BRPI0610843A2 - vacina toxóide alfa contra c. perfringens - Google Patents

Abstract

VACINA TOXOIDE ALFA CONTRA C. PERFRINGENS. A presente invenção refere-se a vacinas que compreendem toxóides tipo alfa contra C. perfringens, fragmentos antigênicos dos mesmos, fragmentos antigênicos inativados de toxinas alfa de C. perfríngens ou qualquer combinação dos mesmos. A presente invenção descreve ainda processos de uso destas vacinas para proteção de animais contra clostridioses, doenças provocadas por bactérias do gênero Clostridium. A presente invenção descreve também processos para a produção destas vacinas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINATOXÓIDE-ALFA CONTRA C. PERFRINGENS".

Referência Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados

Este é um pedido de patente não provisório que reivindica priori-dade, segundo o § 119(e) do 35 U.S.C., do pedido de patente provisório U.S.N2 60/672 289, depositado em 18 de abril de 2005, o conteúdo do qual sãoaqui incorporados em sua totalidade por referência neste pedido de patente.Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a vacinas compreendendo toxóidesdo tipo alfa do C. perfringens, fragmentos antigênicos dos mesmos, fragmen-tos antigênicos de alfa toxinas e quaisquer combinações dos mesmos. Apresente invenção refere-se ainda a métodos para uso destas vacinas paraproteção de animais contra doenças provocadas por clostrídios. A presenteinvenção refere-se também a processos de produção destas vacinas.

Antecedentes da Invenção

O Clostridium perfringens (C. perfringens) é uma bactéria anae-róbica encontrada naturalmente no solo, em matéria orgânica em decompo-sição e como parte da flora intestinal natural de animais, inclusive de sereshumanos. O C. perfringens é também o agente etiológico de inúmeras doen-ças clostridiais, presente em animais domésticos, valiosos em termos eco-nômicos. O C. perfringens produz algumas toxinas com ação patogênica emanimais, incluindo a toxina alfa, a toxina beta, a toxina beta 2, a toxina épsi-lon, a toxina teta, a toxina um, a toxina delta, a toxina iota, a toxina kapa e atoxina lâmbda. Além disso, o C. perfringens codifica outras substâncias bio-logicamente ativas que causam efeitos patológicos, incluindo: hialuronidase,fosfatase ácida, protease, colagenase, sulfatase e neuraminidase.

As diferentes cepas de C. perfringens são designadas com Biotiposde A até E, dependendo do espectro de toxinas que aquela bactéria específicaproduz [Justin era/., Biochemistry41:6253-6262 (2002); McDonel, Pharmaco-logy of Bacterial Toxins; F Dorner and J Drews (eds.) Pergamon Press, Ox-ford (1986)]. Inicialmente, essa classificação de tipos era fundamentada emensaios de neutralização sorológica em camundongos ou porquinhos-da-índia. Mais recentemente, os métodos para classificação de tipo molecularempregam a reação em cadeia da polimerase (PCR), direcionada para seqüên-cias genéticas que codificam uma das inúmeras toxinas do C. perfringens.

A clostridiose intestinal em cavalos foi correlacionada com con-centrações altas do C. perfringens Tipo A no intestino. O quadro, em cava-los, manifesta-se por diarréia líquida profusa e um alto índice de mortalidade.O C. perfringens Tipo A está ligado também à doença entérica em leitõeslactentes com sintomas que incluem enterite necrótica leve e atrofia de vilo-sidades [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

As doenças clostridiais causadas por C. perfringens são caracte-rizadas por morte súbita em aves bem-desenvolvidas com lesões fibrinone-cróticas confluentes ("Toalha turca"), no intestino delgado (formas entéricas),e/ou hepatite associada a C. perfringens com colangiohepatite ou necrosefibrinóide no fígado. Aves acometidas passam por um período rápido de de-pressão, diarréia e desidratação. A mortalidade varia de 2% a 50%. A pato-logia hepática leva à condenação dos animais abatidos.

A enterite necrótica (EM) é um exemplo de doença entérica clos-tridial causada por C. perfringens que resulta em conseqüências econômicassignificantes na avicultura. A doença é especialmente comum em galinhasde 2 a 10 semanas de idade, criadas em chão batido, embora a doença te-nha sido também relatada em perus e galinhas poedeiras criadas em gaiola.

A enterite necrótica ocorre geralmente, na avicultura, como doença secundá-ria ou em uma situação em que há alteração da microflora intestinal normal,permitindo a proliferação anormal de C. perfringens patogênico. A prevalên-cia de enterite necrótica subclínica é desconhecida, uma vez que as lesõessomente podem ser observadas por meio de exame post-mortem. No entan-to, relatos de comprometimento e inversão do desenvolvimento alimentar eredução de peso corporal foram atribuídos à doença subclínica [Lovland andKadhusdal, Avian Path. 30:73-81 (2001)]. Fatores predisponentes que levamà enterite necrótica, tanto em surtos naturais como em modelos experimen-tais, incluem: (a) coccidiose, (b) migração de larvas parasitárias, (c) raçãocom alto teor de peixe ou trigo e (d) doenças imunossupressoras. Ademais,a enterite necrótica pode ser reproduzida experimentalmente da seguintemaneira: (i) fornecimento de ração contaminada por C. perfríngens aos ani-mais (ii) administração de culturas em vegetais por via oral ou no papo ou(iii) administração intraduodenal de caldos de culturas de toxinas brutas sembactérias aos animais.

Os Tipos A ou C do C. perfríngens são os biotipos que causamenterite necrótica em aves domésticas, sendo a toxina alfa a mais comumentedetectada [Wages and Opengart, Necrotic Enteritis. pp: 781-785, In: Diseaseof Poultry, 11th ed., (eds., Saif et ai), lowa State Press, Ames, IA (2003)]. Defato, mais de 90% dos isolados de C. perfríngens, obtidos de quarenta e du-as aves domésticas infectadas pelo Tipo A, produziram uma toxina letal, jun-tamente com sialidase, e as toxinas teta e mu [Daube et ai, AJVR 54:496-501 (1996)]. Ademais, a enterotoxina, produzida pelo C. perfríngens Tipo A,foi identificada em galinhas com enterite necrótica e pode também participarna doença intestinal [Nilo, Can. J. Comp. Med. 42:357-363 (1978)].

Recentemente, foi relatado que o C. perfríngens Tipo A ou TipoC pode codificar o gene cpb2 [Gilbert et ai, Gene 203:56-73 (1997)] e ex-pressar o seu produto, a toxina beta 2. Foi observada uma forte correlaçãoentre a expressão da toxina beta 2 e a enterite neonatal em suínos [Bues-chel et ai, Vet Micro 94:121-129 (2003)]. A toxina beta 2 foi implicada tam-bém como fator patogênico na enterite eqüina e bovina. Bueschel et ai, su-pramencionados, relataram ainda que 37,2% dos três mil e vinte isoladosobtidos de C. pe/fringens codificaram a toxina beta 2 e, dos isolados exami-nados de C. perfríngens Tipo A, 35,1% codificaram a toxina beta 2. Foi cons-tatado, na amostra limitada (n=5) de isolados de campo de C. perfríngensTipo A das aves, que =35% eram positivos para o genótipo cpb2 e 40% des-te expressaram também a toxina beta 2. Além disso, Engstrom et ai, [VetMicro 94:225-235 (2003)], ao empregarem a técnica de PCR, constataramque 12% dos isolados de C. perfríngens, provenientes de galinhas com he-patite, eram também positivos para cpb2. A enterotoxina do C. perfríngensTipo A demonstrou também ser patogênica em galinhas, ocasionando o a-cúmulo de líquido em um modelo de alça intestinal ligada [Niilo, Appl. Micro.28:889-891 (1974)].

Atualmente, os esforços para controlar o C. perfringens basei-am-se em medidas sanitárias e na introdução de antibióticos na ração dosanimais. O componente clostridial da doença responde bem aos antibióticose é, de maneira geral, suprimido por aditivos antibióticos contidos na ração emedicamentos ionóforos contra coccidiose. No entanto, antibióticos são cus-tosos e sujeitos às crescentes preocupações relativas à promoção de resis-tência bacteriana.

A vacinação tornou-se também uma medida de controle impor-tante em animais domésticos, uma vez que o curso de muitas doenças as-sociadas ao C. perfringens é rápido e freqüentemente fatal. Por exemplo, opedido de Patente U.S. N2 4 292 307 define uma vacina multivalente "uni-versal", preparada a partir de toxóides de C. perfringens Tipo A, Tipo B eTipo D, a qual inclui ainda toxóides de Cl. oedematiens e toxóide de Cl. sep-ticum. Ademais, as vacinas disponíveis no mercado são freqüentementemultivalentes e consistem em células inativadas, toxinas ou combinações deambas [consultar, Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

A vacinação das fêmeas do plantei pode resultar também emproteção passiva da ninhada nascida subseqüentemente. A proteção passi-va de neonatos mamíferos, contra infecções patológicas causadas por clos-tridium, baseia-se na transferência de anticorpos específicos sob a forma deanticorpos presente em colostro. Por exemplo, Smith e Matsuoka [Am. J.Vet. Res. 20:91-93 (1959)] empregaram uma vacina inativada para inocularovelhas prenhas e relatou a proteção induzida por transmissão materna daninhada de carneiros contra a toxina épsilon do C. perfringens.

A imunidade passiva dura tipicamente em ninhadas de mamífe-ros de 2 a 3 semanas [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

Ao contrário de mamíferos lactentes, a imunidade passiva emaves possui várias deficiências óbvias, mais acentuadamente, a ausênciacompleta de anticorpos maternos, obtidos a partir de leite materno. Emboraa imunidade passiva seja apenas uma das possíveis explicações da correla-ção que observaram, Heier et ai, [Avian Diseases 45:724-732 (2001)] nãorelataram que a sobrevida de ninhadas de pintos era significativamente maisalta em plantei de galinhas de corte norueguesas com títulos mais altos deanticorpos maternos naturais, específicos contra a toxina alfa de C. perfrin-gens, do que naqueles planteis com títulos baixos. Além disso, Lovland et ai[Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] relataram que os resultados eramcompatíveis com a proteção passiva reduzida da progênie de galinhas quetinham sido inoculadas com vacinas à base de toxóides de C. perfringensTipo A ou Tipo C, em comparação à progênie de galinhas não vacinadas.

Até aqui, não pareceu ser possível obter proteção comercial-mente significante, contra o C. perfringens, a não ser que anticorpos mater-nos para a maioria, se não para todos os componentes patológicos produzi-dos pela bactéria C. perfringens, estivesse presente no inoculado. Por e-xemplo, a vacinação da porca usando um produto que não inclua enterotoxi-épsilon, em cabras, protege somente contra morte por toxemia, porém nãocontra enterocolite [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

De fato, apesar de a arrumação em tabelas de uma quantidadeimpressionante de dados, referentes aos vários biotipos de C. perfringens esuas toxinas e substâncias bioativas deletérias correspondentes, as doençasclostridiais em animais matrizes de corte permanece um problema econômi-co relevante para os fazendeiros. Por conseguinte, há necessidade de pro-ver meios adicionais para proteção de rebanhos contra os efeitos patológi-cos do C. perfringens. Mais especificamente, permanece a necessidade deprover uma vacina segura e eficaz contra C. perfringens na avicultura. Alémdisso, há necessidade de prover uma vacina simples contra C. perfringensque possa ser administrada a fêmeas de animais, especialmente, rebanhosférteis e/ou prenhes, que protegerão passivamente as suas prole.

A citação de qualquer referência no presente não deve ser inter-pretada como admissão de que esta referência é disponibilizada ao presentepedido de patente como "técnica anterior".

Sumário da Invenção

A presente invenção prove vacinas contra C. perfringens quecompreendem toxóide alfa contra C. perfringens e/ou um fragmento antigê-nico de um toxóide alfa contra C. perfringens e/ou qualquer combinação dosmesmos sob a forma de antígeno. A presente invenção prove ainda vacinasque consistem, essencialmente, em um único toxóide Tipo alfa contra C. per-fringens e/ou um fragmento antigênico de toxóide alfa contra C. perfringense/ou um fragmento antigênico inativo de uma toxina alfa do C. perfringense/ou qualquer combinação dos mesmos, sob a forma de antígeno.

Preferencialmente, uma ou duas doses de 0,25 - 0,6 ml por do-se de uma vacina da presente invenção são suficientes para induzir pelomenos quatro unidades antitoxina (A.U.) de anticorpo antitoxina alfa, por mlde anti-soro de um animal (por exemplo, uma galinha) vacinado com a vaci-na. Em uma concretização desse tipo, a determinação de unidades antitoxi-na (A.U.) do anticorpo antitoxina alfa, por ml de anti-soro de um animal vaci-nado com a vacina, é efetuada de seis a sete semanas após a imunização.

Em uma concretização específica, uma dose única da vacina é suficientepara induzir, pelo menos, quatro unidades antitoxina (A.U.) do anticorpo anti-toxina alfa, por ml de anti-soro do animal vacinado, enquanto que, em umaconcretização alternativa, são necessárias duas doses da vacina. Em umaconcretização, o antígeno possui 2 ou mais unidades de Potência TotalCombinada (TCP).

Em uma destas concretizações, o animal é uma ave. Em umaconcretização específica, a ave é uma galinha. Em outra concretização, aave é um peru.

Em uma concretização, o antígeno originou-se de uma célula deC. perfringens Tipo A, por exemplo, um toxóide alfa do C. perfringens Tipo A.

