestão proteolítica para remover o domínio de ligação de celulose. A digestão da papaína (Papaya Látex, 14 U/mg, Sigma) pelas ce- lobioidrolases nativas foi realizada a 37°C por 24 horas em uma mistura de reação composta de 10 mM de L-cisteína e 2 mM de EDTA em 50 mM de tampão acetato de sódio (pH 5,0) com adição de papaína (duas concentra- ções de papaína foram testadas: de um quinto a um décimo da quantidade de papaína da quantidade total da Cel7A na mistura de reação). A proteína de núcleo resultante foi purificada com Coluna de troca de ânion DEAE Se- pharose FF (Pharmacia, Uppsala1 Suécia) conforme descrito acima. O pro- duto foi analisado em SDS-PAGE.

Os resultados da hidrólise a 45°C e 70°C são mostrados na figu- ra 4 e figura 5, respectivamente. Os resultados mostram claramente que to- das as celobioidrolases mostram hidrólise mais rápida e completa em ambas temperaturas, quando comparadas a celobioidrolase da técnica anterior de Cel7A da T. reesei. As celobioidrolases termoestáveis de Thermoascus au- rantiacus ALK04242 e Chaetomium thermophilum ALK04265 a 70°C são superiores quando comparadas à Cel7A de T. reesei, também no caso onde o núcleo de Cel7A da Thermoascus é ligado ao CBD da Cel7A da T. reesei (Ta Cel7A + Tr CBD). Foi surpreendente o fato de que as celobioidrolases isoladas e clonadas nesse trabalho serem superiores, quando abrigando um CBD, na taxa e formação de produto na hidrólise de celulose cristalina tam- bém na temperatura de hidrólise convencional de 45°C, quando comparada a celobioidrolases da técnica anterior de Cel7A da T.reesei (CBHI) na mes- ma concentração de enzima. Os resultados também estão de acordo com aquelas preparações de enzima (At Cel7A e ct Cel7A), que foram purificadas dos hospedeiros originais e testadas na hidrólise de Avicel (50°C, 24 horas) (Exemplo 2, Tabela 1).

Exemplo 18. Clonagem dos genes de endoglicanase da Acremonium thermophilum ALK04245, Chaetomium thermophilum ALK04261, e Thermoascus aurantiacus ALK04242

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados con- forme descrito no Exemplo 13. A construção das bibliotecas genômicas de Aeremonium, Chaetomium, e Thermoaseus foi descrita no Exemplo 12.

Os peptídeos derivados das endoglucanases purificadas de A- eremonium e Chaetomium compartilharam homologia com várias endoglica- nases da glicosil hidrolase família 45, tal como endoglicanase de Cel45A de Melanocarpus aibomyees (AJ515703) e endoglicanase de Humieola insolens (A35275), respectivamente. Os peptídeos derivados da endoglicanase de Thermoaseus compartilharam quase 100% de identidade com a seqüência de endoglicanase publicada de EG1 de Thermoascus aurantiacus (AF487830). De modo a ampliar a sonda para classificação das bibliotecas genômicas de Acremonium e Chaetomium, iniciadores de degeneração fo- ram designados com base nas seqüências de peptídeo. A ordem dos peptí- deos na seqüência da proteína e a natureza de sentido ou anti-sentido cor- respondente dos iniciadores foi deduzida da comparação com endoglicana- ses homólogas publicadas. As seqüências de iniciador e os peptídeos cor- respondentes são listados na Tabela 14. Devido à identidade de quase 100% dos peptídeos de Thermoascus com a seqüência publicada, o gene da endoglicanase foi ampliado por PCR diretamente do DNA genômico. Tabela 14. Oligonucleotídeos sintetizados e usados como iniciadores da PCR para ampliar a sonda para classificação do gene de cel45A (EG-40) de Acremonium thermophilum e ce17B (EG-54) de Chaetomium thermophilum a partir das bibliotecas genômicas correspondentes

<table>table see original document page 63</column></row><table>

(a Aminoácidos do peptídeo usado para designação da seqüência do inicia- dor

(bN = A,C,G, ou T; R = A ou G; Y = C ou T

(c Peptídeo não derivado da proteína EG-40 de Acremonium, porém se origi- na da seqüência de Ce145A de M. albomyces (AJ515703) homóloga à EG- 40.

(d Um sítio de restrição HindIII foi adicionado à extremidade 5' do oligonucle- otídeo

(e Um sítio de restrição EcoRI foi adicionado à extremidade 5' do oligonucleo- tídeo.

A sonda específica do gene de ce145A de Acremonium thermo- philum para classificação da biblioteca genômica foi ampliada com os inicia- dores à frente (TAYTGGGAYTGYTGYAARCC) e reversos (RTTRTCNG- CRTTYTGRAACCA) usando DNA genômico como um gabarito. As misturas de reação da PCR continham 50 mM de Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM (NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCI2, 0,1 mM de dNTPs, 0,5 μg de cada iní- ciador, 1 unidade de DNA polimerase Dynazyme (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 0,5 μg de DNA genômico de Acremonium. As condições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação ini- cial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 minuto de recombi- nação a 50-60°C, 2 minutos de extensão a 72°C e uma extensão final a 72°C por 10 minutos. Para ampliação do gene de cel7B de Chaetomium thermophilum (codificação para Ct EG-54) sonda específica, um iniciador à frente (GGAATTCGAYCARACNGARCARTA) e um iniciador reverso (GCA- AGCTTCGRCARAARTCRTCRTT) foram usados. As misturas de reação da PCR continham 10 mM de Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM de KCI, 0,1% de Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 250 pmol de cada iniciador, 2 unidades de DNA polimerase Dynazyme II (Finnzymes, Finlândia) e aproxi- madamente 2 μg de DNA genômico de Chaetomium. As condições para re- ação da PCR eram conforme descrito acima, exceto que a recombinação foi realizada a 45-50°C.

Dois produtos da PCR foram obtidos da reação da PRC de Acremonium. Fragmentos de DNA de cerca de 0,6 kb e 0,8 kb foram isola- dos do gel agarose e foram clonados no vetor pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA) resultando nos plasmídeos pALK1710 e pALK1711, respectivamente. Os produtos de DNA foram caracterizados por seqüenciamento e realização de hibridizações Southern blot para o DNA genômico de Acremonium digeri- do com várias enzimas de restrição. O padrão de hibridização obtido com os dois fragmentos em condições de lavagem estringente sugerem que dois genes de endoglicanase putativa seriam classificados da biblioteca genómi- ca de Acremonium. As seqüências de aminoácido deduzidas de ambos pro- dutos da PCR tinham homologia com relação às várias seqüências de endo- glicanase publicadas da glicosil hidrolase família 45 (programa BLAST, Nati- onal Center for Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990). Um produto da PCR de tamanho esperado (estimado da se- qüência de endoglicanase homóloga Humicola insolens, A35275) foi obtida da reação da PCR de Chaetomium. Esse fragmento de DNA de cerca de 0,7 kb foi clonado no vetor pCR4-TOPO(R) TA (Invitrogen, USA) resultando no plasmídeo pALK2005 e analisado conforme descrito acima. A seqüência de aminoácido deduzida do produto da PCR tinha homologia com relação a to- das seqüências de celulase publicadas da glicosil hidrolase família 7 (pro- grama BLAST, versão 2.2.9 na NCBI, National Center for Biotechnology In- formation; Altschul e outros, 1990).

A inserção dos plasmídeos pALK1710, pALK1711 e pALK2005 foi isolada pela digestão da enzima de restrição e rotulada com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). Cerca de 1-2 χ 105 placas da biblioteca genômica ampliada de Acremonium ou Chaetomi- um foram classificadas. A temperatura para hibridização era dè 68°C e os filtros foram lavados 2x5 minutos em temperatura ambiente usando 2 χ SSC - 0,1% SDS seguido por 2x15 minutos a 68°C usando 0,1 SSC - 0,1% SDS. Várias placas positivas foram obtidas, das quais cinco a seis placas hibridizando fortemente foram purificadas de cada classificação. DNAs do fago foram isolados e analisados por hibridização Southern blot. Fragmentos de restrição hibridizando com relação à sonda foram subclonados no vetor • pBluescript Il KS+ (Stratagene, USA) e as partes revelantes foram seqüenci- adas. Em todos os casos, o fragmento de fago subclonado contém o gene de comprimento pleno de interesse. A tabela 15 resume as informações das sondas usadas para classificação dos genes de endoglicanase, clones de fago a partir dos quais os genes foram isolados, fragmentos de restrição es- colhidos contendo os genes de comprimento pleno com suas regiões promo- tora e terminadora, nomes dos plasmídeos contendo o fragmento de fago subclonado e os números de depósito na Deutsche Sammlung von Mikroor- ganismen und Zellkulturen GmbH Culture Collection (DSM) para as cepas de E.colitransportando esses plasmídeos. Tabela 15. Sondas usadas para clonagem do gene da endoglicanase, clones de fago e subclone escolhidos, nome do plasmídeo e número de depósito correspondente da cepa E.coli.

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O gene cel5A de Thermoascus aurantiacus (codificando para EG-28) (SEQ ID Nº:9) foi ampliado diretamente do DNA genômico isolado por reação da PCR. Os iniciadores à frente (ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTCGGCTCTCTCGTGCTC) e reverso (AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCATATT) que foram usados para ampliação foram designados com base no gene eg1 de T. aurantiacus publicado (AF487830). As misturas da PCR continham tampão 1 χ Phusion HF, 0,3 mM dNTPs, 0,5 μΜ de cada iniciador, duas unidades de DNA poli- merase Phusion® DNA (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 0,25 μg de DNA genômico de Thermoascus. As condições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguido por 25 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos de recombinação a 57-67°C, 2 minutos e meio de extensão a 72°C e uma extensão final a 72°C por 5 mi- nutos. O produto ampliado de 1,3 kb contendo o gene exato (do códon START para STOP) foi clonado como um fragmento SacII-Pstl no vetor p- Bluescript Il KS+. Dois clones independentes foram seqüenciados e um clo- ne foi selecionado e designado como pALK1926. O número de depósito da cepa E.coli contendo pALK1926 na Deutsche Sammlung von Mikroorganis- men und Zellkulturen GmbH Culture Collection é DSM 17326.

Informações relevantes dos genes e seqüências de proteína de- duzidas (SEQ ID N°:9-16) são resumidas nas Tabelas 16 e 17, respectiva- mente. As seqüências de peptídeo das endoglicanases purificadas de EG-40 de Acremonium (gene At cel45A), EG-54 de Chaetomium (gene Ct ce/7B) e EG-28 de Thermoascus (gene Ta ce/5A) foram encontradas nas seqüências de ãminoácido deduzidas correspondentes dos genes clonados confirmando que os genes apropriados foram clonados.

Tabela 16. Resumo dos genes de endoglicanase isolados de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum e Thermoaseus aurantiacus. <table>table see original document page 67</column></row><table>

(a O códon STOP está incluído

(b O códon STOP não está incluído

Tabela 17. Resumo das seqüências de endoglicanase deduzidas de Acre- monium thermophilum, Chaetomium thermophilum e Thermoaseus aurantia- eus. ss, seqüência de sinal.

<table>table see original document page 67</column></row><table> (a A previsão da seqüência de sinal foi realizada usando o programa SignaIP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor NN foi obtido usando redes neuronais e valor HMM usando modelos Markov impedidos. (b São indicadas as presenças de um domínio de ligação de celulose na pro- teína, os aminoácidos de CBD C-terminal são indicados (numeração de a- cordo com o polipeptídeo de comprimento pleno)

(c A seqüência de sinal prevista não está incluída. A previsão foi feita usando a ferramenta Compute pl/MW no servidor ExPASy (Gasteiger e outros, 2003).

(d Os sítios de N-glicosilação putativa N-X-S/T foram previstos usando o pro- grama NetNGIyc 1.0 (Gupta e outros, 2004).

(e De acordo com Hong e outros, 2003a

As seqüências de proteína deduzidas das endoglicanases de EG-40 (At Cel45A) de Acremonium e semelhante a EG-40 (At Cel45B), EG- 54 (Ct Cel7B) Chaetomium e EG-28 (Ta Cel5A) Thermoascus compartilham homologia com as celulases da glicosil hidrolase família 45 (.Acremonium), família 7 (Chaetomium), e família 5 {Thermoascus), assim identificando os genes isolados como elementos dessas famílias de genes. As homologias mais próximas das endoglicanases EG-40/Cel45A de Acremonium e seme- lhante a EG-40/Cel45B são as endoglicanases de Thieiavia terrestris (CQ827970, 77,3% de identidade) e Myeeiiophthora thermophila (AR094305, 66,9% de identidade), respectivamente (Tabela 18). As duas endoglicanases isoladas de Aeremonium família 45 compartilham apenas uma identidade de 53,7% uma com a outra. Dessas enzimas, apenas a EG-40/Cel45A contém um domínio de ligação de celulose (CBD).

A homologia mais próxima para a seqüência da proteína previs- ta da endoglicanase de EG-54/Cel7B de Chaetomium endoglicanase é en- contrada na seqüência de celulase da Cel7A de Melanocarpus albomyees (AJ515704). A identidade entre essas duas seqüências de proteína é de 70,6%.

A seqüência de proteína da endoglicanase isolada de Thermo- ascus aurantiaeus é completamente idêntica àquela EGI de T.aurantiaeus publicada (AF487830, Tabela 18). A homologia mais próxima foi encontrada em uma seqüência de β-glicanase de Talaromyces emersonii (AX254752, 71,1% de identidade).

Tabela 18. Comparação das endoglicanases deduzidas de EG-40 de Acre- monium thermophilum, semelhante a EG-40/Cel45B, EG-54/Cel7B de Chae- tomium thermophilum e EG-28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus com su- as contrapartes homólogas. O alinhamento foi realizado usando o programa Needle do pacote de programas da EMBOSS. *lndica uma endoglicanase codificada por um gene clonado nesse trabalho.

<table>table see original document page 69</column></row><table> <table>table see original document page 70</column></row><table>

Exemplo 19. Produção de endoglicanase recombinante em Trichoder- ma reesei

Os plasmídeos de expressão foram construídos para produção de proteínas recombinantes de EG-40/Cel45A de Acremonium, semelhante a EG-40/Cel45B, e EG-28/Cel5A de Thermoascus conforme descrito no Exemplo 14. Cassetes de expressão linear (tabela 19) foram isolados da estrutura do vetor por digestão da enzima de restrição, transformada em T.reesei A96 e tranformantes purificados conforme descrito no Exemplo 14. Tabela 19. Cassetes de expressão construídos para produção de endoglica- nases de EG-40/Cel45A de Acremonium thermophilum, semelhante a EG- 40/Cel45B e EG-28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus no Trichoderma reesei.

A estrutura esquematica dos cassetes de expressao e descrita na figura 2.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da estrutura de vetor por digestão com EcoRI ou NotI.

(b É indicado o número de nucleotídeos após o códon STOP do gene clona- do que são incluídos no cassete de expressão. O sítio de restrição na região

3' do gene que foi usado na construção do cassete de expressão é indicado entre parênteses. A produção da endoglicanase dos transformantes foi analisada dos sobrenadantes de cultura dos cultivos de frascos de agitação (50 mL). Os transformantes cresceram como no Exemplo 14 e a atividade da enzima da proteína recombinante foi medida a partir do sobrenadante de cultura como a liberação dos açúcares de redução a partir da carboximetilcelulose (2% (peso/volume) CMC) a 50°C em 50 mM de tampão citrato, pH 4,8 es- sencialmente conforme descrito por Bailey and Nevalainen 1981; Haakana e outros, 2004. A produção das proteínas recombinantes foi também detecta- da a partir dos sobrenadantes de cultura por SDS-eletroforese de gel polia- crilamida. Os anticorpos policlonais específicos para Acremonium EG-40 foram produzidos em coelhos (University of Helsinki1 Finlândia). A expressão de EG-40 foi verificada por análise Western blot com anticorpos anti-EG-40 usando o ProtoBIot Western blot AP (Promega). Os genótipos dos transfor- mantes escolhidos foram analisados por Southern blotting empregando o cassete de expressão como uma sonda.

O pH ótimo das endoglicanases produzidas heterologamente foi determinado no tampão universal de Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 4,0-8,0 usando carboximetilcelulose como substrato. Conforme mostrado na figura 6A, a faixa mais ampla de pH (4,5-6,0) é aquela da proteína EG- 40/Cel45A de Acremonium, o pH ótimo sendo de 5,5. Os pHs ótimos para as • outras endoglicanases produzidas heterologamente são de 5,0-5,5 e 6,0 pa- ra semelhante a EG-40/Cel45B de Acremonium e EG-28/Cel5A de Thermo- ascus, respectivamente. A temperatura ótima para atividade enzimática des- sas endoglicanases foi determinada na faixa de temperatura de 50-85°C conforme descrito acima. A atividade mais alta das enzimas foi determinada como sendo a 75°C, 60/C e 75°C para EG-40/Cel45A de Acremonium, se- melhante a EG-40/Cel45B e EG-28/Cel5A de Thermoascus, respectivamen- te (Figura 6 B).

Os transformantes escolhidos foram cultivados, conforme descri- to no Exemplo 14, em um bioreator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação. Exemplo 20. Clonagem dos genes de beta-glicosidase de Acremonium thermophilum ALK04245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 e Thermoascus aurantiacus ALK04242

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados con- forme descrito no Exemplo 13. A construção das bibliotecas genômicas de Acremonium, Chaetomium e Thermoascus foi descrita no Exemplo 12.

Os peptídeos derivados das β-glicosidases purificadas de Acre- monium, Chaetomium e Thermoascus compartilharam homologia com várias β-glicosidases da glicosil hidrolase família 3, tais como β-glicosidases de A- eremonium ceilülolytieus (BD168028), Trichoderma viride (AY368687) e Ta- laromyces emersonii (AY072918) respectivamente. De modo a ampliar a sonda para classificação das bibliotecas genômicas de Acremonium, Chae- tomium ou Thermoascus iniciadores de degeneração foram designados com base nas seqüências de peptídeo. A ordem dos peptídeos na seqüência da proteína e a natureza de sentido ou anti-sentido correspondente dos inicia- dores foi deduzida da comparação com β-glucosidases. As seqüências de iniciador e os peptídeos correspondentes são listados na Tabela 20.

Tabela 20. Oligonucleotídeos sintetizados e usados como iniciadores da PCR para ampliar uma sonda para classificação do gene de cel3A (PG-101) de Acremonium thermophilum, cel3A (ββ-76) de Chaetomium thermophilum e cel3A (βG-81) de Thermoascus aurantiacus a partir das bibliotecas genô-

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(a Aminoácidos do peptídeo usados para designação da seqüência do inicia- dor (b Para reduzir a degeneração, alguns códons foram escolhidos de acordo com a preferência dos fungos. N = A, C, G, ou T; R = A ou G; Y = C ou T (c Peptídeo não derivado da proteína purificada PG-101 de Acremonium, po- rém se origina da seqüência de β-glicosidase A. cellulolyticus (BD168028) homóloga à βG-101.

As sondas para classificação das bibliotecas genômicas constru- ídas foram ampliados com as combinações de iniciador listadas (Tabela 20) usando DNA genômico de Acremonium, Chaetomium ou Thermoascus como o gabarito. As misturas de reação da PCR continham 50 mM de Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM (NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCI2, 0,1 mM de dNTPs, 0,25 μg de cada iniciador, 1 unidade de DNA polimerase Dynazyme (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 0,5 μg de DNA genômico. As condições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desna- turação inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 minuto de recombinação a 40°C (DNA de Acremonium como um gabarito), a 50°C (DNA de Chaetomium como um gabarito) ou 63°C (DNA de Thermoascus como um gabarito), 2-3 minutos de extensão a 72°C por 5-10 minutos.

Produtos da PCR específicos de tamanho esperado (estimado das seqüências de β-glicosidase homólogas BD168028, AY072918 e AY368687) foram isolados do gel de agarose. Fragmentos de DNA de cerca de 1,8 kb (Acremonium), 1,5 kb (Chaetomium) e 1,52 kg (Thermoascus) fo- ram clonados

no vetor pCR4-TOPO(R) TA (Invitrogen, USA) resultando nos plasmídeos pALK1924, pALK1935 e pALK1713, respectivamente. Os produ- tos de DNA foram caracterizados por seqüenciamento e realização de hibri- dizações Southern blot em relação ao DNA genômico digerido com várias enzimas de restrição. O padrão de hibridização nas condições de lavagem estringentes sugerem que um gene de β-glicosidase putativo seria isolado da biblioteca genômica de Acremonium, Chaetomium è Thermoascus. As seqüências de aminoácido deduzidas de todos os três produtos da PCR pos- suem homologia com relação às várias seqüências de β-glicosidase publica- das da glocosil hidrolase família 3 (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990).

A inserção dos plasmídeos pALK1713, pALK1924 e pALK1935 foi isolada pela digestão da enzima de restrição e rotulada com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). Cerca de 1-2 χ 105 placas da biblioteca genômica ampliada de Acremonium, Chaetomium ou Thermoascus foram classificadas, conforme descrito no Exemplo 18. Vá- rias placas positivas foram obtidas, das quais cinco a seis placas fortemente hibridizantes foram purificadas de cada classificação. Os DNAs de fago fo- ram isolados e analisados por hibridização Southern blot. Os fragmentos de restrição hibridizando com relação à sonda foram subclonados no vetor p- Bluescript Il KS+ (Stratagene, USA) e as partes revelantes foram sequencia- das. Em todos os casos, o fragmento de fago subclonado contém o gene de comprimento pleno de interesse. A tabela 21 resume as informações das sondas usadas para classificação dos genes de β-glicosidase, clones de fa- go dos quais os genes foram isolados, fragmentos de restrição escolhidos contendo os genes de comprimento pleno com suas regiões promotora e terminadora, nomes dos plasmídeos contendo o fragmento de fago subclo- nado e os números de depósito na Deutsche Sammlung von Mikroòrganis- men und Zellkulturen GmbH Culture Collection (DSM) para as cepas de E.colitransportando esses plasmídeos.

Tabela 21. Sondas usadas para clonagem do gene da β-glieosidase, clones de fago e subclone escolhidos, nome do plasmídeo e número de depósito correspondente da cepa E.coli.

<table>table see original document page 74</column></row><table> Informações relevantes dos genes e seqüências de proteína de- duzidas (SEQ ID N°:21-26) são resumidas nas Tabelas 22 e 23, respectiva- mente. As seqüências de peptídeo das proteínas purificadas de βG-10 (At cel3A) de Acremonium, βG-76 (Ct cel3A) de Chaetomium e βG-81 (Ta cel5A) de Thermoascus foram encontradas nas seqüências de aminoácido deduzidas correspondentes dos genes clonados confirmando que os genes apropriados foram clonados.

Tabela 22. Resumo dos genes de β-glicosidase isolados de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum e Thermoascus aurantiacus.

<table>table see original document page 75</column></row><table>

(a O códon STOP está incluído

(b O códon STOP não está incluído

Tabela 23. Resumo das seqüências de β-glicosidase deduzidas de Acremo- nium thermophilum, Chaetomium thermophilum e Thermoascus aurantiacus. ss, seqüência de sinal

<table>table see original document page 75</column></row><table>

(a A previsão da seqüência de sinal foi realizada usando o programa SignalP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor NN foi obtido usando redes neuronais e valor HMM usando modelos Markov impedidos. (b Presença de um domínio de ligação de celulose na proteína. (c A seqüência de sinal prevista não está incluída. A previsão foi feita usando a ferramenta Compute pl/MW no servidor ExPASy (Gasteiger e outros, 2003).

(d Os sítios de N-glicosilação putativa N-X-S/T foram previstos usando o pro- grama NetNGIyc 1.0 (Gupta e outros, 2004).

As seqüências de proteína deduzidas das β-glicosidases de PG- 101/Cel3A de Acremonium, pG-76/Cel3A de Chaetomium e pG-81/Cel3A de Thermoascus compartilham homologia com as enzimas da glicosil hidrolase família 3, assim identificando os genes isolados como elementos dessas fa- mílias de genes. As contrapartes mais próximas das β-glicosidases de A- cremonium, Chàetomium e Thermoascus são aquelas de Magnaporthe gri- sea (β-glicosidase, AY849670), Neurospora crassa (hipotética, XM-324308) e Talaromyces emersonii (β-glicosidase, AY072918), respectivamente (Ta- bela 24). A identidade de seqüência mais alta (73,2%) encontrada foi aquela de β6-76/ΟβΙ3Α de C. thermophilum para proteína hipotética N. crassa indi- cando que novos genes de enzimas foram clonados.

Tabela 24. Comparação das β-glicosidases deduzidas de ββ-101/ΟβΙ3Α de Acremonium thermophilum, ββ-76/ΟβΙ3Α de Chàetomium thermophilum e β6-81/ΌβΙ3Α de Thermoascus aurantiacus com suas contrapartes homólo- gas. O alinhamento foi realizado usando o programa Needle do pacote de programas EMBOSS. * Indica uma β-glicosidase codificada por um gene clonado nesse trabalho.

<table>table see original document page 76</column></row><table> <table>table see original document page 77</column></row><table>

Exemplo 21. Produção de beta-glicosidases recombinantes em Tricho- derma reesei

Plasmídeos de expressão foram construídos para produção das proteínas recombinantes de βG-101/Cel3A de Acremonium, βG-76/Cel3Α de Chaetomium e βG-81/Cel3A de Thermoascus conforme descrito no Exemplo 14. Cassetes de expressão linear (Tabela 25) foram isolados da estrutura do vetor por digestão da enzima de restrição, transformados em T. reesei A96 ou A33 (ambas cepas possuindo genes codificando as quatro maiores celu- lases CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A deletadas) e os transformantes purificados conforme descrito no Exemplo 14. Tabela 25. Cassetes de expressão construídos para produção de β- glicosidases de βG-101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG-76/ΟβΙ3Α de Chaetomium thermophilum e pG-81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus em Trichoderma reesei. A estrutura esquemática dos cassetes de expressão

<table>table see original document page 78</column></row><table>

(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da estrutura de vetor por digestão com EcoRI ou NotI.

(b É indicado o número de nucleotídeos após o códon STOP do gene clona- do que são incluídos no cassete de expressão. O sítio de restrição na região 3' do gene que foi usado na construção do cassete de expressão é indicado entre parênteses.

A produção da beta-glicosidase dos transformantes foi analisada dos sobrenadantes de cultura dos cultivos de frascos de agitação (50 mL). Os transformantes cresceram como no Exemplo 14 e a atividade da enzima da proteína recombinante usando substrato de 4-nitrofenil-β-D- glicopiranosídeo conforme descrito em Bailey e Nevalainen 1981. A produ- ção das proteínas recombinantes foi também detectada a partir dos sobre- nadantes de cultura por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida. Além disso, a expressão de βG-81 de Thermoascus foi verificada por análise Western blot com anticorpos anti-βG-81 conforme descrito no Exemplo 19. Os genóti- pos dos transformantes escolhidos foram analisados por Southern blotting empregando o cassete de expressão como uma sonda.

O pH ótimo das β-glicosidases produzidas heterologamente foi determinado no tampão universal de Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 3,0-8,0 usando 4-nitrofenil-β-glicopiranosídeo como substrato. Os pHs ó- timos para βG-101 de Aeremonium, βG-76 de Chaetomium e βG-81 para Thermoaseus são 4,4, 5,5 e 4,5 respectivamente 9figura 7A). A temperatura ótima para atividade enzimática dessas β-glicosidases foi determinada na faixa de temperatura de 50-85°C conforme descrito acima. A atividade mais alta das enzimas foi determinada como sendo a 70°C, 65°C e 75°C para βΘ- 101/Ce 145A dé Acremonium, pG-76/Cel3A de Chaetomium e pG-81/Cel3A de Thermoascus, respectivamente (Figura 7B).

Os transformantes escolhidos foram cultivados, conforme descri- to no Exemplo 14, em um bioreator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação.

Exemplo 22. Clonagem dos genes de xilanase de Acremonium thermo- philum ALK04245 e Thermoascus aurantiacus ALK04242

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados con- forme descrito no Exemplo 13. A construção das bibliotecas genômicas de Acremonium foi descrita no Exemplo 12.

Os peptídeos derivados da xilanase de Acremonium comparti- lharam homologia com várias xilanases da glicosil hidrolase família 10, tais como Humicola grisea XYNI (AB001030). Todos os peptídeos derivados da xilanase de Thermoascus eram completamente idênticos à seqüência de Thermoascus aurantiacus XYNA publicada (AJ132635) assim identificando a proteína purificada como a mesma enzima. Em razão disso, o gene da xila- nase de Thermoascus foi ampliado por PCR a partir do DNA genômico.

De modo a ampliar a sonda para classificação do gene da xila- nase de Acremonium a partir das bibliotecas genômicas, iniciadores de de- generação foram designados com base nas seqüências de peptídeo (Exem- plo 11, Tabela 5). A ordem dos peptídeos na seqüência da proteína e a natu- reza de sentido ou anti-sentido correspondente dos iniciadores foi deduzida da comparação com seqüência de Humicola insoiens XYNI (AB001030). A seqüência do iniciador de sentido (GAYGGYGAYGCSACYTAYATG) se ba- seia no Peptídeo 3 (aminoácidos 2-8) e iniciador de anti-sentido (YTTYT- GRTCRTAYTCSAGRTTRTA) no Peptídeo 1 (aminoácidos 4-11).

Um produto da PCR de tamanho esperado (estimado da se- qüência de homóloga de Humicola insoiens XYNI, AB001030) foi obtida da reação. Esse fragmento de DNA de cerca de 0,7 kb foi clonado no vetor p- CR4-TOPO(R) TA (Invitrogen, USA) resultando no plasmídeo pALK1714 e foi caracterizado por seqüenciamento. A seqüência de aminoácido deduzida do produto da PCR tinha homologia com relação a todas seqüências de xilana- se publicadas da glicosil hidrolase família 10 (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990).

A inserção do plasmídeo pALK1714 foi isolada pela digestão da enzima de restrição e rotulada com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). Cerca de 1-2 χ 10"5 placas da biblioteca ge- nômica ampliada de Acremonium foram classificadas conforme descrito no Exemplo 18. Várias placas positiva foram obtidas, das quais cinco placas hi- bridizando fortemente foram purificadas. DNAs do fago foram isolados e ana- lisados por hidridização Southern blot. Um fragmento de restrição 3,0 kb Xbal hibridizando com relação à sonda foi subclonado no vetor pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) resultando no plasmídeo pALK1725. As partes relevantes de pALK1725 foram seqüenciadas e encontradas como contendo o gene de comprimento pleno xy10A do Acremonium thermophilum (SEQ ID N°:19). O número do depósito da cepa E.colicontendo pALK1725 na

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Culture CoIIection (DSM) foi o DSM 16726.

O gene xyn10A de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID N°: 17) foi ampliado diretamente do DNA genômico isolado por reação da PCR. Os inici- adores à frente (TTATACCGCGGGAAGCCATGGTTCGACCAACGATCC- TAC) e reverso (TTATAGGATCCACCGGTCTATACTCACTGCTG- CAGGTCCTG) que foram usados na ampliação do gene foram designados com base no gene xynA de T. aurantiacus publicado (AJ132635). As misturas da reação da PCR continham tampão 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 15 mM (NH4)2SO4, Triton 0,1% X-100, 1,5 mM MgCI2, 0,3 mM dNTPs, 1 μΜ cada iniciador, 1 unidade de DNA polimerase PhusionTM DNA (Finnzymes, Finlân- dia) e aproximadamente 0,5 μg de DNA genômico de Thermoascus. As con- dições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desnatura- ção inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 minuto de re- combinação a 60-66°C, 3 minutos de extensão a 72°C e uma extensão final a 72°C por 10 minutos. O produto ampliado de 1,9 kb contendo o gene exato (do códon START para STOP) foi clonado como um fragmento Sad\-BamH\ no vetor pBluescript Il KS+. Três clones independentes foram seqüenciados e um clone foi selecionado e designado como pALK1715. O número de depósi- to da cepa E.coli contendo pALK1715 na Deutsche Sammlung von Mikroor- ganismen und Zellkulturen GmbH Culture Collection é DSM 16724.

