ES2584927T7 - Derivados de oligosacáridos sulfatados novedosos - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de oligosacáridos sulfatados novedosos
Campo de la Invención
La presente invención descrita aquí mismo se relaciona con compuestos que tienen una actividad como inhibidores de proteínas de unión al sulfato de heparano, incluyendo la enzima heparanasa. En particular, la presente invención está dirigida a los derivados de oligosacáridos sulfatados, aunque el alcance de la presente invención no se limita necesariamente a los mismos. Específicamente, la presente invención se relaciona con oligosacáridos polisulfatados modificados con grupos específicos altamente lipofílicos. La presente invención también se relaciona con métodos para la preparación de los compuestos, composiciones que comprenden los compuestos, y los compuestos y composiciones de los mismos para el tratamiento antiangiogénico, antimetástasico, antiinflamatorio, antimicrobiano, anticoagulante y/o antitrombótico de un sujeto mamífero. De manera adicional, los compuestos tienen una utilidad de prevención de los trastornos anteriores cuando son administrados a un sujeto mamífero.
Antecedentes de la Invención
El agente oligosacárido sulfatado conocido como PI-881,2 es un inhibidor prometedor del crecimiento tumoral y metástasis341 y ha pasado por ensayos clínicos en pacientes con cáncer56. PI-88 es una mezcla de oligosacáridos de manosa monofosforilados altamente sulfatados que se encuentran en un rango de tamaño de di- a hexasacárido78. PI-88 ejerce efectos angiogénicos inhibiendo las interacciones de factores de crecimiento angiogénicos (principalmente FGF-1, FGF-2 y VEGF) y sus receptores con sulfato de heparano91. Además, PI-88 es un inhibidor potente de la enzima heperanasa, una glucosidasa que escinde cadenas laterales de sulfato de heparano de proteoglicanos que son un constituyente principal de la matriz extracelular (ECM) y membranas basales que rodean las células tumorales12. La heparanasa ha estado fuertemente implicada en la angiogénesis: es capaz de liberar factores de crecimiento angiogénicos enlazados a sulfato de heparano activos de la ECM y está implicada en la degradación de la ECM y remodelación de tejido subsecuente asociado con la formación de nuevos vasos sanguíneos10. La degradación de la ECM por la heparanasa también es crucial en el esparcimiento de células tumorales (metástasis) permitiéndoles pasar al torrente sanguíneo y colocarse en sitios remotos en donde pueden formar tumores secundarios1110.
Además de sus efectos angiogénicos, PI-88 inhibe la cascada de coagulación de la sangre (i) inhibiendo las proteasas en la vía intrínseca, (ii) estimulando la liberación del inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI), y (iii) activando la inhibición mediada por el cofactor de heparina II de trombina. Sin embargo, PI-88 no interactúa con At III y por lo tanto no muestra una actividad anti-Xa o anti-IIa mediada por AT-III1213. Los estudios in vivo en monos han mostrado que las dosis bajas de PI-88 estimulan la liberación de todo el sulfato de heparano enlazado a TPFI de la pared de la célula vascular12. Aparte de su efecto en la coagulación, la TPFI también es un agente antiangiogénico14 y un inhibidor de la metástasis15. PI-88 también ha demostrado bloquear la proliferación de las células del músculo liso vascular y el engrosamiento intimal 16, para inhibir la infección por el virus del herpes simple (HSV) de células y el esparcimiento de célula a célula de HSV-1 y HSV-2 17, para inhibir la inefectividad y mejorar la supervivencia de modelos de múridos del dengue y flavivirus encefalíticos 18, para inhibir la proteinuria en nefritis de Heymann pasiva 19 y para mostrar una actividad antimalárica in vitro contra el Plasmodium falciparum20.
Varios otros polisacáridos y oligosacáridos polisulfatados y sus derivados son bien conocidos por exhibir tipos similares de actividades biológicas a PI-8821-26 Estas actividades biológicas son atribuidas a la inhibición de varias proteínas de unión al sulfato de heparano (HS.). Recientemente, se divulgaron algunos derivados de oligosacáridos sulfatados con perfiles farmacocinéticos y/o ADME (absorción, distribución, metabolismo, excreción) mejorados27'28. Los compuestos comprendieron un solo esqueleto de carbono y, por lo tanto, también proporcionan ventajas de síntesis y caracterización sobre mezclas tales como PI-88.
El objeto de la presente invención es la creación de miméticos de HS con una potencia aún mayor, propiedades farmacocinéticas mejoradas y un perfil de efectos secundarios reducido.
Compendio de la Invención
De acuerdo con la primera realización de la presente invención, se proporciona un compuesto de una fórmula general:
[X]n-Y-ZR1R2 I
en donde:
X e Y son cada uno una unidad de monosacárido en donde cada grupo hidroxilo no comprendido en un enlace glucosídico está independientemente sustituido por un grupo SO3M o H, en donde M es cualquier catión farmacéuticamente aceptable;
X e Y son cualquiera de D- o l-hexosa o pentosa, en donde la hexosa se selecciona entre el grupo que consiste en glucosa, altrosa, alosa, talosa, galactosa, idosa y gulosa;
Y está en una forma abierta de anillo o cíclica;
Z es O, S, un estado de oxidación más elevado de S, o un enlace, y está enlazado al carbono anomérico cuando Y es un monosacárido de reducción;
R1 es un conector seleccionado del grupo que incluye alquileno, alquenileno, alquinileno, arileno, heteroalquileno, heteroarileno, acileno, aroileno, alquilenamido, alquilentioamido, triazolileno, un conector oximetil[1,2,3]-triazol-1-ilo o es un enlace;
R2 es un resto lipofílico seleccionado del grupo que incluye colestanilo, colato, desoxicolato, propilestearamida;
n es un número entero de 0-6;
el nivel de sulfatación de cada compuesto es de entre 70 y 100 % de los grupos hidroxilo totales.
De acuerdo con una segunda realización de la presente invención, se proporciona una composición veterinaria o farmacéutica para la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de un melanoma, cáncer colorrectal o un trastorno que resulta del crecimiento tumoral, la angiogénesis, tal como la proliferación o migración de células endoteliales, la propagación de células tumorales (metástasis), inflamación, coagulación/trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovasuclar, cuya composición comprende por lo menos un compuesto de acuerdo con la primera realización junto con un diluyente o portador veterinaria o farmacéuticamente aceptable para dicho al menos un compuesto.