Em outra concretização, o antígeno originou-se de uma célula de C. perfrin-gens Tipo C, por exemplo, um fragmento antigênico inativo de uma toxinaalfa de C. perfringens Tipo C. Em ainda uma outra concretização, o antígenooriginou-se de C. perfringens Tipo B. Em ainda outra concretização, o antí-geno originou-se de C. perfringens Tipo D. Ainda em uma outra concretiza-ção, o antígeno originou-se de C. perfringens Tipo E. E em mais outra con-cretização, a vacina compreende um antígeno que originou-se de um subtipode C. perfringens.

Em uma concretização, uma vacina da presente invenção com-preende um antígeno que é antígeno de um único Tipo de C. perfringens,com a ressalva de que somente antígeno de um único Tipo de C. perfringensestá presente nesta vacina. Em uma concretização específica deste tipo, oC. perfringens é do Tipo A. Em uma concretização correlata, o C. perfringensé do Tipo C. Em uma concretização, o antígeno um toxóide alfa. Em umaconcretização em particular deste tipo, o toxóide alfa está compreendido emum sobrenadante de toxóide alfa contra C. perfringens. Em uma concretiza-ção específica, a vacina compreende um sobrenadante de um único Tipo deC. perfringens, o Tipo A.

Em uma vacina da presente invenção, o antígeno é um toxóidealfa de uma toxina alfa naturalmente codificada por uma célula do C. perfrin-gens. Em outra vacina da presente invenção, o antígeno é um polipeptídeorecombinante, isto é, um daqueles codificados por um gene que foi manipu-lado geneticamente. Em uma concretização desse tipo, o polipeptídeo re-combinante é um toxóide alfa no qual regiões enzimáticas da toxina alfa cor-respondente foram geneticamente removidas ou alteradas, porém, no qualforam mantidos uma ou mais epitopos antigênicos.

Em uma concretização específica, o antígeno é um preparadointeiramente de células. Em outra concretização, o antígeno é um preparadosem células. Em ainda outra concretização, o antígeno é um toxóide alfa emum sobrenadante de toxóide alfa contra C. perfringens. Em uma concretiza-ção específica desse tipo, o sobrenadante de toxóide alfa contra C. perírin-gens é também um preparado sem células.

Em outra característica da presente invenção, uma vacina podeconter também antígenos múltiplos que podem resultar na produção de anti-corpos de uma variedade de especificações quando administrado a um ani-mal de pesquisa. Nem todos estes anticorpos precisam ser protetores contrauma doença. Em uma concretização específica desse tipo, estes antígenosderivam também de C. perfringens. Dessa forma, uma vacina da presenteinvenção pode conter fatores patogênicos ativos ou inativados, junto com umtoxóide alfa. Por conseguinte, de acordo com a presente invenção, o toxóidealfa pode estar combinado a outras células clostridiais e não clostridiais, to-xóides e extratos, além de fragmentos antigênicos inativos de toxina alfa.

Uma destas vacinas multivalentes da presente invenção com-preende um toxóide alfa contra C. perfringens e/ou um fragmento antigênicode um toxóide alfa contra C. perfringens e/ou um fragmento antigênico inati-vo de uma toxina alfa do C. perfringens e/ou qualquer combinação dosmesmos, e compreende ainda um antígeno viral e/ou um antígeno bacteria-no e/ou um antígeno parasitário. Em uma concretização específica dessetipo, a origem viral do antígeno é o vírus da doença infecciosa da bursa. Emoutra concretização, a origem viral do antígeno é o vírus da bronquite infec-ciosa. Em ainda outra concretização, a origem viral do antígeno é o reovírus.

Ainda em outra concretização, a origem viral do antígeno o vírus da doençade Newcastle. Em mais uma outra concretização, a origem bacteriana doantígeno é E. coli. Em outra concretização, a origem bacteriana do antígenoé Salmonella. Em ainda outra concretização, a origem bacteriana do antíge-no é Campylobacter. Em mais uma outra concretização, a origem parasitáriado antígeno provém de Eimeria. Em uma concretização específica dessetipo, o antígeno empregado na vacina é parte de um merozóita de Eimeria,um oocisto de Eimeria ou mista mistura dos mesmos. Em uma concretizaçãocorrelata, o hospedeiro natural do parasita é uma ave. Em uma concretiza-ção específica desse tipo, o parasita é o Eimeria e o hospedeiro natural doparasita é uma galinha.

Uma vacina multivalente da presente invenção pode compreen-der também um ou mais dos seguintes antígenos: toxina beta do C. perfrin-gens, toxina beta 2 do C. perfringens, enterotoxina do C. perfringens, toxinaépsilon do C. perfringens, toxina iota do C. perfringens, toxina kapa do C.perfringens, toxina lâmbda do C. perfringens, toxina teta do C. perfringens,toxina hemorrágica do C. sordellii, toxina letal do C. sordellii, toxina A do C.difficile, toxina B do C. difficile, toxina alfa do C. septicum, toxina alfa do C.novyi e toxina beta do C. novyi.

Em uma vacina multivalente específica da presente invenção, avacina compreende um toxóide alfa contra C. perfringens e/ou um fragmentoantigênico de um toxóide alfa contra C. perfringens e/ou um fragmento anti-gênico inativo de uma alfa toxina de C. perfringens e/ou qualquer combina-ção dos mesmos, compreendendo ainda um ou mais antígenos virais prove-nientes de vírus da doença infecciosa da bursa e/ou do vírus da bronquiteinfecciosa e/ou do reovírus e /ou do vírus da doença de Newcastle, e/ou an-tígenos bacterianos provenientes de E. coli e/ou Salmonella e/ou Campylo-bacter, além de um antígeno parasitário proveniente do Eimeria.

Em uma concretização alternativa, uma vacina multivalente dapresente invenção consiste, essencialmente, em alfa toxóide contra um úni-co Tipo de C. perfringens e/ou um fragmento antigênico de um alfa toxóidecontra C. perfringens e/ou um fragmento antigênico inativo de uma toxinaalfa de C. perfringens e/ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma con-cretização correlata, a vacina contém ainda um antígeno viral e/ou um antí-geno bacteriano e/ou um antígeno parasitário, conforme provido no presente.

Uma vacina da presente invenção pode compreender tambémum adjuvante. Um adjuvante animal popular é um adjuvante hidróxido dealumínio. Um adjuvante alternativo pode compreender emulsão água-em-óleo junto com o antígeno. Em uma vacina específica desse tipo, a emulsãoágua-em-óleo é preparada com 70% de fase oleosa e 30% de fase aquosa.

Em outra concretização, o adjuvante é especificamente um adjuvante dife-rente de hidróxido de alumínio. Em uma destas concretizações, a vacina,incluindo um adjuvante diferente de hidróxido de alumínio, é administrada aaves domésticas. Em uma concretização específica, uma vacina compreen-de um toxóide alfa contra C. perfringens, um adjuvante e um ou mais antíge-nos protetores, recombinantes ou naturais, obtidos de um vírus, bactériae/ou de um extrato bacteriano.

Em outra característica, a presente invenção prove métodos pa-ra conferir imunidade ativa a uma ave, pela imunização de uma ave comuma vacina da presente invenção. Em uma concretização específica, a doseda vacina, para esta imunidade ativa, é de aproximadamente 0,05 a aproxi-madamente 0,1 ml. Em uma concretização, a ave é um peru. Em outra con-cretização, a ave é uma galinha. Em ainda outra concretização, a ave é umfaisão. A presente invenção prove também um método de administração deuma vacina multivalente da presente invenção para uma ave para proteger amesma contra diversas doenças.

A presente invenção prove também métodos para conferir imu-nidade passiva à prole da fêmea de um animal (por exemplo, uma fêmeaprenha), compreendendo a administração de uma vacina da presente inven-ção à fêmea do animal (por exemplo, mãe), antes do nascimento de suaprogênie. Em uma concretização, a fêmea é uma ave e a vacina é adminis-trada à fêmea antes da postura de ovos que compõem a sua progênie. Des-sa maneira, é conferida imunidade passiva à sua prole. Nesta concretização,a ave é uma galinha. Em outra concretização, a ave é uma perua. Em aindaoutra concretização, a ave é a fêmea de faisão.

Em uma concretização específica, o método prove imunidadepassiva contra uma doença provocada por bactérias do gênero Clostridium àprogênie do animal vacinado. Em um destes métodos, esta doença é clostri-diose do tipo entérica. Em um método específico deste tipo, a doença entéri-ca da clostridiose é enterite necrótica. Em outro destes métodos, a doençaclostridiose é colangiohepatite. Em ainda outra concretização, o método con-fere imunidade passiva contra uma doença clostridiose à progênie do animalvacinado, bem como confere proteção contra dermatite gangrenosa, sépticae/ou hepatite.

Em uma concretização, o método para conferir imunidade passi-va à progênie da fêmea de um animal compreende a administração de umavacina multivalente à fêmea do animal para proteção de sua progênie contradiversas doenças. Em uma concretização específica deste tipo, a fêmea doanimal pertence à família de aves domésticas e sua progênie é protegidacontra diversas doenças que afetam aves domésticas.

Em uma concretização específica, a dosagem para conferir imu-nidade passiva à progênie da fêmea de um animal é de aproximadamente0,25 ml por dose da vacina. Em outra concretização, a dosagem é de apro-ximadamente 0,4 ml por dose da vacina. Em ainda outra concretização, adosagem é de aproximadamente 0,6 ml por dose da vacina. Em uma concre-tização exemplificada abaixo, a dosagem é de aproximadamente 0,5 ml pordose da vacina.

A presente invenção prove ainda um processo para produção deuma vacina de toxóide alfa contra C. perfringens da presente invenção. Umdestes métodos, compreende o cultivo de uma célula de C. perfringens emum meio de cultura que produza quantidade suficiente de células cultivadasque permita a secreção de uma toxina alfa de C. perfringens no meio celular.

O toxóide alfa contra C. perfringens é produzido, em seguida, por inativaçãoda toxina alfa secretada. A maior parte das células cultivadas são removidasdo meio de cultura para formarem um sobrenadante contendo toxóide alfacontra C. perfringens. Em uma concretização específica do método, a con-centração do sobrenadante contendo toxóide alfa contra C. perfringens éajustada de forma a ser suficiente para induzir pelo menos quatro unidadesde antitoxina (A.U.) do anticorpo antitoxina alfa por ml de anti-soro de umanimal (por exemplo, uma galinha) que foi vacinado com uma ou duas dosesde 0,25 - 0,6 ml por dose da referida vacina. Em uma destas concretiza-ções, o processo de concentração inclui uma diafiltração contra uma soluçãotamponada a fim de remover contaminantes de baixo peso molecular.

O processo de produção de uma vacina de toxóide alfa contra C.perfringens da presente invenção pode compreender ainda a mistura do so-brenadante contendo alfa toxóide contra C. perfringens com um adjuvante.

Em uma destas concretizações, o sobrenadante contendo toxóide alfa contraC. perfringens é misturado em uma emulsão água em óleo. Em uma concre-tização específica deste tipo, a emulsão água em óleo é preparada com 70%de fase oleosa e 30% de fase aquosa.

As células de C. perfringens, empregadas no processo, podemser células provenientes de um único Tipo de C. perfringens. Em uma con-cretização específica deste tipo, a célula do único Tipo de C. perfringens éuma célula de C. perfringens Tipo A. Em uma concretização alternativa, acélula do único Tipo de C. perfringens é uma célula de C. perfringens Tipo C.Estas e outras características da presente invenção serão apre-ciadas melhor por referência à Descrição Detalhada a seguir.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção prove vacinas únicas contra C. perfringensque são seguras e eficazes para prevenção de doenças provocadas por bac-térias do gênero Clostridium em animais. Em uma concretização específica,a administração de uma vacina da presente invenção à fêmea de um animalresulta na imunização da fêmea do animal e no desenvolvimento de anticor-pos que podem ser transferidos passivamente para sua progênie nascidasubseqüentemente. Em uma concretização, a presente invenção prove umavacina que compreende uma quantidade específica mínima de um toxóidealfa contra um único Tipo de C. perfringens, eficaz contra infecções nocivasprovocadas pelo C. perfringens. Em uma concretização específica, a vacinacompreende uma combinação segura e imunologicamente eficaz de um to-xóide alfa da presente invenção e um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

As vacinas da presente invenção podem ser utilizadas para pro-teger contra qualquer condição ou doença em que haja participação do C.perfringens. Estas doenças incluem doenças do tipo clostridiose. Em umaconcretização deste tipo, a clostridiose é uma doença entérica. Por conse-guinte, em uma concretização específica, a presente invenção prove vacinasque são eficazes para a prevenção da manifestação entérica da clostridioseem aves domésticas, conhecida como enterite necrótica. Outras síndromesde doenças podem ser prevenidas também pelas vacinas da presente in-venção e incluem, entre outras, hepatite relacionada a clostrídios, colangio-hepatite e dermatite gangrenosa.

A presente invenção expõe que uma vacina compreendendouma quantidade específica mínima de toxóide alfa (isto é, que tenha um TCPespecífico mínimo), obtido de um único Tipo de C. períringens, protege aprogênie da fêmea vacinada do animal, sujeita a clostridioses como enteritenecrótica, independentemente de quaisquer toxinas letais adicionais expres-sadas por um C. perfringens provocado. A presente invenção expõe aindauma vacina que resulta em uma resposta específica mínima de antitoxinaalfa, proveniente da fêmea vacinada do animal, que protege também a pro-gênie desta fêmea vacinada do animal, sujeita a clostridioses, independen-temente de quaisquer toxinas letais adicionais expressadas por C. perírin-gens naturalmente existente. As vacinas da presente invenção podem seradministradas também junto a um adjuvante aceitável.