Informações relevantes dos genes e seqüências de proteína dedu- zidas (SEQ ID N9:17-20) são resumidas nas Tabelas 26 e Tabela 27, respecti- vamente. As seqüências de peptídeo das proteínas XYN-60 de Acremonium e XYN-30 de Thermoascus foram encontradas nas seqüências de aminoácido deduzidas correspondentes dos genes clonados (At xyrrtOA e Ta xyrrtOA, res- pectivamente) confirmando que os genes apropriados foram clonados.

Tabela 26. Resumo dos genes de xilanase isolados de Acremonium thermo- philum e Thermoascus aurantiacus.

<table>table see original document page 81</column></row><table>

(a O códon STOP está incluído

(b O códon STOP não está incluído

Tabela 27. Resumo das seqüências de xilanase deduzidas de Aeremonium

<table>table see original document page 81</column></row><table> (a A previsão da seqüência de sinal foi realizada usando o programa SignaIP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor NN foi obtido usando redes neuronais e valor HMM usando modelos Markov impedidos. (b É indicada a presença de um domínio de ligação de carboidrato CBD e dos aminoácidos de CBD C-terminal (numeração de acordo com o polipeptí- deo de comprimento pleno)

(c A seqüência de sinal prevista não está incluída. A previsão foi feita usando a ferramenta Compute pl/MW no servidor ExPASy (Gasteiger e outros, 2003).

(d Os sítios de N-glicosilação putativa N-X-S/T foram previstos usando o pro- grama NetNGIyc 1.0 (Gupta e outros, 2004). (e De acordo com Hong e outros, 1999.

As seqüências de proteína deduzidas das xilanases de Acremo- nium e Thermoascus compartilham homologia com várias enzimas de glico- sil hidrolase da família 10, identificando os genes correspondentes como elementos das xilanases família 10. A contraparte mais próxima de XYN- 60/Xyn10A de Acremonium encontrada é a XYLI de Humicola grisea (AB001030) mostrando 67,1% de identidade com XYN-60 (Tabela 28). A seqüência de proteína prevista da xilanase de XYN-3-/Xyn10A de Thermo- ascus aurantiacus é completamente idêntica aquela de XYNA de T.aurantiacus publicada (P23360, Tabela 28). A homologia mais próxima foi encontrada em uma seqüência de xilanase de Aspergillus niger (A62445, 69,7% de identidade). Tabela 28. Comparação das xilanases deduzidas de XYN-60/Xyn1 OA de Acremonium thermophilum e XYN-30/Xyn1 OA de Thermoascus aurantiacus com suas contrapartes homólogas. O alinhamento foi realizado usando o programa Needle do pacote de programas da EMBOSS. *lndica uma xilana-

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Exemplo 23. Produção de xilanases recombinantes em Trichoderma reesei

Os plasm/deos de expressão foram construídos para produção de proteínas recombinantes de XYN-60/Xyn10A de Acremonium e XYN- 30/Xyn10A de Thermoaseus conforme descrito no Exemplo 14. Cassetes de expressão linear (tabela 29) foram isolados da estrutura do vetor por diges- tão da enzima de restrição, transformada em T. reesei A96 e tranformantes purificados conforme descrito no Exemplo 14. Tabela 29. Cassetes de expressão construídos para produção de xilanases de XYN-60/Xyn1 OA de Acremonium thermophilum e XYN-30/Xyn1 OA de Thermoascus aurantiacus no Trichoderma reesei. A estrutura esquemática

<table>table see original document page 84</column></row><table>

(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da estrutura de vetor por digestão com EcoRl.

(b É indicado o número de nucleotídeos após o códon STOP do gene clona- do que são incluídos no cassete de expressão. O sítio de restrição na região 3' do gene que foi usado na construção do cassete de expressão é indicado entre parênteses.

A produção da xilanase dos transformantes foi analisada dos so- brenadantes de cultura dos cultivos de frascos de agitação (50 mL). Os trans- formantes cresceram como no Exemplo 14 e a atividade da enzima da proteí- na recombinante foi medida a partir do sobrenadante de cultura como a Iibe- ração dos açúcares de redução a partir da xilana de bétula (1% peso/volume) a 50°C em tampão de citrato a 50 mM, pH 5,3 conforme descrito por Bailey e Poutanen 1989. A produção da proteína recombinante foi também analisada do sobrenadante de cultura por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida. Além disso, a expressão de ambas xilanases foi determinada por análise Western blot com anticorpos anti-XYN-30 ou anti-XYN-60 conforme descrito no Exem- plo 19. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram analisados por Southern blotting usando o cassete de expressão como uma sonda.

XYN-30/Xyn1 OA de Thermoascus foi produzida em T. reesei e o pH ótimo da proteína produzida heterologamente foi determinado no tampão universal Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 3,0-8,0 usando xilana de bétula como substrato (figura 8A). O pH ótimo foi determinado como sendo de 4,5. A temperatura ótima para atividade enzimática de XYN-30 foi deter- minada como sendo de 75°C (figura 8B). Os transformantes escolhidos foram cultivados, conforme descri- to no Exemplo 14, em um bioreator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação.

Exemplo 24. Desempenho das celobioidrolases recombinantes na hi- drólise

O desempenho das celobioidrolases recombinantes purificadas foi avaliado nos estudos de hidrólise com enzimas T.reesei purificadas. A hi- drólise foi realizada com misturas controladas de enzimas purificadas nos vá- rios substratos pré-tratados. Os filtrados de cultura de T.reesei contendo dife- rentes enzimas de CBH/Cel7 clonadas foram obtidos conforme descrito nos Exemplos 14 e 15 e as enzimas de CBH foram purificadas por cromatografia de afinidade conforme descrito no Exemplo 2. Além disso, celulases de T.reesei puras (purificadas conforme descrito Suurnàkki e outros, 2000) foram empre- gados nas misturas de enzima. As celobioidrolases no experimento foram:

(Ta Cel7A) de CBH de Thermoascus aurantiacus ALK04242

(Ta Cel7A). de CBH de Thermoascus aurantiacus ALK04242 com CBD de (Ta Cel7A +Tr CBD) de Trichoderma reesei geneticamente a- nexado

(Ta Cel7A) de CBH de Thermoascus aurantiacus ALK04242 com CDB de (Ta Cel7A +Ct CBD) e de (At Cel7A) geneticamente anexados

(At Cel7A) de CBH de Acremonium thermophilum ALK04245

(Ct Cel7A) de CBH de Chaetomium thermophilum ALK04265

Cada CBH/Cel7 a ser testado (dosagem de 14,5 mg/g de matéria seca de substrato) foi usado tanto em conjunto com EGII/Cel5A de T. reesei (3,6 mg/g) ou com uma mistura contendo EGI/Cel7B T. reesei (1,8 mg/g), EGII/Cel5A (1,8 mg/g), xilanase pl 9 (Tenkanen e outros, 1992) (5.000 nkat/g) e acetil xilana estearase (AXE) (Sundberg and Poutanen, 1991) (250 nkat/g). Todas misturas foram suplementadas com β-glicosidase adicional a partir de uma preparação de enzima comercial Novozym 188 (176 nkat/g d.w.). Tubos em triplicata contendo a mistura de enzima e 10 mg (matéria seca)/mL de substrato suspenso em 0,05 M de acetato de sódio foram incubados na mistu- ra por agitação magnética a 45°C por 48 horas. Amostras de referência com enzimas inativadas e substratos correspondentes foram também preparados. A liberação dos produtos de hidrólisè foi medida como açúcares de redução com método de DNS usando glicose como padrão (Tabela 30).

Os substratos que se seguem foram usados no experimento:

Celulose cristalina (AviceI)

Fibra de espruce pré-tratada com vapor e lavada (impregnação com 3% peso/peso de SO2 por 20 minutos, seguido por pré-tratamento de vapor a 215°C por 5 minutos), matéria seca 25,9% (ESPRUCE).

Fibra de palha de milho oxidada, úmida e lavada (WOCS).

Fibra de salgueiro pré-tratada com vapor e lavada (pré- tratamento por 14 minutos a 210°C), matéria seca a 23,0% (SALGUEIRO). Tabela 30. Produtos de hidrólisè com enzimas de CBH (45°C, pH 5,0). Pro- dutos de reação após 48 horas de hidrólisè como açúcares de redução (mg/mL), glicose medida como padrão. Abreviaturas: CBH = celobioidrolase; EGI = (Cel7B) de endoglicanase I de T. reesei, EGII = (Cel5A) de endoglica- nase II de T. reesei; bG = β-glicosidase (da Novozym 188); XYL= xilanase pl 9 (XYN II) de T. reesei, AXE = acetil xilana esterase de T. reesei; nd = não realizado.

<table>table see original document page 86</column></row><table> Na tabela 30, as celobioidrolases diferentes foram comparadas com base na mesma dosagem de proteína na hidrólise. Os resultados mos- tram que nos substratos celulósicos (Avicel e fibra de espruce) Cel7A de Thermoascus àurantiacus com CBD anexado geneticamente mostrou çlara- mente hidrólise superior a T.reesei CBHI/Cel7A. Sem CBD1 Cel7A de T.aurantiacus foi menos eficaz nesses substratos. O desenvolvimento das celobioidrolases de Acremonium thermophilum e Chaetomium thermophilum foi também melhor em relação aquele de CBHI/Cel7A de T.reesei nos vários substratos; especificamente, Cel7A de C. thermophilum mostrou alta eficiên- cia na celulose pura (Avicel).

No caso de substratos contendo quantidades notáveis de hemi- celulose (salgueiro e palha de milho) as enzimas CBH/Cel7 precisaram cla- ramente da adição de ambas hemicelulolases e endoglucanases para de- sempenhar seu papel com eficiência. Caso nenhuma hemiceluláse adicional estiver presente, Cel7A de T.aurantiacus com CBD geneticamente anexado mostrou nova e claramente hidrólise mais alta. Com as enzimas de degrada- ção de hemicelulose mais importantes (xilanase, acetil xilana esterase e E- Gl) Cel7A de T.aurantiacus com CBD geneticamene anexado teve novo de- sempenho com eficiência mais alta. Cel7A de C. thermophilum foi mais efici- ente que enzima T. reesei e Cel7A de C. thermophilum produziu produtos de hidrólise no mesmo nível que CBHI/Cel7A de T. reesei. O domínio de ligação de celulose de T. reesei mostrou fornecer eficiência ligeiramente melhor em relação a CBD de C.thermophilum no desempenho hidrolítico de Cel7A de T.aurantiacus, mesmo que a diferença seja pequena.

Pode ser concluído que, quando CBHI/Cel7A foi substituída na mistura de enzimas de Trichoderma pelas celobioidrolases produzidas aqui, a eficiência da hidrólise conforme julgada por essas disposições experimen- tais foi claramente melhorada no caso de Cel7A de T. aurantiacus com CBD geneticamente anexado e também aperfeiçoou no caso de Cel7A de A. ther- mophilum e Cel7A de C. thermophilum. Considerando-se também a melhor estabilidade da temperatura das celobioidrolases produzidas aqui, os resul- tados indicam que o desempenho das misturas de enzimas de celulase em temperaturas superiores a 45°C pode ser claramente aperfeiçoado por em- prego das celobioidrolases produzidas aqui.

Exemplo 25. Desempenho das endoglucanases recombinantes na hi- drólise

As preparações contendo as endoglicanases foram comparadas em estudos de hidrólise misturadas com as enzimas CBH/Cel7 e CBH/Cel6 purificadas em vários substratos pré-tratados. Os filtrados de cultura de T. reesei contendo diferentes enzimas de endoglicanase clonadas foram obti- das conforme descrito no Exemplo 19. As enzimas foram enriquecidas por remoção das proteínas termoestáveis das misturas por um tratamento térmi- co (60°C, 2 horas, pH 5) e o sobrenadante foi usado para estudos de hidróli- se. Além disso, celulases de T. reesei (purificadas como descrito por Suurnãkki e outros, 2000) foram empregados nas misturas de enzima. As endoglicanases usadas no experimento eram:

At EG-40/Cel45A (ALK04245 EG-40) de endoglicanase Acre- monium thermophilum ALK04245

Semelhante a At EG-40/Cel45B (semelhante a ALK04245 EG- 40)de endoglicanase de Acremonium thermophilum ALK04245

Endoglicanase de Ta EG-28/Cel5A (ALK04242 EG-28) de Thermoascus aurantiacus ALK04242.

Os substratos que se seguem foram usados no experimento: Fibra de espruce pré-tratada em vapor e lavada (impregnação com SO2 a 3% por 20 minutos, seguido por pré-tratamento com vapor a 215°C por 5 minutos), matéria seca a 25,9% (ESPRUCE).

Fibra de palha de milho explodida em vapor (pré-tratamento em vapor a 210°C por 5 minutos, matéria seca 31,0% (SECS).

As endoglucanases a serem estudadas (dosagem de 840 nkat/g de matéria seca, com base na atividade da endoglicanase contra HIEC de acordo com IUPAC, 1987) foram também usadas com celobioidrolases de T. reesei (CBHI/Cel7A, 8,1 mg/g d.m. e cBHII/Cel6A, 2.0 mg/g d.m.) ou com Cel7A de Thermoascus aurantiacus com CBD de T. reesei geneticamente (10,1 mg/g d.m.). EGI (Cel7B) e EGII (Cel5A) de T. reesei purificados (Suurnákki e outros, 2000) foram também incluídos nos experimentos para comparação. Todas as misturas foram suplementadas com β-glicosidase adicional da Novozym 188 (para fabricar a dosagem de β-glicosidase de 560 nkat/g d.w., a dosagem relativamente alta foi usada para compensar as dife- renças nas atividades de base das diferentes preparações de EG). Tubos em triplicata foram incubados em mistura a 45°C por 48 horas e amostras de referência com enzimas inativadas e substratos correspondentes foram pre- paradas. A liberação de produtos de hidrólise foi medida nos açúcares de redução com método DNS usando glicose como padrão (Tabela 31).

Tabela 31. Produtos de hidrólise com preparações diferentes de endoglica- nase quando usadas em conjunto com celobioidrolases de T. reesei ou com Cel7A de T.aurantiacus abrigando CBD de T.reesei. Produtos de reação a- pós 48 horas de hidrólise como açúcares de redução (mg/mL), glicose medi- da como padrão. Abreviaturas: CBHI = (Cel7A) de ceIobioidrólase I de T. reeser, CBHII = (Cel6A) de celobioidrolase Il de T.reesei·, EGI = (cel7B) de endoglicanase I de T. reesei) EGII = (Cel5A) de endoglicanase Il de T. ree- sei) bG = β-glicosidase (da Novozym 188); nd = não realizado.

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Na tabela 31, as celobioidrolases diferentes foram comparadas com base na mesma dosagem de atividade na hidrólise. Isso pode favorecer as enzimas com baixa atividade específica contra o substrato (hidroxietil ce- lulose) usadas no ensaio e subestimar a eficiência das enzimas com alta atividade específica contra hidroxietil celulose. Em qualquer caso, os resul- tados mostram que as endoglicanases de Acremonium thermophilum têm desempenho muito bom na hidrólise quando tem efeito em conjunto com ambas celobioidrolases usadas na mistura. As endoglicanases de A. ther- mophilum apresentam desempenho semelhante à EGI/Cel7B de T.reesei que é uma enzima muito eficiente no substrato de palha de milho contendo hemicelulose, devido à sua forte atividade colateral da xilanase. Cel5A (AL- K04242 EG-28 da endoglicanase de T. aurantiacus mostrou hidrólise mais baixa em relação as enzimas de T. reesei.

Pode ser concluído que as endoglicanases de A.thermophilum têm desempenho de eficiência comparável ou melhor quando comparadas enzimas de Thichoderma correspondentes na hidrólise conforme julgado por essa disposição experimental. Considerando-se também a estabilidade da temperatura das endoglicanases descritas aqui, os resultados indicam que o desempenho das misturas da enzima celulase em temperaturas supe- riores a 45QC pode ser melhorado por emprego das endoglicanases descri- tas aqui.

Exemplo 26. Hidrólise de espruce pré-tratado com vapor em temperatu- ras altas

Fibra de espruce explodida em vapor e lavada (impregnação com 3% peso/peso de SO2 por 20 minutos, seguido por pré-tratamento com vapor a 215°C por 5 minutos), com matéria seca de 25,9% foi suspensa em 5 mL de 0,05 M tampão acetato de sódio na consistência de 10 mg/ml_. Esse substrato foi hidrolisado usando diferentes misturas de enzima nos tubos de teste com agitação magnética no banho de água ajustado em diferentes temperaturas por 72 horas. Para cada ponto da amostra, uma triplicata dos tubos de teste foi retirada da hidrólise, fervida por 10 minutos a fim de termi- nar a hidrólise da enzima, centrifugada e o sobrenadante foi analisado quan- to aos produtos de reação de hidrólise. Os espaços em branco contendo o substrato sozinho (apenas tampão foi adicionado ao invés das enzimas) fo- ram também incubados nas condições correspondentes.

Uma mistura de celulases termofílicas foi preparada usando os seguintes componentes:

Prèparação de CBH/Cel7 termofílica contendo Thermoascus au- rantiacus ALK04242 Cel7A com CBD geneticamente anexado de C- BHI/Cel7A de T. reesei. A preparação da proteína foi produzida conforme descrito no Exemplo 15 e purificada de acordo com o Exemplo 2 resultando na preparação de Ta Cel7A + Tr CBD purificada com teor de proteína de 5,6 mg/mL.

A preparação de endoglicanase termofílica contendo endoglica- nase de Acremonium thermophilum ALK04245 At EG-40/Cel45A. A proteína foi produzida em T. reesei conforme descrito no Exemplo 19. A fim de enri- quecer os componentes termofílicos, o meio de cultura gasto foi tratado com aquecimento (60°C por 2 horas). A preparação obtida continha 4,9 mg/mLde proteína e atividade de endoglicanase (de acordo com IUPAC, 1987) 422 nkat/mL.

Preparação de β-glicosidase termofílica obtida conforme descrito no Exemplo 21 contendo β-glicosidase Ta 3G-81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus ALK04242. A fim de enriquecer os componentes termofílicos, o caldo fermentado foi tratado com aquecimento (65°C por duas horas). A pre- paração obtida continha 4,3 mg/mL de proteína e a atividade da β- glicosidase de 6270 nkat/mL (de acordo com Bailey e Linko, 1990).

Essas preparações de enzima foram combinadas como se se- gue (por 10 mL de mistura): preparação de CBH/Cel7 4,51 mL, preparação de endoglicanase, 5,19 mL e preparação de β-glicosidase 0,29 mL. Essa mistura foi usada como "MISTURA 1" das enzimas termofílicas.

Como uma comparação e referência, uma mistura do estado da técnica comercial de enzimas de Trichoderma reesei foi construída combi- nando (por 10 mL): 8,05 ml_ de Celluclast 1,5 L FG (da Novozymes A/S) e 1,95 mL de Novozym 188 (da Novozymes A/S). A mesma foi denominada como "ENZIMAS DE T. REESEf.

As enzimas foram dosadas com base na atividade FPU das mis- turas: "MISTURA 1" usando a dosagem de 5,5 FPU por 1 grama de matéria seca no substrato de espruce e "ENZIMAS T. REESEI" usando 5,8 FPU por 1 grama de matéria seca no substrato de espruce.

As amostras foram retiradas da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantifi- cados usando o ensaio para reduzir os açúcares (Bemfeld, 1955), empre- gando glicose como padrão. A quantidade de produtos de hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura 9.

Os resultados mostram claramente o melhor desempenho das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Trichoderma do es- tado da técnica a 55°C e 60°C no substrato de espruce. Com base na análi- se de HPLC, o rendimento máximo dos açúcares do substrato seria de 5,67 mg por 10 mg de substrato de espruce seco. Em razão da dosagem relati- vamente baixa da enzima os rendimentos de açúcar final foram claramente mais baixos. Para enzimas termoestáveis, o rendimento do açúcar com base no ensaio do açúcar de redução foi de 66% e 57% do teórico em 55°C e 60°C, respectivamente. Para as enzimas de Trichoderma do estado da téc- nica, o mesmo foi de apenas 31% e 11% a 55°C e 60°C, respectivamente. Exemplo 27. Hidrólise de palha de milho pré-tratado com vapor em temperaturas altas

Fibra de palha de milho explodida em vapor (tratamento a 195°C por 5 minutos), com matéria seca de 45,3% foi suspensa em 5 mL de 0,05 tampão de acetato de sódio na consistência de 10 mg/mL. Os tratamentos e medições foram realizados conforme descrito no Exemplo 26.

Uma mistura das celulases termofílicas descritas aqui foi cons- truída usando os componentes que se seguem:

Preparação termofílica de CBH contendo Cel7A de Thermoas- cus aurantiacus ALK04242 com CBD geneticamente anexado de C- BHI/Cel7A de T. reesei (Ta Cel7A + Tr CBD, Exemplo 15). O teor de proteí- na da preparação foi de 31 mg/mL.

Preparação da endoglicanase termofílica contendo endoglicana- se At EG-40/Cel45A de Acremonium thermophilum ALK04245 foi obtida conforme descrito no Exemplo 19. A preparação de enzima concentrada continha atividade de endoglicanase (de acordo com IUPAC, 1987) de 2057 nkat/mL.

Préparação de β-glicosidase termofílica contendo β-glicosidase de Ta BBG-81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus ALKO 4242 foi obtida conforme descrito no Exemplo 21 contendo atividade de β-glicosidase (de acordo com Bailey and Linko, 1990) de 11.500 nkat/mL.

Produto de xilanase termofílica contendo uma xilanase AM24 o- riginária de Nonomuraea flexuosa DSM43186. O produto foi preparado por emprego de uma cèpa de Trichoderma reesei recombinante que havia sido transformada com o cassete de expressão pALK1502, conforme descrito no W02005/100557. O produto sólido foi dissolvido na matéria para obter uma solução a 10% e uma preparação de enzima com atividade de xilanase (ana- lisada de acordo com Bailey e outros, 1992) de 208.000 nkat/mL foi obtida.

Essas preparações de enzima foram combinadas como se se- gue (por 10 mL de mistura): preparação de CBH/Cel7 7,79 mL, preparação de endoglicanase 0,96 mL, preparação de β-glicosidase 1,14 mL e prepara- ção da xilanase 0,31 mL. Essa mistura foi usada como "MISTURA 2" das enzimas termofílicas.

Como uma comparação e referência, uma mistura do estado da • técnica comercial de enzimas de Trichoderma reesei foi construída combi- nando (por 10 mL), 8,05 mL de Celluclast 1,5 L FG (da Novozymes A/S) e 1,95 mL de Novozym. 188 (da Novozymes A/S). A mesma foi denominada como "ENZIMAS DE T. REESEr.

As amostras foram retiradas da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantifi- cados usando o ensaio para reduzir os açúcares (Bemfeld, 1955), empre- gando glicose como padrão. A quantidade de produtos de hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura 10.

Os resultados mostram claramente o melhor desempenho das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Trichoderma do es- tado da técnica. A 55°C a mistura de enzimas termofílicas mostrou hidrólise mais eficiente em comparação às enzimas T. reeser. A hidrólise foi mais rá- pida e rendimentos de açúcar maiores foram também obtidos. Com base na análise de HPLC, o rendimento máximo dos açúcares (incluindo os açúcares solúveis livres no substrato não lavado que foi usado) do substrato seria de 5,73 mg por 10 mg de substrato seco. Assim, a hidrólise pelas enzimas da MISTURA 2 estava quase completa em 48 horas. A 55°C e 57,5°C as enzi- mas termofílicas descritas aqui mostraram também um desempenho clara- mente melhor na hidrólise em relação às enzimas de Trichoderma do estado da técnica.

Exemplo 28. Hidrólise de palha de milho pré-tratada em temperaturas altas usando mistura com uma xilanase termoestável

O procedimento explicado no Exemplo 27 foi repetido, exceto que o produto de xilanase XT 02026A3 foi substituído por preparação termo- fílica de xilanase contendo xilanase Ta XYN-30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus ALK04242 produzida em T. reesei. O caldo fermentador, produ- zido conforme descrito no Exemplo 23 continha atividade de xialanase de 132.000 nkat/mL (ensaiado de acordo com Bailey e outros, 1992).

Essas preparações de enzima foram combinadas como se se- gue (por 10 mL de mistura): preparação de CBH/Cel7 7,64 ml_, preparação de endoglicanase 0,96 mL, preparação de β-glicosidase 1,15 mL e prepara- ção da xilanase 0,25 mL. Essa mistura foi usada como "MISTURA 3" das enzimas termofílicas.

Como uma comparação e referência, uma mistura do estado da técnica comercial de enzimas de Trichoderma reesei foi construída combi- nando (por 10 mL), 8,05 mL de Celluclast 1,5 L FG (da Novozymes A/S) e 1,95 mL de Novozym 188 (da Novozymes A/S). A mesma foi denominada como "ENZIMAS DE T. REESEF'.

As amostras foram retiradas da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantifi- cados usando o ensaio para reduzir os açúcares (Bemfeld, 1955), empre- gando glicose como padrão. Os resultados dos brancos do substrato foram subtraídos das amostras com enzimas, e a concentração dos produtos de hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura 11.

Os resultados mostram claramente o melhor desempenho da mistura das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Tricho- derma do estado da técnica. A 45°C a mistura de enzimas termofílicas mos- trou hidrólise mais eficiente em comparação às enzimas T. reesei. A 55°C e 60°C as enzimas termofílicas descritas aqui mostraram também um desem- penho claramente melhor na hidrólise em relação às enzimas de Triehoder- ma do estado da técnica. O desempenho da nova mistura de enzima a 60°C estava no mesmo nível de desempenho das enzimas do estado da arte a 45°C.

Exemplo 29. Hidrólise de espruce pré-tratado em temperaturas altas usando mistura com uma xilanase termoestável

O procedimento conforme descrito no Exemplo 28 foi repetido com fibra de espruce explodida em vapor e lavada (impregnação com 3% peso/peso de SO2 por 20 minutos, seguido por pré-tratamento com vapor a 215°C por 5 minutos com matéria seca de 25,9%) como substrato usando temperaturas de hidrólise de 45°C, 55°C e 60°C. As amostras foram toma- das da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantificados usando o ensaio para reduzir os açúcares (Bemfeld, 1955), empregando glicose como padrão. Os resulta- dos dos brancos do substrato foram subtraídos das amostras com enzimas, e a concentração dos produtos de hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura. 12.

Os resultados mostram claramente o melhor desempenho da mistura das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Tricho- derma do estado da técnica. A 45°C a mistura de enzimas termofílicas mos- trou hidrólise mais eficiente em comparação às enzimas T. reesei, evidente- mente devido à melhor estabilidade em hidrólise de longo prazo. A 55°C a eficiência da mistura das enzimas descritas aqui ainda estava no mesmo nível em relação a 45°C, considerando-se que a mistura do estado da técni- ca foi ineficaz com o substrato usado nessa temperatura. A 60°C as enzimas termofílicas descritas aqui mostraram hidrólise diminuída embora a hidrólise estivesse próxima ao mesmo nível de desempenho das enzimas do estado da técnica a 45°C.

Exemplo 30. Avaliação da inibição da glicose das β-glicosidases de A- cremonium thermophilum ALK04245, Chaetomium thermophilum AL- K04261 e Thermoascus aurantiacus ALK04242

Os filtrados de cultura produzidos pelas cepas de Acremonium thermophilum ALK04245, Chaetomium thermophilum ALK04261 e Thermo- ascus aurantiacus ALK04242 são descritos no Exemplo 1. As atividades da β-glicosidase (medidas de acordo com Bailey and Linko, 1990) dessas pre- parações foram de 21,4 nkat/mL, 5,6 nkat/mL e 18,6 nkat/mL, respectiva- mente. Para comparação, enzimas comerciais Celluclast 1,5 L (β-glicosidase 534 nkat/mL) e Novozym 188 (β-glicosidase 5840 nakat/mL) foram também incluídas no experimento.

A fim de avaliar a sensibilidade das β-glicosidases diferentes na direção de inibição da glicose, o procedimento de ensaio de atividade padrão foi realizado na presença de concentrações diferentes de glicose. As solu- ções de substrato (p-nitrofeil-β-D-glicopiranosídeo) para o ensaio de ativida- de da β-glicosidase foram suplementados por glicose, de modo que a con- centração na mistura de ensaio foi ajustada para os valores de 0 a 0,5 M. Exceto essa adição de glicose, o ensaio foi realizado usando o procedimento padrão (Bailey and Linko, 1990). As atividades na presença de concentra- ções variadas de glicose como uma porcentagem da atividade sem glicose são apresentadas na figura 13.

Os resultados mostram que β-glicosidases de C. thermophilum e T. aurantiacus foram menos afetados pela inibição de glicose que as β- glicosidases presentes nas enzimas comerciais: β-glicosidase derivada de Aspergillus em Novozym 188 ou β-glicosidase derivada de Trichoderma em Celluclast 1,5L. A enzima A. thermophilum mostrou comportamento compa- rável ao da enzima T. reesei de Celluclast. Especialmente a enzima C.thermophilum foi claramente menos afetada por alta concentração de gli- cose. Assim, esses resultados indicam que considerando-se a inibição de glicose o uso de novas β-glicosidases, especialmente de cepas Acremonium thermophilum ALK04242 e Chaetomium thermophilum ALK04261, fornece- ria vantagens claras na hidrólise em condições industriais com alta concen- tração de glicose.

Exemplo 31. Atividade do papel filtro das misturas de enzima em tem- peraturas altas

A atividade do papel filtro das preparações de enzima foi medida de acordo com o método da IUPAC (1987) conforme descrito no procedi- mento, exceto que a reação da enzima foi realizada a temperaturas de 50°C a 70°C. A atividade de FPU calculada se baseia na quantidade de enzima necessária para hidrolisar 4% do substrato de papel de filtro em 1 hora sob condições experimentais. A atividade de FPU foi considerada como repre- sentando a atividade de celulase total de uma preparação de enzima.

As misturas de enzima foram a MISTURA 2 preparada conforme descrito no Exemplo 27, a MISTURA 3 preparada conforme dèscrito no E- xemplo 28e MISTURA 4 A MISTURA 4 foi preparada por combinação das preparações de enzima descritas no Exemplo 27 como se segue (por 10 mL da mistura): preparação de CBH/Cel7, 7,84 mL, preparação de endoglicana- se, 0,99 mL e preparação de β-glicosidase, 1,17 mL.

As misturas de enzima usadas como referência, representando as misturas do estado da técnica foram: • "ENZIMAS A DE T. REESEf preparadas de acordo com a pre-

paração dé "ENZIMAS DE T. REESEr descrita no Exemplo 26.

"ENZIMAS B DE T. REESEf que foram construídas combinan- do (por 10 mL), 8,05 mL de Econase CE (uma preparação comercial de celu- lase de T.reeseida AB Enzymes Oy, Rajamaki, Finlândia) e 1,95 mL de No- vozym 188 (da Novozymes A/S).

As atividades de FPU medidas para as preparações de enzima em temperaturas diferentes são apresentadas na figura 14, como as porcen- tagens de atividade sob condições padrão (IUPAC, 1987) (a 50°C). Os resultados mostram claramente que as misturas da invenção

mostram atividade de celulose total mais alta em temperaturas elevadas (60- 70°C) quando comparada às misturas do estado da técnica, com base nas enzimas de Trichoderma e Aspergillus.

Exemplo 32. Uso das novas beta-glicosidades na preparação de sofo- rose

Uma mistura de hidrolisado de amido de alta concentração (Nu- triose 74/968, Roquette) foi tratada com preparação de enzima enriquecida com βG-81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus produzida conforme descrito no Exemplo 21, para obtenção de uma mistura de açúcar contendo quanti- dades apreciáveis de indutor de celulose (soforose) para superar a repres- são da glicose.

A preparação de enzima enriquecida com Ta βG-81/CelΙ3Α foi adicionada a uma solução de Nutriose a 70% (peso/peso) para uma concen- tração final de 1 g de proteína total/litro. O recipiente da mistura foi incubado em um banho de água a 65°C por 3 dias com agitação constante e usado como uma fonte de carbono em um meio de frasco agitado para duas cepas diferentes de Trichoderma (A47 e Rut-C30). O efeito do tratamento da enzi- ma foi medido como uma atividade da endoglicanase formada durante uma cultivo de frasco de agitação de 7 dias. Como uma referência, os cultivos foram realizados nas mesmas condições com Nutriose não tratada como uma fonte de carbono. Um aumento superior a duas vezes nas atividades foi obtido nos cultivos de frasco de agitação realizados em um meio de Nutriose pré-tratado com Ta βG-81/CelΙ3Α com as cepas testadas. Os resultados são mostrados na figura 15.