La tercera realización de la presente invención comprende el uso de un compuesto de acuerdo con la Fórmula I en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de un melanoma, cáncer colorrectal o un trastorno que resulta del crecimiento tumoral, la angiogénesis, tal como la proliferación o migración de células endoteliales, la propagación de células tumorales (metástasis), inflamación, coagulación/trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovascular.
De acuerdo con una cuarta realización de la presente invención, se proporciona un compuesto de Fórmula I para la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de un melanoma, cáncer colorrectal o un trastorno que resulta de la angiogénesis, tal como la proliferación o migración de células endoteliales (metástasis), inflamación, coagulación/trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovascular.
Para que la presente invención pueda ser entendida más fácilmente y puesta en práctica, una o más realizaciones preferidas de la misma serán descritas a continuación, a modo de ejemplo solo, haciendos referencia a las figuras adjuntas.
Breve Descripción de los Dibujos
La figura 1 muestra ejemplos del grado de formación de brotes angiogénicos en el análisis de angiogénesis aórtico de rata utilizado para demostrar la actividad angiogénica de los compuestos.
La figura 2 muestra los datos para cultivos aórticos tratados con medio (para un grupo de control no tratado) o compuestos de análisis cada 48 días desde el día 0 durante 7 días. En séptimo día, se agregó VEGF (10 mg/ml) a los cultivos cada 2-3 días durante 7 días adicionales y la cantidad de angiogénesis fue posteriormente evaluada, por lo tanto, se demostró que los compuestos ejercen sus efectos inhibitorios a través de un mecanismo antiangiogénico en lugar de mediante la inducción de un efecto tóxico en el tejido. Los tres compuestos inhibieron la angiogénesis de manera potente (ver Tabla 4).
La figura 3 muestra la mediana de los volúmenes de tumor de ratones de control no tratados y de ratones tratados con compuestos de análisis seleccionados en el modelo de melanoma de ratón B16. A pesar de la reducción de los niveles de dosis para los compuestos de la presente invención, o duración limitada de la exposición, la actividad antitumoral se vio incrementada de todas formas en comparación con PI-88 o análogos nolipofílicos. Bid = bis in die (dos veces al día), sid = semel in die (una vez al día), qd = quaque die (cada día).
La figura 4 muestra los datos del porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) de ratones que tienen tumores tratados con compuestos de análisis seleccionados en el modelo de melanoma de ratón B16. A pesar de la reducción de los niveles de dosis para los compuestos de la presente invención, los valores %TGI se vieron aun así mejorados en comparación con PI-88 o análogos nolipofílicos. Bid = dis in die (dos veces al día), sid = semel in die (una vez al día).
La figura 5 muestra ejemplos de compuestos de análisis que bloquean la formación de colonias de pulmonares de las células de melanoma B16F1 en ratones. Los compuestos y dosis administrados son descritos debajo de cada imagen.
La figura 6 muestra el número de nódulos metastásicos de pulmón como un porcentaje comparado con el control salino con compuestos de análisis seleccionados en el modelo de metástasis de pulmón B16. Los ratones tratados con PI-88 y los compuestos seleccionados mostraron menos nódulos metastásicos de pulmón en comparación con el control salino. A pesar de la reducción de los niveles de dosificación en la mayoría de los casos para los compuestos de la presente invención, la inhibición de la metástasis aun asi fue similar a las observadas con las dosificaciones más elevadas de PI-88. Bid = bis in die (dos veces al día), sid = semel in die (una vez al día).
La figura 7 muestra los datos del porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) de ratones que tienen tumores tratados con los compuestos de análisis seleccionados en el modelo de xenoinjerto HT29 de cáncer colorrectal. A pesar de la redución de los niveles de dosis para los compuestos de la presente invención, los valores %TGI se vieron aun así mejorados en comparación con PI-88 o análogos nolipofílicos. Bid = bis in die (dos veces al día), sid = semel in die (una vez al día).
La figura 8 muestra el efecto de compuestos de análisis en la transmisión de célula a célula de HSV. Las células fueron infectadas con ~200 PFU de ya sea HSV-1 o HSV-2, y posteriormente revestidas con EMEM suplementado con 1 % de metilcelulosa y 10 pg/ml del compuesto de análisis. Los resultados son expresados como un porcentaje del área promedio de placas virales desarrolladas en células tratadas con fármaco relativas a controles con un tratamiento simulado. Las imágenes de veinte placas virales fueron capturadas y sometidas a determinaciones de área utilizando el software IM500.
La figura 9 muestra el efecto de los compuestos de análisis de la unión de viriones de HSV a células. Los compuestos de análisis a concentraciones específicas fueron incubados a una temperatura de 4°C con HSV-1 o HSV-2 marcado con metil-[3H]timidina durante un periodo de 2 horas de absorción de virus a células GMK AH1. Los resultados son expresados como un porcentaje de cpm viral adherido que se halla en los viriones tratados con compuesto en relación con controles con un tratamiento simulado. Los experimentos con el compuesto 4, el número medio de cpm adherido de virus con un tratamiento simulado que se adhirió a las células a 4°C fue 4263 para HSV-1 y 1742 para HSV-2. Los valores mostrados son las medias de cuatro determinaciones de dos experimentos separados.
Las figuras de la 10 a la 40 muestran los esquemas de reacción y estructuras químicas de la presente invención.
Descripción Detallada de Realizaciones Preferidas
Los derivados de oligosacárido sulfatado descritos en WO 2005/085264 son buenos inhibidores de la angiogénesis y otros procesos mediados por proteínas de unión a HS. Tales compuestos tienen utilidad en la prevención o tratamiento en sujetos mamíferos de un trastorno que resulta de la angiogénesis, metástasis, inflamación, coagulación, trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovascular. Esta utilidad resulta de la habilidad de los compuestos para inhibir la actividad de proteínas de unión a HS tales como los factores de crecimiento FGF-2 y VEGF, y la enzima heparanasa. Los inventores han encontrado que si los oligosacáridos sulfatados son modificados con grupos altamente lipofílicos, por ejemplo, colestanol o ácido esteárico, dichos grupos estando adheridos a un carbohidrato directamente o a través de un conector, entonces los nuevos compuestos generados tienen una potencia incrementada significativamente como agentes antiangiogénicos y han mejorado sus propiedades farmacocinéticas. Esto es demostrado por su actividad en varios análisis de angiogénesis in vitro y ex vivo tal como la proliferación de células endoteliales inducida por el factor de crecimiento y análisis de migración, el análisis de formación de tubo endotelial en Matrigel™ y el análisis de aorta de rata. La potencia incrementada también es manifestada en modelos animales de crecimiento tumoral. Cabe destacar el hecho de que los sacáridos sulfatados más pequeños (por ejemplo, mono- a trisacáridos), los cuales generalmente son inactivos o tienen solo una actividad antiangiogénica leve (u otra actividad parecida a HS) comparada con homólogos más grandes, una vez modificados tienen una actividad incrementada significativamente similar o mejor que sus cogéneres más grandes pero no modificados.