Conforme é exemplificado abaixo, galinhas vacinadas com umavacina derivada de um isolado inativado de C. perfringens Tipo A que ex-presse uma toxina alfa, porém não uma toxina beta 2 correspondente, levouinesperadamente à imunização passiva de pintos da progênie de três sema-nas em um teste com uma cepa de C. perfringens que expressava tanto atoxina alfa como a toxina beta 2. Até esta data, não havia evidências dessaproteção cruzada contra estas duas toxinas distintas. Por conseguinte, apresente invenção prove vacinas relativamente simples que são capazes deestimular uma quantidade específica mínima de antitoxinas alfa e, dessemodo, proteger contra doenças provocadas por bactérias do gênero Clostri-dium, por exemplo, enterite necrotica, não obstante o tipo de outras toxinasque a cepa testada de C. perfringens possa expressar.

De fato, apesar de a multiplicidade de toxinas e de outras proteí-nas biologicamente ativas, produzidas pelo C. perfringens e que demonstra-ram possuir efeitos patogênicos sobre animais, e as inúmeras citações naliteratura sobre as contribuições destas várias toxinas e de outras proteínaspara a patologia da enterite necrotica, as vacinas únicas, descritos no pre-sente pedido, provêem uma resposta imunológica relevante contra C. per-fringens em galinhas poedeiras vacinadas, além de imunidade passiva parasua ninhada nascida subseqüentemente.

Embora a presente invenção independa completamente dequalquer teoria ou modelo, os resultados providos neste pedido são compa-tíveis com o fato de que a toxina alfa do C. perfringens é o componente anti-gênico não só necessário como suficiente para proteção contra a enteritenecrosante. Embora as toxinas beta, beta 2 e enteroxinas possam ser fun-damentais para a patologia da enterite necrosante, os resultados providosneste pedido são compatíveis com o fato de que o toxóide alfa é o único to-xóide necessário em uma vacina para enterite necrosante. Ademais, como aprodução da toxina alfa é, de maneira geral, a mais alta em cepas do Tipo A,as cepas de C. perfringens Tipo A são particularmente úteis como fonte detoxina alfa do C. perfringens. No entanto, outros Tipos de C. perfringens po-dem ser utilizados com êxito, especialmente quando modificação genéticativer sido utilizada para aumentar o nível de produção de toxina alfa nestesoutros Tipos.

Conforme utilizados no presente, os termos seguintes possuirãoas definições descritas abaixo:

Conforme utilizado no presente, um "antígeno de proteção" é umantígeno que resulta na produção de anticorpos específicos que conferemproteção contra infecção e/ou doença ao animal vacinado com aquele antí-geno e/ou sua progênie. Uma vacina que contenha este antígeno de prote-ção é chamada de "imunologicamente eficaz".

Conforme utilizado no presente, o termo "fragmento antigênico",em relação a uma proteína em particular, é um fragmento desta proteína queé antigênico. Por exemplo, um fragmento antigênico de uma toxina alfa oude um toxóide alfa é um fragmento da toxina alfa ou toxóide alfa que é anti-gênico. Conforme utilizado no presente, um fragmento antigênico de umatoxina alfa ou de um toxóide alfa pode ser qualquer fragmento da toxina alfaou toxóide alfa, respectivamente, incluindo fragmentos grandes, em que detoda a extensão da proteína esteja faltando apenas um único aminoácido.

Em uma concretização específica, um fragmento antigênico de uma toxinaalfa ou toxóide alfa contém entre 6 e 120 resíduos de aminoácidos. Ademais,um fragmento antigênico de uma determinada toxina alfa pode ser obtido deorigem recombinante, de uma proteína isolada de fontes naturais ou pormeio de síntese química. Além disso, um fragmento antigênico pode ser ob-tido após a digestão proteolítica de uma toxina alfa, toxóide alfa ou de umfragmento dos mesmos, por meio de expressão recombinante ou, alternati-vamente, ele pode ser gerado de novo, por exemplo, por meio de sínteseprotéica.Conforme utilizado no presente, um "fragmento antigênico inati-vo" de uma toxina alfa de C. perfringens é um fragmento antigênico de umatoxina alfa de C. perfringens que retém pelo menos um epitopo antigênico,porém não possui atividade catalítica suficiente da toxina alfa para torná-lodeletério. Estes fragmentos antigênicos inativos pode ser utilizados isolada-mente ou, alternativamente, podem ser incorporados em proteínas de fusão.

Conforme utilizado no presente, o termo "toxóide alfa" refere-sea qualquer toxina alfa inativa (por exemplo, uma toxina alfa de extensãocompleta), porém não pretende restringir de forma alguma os meios especí-ficos de inativação de toxina alfa para produção daquele toxóide alfa. Estesprocessos de inativação incluem: (i) processos químicos que modificam aproteína intacta, por exemplo, tratamento com formaldeído ou glutaraldeído;(ii) processos físicos, como aquecimento; (iii) processos enzimáticos quealteram a proteína, como uma protease que diva a toxina em fragmentos;(iv) processos recombinantes, como engenharia genética do gene da toxinaalfa para remover ou alterar regiões enzimáticas da proteína, porém retendoum ou mais epitopos antigênicos (consultar, por exemplo., US 5.817.317,cujo conteúdo é aqui, integralmente, incorporado por referência neste pedidode patente); e/ou combinações de todos e quaisquer dos precedentes.

Conforme utilizado no presente, um "sobrenadante de toxóidealfa" de C. perfringens é uma solução compreendendo toxina alfa inativadade C. perfringens, na qual pelo menos a maioria das células que produzem atoxina foram removidas (isto é, mais de 70% das células tendo sido removi-das e, em uma concretização específica, mais de 90% das células tendosido removidas). Em uma concretização específica, a toxina alfa do C. per-fringens foi secretada no meio de cultura, por células do C. perfringens queforam acrescentadas e/ou cultivadas naquele meio de cultura e, em seguida,inativadas. Em outra concretização, a toxina alfa inativada do C. perfringensinclui a toxina alfa do C. perfringens associada às células que foram libera-das por lise celular e inativadas em seguida. Os meios de preparo do "so-brenadante de toxóide alfa" não pretendem de forma alguma ficarem restri-tos a qualquer processo em particular de remoção das células ou de restoscelulares da solução, e incluem centrifugação, cromatografia em coluna, ul-trafiltração, etc.

Conforme utilizada no presente, uma solução "livre de células" éaquela em que mais de 90% das células de uma cultura foram removidas.

Os meios de preparado da solução "livre de células" não pretendem de for-ma alguma ficarem restritos a qualquer processo em particular de remoçãodas células ou de restos celulares da solução, e inclui centrifugação, croma-tografia em coluna, ultrafiltração, etc.

Conforme utilizado no presente, o termo "único Tipo de C. per-fringens" refere-se a um Tipo de C. perfringens, por exemplo, Tipo A ou TipoB ou Tipo C, etc, ao contrário de múltiplos Tipos, por exemplo, Tipo A e TipoB e Tipo C. Por conseguinte, uma célula, composição, preparado, vacina,etc, compreendendo um toxóide alfa contra "um único Tipo de C. perfrin-gens" é uma célula, sobrenadante, composição, preparado, vacina, etc, quecontém toxóide alfa proveniente de um único Tipo específico de C. perfrin-gens e não contém toxóide alfa proveniente de qualquer outro Tipo de C.perfringens. Por outro lado, estas células, sobrenadantes, composições,preparados, vacinas, etc, podem conter outros componentes diferentes detoxóide alfa, incluindo outros toxóides contra C. perfringens e/ou adjuvantes,e/ou estimuladores imunológicos, etc.

Conforme utilizada no presente, uma "unidade antitoxina" ou"A.U." de anticorpo antitoxina alfa por ml de anti-soro é utilizada alternada-mente com unidades de "Teste Neutralizante de antitoxina alfa" ou unidadesde "TNT", e é definida pela capacidade do soro de neutralizar os efeitos tóxi-cos da toxina alfa em um ensaio biológico com camundongos. Neste teste,uma quantidade conhecida de toxina alfa, estabelecida por padrões interna-cionais [Farmacopéia Européia 5.0.: 01/2005:0088, páginas 803-804] é mis-turada a uma série de diluições de soro obtido de animais vacinados. A mis-tura é incubada por uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, inje-tada por via intravenosa em camundongos. Os camundongos sobreviverãose a toxina for completamente neutralizada pelo soro, em caso contrário,morrerão. As unidades ou título de antitoxina são determinados como o nú-mero inversamente proporcional à diluição mais alta do soro que neutralizoua toxina.

Conforme utilizado no presente, o termo "Poder Total Combina-do" é abreviado por "TCP" e definido conforme descrito por Batty [Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Capítulo 8, Volume 5A (1971), ed.JR Norris e DW Ribbons]. Neste ensaio, um volume específico do sobrena-dante contendo toxóide alfa é posto em contato com uma quantidade conhe-cida de antitoxinas. Após um período de incubação apropriado, para permitirque a antitoxina e o toxóide alfa se liguem, por exemplo, uma hora em tem-peratura ambiente, uma quantidade conhecida de toxina alfa é acrescenta-da. É fornecido então um período adequado ao restante de antitoxina livrepara se ligar com a toxina alfa, por exemplo, uma hora em temperatura am-biente. A quantidade de toxina alfa livre é determinada em seguida pelo a-créscimo de um substrato à solução para medir a atividade enzimática datoxina alfa. Substratos adequados incluem hemácias (principalmente hemá-cias de ovelha) e lecitina. O toxóide alfa pode então ser quantificado pelocálculo da quantidade de atividade enzimática determinada. Quanto maior aquantidade presente de toxóide alfa na solução do ensaio, mais alto o valorda atividade enzimática medido no ensaio.

Os termos "Tipo" e "biotipo" são utilizados no presente alterna-damente e referem-se ao fenótipo específico de um C. perfringens tendocomo base a expressão de vários genes de toxinas. O Clostridium perfrin-gens é dividido em tipos, baseado na produção de quatro toxinas principais,alfa, beta, épsilon e iota. O C. perfringens Tipo A produz toxina alfa; o Tipo Bproduz toxinas alfa, beta e épsilon; o Tipo C produz toxinas alfa e beta, oTipo D produz toxinas alfa e épsilon, o Tipo E produz toxinas alfa e iota. Fo-ram descritas 17 exotoxinas de C. perfringens. A classificação de biótipos deC. perfringens baseia-se na produção de algumas ou de todas as outras to-xinas e/ou enzimas clostridianas. Por exemplo, um tipo patológico enteroto-xigênico do C. perfringens Tipo A produz toxinas teta e um, além da toxinaalfa.

Conforme utilizada no presente, uma vacina multivalente é umavacina que compreende dois ou mais antígenos diferentes. Em uma concre-tização específica deste tipo, a vacina multivalente estimula o sistema imu-nológico do recipiente contra dois ou mais patógenos diferentes.

O termo "adjuvante" e "estimulador imunológico" são utilizadosno presente alternadamente e definidos como uma ou mais substâncias queocasionam estimulação do sistema imunológico. Nesse contexto, um adju-vante é utilizado para intensificar uma resposta imunológica a um ou maisantígenos da vacina. Um adjuvante pode ser administrado para o animal vi-sado antes, em combinação ou após a administração da vacina. Adjuvantesda presente invenção podem ser obtidos de algumas origens, incluindo apartir de origem natural, origem recombinante e/ou sintetizados quimicamen-te, etc. Exemplos de compostos químicos utilizados como adjuvantes inclu-em, entre outros, compostos de alumínio, óleos que podem ou não ser me-tabolizados, polímeros em bloco, ISCOM (complexos estimuladores imuno-lógicos), vitaminas e minerais (incluindo, entre outros: vitamina E, vitaminaA, selênio e vitamina B12), Quil A (saponinas) e CARBOPOL®. Exemplosadicionais de adjuvantes, os quais às vezes foram referidos especificamentecomo estimuladores imunológicos incluem componentes de parede celularde bactérias e de vírus (por exemplo, lipopolissacarídeos, lipoproteínas, gli-coproteínas, muramilpeptídeos, beta-1,3/1,6-glucanos), vários complexos decarboidratos derivados de plantas (por exemplo, glicanos, acemannan), vá-rias proteínas e peptídeos de origem animal (por exemplo, hormônios, citoci-nas, fatores co-estimuladores) e novos ácidos nucléicos derivados de vírus ede outras fontes (por exemplo, RNA de dupla fita, CpG). Além disso, qual-quer número de combinações das substâncias supramencionadas pode pro-ver um efeito adjuvante e pode, por conseguinte, formar um adjuvante dapresente invenção.

Conforme utilizada no presente, uma "antitoxina alfa" é um anti-corpo (monoclonal ou policlonal) que se liga à toxina alfa. Anticorpos contratoxina alfa podem ser determinados por um ensaio de TNT conforme descri-to acima. Alternativamente, anticorpos podem ser detectados por sua capa-cidade de bloquearem o efeito hemolítico da toxina alfa. Em um ensaio deinibição de hemólise, uma quantidade conhecida de toxina alfa, suficientepara catalizar a lise de um preparado específico de hemácias de ovelhas, émisturada a uma série de diluições de soro e incubada por uma a uma horaem 36 ± 2°C. A mistura é em seguida incubada com hemácias de ovelhas a0,5% por três horas em 36 ± 2°C. Quando o anticorpo liga-se à toxina alfa, atoxina é incapaz de hemolisar as hemácias. O título é determinado pelo valorinversamente proporcional à diluição mais alta do soro que resultar em au-sência de hemólise. Em um ensaio semelhante, a capacidade de anticorposde se ligar à toxina alfa para inibir a atividade de fosfolipase pode ser medidapela determinação da diluição mais alta do soro que bloqueia a clivagem dalecitina.