Lista de Organismos Depositados

<table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table>

(1) The Centralbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Países Baixos

(2) The Centralbureau Voor Schimmelcultures at Oosterstraat 1, 3742 SK

BAARNlPaisesBaixos

(3) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), MascheroderWeg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha

(4) [Após o término do período de depósito corrente, as amostras serão ar- mazenadas de acordo com tratados de modo a tornar a cepa disponível a- lém do tempo permitido pela patente]

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LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Roal

<i2o> Tratamento de material celulósico e enzimas úteis para o mesmo

<130> 2051999

<160> 30

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 3192

<212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus <220>

<221> GDS

<222> (1514) .. (2122)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (2123) .. (2187)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (2188) .. (2949)

<223>

<400> 1

ctagaccttt atcctttcat ccgaccagac ttcccctttg accttggcgc cctgttgact 60

acctacctac ctaggtaggt aacgtcgtcg accctcttga atgatcctcg tcacactgca 120 aacatccgaa acatacggca aaagatgatt gggcatggat gcaggagaca tcgaatgagg 180 gcttagaagg aaatgaaaac ctgggaccag gacgctaggt acgatgaaat ccgccaatgg 240

tgaaacttta agtcgtgcct acagcacagg ctctgtgaag attgcgctgt tcagacttaa 300

tcttctcatc acagtccaag tctttatgaa aaggaaaaga gagagaagag cgctatttcg 360

agctgtcggc ctcataggga gacagtcgag cataccagcg gtatcgacgt tagactcaac 420

caagaataat gacgagaata aacacagaag tcaaccttga actgtatatc agggttccag 480

cagcagatag ttacttgcat aaagacaact ccccgagggc tctctgcata caccaggatg 540

ttccggaatt attcactgct cgtttccgac gtggcgtcag tgatccgtct ccacagaacc 600

tctacctggg gaataaccca ggggaggaat ctgcaagtaa gaacttaata ccaatccccg 660

gggctgccgg ggtgaatcaa atctcccgcg ggaaattaaa cccatacgat gtttttgcac 72 0

cacatgcatg cttggcacga tttctccgca agggagtcac agagaaagac atatttcgca 780

tactactgtg actctgcaga gttacatatc actcaggata cattgcagat cattgtccga 840

gcatcaaaca tggacctgca ggatcaacgg cccgacaaaa cacaagtggc taaagctggg 900

ggatgcccga acccgctgcg caatatcatt gatggatgtt cccccacatt tttaaaacat 960

cgacggatcg gçccgcatac taatcctttt atcaaccaaa agttccactc gactagagaa 1020

aaaaaggcca aggccactaa ttgcagtcgg atactggtct tttcgccgtc caacaccttc 1080

atccatgatc cccttagcca ccaatgcccc acataataca tgttgacata ggtacgtagc 1140

tctgttatcc aatcgcatcc gaacctcttt aacggacccc tcctacacac cttatcctaa 1200

cttcaggaga ctgttgccca ttggggattg aggaggtccg ggttgcagga tgcgttctag 1260

gctaaattct cggccggtag ccatctcgaa tctctcgtga agccttcatc tgaacggttg 1320

gcggcccgtc aagccgatga ccatgggttc ctgatagagc ttgtgcctga ccggccttgg 1380

cggcatagac gagctgaaca catcaggtat gaacagatca gatataaagt cggattgagt 1440

cctagtacga agcaatccgc caccaccaaa tcaagcaacg agcgacagca ataacaatat 1500

caatcgaatc gca atg tat> cag cgc gct ctt ctc ttc tct ttc ttc ctc 1549 Met Tyr Gln Arg Ala Leu Leu Phe Ser Phe Phe Leu

1 5 10

gcc gcc gcc cgc gcg cag cag gcc ggt acc gta acc gca gag aat cac 1597 Ala Ala Ala Arg Ala Gln Gln Ala Gly Thr Val Thr Ala Glu Asn His

15 20 25

cct tcc ctg acc tgg cag caa tgc tcc age ggc ggt agt tgt acc acg 1645 Pro Ser Leu Thr Trfi Gln Gln Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr 30 35 40

cag aat gga aaa gtc gtt ate gat gcg aac tgg cgt tgg gtc cat acc 1693 Gln Asn Gly Lys Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Thr 45 50 55 60

acc tct gga tac acc aac tgc tac acg ggc aat acg tgg gac acc agt 1741

Thr Ser Gly Tyr Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser 65 70 . 75

ate tgt ccc gac gac gtg acc tgc gct cag aat tgt gcc ttg gat gga 1789

Ile Cys Pro Asp Asp Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly

80 85 90

gcg gat tac agt ggc acc tat ggt gtt acg acc agt ggc aac gcc ctg 1837

Ala Asp Tyr Ser Gly Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Ash Ala Leu 95 100 105

aga ctg aac ttt gtc acc caa age tca ggg aag aac att ggc tcg cgc 1885

Arg Leu Asn Phe Val Thr Gln Ser Ser Gly Lys Asn Ile Gly Ser Arg 110 115 120

ctg tac ctg ctg cag gac gac acc act tat cag ate ttc aag ctg ctg 1933 Leu Tyr Leu Leu Gln Asp Asp Thr Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu 125 130 135 140

ggt cag gag ttt acc ttc gat gtc gac gtc tcc aat ctc cct tgc ggg 1981

Gly Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly 145 150 155

ctg aac ggc gcc ctc tac ttt gtg gcc atg gac gcc gac ggc gga ttg 2029

Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu

160 165 170

tcc aaa tac cct ggc aac aag gea ggc gct aag tat ggc act ggt tac 2077

Ser Lys Tyr Pro Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr 175 180 185

tgc gac tct cag tgc cct cgg gat ctc aag ttc ate aac ggt cag 2122

Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln 190 195 200

gtacgtcaga agtgataact agccagcaga gcccatgaat cattaactaa cgctgtcaaa 2182 tacag gcc aat gtt gaa ggc tgg cag ccg tct gcc aac gac cca aat gcc 2232 Ala Asn Val Glu Gly Trp Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala

205 210 215

ggc gtt ggt aac cac ggt tcc tgc tgc gct gag atg gat gtc tgg gaa 2280

Gly Val Gly Asn His Gly Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu 220 225 230

gcc aac age ate tet act gcg gtg acg cct cac cca tgc gac acc ccc 2328 Ala Asn Ser Ile Ser Thr.Ala Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro 235 240 245 250

ggc cag acc atg tgc cag gga gac gac tgt ggt gga acc tac tcc tcc 2376

Gly Gln Thr Met Cys Gln Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser

255 260 265

act cga tat gct ggt acc tgc gac cct gat ggc tgc gac ttc aat cct 2424

Thr Arg Tyr Ala Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro 270 275 280

tac cgc cag ggc aac cac tcg ttc tac ggc ccc ggg cag ate gtc gac 2472 Tyr -Arg Gln Gly Asn His Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Gln Ile Val Asp

285 290 295

acc age tcc aaa ttc acc gtc gtc acc cag ttc ate acc gac gac ggg 2520

Thr Ser Ser Lys Phe Thr Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly 300 305 310

' acc ccc tcc ggc acc ctg acg gag ate aaa cgc ttc tac gtc cag aac 2568

Thr Pro Ser Gly Thr Leu Thr Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn 315 32Ό 325 330

ggc aag gta ate ccc cag tcg gag tcg acg ate age ggc gtc acc ggc 2616

Gly Lys Val Ile Pro Gln Ser Glu Ser Thr Ile Ser Gly Val Thr Gly

335 340 345

aac tca ate acc acc gag tat tgc acg gcc cag aag gcc gcc ttc ggc 2664

Asn Ser Ile Thr Thr Glu Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ala Ala Phe Gly 350 355 360

gac aac acc ggc ttt ttc acg cac ggc ggg ctt cag aag ate agt cag 2712 Asp Asn Thr Gly Phe Phe Thr His Gly Gly Leu Gln Lys lie Ser Gln 365 370 375 gct ctg gct cag ggc atg gtc ctc gtc atg age ctg tgg gac gat cac 2760

Ala Leu Ala Gln Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His

380 385 390

gcc gcc aac atg ctc tgg ctg gac age acc tac ccg act gat gcg gac 2808

Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp 395 400 405 410

ccg gac acc cct ggc gtc gcg cgc ggt acc tgc ccc acg acc tcc ggc 2856 Pro Asp Thr Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Ser Gly 415 420 425

gtc ccg gcc gac gtt gag tcg cag tac ccc aat tca tat gtt ate tac 2 904 Val Pro Ala Asp Val Glu Ser Gln Tyr Pro Asn Ser Tyr Val Ile Tyr

430 435 440

tcc aac ate aag gtc gga ccc ate aac tcg acc ttc acc gcc aac 2 949

Ser Asn Ile Lys Val Gly Pro Ile Asn Ser Thr Phe Thr Ala Asn 445 450 455

taagtaagta actggcactc taccaccgag agcttcgtga agatacaggg gtggttggga 3009 gattgtcgtg tacaggggac atgcgatgct caaaaatcta catcagtttg ccaattgaac 3069 catgaaaaaa agggggagat caaagaagtc tgtcaaaaga ggggggctgt ggcagcttaa 3129 gccttgttgt agatcgagtc gacgccctat agtgagtcgt attagagctc gcggccgcga 3189 gct 3192

<210> 2 <211> 457 <212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus

<400> 2

Met Tyr Gln Arg Ala Leu Leu Phe Ser Phe Phe Leu Ala Ala Ala Arg 1 5 10 15

Ala Gln Gln Ala Gly Thr Val Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr 20 25 30

Trp Gln Gln Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys 35 40 45 Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr

50 55 60

Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser Ile Cys Pro Asp 65 . ' 70 75 80

Asp Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser

85 90 95

Gly Thr Tyr Gly Val Thr. Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe

100 105 110

Val Thr Gln Ser Ser Gly Lys Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu

115 120 125

Gln Asp Asp Thr Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gly Gln Glu Phe

130 135 140

Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala 145 150 155 160

Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro

165 170 175

Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln

180 185 190

Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly

195 200 205

Trp Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Asn His Gly

210 215 220

Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr 225 230 235 240

Ala Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys Gln

245 250 255

Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Thr

260 265 270

Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gln Gly Asn His

275 280 285

Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr 290 295 300 Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr Leu 305 310 315 320

Thr Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Gln

325 330 335

Ser Glu Ser Thr Ile Ser Gly Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu

340 345 350

Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe Phe

355 360 365

Thr His Gly Gly Leu Gln Lys Ile Ser Gln Ala Leu Ala Gln Gly Met

370 375 380

Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp 385 390 395 400

Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Asp Thr Pro Gly Val

405 410 415

Ala Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu

420 425 430

Ser Gln Tyr Pro Asn Ser Tyr Val Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly

435 440 445

Pro Ile Asn Ser Thr Phe Thr Ala Asn

450 455

<210> 3 <211> 3055 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> CDS

<222> (972) . . (1595)

<223>

<220>

<221> íntron

<222> (1596)..(1729)

<223> <220>

<221> CDS

<222> (1730)..(2290) <223>

<220>

<221> íntron <222> (2291)..(2412) <223> <220> <221> CDS

<222> (2413) ., (2540) <223> <220>

<221> íntron <222> (2541) .. (2627) <223> <220>

<221> CDS

<222> (2628)..(2691)

<223>

<400> 3

gaàttcggat cacaccgaga gcttcgcgat caacgttccg catcttcgtt >accttgatag

actgtgccac gcctgggaga cgggtgccgt tcgttgccga aacagccagg caggaagcct

cagcgcgccc ctctctttct cctcatttct

atttcttgat cccttgactc ctcagccccc tctctttctg tacatacgtc ecctctcgcg

cggagtgcca cccgcaggga acgagacttg

gagatccagg ccccccgatc tcgttctcgc

gtgggaagtc ttcggagcgg cacccaggcc

ggttgccttc atctatcgtg gctgcacatc

ggccagctgt ctcagcttgt acccgtctac 60

ctcgcgtttg ctggactgct ttgtgagggg 120

accatcggtt actgcgcaga ctgagaaccg 180

gtccaccttc atgtatcttc atatggaccc 240

tgcccaccac gatggacacc atgccaatct 300

cagcagtccg acaatgtaca gtgatgggca 360

gtgtccacgc gcggccgggg atgcctggga 420

gctgatgggg tgcggtgcat ggtggcacaa 480

acgtatcctt cccccgccgg cgatgcccaa 540

catcttgccg atgcccggca cggctctggc 600

cgccgtgccc ccattgggaa agcaggcttt 660 gttcttcccg tctgtcgatc gtctcccacc taccctccct cctcgcaagg gcttaccctg 720 gcccctcact gctgcttcac ctcactgctg cttccccgca atgccccctc gccccccccc 780 cccccctctc ctttgcagta cagatctaca taatatcgag acgcccccca agctgtttct 840 ctggcacagc cctctcgcgc gtggtgcaag agcaagtcag agtatcaatt cccccatctc 900 tcatctcagc ccttctgccg tggtccaccc gacattctgg gcccgtagcc aagaccgatc 960 cgcctctcac c atg cac aag cgg gcg gcc acc ctc tcc gcc ctc gtc gtc 1010 Met His Lys Arg Ala Ala Thr Leu Ser Ala Leu Val Val 15 10

gcc gcc gcc ggc ttc gcc cgc ggc cag ggc gtg ggc acg cag cag acg 1058

Ala Ala Ala Gly Phe Ala Arg Gly Gln Gly Val Gly Thr Gln Gln Thr 15 20 25

gag acg cac ccc aag ctc acc ttc cag aag tgc tcc gcc gcc ggc age 1106

Glu Thr His Pro Lys Leu Thr Phe Gln Lys Cys Ser Ala Ala Gly Ser 30 35 40 45

tgc acg acc cag aac ggc gag gtg gtc ate gac gcc aac tgg cgc tgg 1154

Cys Thr Thr Gln Asn Gly Glu Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp

50 55 60

gtg cac gac aag aac ggc tac acc aac tgc tac acg ggc aac gag tgg 1202

Val His Asp Lys Asn Gly Tyr Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Glu Trp 65 70 75

aac acc acc ate tgc gcc gac gcc gcc tcg tgc gcc age aac tgc gtc 12 50

Asn Thr Thr Ile Cys Ala Asp Ala Ala Ser Cys Ala Ser Asn Cys Val

80 85 90

gtc gac ggc gcc gac tac cag ggc acc tac ggc gcc tcc acc tcc ggc 1298

Val Asp Gly Ala Asp Tyr Gln Gly Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly 95 100 105

aac gcc ctg acc ctc aag ttc gtc acc aag ggc age tac gcc acc aac 1346

Asn Ala Leu Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys Gly Ser Tyr Ala Thr Asn 110 115 120 125

ate ggc tcg cgc atg tac ctg atg gcc age ccc acc aag tac gcc atg 1394 Ile Gly Ser Arg Met Tyr Leu Met Ala Ser Pro Thr Lys Tyr Ala Met 130 135 140 ttc acc ctg ctg ggc cac gag ttc gcc ttc gac gtc gac ctg age aag 1442

Phe Thr Leu Leu Gly His Glu Phe Ala Phe Asp Val Asp Leu Ser Lys

145 150 155

ctg ccc tgc ggc ctc aac ggc gcc gtc tac ttc gtc age atg gac gag 1490 Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Val Tyr Phe Val Ser Met Asp Glu 160 165 170

gac ggc ggc acc age aag. tac ccc tcc aac aag gcc ggc gcc aag tac 1538 Asp Gly Gly Thr Ser Lys Tyr Pro Ser Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr 175 180 185

ggc acg ggc tac tgc gac tcg cag tgt ccg cgc gac ctc aag ttt ate 1586 Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile 190 195 200 205

gac ggc aag gtgagaaccc gcactagcgt cccgccttcc gtgtccctcc 1635

Asp Gly Lys

ttttgccttc ttcgaccgcc ctcttccctg cgggccaggg tcgctggggt gctgtcctcc 1695 tttctggtgg gcagcggtgc tgatcccgcg ccag gcc aac tcg gcc age tgg cag 1750

Ala Asn Ser Ala Ser Trp Gln 210 215

ccc tcg tee aac gac cag aac gcc ggc gtg ggc ggc atg ggc tcg tgc 1798

Pro Ser Ser Asn Asp Gln Asn Ala Gly Val Gly Gly Met Gly Ser Cys ' 220 225 230

tgc gcc gag atg gac ate tgg gag gcc aac tcc gtc tcc gcc gcc tac 1846

Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Val Ser Ala Ala Tyr 235 240 245

acg ccg cac ccg tgc cag aac tac cag cag cac age tgc age ggc gac 1894 Thr Pro His Pro Cys Gln Asn Tyr Gln Gln His Ser Cys Ser Gly Asp

250 255 260

gac tgc ggc ggc acc tac tcg gcc acc cgc ttc gcc ggc gac tgc gac 1942 Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ala Thr Arg Phe Ala Gly Asp Cys Asp 265 270 275

ccg gac ggc tgc gac tgg aac gcc tac cgc atg ggc gtg cac gac ttc 1990 Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Ala Tyr Arg Met Gly Val His Asp Phe 280 285 290 295

tac ggc aac ggc aag acc gtc gac acc ggc aag aag ttc tcc ate gtc 2038

Tyr Gly Asn Gly Lys Thr Val Asp Thr Gly Lys Lys Phe Ser Ile Val 300 305 310

acc cag ttc aag ggc tcc ggc tcc acc ctg acc gag ate aag cag ttc 2086

Thr Gln Phe Lys Gly Ser Gly Ser Thr Leu Thr Glu Ile Lys Gln Phe

315 320 325

tac gtc cag gac ggc agg aag ate gag aac ccc aac gcc acc tgg ccc 2134

Tyr Val Gln Asp Gly Arg Lys Ile Glu Asn Pro Asn Ala Thr Trp Pro 330 335 340

ggc ctc gag ccc ttc aac tcc ate acc ccg gac ttc tgc aag gcc cag 2182

Gly Leu Glu Pro Phe Asn Ser Ile Thr Pro Asp Phe Cys Lys Ala Gln 345 350 355

aag cag gtc ttc ggc gac ccc gac cgc ttc aac gac atg ggc ggc ttc 2230 Lys Gln Val Phe Gly Asp Pro Asp Arg Phe Asn Asp Met Gly Gly Phe 360 365 370 375

acc aac atg gcc aag gcc ctg gcc aac ccc atg gtc ctg gtg ctg tcg 2278

Thr Asn Met Ala Lys Ala Leu Ala Asn Pro Met Val Leu Val Leu Ser 380 385 390

ctg tgg gac gac gtgagccatt ttcgcattct ctcctgactc tcctccgctg 2330

Leu Trp Asp Asp 395

ccatcaccac ctcttccacc accgccacga gggtgtagct tgatctccgc tgactgacgt 2390 gtgcccacac ccccgtttct ag cac tac tcc aac atg ctg tgg ctc gac tet 2442

His Tyr Ser Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser 400 405

acc tac ccg acc gac gcc gat ccc age gcg ccc ggc aag gga cgt ggc 2490

Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Ser Ala Pro Gly Lys Gly Arg Gly 410 415 420

acc tgc gac acc age age ggc gtg cca age gac gtg gag tcg aag aat 2538 Thr Cys Asp Thr Ser Ser Gly Val Pro Ser Asp Val Glu Ser Lys Asn

425 430 435

gg gtgagtcgga tcttctgcat gcggcccgtt ttccgagcat tgcttggggt 2590

Gly

cctccctcag gctgacacac gcgcgccttc gatacag c gat gcg acc gtc ate 2643

Asp Ala Thr Val Ile 440

tac tcc aac ate aag ttt ggg ccg ctg gac tcc acc tac acg gct tcc 2691 Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Leu Asp Ser Thr Tyr Thr Ala Ser 445 450 455

tgagcagccg ctttgggttc ggtggggccg aagcacaaca agtgtgtgcg tagctgagat 2751 gatggccgat ctctgtcctt tgtctcctag tgtctctctt atcgaacaac cccccgacct 2811 gcagcgtcgg cgggcatcgt atagtctggt gtaactgtat atagctctgt gcgtgtgaat 2871 cgaacgagca cçgacgaaat gtggtgtttc atgctatcgt acatgctctt gcgagatctg 2931 aagtcgtcaa ttagacattg ccaccatcca acttggcgac tgtccacccg gtccatttgt 2991 atcactggct cttccgagac ccggtctctc tcacaccgta atcactgcaa gcagagttga 3051 attc 3055

<210> 4 <211> 459 <212> PRT

<213> Acremonium thermophilum <400> 4

Met His Lys Arg Ala Ala Thr Leu Ser Ala Leu Val Val Ala Ala Ala 1 5 10 15

Gly Phe Ala Arg Gly Gln Gly Val Gly Thr Gln Gln Thr Glu Thr His 20 25 30

Pro Lys Leu Thr Phe Gln Lys Cys Ser Ala Ala Gly Ser Cys Thr Thr

35 40 45

Gln Asn Gly Glu Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Asp

50 55 60

Lys Asn Gly Tyr Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Glu Trp Asn Thr Thr 65 70 75 80 Ile Cys Ala Asp Ala Ala Ser Cys Ala Ser Asn Cys Val Val Asp Gly

85 90 95

Ala Asp Tyr Gln Gly Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asn Ala Leu

100 105 110

Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys Gly Ser Tyr Ala Thr Asn Ile Gly Ser

115 120 125

Arg Met Tyr Leu Met Ala Ser Pro Thr Lys Tyr Ala Met Phe Thr Leu

130 135 140

Leu Gly His Glu Phe Ala Phe Asp Val Asp Leu Ser Lys Leu Pro Cys 145 150 155 160

Gly Leu Asn Gly Ala Val Tyr Phe Val Ser Met Asp Glu Asp Gly Gly

165 170 175

Thr Ser Lys Tyr Pro Ser Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly

180 185 190

Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asp Gly Lys

195 200 205

Ala Asn Ser Ala Ser Trp Gln Pro Ser Ser Asn Asp Gln Asn Ala Gly

210 215 220

Val Gly Gly Met Gly Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala 225 230 235 240

Asn Ser Val Ser Ala Ala Tyr Thr Pro His Pro Cys Gln Asn Tyr Gln

245 250 255

Gln His Ser Cys Ser Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ala Thr

260 265 270

Arg Phe Ala Gly Asp Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Ala Tyr

275 280 285

Arg Met Gly Val His Asp Phe Tyr Gly Asn Gly Lys Thx Va. 1 Asp Thx

290 295 300

Gly Lys Lys Phe Ser Ile Val Thr Gln Phe Lys Gly Ser Gly Ser Thr 305 310 315 320

Leu Thr Glu Ile Lys Gln Phe Tyr Val Gln Asp Gly Arg Lys Ile Glu 325 330 335 Asn Pro Asn Ala Thr Trp Pro Gly Leu Glu Pro Phe Asn Ser Ile Thr

340 345 350

Pro Asp Phe Cys Lys Ala Gln Lys Gln Val Phe Gly Asp Pro Asp Arg

355 360 365

Phe Asn Asp Met Gly Gly Phe Thr Asn Met Ala Lys Ala Leu Ala Asn

370 375 380

Pro Met Val Leu Val Leu. Ser Leu Trp Asp Asp His Tyr Ser Asn Met 385 390 395 400

Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Ser Ala Pro

405 410 415

Gly Lys Gly Arg Gly Thr Cys Asp Thr Ser Ser Gly Val Pro Ser Asp

420 425 430

Val Glu Ser Lys Asn Gly Asp Ala Thr Val Ile Tyr Ser Asn Ile Lys

435 440 445

Phe Gly Pro Leu Asp Ser Thr Tyr Thr Ala Ser

450 455

<210> 5 <211> 3401 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> CDS

<222> (891) .. (1299) .

<223>

<220>

<221> íntron

<222> (1300) . . (1387)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (1388) .. (1442) <223> <220>

<221> íntron <222> (1443)..(1495) <223>

<220>

<221> CDS

<222> (1496) .. (1643) <223> <220> <221> íntron

<222> (1644) . . (1697) <223> <220>

<221> CDS <222> (1698)..(1928) <223> <220>

<221> íntron <222> (1929)..(2014)

<223> <22 0>

<221> CDS

<222> (2015)..(2740) <223> <400> 5

ctcgagtttc cctggtcggc cactctctgc

tgtgtccagt cgtgtatctc ttgactgcac

gtggatgccc gtccactcat ttgtccgtct

tccacggccc actccccgga caacctcggc

cccctcctgc ggggtccgtc gtgccctggc

gagccaccgc agagccccat ctccaaagcg

tggggcccac gtcgatggcc tggcatccct

tcatctcgct ctgcgcccct ggatgtgccg 60

gacgtgttcc tcgcgactcg tctcgcgccg 120

actgggtcag cctctcgtct cgaacgagct 180

tctggatggc cctcctcccc ctccgtgtct 240

tgcatgctcc acatcgcttg atcacgctgc 300

accgtggcag cactacctct gtttctggga 360

tgccaccctc ctccatcccc ctgacctcac 420 tcccaaccga taggagaagt ggtcatgggc acgaccccgt gcacgtcttg gactcgacga 480 gcttgatcgg gccggaagcc gtcaacgacg ggggagccgt gtcttgccac gcgtggccgt 540 ccttcgacag tggacagcga gaaaactggt ggggaagagg gctgctacag tcttgtcttg 600 cgaggcccga cgctcctagt ccgagaacca cctacgtgtt tctcgcgaag acggggccag 660 cttagcggcc aaatttgccc cccgggccta gggtctagcg atggggatga tgaactggtg 720 tcgacgatgt ctatataacg acggcgatct cctgtctctg agatcccatc ctttcatctc 780 caacccactt catcccttcc tctctctctc cccctccctt ctctgacata ccgagtcctc 840 agaagcctcg tccgtcgtca cctattctca cttccccgcg aactccggcc atg tat 896

Met Tyr

1

acc aag ttc gcc gcc ctc gcc gcc ctc gtg gcc acc gtc cgc ggc cag 944

Thr Lys Phe Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Thr Val Arg Gly Gln

10 15

gcc gcc tgc tcg ctc acc gcc gag acc cac ccg tcg ctg cag tgg cag 992

Ala Ala Cys Ser Leu Thr Ala Glu Thr His Pro Ser Leu Gln Trp Gln 20 25 30

aag tgc acc gcg ccc ggc age tgc acc acc gtc age ggc cag gtc acc 1040

Lys Cys Thr Ala Pro Gly Ser Cys Thr Thr Val Ser Gly Gln Val Thr 35 40 45 50

átc gac gcc aac tgg cgc tgg ctg cac cag acc aac age age acc aac 1088

Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Gln Thr Asn Ser Ser Thr Asn

55 60 . .65

tgc tac acc ggc aac gag tgg gac acc age ate tgc age tcc gac acc 1136

Cys Tyr Thr Gly Asn Glu Trp Asp Thr Ser Ile Cys Ser Ser Asp Thr

70 75 80

gác tgc gcc acc aag tgc tgc ctc gac ggc gcc gac tac acc ggc acc 1184

Asp Cys Ala Thr Lys Cys Cys Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Thr Gly Thr

85 90 95

tac ggc gtc acc gcc age ggc aac tcg ctc aac ctc aag ttc gtc acc 1232

Tyr Gly Val Thr Ala Ser Gly Asn Ser Leu Asn Leu Lys Phe Val Thr 100 105 110

cag ggg ccc tac tcc aag aac ate ggc tcg cgc atg tac ctc atg gag 1280 Gln Gly Pro Tyr Ser Lys Asn Ile Gly Ser Arg Met Tyr Leu Met Glu 115 120 125 130

tcg gag tcc aag tac cag g gtgagcatat agatcacatc tttcgtcact Ser Glu Ser Lys Tyr Gln 135

tgcgtccgtt tcgcacggca agcggtccag acgctaacgg gacggttctc ttctctag gc ttc act ctc ctc ggt cag gag ttt acc ttt gac gtg gac gtc tcc Gly Phe Thr Leu Leu Gly Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser

140 145 150

aac ctc gg gtaggtgatg acttctcccg catgagaaga gctctgctaà Asn Leu Gly

ccgtgttgtc cag c tgc ggt ctg aac gga gcg ctc tac ttc gtg tcc atg Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met 160 165

gac ctc gac ggc ggc gtg tcc aag tac acc acc aac aag gcc ggc gcc Asp Leu Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Thr Thr Asn Lys Ala Gly Ala

170 175 180

ãag tac ggc acc ggc tac tgc gac tcc cag tgc ccg cgg gat ctc aag Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys

185 190 195

ttc ate aac ggc cag gtgggtcgag agaccctctt cccctctcag tgaacgatgt Phe Ile Asn Gly Gln 200

ctgaccctct ctag gcc aac ate gac ggc tgg caa ccg tcg tcc aac gac Ala Asn Ile Asp Gly Trp Gln Pro Ser Ser Asn Asp 205 210 215

gcc aac gcc ggc ctc ggg aac cac ggc age tgc tgc tcc gag atg gac Ala Asn Ala Gly Leu Gly Asn His Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp

220 225 230

ate tgg gag gcc aac aag gtc tcc gcc gcc tac acg ccg cac ccc tgc Ile Trp Glu Ala Asn Lys Val Ser Ala Ala Tyr Thr Pro His Pro Cys 235 240 245

acc acc ate ggc cag acc atg tgc acc ggc gac gac tgc ggc ggc acc 1877 Thr Thr Ile Gly Gln Thr Met Cys Thr Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr 250 255 260

tat tcg tcg gac cgc tat gcc ggc ate tgc gac ccc gac ggt tgc gat 1925 Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr.Ala Gly Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp 265 270 275 280

ttt gtaggttctt tctctcgccg ctccctgacg acctatatgt gtgaágggac 1978 Phe

gcacagaaaa gacaaggtca aagctgacca gageag aac tcg tac cgc atg ggc 2032 Asn Ser Tyr Arg Met Gly 285

gac acc age ttc tac ggc ccc ggc aag acg gtc gac acc ggc tcc aag 2080 Asp Thr Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Lys Thr Val Asp Thr Gly Ser Lys 290 295 300

ttc acc gtc gtg acc cag ttc ctc acg ggc tcc gac ggc aac ctc age 2128 Phe Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Thr Gly Ser Asp Gly Asn Leu Ser 305 310 315

gag ate aag cgc ttc tac gtg cag aac ggc aag gtc ate ccc aac tcc 2176 Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser 320 326 330 335

gag tcc aag ate gcc ggc gtc tcc ggc aac tcc ate acc acc gac ttc 2224 Glu Ser Lys Ile Ala Gly Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Asp Phe 340 345 350

tgc acc gcc cag aag acc gcc ttc ggc gac acc aac gtc ttc gag gag 2272 Cys Thr Ala Gln Lys Thr Ala Phe Gly Asp Thr Asn Val Phe Glu Glu 355 360 365

cgc ggc ggc ctc gcc cag atg ggc aag gcc ctg gcc gag ccc atg gtc 2320 Arg Gly Gly Leu Ala Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Glu Pro Met Val 370 375 380 ctg gtc ctg tcc gtc tgg gac gac cac gcc gtc aac atg ctc tgg ctc 2368

Leu Val Leu Ser Val Trp Asp Asp His Ala Val Asn Met Leu Trp Leu

385 390 395

gac tcc acc tac ccc acc gac age acc aag ccc ggc gcc gcc cgc ggc 2416

Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ser Thr Lys Pro Gly Ala Ala Arg Gly 400 405 410 415

gac tgc ccc ate acc tcc ggc gtg ccc gcc gac gtc gag tcc cag gcg 2464

Asp Cys Pro Ile Thr Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ser Gln Ala 420 425 430

ccc aac tcc aac gtc ate tac tcc aac ate cgc ttc ggc ccc ate aac 2512 Pro Asn Ser Asn Val Ile Tyr Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Asn