Algunos de los compuestos también muestran una potencia incrementada como agentes antivirales. Por ejemplo, la modificación lopifílica resultó en una capacidad aumentada para inhibir la infección de células y la transmisión de célula a célula del virus del herpes simple (HSV), virus sincitial respiratorio (RSV), o V1H. Además, las modificaciones proporcionaron algunos compuestos con la capacidad de inactivar de manera completa las partículas de virus, por lo tanto, haciéndolós antivirales más potentes que los oligosacáridos sulfatados no modificados (tales como PI-88) los cuales pueden inhibir los pasos de unión/entrada del virus sin inactivar los viriones.
Uno de los efectos secundarios de los oligosacáridos sulfatados no modificados es una actividad anticoagulante. Las modificaciones lipofílicas descritas en la presente invención resultan en compuestos nuevos con una actividad anticoagulante reducida comparada con PI-88, la cual puede resultar en márgenes terapéuticos más amplios. El hematoma en el sitio de injeccion comúnmente visto en animales tratados con PI-88 también es eliminado, por lo tanto, se mejora potencialmente el cumplimiento del paciente.
Los derivados de oligosacáridos sulfatados descritos en esta especificación también pueden ser sintetizados utilizando un número de estrategias diferentes tal y como se ha descrito ampliamente más adelante y tal y como se ha ilustrado en los ejemplos.
Con respecto a los compuestos de la Fórmula I, las unidades de monosacárido X e Y son cualquier hexosa o pentosa, en donde la hexosa se selecciona entre el grupo que consiste en glucosa, altrosa, alosa, talosa, galactosa, idosa y gulosa y puede ser un isómero D o l. Tales pentosas incluyen ribosa, arabinosa, xilosa y lixosa. Los conectores glucosídicos de las unidades de monosacárido pueden ser exclusivamente de un tipo de tipos diferentes en términos de configuración y conexión.
El catión farmacéuticamente aceptable M puede ser cualquier catión de este tipo, pero es preferentemente sodio.
Con respecto al número entero n, n es un número entero de 0-6, preferentemente 2, 3 o 4, para proporcionar un compuesto el cual es un tri-, tetra- o pentasacárido.
El grupo R2 puede ser cualquier resto lipofílico, tal como se define en la reivindicación 1, pero es preferentemente estereamida de propilo o colestanilo.
La configuración anomérica, en donde sea aplicable, en ZR1 de los compuestos de la fórmula I pueden ser ya sea a o p o una mezcla anomérica a/p.
Con respecto a los sustituyentes dados anteriormente en la definición de compuestos de la Fórmula I, el término “alquilo”, cuando es utilizado solo o en palabras compuestas tales como “arilalquilo” se refiere a un grupo de cadena lineal, ramificada o hidrocarburo cíclico.
El término “arilo”, cuando es utilizado solo o en palabras compuestas tales como “arilalquilo”, denota residuos simples, polinucleares, conjugados o fusionados de hidrocarburos aromáticos. Un grupo arilo puede ser sustituido de manera opcional por uno o más sustituyentes opcionales.
El término “acilo” se refiere a un grupo -C(O)-R en donde R es un grupo alquilo o arilo. Ya que el grupo R puede ser sustituido de manera opcional tal y como se describió anteriormente, “acilo” es usado para referirse a un acilo sustituido de manera opcional.
Los sustituyentes opcionales para alquilo, arilo o acilo incluyen halo (bromo, fluoro, cloro, iodo), hidroxi, Ci-6alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, propilo (n- e i-isómeros)), Ci-6alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi (n- e i-isómeros), butoxi (n-, sec- y t-isómeros), nitro, amino, Ci-6alquilamino (por ejemplo metilamino, etilamino, propil (n- e i- isómeros)amino), Ci-6dialquilamino (por ejemplo, dimetilamino, dietilamino, diisopropilamino), halometilo (por ejemplo, trifluorometilo, tribromometilo, triclorometilo), halometoxi (por ejemplo trifluorometoxi, tribromometoxi, triclorometoxi) y acetilo.
El grado de sulfatación de los compuestos de acuerdo con la presente invención es típicamente de por lo menos 70 %. Es decir, por lo menos el 70 % de los grupos hidroxilo de un derivado de oligosacárido no comprendido en un enlace glucosídico son substituidos por SO3M. El grado de sulfatación es típicamente de 70 a 100 % y preferentemente es por lo menos tan elevado como 90 %.
Los compuestos de la Fórmula I pueden hacerse a través de una ruta sintética en pasos a partir de unidades estructurales de tipo carbohidrato o comenzando con un oligosacárido de la longitud apropiada y haciendo las modificaciones deseadas. Los monosacáridos de la fórmula I pueden hacerse directamente del material de partida del monosacárido. Las modificaciones lipofílicas pueden ser introducidas al sacárido por un número de métodos diferentes, como será aparente para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los grupos lipofílicos pueden ser introducidos en la posición anomérica del extremo reductor del azúcar a través de un enlace glucosídico O-, N-, S- o C- y dicho grupo puede estar directamente enlazado con la posición anomérica o puede estar adherido a través de un conector. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que existen varios tipos de conectores adecuados.
Cabe destacar que todos los derivados hechos tal y como se describió anteriormente son posteriormente sometidos a una desprotección (típicamente, desacetilación con NaOMe) y el poliol sulfonado resultante con un reactivo de sulfonación tal como un complejo de trióxido de azufre y piridina o un complejo de trióxido de azufre y trimetilamina.
Tal y como se indica anteriormente, los compuestos de acuerdo con la presente invención tienen utilidad en la prevención o tratamiento en sujetos mamíferos de un trastorno resultante de la angiogénesis, metástasis, inflamación, coagulación, trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana o enfermedad cardiovascular. Los compuestos tienen una utilidad particular en el tratamiento de los desórdenes en humanos. Los compuestos tienen una utilidad particular en el tratamiento de los desórdenes anteriores en humanos. Los compuestos son típicamente administrados como un componente de una composición farmacéutica tal y como se describe en los siguientes párrafos.