Conforme utilizado no presente, o termo "polipeptídeo" é utiliza-do, alternadamente, com o termo "proteína" e pretende ainda incluir peptí-deos. Por conseguinte, conforme utilizado no presente, um polipeptídeo éum polímero de dois ou mais aminoácidos, unidos por ligações peptídicas.Polipeptídeos da presente invenção incluem proteínas que ocorrem natural-mente; proteínas recombinantes, proteínas sintetizadas quimicamente; frag-mentos de proteínas naturais, recombinantes ou sintéticas, além de proteí-nas de fusão que compreendem qualquer proteína natural, recombinantee/ou sintética e/ou quaisquer de seus fragmentos. Preferencialmente, o ter-mo polipeptídeo é utilizado para definir um polímero compreendendo vinteou mais resíduos de aminoácidos, unidos por ligações peptídicas.

Uma "seqüência heteróloga de nucleotídeos", conforme utilizadano presente, é uma seqüência de nucleotídeos que foi acrescentada porprocessos recombinantes a uma seqüência de nucleotídeos que codificauma proteína da presente invenção, por exemplo, uma toxina alfa da presen-te invenção, ou que codifica um fragmento da mesma (por exemplo, umfragmento antigênico inativo), para formar um ácido nucléico que não é for-mado naturalmente na natureza. Estes ácidos nucléicos podem codificar pro-teínas de fusão. Ademais, conforme utilizada no presente, uma seqüênciaheteróloga de nucleotídeos não precisa ser uma seqüência contígua de nu-cleotídeos, porém pode incluir múltiplas seqüências não contíguas de nucle-otídeos que foram combinadas a uma seqüência de nucleotídeos que codifi-ca um polipeptídeo da presente invenção, ou uma porção do mesmo. Umaseqüência heterologa de nucleotídeos pode compreender seqüências nãocodificadoras, incluindo sítios de restrição, sítios de regulação, promotores esimilares. Em ainda outra concretização, a seqüência heterologa de nucleo-tídeos pode funcionar como meio de detecção de uma seqüência de nucleo-tídeos da presente invenção. A presente invenção prove seqüências heteró-logas de nucleotídeos que, quando combinadas a seqüências de nucleotí-deos, codificam um polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo, esão necessárias e suficientes para codificar todas as proteínas de fusão dapresente invenção.

Conforme utilizada no presente, uma vacina "constituída essen-cialmente de" ou que "consiste essencialmente em" um toxóide alfa contraum único Tipo de C. perfringens e/ou fragmento antigênico do toxóide alfacontra C. perfringens e/ou fragmento antigênico inativo da toxina alfa corres-pondente é uma vacina que contém uma quantidade imunologicamente efi-caz do toxóide alfa contra o único Tipo de C. perfringens e/ou fragmento an-tigênico do toxóide alfa contra C. perfringens e/ou fragmento antigênico ina-tivo da toxina alfa correspondente, para proteger contra uma doença clostri-diana, porém não contém uma quantidade imunologicamente eficaz de qual-quer outro antígeno conhecido que proteja contra uma doença clostridiana,como outro antígeno do C. perfringens ou toxina alfa, toxóide alfa ou frag-mento dos mesmos de outro Tipo de C. perfringens. Estas vacinas podemincluir ainda antígenos relacionados a outras doenças como antígenos viraisdo vírus da doença infecciosa da bursa, reovírus e vírus da doença de New-castle; antígenos bacterianos de E. coli, Salmonella, e Campylobacter, e an-tígenos parasitários como os de Eimeria.

Conforme utilizado no presente, o termo "aproximadamente",quando utilizado em conjunto com um valor particular de dose, significa queo valor da dose inclui 20 por cento do valor indicado, por exemplo, uma dosede aproximadamente 0,5 ml pode compreender entre 0,4 ml e 0,6 ml.Isolamento de C. Perfringens Tipo A

Isolados de C. perfringens, como de C. períringens Tipo A, po-dem ser obtidos de amostras de fezes e/ou esfregaços intestinais de animaisinfectados. As amostras/esfregaços podem ser aplicadas sobre placas deÁgar sangue, incubados sob condições anaeróbicas em 35 ± 1QC por 24-48horas e as colônias que se parecem com as de C. períringens tipo A sãocoletadas individualmente. Para confirmar a sua identificação como isola-do(s) de C. perfringens tipo A , as colônias selecionadas podem ser aindatestadas quanto a características bioquímicas do C. períringens tipo A, inclu-indo constituição genética.

A presença do gene da toxina alfa no isolado pode ser determi-nada por análise genética, por exemplo, por PCR. A expressão da toxina alfapode ser demonstrada por sua atividade de lecitinase em um ensaio utilizan-do geme de ovo e/ou por ensaio de hemólise empregando hemácias de ove-lhas. Em uma concretização específica, isolados de C. perfringens que ex-pressam um nível alto de toxina alfa são utilizados no preparo de uma vacinada presente invenção. Um isolado ou mais selecionados de C. períringenspodem crescer anaerobicamente em caldo nutritivo por 4-24 horas. A culturapode ser inativada com, por exemplo, formalina, concentrada e mistura aesta vacina.

Toxinas do C. Períringens

Toxina alfa - A toxina alfa é produzida por todos os tipos de C.perfringens. A toxina alfa é uma fosfolipase C multifuncional que pode dividira lecitina, formando fosforilcolina e um diglicerídeo. Quando administradapor via intravenosa, a toxina alfa demonstrou ser letal para camundongos. Atoxina alfa é também acentuadamente hemolítica. No entanto, a susceptibili-dade das hemácias pode variar imensamente dependendo da espécie deanimal utilizada como a fonte das hemácias. A toxina alfa também acarreta aagregação de plaquetas, a lise de plaquetas, leucócitos e de outras célulasdo corpo, bem como ocasiona aumento da permeabilidade vascular.

Toxina beta - A toxina beta é produzida por C. períringens TiposB e C. A toxina beta é responsável pela inflamação do intestino e perdasvolumosas de muco, bem como pela inibição do movimento intestinal. Ela éuma proteína com peso molecular de 35 kDa e muito mais susceptível a en-zimas proteolíticas, como tripsina, do que outras toxinas do C. perfringens.De acordo com o relatado, esta toxina é letal para animais, sendo camun-dongos os mais sensíveis e galinhas, as menos sensíveis.

Toxina beta 2 - A toxina beta 2 é a toxina mais recentementedescoberta do C. perfringens. Apesar da semelhança de nomes, não foiconstatada homologia entre a seqüência de aminoácidos da toxina beta 2 eda toxina beta. A literatura mostrou haver uma forte relação entre a toxinabeta 2 e enterite necrosante em certos animais [Garmory et ai, Epidemiol./nfect. 124:61-67 (2000), Herholz et ai, J. Clin. Morco, Feb:358-361 (1999)].A toxina beta 2 possui 28 kDa de peso molecular e foi constatado que elaera letal para camundongos e citotóxica para certas linhagens celulares, in-duzindo ao arredondamento e lise das células sem afetar o citoesqueleto deactina [Manteca et ai, Vet. Microb. 86:191-202 (2002), Schotte et ai, J. VetMed B 51:423-416 (2004), Gilbert et ai, Gene 203:65-73 (1997)].

Enterotoxina - A enterotoxina é produzida tipicamente por cepasdo C. perfringens Tipo A. A presença da enterotoxina foi tradicionalmenteutilizada para delinear cepas associadas à doença entérica daquelas associ-adas à gangrena gasosa tecidual. As cepas que provocam gangrena gasosanão possuem tipicamente enterotoxina. A enterotoxina é uma proteína sen-sível ao calor com peso molecular de 34 kDa. A dose letal para camundon-gos é de aproximadamente 10 microgramas. Inicialmente, a interação formaporos na célula do hospedeiro, seguido por alteração da permeabilidade ce-lular, inibição da síntese de macromoléculas, desintegração do citoesqueletoe, finalmente, lise [consultar, Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].A enterotoxina afeta o sentido inverso do transporte líquido nas células dointestino.

Toxina épsilon - Esta toxina é produzida por C. perfringens Ti-pos B e D. A toxina épsilon é secretada sob a forma de pró-toxina, converti-da pela tripsina endógena em uma neurotoxina extremamente potente.Quando administrada por via intravenosa, esta toxina pode ser extremamen-te letal para camundongos. A toxina épsilon possui uma alta afinidade pelotecido nervoso e tem como efeito a permeabilidade vascular. Ela altera tam-bém a permeabilidade da parede do intestino, permitindo a entrada de molé-culas grandes, inclusive a sua, na circulação sangüínea. A toxina épsilonsegue, em seguida, pela circulação sangüínea até o cérebro onde provoca odesequilíbrio osmótico. Este desequilíbrio osmótico no cérebro leva a sinaisneurológicos, observados antes da morte do animal acometido.

Toxina kapa - Esta toxina é uma enzima com capacidade parahidrolisar colágeno, produzida por C. perfringens Tipos A, D, E e alguns Ti-pos B e C. A toxina kapa possui peso molecular de 80 kDa e é letal paracamundongos. A injeção intravenosa da toxina kapa, em um camundongo,levou à morte em uma hora em decorrência da intensa hemorragia dos pulmões.

Toxina teta - A maioria das cepas de C. perfringens produz toxi-na teta. Esta toxina é uma proteína de 74 kDa, responsável pelas zonas cla-ras de hemólise observadas em volta de colônias em placas de ágar sangue.

A toxina teta purificada é extremamente letal para camundongos, levando àmorte em questão de minutos. Ela é inibida por certos esteróides, sendo ocolesterol o inibidor mais potente.

Imunidade passiva

A presente invenção inclui uma vacina contendo um preparadoseguro e imunologicamente eficaz de uma quantidade mínima de um antíge-no da presente invenção, por exemplo, um toxóide alfa, para vacinação defêmeas não humanas, principalmente fêmeas férteis e/ou prenhas, que po-dem então transferir o efeito da vacina para sua prole. Esta transferência deimunidade materna para progênie é denominada "imunidade passiva". A i-munidade passiva pode ser obtida, inter alia, pela ingestão de colostro, con-forme ocorre em mamíferos, ou a capacidade de absorção de anticorpos,com entrada na circulação sangüínea vindos da gema de ovo, conforme o-corre em aves domésticas. Além disso, conforme exposto no presente pedi-do, as aves domésticas podem consumir anticorpos em ovo, resultando emaumento do nível de anticorpos sistêmicos circulantes.Como demonstrado no presente, a transferência passiva de umaquantidade específica de antitoxina alfa para o animal recém-nascido prote-ge este recém-nascido contra um ataque de um Clostridium perfringens viru-lento. A extensão da proteção, conforme exposta abaixa, foi inteiramenteinesperada, uma vez que até esta data, acreditava-se ser obrigatório parauma proteção significativa contra um ataque oral de C. perfringens Tipo Aque o intestino tivesse que ser banhado com anticorpos. Da mesma forma, ébastante surpreendente que existisse uma correlação entre transferênciamaterna de anticorpo de imunidade de mucosa através da ingestão de colos-tro, no mamífero recém-nascido, e a absorção de anticorpos maternos noovo.

Como demonstrado abaixo para galinhas, os anticorpos do tipoantitoxina alfa são absorvidos na circulação sangüínea em ovo. Ademais, apresente invenção descreve que a indução de um título definido do anticorpoantitoxina alfa mínimo específico, na circulação sangüínea da galinha, é sufi-ciente para proteger a ninhada daquela galinha vacinada de um ataque deum C. perfringens Tipo A, efetuado semanas após o nascimento desta ni-nhada.

Imunidade ativa

A presente invenção inclui a vacinação de pintos (por exemplo,pintos de granja) e/ou filhotes de peru para conferir imunidade ativa contraenterite necrótica, dermatite necrótica e dermatite gangrenosa. Os pintose/ou filhotes de peru são vacinados precocemente em vida, aproximadamen-te com um dia de vida ou ligeiramente mais velhos (na primeira semana devida) com uma dose única ou duas da vacina. As dosagens apropriadas davacina para obter-se imunização ativa podem variar de aproximadamente0,05 ml a aproximadamente 0,5 ml. Em uma concretização específica, a do-sagem da vacina é de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 0,1 ml.

Cultura de células

O Clostridium perfringens secreta toxina alfa no meio durante ocrescimento. Após inativação e remoção de pelo menos a maioria das célu-las do meio de crescimento, a solução resultante é referida como sobrena-dante de toxóide alfa. As células são geralmente removidas para minimizar apresença de antígenos externos na vacina que poderiam promover de outraforma reatividade e diminuírem a resposta imunológica. No entanto, a quan-tidade de toxina alfa associada à célula é limitada. Por conseguinte, o antí-geno da toxina alfa pode ser derivado das células e/ou o meio, de formaconcentrada ou não concentrada.

O C. perfríngens pode ser cultivado em qualquer recipiente a-propriado, incluindo frascos, tubos, vasilhames ou meios de fermentaçãomecânicos. A fermentação pode ser monitorada durante o crescimento deforma a ser feita a colheita da fermentação quando a produção de toxina alfaestiver em seu pico. Processos típicos incluem cromatografia por afinidade,eletroforese em gel (sistema PHAST, etc), imunoensaios e ensaios de he-molisina e lecitinase. O líquido ou extrato da cultura de células pode ser ina-tivado com formaldeído (0,1-2,0%) ou uma combinação de formaldeído ecalor. Outras substâncias químicas tipicamente utilizadas para desnaturaçãode proteína e que podem ser empregadas também incluem, entre outros:glutaraldeído, fenol, vários detergentes como Triton X-100, Sulfato de dode-cil sódico (SDS), e álcoois. Os níveis residuais de formaldeído podem sermonitorados durante a inativação para manter um nível ideal sem produçãoexcedente ou insuficiente de toxóide. Processos típicos para determinaçãode formaldeído livre são listados na Farmacopéia Européia (01/2005:20418)ou em 9 CFR (113.100). Há disponíveis processos semelhantes para deter-minação de outros tipos de agentes de inativação de toxinas. Em certas cir-cunstâncias, a toxina alfa é deliberadamente mantida sub-toxóide neste pon-to para minimizar a desnaturação de epitopos fundamentais para o desen-volvimento de antitoxinas e, em seguida, tratada posteriormente para neutra-lização de poder tóxico em um ponto adiante no processo. Outros agentesquímicos ou biológicos adequados capazes de inativar a toxina e que podemser utilizados são glutaraldeído, fenol, vários detergentes como Triton X-100,Sulfato de dodecil sódico (SDS) e álcoois.