435 440 445

tcc acc tac acc ggc acc ccc age ggc ggc aac ccc ccc ggc ggc ggg 2560

Ser Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Gly 450 455 460

acc acc acc acc acc acc acc acc acc tcc aag ccc tcc ggc ccc acc 2608

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Pro Ser Gly Pro Thr

465 470 475

acc acc acc aac ccc tcg ggt ccg cag cag acg cac tgg ggt cag tgc 2 656

Thr Thr Thr Asn Pro Ser Gly Pro Gln Gln Thr His Trp Gly Gln Cys 480 485 490 495

ggc ggc cag gga tgg acc ggc ccc acg gtc tgc cag age ccc tac acc 2704

Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Val Cys Gln Ser Pro Tyr Thr 500 505 510

tgc aag tac tcc aac gac tgg tac tcg cag tgc ctg taagccataa 2750

Cys Lys Tyr Ser Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu

515 520

gccccctgta cgttcggaag acggtggcaa cagacaaacc cctcccccga gcacaccccc 2810 cagggatcta agggggttgt ggttaagaca taagaatgcg ccgtggcttg gcctacgcca 2870 cggtcatgaa agtgcagtga aaatgggggc aagagtcgga aaaagtgagt ttgcttgcaa 2 93 0 gggagagagg atgtcgagag gtgatgactt cgtttgtaca tagttggctc ttcgtgattg 2990 ggaacgggag gagtgtcggg gggagccctc cagactcctt ggcctctccg ctcgttccat 3050 ctttctcagt acatatacat ctgcattttc atccacgtct ctggcgtctc tggatgtgaa 3110 cgaatccgac aactggtggg ctgagatgaa tcgcaaggag agtatcttgc gaggatatca 3170 cagtcagaaa gtagcatttg agccactact aaaaggtcaa ccagtatgcg aagcttagca 3230 attatataca gcagctcaac ttcagaacga agtattgcat gtggcagaga atcttgggaa 3290 atgagccatg aagacctcgt cgagagagta cctctcaccg ccaaataacc agctagcggg 3350 ttgggagagg agcaatagga cgagcgcgat ggacagatat acgaactcga g 3401

<210> 6 <211> 523 <212> PRT <213> Acremonium thermophilum <400> 6

Met Tyr Thr Lys Phe Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Thr Val Arg 1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Cys Ser Leu Thr Ala Glu Thr His Pro Ser Leu Gln

15 20 25 30

Trp Gln Lys Cys Thr Ala Pro Gly Ser Cys Thr Thr Val Ser Gly Gln

35 40 45

Val Thr Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Gln Thr Asn Ser Ser 50 55 60

Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Glu Trp Asp Thr Ser Ile Cys Ser Ser 65 70 75 80

Asp Thr Asp Cys Ala Thr Lys Cys Cys Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Thr

85 90 95

Gly Thr Tyr Gly Val Thr Ala Ser Gly Asn Ser Leu Asn Leu Lys Phe

100 105 110

Val Thr Gln Gly Pro Tyr Ser Lys Asn Ile Gly Ser Arg Met Tyr Leu

115 120 125

Met Glu Ser Glu Ser Lys Tyr Gln Gly Phe' Thr Leu Leu Gly Gln Glu 130 135 140

Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Gly Cys Gly Leu Asn Gly 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Leu Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr

165 170 175

Thr Thr Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser

180 185 190

Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Ile Asp

195 200 205

Gly Trp Gln Pro Ser Ser Asn Asp Ala Asn Ala Gly Leu Gly Asn His

210 215 220

Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Lys Val Ser 225 230 235 240

Ala Ala Tyr Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Ile Gly Gln Thr Met Cys

245 250 255

Thr Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Ala Gly

260 265 270

Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Tyr Arg Met Gly Asp

275 280 285

Thr Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Lys Thr Val Asp Thr Gly Ser Lys Phe

290 295 300

Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Thr Gly Ser Asp Gly Asn Leu Ser Glu 305 310 315 320

Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Glu

325 330 335

Ser Lys Ile Ala Gly Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Asp Phe Cys

340 345 350

Thr Ala Gln Lys Thr Ala Phe Gly Asp Thr Asn Val Phe Glu Glu Arg

355 360 365

Gly Gly Leu Ala Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Glu Pro Met Val Leu

370 375 380

Val Leu Ser Val Trp Asp Asp His Ala Val Asn Met Leu Trp Leu Asp 385 390 395 400

Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ser Thr Lys Pro Gly Ala Ala Arg Gly Asp 405 410 415 Cys Pro Ile Thr Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ser Gln Ala Pro

420 425 430

Asn Ser Asn Val Ile Tyr Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Asn Ser

435 440 445

Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Gly Thr

450 455 460

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Pro Ser Gly Pro Thr Thr 465 470 475 480

Thr Thr Asn Pro Ser Gly Pro Gln Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly

485 490 495

Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Val Cys Gln Ser Pro Tyr Thr Cys

500 505 510

Lys Tyr Ser Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 515 520

<210> 7

<211> 3649

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum

<220>

<221> CDS

<222> (1290) . . (2879)

<223>

<220>

<221> íntron

<222> (2880)..(2943)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (2944)..(2949)

<223>

<400> 7

tctagagctg tcgacgcggc cgcgtaatac gactcactat agggcgaaga attcggatcg gactagagct cgtcacgggc tcgcgccgac gaggcgatga ggacgaaggg ccgacataat 120

ccgtacttta cgctacatga cgactctcga aaattgtaaa gggccggcat ttcggagcga 180

gtgctgcgag ggcgcattcg cggcgtacct ggaattcctg gaatggtaag caatggccag 240

caatgggcca ggtatggacc agcttgaatc ctggttgcgg cgtcaccagg cccagcatgg 300

tgcccagaat ggcccaccgt ggcccatcgt cctaagaaac aagctgcgtc ccgcgatcca 360

aaaacgtcgt cttcggcgca cgtcctccgt ggtccccccg gctggacacc ctggctggcc 420

ctccaatgag cggcatttgc ccctgtcgag cgtgtcggca accttaatcg actccatctc 480

tcggctccac gccgtccatc ctgtcctcga cctcgtcatc tgtgctcccc ttgccctccc 540

ttgcccttcc ttgcctccgc cacgacgtgc cacaatgtga ccctgctgcc cggagcgccc 600

agcgccatgc accgtttggg cttgtcgccg tgtcgccagt ctccatcgag cgattcgacc 660

gtgtgcctct ctccaccagc gttccccgcg ctctccatag tccatgctac ttcgagccgt 720

tgcctcacaa gctgccagcg gcatggctct gtcggtctcg cctctccttt tcccgtgaag 780

cgctgccata caattctccg tctgccccag tccttgaggc gccgctattc ccaatcggcc 840

atggcactgg ccagcccgat ccatgttcga tcgagcttcg acgggccgtg agccgtctgc 900

acggaggagc ttgcgagcct gcgaacctgg cggacctgga gaagcctggc ccatctccct 960

ggatggagat actgggtgcg ctagcaccac ggcgtgccac ggccaagctc cggccgaccc 1020

ggaggcggga agagggttgc gttgctgtct tcggcggctg tcagggcaaa gggtaatcgt 1080

caatgtggga aaaggggctc atctccatga gattcatgac tcggacatcg tctatataag 1140

tcgagtcccc catcctccaa cagccgattc tgctcctcat cccatcacca ccctcgtcca 1200

caaccacgca gttgtgtaca tcaaaacaag ttcgctcctt ttacatcttc accacaacaa 1260

cagcacatcc tctcctttcg gctttcaag atg atg tat aag aag ttc gcc gct 1313

Met Met Tyr Lys Lys Phe Ala Ala 1 5

ctc gcc gcc ctc gtg gct ggc gcc tcc gcc cag cag gct tgc tcc ctc 1361 Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ser Ala Gln Gln Ala Cys Ser Leu 10 15 20

acc gct gag aac cac cct age ctc acc tgg aag cgc tgc acc tet ggc 1409 Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr Trp Lys Arg Cys Thr Ser Gly 25 30 35 40

ggc age tgc tcg acc gtg aac ggc gcc gtc acc ate gat gcc aac tgg 1457 Gly Ser Cys Ser Thr Val Asn Gly Ala Val Thr Ile Asp Ala Asn Trp cgc tgg act cac acc gtc tcc ggc tcg acc aac tgc tac acc ggc aac 1505

Arg Trp Thr His Thr Val Ser Gly Ser Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn

60 65 70

cag tgg gat acc tcc ctc tgc act gat ggc aag age tgc gcc cag acc 1553 Gln Trp Asp Thr Ser Leu Cys Thr Asp Gly Lys Ser Cys Ala Gln Thr 75 80 85

tgc tgc gtc gat ggc gct .gac tac tet tcg acc tat ggt ate acc acc 1601

Cys Cys Val Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Ser Thr Tyr Gly Ile Thr Thr 90 95 100

age ggt gac tcc ctg aac ctc aag ttc gtc acc aag cac cag tac ggc 1649

Ser Gly Asp Ser Leu Asn Leu Lys Phe Val Thr Lys His Gln Tyr Gly 105 110 115 120

acc aac gtc ggc tcc cgt gtc tat ctg atg gag aac gac acc aag tac 1697

Thr Asn Val Gly Ser Arg Val Tyr Leu Met Glu Asn Asp Thr Lys Tyr 125 130 135

cag atg ttc gag ctc ctc ggc aac gag ttc acc ttc gat gtc gat gtc 1745

Gln Met Phe Glu Leu Leu Gly Asn Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val

140 145 150

tcc aac ctg ggc tgc ggt ctc aac ggc gcc ctc tac ttc gtt tcc atg 1793

Ser Asn Leu Gly Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met 155 160 165

gat gct gat ggt ggc atg age aaa tac tet ggc aac aag gct ggc gcc 1841 Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr Ser Gly Asn Lys Ala Gly Ala 170 175 180

aag tac ggt acc ggc tac tgc gat gct cag tgc ccg cgc gac ctc aag 1889 Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys 185 190 195 200

ttc ate aac ggc gag gcc aac gtt ggg aac tgg acc ccc tcg acc aac 1937

Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Val Gly Asn Trp Thr Pro Ser Thr Asn

205 210 215

gat gcc aac gcc ggc ttc ggc cgc tat ggc age tgc tgc tet gag atg 1985 Asp Ala Asn Ala 220

gat gtc tgg gag Asp Val Trp Glu 235

tgc acc acc gtt Cys Thr Thr Val 250

acc tac age tet Thr Tyr Ser Ser 265

gac ttc aac gcc Asp Phe Asn Ala

atg act gtc gac Met Thr Val Asp 300

aag aac tcg gct Lys Asn Ser Ala 315

gac ggc aag ate Asp Gly Lys Ile 330

gga aac tcc att Gly Asn Ser Ile 345

agt aac acc gat Ser Asn Thr Asp

aag gcc ctc gea Lys Ala Leu Ala 380

Gly Phe Gly Arg

gcc aac aac atg Ala Asn Asn Met 240

ggc cag age cgc Gly Gln Ser Arg 255

gac cgc tat gct Asp Arg Tyr Ala 2.70

tac cgc caa ggc Tyr Arg Gln Gly 285

acc aac aag aag Thr Asn Lys Lys

ggc gtc ctc age Gly Val Leu Ser 320

att gcc aac gct Ile Ala Asn Ala 335

acc cag gag tat Thr Gln Glu Tyr 350

gac ttc aac cgc Asp Phe Asn Arg 365

ggc ccc atg gtc Gly Pro Met Val

Tyr Gly Ser Cys 225

gct act gcc ttc Ala Thr Ala Phe

tgc gag gcc gac Cys Glu Ala Asp 260

ggt gtt tgc gac Gly Val Cys Asp 275

gac aag acc ttc Asp Lys Thr Phe 290

atg acc gtc gtc Met Thr Val Val 305

gag ate aag cgc Glu Ile Lys Arg

gag tcc aag ate Glu Ser Lys Ile 340

tgc gat gcc cag Cys Asp Ala Gln 355

aag ggc ggt atg Lys Gly Gly Met 370

ctg gtc atg tcc Leu Val Met Ser 385

Cys Ser Glu Met 230

act cct cac cct Thr Pro His Pro 245

acc tgc ggt ggc Thr Cys Gly Gly

cct gat ggc tgc Pro Asp Gly Cys 280

tac ggc aag ggc Tyr Gly Lys Gly 295

acc cag ttc cac Thr Gln Phe His 310

ttc tac gtc cag Phe Tyr Val Gln 325

ccc ggc aac ccc Pro Gly Asn Pro

aag gtc gcc ttc Lys Val Ala Phe 360

gct cag atg age Ala Gln Met Ser 375

gtc tgg gat gac Val Trp Asp Asp 390 cac tac gcc aac atg ctc tgg ctc gac tcg acc tac ccc ate gac cag 2513 His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Ile Asp Gln

395 400 405

gcc ggc gcc ccc ggc gcc gag cgc ggt gct tgc ccg acc acc tcc ggt 2561

Ala Gly Ala Pro Gly Ala Glu Arg Gly Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly 410 415 420

gtc cct gcc gag ate gag.gcc cag gtc ccc aac age aac gtc ate ttc 2609

Val Pro Ala Glu Ile Glu Ala Gln Val Pro Asn Ser Asn Val Ile Phe 425 430 435 440

tcc aac ate cgt ttc ggc ccc ate ggc tcg acc gtc cct ggc ctt gac 2 657

Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Val Pro Gly Leu Asp

445 450 455

ggc age aac ccc ggc aac ccg acc acc acc gtc gtt cct ccc gct tet 2705

Gly Ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr Val Val Pro Pro Ala Ser 460 465 470

acc tcc acc tcc cgt ccg acc age age act age tet ccc gtt tcg acc 2753

Thr Ser Thr Ser Arg Pro Thr Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Ser Thr

475 480 485

ccg act ggc cag ccc ggc ggc tgc acc acc cag aag tgg ggc cag tgc 2801

Pro Thr Gly Gln Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gln Lys Trp Gly Gln Cys ' 490 495 500

ggc ggt ate ggc tac acc ggc tgc act aac tgc gtt gct ggc acc acc 2849 Gly Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Asn Cys Val Ala Gly Thr Thr 505 510 515 520

tgc act cag ctc aac ccc tgg tac age cag gtatgtttct cttccccctt 2899

Cys Thr Gln Leu Asn Pro Trp Tyr Ser Gln 525 530

ctagactcgc ttggatttga cagttgctaa catctgctca acag tgc ctg 2949

Cys Leu

taaacaactc gcttcgttcg cacgacggag gagggccatg agaaagaatg ggcaacatag 3009 attctttgcg cggttgtgga ctacttgggt attttctgga tgtacatagt tttatcacgt 3069 catgaggctg tcatgtgggg atgtgtatct ttttcgcttc ttcgtacata aatttacgca 3129 ttgagctttt caccccccaa aaacagttcc ctgatttgct ggagtaactt gatggtaaag 3189 cttggtcata agctcttcaa tggaaaaaac gatacagtca tgccttgaca catcctccca 3249 aagtcttcgt ccatgacatc acggtcgatc cttaagcaca agttcaataa ccccatgtgg 3309 cgttgccttg tcctgaaaca cagatgagat cttcagccca gccgcatcgg ccacttcctt 3369 gaactgagcc aacgagcgtt ccttcccgcc gattgagagc atcgcatagt ccttgaaggc 3429 tgcatagaga ggaatagggg gcttgtttcc ggtagttggg ctgccggaac tcggatctgt 3489 tggcgcaagg gggtcagggt tgatctgctc ggcgatgagg acgcgtccat cggggtttgt 3549 tagtgcacga gcgacattgc gcaggatggt gactgccaca gggtcggagt aatcgcggag 3 609 gatgtggcgg aggtagtaga ccagtgcacc tggaatcgat 3 649

<210> 8

<211> 532 <212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum <400> 8

Met Met Tyr Lys Lys Phe Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala 1 5 10 15

Ser Ala Gln Gln Ala Cys Ser Leu Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu

20 25 30

Thr Trp Lys Arg Cys Thr Ser Gly Gly Ser Cys Ser Thr Val Asn Gly

35 40 45

Ala Val Thr Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Thr Val Ser Gly

50 55 60 Ser Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Gln Trp Asp Thr Ser Leu Cys Thr 65 70 75 80

Asp Gly Lys Ser Cys Ala Gln Thr Cys Cys Val Asp Gly Ala Asp Tyr

85 90 95

Ser Ser Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asp Ser Leu Asn Leu Lys

100 105 110

Phe Val Thr Lys His Gln Tyr Gly Thr Asn Val Gly Ser Arg Val Tyr 115 120 125

Leu Met Glu Asn Asp Thr Lys Tyr Gln Met Phe Glu Leu Leu Gly Asn

130 135 140 Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Gly Cys Gly Leu Asn 145 150 155 160

Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys

165 - 170 175

Tyr Ser Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp

180 185 190

Ala Gln Cys Pro Arg Asp.Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Val

195 200 205

Gly Asn Trp Thr Pro Ser Thr Asn Asp Ala Asn Ala Gly Phe Gly Arg

210 215 220

Tyr Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Asn Met 225 230 235 240

Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Ser Arg

245 250 255

Cys Glu Ala Asp Thr Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Ala

260 265 270

Gly Val Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ala Tyr Arg Gln Gly

275 280 285

Asp Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Asn Lys Lys

290 295 300

Met Thr Val Val Thr Gln Phe His Lys Asn Ser Ala Gly Val Leu Ser 305 310 315- 320

Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asp Gly Lys Ile Ile Ala Asn Ala

325 330 335

Glu Ser Lys Ile Pro Gly Asn Pro Gly Asn Ser Ile Thr Gln Glu Tyr

340 345 350

Cys Asp Ala Gln Lys Val Ala Phe Ser Asn Thr Asp Asp Phe Asn Arg

355 360 365

Lys Gly Gly Met Ala Gln Met Ser Lys Ala Leu Ala Gly Pro Met Val

370 375 380

Leu Val Met Ser Val Trp Asp Asp His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu 385 390 395 400 Asp Ser Thr Tyr Pro Ile Asp Gln Ala Gly Ala Pro Gly Ala Glu Arg

405 410 415

Gly Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Ile Glu Ala Gln

420 425 430

Val Pro Asn Ser Asn Val Ile Phe Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile

435 440 445

Gly Ser Thr Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr

450 455 460

Thr Thr Val Val Pro Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Arg Pro Thr Ser 465 470 475 480

Ser Thr Ser Ser Pro Val Ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro Gly Gly Cys

485 490 495

Thr Thr Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile GÍy Tyr Thr Gly Cys

500 505 510

Thr Asn Cys Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn Pro Trp Tyr

515 520 525

Ser Gln Cys Leu

530 <210> 9 <211> 1339 <212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus <220>

<221> CDS

<222> (17)..(122)

<223>

<220>

<221> Intron <222> (123)..(177) <223> <220>

<221> CDS <222> (178)..(236) <223> <220>

<221> íntron <222> (237) .. (296) <22 3> <220>

<221> CDS <222> (297).. (449) <223> <220>

<221> íntron <222> (450)..(508) <223> <220>

<221> CDS

<222> (509)..(573)

<223>

<220>

<221> íntron <222> (574)..(647) <223> <220>

<221> CDS <222> (648) .. (745) <2 2 3 > <220>

<221> íntron <222> (746)..(806) <223> <220>

<221> CDS <222> (807)..(1330)

<223>

<400> 9

ccgcggactg cgcatc atg aag ctc ggc tct ctc gtg ctc gct ctc age gea 52

Met Lys Leu Gly Ser Leu Val Leu Ala Leu Ser Ala 1 5 10

gct agg ctt aca ctg tcg gcc cct ctc gea gac agg aag cag gag acc 100

Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Gln Glu Thr 15 20 25

aag cgt gcg aaa gta ttc caa t gttcgtaaca tccacgtctg gcttgctggc 152

Lys Arg Ala Lys Val Phe Gln 30 35

ttactggcaa ctgacaatgg cgaag gg ttc ggt tca aac gag tcc ggt gct 203

Trp Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala

40

gaa ttc gga age cag aac ctt cca gga gtc gag gtcagcatgc ctgtactctc 256 Glu Phe Gly Ser Gln Asn Leu Pro Gly Val Glu 45 50 55

tgcattatat taatatetea agaggcttac tctttcgcag gga aag gat tat ata 311

Gly Lys Asp Tyr Ile 60

tgg cct gat ccc aac acc att gac aca ttg ate age aag ggg atg aac 359 Trp Pro Asp Pro Asn Thr Ile Asp Thr Leu Ile Ser Lys Gly Met Asn 65 70 75

ate ttt cgt gtc ccc ttt atg atg gag aga ttg gtt ccc aac tca atg 407

Ile Phe Arg Val Pro Phe Met Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Ser Met

80 85 90

acc ggc tct ccg gat ccg aac tac ctg gea gat ctc ata gcg 449

Thr Gly Ser Pro Asp Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu Ile Ala

95 100 105

gtacatttca attccaccat gtttggagct gtcttcgttg tgctgacatt taatggtag act gta aat gea ate acc cag aaa ggt gcc tac gcc gtc gtc gat cct

508

556 Thr Val Asn Ala Ile Thr Gln Lys Gly Ala Tyr Ala Val Val Asp Pro

110 115 120

cat aac tac ggc aga ta gtgaggtccc cggttctggt attgctgctg 603

His Asn Tyr Gly Arg Tyr

125

tatatctaag tagatatgtg tttctaacat ttccacgatt tcag c tac aat tct 657

Tyr Asn Ser 130

ata ate tcg age cct tcc gat ttc cag acc ttc tgg aaa acg gtc gcc 705

Ile Ile Ser Ser Pro Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Lys Thr Val Ala 135 140 145

tca cag ttt gct tcg aat cca ctg gtc ate ttc gac act a gtaagctgaa 755

Ser Gln Phe Ala Ser Asn Pro Leu Val Ile Phe Asp Thr 150 155 160

cacccgaaat taactgagtc tgagcatgtc tgacaagacg atccatgaaa g at aac 811

Asn Asn

gaa tac cac gat atg gac cag acc tta gtc ctc aat ctc aac cag gcc 859

Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Thr Leú Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala

165 170 175

gct ate gac ggc ate cgt tcc gcc gga gcc act tcc cag tac ate ttt 907

Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe

180 185 190

gtc gag ggc aat tcg tgg acc ggg. gea tgg acc tgg acg aac gtg aac 955

Val Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn Val Asn

195 200 205 210

gat aac atg aaa age ctg acc gac cca tct gac aag ate ata tac gag 1003

Asp Asn Met Lys Ser Leu Thr Asp Pro Ser Asp Lys Ile Ile Tyr Glu

215 220 225

atg cac cag tac ctg gac tct gac gga tcc ggg aca tca gcg acc tgc 1051

Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala Thr Cys

230 235 240 135

gta tct tcg acc ate ggt caa gag cga ate acc age gea acg caa tgg 1099

Val Ser Ser Thr Ile Gly Gln Glu Arg Ile Thr Ser Ala Thr Gln Trp

245 250 255

etc agg gcc aac ggg aag aag ggc ate ate ggc gag ttt gcg ggc gga 1147

Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu Phe Ala Gly Gly

260 265 270

gcc aac gac gtc tgc gag acg gcc ate acg ggc atg ctg gac tac atg 1195

Ala Asn Asp Val Cys Glu Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Asp Tyr Met

275 280 285 290

gcc cag aac acg gac gtc tgg act ggc gcc ate tgg tgg gcg gcc ggg 1243

Ala Gln Asn Thr Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala Ala Gly

295 300 305

ccg tgg tgg gga gac tac ata ttc tcc atg gag ccg gac aat ggc ate 1291

Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Met Glu Pro Asp Asn Gly Ile

310 315 320

gcg tat cag cag ata ctt cct att ttg act ccg tat ctt tgactgcag 1339

Ala Tyr Gln Gln Ile Leu Pro Ile Leu Thr Pro Tyr Leu 325 330 335

<210> 10

<211> 335

<212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus <400> 10

Met Lys Leu Gly Ser Leu Val Leu Ala Leu Ser Ala Ala Arg Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Gln Glu Thr Lys Arg Ala Lys

20 25 30

Val Phe Gln Trp Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser 35 40 45

Gln Asn Leu Pro Gly Val Glu Gly Lys Asp Tyr Ile Trp Pro Asp Pro 50 55 60 Asn Thr Ile Asp Thr Leu Ile Ser Lys Gly Met Asn Ile Phe Arg Val 65 70 75 80

Pro Phe Met Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Ser Met Thr Gly Ser Pro

'85 90 95

Asp Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu Ile Ala Thr Val Asn Ala Ile Thr

100 105 110

Gln Lys Gly Ala Tyr Ala .Val Val Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr

115 120 125

Tyr Asn Ser Ile Ile Ser Ser Pro Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Lys

130 135 140

Thr Val Ala Ser Gln Phe Ala Ser Asn Pro Leu Val Ile Phe Asp Thr 145 150 155 160

Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Thr Leu Val Leu Asn Leu Asn.

165 170 175

Gln Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr

180 185 190

Ile Phe Val Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn

195 200 205

Val Asn Asp Asn Met Lys Ser Leu Thr Asp Pro Ser Asp Lys Ile Ile

210 215 220

Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala 225 230 235 240

Thr Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Gln Glu Arg Ile Thr Ser Ala Thr

245 250 255

Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu Phe Ala

260 265 270

Gly Gly Ala Asn Asp Val Cys Glu Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Asp

275 280 285

Tyr Met Ala Gln Asn Thr Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala

290 295 300

Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Met Glu Pro Asp Asn 305 310 315 320 Gly Ile Ala Tyr Gln Gln Ile Leu Pro Ile Leu Thr Pro Tyr Leu 325 330 335

<210> 11 <211> 2334 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> N = unidentified <220>

<221> CDS

<222> (715).. (797)

<223>

<220>

<221> íntron <222> (798).. (856) <223> <220>

<221> CDS

<222> (857)..(1105)

<223>

<220>

<221> íntron

<222> (1106)..(1228)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (1229)..(1787)

<223>

<400> 11

tctgtctctt gtntcagaac agatctcctg gcggcctgct ttgccggtcc gaattgcgat cgatgcaacg tcgattgcat acgagctaag cccgtctcgt gataaccgca aggggtcttc 120 cgagtttctg tctgcgaccc aggcattttc cgatttgtgt gcggggaccc aactgtcttc 180 tggggagtac ctggtgacaa aagcacagat aaacagatgg atgacggtat tgctgtgata 240 tcgccgtggc gctgaatcct ttctcttcgc taccaagata tttattcccc gttgtgaaat 300 cttctattca gcccatccca tccggcaaca cgcatctgct tttcgttccg gcattccgat 360 acctggttcc tggagtgcct accgagcctc gcttcctggg atcgggcgtt gcaccccgcc 420 aaaccctatg ccccaaacgg tacggacaag gatgccggac cccggttttg tccagaaagg 480 ttgcattcct acccacctcg ctggagccac aacatgcaga tcaccgcccg agggaggaca 540 tgtgtggtgc agggacgttg gcaactctgc tgtgtctgaa gtatatgagg ccgatggttc 600 tccttgcaca aagcagagaa tggagtagcc agctcctcct caccagagtc gcctttgcag 660 cgtctcggca ttgcaggctc cccatcgtca gcatttcact tctcagcaac gaac atg 717

Met 1 .

cgc tcc tca ccc ttt ctc cgc gca gct ctg gct gcc gct ctg cct ctg 765

Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro Leu 5 10 15

age gcc cat gcc ctc gac gga aag tcg acg ag gtatgccaat cctcgtacct 817 Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg 20 25

ctgccctctg tagaaacaag tgaccgactg caaagacag a tac tgg gac tgc tgc 872

' . Tyr Trp Asp Cys Cys

30

aag ccg tcc tgc ggc tgg ccg gga aag gcc tcg gtg aac cag ccc gtc 920

Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val 35 40 45

ttc tcg tgc tcg gcc gac tgg cag cgc ate age gac ttc aac gcg aag 968

Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys 50 55 60 65

tcg ggc tgc gac gga ggc tcc gcc tac tcg tgc gcc gac cag acg ccc 1016 Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro

70 75 80

tgg gcg gtc aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc gca gcc acg gcc ate 1064

Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile 85 90 95

gcc ggc ggc tcc gag tcc age tgg tgc tgc gcc tgc tat gc 1105

Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala

100 105 110

gtgagttctc tgcaagccgc ttcccacccc cgctttctgt gcaggccgct tcccccctac 1165 ccacccactt cccccccccc gcctctgtga tcgggcatcc gagctaagtt gcgtgtcgtc 1225 cag a ctc acc ttc aac tcg ggc ccc gtc gcg ggc aag acc atg gtg gtg 1274 Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val 115 120 125

cag tcg acc age acc ggc ggc gac ctg ggc age aac cag ttc gac ctc 1322

Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu 130 135 140

gcc ate ccc ggc ggc ggc gtg ggc ate ttc aac ggc tgc gcc tcc cag 1370

Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln 145 150 155

ttc ggc ggc etc ccc ggc gcc cag tac ggc ggc ate age gac cgc age 1418 Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser

160 165 170

cag tgc tcg tcc ttc ccc gcg ccg ctc cag ccg ggc tgc cag tgg cgc 1466

Gln Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg 175 180 185 190

ttc gac tgg ttc cag aac gcc gac aac ccc acc ttc acc ttc cag cgc 1514

Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg

195 200 205

gtg cag tgc ccg tcc gag ctc acg tcc cgc acg ggc tgt aag cgc gac 1562

Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp 210 215 220

gac gac gcc age tat ccc gtc ttc aac ccg cct age ggt ggc tcc ccc 1610 Asp Asp Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro

225 230 235

age acc acc age acc acc acc age tcc ccg tcc ggt ccc acg ggc aac 1658 Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn 240 245 250

cct cct gga ggc ggt ggc tgc act gcc cag aag tgg gcc cag tgc. ggc 1706

Pro Pro Gly Gly Gly Gly.Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly 255 260 265 270

ggc act ggc ttc acg ggc tgc acc acc tgc gtc tcg ggc acc acc tgc 1754

Gly Thr Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys

275 280 285

cag gtg cag aac cag tgg tat tcc cag tgt ctg tgagcgggag ggttgttggg 1807 Gln Val Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 290 295

gtccgtttcc ctagggctga ggctgacgtg aactgggtcc tcttgtccgc cccatcacgg 1867 gttcgtattc gcgcgcttag ggagaggagg atgcagtttg agggggccac attttgaggg 1927 ggacgcagtc tggggtcgaa gcttgtcggt tagggctgcc gtgacgtggt agageagatg 1987 ggaccaagtg cggagctagg caggtgggtg gttgtggtgg tggcttacct tctgtaacgc 2047 aatggcatct catctcactc gcctgctccc tgattggtgg ctctgttcgg cctggcgctt 2107 tttgggaccg ctggctggaa tggattgctc cggaacgcca ggttgagctg ggctggcgcg 2167 agtagattgg ccgctccgag ctgcaaccat aataaaattt tcggaccctg taagccgcac 2227 ccgaccaggt ctccattggc ggacatgcac gacgtccttc gcaggcacgg cctgcccgcc 2287 tctgatcacc cgcagttttc gtaccgtcag accagataca agccccg 2334

<210> 12 <211> 297

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> misc_feature

<222> (13) .. (13) '

<223> N = unidentified <400> 12 Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro 1 5 10 15

Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

20 25 - ' 30

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro

35 40 45

Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala

50 55 60

Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr 65 10 75 80

Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

85 90 95

Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu

100 105 110

Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser

115 120 125

Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile

130 135 140

Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly 145 150 155 160

Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys

165 170 175

Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp

180 185 190

Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln

195 200 205

Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp

210 215 220

Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr 225 230 235 240

Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr

260 265 270

Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val

275 280 285

Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu

290 295

<210> 13 <211> 2033 <212> DNA

<213> Acremoniuiti thermophilum <220>

<221> CDS

<222> (259) .. (702)

<223>

<220>

<221> íntron <222> (703)..(857) <223> <220>

<221> CDS

<222> (858)..(888)

<223>

<220>

<221> íntron <222> (889)..(990) <2 2 3 > <220>

<221> CDS

<222> (991)..(1268)

<223>

<400> 13

ctcgaggaga ggaaccgagt ttgaaagatg ctatatatcg atagactacc ggcgtcgcct cgccctgtcc gctctcttgc attccccctg ttgatgagac gagacaaaat tcctggttag 120 aaaagatccg tcgccgagat ttcaccagtg gtaagtcccg agaattggtc attcgacgtt 180 caatatgagt gtcaaagcta tgggtcctaa caaagaagga agcaagagct ttaaagagac 240 agaataacag cagcaaag atg cgt ctc cca cta ccg act ctg ctc gcc ctc 291

Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu

1 5 10

ttg ccc tac tac ctc gaa gtg tcc gct cag ggg gca tcc gga acc ggc 339

Leu Pro Tyr Tyr Leu Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly 15 20 .25

10 acg aca aca cgt tac tgg gat tgc tgc aag ccg age tgc gcg tgg cct 387

Thr Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro

30 35 40

ctg aag ggc aat tcg ccc age ccg gtg cag act tgc gac aag aat gac 435

Leu Lys Gly Asn Ser Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp 45 50 55

agg ccg ctg aac gat ggg gga aac acc aag tcc ggc tgc gac aac ggt 483

Arg Pro Leu Asn Asp Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly 60 65 70 75

ggc ggg gcc ttc atg tgc tca tcc cag agt ccc tgg gcc gtc aat gag 531

Gly Gly Ala Phe Met Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu

80 85 90

acc acc age tac ggc tgg gca gcc gtt cgt ate gcc ggc agt acc gag 579

Thr Thr Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu 95 100 105

tcg gcc tgg tgc tgt gcc tgc tac gag ctc acc ttc acc agt ggg ccc 627

Ser Ala Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro

110 115 120

gtc agt gga aag aag ctc ata gtc cag gcc acg aac act ggt gga gac 675

Val Ser Gly Lys Lys Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp 125 130 135

ctt ggg age aac cac ttt gac ctt gcg gtatgtgggg tttttctttc 722 Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Ala 140 145

ttcatcatcg ctctcaccat ggattcctcg gcgcaaggac caagattgag aagcgtcaat 782 gccgggttgg acacgggagc cgggatagga acacagaggc cgtttaagac cgtcagctga 842 cagcagagca attag att ccc gga ggt ggt gtt ggt cag tcc aat g 888

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn 150 155

gtaggttcct tccctgaagt accggcaaca gcctgtgcgt tgctgtatac cccttttaat 948 catagcatct tcctgctgga tacaagccaa cccattttct ag ct tgc acg aac 1001

Ala Cys Thr Asn

160

cag tat ggt gcg ccc ccg aac ggc tgg ggc gac agg tat ggt ggc gtg 1049

Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Val 165 170 175

cac tcg cgg age gac tgc gac age ttc ccc gcg gcg ctc aag gcc ggc 1097 His Ser Arg Ser Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys Ala Gly

180 185 190

tgc tac tgg cga ttc gac tgg ttc cag ggc gcc gac aac ccg tcc gtg 1145

Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Glri Gly Ala Asp Asn Pro Ser Val 195 200 205 210

' age ttc aaa cag gta gcc tgc ccg gea gcc ate aca gct aag age ggc 1193

Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys Ser Gly

215 · 220 225

tgt aet cgc cag aac gat gcc ate aac gag act ccg act ggg ccc age 1241

Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly Pro Ser 230 235 240

act gtg cct acc tac acc gcg tca ggc tgaaagtcgg ctggggcacc 1288

Thr Val Pro Thr Tyr Thr Ala Ser Gly 245 250

attgcccagg tgatggttgg gcatgtgtta gtctcactca ccagggacat ttgtcgcgac 1348 ctgatcatag gcgccagggg agttgaaagg ggttgccgta cgagaagaca ttttgtcgcc 1408 gtcttactcc cagccacttc tgtacatatt caatgacatt acatagcccg caaatatgtt 1468 catatatcgt ggccgcccaa accgccccgg tttgcttagg ctggagctga agtggctcgc 1528

cgatggctgt caaaggcagt cggaatattc ctcgttgctt cggcaacacg gtagctgctt 1588

gaaccgtacc cagcattaga acaccccccg ccgagggctt gctacgtcaa tggcggggtc 1648

tccaacccct gcgcggcaca aaaccaacca cgccctcgtc ttttatgatg tcctcgctca 1708

aacgtcccgt gacgacactc cgctcatggt ctggtcctct gatgtagaag gggtaggtca 1768

gccgatggtc gtcaccgtcg tcaatgcttc cctcaagctt cttgcggcct ttatcctcca 1828

actcttccca catgagaact ccatctttcc gccttttcac aaagccactg ccctccttgt 1888

caagggccaa aaaccaacgc cgctgatgaa tgcttccgat cgtgtttgac gcgcccgggg 1948

tatgcatttg gttcggcgca cttttttcgt cctccagctc ccttaactcc cgttccatct 2008

gagagggtga ctcgtctact cgact 2033

<210> 14

<211> 251

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 14

Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu 1 5 10 15

Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Thr Thr Arg Tyr 20 25 30

20 Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Leu Lys Gly Asn Ser 35 40 45

Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp Arg Pro Leu Asn Asp

50 55 60

Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Gly Ala Phe Met 65 70 75 80

Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu Thr Thr Ser Tyr Gly

85 90 95

Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu Ser Ala Trp Cys Cys

100 105 110

Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys

115 120 125 Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His

130 135 140

Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn Ala Cys 145 150 155 160

Thr Asn Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly

165 170 175

Gly Val His Ser Arg Ser.Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys

180 185 190

Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro

195 200 205

Ser Val Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys

210 215 220

Ser Gly Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly 225 230 235 240

Pro Ser Thr Val Pro Thr Tyr Thr Ala Ser Gly 245 250

<210> 15 <211> 2800 <212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum <220>

<221> misc_feature <222> (2786)..(2786) > <223> N = not identified <220>

<221> CDS

<222> (768)..(2042)

<223>

<400> 15

ggatccaaga ccgatccCga ggattctcgg attatgtttg catctcaccc tccgaaaccg catgaaaaat tgaaatgggc aactgtcgct gtgtttaatg ctttgcacat catgggatca tgttcacccg ctctaatctc tcatcctcca gatcctatct atcctccgca tctagccggc ttcttgcttg tgatccaaag ccctgatccc acgcggcttc tagacgcttt agaaattaca 240

ccgaatctcc ccatgccctt cttgcaatat cttcccgacc aggaacttcg ggtgctcaac 300

atccgcgagc ttgacgacga cccttcttgg ccggcttggc atgcgactct gttcgggact 360

caatgcaact ctgggccctt caatgccgcg catgaccgtt actgaggctt agccgcccca 420

atcgcttggc acggtacctt gcagacggaa tcccgggccc gttgtccgat ctgctttggt 480

tccggtagag aagcctcgga ggaagagaca cacggacaca acgattgcgg gccccaatgc 540

gctgctccta attgaggctc cgaggtcgtg tgccgtgtgg agaggccgcg actgggtctg 600

gggtgcggag gattgcggag atgaagataa tctgggtgca accgtggata cataaaaggg 660

agtagttctc ccctctgtga aaccttcttc cccaggattc tcctcgcctc taagagtcca 720

aagtcattca agacatccta cagcggggtc agtgagattc cataatc atg act cgc 776

Met Thr Arg 1

aag ttc gca ctc gtt ccc ctc ctt ctg ggt ctt gcc tcg gcc cag aaa 824 Lys Phe Ala Leu Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Ala Ser Ala Gln Lys 5 10 15

ccc ggc aac act cca gaa gtc cac ccc aag ate acc act tac cgc tgc 872 Pro Gly Asn Thr Pro Glu Val His Pro Lys Ile Thr Thr Tyr Arg Cys 20 25 30 35

age cac cgc cag gga tgc cgc ccg gag acg aac tac ate gtc ctc gac 920 Ser His Arg Gln Gly Cys Arg Pro Glu Thr Asn Tyr Ile Val Leu Asp 40 45 50

tcc ctc acc cat ccc gtg cac cag ttg aac tcc aac gcg aac tgc ggc 968 Ser Leu Thr His Pro Val His Gln Leu Asn Ser Asn Ala Asn Cys Gly 55 60 65

gac tgg ggt aac ccg ccc ccg cgc age gtc tgc cct gat gtc gag acc 1016 Asp Trp Gly Asn Pro Pro Pro Arg Ser Val Cys Pro Asp Val Glu Thr 70 75 80

tgc gcg cag aat tgc ate atg gag ggc ate caa gac tac tcc acc tac 1064 Cys Ala Gln Asn Cys Ile Met Glu Gly Ile Gln Asp Tyr Ser Thr Tyr 85 90 95

ggc gtg acc acc tet ggc tet tcc ctt cgc ctg aag cag ate cac cag 1112 Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Arg Leu Lys Gln Ile His Gln 100 105 110 115

ggc cgc gtc acc tct cct cgt gtc tac ctc ctc gac aag acg gag cag 1160

Gly Arg Val Thr Ser Pro Arg Val Tyr Leu Leu Asp Lys Thr Glu Gln

120 125 130

cag tat gag atg atg cgt ctc acc ggc ttc gag ttc act ttc gac gtc 1208

Gln Tyr Glu Met Met Arg . Leu Thr Gly Phe Glu Phe Thr Phe Asp Val

135 140 145

gac acc acc aag ctc ccc tgc ggc atg aac gct gcg ctc tat ctc tcc 1256

Asp Thr Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Ala Ala Leu Tyr Leu Ser 150 155 160

gag atg gac gct acc ggc gct cgc tcc cgc ctc aac cct ggc ggt gcc 1304

Glu Met Asp Ala Thr Gly Ala Arg Ser Arg Leu Asn Pro Gly Gly Ala 165 170 175

tac tac ggc acg ggt tac tgc gat gca cag tgc ttc gtc acc ccc ttc 1352

Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Phe Val Thr Pro Phe 180 185 190 195

ate aat ggc ate ggc aac ate gag ggc aag ggc tcg tgc tgc aac gag 1400

Ile Asn Gly Ile Gly Asn Ile Glu Gly Lys Gly Ser Cys Cys Asn Glu

200 205 210

atg gac att tgg gag gcc aac tcg cgt agt cag tcc att gct ccg cac 1448

Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ser Gln Ser Ile Ala . Pro His

215 220 225

ccc tgc aac aag cag ggt ctg tac. atg tgc tcc ggc cag gag tgc gag 1496

Pro Cys Asn Lys Gln Gly Leu Tyr Met Cys Ser Gly Gln Glu Cys Glu 230 235 240

ttc gac ggc gtc tgc gac gag tgg gga tgc aca tgg aac ccg tac aag 1544

Phe Asp Gly Val Cys Asp Glu Trp Gly Cys Thr Trp Asn Pro Tyr Lys 245 250 255

gtc aac gtt acc gat: tac tat ggc cgc ggt ccg cag ttc aag gtc gac 1592

Val Asn Val Thr Asp Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Gln Phe Lys Val Asp 260 265 270 275 acg acc cgt ccc ttc acc gtc ate aca cag ttt cca gcc gac cag aac 1640

Thr Thr Arg Pro Phe Thr Val Ile Thr Gln Phe Pro Ala Asp Gln Asn

280 285 290

ggc aag ctg acg tcg ate cat cgc atg tat gtg caa gat ggc aag ttg 1688

Gly Lys Leu Thr Ser Ile His Arg Met Tyr Val Gln Asp Gly Lys Leu 295 300 305

ate gag gcg cat acc gtc aac ctg ccg ggt tat cct caa gtg aac gcg 1736

Ile Glu Ala His Thr Val Asn Leu Pro Gly Tyr Pro Gln Val Asn Ala 310 315 320

ctg aac gat gac ttc tgc cgt gcc acg gga gcc gcg acg aag tat ctt 1784 Leu Asn Asp Asp Phe Cys Arg Ala Thr Gly Ala Ala Thr Lys Tyr Leu

325 330 335

gaa ctg ggt gcc act gcg ggt atg ggc gag gct ctg agg cgt ggt atg 1832

Glu Leu Gly Ala Thr Ala Gly Met Gly Glu Ala Leu Arg Arg Gly Met 340 345 350 355

gtg ctg gct atg age ate tgg tgg gat gag age ggc ttc atg aac tgg 1880

Val Leu Ala Met Ser Ile Trp Trp Asp Glu Ser Gly Phe Met Asn Trp

360 365 370

ctt gat age ggc gag tet ggg ccg tgc aac ccg aac gag ggt aac cca 192 8

Leu Asp Ser Gly Glu Ser Gly Pro Cys Asn Pro Asn Glu Gly Asn Pro 375 380 385

cag aac att cgc cag att gag ccc gag ccg gag gtt acc tat age aac 1976

Gln Asn Ile Arg Gln Ile Glu Pro Glu Pro Glu Val Thr Tyr Ser Asn 390 395 400

ctg cgc tgg ggt gag att ggg tcg act tat aag cac aat ctg aag ggc 2024 Leu Arg Trp Gly Glu Ile Gly Ser Thr Tyr Lys His Asn Leu Lys Gly

405 410 415

ggg tgg act ggc agg aac taagtgttgg ggattagagc ctgtgattgg 2072

Gly Trp Thr Gly Arg Asn 420 425

atacctgtgg gttaaacggg gctcggtttg agagggttgt tgaaatttat ttctcgtaca 2132 tagttggcgt cttggcgaat atatgccccc aggactttga tccagtcttc gtccatttct 2192 ctgtgactta gttggtgcaa gtatcattgt tatgtcctgg gtgagacaaa gcaatctctt 2252 cagtggtcat gggtaaataa tctacaggct gtgaatggcg ttgcgtcagc ctcattaact 2312 taaacgattg gactcccctt ttcctaatca tcgccgttgc cgtgtaactc tcctagatct 2372 cttgttgtat atggcttcaa ctcgaagtga agaaaaatgg atacggcgac ctctttgtgc 2432 caattttctt gctgttcttc cggtattgac cctcggcaag acaactatgg ccaatattct 2492 gttatagtcg gcagttagtg ttgtgtcgta caagtcgtgc gggagcaata ctcaacagcc 2552 gcccttaata tggttattta cgccacgacg cacttcatta cacggctttg gggggtatat 2 612 attccgttca actctatccc tcattcggtg tgattgaacg tctccaacag tgaaagtata 2672 agtctgacaa aaatgcccaa ccgccatgcc actgatgatc ctgttgagat gctcgtggtc 2732 tatàacatcc tgtctaagtg ttacctccct aatgttagcc ccagttctgc tctncttgtc 2792 tcgacagc 2800

<210> 16 <211> 425 <212> PRT <213> Chaetomium thermophilum <220>

<221> misc_feature <222> (2786).. (2786) <223> N = not identified <400> 16

' Met Thr Arg Lys Phe Ala Leu Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Ala Ser 1 5 10 . .15

Ala Gln Lys Pro Gly Asn Thr Pro Glu Val His Pro Lys Ile Thr Thr 20 25 30

Tyr Arg Cys Ser His Arg Gln Gly Cys Arg Pro Glu Thr Asn Tyr Ile 35 40 45

Val Leu Asp Ser Leu Thr His Pro Val His Gln Leu Asn Ser Asn Ala

50 . 55 60

Asn Cys Gly Asp Trp Gly Ásn Pro Pro Pro Arg Ser Val Cys Pro Asp

65 '70 75 80

Val Glu Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ile Met Glu Gly Ile Gln Asp Tyr 85 90 95 Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Arg Leu Lys Gln

100 105 110

Ile His Gln Gly Arg Val Thr Ser Pro Arg Val Tyr Leu Leu Asp Lys

115 120 125

Thr Glu Gln Gln Tyr Glu Met Met Arg Leu Thr Gly Phe Glu Phe Thr

130 135 140

Phe Asp Val Asp Thr Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Ala Ala Leu 145 150 155 160

Tyr Leu Ser Glu Met Asp Ala Thr Gly Ala Arg Ser Arg Leu Asn Pro

165 170 175

Gly Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Phe Val

180 185 190

Thr Pro Phe Ile Ásn Gly Ile Gly Asn Ile Glu Gly Lys Gly Ser Cys

195 200 205

Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ser Gln Ser Ile

210 215 220

Ala Pro His Pro Cys Asn Lys Gln Gly Leu Tyr Met Cys Ser Gly Gln 225 230 235 240

Glu Cys Glu Phe Asp Gly Val Cys Asp Glu Trp Gly Cys Thr Trp Asn

245 250 255

Pro Tyr Lys Val Asn Val Thr Asp Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Gln Phe

260 265 270

Lys Val Asp Thr Thr Arg Pro Phe Thr Val Ile Thr Gln Phe Pro Ala

275 280 285

Asp Gln Asn Gly Lys Leu Thr Ser Ile His Arg Met Tyr Val Gln Asp

290 295 300 .

Gly Lys Leu Ile Glu Ala His Thr Val Asn Leu Pro Gly Tyr Pro Gln 305 310 315 320

Val Asn Ala Leu Asn Asp Asp Phe Cys Arg Ala Thr Gly Ala Ala Thr

325 330 335

Lys Tyr Leu Glu Leu Gly Ala Thr Ala Gly Met Gly Glu Ala Leu Arg 340 345 350 Arg Gly Met Val Leu Ala Met Ser 355 360

Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Glu

370 375

Gly Asn Pro Gln Asn Ile Arg Gln 385 390

Tyr Ser Asn Leu Arg Trp Gly Glu 405

Leu Lys Gly Gly Trp Thr Gly Arg 420

<210> 17 <211> 1943 <212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus <220>

<221> CDS <222> (13)..(256) <223> <220> '

<221> íntròn <222> (257) . . (329) <223> <220>

<221> CDS <222> (330) . . (370) <223> <220>

<221> íntron <222> (371)..(444) <223> <22 0>

<221> CDS

Ile Trp Trp Asp Glu Ser Gly Phe 365

Ser Gly Pro Cys Asn Pro Asn Glu 380

Ile Glu Pro Glu Pro Glu Val Thr 395 400

Ile Gly Ser Thr Tyr Lys His Asn 410 415

Asn 425 <222> (445)..(493)

<223>

<220>

<221> Intron <222> (494)..(561) <223> <220>

<221> CDS <222> (562)..(683) <223> <220>

<221> Intron <222> (684)..(786) <223> <220>

<221> CDS

<222> (787)..(932)

<223>

<220>

<221> Intron <222> (933)..(1001) <223> <220>

<221> CDS

<222> (1002)..(1090) <223> <220>

<221> Intron <222> (1091)..(1155) <223> <220>

<221> CDS <222> (1156)..(1174) <223> <220>

<221> íntron <222> (1175) . . (1267) <223> <220>

<221> CDS

<222> (1268) .. (1295)

<223> <220>

<221> íntron

<222> (1296)..(1361)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (1362)..(1451) <223> <220> <221> íntrón

<222> (1452)..(1551) <223> <220>

<221> CDS <222> (1552)..(1617) <223> <220>

<221> íntron <222> (1618)..(1829)

<223> <220>

<221> CDS <222> (1830)..(1922)

<223>

<400> 17

ccgcgggaag cc atg gtt cga cca acg ate cta ctt act tca ctc ctg cta 51

Met Val Arg Pro Thr Ile Leu Leu Thr Ser Leu Leu Leu

1 5 10

gct ccc ttc gea gct gcg.age cct ate ctc gag gaa cgc caa gct gea 99

Ala Pro Phe Ala Ala Ala Ser Pro Ile Leu Glu Glu Arg Gln Ala Ala 15 20 25

cag agt gtc gac caa ctg ate aag gct cgc ggc aag gtg tac ttt ggc 147

Gln Ser Val Asp Gln Leu Ile Lys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Phe Gly 30 35 40 45

gtc gcc acg gac caa aac cgg ctg acg acc ggc aag aat gcg gct ate 195

Val Ala Thr Asp Gln Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asn Ala Ala Ile

50 55 60

ate cag gct gat ttc ggc cag gtc acg ccg gag aat agt atg aaa tgg 243

Ile Gln Ala Asp Phe Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp

65 70 75

gac gct act gaa c gtgcgtgaga aagataattt gatttttttc ttctatgacc 296

Asp Ala Thr Glu 80

gctcggaccg ttctgactag gtttataata tag ct tet caa gga aac ttc aac 349

Pro Ser Gln Gly Asn Phe Asn

85

ttt gcc ggt gct gat tac ctt gtacgtacat acgaccactt gacgtttctt 400

Phe Ala Gly Ala Asp Tyr Leu

90 95

gcacgcaact gcgattgagg agaagatact aatcttcttg aaag gtc aat tgg gcc 456

Val Asn Trp Ala

cag caa aat gga aag ctg ate cgt ggc cat act ctt g gttagtagaa 503 Gln Gln Asn Gly Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu 100 105 110

cgccaacctg cttccctaac ttactgaaga aggaaaaccg aattgaccgt cccccaag 561

ta tgg cac tcg cag ctg ccc tcg tgg gtg age tcc ate acc gac aag 608 Val Trp His Ser Gln Leu Pro Ser Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Lys 115 120 125

aat acg ctg acc aac gtg atg aaa aat cac ate acc acc ttg atg acc 656

Asn Thr Leu Thr Asn Val Met Lys Asn His Ile Thr Thr Leu Met Thr 130 135 140

cgg tac aag ggc aag ate cgt gea tgg gtcagtcatc ctaccctàag 703

Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp

145 150

ctgcgtttca atgaagagac aaataagaac acacgtattt gcccgggcgt ttcagaatca 763 gaactgacag aatcactgaa tag gac gtg gtg aac gag gea ttc aac gag gat 816 Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Asn Glu Asp

155 160

ggc tcc etc cgc cág act gtc ttc etc aac gtc ate ggg gag gat tac 864

Gly Ser Leu Arg Gln Thr Val Phe Leu Asn Val Ile Gly Glu Asp Tyr 165 170 175

ate ccg att gct ttc cag acc gcc cgc gcc gct gac ccg aat gcc aag 912

Ile Pro Ile Ala Phe Gln Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn Ala Lys

180 185 190

ctg tac ate aac gat tac aa gtaagattta aggctcagtg atattccatt 962

Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn

195 200

tagtgtgaga agcattgctt atgagcatct gtattacag c ctc gac agt gcc tcg 1017

Leu Asp Ser Ala Ser 205

tac ccc aag acg cag gcc att gtc aac cgc gtc aag caa tgg cgt gea 1065 Tyr Pro Lys Thr Gln Ala Ile Val Asn Arg Val Lys Gln Trp Arg Ala 210 215 220

gct gga gtc ccg att gac ggc ata g gtatgtctct ctttctgttt 1110 Ala Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile 225 230

gtgatgtgac cgatttgaaa ccagtctaac gttagctggg tctag ga tcg caa acg 1166 Gly Ser Gln Thr

cac ctc ag gtaaataatc gggaatgcct cggagaataa aagagaaaaa 1214 His Leu Ser 235

aaatgattgt cttatcagat cgtatcgact gactcatggc ttgtccaaaa tag c gct 1271 Ala

ggt cag gga gcc ggt gtt cta caa taagtgcccc cctcccctat tttttactat 1325 Gly Gln Gly Ala Gly Val Leu Gln 240 245

tattgcgaga gcggaatagg ctgacaaccc caaacg gct ctt ccg ctc ctt gct 1379 Ala Leu Pro Leu Leu Ala 250

agt gcc gga act ccc gag gtc gct ate acg gaa ctg gac gtg gct ggt 1427 Ser Ala Gly Thr Pro Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Ala Gly 255 260 265

gct age ccg acg gat tàc gtc aat gtãtgtacct cgttgtccct atcccccttg 1481 Ala Ser Pro Thr Asp Tyr Val Asn 270 275

gatactttgt ataattatta tcttcccgga gcctgttgat cagatctgac gatcatttct 1541

cgttttttag gtc gtg aao gct tgc ctc aac gtg cag tcc tgc gtg ggc 1590 Val Val Asn Ala Cys Leu Asn Val Gln Ser Cys Val Gly 280 285

ate acc gtc tgg ggc gtg gea gat ccg gtaagcgcgg ttcttccgta 1637 Ile Thr Val Trp Gly Val Ala Asp Pro 290 295

ctccgtaccc aactagagtt cgggctgtca cgtcatgtct tagtcgtctt cagtcaggcc 1697

aaggccaaga cacaggacct gaaacgggca ggcagcagct gctagcagcc caagaagcag 1757

ccacatgatg catgattatt attattatat ctccgagttc tgggctaacg attggtgata 1817

ataaataaat ag gac tca tgg cgt gct age acg acg cct ctc ctc ttc gac 1868 Asp Ser Trp Arg Ala Ser Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asp 300 305 310

ggc aac ttc aac ccg aag ccg gcg tac aac gcc att gtg cag gac ctg Gly Asn Phe Asn Pro Lys Pro Ala Tyr Asn Ala Ile Val Gln Asp Leu

315 320 325

cag cag tgagtataga ccggtggatc c Gln Gln <210> 18 <211> 329 <212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus <400> 18

Met Val Arg Pro Thr Ile Leu Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ala Pro Phe 1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Pro Ile Leu Glu Glu Arg Gln Ala Ala Gln Ser Val

20 25 30

Asp Gln Leu Ile Lys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Phe Gly Val Ala Thr

35 40 45

Asp Gln Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asn Ala Ala Ile Ile Gln Ala

50 55 60

Asp Phe Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr 65 70 75 80

Glu Pro Ser Gln Gly Asn Phe Asn Phe Ala Gly Ala Asp Tyr Leu Val

85 90 95

Asn Trp Ala Gln Gln Asn Gly Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu Val

100 105 110

Trp His Ser Gln Leu Pro Ser Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Lys Asn

115 120 125

Thr Leu Thr Asn Val Met Lys Asn His Ile Thr Thr Leu Met Thr Arg

130 135 140

Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Ásn Glu Ala Phe Asn 145 150 155 160 Glu Asp Gly Ser Leu Arg Gln Thr Val Phe Leu Asn Val Ile Gly Glu

165 170 175

Asp Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Gln Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn

180 185 190

Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Pro

195 200 205

Lys Thr Gln Ala Ile Val .Asn Arg Val Lys Gln Trp Arg Ala Ala Gly

210 215 220

Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240

Gly Ala Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Leu Leu Ala Ser Ala Gly Thr

245 250 255

Pro Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Ala Gly Ala Ser Pro Thr

260 265 270

Asp Tyr Val Asn Val Val Asn Ala Cys Leu Asn Val Gln Ser Cys Val

275 280 285

Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ala Asp Pro Asp Ser Trp Arg Ala Ser

290 295 300

Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asri Phe Asn Pro Lys Pro Ala Tyr 305 310 315 320

Asn Ala Ile Val Gln Asp Leu Gln Gln 325

<210> 19 <211> 2955 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> CDS

<222> (1335)..(1671)

<223>

<220>

<221> íntron <222> (1672) .. (1806) <223> <220>

<221> CDS <222> (1807)..(2032) <223> <220>

<221> íntron <222> (2033)..(2117)

<223> <220>

<221> CDS <222> (2118)..(2802) <223> <400> 19

tctagagctg tcgacgcggc cgcgtaatac gactcactat agggcgaaga attcggatca 60

cgtttgcttc agcaagtcgt tcgctacgac accacgtcca tgatggaggc cctgattcaa 120

tcataccaag gacggggcat gatggctgat ggctggactc gaagtgagtg gcccgtggct 180

gaattttcct tcccgttctc tacagtcctt ccctcagcga cacatccgca gttttgacag 240

cggaaatcgt caggatgctc cgccttctct cgcaacctga gtgcccaggc gtctcggcca 300

ccgtctctta tatatggccg ctgggtccgc ctttcgatcg gttttcgatt tggtctctcc 360

tagttccctc agctgacccg ggatatcgct tgtggctccg aaacctcacc atcccagacg 42 0

agcaagttct ccgcagtcca cctcagctca tccggccctt ggtagcatcg cagcgacccc 480

agacgaaggc accaaagaag catactatat attaggctaa atcgagcccc acgtggaata 540

tttgccatcg aggaggggtg gttgggcttc ttgtcctcgc aggtgctgcg cctgtaccta 600

cctggtgctc cagctggtgc tcccgctggt gctgttccag tcgccgtctg gccccaatgc 660

tctgtatctc ggttcgtccc gcactccttt cgccaagcgc taccaatgct ttgacgaacc 720

cggtaaattt gcagtggacc tgcagctggg caaacccgca gtgggaacca cagacctggt 780

tcgttcgaca cactccaatc gcaaccccgc ccgcgcaaac cttgcaccac atgtcgcccc 840

tttcccagtt gggtccctga agacacggag ccacttccgt gatcgtcggc tccccaagcc 900

gacagtcgga cgctgcaata ggatgccagc acccgtggat ccaagggcca gtgaccccaa 960

ctctttcgcg gtattctggc cctcccaaag gtatgccagg acttccctgt ctttgctacc 1020 accagctctc ctccacggcg gaacggatac gccgtctcgc cggctcttgc tcgacaacat 1080 gcgagggggc gcgaaggcta ggttgtgacg atgcgacggt gcgatgtcac catttggcag 1140 tgatgttttc cgttgtcccc ttctccaccc tgcgccgttt cctcaaagac gccccaacca 1200 taaatacgat gcgacgccaa ccttcatgtg ttcgtggcat cttgcctgac cagtctcagc 1260 aagaaacctg tggcggcgcg attgtcttga ccttctgatt gaaaacggat ctgcgtcctc 1320 ctcgatagcc gacc atg cgc gcc aag caa ctc ctg gcg gcc ggc ctg ctg 1370 Met Arg.Ala Lys Gln Leu Leu Ala Ala Gly Leu Leu 1 5 10

gcc ccc gcg tcc gtc tcg gcc cag ctc aac age ctc gcc gtg gcg gct 1418

Ala Pro Ala Ser Val Ser Ala Glri Leu Asn Ser Leu Ala Val Ala Ala 15 20 25

ggc ctc aag tac ttc ggc acg gcc gtg cgg gag gcc aac gtc aac ggc 1466

Gly Leu Lys Tyr Phe Gly Thr Ala Val Arg Glu Ala Asn Val Asn Gly 30 35 40

gac gcc acc tac atg tcg tac gtc aac aac aag tcc gag ttc ggc cag 1514 Asp Ala Thr Tyr Met Ser Tyr Val Asn Asn Lys Ser Glu Phe Gly Gln 45 50 55 60

gtg acg ccc gag aac ggc cag aag tgg gat tcc acc gag ccc age cag 1562

Val Thr Pro Glu Asn Gly Gln Lys Trp Asp Ser Thr Glu Pro Ser Gln 65 70 75

' ggc cag ttc age tac age cag ggc gac ate gtc ccc ggc gtc gcg aag 1610

Gly Gln Phe Ser Tyr Ser Gln Gly Asp Ile Val Pro Gly Val Ala Lys

80 . 85 90

aag aac ggc cag. gtg ctg cgc tgc. cac acc ctg gtg tgg tac age cag 1658

Lys Asn Gly Gln Val Leu Arg Cys His Thr Leu Val Trp Tyr Ser Gln 95 100 105

ctc ccc age tgg g gtcagtgact ctctctttct ctctgtcttt ctctttgtct 1711

Leu Pro Ser Trp 110

ttctctcttt ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctccca tccagcatcg 1771 actgctgatc ttgctgacca gaagctcgtg tgcag tg tca tcc gga agt tgg 1823 Val Ser Ser Gly Ser Trp 115

acc cgc gcg acg ctt cag tcc gtc ate gag acg cac ate tcg aac gtg 1871

Thr Arg Ala Thr Leu Gln Ser Val Ile Glu Thr His Ile Ser Asn Val

120 125 130

atg ggc cac tac aag ggc cag tgc tac gcc tgg gac gtg gtc aac gag 1919

Met Gly His Tyr Lys Gly Gln Cys Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu 135 140 145 150

gcc ate aac gac gac ggc acg tgg cgg acc age gtc ttc tac aac acc 1967

Ala Xle Asn Asp Asp Gly Thir Tirp Axg Thr Seir Val Phe Tyir Asn Thr

155 160 165

ttc aac acc gac tac ctg gcc att gcc ttc aac gcc gcg aag aag gcc 2015

Phe Asn Thr Asp Tyr Leu Ala Ile Ala Phe Asn Ala Ala Lys Lys Ala 170 175 180

gat gcg ggc gcg aag ct gtaggtgtcg gcctttacgt tgccgcagcg 2062

Asp Ala Gly Ala Lys Leu 185

cacctccgcg acatgagccc cagagcgcgt ggctaatagt tcctcacgca cgcag g 2118

tac tac aac gac tac aat ctc gag tac aac ggc gcc aag acc aac acg 2166

Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu Glu Tyr Asn Gly Ala Lys Thr Asn Thr 190 195 200

gcc gtg cag ctg gtg cag ate gtg cag cag gcc ggc gcg ccc ate gac 2214

Ala Val Gln Leu Val Gln Ile Val Gln Gln Ala Gly Ala Pro Ile Asp 205 210 215 220

ggg gtg ggc ttc cag ggc cac ctg ate gtg ggg tca acg ccg tcg cgc 2262 Gly Val Gly Phe Gln Gly His Leu Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Arg