Las composiciones farmacéuticas para una administración oral pueden ser en forma de un comprimido, cápsula, polvo o líquida. Un comprimido puede incluir un portador sólido tal como una gelatina o un adyuvante o un diluyente inerte. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites vegetales o animales, un aceite mineral o un aceite sintético. Solución salina fisiológica, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol pueden ser incluidos. Tales composiciones y preparaciones generalmente contendrán por lo menos 0,1 % del compuesto.
La administración parenteral incluye la administración por las siguientes vías: intravenosamente, cutáneamente o subcutáneamente, nasalmente, intramuscularmente, intraocularmente, transepitelialmente, intraperitonealmente y tópicamente. La administración tópica incluye una administración dérmica, ocular, rectal, nasal así como una administración por inhalación o por medio de un aerosol. Para una inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o una inyección en el sitio en donde el tratamiento es deseado, el principio activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable la cual está libre de pirógeno y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, soluciones de los compuestos en cuestión o derivados de estos.
Además del por lo menos un compuesto y un diluyente o portador, las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden incluir de manera adicional un excipiente, amortiguador, estabilizador, agente de isotonización, conservante o antioxidante o cualquier otro material conocido por aquellos expertos en la técnica veterinaria o farmacéuticamente aceptables. Podrá ser apreciado por un experto en la técnica que tales materiales deberán ser no tóxicos y no deberán interferir con la eficacia del/de los compuesto(s). La naturaleza precisa de cualquier aditivo puede depender de la vía de administración de la composición, es decir, si la composición es para ser administrada oralmente o parenteralmente. Con respecto a los amortiguadores, las composiciones acuosas típicamente incluyen tales sustancias de modo de mantener la composición a un pH cercano al fisiológico o al menos dentro de un rango de aproximadamente un pH 5,0 a 8,0.
Las composiciones de acuerdo con la presente invención también pueden incluir principios activos además del por lo menos un compuesto. Tales principios serán escogidos principalmente por su eficacia como agentes antiangiogénicos, antimetastásicos, antiinflamatorios, anticoagulantes, antimicrobianos y antitrombóticos, y agentes efectivos contra los niveles de triglicéridos en sangre elevados y enfermedad cardiovascular, pero pueden ser escogidos por su eficacia contra cualquier afeción asociada.
Una composición veterinaria o farmacéutica de acuerdo con la presente invención será administrada a un sujeto en ya sea una cantidad efectiva profilácticamente o efectiva terapéuticamente como sea necesario para la situación particular bajo consideración. La cantidad real de por lo menos un compuesto administrado mediante una composición, y la tasa y tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de la afección tratada o la profilaxis requerida. La prescripción de tratamiento tales como decisiones o dosificación y similares estarán dentro de la habilidad del médico o veterinario responsable del cuidado del sujeto. Sin embargo, típicamente, las composiciones para la administración a un sujeto humano incluirán de entre aproximadamente 0,01 y 100 mg del compuesto por kg de peso corporal y más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 10 mg/kg de peso corporal.
Los compuestos pueden ser incluidos en composiciones como derivados aceptables en veterinaria o farmacéuticamente de los mismos. Tal y como se utiliza en la presente invención “derivados” de los compuestos incluye sales, complejos de coordinación con iones de metal tales como Mn2+ y Zn2+, ésteres tales como ésteres hidrolizables in vivo, ácidos libres o bases, hidratos y profármacos. Los compuestos que tienen grupos acídicos tales como fosfatos o sulfatos pueden formar sales con metales alcalinos o alcalinotérreos tales como Na, K, Mg y Ca, y con aminas orgánicas tales como trietilamina y Tris (2-hidroxietil) amina. También pueden formarse sales entre compuestos con grupos básicos, tales como aminas, con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico o ácido sulfúrico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido fumárico, o ácido tartárico. Los compuestos que tienen tanto grupos básicos como acídicos pueden formar sales internas.
Los ésteres pueden formarse entre grupos de ácido carboxílico o hidroxilo en el compuesto y un ácido carboxílico o un alcohol apropiados como el otro componente de la reación, utilizando técnicas que serán bien conocidas para aquellos expertos en la técnica.
Los derivados de profármaco de los compuestos de la presente invención pueden ser transformados in vivo o in vitro en los compuestos originales. Típicamente, por lo menos una de las actividades biológicas de un compuesto original puede ser eliminada en la forma de profármaco del compuesto, y puede ser activada por una conversión del profármaco al compuesto original o un metabolito del mismo. Los profármacos de los compuestos de la presente invención incluyen el uso de grupos de protección los cuales pueden se removidos in vivo para liberar el compuesto activo o servir para inhibir la eliminación del fármaco. Los grupos de protección adecuados serán conocidos por aquellos expertos en la técnica.
También como se indicó anteriormente, los compuestos de acuerdo con la presente invención tienen utilidad en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de un trastorno que resulta de la angiogénesis, metástasis, inflamación, coagulación/trombosis, infección microbiana, niveles de triglicéridos en sangre elevados, y/o enfermedad cardiovascular. Los procesos para la fabricación de tales medicamentos serán conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen los procesos utilizados para fabricar las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente.
Ahora se brindará una descripción general de las vías sintéticas para obtener los compuestos de acuerdo con la presente invención.
Procedimientos Generales
Procedimiento General de Desacetilación
Una solución del peracetato en MeOH anhidro (0,1 M) (o MeOH-THF) fue tratada con una solución de NaOMe en MeOH (1,35 M, 0,2-0,6 eq). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 1 a 3 horas (monitoreada por TLC). Se agregó resina acídica AG ®-50W-X8 (forma H+) para ajustar el pH = 6-7, y la mezcla fue filtrada y la resina fue lavada con MeOH. El filtrado combinado y los lavados fueron concentrados al vacío y secados por completo para proporcionar el producto de poliol.