O toxóide alfa resultante pode ser armazenado, sem efeitos no-civos, por um período de tempo antes de qualquer processamento adicional.Tipicamente, o armazenamento ideal é em 2-8°C. Toxóides inativados contraclostrídios, no entanto, são extremamente estáveis e podem ser armazena-dos em temperatura mais alta. Para períodos de armazenamento superioresa 6 meses em temperaturas superiores a 8°C, pode ser recomendável repe-tir o teste da potência do toxóide, fazendo-se um teste de Poder Total Com-binado (TCP) ou outro ensaio imunológico semelhante para determinar aestabilidade imunogênica do toxóide.

As células podem ser removidas do meio de cultura inativadopor centrifugação e/ou filtração para obter o sobrenadante do toxóide. A re-moção das células serve para reduzir a reatividade de tecidos que pode sercausada pelos componentes celulares, enquanto que a remoção de antíge-nos externos do preparado ajuda a fazer com que a resposta imunológicafique voltada para o componente toxóide da vacina.

O meio de cultura inativado pode ser concentrado por algumastécnicas, incluindo ultrafiltração (preferencialmente utilizando membranas deultrafiltração com limites para peso molecular inferiores a 30.000) ou por liofi-lização. O processo de concentração pode incluir diafiltração em uma solu-ção aquosa (por exemplo, solução salina com tampão fosfato), visando re-mover contaminantes de baixo peso molecular do preparado. O líquido con-centrado pode ser tratado uma ou mais vezes com formaldeido e/ou caloraté que um ensaio adequado indique não haver mais toxicidade no líquido.Estes ensaios incluem um ensaio biológico com camundongo, isto é, a inje-ção do líquido no camundongo e a observação de seus efeitos sobre o ca-mundongo ou a determinação da atividade da hemolisina ou da lecitinase,etc.

O pH da solução pode precisar ser ajustado antes de ser efetua-da a mistura para assegurar uma ligação ideal aos adjuvantes, emulsificaçaocom óleos e/ou estabilidade da solução. O ponto isoelétrico (pl) da toxinaalfa é de aproximadamente 5,5 [Smith era/., The Pathogenic Anaerobic Bac-teria, (3rd Ed.) Charles Thomas Publishers, p. 116 (1984)]. O ajuste do pHda solução do toxóide alterará a carga final sobre a proteína, intensificandovantajosamente a ligação de certos adjuvantes, como adjuvantes de alumí-nio. O pH pode ser ajustado também para um nível que aumente a estabili-dade do toxóide alfa para armazenamento por um período de tempo prolon-gado. Por exemplo, as proteínas são mais propensas a precipitar em umasolução que tenha o seu pl, porém são geralmente estáveis em pH com 1unidade acima ou abaixo desse valor.

Ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos da invenção

Um ácido nucléico, como um cDNA, que codifica um polipeptí-deo da presente invenção, pode ser utilizado para gerar células recombinan-tes do hospedeiro bacteriano que expressem uma proteína e/ou antígeno dapresente invenção, por exemplo, a toxina alfa. Estas células recombinantesdo hospedeiro podem ser inativadas, isto é, convertida em bacterinas, e utili-zadas em composições imunogênicas como vacinas.

Ademais, a obtenção e/ou construção de um ácido nucléico quecodifique um polipeptídeo da presente invenção, inclui aqueles que codifi-cam uma toxina alfa da presente invenção, ou um fragmento antigênico ina-tivo da mesma, pode facilitar a produção da toxina alfa, toxóide alfa ou defragmentos dos mesmos. A toxina alfa, toxóide alfa e/ou fragmentos antigê-nicos de qualquer um destes são úteis para produção de certas vacinas dapresente invenção.

De acordo com o mesmo, a presente invenção inclui construtosde ácidos nucléicos que permitem a expressão e isolamento das proteínase/ou fragmentos antigênicos da presente invenção. Seqüências para estesácidos nucléicos e proteínas recombinantes correspondentes dos antígenosa serem utilizados nesta caracterização da presente invenção são bem-conhecidos para o versado na técnica. Uma amostra pequena dos antígenosque podem ser utilizados nas vacinas da presente invenção, juntamente como seu número de acesso no GenBank e um artigo científico expondo suasseqüências de aminoácidos são providos abaixo.Exemplos de antígenos que podem ser utilizados em vacinas

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1 Estas seqüências providas nestes artigos são aqui incorporadas por referência.Os ácidos nucléicos que codificam antígenos protéicos que po-dem ser utilizados nas vacinas da presente invenção podem conter aindaseqüências heterólogas de nucleotídeos. Para expressar uma proteína re-combinante da presente invenção na célula de um hospedeiro, pode serconstruído um vetor de expressão compreendendo o cDNA correspondente.

A presente invenção, portanto, inclui vetores de expressão contendo ácidosnucléicos que codificam proteínas recombinantes da presente invenção, in-cluindo variantes das mesmas.

Em resultado à degeneração de seqüências de nucleotídeos decodificação, outras seqüências de nucleotídeos que codificam substancial-mente as mesmas seqüências de aminoácidos, como um ácido nucléico quecodifica um polipeptídeo da presente invenção, podem ser utilizadas na prá-tica da presente invenção. Elas incluem, entre outros, genes alelos, geneshomólogos de outras cepas e/ou aquelas alteradas pela substituição de có-dons diferentes que codificam o mesmo resíduo de aminoácido dentro daseqüência, produzindo desse modo uma modificação silenciosa. Célulashospedeiras, compreendendo os vetores de expressão da presente invençãotambém são incluídas. Uma célula hospedeira comumente utilizada é umacélula de E. coli.

Processos gerais para clonagem de cDNAs e expressão de suasproteínas recombinantes correspondentes já foram descritos [consultarSambrook e Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3- edição,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor LI. (2000)].

Ademais, qualquer técnica para mutagênese, conhecida na téc-nica, pode ser utilizada para modificar uma toxina alfa nativa da presenteinvenção, incluindo, entre outras, mutagênese in vitro em sítio direcionado[Hutchinson era/., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978); Zoller and Smith, DNA,3:479-488 (1984); Oliphant era/., Gene, 44:177 (1986); Hutchinson era/.,Proc. A/aí/. Acad. Sei. U.S.A., 83:710 (1986); Wang and Malcolm, BioTechni-ques 26:680-682 (1999), os conteúdos dos quais são aqui incorporados, emsua totalidade, por referência neste pedido de patente]. O uso de agentes deligação TAB@ (Pharmacia), etc. e de técnicas de PCR podem ser empregadostambém para mutagênese em sítio direcionado [consultar Higuchi, "UsingPCR to Engineer DNA", em PCR Technology: Principies and Applications forDNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, pág. 61-70(1989)].

Polipeptídeos da presente invenção

A presente invenção inclui polipeptídeos isolados e/ou recombi-nantes, incluindo as toxinas alfas e toxóides alfas da presente invenção, va-riantes de cepas dos mesmos, fragmentos antigênicos inativos dos mesmose proteínas de fusão dos mesmos. Ademais, polipeptídeos contendo se-qüências alteradas em que resíduos de aminoácidos, funcionalmente equi-valentes, são substituídos por aqueles contidos na seqüência de aminoáci-dos do tipo selvagem, resultando em uma substituição conservadora de a-minoácidos, são incluídos também pela presente invenção.

Por exemplo, um ou mais destes resíduos de aminoácidos, con-tidos na seqüência, podem ser substituídos por outro aminoácido de polari-dade similar, que atue como um equivalente funcional, resultando em umaalteração silenciosa. Substitutos de um aminoácido contido na seqüênciapodem ser selecionados entre outros componentes da classe à qual o ami-noácido pertença.

Por exemplo, os aminoácidos não polares incluem alanina, leu-cina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os ami-noácidos de pólo neutro incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina,asparagina e glutamina. Os aminoácidos com carga positiva (básicos) inclu-em arginina e lisina. Os aminoácidos com carga negativa (acidicos) incluemácido aspártico e ácido glutâmico.

Trocas de aminoácidos conservadoras particularmente preferi-das são:

(a) Lis por Arg ou vice-versa, de forma que uma carga positivapossa ser mantida;

(b) Glu por Asp ou vice-versa, de forma que uma carga negativapossa ser mantida;

(c) Ser por Tr ou vice-versa, de forma que um -OH livre possaser mantido;

(d) Gln por Asn ou vice-versa, de forma que um NH2 livre possaser mantido; e

(e) lie por Leu ou por Vai ou vice-versa, como aminoácidos hi-drofóbicos praticamente equivalentes.

Todos os polipeptídeos da presente invenção, incluindo os frag-mentos antigênicos, podem fazer parte de uma proteína de fusão. Em umaconcretização específica, um polipeptídeo de fusão é expresso em uma célu-la procariótica. Este tipo de proteína de fusão pode ser utilizado, por exem-pio, para intensificar a antigenicidade de um antígeno ou fragmento domesmo, para diminuir ou remover a sua toxicidade sem anular a sua antige-nicidade ou para isolar um antígeno da presente invenção. O isolamento daproteína de fusão, no último caso, pode ser facilitado pelo uso de uma colu-na de afinidade, específica para a proteína/peptídeo que foi fundido ao antí-geno. Estas proteínas de fusão incluem: proteína de fusão de glutationa-S-transferase (GST), proteína de fusão de uma proteína de ligação de maltose(MBP), proteína de fusão com tag FLAGG ou proteína de fusão com tag deuma poli-histidina. Seqüências específicas de agente de ligação, como umagente de ligação Ser-Gli, podem fazer parte também desta proteína de fusão.

De fato, a expressão de um polipeptídeo de fusão pode facilitaruma expressão estável e/ou permitir a purificação com base nas proprieda-des da parceira fundida. Dessa forma, a purificação dos polipeptídeos dapresente invenção pode ser simplificada pelo uso de proteínas de fusão quepossuam afinidade de Tags. Por exemplo, a GST liga glutationa conjugada auma matriz sólida de sustentação, a MBP liga-se uma matriz de maltose epolihistidina atua como quelante em uma matriz de sustentação de quelaçãode Ni [consultar Hochuli et ai, Biotechnology6:1321-1325 (1998)].

A proteína de fusão pode ser extraída da matriz específica comtampões apropriados, ou pelo tratamento com uma protease, específica paraum sítio de clivagem, incorporado geneticamente, entre a toxina alfa, porexemplo, e a sua parceira de fusão. Alternativamente, uma toxina alfa podeser combinada com uma proteína marcada, como uma proteína verde fluo-rescente [Waldo et ai, Nature Biotech. 17:691-695 (1999); Patente U.S. N- 5625 048 e WO 97/26333, cujos conteúdos são aqui incorporados, em suatotalidade, por referência neste pedido de patente].

Alternativamente ou em acréscimo, outras etapas de cromato-grafia em coluna (por exemplo, filtração em gel, troca iônica, cromatografiapor afinidade, etc.) podem ser utilizadas para purificar os polipeptídeos natu-rais ou recombinantes da presente invenção (consultar abaixo). Em muitoscasos, estas etapas de cromatografia em coluna empregam cromatografialíquida de alto desempenho ou outros processos análogos em vez de osprocedimentos mais clássicos à base de gravidade.

Além disso, os polipeptídeos da presente invenção, incluindo astoxinas alfas e fragmentos antigênicos inativados das mesmas podem sersintetizados quimicamente [consultar, por exemplo, Synthetic Peptides: AUser's Guide, W.H.Freeman & Co., New York, N.Y., pp. 382, Grant, ed.(1992)].

Procedimentos Gerais de Purificação de Polipeptídeos

De maneira geral, as etapas iniciais para purificação de um poli-peptídeo da presente invenção podem incluir a inclusão ou exclusão de sal,por exemplo, em fracionamentos de sulfato de amônio; em fracionamentospara exclusão de solvente, por exemplo, uma precipitação por etanol. Ade-mais, ultracentrifugação de alta velocidade pode ser utilizada isoladamenteou em conjunto com outras técnicas de extração.

Geralmente, um bom isolamento secundário ou etapas de purifi-cação incluem absorção de fase sólida, utilizando gel de fosfato de cálcio,hidroxiapatita ou ligação de fase sólida. A ligação de fase sólida pode serexecutada pela ligação iônica, com um agente para troca de anion, comodietilaminoetila (DEAE), ou dietil [2-hidroxipropil aminoetil] (QAE) SEFADEXou celulose; ou usando um agente para troca de cátion, como carboximetil(CM) ou sulfopropil (SP) SEPHADEX ou celulose. Meios alternativos de liga-ção de fase sólida incluem a exploração de interações hidrofóbicas, por e-xemplo, o uso de um suporte sólido, como fenilSefarose e um tampão alta-mente salino; ligação imunológica por ligação por afinidade, utilizando, porexemplo, um anticorpo antitoxina alfa ligado a um suporte ativado. Outrossuportes de fase sólida incluem aqueles contendo corantes específicos oulectinas, etc.

Uma outra técnica de suporte de fase sólida, freqüentementeutilizada no final do procedimento de purificação, baseia-se em exclusão portamanho, como géis de SEFADEX e SEFAROSE. Alternativamente, podeser empregada uma técnica de membrana pressurizada ou centrífuga, utili-zando filtros de membrana para exclusão por tamanho. Geralmente, estesdois métodos são utilizados em conjunto.