225 230 235

age tcc ctg gcc acg gcg ctg aag cgc ttc acg gcg ctt ggc ctg gag 2310

Ser Ser Leu Ala Thr Ala Leu Lys Arg Phe Thr Ala Leu Gly Leu Glu

240 245 250

gtg gcg tac acg gag ctg gac ate cgg cac tcg age ctg ccg ccg tcg 2358 Val Ala Tyr Thr Glu Leu Asp Ile Arg His Ser Ser Leu Pro Pro Ser

255 260 265

tcg gcg gcg ctg gcg acg cag ggc aac gac ttc gcc age gtg gtg ggc 2406 Ser Ala Ala Leu Ala Thr Gln Gly Asn Asp Phe Ala Ser Val Val Gly 270 275 280

tcg tgc ctc gac gtg gcg ggc tgc gtg ggc ate acc ate tgg ggg ttc 2454 Ser Cys Leu Asp Val Ala. Gly Cys Val Gly Ile Thr Ile Trp Gly Phe 285 290 295 300

acg gac aag tac age tgg gtg ccc gac acg ttc ccc ggc tcg ggc gcg 2 502 Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro Asp Thr Phe Pro Gly Ser Gly Ala

305 310 315

gcg ctg ctg tac gac gcg aac tac age aag aag ccg gcg tgg acg tcg 2550 Ala Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Ser Lys Lys Pro Ala Trp Thr Ser 320 325 330

gtc tcg tcg gtg ctg gcg gcc aag gcg acg aac ccg ccc ggc ggc ggg 2598 Val Ser Ser Val Leu Ala Ala Lys Ala Thr Asn Pro Pro Gly Gly Gly

335 340 345

aac cca ccc ccc gtc acc acc acg acc acg acc acg acc acg tcg aag 2 646

Asn Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys 350 355 360

ccg tcg cag ccc acc acc acg acc acg acc acc age ccg cag ggt ccg 2694

Pro Ser Gln Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Pro Gln Gly Pro 365 37-0 375 380

cag cag acg cac tgg ggc cag tgc. ggc ggg ate ggc tgg acg ggg ccg 2742 Gln Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro

385 390 395

cag tcg tgc cag age ccg tgg acg tgc cag aag cag aac gac tgg tac 2790 Gln Ser Cys Gln Ser Pro Trp Thr Cys Glrl Lys Gln Asn Asp Trp Tyr 400 405 410

tet cag tgc ctg tgaccaccac ggctgaccag ctgccattcc gaccacgggg 2842

Ser Gln Cys Leu 415 cccggactac aaaaagaggg gacggtgtaa ataaagagcc gaacgggtct acgtacactg ttttgacctt ttctccgcag acgtatatta tcaattatag ttggatttct aga <210> 20 <211> 416 <212> PRT

<213> Acremonium thermophilum <400> 20

Met Arg Ala Lys Gln Leu Leu Ala Ala Gly Leu Leu Ala Pro Ala Ser 1 5 10 15

Val Ser Ala Gln Leu Asn Ser Leu Ala Val Ala Ala Gly Leu Lys Tyr

20 25 30

Phe Gly Thr Ala Val Arg Glu Ala Asn Val Asn Gly Asp Ala Thr Tyr

35 40 .45

Met Ser Tyr Val Asn Asn Lys Ser Glu Phe Gly Gln Val Thr Pro Glu

50 55 60

Asn Gly Gln Lys Trp Asp Ser Thr Glu Pro Ser Gln Gly Gln Phe Ser 65 70 75 80

Tyr Ser Gln Gly Asp Ile Val Pro Gly Val Ala Lys Lys Asn Gly Gln

85 90 95

Val Leu Arg Cys His Thr Leu Val Trp Tyr Ser Gln Leu Pro Ser Trp

100 105 110

Val Ser Ser Gly Ser Trp Thr Arg Ala Thr Leu Gln Ser Val Ile Glu

115 120 125

Thr His Ile Ser Asn Val Met Gly His Tyr Lys Gly Gln Cys Tyr Ala

130 135 140

Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Ile Asn Asp Asp Gly Thr Trp Arg Thr 145 150 155 160

Ser Val Phe Tyr Asn Thr Phe Asn Thr Asp Tyr Leu Ala Ile Ala Phe

165 170 175

Asn Ala Ala Lys Lys Ala Asp Ala Gly Ala Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp 180 185 190 Tyr Asn Leu Glu Tyx Asn Gly Ala Lys Thr Asn Thr Ala Val Gln Leu

195 200 205

Val Gln Ile Val Gln Gln Ala Gly Ala Pro Ile Asp Gly Val Gly Phe

210 215 220

Gln Gly His Leu Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Arg Ser Ser Leu Ala 225 230 235 240

Thr Ala Leu Lys Arg Phe.Thr Ala Leu Gly Leu Glu Val Ala Tyr Thr

245 250 255

Glu Leu Asp Ile Arg His Ser Ser Leu Pro Pro Ser Ser Ala Ala Leu

260 265 270

Ala Thr Gln Gly Asn Asp Phe Ala Ser Val Val Gly Ser Cys Leu Asp

275 280 285

Val Ala Gly Cys Val Gly Ile Thr Ile Trp Gly Phe Thr Asp Lys Tyr

290 295 300

Ser Trp Val Pro Asp Thr Phe Pro Gly Ser Gly Ala Ala Leu Leu Tyr 305 310 · 315 320

Asp Ala Asn Tyr Ser Lys Lys Pro Ala Trp Thr Ser Val Ser Ser Val

325 330 335

Leu Ala Ala Lys Ala Thr Asn Pro Pró Gly Gly Gly Asn Pro Pro Pro

340 345 350

Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Pro Ser Gln Pro

355 360 365

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Pro Gln Gly Pro Gln Gln Thr His

370 375 380

Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Gln Ser Cys Gln 385 390 395 400

Ser Pro Trp Thr Cys Gln Lys Gln Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 405 410 415

<210> 21 <211> 5092 <212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223 > <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223>

CDS

(669)..(728)

Intron (729) .. (872)

CDS

(873)..(1015)

Intron (1016)..(1082)

CDS

(1083)..(1127) íntron

(1128)..(1183) CDS

(1184)..(1236) íntron

(1237)..(1300) <220>

<221> CDS

<222> (1301) .. (1717) <223>

<220>

<221> íntron <222> (1718)..(1776) <223> <220> <221> CDS

<222> (1777)..(2489)

<223>

<220>

<221> íntron

<222> (2490).. (2599) <223> <220>

<221> CDS

<222> (2600)..(3469)

<223> <220>

<221> íntron

<222> (3470) . . (3531) >

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (3532) .. (3759)

<223>

<400> 21

ggatccgtcc gcggacaCag gcagagagac ggcacgggga ctcgacctga tcctcccagg 60 gcggggtgtt gtttgtggcg agggagcgat gctgatgttc ttccagctcc gttgctacct 120 tcccacggcc atttagccgg cggacggcat gtaacatgtc aaacatgtgg gctcggcagt 180 gggggcgtga gacgcagcac ctgacccggc ggcgcggcgc ttgcagggtc cagggacagc 240 cggccgtggt cgtttgcggg gaaggcgaca cagacgactt ggcgcggccc gccggaaggc 300 gaggaatcat gagtgcgacg gagacatggc aagaccacgg ccttcctggc gaagaagaag 360 atgaataatc gcaggggcag tgtggcatgg accgcacggc cgccagggac ctgccccgtg 420 aggtttctcg ggtgtttcca ctggttccat.cgctgggggc gatcccgagc ccgtgtgccc 480 gtgtaactat tattgacgat caacatgcca tggccagcca gcttctataa taatcatata 540 taacaccccc cgttctcccg ctgccttgct ccgtggtctt cctggtcctg cttgaggttc 600 acgagtctcc ttgcatggtc aactcgtcct ctgcttcatc cgctgcttga ctccgtacct 660 cagcaacc atg agg ctt ggg tgg ctg gag ctg gcc gtc gcg gcg gcc gca 710 Met Arg Leu Gly Trp Leu Glu Leu Ala Val Ala Ala Ala Ala

1 .5 10

acc gtc gcc age gcc aag gtgcgtcaga ccctcccccg gatcgacctt 758

Thr Val Ala Ser Ála Lys 20

15 taggtgcttc ttcagcaagt gcgcgccggc cgcgacatcc gccgccgctg ccctcaccga 818 cgcagcaccc atatgcagca ggagagaagg catctctgac gaaagctccc ccag gat 875

Asp

gac ttg gcc tac tcg ccg cct ttc tac ccg tcg cca tgg atg aac gga 923

Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Trp Met Asn Gly 25 30 35

aac gga gag tgg gcg gag gcc tac cgc agg gct gtc gac ttc gtc tcg 971

Asn Gly Glu Trp Ála Glu Ala Tyr Arg Arg Ala Val Asp Phe Val Ser

40 45 50

cag ctg acc ctc gcg gag aag gtc aac ctg acg acc ggt gtc gg 1015

Gln Leu Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Val Gly 55 60 65

gtgagtccat tgacctctac cgagcccccg ttccatgtcc attgagcaat tggctgacgt 1075 cttgaag c tgg atg cag gag aaa tgt gtc ggt gaa acg ggc age att ccg 1125 Trp Met Gln Glu Lys Cys Val Gly Glu Thr Gly Ser Ile Pro

70 75 . 80

ag gtaggctcac ttcccaatgc cgctgcaaag gaggtgtcta aactggaata aatcag 1183 Arg

a ctg ggg ttc cgt gga ctg tgc ctc çaa gac tcg ccc ctt ggt gtc aga 1232 Leu Gly Phe Arg Gly Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu Gly Val Arg 85 90 95

ttt g gtaggtcttt caacagagaa caagggtcgt cgcgggagag atgctgatcg 1286 Phe 100

atacctactt ttag ct gac tac gtt tct gcc ttc ccc gcc ggt gtc aat 1335

Ala Asp Tyr Val Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn 105 110

gtc gct gca acg tgg gat aag aac ctc gcc tac ctt cgt ggg aag gcg 1383

Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala

115 120 125

atg ggt gag gaa cac cgt ggt aag ggc gtc gac gtc cag ctg gga cct 1431

Met Gly Glu Glu His Arg Gly Lys Gly Val Asp Val Gln Leu Gly Pro 130 135 140

gtc gcc ggc cct ctt ggc aga cac ccc gac ggt ggc aga aac tgg gag 1479

Val Ala Gly Pro Leu Gly Arg His Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu 145 150 155 160

ggt ttc tct cct gac ccc gtc ctg acc ggt gtg ctt atg gcg gag acg 1527

1 Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Met Ala Glu Thr

165 170 175

ate aag ggt ate cag gat gcc ggt gtg att gct tgc gcc aag cac ttc 1575

Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Cys Ala Lys His Phe

180 185 190

att ggt aac gag atg gag cac ttc cgg caa gcc ggt gag gct gtt ggc 1623

Ile Gly Asn Glu Met Glu His Phe Arg Gln Ala Gly Glu Ala Val Gly

195 200 205

tat ggt ttc gat att acc gag agt gtc age tca aat ate gac gac aag 1671

Tyr Gly Phe Asp Ile Thr Glu Ser Val Ser Ser Asn Ile Asp Asp Lys 210 215 220

acg ctt cac gag ctg tac ctt tgg ccc ttt gcg gat gct gtt cgc g 1717 Thr Leu His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg 225 230 235

gtaagcagtc cccccctcat aggtgattgt acatgtgtat ttctgactcg ctttcaaag 1776 ct ggc gtt ggt tcg ttc atg tgc tcc tac aac cag gtt aac aac age 1823 Ala Gly Val Gly Ser Phe Met Cys Ser Tyr Asn Gln Val Asn Asn Ser

245 250 255

tac age tgc tcg aac age tac ctc cta aac aag ttg ctc aaa tcg gag 1871

Tyr Ser Cys Ser Asn Ser Tyr Leu Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ser Glu 260 265 270

ctt gat ttt cag ggc ttc gtg atg agt gac tgg gga gcg cac cac age 1919 Leu Asp Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Gly Ala His His Ser

275 280 285

ggc gtt gga gct gcc ctg gct ggc ctt gac atg tcg atg cca gga gac 1967

Gly Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp 290 295 300

acc gcc ttt ggt acc ggc aaa tcc ttc tgg gga acc aac ctg acc ate 2015 Thr Ala Phe Gly Thr Gly Lys Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile

305 310 315

gcc gtt ctc aac ggt act gtt ccg gaa tgg cgt gtg gat gac atg gct 2063 Ala Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Glu Trp Arg Val Asp Asp Met Ala 320 325 330 335

gtt cgc ate atg gcg gcc ttt tac aag gtt ggt cgc gac cgt tac cag 2111

Val Arg Ile Met Ala Ala Phe Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Tyr Gln 340 345 350

gtg ccg gtc aac ttc gac tcg tgg acg aag gat gaa tac ggt tac gag 2159 Val Pro Val Asn Phe Asp Ser Trp Thr Lys Asp Glu Tyr Gly Tyr Glu

355 360 365

cac gea ctg gtt ggc cag aac tat gtc aag gtc aat gac aag gtg gat 2207

His Ala Leu Val Gly Gln Asn Tyr Val Lys Val Asn Asp Lys Val Asp 370 375 380

gtt cgt gcc gac cat gcg gac ate ate cgt caa att ggg tet gct agt 2255 Val Arg Ala Asp His Ala Asp Ile Ile Arg Gln Ile Gly Ser Ala Ser

385 390 395

gtt gtc ctt ctt aag aac gat gga gga ctc cca ttg acc ggc tat gaa 2303

Val Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Gly Leu Pro Leu Thr Gly Tyr Glu 400 405 410 415

aag ttc acc gga gtt ttt gga gag gat gcc gga tcg aac cgt tgg ggc 2351

Lys Phe Thr Gly Val Phe.Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Arg Trp Gly

420 425 430

gct gac ggc tgc tct gat cgt ggt tgc gac aac ggc acg ttg gca atg 2399

Ala Asp Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met 435 440 445

ggt tgg ggc agt ggc act gct gac ttc ccc tac ctt gtc act ccc gag 2447

Gly Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asp Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu

450 455 460

cag gca ate cag aat gaa ate ctt tcc aag ggg aag ggg tta 2489

Gln Ala Ile Gln Asn Glu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Gly Leu

465 470 475

gtgagtgctg tcaccgacaa tggtgccctt gaccagatgg aacaggttgc gtctcaggcc 2 549

aggtattcct tcctccgtat ccctagcaat cgaatctcca ctgactttag gac age 2605

Asp Ser

' gtt tct ate gtt ttc gtc aac gcc gac tct ggt gaa ggc tac ate aac 2653

Val Ser Ile Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn 480 485 490 495

gtt gat ggc aac gaa ggt gat cgg aag aac ctc acc ctc tgg aaa gga 2701

Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp. Lys Gly

500 505 510

ggc gag gag gtg ate aag act gtt gca gcc aac tgc aac aac acc att 2749

Gly Glu Glu Val Ile Lys Thr Val Ala Ala Asn Cys Asn Asn Thr Ile 515 520 525

gtt gtg atg cac act gtg gga cct gtc ttg ate gat gag tgg tat gac 2797

Val Val Met His Thr Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Glu Trp Tyr Asp

530 535 540 aac ccc aac gtc Asn Pro Asn Val 545

age ggc aac agt Ser Gly Asn Ser 560

gga aag acg ccg Gly Lys Thr Pro

cct ctg ctc acc Pro Leu Leu Thr 595

ttc acc gag ggc Phe Thr Glu Gly 610

gag acg ccc ate Glu Thr Pro Ile 62 5

gaa tac tcg aac Glu Tyr Ser Asn 640

cca gcc tcc ggc Pro Ala Ser Gly

acg gac tat gea Thr Asp Tyr Ala 675

tta tac ate tat Leu Tyr Ile Tyr 690

cgg cga tcc cga

acc gcc ate gtc Thr Ala Ile Val 550

ctc gtc gat gtg Leu Val Asp Val 565

ttt acg tgg gga Phe Thr Trp Gly 580

aaa ccc aac aac Lys Pro Asn Asn

gtc ttc ate gac Val Phe Ile Asp 615

tat gag ttc ggg Tyr Glu Phe Gly 630

ate tac gtc cag Ile Tyr Val Gln 645

age acc aag gcg Ser Thr Lys Ala 660

gat tac ttg tac Asp Tyr Leu Tyr

cct tgg ctt aac Pro Trp Leu Asn 695

ctt acg gaa atg

tgg gcc ggt ctt Trp Ala Gly Leu 555

ctc tac ggc cgt Leu Tyr Gly Arg 570

aag act cgc gag Lys Thr.Arg Glu 585

ggc aag ggt gct Gly Lys Gly Ala 600

tac aga agg ttc Tyr Arg Arg Phe

ttt ggt ctg agt Phe Gly Leu Ser 635

ccc ctt aac gea Pro Leu Asn Ala 650

gct cct acc ttt Ala Pro Thr Phe 665

cct gag gat ata Pro Glu Asp Ile 680

acg acg gac ccc Thr Thr Asp Pro

aag gcc gag gac

cca ggc cag gag Pro Gly Gln Glu

gtc age ccc gga Val Ser Pro Gly 575

tcg tac ggc gct Ser Tyr Gly Ala 590

ccc cag gac gac Pro Gln Asp Asp 605

gac aag tac aac Asp Lys Tyr Asn 620

tat act act ttt Tyr Thr Thr Phe

cga cct tac acc Arg Pro Tyr Thr 655

ggg aat ate age Gly Asn Ile Ser 670

cac aag gtc cca His Lys Val Pro 685

gaa gaa gtc ctc Glu Glu Val Leu 700

tac ate cca tet Arg Arg Ser Arg Leu Thr Glu Met Lys Ala Glu Asp Tyr Ile Pro Ser

705 710 715

ggc gcg act gat gga tct cct cag ccc ate ctt ccg gea ggc ggt gct 3373

Gly Ala Thr Asp Gly Ser Pro Gln Pro Ile Leu Pro Ala Gly Gly Ala 720 725 730 735

cct ggt ggc aac ccg ggt ctc tat gat gag atg tac agg gta tct gea 3421 Pro Gly Gly Asn Pro Gly.Leu Tyr Asp Glu Met Tyr Arg Val Ser Ala

740 745 750

ate ate acc aac acc ggt aac gtt gtt ggt gat gag gtt cct cag ctg 3469 Ile Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Val Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu 755 760 765

gtgagtttcg cagtctcatt gatatatgtc tttcgagttg gtcactgacc cgcgatctat 3529 ag tat gtc tct ctt ggt ggt cca gat gac ccc aag gtc gtg ctc cgc 3576

Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asp Asp Pro Lys Val Val Leu Arg 770 775 780

aac ttt gac cgc ate acg ctc cac ccc ggc caa cag aca atg tgg acc 3624

Asn Phe Asp Arg Ile Thr Leu His Pro Gly Gln Gln Thr Met Trp Thr

785 790 795

acg aca ttg acg cga cgc gat ate tcg aac tgg gac cct gcc tcc cag 3672 Thr Thr Leu Thr Arg Arg Asp Ile Ser Asn Trp Asp Pro Ala Ser Gln 800 805 810

aat tgg gtt gtg acc aaa tat ccc aag aca gtc tac ate ggc age tct 3720 Asn Trp Val Val Thr Lys Tyr Pro Lys Thr Val Tyr Ile Gly Ser Ser 815 820 825 830

tcg cgg aaa ctg cac ctg cag gea ccg ctt ccc cct tac tgaggtttta 3769

Ser Arg Lys Leu His Leu Gln Ala Pro Leu Pro Pro Tyr

835 840

tccggaagga ggaagtaaaa acacaatgtt ttagttgtac aggcgtcttt cgtttgtgat 3829 tatccatagg catatcaaga ccactttggg ttatatatat atatatatat ataagcggcc 3889 gaggaaaggc aatgggtagc atggttcaag gggaggaacc gtcttgaaac tactctcaat 3949 ttctttcagt agatagtgca ctccggttga gtcccaaata tagttttaat aatggtaaat 4009 ggttcagaaa aagaaaatgt agaggtttca aacacgctag ttgaccctga taggaattga 4069 gcatgaatgc ctacacattc caagtcgtgt tagcgagtcg atagccgatg aacctattcc 4129

gtaggttgag gttcacccta caaataagcc aggatttaag taaatacctg ctcgtgaaat 4189

ctacaacgca tcagatcaga ggaaaattca aatggcagaa gtgcgagcac ctcggtgaga 4249

agagatcgag ctgtcgaagt cggctggaac acaggtaaag agaagtaata caattcattg 4309

atttttacat cgtttaacat gtagaaggta tctaaaatag taagtccaga tatgggccat 4369

ggagatcgcc tcggcgatct tcgggagtat ctcgggagac gcacatgacc gcgcttaacc 4429

ctgtcggttg gacccgagtc cgaccgacgt catcagcgca gcgcaggtca ggctgcgcgc 4489

aacgtcaatg ccagggggtg ctgggacagt tgcatatcaa tcgatcagtc aattaaagca 4549

tctgctttcc acgttctttt tttatcacct ttcacttccc ctgtcccact tgccttggga 4609

ttgttgagcc caaagaagaa ggagaagaaa atgggctcga caccccggaa cgggtggtcg 4669

acgagcacat catcagcagç gtcttattat caacattcçc aaccaccggc cctcgttctc 4729

ctcgtctacc cgctcactct cctcctcggc tccctgtaca gagccatttc ccccaccgcg 4789

cgggtgaggc acgatgctgc agaccctgct ctggccccga ccatagcgtc cgacatcaac 4849

ctgtcccagt catcccggta ttcccattcc catagcaaca gcaacagccc ggtcaattac 4909

ttcgcccgca aggacaacat ctttaacgtc tacttcgtca agatcggctg gttctggacg 4969

accctcgcct tcctcacgtt actcctcacc cagcctgcct acacaaacgc cggtcccctg 5029

cgcgcccgac gcaccctcca agccctgtcc cgctacgcca tcgtcaccct actacctgga 5089

tcc 5092

<210> 22

<211> 843

<212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus

<400> 22

Met Arg Leu Gly Trp Leu Glu Leu Ala Val Ala Ala Ala Ala Thr Val

1 5 10 15

Ala Ser Ala Lys Asp Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser

20 25 30

Pro Trp Met Asn Gly Asn Gly Glu Trp Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Ala 35 40 45

30 Val Asp Phe Val Ser Gln Leu Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr 50 55 60 Thr Gly Val Gly Trp Met Gln Glu Lys Cys Val Gly Glu Thr Gly Ser 65 70 75 80

Ile Pro Arg Leu Gly Phe Arg Gly Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu 85 90 95

Gly Val Arg Phe Ala Asp Tyr Val Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn 100 105 110

Val Ala Ala Thr Trp Asp . Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala 115 120 125

Met Gly Glu Glu His Arg Gly Lys Gly Val Asp Val Gln Leu Gly Pro 130 135 140

Val Ala Gly Pro Leu Gly Arg His Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu 145 150 155 160

Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Met Ala Glu Thr 165 170 175

Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Cys Ala Lys His Phe 180 185 190

Ile Gly Asn Glu Met Glu His Phe Arg Gln Ala Gly Glu Ala Val Gly 195 200 205

Tyr Gly Phe Asp Ile Thr Glu Ser Val Ser Ser Asn Ile Asp Asp Lys 210 215 220

Thr Leu His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala 225 230 . 235 240

Gly Val Gly Ser Phe Met Cys Ser Tyr Asn Gln Val Asn Asn Ser Tyr 245 250 255

Ser Cys Ser Asn Ser Tyr Leu Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ser Glu Leu 260 265 270

Asp Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Gly Ala His His Ser Gly 275 280 285

Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Thr 290 295 300

Ala Phe Gly Thr Gly Lys Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ala 305 310 315 320 Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Glu Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val

325 330 335

Arg Ile Met Ala Ala Phe Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Tyr Gln Val

340 345 350

Pro Val Asn Phe Asp Ser Trp Thr Lys Asp Glu Tyr Gly Tyr Glu His

355 360 365

Ala Leu Val Gly Gln Asn Tyr Val Lys Val Asn Asp Lys Val Asp Val

370 375 380

Arg Ala Asp His Ala Asp Ile Ile Arg Gln Ile Gly Ser Ala Ser Val 385 390 395 400

Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Gly Leu Pro Leu Thr Gly Tyr Glu Lys

405 410 415

Phe Thr Gly Val Phe Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Arg Trp Gly Ala

420 425 430

Asp Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly

435 440 445

Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asp Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln

450 455 460

Ala Ile Gln Asn Glu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Gly Leu Asp Ser Val 465 470 475 480

Ser Ile Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn Val

485 490 495

Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp Lys Gly Gly

500 505 510

Glu Glu Val Ile Lys Thr Val Ala Ala Asn Cys Asn Asn Thr Ile Val

515 520 525

Val Met His Thr Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Glu Trp Tyr Asp Asn

530 535 540

Pro Asn Val Thr Ala Ile Val Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser 545 550 555 560

Gly Asn Ser Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Ser Pro Gly Gly 565 570 575 Lys Thr Pro Phe Thr 580

Leu Leu Thr Lys Pro 595

Thr Glu Gly Val Phe 610

Thr Pro Ile Tyr Glu 625

Tyr Ser Asn Ile Tyr 645

Ala Ser Gly Ser Thr 660

Asp Tyr Ala Asp Tyr 675

Tyr Ile Tyr Pro Trp 690

Arg Ser Arg Leu Thr 705

Ala Thr Asp Gly Ser 725

Gly Gly Asn Pro Gly 740

Ile Thr Asn Thr Gly 755

Val Ser Leu Gly Gly 770

Asp Arg Ile Thr Leu 785

Leu Thr Arg Arg Asp 805

Val Val Thr Lys Tyr 820

177

Trp Gly Lys Thr Arg Glu 585

Asn Asn Gly Lys Gly Ala 600

Ile Asp Tyr Arg Arg Phe 615

Phe .Gly Phe Gly Leu Ser 630 635

Val Gln Pro Leu Asn Ala 650

Lys Ala Ala Pro Thr Phe 665

Leu Tyr Pro Glu Asp Ile 680

Leu Asn Thr Thr Asp Pro 695

Glu Met Lys Ala Glu Asp 710 715

Pro Gln Pro Ile Leu Pro 730

Leu Tyr Asp Glu Met Tyr 745

Asn Val Val Gly Asp Glu 760

Pro Asp Asp Pro Lys Val 775

His Pro Gly Gln Gln Thr 790 795

Ile Ser Asn Trp Asp Pro 810

Pro Lys Thr Val Tyr Ile 825

Ser Tyr Gly Ala Pro 590

Pro Gln Asp Asp Phe 605

Asp Lys Tyr Asn Glu 620

Tyr Thr Thr Phe Glu 640

Arg Pro Tyr Thr Pro 655

Gly Asn Ile Ser Thr 670

His Lys Val Pro Leu 685

Glu Glu Val Leu Arg 700

Tyr Ile Pro Ser Gly 720

Ala Gly Gly Ala Pro 735

Arg Val Ser Ala Ile 750

Val Pro Gln Leu Tyr 765

Val Leu Arg.Asn Phe 780

Met Trp Thr Thr Thr 800

Ala Ser Gln Asn Trp 815

Gly Ser Ser Ser Arg 830 Lys Leu His Leu Gln Ala Pro Leu Pro Pro Tyr

835 840

<210> 23

<211> 3510

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> CDS

<222> (391) . . (447) <223> <220>

<221> íntron

<222> (448)..(539) <223>

<220>

<221> CDS <222> (540)..(685) <223> <220> <221> íntron

<222> (686)..(759)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (760)..(1148) <223> <220>

<221> íntron <222> (1149)..(1217)

<223> <220>

<221> CDS <222> (1218)..(3208)

<223>

<400> 23

gcaggtagct acgacattcg acggtccacg cccagtggcg tctgctcggc cgtctgggaa 60 ccatgcacgc ccgcctctta ggtcgagcga ggtataacat actatctgca cggctaccta 120 tatattacgt cgatgtcacc cgcaggatgc gagcaccatt acttcgtgtc tcacccgccc 180 ttccgctccg catctcgtga acctaaaccc acgcgggcac actgcttctt gtgagagcct 240 ctacccgttc cacaagagcc atagctagag agagaagggc agccaaggga ccggtcaagc 300 ggcgctcttc atcgcaccaa tctcgacaac ccggcagacg tcaccaccgg ctcccgçcgc 360 acgacgtcac acgggactga ctacgaagac atg agg cag gcc ctt gtt tcg ctg 414

Met Arg Gln Ala Leu Val Ser Leu 1 5

gcc ttg ctg gcc age age cct gtt tcg gcg gcg gtgaccgcca gggacgccca 467 Ala Leu Leu Ala Ser Ser Pro Val Ser Ala Ala

15 10 15

ggtatggtcc caactgctct tcctccctgt ttcctcctct accggtgctg acaacgacaa 527 tagctgcacc ag cga gaa ctc gcc act tcc gac cct ttc tat cct tcg cca 578 Arg Glu Leu Ala Thr Ser Asp Pro Phe Tyr Pro Ser Pro 20 25 30

tgg atg aac cct gaa gcc aat ggc tgg gag gac gcc tac gcc aag gcc 626

Trp Met Asn Pro Glu Ala Asn Gly Trp Glu Asp Ala Tyr Ala Lys Ala 35 40 45

aag gcg ttc gtt tcc cag ctg acg ctc ttg gaa aag gtc aac ctg acg 674

Lys Ala Phe Val Ser Gln Leu Thr. Leu Leu Glu Lys Val Asn Leu Thr

25 50 55 60

act ggc ate gg gtgagtçttg ttctctcctg tagaaccgcc taccagaaga 725

Thr Gly Ile Gly 65

cattcaggaa gtgctaatga tgggcggttg acag c tgg caa gga gga caa tgc 778

Trp Gln Gly Gly Gln Cys

70

gtg ggc aac gtc ggt tcc gtc ccg cgt ctc ggc ctt cgc age ctg tgc 826 Val Gly Asn Val Gly Ser Val Pro Arg Leu Gly Leu Arg Ser Leu Cys 75 80 85 90

atg cag gac tcc ccc gtg ggt ate cgc ttt ggg gac tac gtc tcc gtc 874 Met Gln Asp Ser Pro Val Gly Ile Arg Phe Gly Asp Tyr Val Ser Val 95 100 105

ttc ccc tet ggt cag acc acg gct gcc acc ttc gac aag ggt ctg atg 922 Phe Pro Ser Gly Gln Thr Thr Ala Ala Thr Phe Asp Lys Gly Leu Met 110 115 120

aac cgt cgc ggc aat gcc atg ggc cag gag cac aaa gga aag ggt gtc 970 Asn Arg Arg Gly Asn Ala Met Gly Gln Glu His Lys Gly Lys Gly Val 125 130 135

aac gtc ctg ctc ggc ccg gtc gct ggc ccc att ggc cgt acg ccc gag 1018 Asn Val Leu Leu Gly Pro Val Ala Gly Pro Ile Gly Arg Thr Pro Glu 140 145 150

ggg gga cga aac tgg gag ggc ttc tcc ccc gac ccc gtc cta acg ggt 1066 Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly 155 160 165 170

att gcc ttg gcc gaa acg ate aag gga ate cag gat gct ggt gtc att 1114 Ile Ala Leu Ala Glu Thr Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile 175 180 185

gct tgc gcc aag cat ttc ate gcg aac gaa cag g gtgcgtgatg 1158 Ala Cys Ala Lys His Phe Ile Ala Asn Glu Gln 190 195

gaacgcggga cgtgctctga tgcaaaccca cgagcactga ccacgctttc ctcgaacag 1217

aa cac ttc cgc cag tcc ggc gag gcc cag ggc tac ggc ttt gac ate 1264

Glu His Phe Arg Gln Ser Gly Glu Ala Gln Gly Tyr Gly Phe Asp Ile 200 205 210

tcc gag tcg ctg tcg tcc aac ate gac gac aag acc atg cac gag ctg 1312 Ser Glu Ser Leu Ser Ser Asn Ile Asp Asp Lys Thr Met His Glu Leu 215 220 225

tat ctg tgg ccc ttc gcc gac ggc gtg cgt gcc ggc gtc ggc gcc ate 1360 Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Gly Val Arg Ala Gly Val Gly Ala Ile 230 235 240 245

atg tgc tcg tac aac cag ate aac aac tcg tac ggg tgc cag aac tcc 1408 Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Gln Asn Ser 250 255 260

aag acc ctg aac aac ctg ctc aag aac gag ctc ggc ttc cag ggc. ttc 1456

Lys Thr Leu Asn Asn Leu . Leu Lys Asn Glu Leu Gly Phe Gln Gly Phe

265 270 275

gtc atg age gac tgg cag gcc cag cac acc ggc gcg gcc ãgc gcc gtc 1504 Val Met Ser Asp Trp Gln Ala Glri His Thr Gly Ala Ala Ser Ala Val 280 285 290

gcc ggc ctg gac atg acc atg ccc ggc gac acc age ttc aac acc ggc 1552 Ala Gly Leu Asp Met Thr Met Pro Gly Asp Thr Ser Phe Asn Thr Gly 295 300 305

ctc age tac tgg ggc acg aac ctc acc ctc gcc gtc ctg aac ggc acc 1600 Leu Ser Tyr Trp Gly Thr Asn Leu Thr Leu Ala Val Leu Asn Gly Thr 310 315 320 325

gtc ccc gag tac cgc ate gac gac atg gtc atg cgc ate atg gcc gcc 1648

Val Pro Glu Tyr Arg Ile Asp Asp Met Val Met Arg Ile Met Ala Ala 330 335 340

1 ttc ttc aag acc ggc cag acc ctg gac ctg ccg ccc ate aac ttc gac 1696

Phè Phe Lys Thr Gly Gln Thr Leu Asp Leu Pro Pro Ile Asn Phe Asp

345 350 355

tcg tgg acc acc gac acc ttc ggc ccg ctc cac ttc gcc gtc aac gag 1744

Ser Trp Thr Thr Asp Thr Phe Gly Pro Leu His Phe Ala Val Asn Glu 360 365 370

gac cgc cag cag ate aac tgg cac gtc aac gtc cag gac aac cat ggc 1792

Asp Arg Gln Gln Ile Asn Trp His Val Asn Val Gln Asp Asn His Gly 375 380 385

age ctc ate cgc gatj ate gcg gcc aag gga acc gtc ctg ctg aag aac 1840 Ser Leu Ile Arg Glu Ile Ala Ala Lys Gly Thr Val Leu Leu Lys Asn 390 395 400 405 acc ggg tcc ctc ccg ctc aac aag ccc aag ttc ctc gtc gtg gtc ggc 1888 Thr Gly Ser Leu Pro Leu Asn Lys Pro Lys Phe Leu Val Val Val Gly