Procedimiento general para sulfonación
Una mezcla del poliol y el complejo trimetilamina SO3 o piridina SO3 (2 eq. por alcohol) en DMF fue calentada (60°C, o/n). La mezcla de reacción enfriada (TA) fue tratada con MeOH y posteriormente hecha básica (hasta un pH >10]) mediante la adición de Na2CO3 (10 % p/p). La mezcla fue filtrada y el filtrado evaporado y coevaporado (H2O). El material polisulfatado crudo fue disuelto en H2O y sometido a una cromatografía de exclusión por tamaño (ver abajo) para proporcionar el producto sulfatado. Cuando fue requerido, después de la liofilización el producto fue pasado a través de una columna de resina de intercambio iónico (Ag ®-50W-X8, forma Na+, 1 x 4 cm, H2O desionizado, 15 ml) para poder transferir el producto uniformemente en la forma de sal de sodio. La solución recolectada fue evaporada y liofilizada para proporcionar el producto final.
Cromatografía de exclusión por tamaño
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) fue ejecutada sobre Bio-Gel P-2 en una columna de 5 x 100 cm y una velocidad de flujo de 2,8 ml/min de 0,1 M NH4+ HCO3', recolectando fracciones de 2,8 min (7,8 ml). Las fracciones se analizaron para determinar el contenido en carbohidratos sembrándolas en placas de gel de sílice y se visualizaron por calcinación y/o se analizaron para determinar las especies policargadas mediante el ensayo de azul de dimetilmetileno (DMB)29. Finalmente, se verificó la pureza de las fracciones mediante CE8 y aquellas libres de sal fueron agrupadas y liofilizadas.
Ejemplo 1: 2,3,4,6-tetra-0-acetiI-a-D-manopiranosil-(l^3)-2,4,6-tri-0-acetil-a-D-manopiranosil-(l^3)-2,4,6-tri-O-acetila-D-manopiranosil-(l^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosida (2) de dodecilo
A una solución de tricloroacetamida 128 (0,469 g, 0,285 mmol) en DCM (15 ml) se le agregó 1-dodecanol (0,849 mmol), 3 eq) y 3Á MS (50 mg). La mezcla fue agitada a una temperatura de -20°C durante 20 minutos. TMSOTf (103 pl, 0,57 mmol, 2 eq) fue agregado y la mezcla fue agitada a una temperatura de -20°C durante 50 minutos antes de desactivarla con Et3N (30 pl, 0,285 mmol, 1 eq). Posteriormente a calentar a temperatura ambiente, la mezcla fue filtrada y el sólido fue lavado con DCM. Los lavados y filtrados combinados fueron evaporados en gel de sílice y purificados por cromatografía en columna (sílice 2 x 20 cm, gradiente de elución con CHCb, CHCb-MeOH 99:1 a 98:2) para proporcionar el de glucósido 2 como una goma incolora. Dos fracciones fueron obtenidas, cada una conteniendo el producto derivado (76 mg, 2:BnNHAc = 5:3; 179 mg, 2:BnNHAc = 5:11) 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5,30-5,16 (m, 8H), 4,99-4,87 (m, 8H), 4,31-3,77 (m, 19H), 3,68-3,61 (m, 1H, OCH2), 3,44-3,36 (m, 1H, OCH2), 2,18, 2,17, 2,15, 2,11,2,10, 2,09, 2,07, 2,06, 2,05, 2,02, 2,01, 1,97, 1,95 (cada s, total 48H, 16xAc), 1,58 (quintete, 2H, J= 6,7, CH2), 1,33-1,22 (m, 18H, 9xCH2), 0,86 (t, 3H, J= 6,7, CH3).
a-D-Manopiranosil-(l^3)-a-D-manopiranosil-(l->3)-a-D-manopiranosil-(l^3)-a-D-manopiranosil-(l->2)-a-D-manopiranósido de dodecilo (3)
Siguiendo el procedimiento general para la desacetilación, se trató glucósido 2 (72 mg, 0,043 mmol) en MeOH (3 ml) con NaOMe (11 M en MeOH, 5 pl, 0,055 pmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 20 horas, neutralizada por adición de resina AG50WX8 (forma H+'), filtrada y lavada con agua. La solución fue extraída con EtOAc (x2) para eliminar el BnNHAc. La fase acuosa fue evaporada a sequedad y el residuo fue secado con congelamiento para proporcionar el poliol 3 como un sólido amorfo, utilizado directamente para el siguiente paso 1H RMN (D2O, 400 MHz, interno DOH a 4,60 ppm) 84,97-4,83 (m, 5H), 4,06-3,21 (m, 32H), 1,41 (s a, 2H), 1,11 (s a, 18H), 0,71 (t, 3H, J= 6,7, CH3).
2,3,4,6-Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(l^ 3)-2,4,6-tri-0-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(l^ 3)2.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(l^- 3)-2,4,6-tri-0-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(l^- 2)-3,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de dodecilo (4)
Siguiendo el procedimiento estándar para la sulfonación, el poliol 3 (0,43 mmol) fue sulfonado y purificado por SEC para proporcionar el producto 4 como un polvo blanco (77 mg). 1H RMN (D2O, 400 MHz, interno DOH a 4,60 ppm) 8 5,19 (s, 1H), 5,15 (d, IH 5 J= 1,9), 5,10 (d, IH 5 J= 1,9), 5,07 (d, IH 5 J= 1,9), 4,89 (m, 1H), 3,77-3,64 (m, 3OH, azúcar), 3,48-3,41 (m, 1H, OCH2), 3,33-3,27 (m, 1H, OCH2), 1,30 (m, 2H, CH2), 1,10-0,90 (m, 18H, 9xCH2), 0,54 (t, 3H5 J= 6,7, CH3).
Ejemplo 2: 12-Azido-1-dodecanol
Una mezcla de 12-bromo-1-dodecanol (246 mg, 0,97 mmol) en t-butanol (1,8 ml, 0,5 M) fue tratada con azida de sodio (121 mg, 1,855 mmol, 2 eq), ioduro de tetrabutilamonio (17 mg, 0,0464 mmol, 0,05 eq) y solución de bicarbonato de sodio sat. aq. (0,9 ml) en ese orden. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 4 días. La mezcla fue filtrada a través de un lecho de celite y la masa retenida lavada con acetato de etilo (20 ml). Los lavados y el filtrado combinados fueron evaporados en gel de sílice y purificados por columna flash (2,5x18 cm, gradiente de elución con hexano-acetato de etilo 6:1, 4:1 a 2:1) para proporcionar 12-Azido-1-dodecanol como un aceite incoloro (193 mg, 92 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 3,62 (t, 2H, J= 7,0, OCH2), 3,24 (t, 2H, J= 7,0, NCH2), 1,61-1,51 (m, 4H)51,35-1,25 (m, 16H).