Separações de suporte de fase sólida são geralmente executa-das em bateladas com centrifugação a baixa velocidade ou por cromatogra-fia em coluna. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), incluindotécnicas correlatas como FPLC, é atualmente o meio mais comum de reali-zação de cromatografia líquida. Técnicas de exclusão por tamanho podemser executadas também com o auxílio de centrifugação a baixa velocidade.

Além disso, podem ser empregadas técnicas de permeação por tamanho,como de eletroforese em gel. Estas técnicas são geralmente executadas emtubos, placas ou por eletroforese capilar.

Quase todas as etapas envolvendo purificação de polipeptídeosempregam uma solução tamponada. Exceto se especificado de outra forma,são utilizadas geralmente concentrações de sais de tampão de 25-100 mM.

Tampões de concentração baixa implicam geralmente concentrações de 5-25mM. Tampões de concentração alta implicam geralmente concentraçõesdo agente do tamponamento entre 0,1 - 2,0 M. Tampões típicos podem seradquiridos da maioria dos catálogos de produtos bioquímicos e incluem tam-pões clássicos como de Tris, pirofosfato, monofosfato e difosfato e Bonstampões como de Mes, Hepes, Mops, Tricina e Ches [Good et ai, Bioche-mistry, 5:467 (1966); Good and Izawa, Meth. Enzymol., 24B:53 (1972); eFergunson and Good, Anal. Biochem., 104:300 (1980)].

Há materiais disponíveis para executar todas estas técnicas,provenientes de uma variedade de fontes comerciais como Sigma ChemicalCompany em St. Louis, Missouri.

Componentes das vacinas

Toxóide alfa contra C. Perfringens: Em concretizações específi-cas, é vantajoso que a vacina animal contenha a quantidade mínima do to-xóide alfa necessária para proteção contra enterite necrótica. Esse nível foideterminado como sendo de 2 unidades de Poder Total Combinado (TCP)por dose, sob as condições específicas exemplificadas abaixo. As unidadesde TCP são estabelecidas com base em padrões internacionais [Batty, 7o-xin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Capítulo 8, Volume 5A (1971)ed. JR Norris and DW Ribbons] e as vacinas da presente invenção podemser prontamente misturadas para ser obtida a potência desejada. Mesmosob estas condições, podem ser utilizadas menos de 2 unidades de 2 TCPse a vacina compreender ainda estimulantes imunológicos. De qualquer mo-do, é preferível que a vacina resulte em 4 ou mais unidades antitoxina por mlde soro do animal.

Quantificação do toxóide alfa: Geralmente, é recomendávelquantificar o toxóide alfa para assegurar a inclusão de níveis ideais na vaci-na. Um método convencional de quantificar toxóides emprega o teste de Po-der Combinado Total (TCP). Nesse ensaio, um volume específico do sobre-nadante de toxóide alfa é posto em contato com uma quantidade conhecidade unidades antitoxina. Após prover um período adequado de incubação,para permitir a ligação entre a antitoxina e o toxóide alfa, por exemplo, 0,5 -2 horas, uma quantidade conhecida de toxina alfa é acrescentada. A seguir,é concedido um período adequado para que a antitoxina livre ligue-se à toxi-na alfa. A quantidade de toxina alfa livre é, em seguida, determinada peloacréscimo da solução contendo um substrato para a atividade da fosfolipaseC da toxina alfa. Substratos adequados incluem hemácias (principalmentehemácias de ovelha) e lecitina. O toxóide alfa pode ser então quantificadopor cálculo com base na quantidade de atividade da fosfolipase C. Quantomaior for a quantidade de toxóide alfa presente na solução do ensaio, tantomaior será a quantidade da atividade da fosfolipase C medida no ensaio.

Alternativamente, a determinação pode ser efetuada sem a medição da ati-vidade da fosfolipase C, por exemplo, pode ser utilizada uma análise de liga-ção competitiva a anticorpo, incorporando uma etapa de cromatografia, imu-noensaio de absorção enzimática direta (ELISA) ou análise de ligação com-petitiva por um aparelho da Biacore ou similar.

Antígenos adicionais: As doenças provocadas por Clostrídiosocorrem freqüentemente sob a forma de infecções mistas e o acréscimo, porconseguinte, de toxóides de outros Clostrídios podem reduzir ainda mais apatologia e sinais clínicos. Exemplos não restritivos de toxóides de outrosClostrídios, obtidos de organismos reconhecidamente causadores de enteri-te gástrica, compreendendo aqueles contra C. perfringens, os quais podemser acrescentados a uma vacina da presente invenção para aumentar a po-tência contra infecções mistas incluem: toxina beta, toxina beta 2, toxina te-ta, toxina épsilon, enterotoxina, toxina kapa, toxina lâmbda e toxina iota deC. perfringens; toxina hemorrágica (HT) e toxina letal (LT) de C. sordellii,toxinas A e B de C. difficile, toxina alfa de C. septicum e toxinas alfa (A) ebeta (B) de C. novyi.

Antígenos de outras bactérias, vírus, fungos ou parasitas podemser incluídos também nas vacinas da presente invenção. Estes antígenosincluem toxinas ou toxóides, bactérias e/ou extratos de bactérias, fungose/ou extratos de fungos; vírus e/ou proteínas virais e/ou proteínas de parasi-tas. Antígenos apropriados de vírus, bactérias e/ou parasitas, cuja origem éprovida no presente, são bem-conhecidos na técnica

Exemplos não restritivos de organismos bacterianos são: Esche-richia coli, Campylobacter spp., Pasteurella spp., Staphylococcus spp., S-treptococcus spp., Enterococcus spp., Chlamydia, Erysipelas spp. Pasteurel-la, Bordetella e Ornithobacterium.

Exemplos não restritivos de toxinas correlatadas são: lipopolis-sacarídeo (LPS) de bactéria gram negativa, o qual, notadamente, intensificaa resposta imunológica de vacinas e melhora, desse modo, a produção deantitoxinas contra a toxina alfa do C. perfringens e de micotoxinas.

Exemplos não restritivos de vírus apropriados são: Coronavírus,Rotavírus, Astrovírus, vírus semelhante a Enterovírus, Torovírus, Adenoví-rus, Reovírus, Birnavírus, Herpesvírus, Paramixovírus, Picornavírus, Vírusda Doença de Mareks, Vírus da Enterite Hemorrágica e Vírus da Doença deNewcastle.

Exemplos não restritivos de parasitas são: Coccidia, as espéciesde Eimeria, por exemplo, e Cryptosporidia, [consultar, o pedido de patenteUS 2004/0018215A1, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade,por referência neste pedido de patente].Adiuvantes

Adjuvantes são úteis também para melhorar a resposta imunoló-gica e/ou aumentar a estabilidade de preparados da vacinas. Adjuvantes sãotipicamente descritos como estimuladores não específicos do sistema imu-nologico, porém podem ser úteis também para direcionar ramificações espe-cíficas do sistema imunologico. Um ou mais compostos que possuam estaação podem ser acrescentados à vacina. Portanto, vacinas específicas dapresente invenção compreendem ainda um adjuvante. Exemplos de com-postos químicos que podem ser utilizados como adjuvantes incluem, entreoutros, compostos de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio), óleosque podem ser metabolizados ou não, óleos minerais, incluindo derivadosoleatos de manita em solução de óleo mineral (por exemplo, MONTANIDEISA 70 da Seppic SA, França), e óleos minerais leves como DRAKEOL 6VR,polímeros em bloco, ISCOM (complexos estimuladores imunológicos), vita-minas e minerais (incluindo, entre outros: vitamina E, vitamina A, selênio evitamina B12) e CARBOPOL®.

Outros adjuvantes adequados, referidos às vezes como estimu-lantes imunológicos, incluem, entre outros: citocinas, fatores de crescimento,quemoquinas, sobrenadantes de culturas celulares de linfócitos, monócitos,células de órgãos linfóides, preparados de células e/ou extratos de plantas,bactérias ou parasitas (Staphylococcus aureus ou preparados de lipopolis-sacarídeos) ou mitogênicos.

De maneira geral, um adjuvante é administrado ao mesmo tem-po em que um antígeno da presente invenção. No entanto, adjuvantes po-dem também, ou alternativamente, ser administrados em um período de du-as semanas anteriores à vacinação e/ou por um período de tempo posteriorà vacinação, isto é, desde que o antígeno, por exemplo, um toxoide alfa,permaneça nos tecidos.

Preparo de Vacinas

São providos também processos para produção das vacinas dapresente invenção. Em uma concretização, a vacina compreende a misturade uma combinação imunologicamente eficaz de um antígeno da presenteinvenção, por exemplo, um sobrenadante de toxoide alfa contra um únicoTipo de C. perfringens e um adjuvante farmaceuticamente aceitável. A quan-tidade de toxoide alfa pode ser quantificada para que contenha pelo menos 2unidades de poder combinado total (TCP) por dose da vacina. O sobrena-dante do toxoide alfa pode ser concentrado pra minimizar o tamanho de do-se exigido para ser obtida pelo menos 4,0 unidades de antitoxina (A.U.) porml de anti-soro de um animal vacinado. O acréscimo de outros agentes demodulação imunológica, farmaceuticamente aceitáveis, pode reduzir o TCPexigido para diminuição de menos de 2 unidades por dose, desde que a va-cina resulte ainda nas 4,0 A.U. requeridas de anticorpo antitoxina alfa por mlde anti-soro do animal vacinado. Em certas concretizações, o toxoide alfacontra C. perfringens é ainda purificado dos sobrenadantes contendo toxoidealfa por técnicas como, por exemplo, entre outras concentração/ultrafiltração,cromatografia e centrifugação.

Administração de Vacinas

As vacinas podem ser administradas sob forma líquida, de emul-são, pó dessecado e/ou em uma névoa por qualquer via parenteral, via in-travenosa, intraperitoneal, intradérmica, por escarificação, via subcutânea,intramuscular ou inoculada por mucosa, por exemplo, via oral, via intranasal,sob a forma de aerossol, gotas oculares, por administração em ovo ou im-plantada sob a forma de pó secado por congelamento.

Animais em Pesquisa

O termo "animal em pesquisa" refere-se a uma espécie de ani-mal capaz de ser infectada por uma bactéria patogênica e em uma concreti-zação específica inclui seres humanos. Animais sujeitos apropriados incluemtambém aqueles existentes em ambiente selvagem, doméstico (por exem-plo, criados para corte, fornecimento de leite, manteiga, ovos, pele, couro,penas e/ou lã), animais de carga, animais de pesquisa, animais de estima-ção, bem como aqueles criados para/em zoológicos, hábitat selvagem e/oucircos.

Em uma concretização específica, um animal em pesquisa dainvenção é um animal "produtor de alimento". Para fins da presente inven-ção, o termo animal "produtor de alimento" será entendido de forma a incluirtodos os animais criados para consumo (por exemplo, perus, galinhas aloja-das) ou para produtos de consumo (por exemplo, vacas leiteiras, galinhaspoedeiras e similares) por seres humanos e/ou outros animais. Uma listanão abrangente destes animais inclui aves, como aves domésticas, ou seja,galinhas, perus, ganso, avestruz, etc, bovinos (por exemplo, gado, vacasleiteiras, búfalo), ovinos (por exemplo, cabras ou ovelhas), suínos (por e-xemplo, suíno, leitões e porcos) e eqüinos (por exemplo, cavalos), etc.

Em outra concretização, o animal em pesquisa é um animal deestimação. Para fins da presente invenção, o termo animal "de estimação"será entendido de forma a incluir gatos domésticos (felino), cachorros (cani-no), espécies de coelho, cavalos (eqüino), roedores (por exemplo, cobaias,esquilos, ratos, camundongos, gerbil e hamsters), primatas (por exemplo,macacos) e aves, como pombos, papagaios, periquitos, araras, canários esimilars.

Outros animais também contemplados para se beneficiarem dasvacinas da invenção, incluem marsupiais (como cangurus), répteis (comotartarugas de criação), aves de caça, cisnes, ratitas e outros animais domés-ticos de valor econômico.

Os exemplos a seguir são fornecidos somente a título de exem-plificação da presente invenção e não devem ser interpretados de forma alimitar de forma alguma o escopo da invenção.Exemplos

Exemplo 1

Eficácia da vacina em galinhas alojadas, vacinas por via subcutânea

Sumário

A vacinação de galinhas alojadas por via subcutânea, utilizandouma vacina compreendendo toxóide alfa de um único Tipo de C. perfringens(Tipo A) resulta em

(i) resposta imunogênica nas galinhas alojadas vacinadas, (ii)uma quantidade expressiva de anticorpo antitoxóide alfa nos ovos das gali-nhas alojadas vacinadas e (iii) proteção passiva da ninhada nascida subse-qüentemente das galinhas alojadas vacinadas.

Materiais

Toxóide alfa contra C. Perfringens Tipo A: O toxóide alfa contraC. perfringens Tipo A é preparado da forma como segue: A cultura de C.perfringens Tipo A é cultivada sob condições anaeróbicas em meio de fer-mentação em larga escala (5000 litros) a uma temperatura de 37°C ± 2. Du-rante a fermentação, é acrescentado hidróxido de sódio para manter o nívelde pH em 7,8 ± 2. Carboidrato (dextrina) é acrescentado também durante afermentação (até 1% p/v) para promover o crescimento. São concedidas de3-6 horas para que a cultura cresça. No final do período de crescimento, éacrescentada uma solução de formaldeído ao meio de fermentação até umnível que final que não exceda 0,5%. As células são removidas por centrifu-gação e o sobrenadante resultante é filtrado em um filtro de profundidadecom poros de tamanho que variam de 0,25 - 2,0 um. Durante esse proces-so, a temperatura é mantida em 5°C ± 3°C. O sobrenadante inativado dacultura é em seguida submetido à diafiltração e concentrado de 10-30 vezes,por ultrafiltração em filtros, cujo limite superior de peso molecular é 20.000.O sobrenadante concentrado é armazenado em 2-8°C para mistura futuraem vacinas. Antes da mistura, é efetuada a análise do sobrenadante con-centrado, quanto à potência, pelo teste de poder combinado (TCP), descritoacima. A potência de cada batelada de toxóide é designada em unidades deTCP por ml.Vacina: O sobrenadante com o toxóide alfa contra C. perfringenstipo A é misturado a uma emulsão água em óleo, contendo 4 Unidades dePoder Combinado (TCP) em mol. A emulsão é preparada com 70% de faseoleosa e 30% de fase aquosa.