410 415 420

gac gac gcg ggc ccc aac ccg gcg gga ccc aac gcc tgc ccc gac cgc 1936 5 Asp Asp Ala Gly Pro Asn Pro Ala Gly Pro Asn Ala Cys Pro Asp Arg 425 430 435

gga tgc gac gtc ggc acc ctc ggc atg gcc tgg ggc tcc ggc tcg gcc 1984

Gly Cys Asp Val Gly Thr Leu Gly Met Ala Trp Gly Ser Gly Ser Ala 440 445 450

10 aac ttc ccc tac ctg ate acc ccg gac gcc gcg ctg cag gcg cag gcg 2032 Asn Phe Pro Tyr Leu Ile Thr Pro Asp Ala Ala Leu Gln Ala Gln Ala

455 460 465

ate aag gac ggc acc cgc tac gag age gtg ctg tcc aac tac cag ctc 2080

Ile Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Glu Ser Val Leu Ser Asn Tyr Glri Leu 15 470 475 480 485

gac cag acc aag gcg ctg gtc acc cag gcc aac gcc acg gcc ate gtc 2128

Asp Gln Thr Lys Ala Leu Val Thr Gln Ala Asn Ala Thr Ala Ile Val

490 495 500

ttc gtc aac gcc gac tcg ggc gag ggc tac ate aac gtc gac ggc aac 2176 20 Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn Val Asp Gly Asn 505 510 515

gag ggc gac cgc aag aac ctc acg ctc tgg cac gac ggc gac gcc ctg 2224

Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp His Asp Gly Asp Ala Leu 520 525 530

25 ate aag age gtg gcc ggc tgg aac ccg aac acc ate gtc gtc ate cac 2272 Ile Lys Ser Val Ala Gly Trp Asn Pro Asn Thr Ile Val Val Ile His

535 540 545

tcg acc ggc ccc gtc ctc gtg acc gac tgg tac gac cac ccc aac ate 2320 Ser Thr Gly Pro Val Leu Val Thr Asp Trp Tyr Asp His Pro Asn Ile 30 550 555 560 565

acc gcc ate ctg tgg gcc ggc gtg ccc ggg cag gag tcc ggc aac gcc 2368 Thr Ala Ile Leu Trp Ala Gly Val Pro Gly Gln Glu Ser Gly Asn Ala

570 575 580

ate acc gac gtc ctc tac gga aaa gtc aac ccg tcg ggc cgc age ccc 2416 Ile Thr Asp Val Leu Tyr Gly Lys Val Asn Pro Ser Gly Arg Ser Pro 585 .590 595

ttc acc tgg ggt ccg acc cgc gag age tac ggc acc gac gtc etc tac 2464

Phe Thr Trp Gly Pro Thr1Arg Glu Ser Tyr Gly Thr Asp Val Leu Tyr

600 . 605 610

act ccc aac aac ggc aag ggc gcg ccg cag cag gcc ttc tcc gag ggc 2512

Thr Pro Asn Asn Gly Lys Gly Ala Pro Gln Gln Ala Phe Ser Glu Gly 615 620 625

gtc ttc ate gac tac cgc cac ttc gac cgc acc aac gcg tcc gtc ate 2560 Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Arg Thr Asn Ala Ser Val Ile 630 635 640 645

tac gag ttc ggc cac ggc ctc age tac acg acg ttc cag tac age aac 2608 Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Gln Tyr Ser Asn

650 655 660

ate cag gtg gtc aag tcc aac gcc ggc gcg tac aag ccc acg acg ggc 2656

Ile Gln Val Val Lys Sér Asn Ala Gly Ala Tyr Lys Pro Thr Thr Gly 665 670 675

' acg acc ate ccc gcg ccc acg ttt ggc age ttc tcc aag gac ctc aag 2704 Thr Thr Ile Pro Ala Pro Thr Phe Gly Ser Phe Ser Lys Asp Leu Lys

680 . 685 690

gac tac ctc ttc ccg tcg gac cag ttc cgc tac ate acc cag tac ate 2752 Asp Tyr Leu Phe Pro Ser Asp Gln Phe Arg Tyr Ile Thr Gln Tyr Ile 695 . 700 705

tac ccg tac ctc aac tcc acc gac ccg gcc aag gcg tcg ctc gac ccg 2 800 Tyr Pro Tyr Leu Asn Ser Thr Asp Pro Alã Lys Ala Ser Leu Asp Pro 710 715 720 725

cac tac ggc aag act} gcg gcc gag ttt ctg ccg ccg cac gcg ctg gac 2848 His Tyr Gly Lys Thr Ala Ala Glu Phe Leu Pro Pro His Ala Leu Asp 730 735 740 age aac ccg cag ccg ctg ctg cgg tcg tcg ggc aag aac gag ccc ggc 2896 Ser Asn Pro Gln Pro Leu Leu Arg Ser Ser Gly Lys Asn Glu Pro Gly

745 750 755

ggc aac cgc cag ctg tac gac ate ctg tac acg gtg acg gcg gac ate 2944

Gly Asn Arg Gln Leu Tyr Asp Ile Leu Tyr Thr Val Thr Ala Asp Ile 760 765 770

acc aac acg ggc age ate gtg ggt gcg gag gtg ccg cag ctg tac gtg 2992 Thr Asn Thr Gly Ser Ile Val Gly Ala Glu Val Pro Gln Leu Tyr Val 775 780 785

tcg ctg ggc ggg ccc gac gac ccc aaa gtg gtc ctg cgc ggg ttc gac 3040 Ser Leu Gly Gly Pro Asp Asp Pro Lys Val Val Leu Arg Gly Phe Asp 790 795 800 805

cgc ate cgc ate gac ccg ggc aag acg gcg cag ttc cgc gtc acc ctg 3088

Arg Ile Arg Ile Asp Pro Gly Lys Thr Ala Gln Phe Arg Val Thr Leu

810 815 820

acc cgc cgg gat ctc age aac tgg gac ccg gcg ate cag gac tgg gtc 3136

Thr Arg Arg Asp Leu Ser Asn Trp Asp Pro Ala Ile Gln Asp Trp Val

825 830 835

âtc age aag tac ccc aag aag gtg tac ate ggc cgg age age agg aag 3184

Ile Ser Lys Tyr Pro Lys Lys Val Tyr Ile Gly Arg Ser Ser Arg Lys 840 845 850

ctg gaa ctc tcc gcc gac ctc gcg tgatccggcg acggccaagt acgtatgtgg 3238 Leu Glu Leu Ser Ala Asp Leu Ala 855 860

actgccatcc gaacacctat actttttggc taggtagggg gagcagcaag gcctgagcat 3298 atactctctc cattgcacat ttctaatgta aatatatata tcattaattg ggagacccaa 3358 actcgaattt atgcatgcgt acaaagtgtg ttgaacaagt ttcggtccag cagatagtaa 3418 ccgtcttagt tcgtccatcc ctctctcgaa tgcgctgtat acacatgcgt atatagacgt 3478 tgtataggtg ccattgctag caatgcaagc tt 3510

<210> 24

<211> 861

<212> PRT <213> Acremonium thermophiIum <400> 24

Met Arg Gln Ala Leu Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Ser Ser Pro Val 1 5 10 15

Ser Ala Ala Arg Glu Leu Ala Thr Ser Asp Pro Phe Tyx Pro Ser Pro

20 25 30

Trp Met Asn Pro Glu Ala. Asn Gly Trp Glu Asp Ala Tyr Ala Lys Ala

35 40 45

Lys Ala Phe Val Ser Gln Leu Thr Leu Leu Glu Lys Va. 1 Asn Lâu Thr

50 55 60

Thr Gly Ile Gly Trp Gln Gly Gly Gln Cys Val Gly Asn Val Gly Ser 65 70 75 80

Val Pro Arg Leu Gly Leu Arg Ser Leu Cys Met Gln Asp Ser Pro Val

85 90 95

Gly Ile Arg Phe Gly Asp Tyr Val Ser Val Phe Pro Ser Gly Gln Thr

100 105 110

Thr Ala Ala Thr Phe Asp Lys Gly Leu Met Asn Arg Arg Gly Asn Ala

115 120 125

Met Gly Gln Glu His Lys Gly Lys Gly Val Asn Val Leu Leu Gly Pro

130 135 140

Val Ala Gly Pro Ile Gly Arg Thr Pro Glu Gly Gly Arg Asn Trp Glu 145 150 .155 160

Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Ile Ala Leu Ala Glu Thr

165 170 175

Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Cys Ala Lys His Phe

180 185 190

Ile Ala Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Ser Gly Glu Ala Gln Gly

195 200 205

Tyr Gly Phe Asp Ile Ser Glu Ser Leu Ser Ser Asn Ile Asp Asp Lys

210 215 220

Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Gly Val Arg Ala 225 230 235 240 Gly Val Gly Ala Ile Met 245

Gly Cys Gln Asn Ser Lys 260

Gly Phe Gln Gly Phe Val 275

Ala Ala Ser Ala Val Ala 290

Ser Phe Asn Thr Gly Leu 305 310

Val Leu Asn Gly Thr Val 325

Arg Ile Met Ala Ála Phe 340

Pro Ile Asn Phe Asp Ser 355

Phe Ala Val Asn Glu Asp 370

Gln Asp Asn His Gly Ser 385 390

Val Leu Leu Lys Asn Thr 405

Leu Val Val Val Gly Asp 420

Ala Cys Pro Asp Arg Gly 435

Gly Ser Gly Ser Ala Asn 450

Leu Gln Ala Gln Ala Ile 465 470

Ser Asn Tyr Gln Leu Asp 485

186

Cys Ser Tyr Asn Gln Ile 250

Thr Leu Asn Asn Leu Leu 265

Met Ser Asp Trp Gln Ala 280

Gly Leu Asp Met Thr Met 295 300

Ser Tyr Trp Gly Thr Asn 315

Pro Glu Tyr Arg Ile Asp 330

Phe Lys Thr Gly Gln Thr 345

Trp Thr Thr Asp Thr Phe 360

Arg Gln Gln Ile Asn Trp 375 380

Leu Ile Arg Glu Ile Ala 395

Gly Ser Leu Pro Leu Asn 410

Asp Ala Gly Pro Asn Pro 425

Cys Asp Val Gly Thr Leu 440

Phe Pro Tyr Leu Ile Thr 455 460

Lys Asp Gly Thr Arg Tyr 475

Gln Thr Lys Ala Leu Val 490

Asn Asn Ser Tyr 255

Lys Asn Glu Leu 270

Gln His Thr Gly 285

Pro Gly Asp Thr

Leu Thr Leu Ala 320

Asp Met Val Met 335

Leu Asp Leu Pro 350

Gly Pro Leu His 365

His Val Asn Val

Ala Lys Gly Thr 400

Lys Pro Lys Phe 415

Ala Gly Pro Asn 430

Gly Met Ala Trp 445

Pro Asp Ala Ala

Glu Ser Val Leu 480

Thr Gln Ala Asn 495 Ala Thr Ala Ile Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile

500 505 510

Asn Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp His

515 520 525

Asp Gly Asp Ala Leu Ile Lys Ser Val Ala Gly Trp Asn Pro Asn Thr

530 535 540

Ile Val Val Ile His Ser.Thr Gly Pro Val Leu Val Thr Asp Trp Tyr 545 550 555 560

Asp His Pro Asn Ile Thr Ala Ile Leu Trp Ala Gly Val Pro Gly Gln

565 570 575

Glu Ser Gly Asn Ala Ile Thr Asp Val Leu Tyr Gly Lys Val Asn Pro

580 585 590

Ser Gly Arg Ser Pro Phe Thr Trp Gly Pro Thr Arg Glu Ser Tyr Gly

595 . 600 605

Thr Asp Val Leu Tyr Thr Pro Asn Asn Gly Lys Gly Ala Pro Gln Gln

610 615 620

Ala Phe Ser Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Arg Thr 625 630 635 640

Asn Ala Ser Val Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr

645 650 655

Phe Gln Tyr Ser Asn Ile Gln Val Val Lys Ser Asn Ala Gly Ala Tyr

660 665 670

Lys Pro Thr Thr Gly Thcr Thr Ile Pro Ala Pro Thr Phe Gly Ser Phe

675 680 685

Ser Lys Asp Leu Lys Asp Tyr Leu Phe Pro Ser Asp Gln Phe Arg Tyr

690 695 700

Ile Thr Gln Tyr Ile Tyr Pro Tyr Leu Asn Ser Thr Asp Pro Ala Lys 705 710 715 720

Ala Ser Leu Asp Pro His Tyr Gly Lys Thr Ala Ala Glu Phe Leu Pro

725 730 735

Pro His Ala Leu Asp Ser Asn Pro Gln Pro Leu Leu Arg Ser Ser Gly 740 745 750 Glu Pro Gly Gly Asn Arg Gln Leu Tyr Asp Ile Leu Tyr Thr 755 760 765

Ala Asp Ile Thr Asn Thr Gly Ser Ile Val Gly Ála Glu Val

775 780

Leu Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asp Asp Pro Lys Val Val 790 795 800

Gly Phe Asp Arg Ile Arg Ile Asp Pro Gly Lys Thr Ala Gln

805 810 815

Val Thr Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ser Asn Trp Asp Pro Ala

820 825 830

Asp Trp Val Ile Ser Lys Tyr Pro Lys Lys Val Tyr Ile Gly 835 840 845

Ser Arg Lys Leu Glu Leu Ser Ala Asp Leu Ala 855 860

<210> 25 <211> 3392 <212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum <220>

<221> CDS

<222> (608) . . (2405)

<223>

<220>

<221> íntron

<222> (2406) .. (2457)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (2458)..(2861)

<223>

<400> 25

tgcggggttg ctgcgactta attaataact ggcaaaacgg cccggagctc agctctgacc

Lys Asn

Val Thr 770 Pro Gln 785

Leu Arg

Phe Arg

Ile Gln

Arg Ser 850 tccgccacat ccgctcggca ccatgccagc gcgttgcaac ggcatgaagc gctcaggttt 120

ttcttccgcc tgctccccac tgccgatggc catctgcacc ccagctcgtc acatttatct 180

cgcgcacagc gtcttcccac cagttgcctt gctcatgacg ctgttaaaga tggccctacc 240

tagccgctga gtcccacaac gccgagatgt ctttggccct ttacaaggca cgccatggcc 300

gtccaaggtc tgttcatgag tgtgtttgtg gggccgaagg acacctcagt ggccacgaaa 360

tgccgccgag cgggccagca catgtcgaga gagacatgga catttatccc cgagatgctg 420

tattagggaa ccggtccttt tçtcggagcc gtgatccgag agcgttcggg agtcgttgag 480

taaaagatgt cgagttgccg ttatatatcg cgggcctgta gctatgtgcc ctctattctc 540

acaggttcaa tcatcagtcc tcgccgtgag acgtagcgcg ctgaactagc gctcgatatc 600

ttccgtc atg gct ctt cat gcc ttc ttg ttg ctg gca tca gca ttg ctg 649 Met Ala Leu His Ala Phe Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Leu 1 5 10

gcc cgg ggt gcc ctg age caa cct gac aac gtc cgt cgc gct gct ccg 697 Ala Arg Gly Ala Leu Ser Gln Pro Asp Asn Val Arg Arg Ala Ala Pro

15 20 25 30

acc ggg acg gcc gcc tgg gat gcc gcc cac tcg cag gct gcc gct gcc 745

Thr Gly Thr Ala Ala Trp Asp Ala Ala His Ser Gln Ala Ala Ala Ala

35 40 45

gtg tcg aga tta tca cag caa gac aag ate aac att gtc acc ggc gtt 793

Val Ser Arg Leu Ser Gln Gln Asp Lys Ile Asn Ile Val Thr Gly Val 50 55 60

ggc tgg ggt aag ggt cct tgc gtc ggc aat acg aac cct gtc tac age 841

Gly Trp Gly Lys Gly Pno Cys Val Gly Asn Thr Asn Pro Val Tyr Ser 65 70 75

ate aac tac cca cag ctc tgc ctg cag gat ggc cca ctg ggt ate cgc 889

Ile Asn Tyr Pro Gln Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly Ile Arg

80 85 90

tcc gcc acc age gtc acg gcc ttc acg ccg ggc att caa gcc gcg tcg 937

Ser Ala Thr Ser Val Thr Ala Phe Thr Pro Gly Ile Gln Ala Ala Ser

95 100 105 110

acc tgg gat gtg gag ttg ate cgg cag cgt ggt gtc tac cta gga cag 985 Thr Trp Asp Val

gag gcc cgg gga Glu Ala Arg Gly 130

gct ctt ggc aag Ala Leu Gly Lys 145

tcc gac ccc tac Ser Asp Pro Tyr 160

att cag tcg gag Ile Gln Ser Glu 175

gag cag gaa ctc Glu Gln Glu Leu

act atg cac gag Thr Met His Glu 210

aac gtg gcc age Asn Val Ala Ser 225

ctc tgc gag aac Leu Cys Glu Asn 240

ggc ttc cgc ggc Gly Phe Arg Gly 255

gtg ggc tcg gcc Val Gly Ser Ala

Glu Leu Ile Arg 115

act ggc gtg cat Thr Gly Val His

ate ccg cac gga Ile Pro His Gly 150

ttg gcc ggt ate Leu Ala Gly Ile 165

ggt gtg cag gct Gly Val Gln Ala 180

aac cgc gag aca Asn Arg Glu Thr 195

cta tac ctc tgg Leu Tyr Leu Trp

gtc atg tgc age Val Met Cys Ser 230

gat agg gcc caa Asp Arg Ala Gln 245

tac ate gtg age Tyr Ile Val Ser 260

aac agt ggc atg Asn Ser Gly Met 275

Gln Arg Gly Val 120

gtc etg ctc ggc Val Leu Leu Gly 135

ggc cgt aac tgg Gly Arg Asn Trp

gct atg tcc gag Ala Met Ser Glu 170

tgc gcg aag cac Cys Ala Lys His 185

atg age age aac Met Ser Ser Asn 200

ccg ttc gcc gac Pro Phe Ala Asp 215

tac aac aag ctc Tyr Asn Lys Leu

aac cag etg ctt Asn Gln Leu Leu 250

gac tgg aac gcg Asp Trp Asn Ala 265

gac atg acc atg Asp Met Thr Met 280

Tyr Leu Gly Gln 125

ccc gtg gcc ggt Pro Val Ala Gly 140

gaa gcc ttc ggc Glu Ala Phe Gly 155

acc ate gag ggc Thr Ile Glu Gly

tac ate gcc aat Tyr Ile Ala Asn 190

gtc gac gac cgc Val Asp Asp Arg 205

gcc gtg cat tcc Ala Val His Ser 220

aac ggc acc tgg Asn Gly Thr Trp 235

aag agg gag ctc Lys Arg Glu Leu

cag cac acc acc Gln His Thr Thr 270

cct ggc age gac Pro Gly Ser Asp 285 ttc aac ggc tgg aac gtc ctc tgg ggt ccg cag ctc aac aac gcc gtc 1513 Phe Asn Gly Trp Asn Val Leu Trp Gly Pro Gln Leu Asn Asn Ala Val

290 295 300

aac age ggc cag gtc tcg cag tcc cgc ctc aac gac atg gtc cag cgc 156.1 Asn Ser Gly Gln Val Ser Gln Ser Arg Leu Asn Asp Met Val Gln Arg 305 310 315

att ctt gct gcg tgg tac.ctc ctc ggc cag aac tcc gga tac ccg tcc 1609 Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Leu Gly Gln Asn Ser Gly Tyr Pro Ser 320 325 330

ate aac ctg cgt gcc aac gtc caá gcc aac cac aag gag aat gtg cgt 1657 Ile Asn Lgu. Ajtçj Ala. Asn Vcil Gln Alâ. Asn His Lys Glu Asn Vsl Axcj 335 340 345 350

gcc gta gcc cgc gat ggc ate gtc ctc ctc aag aac gac ggc att ctg 1705 Ala Val Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ile Leu 355 360 365

cct ctt cag cgt ccc aat aag att gct ctt gtc ggc tcc gcc gea gtc 1753 Pro Leu Gln Arg Pro Asn Lys Ile Ala Leu Val Gly Ser Ala Ala Val

370 375 380

gtc aac ccc cgt ggt atg aac gcc tgc gtg gac cgt ggc tgc aac gag 1801

Val Asn Pro Arg Gly Met Asn Ala Cys Val Asp Arg Gly Cys Asn Glu ' 385 390 395

ggt gcc ctt ggc atg ggc tgg ggc tca ggc acg gtc gag tat ccc tac 1849 Gly Ala Leu Gly Met Gl>y Trp Gly Ser Gly Thr Val Glu Tyr Pro Tyr 400 405 410

ttt gtt gcg ccg tat gat gct ctg cgt gag cgg gea cag cgc . gat ggc 1897 Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Leu Arg Glu Arg Ala Gln Arg Asp Gly 415 420 425 430

acg cag ate agt ctg cat gea tcg gac aat aca aac ggg gtt aac aac 1945

Thr Gln Ile Ser LeU His Ala Ser Asp Asn Thr Asn Gly Val Asn Asn

435 440 445

gcc gtg cag ggc gct gac gcg gcg ttt gtg ttc ate act gct gac tcc 1993 Ala Val Gln Gly Ala Asp Ala Ala Phe Val Phe Ile Thr Ala Asp Ser

450 455 460

ggc gaa ggg tac att acc gtt gag ggc cat gct ggc gac cgg aat cat Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly His Ala Gly Asp Arg Asn His

465 470 475

ctg gat cct tgg cat aat ggt aac cag ctt gtg cag gct gtt gcg cag Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Gln Leu Val Gln Ala Val Ala Gln

480 485 490

gca aat aag aac gtc att gtg gtt gtg cac age gtt ggg ccg gtt att Ala Asn Lys Asn Val Ile Val Val Val His Ser Val Gly Pro Val Ile 495 500 505 510

ctg gag acg ate ctc aat acg ccc ggt gtg agg gct gtt gtt tgg gct Leu Glu Thr Ile Leu Asn Thr Pro Gly Val Arg Ala Val Val Trp Ala

515 520 525

ggc ttg ccg age cag gag age ggt aac gcg ctg gtt gat gtg ctg tac Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala Leu Val Asp Val Leu Tyr

530 535 540

ggc ctt gtt tcg ccg tcg ggc aag ctt gtc tac acc att gcg aag age Gly Leu Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val Tyr Thr Ile Ala Lys Ser

545 550 555

ccg age gac tac ccg act age att gtc cgt ggc gat gat aac ttc cgc Pro Ser Asp Tyr Pro Thr Ser Ile Val Arg Gly Asp Asp Asn Phe Arg

560 565 570

gag ggt ctg ttc ate gac tac agg cac ttc gat aac gcc cgg ate gag Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Asn Ala Arg Ile Glu 575 580 585 590

ccc cgt ttc gag ttt ggc ttc ggt ctc t gtaagtctct taccactccg Pro Arg Phe Glu Phe Gly Phe Gly Leu 595

ttttgtaaca acccgattct aacatccccc ag ca tac acc aac ttc age tat

Ser Tyr Thr Asn Phe Ser Tyr

605 tcc aac ctg ggc ate tcc tcg tcc gea acc gcc ggc cca gcc acg ggc 2525 Ser Asn Leu Gly Ile Ser Ser Ser Ala Thr Ala Gly Pro Ala Thr Gly

610 615 620

ccc acc gtc ccc ggc ggc ccg gcc gac ctc tgg aac tat gtc gcg acc 2573 Pro Thr Val Pro Gly Gly Pro Ala Asp Leu Trp Asn Tyr Val Ala Thr 625 630 635

gtc acg gcg acc gtt acc .aac acc ggc ggc gtg gaa ggt gcc gag gtc 2621

Val Thr Ala Thr Val Thr Asn Thr Gly Gly Val Glu Gly Ala Glu Val 640 645 650

gct cag ctg tac ate tet ttg cca tet tcg gct cct gea tcg cca ccg 2669 Ala Gln Leu Tyr Ile Ser Leu Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Pro Pro 655 660 665 670

aag cag ctt cgt ggc ttt gtc aag ctt aag ttg gcg cct ggt caa age 2717 Lys Gln Leu Arg Gly Phe Val Lys Leu Lys Leu Ala Pro Gly Gln Ser 675 680 685

ggg acg gea acg ttt aga cta agg aag agg gat ttg gct tat tgg gat 2765 Gly Thr Ala Thr Phe Arg Leu Arg Lys Arg Asp Leu Ala Tyr Trp Asp

690 695 700

gtg ggg agg cag aat tgg gtt gtt cct tcg ggg agg ttt ggc gtg ctt 2813 Val Gly Arg Gln Asn Trp Val Val Pro Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu 705 710 715

gtg ggg gct agt tcg agg gat att agg ttg cag ggg gag att gtt gtt 2 861 Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg Leu Gln Gly Glu Ile Val Val 720 725 730

tagggggtta tgttcagcac ctagttgggg aattgatgtg taagttggag taggggtttt 2921 cgtgtacata cataccattt ggtcaatgtt acgacattta gtttatgaag tttcctggtg 2981 gctaccgctg atgagccctc gtatgatacc cacaatctat atgttttact cttctctttc 3 041 cttttttctc ttccttttcc tttattactt cattccttgt gtactttctg tgaacctcca 3101 gtcgaccatc cgacccaatt cgaaagtctt tcctgacctg gttcaggttg gcatattctc 3161 gaaaggatgt cgaccttCct gaccctactg ggctaccggg aaagccctag gatggctgat 3221 ggacagatct ggtgatcaac tatgggaaca ctccggagat ggtgactaat atgcgatggt 3281 catttaaaga gcaccgcttc càgcgatctc cccagttgct cctcaacgat tgacacggcc 3341 aatttatcca gattccggga ttctctgagt gagctgtccc ttttttctag a <210> 26 <211> 734 <212> PRT

<213> Chaetomiuin thermophilum <400> 26

Met Ala Leu His Ala Phe Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Leu Ala Arg 1 5 10 15

Gly Ala Leu Ser Gln Pro Asp Asn Val Arg Arg Ala Ala Pro Thr Gly

20 25 30

Thr Ala Ala Trp Asp Ala Ala His Ser Gln Ala Ala Ala Ala Val Ser

35 40 45

Arg Leu Ser Gln Gln Asp Lys Ile Asn Ile Val Thr Gly Val Gly Trp

50 55 60

Gly Lys Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Asn Pro Val Tyr Ser Ile Asn 65 70 75 80

Tyr Pro Gln Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly Ile Arg Ser Ala

85 90 95

Thr Ser Val Thr Ala Phe Thr Pro Gly Ile Gln Ala Ala Ser Thr Trp

100 105 110

Asp Val Glu Leu Ile Arg Gln Arg Gly Val Tyr Leu Gly Gln Glu Ala

115 120 125

Arg Gly Thr Gly Val His Val Leu Leu Gly Pro Val Ala Gly Ala Leu

130 135 140

Gly Lys Ile Pro His Gly Gly Arg Asn Trp Glu Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160

Pro Tyr Leu Ala Gly Ile Ala Met Ser Glu Thr Ile Glu Gly Ile Gln

165 170 175

Ser Glu Gly Val Gln Ala Cys Ala Lys His Tyr Ile Ala Asn Glu Gln

180 185 190

Glu Leu Asn Arg Glu Thr Met Ser Ser Asn Val Asp Asp Arg Thr Met 195 200 205 His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val His Ser Asn Val

210 215 220

Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Leu Asn Gly Thr Trp Leu Cys 225 230 235 240

Glu Asn Asp Arg Ala Gln Asn Gln Leu Leu Lys Arg Glu Leu Gly Phe

245 250 255

Arg Gly Tyr Ile Val Ser.Asp Trp Asn Ala Gln His Thr Thr Val Gly

260 265 270

Ser Ala Asn Ser Gly Met Asp Met Thr Met Pro Gly Ser Asp Phe Asn

275 280 285

Gly Trp Asn Val Leu Trp Gly Pro Gln Leu Asn Asn Ala Val Asn Ser

290 295 300

Gly Gln Val Ser Gln Ser Arg Leu Asn Asp Met Val Gln Arg Ile Leu 305 310 315 320

Ala Ala Trp Tyr Leu Leu Gly Gln Asn Ser Gly Tyr Pro Ser Ile Asn

325 330 335

Leu Arg Ala Asn Val Gln Ala Asn His Lys Glu Asn Val Arg Ala Val

340 345 350

Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ile Leu Pro Leu

355 360 365

Gln Arg Pro Asn Lys Ile Ala Leu Val Gly Ser Ala Ala Val Val Asn

370 375 380

Pro Arg Gly Met Asn Ala Cys Val Asp Arg Gly Cys Asn Glu Gly Ala 385 390 395 400

Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly Thr Val Glu Tyr Pro Tyr Phe Val

405 410 415

Ala Pro Tyr Asp Ala Leu Arg Glu Arg Ala Gln Arg Asp Gly Thr Gln

420 425 430

Ile Ser Leu His Ala Ser Ásp Asn Thr Asn Gly Val Asn Asn Ala Val

435 440 445

Gln Gly Ala Asp Ala Ala Phe Val Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu 450 455 460 Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly His Ala Gly Asp Arg Asn His Leu Asp 465 470 475 480