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 12-azidodecilo (5)
A una solución de tricloroacetimidato 1 (0,325 g, 0,197 mmol) en DCM (15 ml) se le agregó 12-azidododecanol (1,5 eq) y 3Á MS (50 mg). La mezcla fue agitada a una temperatura de -20°C durante 20 minutos. TMSOTf (54 pl, 0,296 mmol, 1,5 eq) fue agregado y la mezcla fue agitada a una temperatura de -20°C durante 30 minutos antes de desactivarla con Et3N (1 eq). Posteriormente a calentar a temperatura ambiente, la mezcla fue filtrada y el sólido fue lavado con DCM. Los lavados y el filtrado combinados fueron evaporados en gel de sílice y purificados por cromatografía en columna (sílice 2 x 20 cm, de gradiente de elución con CHCb, CHCb-MeOH 99:1 a 98:2) para proporcionar el glucósido 5 como una goma incolora que contiene el producto derivado BnNHAc (71,1 mg, 5:BnNHAc = 1:1).1H RMN (CDCla, 400 MHz) 85,29-5,14 (m, 8H), 5,01-4,86 (m, 8H), 4,28-3,75 (m, 19H), 3,64 (dt, 1H, J= 9,5, 7,0, OCH2), 3,39 (dt, 1H, J= 9,5, 7,0, OCH2), 3,22 (t, 2H, J= 7,0, NCH2), 2,16, 2,15, 2,11, 2,10, 2,09, 2,09, 2,09, 2,09, 2,07, 2,06, 2,04, 2,04, 2,01, 1,95 (cada s, total 48H, 16xAc), 1,57 (m, 4H, 2xCH2), 1,36-1,22 (m, 16H, 8XCH2).
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 12-(4-fenil-[1,2,3]triazol-1-il)dodecilo (6)
En un frasco de muestra de HPLC de 1 ml se cargó la azida 5 (71 mg, 41,5 pmol), t-butanol (100 pl, 0,4 M), fenilacetileno (83 pmol, 2 eq), solución de sulfato de cobre (0,3 M en agua, 14 pl, 4,2 pmol, 10 mol%) y solución de ascorbato de sodio (1M en agua, 12,4 pl, 12,4 pmoll, 30 pmol%) en ese orden. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla fue posteriormente evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía en columna flash (1 x 18 cm, gradiente de elución con hexano-acetato de etilo 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 a 1:3) para proporcionar feniltriazolo 6 como una goma incolora (46,3 mg, 62 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 87,82 (d, 2H, J= 7,2, Ph), 7,75 (s, 1H, triazolo), 7,41 (t, 2H, J= 7,2, Ph), 7,31 (t, 1H, J= 7,2, Ph), 5,30-5,15 (m, 8H), 5,03-4,87 (m, 8H), 4,38 (t, 2H, J= 7,2, NCH2), 4,29-3,77 (m, 19H), 3,64 (dt, 1H, J= 9,6, 6,8, OCH2), 3,40 (dt, 1H, J= 9,6, 6,8, OCH2), 2,17, 2,16, 2,16, 2,13, 2,11,2,11,2,11,2,10, 2,09, 2,07, 2,05, 2,05, 2,02, 2,00, 1,96 (cada s, total 48H, 16xAc), 1,93 (m, 2H, CH2), 1,57 (m, 2H, CH2), 1,34-1,24 (m, 16H, 8xCH2).
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^-2)-3.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 12-(4-fenil-[1,2,3]triazol-1-il)dodecilo (8)
1. (a) Siguiendo el procedimiento general para la desacetilación, se trató peracetato 6 (46 mg, 0,0254 mmol) en MeOH (4,5 ml) con NaOMe (11 M en MeOH, 50 pl, 0,55 pmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 18 horas, neutralizada por adición de resina AG50WX8 (forma H+'), filtrada y lavada con MeOH. El filtrado fue evaporado y el residuo fue secado en disecadores al vacio bajo P2O5 y utilizado sin una purificación o caracterización adicional. (b) siguiendo el porcedimiento estándar de sulfonación, el poliol 7 descrito anteriormente fue sulfonado y purificado por SEC para proporcionar el producto 8 (45 mg) como un polvo blanco 1H RMN (D2O, 400 MHz, interno DOH a 4,60 ppm) 87,88 (s, 1H, triazol-CH), 7,47-7,44 (m, 2H), 7,21-7,10 (m, 3H), 5,23 (s a, 1H), 5,19 (d, lH, l= 1,5), 5,12 (d, lH, J= 1,8), 5,10 (d, 1H, J= 1,5), 4,91 (m, lH), 4,76-3,72 (m, 32H, azúcar y NCH2), 3,37­ 3,30 (m, lH, OCH2), 3,23-3,17 (m, 1H, OCH2), 1,51 (m, 2H, CH2), 1,12 (m, 2H, CH2), 0,90-0,63 (m, 16H, 8xCH2).
Ejemplo 3: 2,3,4,6-Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 12-(4-naftalen-1-il-[1,2,3]triazol-1-il)dodecilo (9)
En un frasco de muestra de HPLC de 1 ml se cargó azida 5 (86 mg, 50,3 |jmol), t-butanol (100 pl, 0,4 M), 1-etinilnaftaleno (83 jmol, 2 eq), solución de sulfato de cobre (0,3 M en agua, 14 pl, 4,2 jmol, 10 mol%) y solución de ascorbato de sodio (1 M en agua, 12,4 pl, 12,4 jmol, 30 pmol%) en ese orden. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 11 días. Posteriormente la mezcla fue evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna flash (1 x 18 cm, gradiente de elución con hexano-acetato de etilo 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 a 1:3) para proporcionar naftiltriazolo 9 como una goma incolora (24,2 mg, 26 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 88,38-8,33 (m, 1H), 7,92-7,86 (m, 2H), 7,80 (s, 1H, triazolo-CH), 7,72 (dd, 1H, J= 7,3, 1,5), 7,54-7,48 (m, 3H), 5,31-5,15 (m, 8H), 5,03-4,87 (m, 8H), 4,47 (t, 2H, J= 7,3, N-CH2), 4,30-3,77 (m, 19H), 3,64 (dt, 1H, J= 9,7, 6,8, OCH2), 3,40 (dt, 1H, J= 9,7, 6,8, OCH2), 2,17, 2,16, 2,16, 2,13, 2,12, 2,11, 2,11, 2,10, 2,09, 2,07, 2,06, 2,05, 2,02, 2,00, 1,97, 1,57 (15s, cada 3H, excepto 2,100 (6H), 16xAc), 2,07-1,95 (m, solapado con singletes Ac, 2H, CH2), 1,57 (m, 1H, CH2), 1,42-1,23 (m, 16H, 8XCH2).