A fase oleosa é preparada da forma como segue:

Óleo mineral 89,20%Span80 10,00%Álcool benzílico 0,75%Trietanolamina 0,05%

A fase aquosa é preparada da forma como segue:

Toxóide contra C. perfringens tipo A + solução salina 88%33% de Tween 80/solução salina 12%

No total, 30% de solução aquosa são adicionados lentamente a70% de fase oleosa e emulsionados com um homogeneizador Silverson(Podem ser utilizados também outros homogeneizadores em linha). A dura-ção da homogeneização depende do volume da emulsão, sendo determina-da pela viscosidade, tamanho de partículas e estabilidade da emulsão porpelo menos três dias em 37°C. Gentamicina é acrescentada à fase aquosade forma que o volume subseqüente atinja uma concentração final de até 30ug/ml. Timerosol é acrescentado à fase aquosa de forma que o volume sub-seqüente atinja uma concentração final de até 0,01%.

Vacinação: As galinhas jovens são vacinadas com 0,5 ml pordose da vacina misturada por via subcutânea. A primeira dose é administra-da em 14 semanas de vida e a segunda, em 20 semanas de vida. Vinte gali-nhas são vacinadas com a vacina misturada descrita acima, contendo 1 TCPpor dose. Um segundo grupo de vinte galinhas jovens são vacinadas com avacina descrita acima, contendo 2 TCP por dose. Um terceiro grupo de vintegalinhas jovens são utilizadas como controle e não são vacinadas. No total,2-3 gaios são reunidos a cada grupo de frangas para produção de ovos ferti-lizados.

Imunidade passiva

São coletados ovos de galinhas controle e vacinadas de 32, 52 e65 semanas de vida. Os pintos da progenie saídos destes ovos são utiliza-dos para avaliar a proteção passiva conforme relacionado na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Os pintos foram alimentados com uma dieta rica em proteínasem medicação durante as primeiras duas semanas e, em seguida, esta foitrocada por uma ração normal pelo restante da experiência. A reação de ca-da ave foi provocada por administração por via oral de C. perfringens Tipo Ado tipo virulento que expressa a toxina alfa e a toxina beta 2. A dose paraesta reação provocada contém 6,3 X IO7 a 6,3 X 108 de unidades formado-ras de colônia por ml, em uma dose de 3 ml. Por 3 dias consecutivos, a rea-ção das aves foi provocada, tendo o teste iniciado quando estas contavamcom 18 ou 19 dias de vida. Dois dias após o teste, as aves foram sacrifica-das e examinadas em seguida para detecção de lesões de enterite necróti-ca. Os resultados de eficácia para os pintos da progenie estão relacionadosindividualmente nas Tabelas 2-4, estipulando o status de vacinação da mãede cada pinto e a extensão de suas lesões de enterite necrótica, se existen-tes, de acordo com a Escala de Pontuação fornecida abaixo. A Tabela 2 re-presenta pintos da progenie de galinhas com 32 semanas de vida, a Tabela3 representa pintos da progenie de galinhas com 52 semanas de vida e aTabela 4 de pintos da progenie de galinhas com 65 semanas de vida. A Ta-bela 5 apresenta a pontuação média para pintos da progenie de galinhasque foram vacinadas com 2 TCP por dose. Conforme apresentado, a proge-nie das galinhas vacinadas está significativamente protegida contra a bacté-ria administrada do teste em relação à progenie de galinhas não vacinadas.

Escala de pontuação para lesões de enterite necrótica (EN)

0 = Sem lesões evidentes de enterite necrótica no intestino dei-gado; intestino com elasticidade normal (enrola-se após ter sido aberto).

1 = Parede intestinal fina e flácida (intestino permanece planoquando aberto, não se enrolando de novo para a posiçãonormal); muco excessivo ou espessado cobrindo a mem-brana mucosa ou hiperemia leve focai ou multifocal da mu-cosa ou congestão dos vasos de serosas.

2 = Áreas isoladas ou algumas áreas multifocais de hiperemiae edema da parede intestinal; áreas isoladas ou algumasáreas multifocais de ulceração ou necrose da mucosa in-testinal.

3 = Áreas extensas multifocais de necrose e ulceração da mu-cosa intestinal ± hemorragia significativa ou camada de fi-brina ou de resíduos necróticos sobre a superfície da mu-cosa (aspecto de toalha turca).

4 = Animal morto com lesões evidentes de enterite necróticade pontuação 2 ou acima.

Tabela 2

<table>table see original document page 43</column></row><table>Tabela 2 -continuacão-

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Tabela 3

Pontuação individual de lesões de enterite necrótica em pintosda progênie de galinhas com 52 semanas de vida

<table>table see original document page 44</column></row><table>Tabela 3 -continuação-

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Tabela 4

Pontuação individual de lesões de enterite necrotica em pintosda progênie de galinhas com 65 semanas de vida

<table>table see original document page 45</column></row><table>Tabela 4 -continuação-

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Tabela 5

Pontuação mediana em pintos da progenie de galinhas vacina-das com uma dose de 2 TCP

<table>table see original document page 46</column></row><table>Títulos de anticorpos

Soro: Foram coletadas amostras de sangue das galinhas quan-do estas contavam com 33 e 78 semanas de vida. O sangue é deixado paracoagular por 2-4 horas em temperatura ambiente e, em seguida, o soro éobtido após centrifugação. O soro é armazenado em -10°C ou mais frio atéque testado em relação ao título de anticorpos. O título de anticorpos paratoxina alfa do C. perfringens é avaliado por um ensaio de inibição de hemóli-se, utilizando diluições seriadas e hemácias de ovelhas da forma como se-gue: Para cada amostra testada, são efetuadas diluições em série (duas ve-zes) em uma placa de microtitulação com fundo em V. Uma quantidade co-nhecida de toxina alfa é acrescentada a cada poço contendo uma diluição daamostra. As placas são em seguida incubadas por uma hora em 36 ± 2°Cpara permitir que os anticorpos obtidos do soro formem complexos com atoxina alfa. Após esta incubação, uma solução de hemácias de ovelha a0,5% é acrescentada aos poços e as placas são incubadas por três horasem 36°C ± 2°C de forma a permitir que a toxina alfa que não está incluídaem um complexo efetue a lise das hemácias. As placas são verificadas emseguida quanto à ausência de hemólise. O valor inverso da diluição mais altada amostra testada que não apresentou hemólise é considerado o objetivofinal. Os títulos de anticorpos são apresentados nas Tabelas 6-8.

Gemas de ovo: As gemas de ovo são processadas para determi-nar o título de anticorpos. Resumidamente, a gema é separada e misturadacom um tampão de extração comercial (Promega EGGstract System, N9 deCatálogo da Promega G1531 e G2610, Madison, Wisconsin). Após a extra-ção, uma pelota de IgY é obtida, a qual é em seguida novamente suspendi-da ao volume original da gema com solução salina de tampão fosfato. O ex-trato de gema de ovo é reunido de pelo menos 5 ovos e testado para títulode anticorpos usando um ensaio de inibição de hemólise (Hl), conforme des-crito acima para o soro. Dessa forma, é efetuada a avaliação do título deanticorpos, presentes em gemas de ovos, coletados de posturas em 40, 52 e65 semanas de vida. Os títulos de anticorpos para as gemas de ovo são a-presentados na Tabela 9.Tabela 6

Título individual de anticorpos de soro de galinha contra toxinaalfa do C. Perfringens Tipo A em 33 semanas de vida

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Tabela 7

Título individual de anticorpos de soro de galinha contra toxinaalfa do C. Perfringens Tipo A em 78 semanas de vida

<table>table see original document page 48</column></row><table>Tabela 7 -continuação-

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<table>table see original document page 49</column></row><table>

Média geométrica = 235 Média geométrica = 2

"Valores < 2 foram considerados como 1 para o cálculo da média geométrica

Tabela 8

Média geométrica de título de inibição de hemólise em soro degalinhas em vários instantes

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Tabela 9

Título de inibição de hemólise em gema de ovo de galinhas, co-letado em vários instantes

<table>table see original document page 49</column></row><table>Exemplo 2

Eficácia de vacina em galinhas alojadas, vacinas por via intramuscular Resumo

A vacinação de galinhas alojadas por via intramuscular, utilizan-do uma vacina compreendendo toxóide alfa de um único Tipo de C. perfrin-gens (Tipo A), resultou também em (i) resposta imunogênica nas galinhasalojadas vacinadas, (ii) anticorpo significativo antitoxoide alfa nos ovos dasgalinhas alojadas vacinadas e (iii) proteção passiva para a ninhada nascidasubseqüentemente das galinhas alojadas vacinadas.

Imunidade passiva

No total, 14 galinhas jovens são vacinadas por via intramuscularcom duas doses de 0,5 ml da vacina do Exemplo 1 acima, contendo 2 TCP.Um grupo adicional de 40 galinhas jovens é utilizado como controle. Trêsgaios são reunidos a cada grupo de galinhas jovens, conforme descrito aci-ma. A primeira dose da vacina é administrada em 10 semanas de vida e asegunda dose, em 23 semanas de vida. Os ovos são recolhidos das gali-nhas em 32 semanas de vida e chocados para determinar proteção passivanos pintos da progênie, após um desafio experimental C. perfringens.

A Tabela 10 apresenta a incidência de enterite necrótica e apontuação mediana para suas lesões correspondentes, conforme determi-nadas pela Escala de Pontuação do Exemplo 1 acima, para os pintos daprogênie de galinhas vacinadas e de controle. A Tabela 11 demonstra a pon-tuação mediana para as lesões de enterite necrótica para cada pinto da pro-gênie. A Tabela 12 lista os títulos de anticorpos contra toxina alfa de C. per-fringens Tipo de cada pinto da progênie, enquanto que, os títulos de anticor-pos para as gemas de ovos de ovos coletados das galinhas vacinadas e decontrole, em 32 semanas de vida, são fornecidos na Tabela 13.Tabela 10

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Tabela 11

Pontuação individual de lesões de enterite necrótica em pintos da proqêniede galinhas com 32 semanas de vida

<table>table see original document page 51</column></row><table>Tabela 11 -continuação-

<table>table see original document page 52</column></row><table>Tabela 12 - continuação-

<table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 13

Título de anticorpos em gema de ovo, coletado de galinhas com 32 semanasde vida

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Exemplo 3

Sorologia em galinhas jovens Leghorn brancas SPF, vacinas por via subcu-tânea

Títulos de anticorpos

Os títulos de anticorpos são avaliados em galinhas jovens Le-ghorn brancas SPF, vacinadas por via subcutânea com a vacina do Exemplo1 acima, contendo 1, 2 ou 3 TCP. As galinhas jovens são vacinadas com 15semanas de vida com 0,5 ml da vacina, e uma dose de reforço é administra-da 4 semanas após a vacina inicial. Amostras de sangue são coletadas 6semanas depois da vacina de reforço. É efetuada a avaliação do título deanticorpos presente no soro de cada ave pelo ensaio de inibição de hemóli-se, conforme descrito acima no Exemplo 1.Tabela 14

Título individual de anticorpos contra toxina alfa de C. Perfrin-gens Tipo A, presentes no soro de galinhas jovens

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* Títulos de <2 são considerados 1 para determinação de média geométricado título

É efetuada a avaliação do título de anticorpos nos ovos coletadosem 25 semanas de vida, de posturas de galinhas Leghorn brancas, por titula-ção de inibição de hemólise. Os resultados são apresentados na Tabela 15.Tabela 15

Título de anticorpos de reunião de gemas de ovo contra toxina alfa de C.

Perfrinaens Tipo A

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Determinação de título de neutralização de toxina (TNT) em soro reunido degalinhas Leghorn brancas

O título de antitoxina contra toxina alfa de C. perfringens Tipo A,presente no soro reunido das galinhas, é avaliado utilizando camundongos.

A titulação de antitoxina é efetuada por teste do soro reunido, utilizando ummétodo conforme descrito no Código de Normas Federais, Serviço de Inspe-ção de Animais e Plantas, Departamento de Agricultura. Os métodos utiliza-dos para medir a antitoxina foram semelhantes ao do 9 CFR §113.111 (c),versão corrente, exceto que toxina alfa e reagentes antitoxina são utilizadosem vez de toxina beta e antitoxina. São utilizados os seguintes reagentes deteste para determinar o título de antitoxina:

1) Antitoxina alfa contra C. perfringens Tipo A: IRP 426 (obtidado Centro de Biologia Veterinária, USDA).

2) Toxina alfa de C. perfringens Tipo A IRP 446 (obtida do Cen-tro de Biologia Veterinária, USDA).