Pro Trp His Asn Gly Asn Gln Leu Val Gln Ala Val Ala Gln Ala Asn

485 490 495

Lys Asn Val Ile Val Val Val His Ser Val Gly Pro Val Ile Leu Glu

500 505 510

Thr Ile Leu Asn Thr Pro Gly Val Arg Ala Val Val Trp Ala Gly Leu

515 520 525

Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Leu

530 535 540

Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Ser 545 550 555 560

Asp Tyr Pro Thr Ser Ile Val Arg Gly Asp Asp Asn Phe Arg Glu Gly

565 570 575

Leu Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Asn Ala Arg Ile Glu Pro Arg

580 585 590

Phe Glu Phe Gly Phe Gly Leu Ser Tyr Thr Asn Phe Ser. Tyr Ser Asn

595 600 605

Leu Gly Ile Ser Ser Ser Ala Thr Ala Gly Pro Ala Thr Gly Pro Thr

610 615 620

Val Pro Gly Gly Pro Ala Asp Leu Trp Asn Tyr Val Ala Thr Val Thr 625 630 635 640

Ala Thr Val Thr Asn Thr Gly Gly Val Glu Gly Ala Glu Val Ala Gln

645 650 655

Leu Tyr Ile Ser Leu Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Pro Pro Lys Gln

660 665 670

Leu Arg Gly Phe Val Lys Leu Lys Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Thr

675 680 685

Ala Thr Phe Arg Leu Arg Lys Arg Asp Leu Ala Tyr Trp Asp Val Gly

690 695 700

Arg Gln Asn Trp Val Val Pro Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Val Gly 705 710 715 720 Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg Leu Gln Gly Glu Ile Val Val 725 730

<210> 27 <211> 1631 <212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus <220>

<221> íntron <222> (610)..(674)

<223> <220>

<221> CDS

<222> (675)..(1628)

<223>

<220>

<221> CDS <222> (1)..(609) <223> <400> 27

atg tat cag cgc gct ctt ctc ttc tct' ttc ttc etc gcc gcc gcc cgc 48

' Met Tyr Gln Arg Ala Leu Leu Phe Ser Phe Phe Leu Ala Ala Ala Arg 1 5 10 15

gcg cag cag gcc ggt aoc gta acc gca gag aat cac cct tcc ctg acc 96

Ala Gln Gln Ala Gly Thr Val Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr

20 25 30

tgg cag caa tgc tcc agç ggc ggt agt tgt acc acg cag aat gga aaa 144

Trp Gln Gln Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys

35 40 45

gtc gtt ate gat gcg aac tgg cgt tgg gtc cat acc acc tct gga tac 192

Val Val Ile Asp Alà Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr 50 55 60

acc aac tgc tac acg ggc aat acg tgg gac acc agt ate tgt ccc gac 240 Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser Ile Cys Pro Asp 65 70 75 80

gac gtg acc tgc gct cag aat tgt gcc ttg gat gga gcg gat tac agt Asp Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser

85 90 95

ggc acc tat ggt gtt acg acc agt ggc aac gcc ctg aga ctg aac ttt Gly Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe

100 105 110

gtc acc caa age tca ggg aag aac att ggc tcg cgc ctg tac ctg ctg Val Thr Gln Ser Ser Gly Lys Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyir Leu Leu

115 120 125

cag gac gac acc act tat cag ate ttc aag ctg ctg ggt cag gag ttt Gln Asp Asp Thr Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gly Gln Glu Phe

130 135 140

acc ttc gat gtc gac gtc tcc aat ctc cct tgc ggg ctg aac ggc gcc Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala 145 150 155 160

ctc tac ttt gtg gcc atg gac gcc gac ggc gga ttg tcc aaa tac cct Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro

165 170 175

ggc aac aag gea ggc gct aag tat ggc act ggt tac tgc gac tet cag Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln

180 185 190

tgc cct cgg gat ctc aag ttc ate aac ggt cag gtacgtcaga agtgataact Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln

195 200

agccagcaga gcccatgaat cattaactaa cgctgtcaaa tacag gcc aat gtt gaa

Ala Asn Val Glu 205

ggc tgg cag ccg tet gcc aac gac cca aat gcc ggc gtt ggt aac cac Gly Trp Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Asn His 210 215 220 ggt tcc tgc tgc gct gag atg gat gtc tgg gaa gcc aac age ate tet 782

Gly Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser

225 230 235

act .gcg gtg acg cct cac cca tgc gac acc ccc ggc cag acc atg tgc 830

Thr Ala Val Thr Pro His Pro Cys .Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys 240 245 250 255

cag gga gac gac tgt ggt. gga acc tac tcc tcc act cga tat gct ggt 878

Gln Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly 260 265 270

acc tgc gac cct gat ggc tgc gac ttc aat cct tac cgc cag ggc aac 926

Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gln Gly Asn

275 280 285

cac tcg ttc tac ggc ccc ggg cag ate gtc gac acc age tcc aaa ttc 974

His Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe 290 295 300

acc gtc gtc acc cag ttc ate acc gac gac ggg acc ccc tcc ggc acc 1022

Thr Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr

305 310 315

ctg acg gag ate aaa cgc ttc tac gtc cag aac ggc aag gta ate ccc 1070 Leu Thr Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro 1 320 325 330 335

cag tcg gag tcg acg ate age ggc gtc acc ggc aac tca ate acc acc 1118 Gln Ser Glu Ser Thr Ile Ser Gly Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr 340 345 350

gag tat tgc acg gcc cag aag gcc gcc ttc ggc gac aac acc ggc ttc 1166 Glu Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe

355 360 365

ttc acg cac ggc ggg ctt cag aag ate agt cag gct ctg gct cag ggc 1214

Phe Thr His Gly Gly Leu Gln Lys Ile Ser Gln Ala Leu Ala Gln Gly 370 375 380

atg gtc ctc gtc atg age ctg tgg gac gat cac gcc gcc aac atg ctc 1262 Met Val Leu Val 385

tgg ctg gac age Trp Leu Asp Ser 400

gtc gcg cgc ggt

Val Ala Arg Gly

gag tcg cag tac Glu Ser Gln Tyr 435

gga ccc att ggc Gly Pro Ile Gly 450

gga aac ccg cct Gly Asn Pro Pro 465

gga age tet ccc Gly Ser Ser Pro 480

att ggc tac age Ile Gly Tyr Ser

gtc ctg aac cct Val Leu Asn Pro 515

<210> 28 <211> 521 <212> PRT <213> Thermoasc <400> 28

Met Ser Leu Trp 390

acc tac ccg act

Thr Tyr Pro Thr 405

acc tgc ccc acg

Thr Cys Pro Thr 420

ccc aat tca tat

Pro Asn Ser Tyr

age acc ggc aac Ser Thr Gly Asn 455

ggc acc acc acc Gly Thr Thr Thr 470

gga cct acc cag Gly Pro Thr Gln 485

ggc ccc acg gtc Gly Pro Thr Val 500

tac tac tet cag Tyr Tyr Ser Gln

aurantiacus

Asp Asp His Ala 395

gat gcg gac ccg Asp Ala Asp Pro 410

acc tcc ggc gtc Thr Ser Gly Val 425

gtt ate tac tcc Val Ile Tyr Ser 440

cct age ggc ggc Pro Ser Gly Gly

acc cgc cgc cca Thr Arg Arg Pro 475

tet cac tac ggc Ser His Tyr Gly 490

tgc gcc age ggc Cys Ala Ser Gly

505 tgc ctg taa Cys Leu 520

Ala Asn Met Leu

gac acc cct ggc Asp Thr Pro Gly 415

ccg gcc gac gtt Pro Ala Asp Val 430

aac ate aag gtc Asn Ile Lys Val 445

aac cct ccc ggc Asn Pro Pro Gly 460

gcc act acc act Ala Thr Thr Thr

cag tgc ggc ggt Gln Cys Gly Gly 495

aca act tgc cag Thr Thr Cys Gln 510 Met Tyx Gln Arg Alá Leu Leu Phe Ser Phe Phe Leu Ala Ala Ala Arg 1 5 10 15

Ala Gln Gln Ala Gly Thr Val Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr

20 25 30

Trp Gln Gln Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys

35 40 45

Val Val Ile Asp Ala Asn .Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr

50 55 60

Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser Ile Cys Pro Asp 65 70 75 80

Asp Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser

85 90 95

Gly Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe

100 105 110

Val Thr Gln Ser Ser Gly Lys Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu

115 120 125

Gln Asp Asp Thr Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gly Gln Glu Phe

130 135 140

Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leú Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala 145 150 155 160

Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro

165 170 175

Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln

180 185 190

Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly

195 200 205

Trp Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Asn His Gly

210 215 220

Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr 225 230 235 240

Ala Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys Gln 245 250 255 Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Thr

260 265 270

Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gln Gly Asn His

275 280 285

Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr

290 295 300

Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr Leu 305 310 315 320

Thr Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Gln

325 330 335

Ser Glu Ser Thr Ile Ser Gly Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu

340 345 350

Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe Phe

355 360 365

Thr His Gly Gly Leu Gln Lys Ile Ser Gln Ala Leu Ala Gln Gly Met

370 375 380

Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp 385 390 395 400

Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Asp Thr Pro Gly Val

405 410 415

Ala Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu

420 425 430

Ser Gln Tyr Pro Asn Ser Tyr Val Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly

435 440 445

Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly

450 455 460

Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly 465 470 475 480

Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile

485 490 495

Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val 500 505 510 Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

515 520

<210> 29 <211> 1734 <212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus <220>

<221> íntron <222> (610) .. (674) <223> <220>

<221> CDS

<222> (1726) . . (1731)

<223>

<22 0>

<221> CDS. <222> (675) .. (1661) <223> <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (609)

<223>

<220>

<221> íntron <222> (1662) . . (1725) <223> <400> 29

atg tat cag cgc gct ctt ctc ttc tct ttc ttc ctc gcc gcc gcc cgc Met Tyr Gln Arg Ala Leu Leu Phe Ser Phe Phe Leu Ala Ala Ala Arg 1 5 10 15

gcg cag cag gcc ggt acc gta acc gca gag aat cac cct tcc ctg acc Ala Gln Gln Ala 20

tgg cag caa tgc Trp Gln Gln Cys 35

gtc gtt ate gat

Val Val Ile Asp 50

acc aac tgc tac

Thr Asn Cys Tyr 65

gac gtg acc tgc

Asp Val Thr Cys

ggc acc tat ggt Gly Thr Tyr Gly 100

gtc acc caa age Val Thr Gln Ser 115

cag gac gac acc Gln Asp Asp Thr 130

acc ttc gat gtc Thr Phe Asp Val 145

ctc tac ttt gtg Leu Tyr Phe Val

ggc aac aag gea Gly Asn Lys Ala 180

Gly Thr Val Thr

tcc age ggc ggt Ser Ser Gly Gly 40

gcg aac tgg cgt Ala Asn Trp Arg 55

acg ggc aat acg Thr Gly Asn Thr 70

gct cag aat tgt Àla Gln Asn Cys 85

gtt acg acc agt Val Thr Thr Ser

tca ggg aag aac Ser Gly Lys Asn 120

act tat cag ate Thr Tyr Gln Ile 135

gac gtc tcc aat Asp Val Ser Asn 150

gcc atg gac gcc Ala Met Asp Ala 165

ggc gct aag tat Gly Ala Lys Tyr

Ala Glu Asn His 25

agt tgt acc acg Ser Cys Thr Thr

tgg gtc cat acc Trp Val His Thr 60

tgg gac acc agt Trp Asp Thr Ser 75

gcc ttg gat gga Ala Leu Asp Gly 90

ggc aac gcc ctg Gly Asn Ala Leu 105

att ggc tcg cgc Ile Gly Ser Arg

ttc aag ctg ctg Phe Lys Leu Leu 140

ctc cct tgc ggg Leu Pro Cys Gly 155

gac ggc gga ttg Asp Gly Gly Leu 170

ggc act ggt tac Gly Thr Gly Tyr 185

Pro Ser Leu Thr 30

cag aat gga aaa Gln Asn Gly Lys 45

acc tet gga tac Thr Ser Gly Tyr

ate tgt ccc gac Ile Cys Pro Asp 80

gcg gat tac agt Ala Asp Tyr Ser 95

aga ctg aac ttt Arg Leu Asn Phe 110

ctg tac ctg ctg Leu Tyr Leu Leu 125

ggt cag gag ttt Gly Gln Glu Phe

ctg aac ggc gcc Leu Asn Gly Ala 160

tcc aaa tac cct Ser Lys Tyr Pro 175

tgc gac tet cag Cys Asp Ser Gln 190 tgc cct cgg gat ctc aag ttc ate aac ggt cag gtacgtcaga agtgataact 629 Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln

195 200

agccagcaga gcccatgaat cattaactaa cgctgtcaaa tacag gcc aat gtt gaa 686 Ala Asn Val Glu

205

ggc tgg cag ccg tet gcc. aac gac cca aat gcc ggc gtt ggt aac cac 734

Gly Trp Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Asn His 210 215 220

ggt tcc tgc tgc gct gag atg gat gtc tgg gaa gcc aac age ate tet 782

Gly Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser

225 230 235

act gcg gtg acg cct cac cca tgc gac acc ccc ggc cag acc atg tgc 830

Thr Ala Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys 240 245 250 255

cag gga gac gac tgt ggt gga acc tac tcc tcc act cga tat gct ggt 878

Gln Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly

260 265 270

acc tgc gac cct gat ggc tgc gac ttc aat cct tac cgc cag ggc aac 926

Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gln Gly Asn 275 280 285

cac tcg ttc tac ggc ccc ggg cag ate gtc gac acc age tcc .aaa ttc 974

His Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe 290 295 300

acc gtc gtc acc cag ttc ate acc gac gac ggg acc ccc tcc ggc acc 1022 Thr Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr

305 310 315

ctg acg gag ate aaa cge ttc tac gtc cag aac ggc aag gta ate ccc 1070 Leu Thr Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro 320 325 330 335

cag tcg gag tcg acg ate age ggc gtc acc ggc aac tca ate acc acc 1118 Gln Ser Glu Ser

gag tat tgc acg Glu Tyr Cys Thr 355

ttc acg cac ggc Phe Thr His Gly 370

atg gtc ctc gtc Met Val Leu Val 385

tgg ctg gac age Trp Leu Asp Ser 400

gtc gcg cgc ggt Val Ala Arg Gly

gag tcg cag tac Glu Ser Gln Tyr 435

gga ccc ate ggc Gly Pro Ile Gly 450

aac ccg acc acc Asn Pro Thr Thr 465

ccg acc age age Pro Thr Ser Ser 480

ggc ggc tgc acc Gly Gly Cys Thr

Thr Ile Ser Gly 340

gcc cag aag gcc

Ala Gln Lys Ala

ggg ctt cag aag Gly Leu Gln Lys 375

atg age ctg tgg Met Ser Leu Trp 390

acc tac ccg act Thr Tyr Pro Thr 405

acc tgc ccc acg Thr Cys Pro Thr 420

ccc aat tca tàt Pro Asn Ser Tyr

tcg acc gtc cct Ser Thr Val Pro 455

acc gtc gtt cct Thr Val Val Pro 470

act age tet ccc Thr Ser Ser Pro 485

acc cag aag tgg Thr Gln Lys Trp 500

Val Thr Gly Asn 345

gcc ttc ggc gac Ala Phe Gly Asp 360

ate agt cag gct Ile Ser Gln Ala

gac gat cac gcc Asp Asp His Ala 395

gat gcg gac ccg Asp Ala Asp Pro 410

acc tcc ggc gtc Thr Ser Gly Val 425

gtt ate tac tcc Val Ile Tyr Ser 440

ggc ctt gac ggc Gly Leu Asp Gly

ccc gct tet acc Pro Ala Ser Thr 475

gtt tcg acc ccg Val Ser Thr Pro 490

ggc cag tgc ggc Gly Gln Cys Gly 505

Ser Ile Thr Thr 350

aac acc ggc ttc Asn Thr Gly Phe 365

ctg gct.cag ggc Leu Ala Gln Gly 380

gcc aac atg ctc Ala Asn Met Leu

gac acc cct ggc Asp Thr Pro Gly 415

ccg gcc gac gtt Pro Ala Asp Val 430

aac ate aag gtc Asn Ile Lys Val 445

age aac ccc ggc Ser Asn Pro Gly 460

tcc acc tcc cgt Ser Thr Ser Arg

act ggc cag ccc Thr Gly Gln Pro 495

ggt ate ggc tac Gly Ile Gly Tyr 510 acc ggc tgc act aac tgc gtt gct ggc acc acc tgc act cag ctc aac 1646 Thr Gly Cys Thr Asn Cys Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn 515 520 525

ccc tgg tac age cag gtatgtttct cttccccctt ctagactcgc ttggatttga 1701 Pro Trp Tyr Ser Gln 530

cagttgctaa catctgctca acag tgc ctg taa 1734 Cys Leu

<210> 30 <211> 534 <212> PRT <213> Thermoascus aurantiacus <400> 30

Met Tyr Gln Arg Ala Leu Leu Phe Ser Phe Phe Leu Ala Ala Ala Arg 1 5 10 15

Ala Gln Gln Ala Gly Thr Val Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr 20 25 30

Trp Gln Gln Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys 35 40 45

Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr 50 55 60

Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser Ile Cys Pro Asp 65 70 75 80

Asp Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser 85 90 95

Gly Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe 100 105 110

Val Thr Gln Ser Ser Gly Lys Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu 115 120 125

Gln Asp Asp Thr Tht Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gly Gln Glu Phe 130 135 140 Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala 145 150 155 160

Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro

165 170 175

Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln

180 185 190

Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly

195 200 205

Trp Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Asn His Gly

210 215 220

Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr 225 230 235 240

Ala Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys Gln

245 250 255

Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Thr

260 265 270

Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gln Gly Asn His

275 280 285

Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr

290 295 300

Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr Leu 305 310 315 320

Thr Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Gln

325 330 335

Ser Glu Ser Thr Ile Ser Gly Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu

340 345 350

Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe Phe

355 360 365

Thr His Gly Gly Leu Gln Lys Ile Ser Gln Ala Leu Ala Gln Gly Met

370 375 380

Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ála Asn Met Leu Trp 385 390 395 400 Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp 405

Ala Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr 42θ'

Ser Gln Tyr Pro Asn Ser Tyr Val 435 440

Pro Ile Gly Ser Thr Val .Pro Gly

450 455

Pro Thr Thr Thr Val Val Pro Pro 465 470

Thr Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val 485

Gly Cys Thr Thr Gln Lys Trp Gly 500

Gly Cys Thr Asn Cys Val Ala Gly 515 520

Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 530

Ala Asp Pro Asp Thr Pro Gly Val

410 415

Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu 425 430

Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly 445

Leu Asp Gly Ser Asn Pro Gly Asn 460

Ala Ser Thr Ser Thr Ser Arg Pro 475 480

Ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro Gly

490 495

Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr 505 510

Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn Pro 525 Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Primalco Ltd1 Biotec

Valta-akseli DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE

Fin-05200 Rajamaki Emitido por força da regra 10.2 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

identificada abaixo

<table>table see original document page 211</column></row><table>

1Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data.

relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais

recente.

3Marcar com um X o campo aplicável.. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Primalco Ltd1 Biotec Recibo no caso de um original, e-

Valta-akseli mitido por força da regra 7.1 pela

05200 Rajamaki autoridade internacional de depósi-

Finland to identificada abaixo

<table>table see original document page 212</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade

Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 213</column></row><table>

1Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3Marcar com um X o campo aplicável.. <table>table see original document page 214</column></row><table>

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. 214

Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy

Tykkimãentie 15

05200 Rajamaki Finland

Recibo no caso de um original, emi- tido por força da regra 7.1 pela au- toridade internacional de depósito identificada abaixo

<table>table see original document page 215</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(0), â referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 216</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data dó novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável. <table>table see original document page 217</column></row><table>

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 218</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy

Tykkimãentie 15 05200 RAJAMÃKI Finland

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Emitido por força da regra 10.2 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

identificada abaixo

<table>table see original document page 219</column></row><table>

1Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3Marcar com um X o campo aplicável.

4Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorga- nismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 220</column></row><table>

<table>table see original document page 220</column></row><table>

1 Quando aplicável a .Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 221</column></row><table>

1Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3Marcar com um X o campo aplicável.

4Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 222</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 223</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL Roal Oy Tykkimãentie 15 05200 Rajamaki Finland

Recibo no caso de um original, emi- tido por força da regra 7.1 pela au- toridade internacional de depósito identificada abaixo

<table>table see original document page 224</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy Tykkimáentie 15 DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE 05200 RAJAMÃKI Emitido por força da regra 10.2 pela Finland AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

identificada abaixo

<table>table see original document page 225</column></row><table>

1Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3Marcar com um X o campo aplicável.

4Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy Recibo no caso de um original, emi-

Tykkimãentie 15 tido por força da regra 7.1 pela au-

05200 Rajamaki toridade internacional de depósito

Finland identificada abaixo

<table>table see original document page 226</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 227</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 228</column></row><table>

<table>table see original document page 228</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Emitido por força da regra 10.2 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

<table>table see original document page 229</column></row><table>

1Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente. 3Marcar com um X o campo aplicável.

4Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Roal Oy Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

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1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 231</column></row><table>

<table>table see original document page 231</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 232</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 233</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy Recibo no caso de um original, emi-

Tykkimãentie 15 tido por força da regra 7.1 pela au-

Fin-05200 Rajamaki toridade internacional de depósito identificada abaixo

<table>table see original document page 234</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade

Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 235</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 236</column></row><table>

<table>table see original document page 236</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy

<table>table see original document page 237</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 238</column></row><table>

1Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy

Tykkimãentie 15 DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE

Fin-05200 RAJAMÀKI Emitido por força da regra 10.2 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

identificada abaixo

<table>table see original document page 239</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal Oy Recibo no caso de um original, emi-

Tykkimaentie 15 tido por força da regra 7.1 pela au-

Fin-05200 Rajamaki toridade internacional de depósito

identificada abaixo

<table>table see original document page 240</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 241</column></row><table>

<table>table see original document page 241</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

Roal °y Recibo no caso de um original, emi-

Tykkimaentie 15 tido por força da regra 7.1 pela au-

Fin-05200 Rajamaki toridade internacional de depósito

identificada abaixo

<table>table see original document page 242</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

<table>table see original document page 243</column></row><table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável.

4 Preencher se a informação foi requerida e se os resultados do teste foram negativos. Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro- organismo para fins de processamento de matéria de patentes

FORMATO INTERNACIONAL

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I<table>table see original document page 244</column></row><table>

1 Quando aplicável a Regra 6.4(d), a referida data é a data na qual o status da autoridade Internacional de depósito foi obtido.

Claims (54)

1. Método para tratar material celulósico, caracterizado pelo fato de que é com celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, pelo que a dita celobioidrolase compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N0: 2, 4, 6 ou 8, ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a celobioidrolase é obtida de Thermoascus aurantiacus, Acre- monium thermophilum ou Chaetomium thermophilum.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a celobioidrolase é obtida de CBS 116239 de Thermoascus au- rantiacus, CBS 116240 de Acremonium thermophilum, ou CBS 730.95 de Chaetomium thermophilum.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as enzimas recombinantes são usadas, preferivelmente produzi- das em uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergillus.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende o emprego de uma celobioidrolase obtida de Ther- moaseus aurantiacus ou Acremonium thermophilum aos quais um domínio de ligação de celulose foi anexado geneticamente.

6. Método de acordo com a reivindicação 5·, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de celulose anexado é derivado de Tricho- derma reesei ou Chaetomium termophilum, e preferivelmente a proteína de fusão resultante compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N9: 28 ou 30.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endoglicanase compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N9: 10, 12, -14 ou 16, ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a endoglicanase pode ser obtida de Thermoaseus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a endoglicanase pode ser obtida de CBS 116239 de Thermoas- cus aurantiacus, CBS 116240 de Acremonium thermophilum ou CBS 730.95 de Chaetomium thermophilum.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a beta-glicosidase compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N9: 22, 24 ou 26, ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lo fato de que a beta-glicosidase é obtida de Thermoascus aurantiacus, A- cremonium thermophilum, ou Chaetomium thermophilum, preferivelmente de CBS 116239 de Thermoascus aurantiacus, CBS 116240 de Acremonium thermophilum, ou CBS 730.95 Chaetomium thermophilum.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é material Iignocelu- lósico.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende tratamento do material Iigno- celulósico com pelo menos uma enzima adicional, preferivelmente uma xila- nase, que compreende, preferivelmente uma seqüência de aminoácido pos- suindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N-: 18 ou 20, ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que a xilanase é obtida de Thermoascus aurantiacus ou Acremo- nium thermophilum, preferivelmente de CBS 116239 Thermoascus aurantia- cus ou CBS 116240 de Acremonium thermophilum.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as enzimas são adicionadas ao material celulósico tanto simultânea quanto seqüencialmente.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das enzimas é codifica- da por um gene semelhante aquele incluído em um microorganismo possu- indo número de acesso DSM 16723, DSM 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM -16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é selecionado do grupo consistindo em pa- lha de milho, gramínea do tipo "switchgrass" nativa da América do Norte, palha de cereais, bagaço de cana de açúcar e materiais derivados de madei- ra.

18. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que com- preende celobióidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, caracterizado pelo fato de que a dita celobioidrolase compreende uma seqüência de ami- noácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N9: -2, 4, 6 ou 8, ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

19. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita celobioidrolase é obtida de Thermoas- cus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum.

20. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a celobioidrolase é obtida de CBS 116239 de Thermoascus aurantiacus, CBS 116240 de Acremonium thermophilum ou CBS 730.95 de Chaetomium thermophilum.

21. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que as enzimas são enzimas recombinantes, pre- ferivelmente produzidas em uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergil- lus.

22. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende uma celobioidrolase obtida de Thermoascus aurantiacus à qual um domínio de ligação de celulose foi ane- xado geneticamente.

23. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de celulose anexado é derivado de Trichoderma reesei ou Chaetomium termophilum, e preferível- mente a proteína de fusão resultante compreende uma seqüência de amino- ácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N°: -28 ou 30.

24. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a endoglicanase compreende uma seqüência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N°: 10, 12, 14.ou 16, ou com relação a um fragmento enzimatica- mente ativo da mesma.

25. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a endoglicanase é obtida de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum, pre- ferivelmente de CBS 116239 de Thermoascus aurantiacus, CBS 116240 de Acremonium thermophilum ou CBS 730.95 de Chaetomium thermophilum.

26. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a beta-glucosidase compreende uma seqüên- cia de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N°: 22, 24 ou 26, ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

27. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a beta-glucosidase é obtida de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, ou Chaetomium thermophilum, pre- ferivelmente de CBS 116239 de Thermoascus aurantiacus, CBS 116240 de Acremonium thermophilum ou CBS 730.95 de Chaetomium thermophilum.

28. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma enzima adicional, preferivelmente uma xilanase, que compreende, pre- ferivelmente, uma seqüência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N°: 18 ou 20, ou com relação a um frag- mento enzimaticamente ativo da mesma.

29. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a xilanase é obtida de Thermoascus aurantia- cus ou Acremonium thermophilum, preferivelmente de CBS 116239 de Thermoascus aurantiacus ou CBS 116240 de Acremonium thermophilum.

30. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das en- zimas é codificada por um gene semelhante aquele incluído em um microor- ganismo possuindo número de acesso DSM 16723, DSM 16728, DSM -16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

31. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que está na forma de meio de cultura gasto, pós, grânulos ou líquidos.

32. Uso de uma preparação de enzima como definida em qual- quer uma das reivindicações 18 a 31, caracterizado pelo fato de que é para degradação de material celulósico.

33. Uso de acordo com reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é selecionado do grupo consistindo em palha de milho, gramínea do tipo switchgrass nativa da América do Norte, palha de cereais, bagaço de cana de açúcar e materiais derivados de madeira.

34. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é um processo para prepara- ção de etanol a partir de material celulósico.

35. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uiji fragmento possuindo atividade celulósica e sendo selecionado do grupo consistindo em: a)um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoáci- do possuindo pelo menos 66% de identidade com relação à SEQ ID N°:4, -79% de identidade com relação à SEQ ID N°:6, 78% de identidade com/rela- ção à SEQ ID N°: 12, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°: 14, 72% de identidade com relação à SEQ ID N°: 16, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°:20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N°:22 ou 24, ou -78% de identidade com relação à SEQ ID N°:26; b)uma variante de a) compreendendo um fragmento pòssuindo atividade celulósica; e c) um fragmento de a) ou b) possuindo atividade celulósica.

36. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que compreende: a) üma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N°: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26; b) uma variante de a) compreendendo um fragmento possuindo atividade de celobioidrolase, endoglicanase, xilanase ou beta-glicosidase; ou c) um fragmento de a) ou b) possuindo atividade de celobioidro- lase, endoglicanase, xilanase ou beta-glicosidase.

37. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é se- lecionado do grupo consistindo em: a) uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 3, 5, 11, 13, 15, -19, 21, 23 ou 25, ou uma seqüência codificando um polipeptídeo da reivindi- cação 35; b) um filamento complementar de a) c) um fragmento de a) ou b) compreendendo pelo menos 20 nu- cleotídeos; e d) uma seqüência que se degenera como resultado do código genético em qualquer uma das seqüências conforme definido em a), b) ou c).

38. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 37, caracteri- zado pelo fato de que possui uma seqüência compreendida das SEQ ID N°S: -3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 ou 25.

39. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 37, caracteri- zado pelo fato de que compreende um gene similar ao incluindo em um mi- croorganismo possuindo número de acesso selecionado do grupo consistin- do em DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 e DSM 17667.

40. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende como uma seqüência heteróloga um polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 39.

41. Vetor de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que é capaz de expressar um polipeptídeo como definido na reivindi- cação 35.

42. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre- ende o vetor como definido na reivindicação 40.

43. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 42, carac- terizada pelo fato de que é capaz de expressar o polipeptídeo codificado pe- la seqüência de polinucleotídeo heteróloga.

44. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 43, carac- terizada pelo fato de que é uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergillus.

45. Cepa de Escherichia coli, caracterizada pelo fato de que possui número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM -17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

46. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que com- preende um polipeptídeo como definido na reivindicação 35.

47. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que está na forma de meio de cultura gasto, pó, grânulos ou líquido.

48. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 46 ou -47, caracterizada pelo fato de que compreende atividade de celobioidrolase, endoglicanase, beta-glicosidase, e opcionalmente de xilanase e/ou atividade de outras enzimas.

49. Preparação da enzima de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 46 a 48, caracterizada pelo fato de que compreende, adicional- mente, aditivos convencionais.

50. Uso de um polipeptídeo como definido na reivindicação 35, ou uma preparação de enzima como definida na reivindicação 46, caracteri- zada pelo fato de que é na indústria de combustíveis, têxteis, detergentes, polpa e papel, alimentos, suprimentos ou bebidas.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a enzima é empregada no tratamento de polpa kraft, polpa me- cânica ou papel reciclado.

52. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a preparação de enzima é meio de cultura gasto.

53. Método para preparar um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento possuindo atividade celulósica e sendo selecionado do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá- cido possuindo pelo menos 66% de identidade com relação à SEQ ID N°:4, 79% de identidade com. relação à SEQ ID N°:6, 78% de identidade com rela- ção à SEQ ID N°: 12, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°:14, 72% de identidade com relação à SEQ ID N°:16, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°:20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N°:22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N°:26; b) uma variante de a) compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica; e c) um fragmento de a) ou b) possuindo atividade celulósica, o dito método compreendendo transformação de uma célula hospedeira com um vetor codificando o dito polipeptídeo, e cultivo da célula hospedeira sob condições que permitem expressão do dito polipeptídeo, e opcionalmente recuperação e purificação do polipeptídeo produzido.

54. Método para tratar material celulósico, caracterizado pelo fa- to de que é com um meio de cultura gasto de pelo menos um microorganis- mo capaz de produzir um polipeptídeo compreendendo um fragmento possu- indo atividade celulósica e sendo selecionado do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá- cido possuindo pelo menos 66% de identidade com relação à SEQ ID N°:4, 79% de identidade com relação à SEQ ID N°:6, 78% de identidade com rela- ção à SEQ ID N°: 12, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°:14, 72% de identidade com relação à SEQ ID N°:16, 68% de identidade com relação à SEQ ID N°:20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N°:22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N°:26; b) uma variante de a) compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica; e c) um fragmento de a) ou b) possuindo atividade celulósica, o dito método compreendendo reação do material celulósico com o meio de cultura gasto para obtenção de material celulósico hidrolisa- do.