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^-2)-3.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 12-(4-naftalen-1-il-[1,2,3]triazol-1-il)dodecilo (11)
1. (a) Siguiendo el procedimiento general para la desacetilación, se trató glucósido 9 (39,6 mg, 0,0213 mmol) en MeOH (3 ml) con NaOMe (11 M en MeOH, 40 pl, 0,044 jmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas, neutralizada por adición de resina AG50WX8 (forma H+), filtrada y lavada con MeOH. El filtrado fue evaporado y el residuo fue secado en un disecador al vacío bajo P2O5. (b) siguiendo el procedimiento estándar de sulfonación, el poliol 10 descrito anteriormente fue sulfonado y purificado por SEC para proporcionar el producto 11 como un polvo blanco (40 mg, 68 %). 1H RMN (D2O, 400 MHz, interno d Oh a 4,60 ppm) 88,05 (s, 1H, triazolo-CH), 7,97 (d, 1H, J= 8,3), 7,90 (d, 2H, J= 7,8), 7,55-7,40 (m, 4H), 5,44-5,22 (m, 4H), 5,09-3,82 (m, 33H, azúcar y NCH2), 3,41-3,33 (m, 1H, OCH2), 3,25-3,16 (m, 1H, OCH2), 1,78 (quintete, 2H, CH2), 1,14-0,79 (m, 18H, 9xCH2).
Ejemplo 4: 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranósido (13)
El tetrasacárido 1230 fue peracetilado (Ac2O, piridina, DMAP, TA, 4 días) y purificado por cromatografía flash (gel de sílice, gradiente de hexano-EtOAc) para proporcionar el peracetato 13 como un aceite. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8 6,20 (d, 1H, J1;2 = 1,8, H-1), 5,35-5,15 (m, 7H), 5,05-4,92 (m, 5H), 4,30-3,85 (m, 15H), 2,18 (s, 6H, OAc), 2,14 (s, 6H, OAc), 2,12 (s, 6H, OAc), 2,10 (s, 3H, OAc), 2,08 (s, 6H, OAc), 2,06 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 3H, OAc), 2,02 (s, 6H, OAc), 1,97 (s, 3H, OAc).
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2.4.6- tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosilo (14)
El peracetato 13 (500 mg, 398 jm oll) en éter dietílico (3,0 ml) y THF (750 pl) fue tratado con bencilamina (0,137 g, 1,3 mmol, 139 pl) a una temperatura de 0°C. La mezcla fue calentada lentamente hasta alcanzar la temperatura ambiente y se dejó reaccionar durante la noche. El solvente fue evaporado y el residuo recogido en DCM y lavado con 0,5 M HCl frío (x3), seguido por salmuera y la solución orgánica fue secada (Na2SO4), filtrada y evaporada. Al residuo se añadió DCM seco y tamices moleculares (3Á, 30 mg), carbonato de cesio anhidro (12,9 mg, 39,8 jm ol) y carbonato de potasio (110 mg, 796 jm ol) fueron agregados. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C antes de que el tricloroacetonitrilo (115 mg, 80 pl, 796 jm ol) fuera agregado. La mezcla fue agitada durante 5 horas a temperatura ambiente hasta una conversión completa de TLC. La mezcla fue filtrada y el solvente fue evaporado para proporcionar el producto crudo el cual fue sometido a una cromatografía de columna (SiO2, 6:1 Hex:EtOAc a 1:3 Hex: EtOAc, producto eluido con 1:2 Hex:EtOAc) para proporcionar la tricloroacetimidina 14 (307,5 mg, 57 %) como un aceite claro el cual fue solidificado cuando se mantuvo en el refrigerador. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 86,40 (d, 0,7H, J1,2 = 1,5, H-l'a), 6,22 (d, 0,3H, Ju = 1,5, H-l'P), 5,40-5,14 (m, 7H), 5,05-4,89 (m, 5H), 4,31-3,84 (m, 15H), 2,19-1,98 (m, 39H, OAc).
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 313-colesterilo (15)
Una solución de 14 (90 mg, 0,0663 mmol) y colesterol (39,8 mg, 0,0995 mmol), 1,5 eq) en DCE (secado sobre 3Á MS, 0,7 ml, 0,094 M) fue agitada con 3Á MS (~50 mg) a una temperatura de -20 °C mientras TMSOTf (10 ml, 0,0995 mmol, 1,5 eq) fue agregado a través de una jeringa. La temperatura (externa) fue calentada hasta -5°C durante un periodo de 40 min. El color amarillo lentamente se tornó anaranjado (rojizo). Se agregó Et3N (50 pl). El color desapareció inmediatamente. La mezcla fue diluida con DCM (20 ml) y lavada con Na2CO3-salmuera sat., secada (Na2SO4) y filtrada. El filtrado fue evaporado en gel de sílice y purificado por cromatografía de columna (sílice 1x18 cm, gradiente de elución con hexano-EtOAc 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 a 1:3) para proporcionar un glucósido 15 como una goma incolora (58 mg, 55 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz): 5,34-5,14 (m, 8H, azúcar y colesterol-H6), 5,05-4,90 (m, 6H, azúcar), 4,30­ 3,84 (m, 15H, azúcar), 2,34-0,80 (m, 30H, colesterol), 2,17, 2,16, 2,13, 2,06, 2,05, 2,02, 2,01, 2,01, 1,96 (cada s, cada 3H, 9xAc), 2,11, 2,10 (cada s, cada 6H, 4xAc), 0,98 (s, 3H, Me), 0,90 (d, 3H, J = 6,4, Me), 0,85 (d, 3H, J = 6,4, Me), 0,84 (d, 3H, J = 6,4, Me), 0,66 (s, 3H, Me); ESMS: m/z 1604 ([M+Na]+).