Resumidamente, antitoxina diluída padrão ou soro são combina-dos com uma quantidade conhecida de toxina alfa padrão. A presença detoxina não neutralizada é, em seguida, detectada por injeção da mistura emcamundongos. A comparação, em relação aos efeitos de quantidades co-nhecidas de antitoxina alfa padrão sobre a atividade da toxina, é em seguidaavaliada pela determinação da diluição do soro padrão ou em teste que pro-tege os camundongos contra morte em um ensaio biológico. O título de anti-toxina, no soro reunido de galinhas jovens Leghorn brancas, é apresentadona Tabela 16 abaixo.Tabela 16

Título de neutralização de toxina (TNT) em galinhas jovens vacinadas e decontrole

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Exemplo 4

Sorologia em galinhas jovens Leghorn brancas SPF, vacinas por via intra-muscular

Títulos de anticorpos

São avaliados títulos de anticorpos em galinhas jovens Leghornbrancas SPF, vacinadas duas vezes por via intramuscular com a vacina doExemplo 1 acima, contendo 1, 2 ou 3 TCP. As galinhas jovens são vacina-das em dez semanas de vida com 0,5 ml da vacina, e uma dose de reforço éfornecida quatro semanas após a vacina inicial. Amostras de sangue sãocoletadas, sete semanas após a vacina de reforço. É efetuada a avaliaçãoindividual de título de anticorpos no soro reunido por ensaio de inibição dehemólise, conforme descrito no Exemplo 1 acima, e apresentados nas Tabe-las 17 e 18 abaixo.

Tabela 17

Título individual de anticorpos, presente no soro de galinhas jovens, contratoxina alfa de C. Perfringens Tipo A

<table>table see original document page 57</column></row><table>Tabela 17 -contiuação-

<table>table see original document page 58</column></row><table>

* Títulos <2 são considerados 1 para determinação da média geométrica dotítulo

O título de neutralização de toxina (TNT), no soro reunido degalinhas, é avaliado utilizando o procedimento conforme descrito no Exem-plo 3 acima, e os resultados são fornecidos na Tabela 18 abaixo.Tabela 18

Título de neutralização de toxina (TNT) em galinhas jovens vacinadas e decontrole

<table>table see original document page 58</column></row><table>O título de anticorpos nos ovos coletados em 25 semanas devida, destas posturas de galinhas Leghorn brancas, é avaliado por titulaçãode inibição de hemólise, conforme descrita no Exemplo 1 acima. Os resulta-dos estão resumidos na Tabela 19.

Tabela 19

Título de anticorpos de gema reunida de ovo contra toxina alfa de C. Perfrinaens

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Exemplo 5

Comparação de uma vacina multivalente e monovalente de toxóide alfa con-tra C. Perfrinaens em suínos

Sumário

Os métodos são expostos para propiciar proteção passiva emporcos recém nascidos pela vacinação de porcas/fêmeas de javalis prenhascom vacinas de toxóide alfa contra C. Períringens Tipo A da presente inven-ção. Os resultados revelam uma resposta de anticorpos em porcas que podeser transferida para sua ninhada através de colostro.

Materiais

Toxóide alfa contra C. perfrinaens Tipo A: Foi preparado toxóide alfa contraC. períringens Tipo A conforme descrito no Exemplo 1 acima.

Vacina: Uma vacina da presente invenção pode ser misturada atoxóide alfa inativado de C. períringens tipo A, contendo > 2 Unidades dePoder Combinado Total. A vacina pode ser misturada a qualquer adjuvanteexposto no presente, incluindo emulsão óleo em água, contendo sais mine-rais, óleos vegetais (óleo de amendoim, óleo de soja), esqualeno, esqualanoe outros óleos que podem ser metabolizados. Outros adjuvantes como Se-ponina, CARBOPOL® e adjuvantes contendo alumínio (hidróxido de alumí-nio, fosfato de alumínio) podem ser utilizados também no preparo da vacina.A vacina pode conter ainda outros antígenos, incluindo E. coli (K88, K99,987P, Tipo 1), toxóides de C. perfringens e/ou toxóides de outras bactérias,incluindo Clostridium difficile, rotavírus e/ou Cryptosporedia.

Administração

As vacinas são administradas a porcas/fêmeas de javali pre-nhas, antes de parirem os leitões, por via intramuscular ou subcutânea, deforma a fornecerem proteção passiva à ninhada recém nascida, pela inges-tão de colostro.

Resultados

O estudo é conduzido em porcas com 32 semanas de vida,comparando três vacinas:

Vacina ng 1: misturada com adjuvante hidróxido de alumínio,contendo 4 TCP de toxóide alfa contra C. perfringens Tipo A em uma dosede 2 ml.

Vacina ne 2: misturada com 4 TCP de toxóide alfa contra C. per-fringens tipo A, E. coli K88, E. coli K99, E. coli 987P, E. coli Tipo 1 e toxóidebeta contra C. perfringens tipo C em uma dose de 2 ml.

Vacina n9 3: preparada como vacina de placebo, sem conter to-xóide alfa contra C. perfringens tipo A, porém contendo E. coli K88, E. coliK99, E coli 987P, E. coli Tipo 1 e toxóide beta contra C. perfringens tipo Cem uma dose de 2 ml.

Um grupo de dez porcas é vacinado por via intramuscular com 2ml da Vacina nB 1. Um segundo grupo de dez porcas é vacinado por via in-tramuscular com 2 ml da Vacina ne 2. O terceiro grupo de sete porcas é va-cinado com 2 ml da Vacina ne 3. Uma dose de reforço é fornecida 20 diasdepois das vacinas iniciais. As amostras de soro são coletadas no dia daprimeira vacina (Dia 0), 20 dias depois da vacina de reforço (Dia 40) e 41dias depois da vacina de reforço (Dia 61). É efetuada em seguida a avalia-ção do título de anticorpos contra toxina alfa pelo ensaio de inibição de he-mólise, descrito no Exemplo 1 acima. Os resultados para as três vacinas sãoapresentados individualmente nas Tabelas 20-22, respectivamente.Tabela 20

Vacina monovalente de toxóide alfa contra C. Perfrinaens Tipo A

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Tabela 21

Vacina combinada de toxóide alfa contra C. Perfrinaens Tipo A e E.Coli-Toxóide beta contra C. Perfrinaens Tipo C

<table>table see original document page 61</column></row><table>Tabela 21 -continuação-

<table>table see original document page 62</column></row><table>

Tabela 22

E. Coli- Toxóide beta contra C. Perfringens Tipo C

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Exemplo 6

Determinação de título de neutralização de toxina (TNT) em soro reunido deporcas vacinadas

Quatro porcas prenhas são separadas uniformemente em doisgrupos de tratamento. Um grupo é vacinado por via intramuscular com 2,0ml de vacina contendo 4 TCP, em uma dose de 2 ml da Vacina n- 1 do E-xemplo 5 acima. O outro grupo é o de controle que não é vacinado. As por-cas são vacinadas em aproximadamente 6-7 semanas antes de parirem aninhada, e uma dose de reforço é fornecida três semanas mais tarde. Amos-tras de sangue são coletadas antes da vacina e imediatamente antes de pa-rirem a ninhada. A Tabela 23 apresenta a avaliação das amostras de soropara título de antitoxina contra toxina alfa, utilizando um teste de neutraliza-ção de toxina (TNT), conforme descrito no Exemplo 3 acima.

Tabela 23

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O escopo da presente invenção não está restrito às concretiza-ções específicas descritas no presente pedido. De fato, várias modificaçõesda invenção, além daquelas descritas no presente, se tornarão aparentespara aqueles versados na técnica, a partir da descrição precedente. Há aintenção de que estas modificações enquadrem-se no escopo das reivindi-cações anexadas.

Deverá ainda ser entendido que todos os tamanhos de bases outamanhos de aminoácidos, além de todos os pesos moleculares e valores demassa, fornecidos para ácidos nucléicos ou polipeptídeos, são valores apro-ximados e fornecidos a título de descrição.

Várias publicações são citadas no presente, sendo a descriçãodas mesmas aqui incorporadas, em sua totalidade, por referência neste pe-dido de patente.

Claims (26)

1. Vacina compreendendo um antígeno selecionado do grupoconsistindo em toxóide alfa contra C. perfringens, fragmento antigênico detoxóide alfa contra C. perfringens, fragmento antigênico inativo de toxina alfade C. perfringens e qualquer combinação dos mesmos;em que uma a duas doses de 0,25 - 0,6 ml, por dose da vacina, é suficientepara induzir a produção de, pelo menos, quatro unidades antitoxina (U.A.) deanticorpo antitoxina alfa, por ml de anti-soro, em uma galinha vacinada coma vacina.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o antígeno éum preparado livre de células.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o antígeno éum toxóide alfa em um sobrenadante de toxóide alfa contra C. perfringens.

4. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o antígeno éum polipeptídeo recombinante.

5. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o referidoantígeno possui 2 ou mais TCP.

6. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o referidoantígeno é selecionado do grupo consistindo em um toxóide alfa Tipo A con-tra C. perfringens e um toxóide alfa Tipo C contra C. perfringens.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ain-da um adjuvante.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, em que uma emul-são água-em-óleo compreende o antígeno e o adjuvante.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, em que a emulsãoágua-em-óleo foi preparada com 70% de fase oleosa e 30% de fase aquosa.

10. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o antígenoé um toxóide Tipo alfa contra C. perfringens; com a ressalva de que somenteum único toxóide Tipo alfa contra C. perfringens está presente na referidavacina.

11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, em que o referidotoxóide alfa compreende um sobrenadante de toxóide alfa contra C. perfringens.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que uma vacinamultivalente compreende ainda uma ou mais das seguintes toxinas: toxinabeta de C. perfringens, toxina beta 2 de C. perfringens, enteroxina de C. per-fringens, toxina épsilon de C. perfringens, toxina iota de C. perfringens, toxi-na kapa de C. perfringens, toxina lâmbda de C. perfringens, toxina teta de C.perfringens, toxina C hemorrágica de C. sordellii, toxina letal de C. sordellii,toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile, toxina alfa de C. septicum, to-xina alfa de C. novyi e toxina beta de C. novyi.

13. Vacina de acordo com a reivindicação 12, em que a vacinamultivalente compreende ainda um ou mais antígenos virais, um ou maisantígenos bacterianos e um ou mais antígenos parasitários;em que o único ou mais antígenos virais são provenientes deuma ou mais das seguintes fontes: vírus da doença infecciosa bursal, reoví-rus e vírus da doença de Newcastle;em que o único ou mais antígenos bacterianos são provenientesde uma ou mais das seguintes fontes: E. coli, Salmonella e Campylobacter,e em que o único ou mais antígenos parasitários são provenientes de parasi-tas do gênero Eimeria.

14. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que uma vacinamultivalente compreende ainda um ou mais antígenos adicionais;em que o antígeno adicional é proveniente de uma ou mais dasseguintes fontes: vírus da doença infecciosa bursal, reovírus, vírus da doen-ça de Newcastle, E. coli, Salmonella, Campylobacter e parasitas do gêneroEimeria.

15. Vacina consistindo essencialmente em um antígeno selecio-nado do grupo consistindo em um único toxóide do Tipo alfa contra C. per-fringens, um fragmento antigênico do toxóide alfa, um fragmento antigênicoinativo de uma única toxina do Tipo alfa de C. perfringens e qualquer combi-nação dos mesmos;em que o único toxóide do Tipo alfa contra C. perfringens e ofragmento antigênico inativo da única toxina alfa de C. perfringens são domesmo Tipo; eem que uma a duas doses de 0,25 - 0,6 ml, por dose, da vacinaé suficiente para induzir a produção de, pelo menos, quatros unidades anti-toxina (U.A.), por ml de anti-soro, em uma galinha vacinada com a vacina.

16. Processo para prover imunidade passiva contra uma multi-plicidade de doenças aviárias à prole de uma ave fêmea, compreendendo aadministração da vacina de como definida na reivindicação 13, à ave fêmea,antes de sua postura de ovos que darão origem à prole; em que é providaimunidade passiva à prole contra uma multiplicidade de doenças.

17. Processo para prover imunidade passiva contra doença clos-tridiose à prole de uma ave fêmea, o referido processo compreendendo aadministração da vacina como definida na reivindicação 1, à ave fêmea, an-tes de sua postura de ovos que darão origem à prole; em que é provida imu-nidade passiva à prole.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a ave éuma galinha ou perua.

19. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a doen-ça é clostridiose e esta clostridiose é uma doença entérica.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a doen-ça entérica da clostridiose é a enterite necrosante.

21. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a doen-ça clostridiose é selecionada do grupo consistindo em colangiohepatite,dermatite gangrenosa e celulite.

22. Processo de produção de uma vacina toxóide alfa contra C.perfringens, compreendendo:(a) cultivo celular de C. perfringens em um meio de cultura paraprodução de uma quantidade de células cultivadas; em que a referida quan-tidade de células cultivadas secretam uma toxina alfa de C. perfringens nomeio celular;(b) inativação da toxina alfa secretada para produção de toxóidealfa contra C. perfringens;(c) remoção da maior parte das células cultivadas, do meio decultura, para formar um sobrenadante de toxóide alfa contra C. perfringens; e(d) ajuste da concentração do sobrenadante de toxóide alfa con-tra C. perfringens, de forma que este seja suficiente para induzir a produçãode pelo menos quatro unidades antitoxina (U.A.) de anticorpo antitoxina alfa,por ml de anti-soro, em uma ave que foi vacina com uma ou duas doses de-0,25 - 0,6 ml, por dose, da referida vacina.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, compreendendoainda a mistura do sobrenadante de toxóide alfa contra C. perfringens comuma emulsão água-em-óleo.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que a emul-são água-em-óleo é preparada com 70% de fase oleosa e 30% de fase aquosa.

25. Processo de acordo com a reivindicação 24, em que a célulacom C. perfringens é uma célula com um único Tipo de C. perfringens.

26. Processo de acordo com a reivindicação 25, em que a referi-da célula com um único Tipo de C. perfringens é selecionada do grupo con-sistindo em célula com C. perfringens Tipo A e célula com C. perfringensTipo C.