a-D-Manop¡ranos¡l-(1^3)-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-a-D-manop¡ranós¡do de 3p-colester¡lo (16)
Una soluc¡ón de 15 (56 mg, 0,0354 mmol) en MeOH (secada sobre 3Á MS, 3 ml) fue ag¡tada con 11M NaOMe en MeOH (50 |jl) durante 40 m¡nutos. Se formó un prec¡p¡tado color blanco. El THF (1 ml) fue agregado con éx¡to para mejorar la solub¡l¡dad. Se agregó DMF (4 ml). Se d¡solv¡ó una parte del prec¡p¡tado. La mezcla fue ag¡tada por un total de 6 horas. Agua (0,8 ml) fue agregada para hacer una soluc¡ón transparente. El pH fue ajustado a 6~7 con la ad¡c¡ón de res¡na AG50W-X8 (forma H+). La mezcla fue f¡ltrada y la res¡na fue lavada con MeOH (1 ml). La evaporac¡ón pretend¡da en un evaporador de rotac¡ón fue deten¡da ya que hubo un surg¡m¡ento de espuma ser¡o. La mezcla fue evaporada med¡ante flujo de a¡re y l¡of¡l¡zada durante 8 horas para proporc¡onar el pol¡ol 16 como un sól¡do blanco el cual fue secado en un d¡secador de vacío bajo P2O5 durante la noche y ut¡l¡zado d¡rectamente para el próx¡mo paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-2,4,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-2.4.6- tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-3,4,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranós¡do de 3pcolester¡lo (17)
S¡gu¡endo el proced¡m¡ento estándar para sulfonac¡ón, el pol¡ol 16 (0,0354 mmol) fue sulfonado. La mezcla cruda enfr¡ada fue bas¡f¡cada med¡ante la ad¡c¡ón de 5 M NaOH (561 jl, 2,81 mmol, 2,05 eq basado en un complejo de p¡r¡d¡na SO3). Poster¡ormente a la evaporac¡ón, el res¡duo fue d¡suelto en agua (3 ml) y pur¡f¡cado por SEC. Las fracc¡ones puras fueron comb¡nadas y d¡al¡zadas ut¡l¡zando Sl¡de-A-Lyser ® Cassette 2K (0,5-3 ml) en agua pur¡f¡cada con la ad¡c¡ón de 1M Na2CO3 durante la noche. Otra carga de 1M Na2CO3 fue agregada y el agua rec¡én pur¡f¡cada fue camb¡ada. La d¡ál¡s¡s cont¡nuó durante la noche. La soluc¡ón amar¡lla fue remov¡da y l¡of¡l¡zada para proporc¡onar el producto 17 como un polvo blanquec¡no (34,8 mg, 42 %). 1H RMN (D2O, 400 MHz) 86,41-6,26 (m, 4h , azúcar y colester¡lo-H6), 5,09 (s, 1H), 5,03 (d, 1H, J= 2,2), 4,86 (s, 1H), 4,73-3,94 (m, 22H), 3,51 (m, 1H, colester¡lo-H3), 2,35 (dm, 1H, J= 11,7, colester¡lo-H4), 2,24 (dm, 1H, J= 11,7, colester¡lo-H4), 1,90-0,51 (m, ¡ncluyendo 0,869 [s, 3H], 0,766 [d, 3H, J= 6,6], 0,689 [d, 3H, J= 6,6], 0,686 [d, 3H, J= 6,6], y 0,533 [s, 3H], 43H, colester¡lo).
Ejemplo 5: Colestanol
Al colesterol (500 mg) se añad¡ó acetato de et¡lo. Palad¡o sobre carbón al 10 % fue agregado y la mezcla fue ag¡tada durante la noche con un globo de h¡drógeno. La mezcla fue f¡ltrada y el solvente evaporado para proporc¡onar el producto como un sól¡do blanco con un rend¡m¡ento cuant¡tat¡vo. 1H r Mn (400 MHz, CDCb) 8: 3,58 (m, 1H, CHOH), 2,44 (ancho, 1H, OH), 1,97-0,83 (m, 31H), 0,88 (d, 3H, J = 6,6, CH3), 0,85 (dd, 6H, J= 1,5, J= 6,6, CH3), 0,79 (s, 3H, CH3), 0,64 (s, 3H, CH3).
2.3.4.6- Tetra-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-3,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranós¡do de 3p-colestan¡lo (18)
A una soluc¡ón de 14 (600 mg, 4,42 x 10'4 moles) en DCM (32 ml) bajo argón, se le agregó colestanol (300 mg). La mezcla fue ag¡tada a una temperatura de -20°C durante 20 m¡nutos. TMSOTf (40 j l) fue agregado. La mezcla fue ag¡tada a una temperatura de -20°C durante 40 m¡nutos, poster¡ormente calentada hasta una temperatura de -10°C durante 20 m¡nutos. Se agregó tr¡et¡lam¡na (70 j l ) a la mezcla y fue calentada hasta alcanzar la temperatura amb¡ente. El solvente fue evaporado. El producto crudo fue pur¡f¡cado ut¡l¡zando cromatografía de columna (S¡O2: 3:1 Hex:EtOAc a 1:2 HexEtOAc) para produc¡r el glucós¡do 18 (220 mg, 31 %) como un ace¡te claro. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 5,35-5,15 (m, 7H), 5,03-4,91 (m, 6H), 4,31-3,85 (m, 15H), 3,51 (m, 1H, C-3), 2,18 (s, 3H, OAc), 2,17 (s, 3H, OAc), 2,14 (s, 3H, OAc), 2,12 (s, 6H, OAc), 2,11 (s, 3H, OAc), 2,10 (s, 3H, OAc), 2,07 (s, 3H, OAc), 2,06 (s, 3H, OAc), 2,05 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 3H, OAc), 2,00 (s, 3H, OAc), 1,97-0,78 (m, 31H, colestanol), 1,97 (s, 3H, OAc), 0,88 (d, 3H, J = 6,6, CH3), 0,85 (dd, 6H, J= 1,5, J= 6,6, CH3), 0,79 (s, 3H, CH3), 0,63 (s, 3H, CH3).
a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-a-D-manop¡ranós¡do de 3p-colestan¡lo (19)
El glucós¡do 18 (43,1 mg) fue desacet¡lado de acuerdo con el proced¡m¡ento general para proporc¡onar el pol¡ol 19 como un sól¡do blanco (21 mg, 74 %) el cual fue reacc¡onado s¡n una pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal o caracter¡zac¡ón.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-2,4,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^3)-2.4.6- tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-3,4,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranós¡do de 3pcolestan¡lo (20)
El pol¡ol 19 (19 mg, 18,3 pmol) fue d¡suelto en DMF (1,3 ml, 0,015 M). Se agregó p¡r¡d¡na SO3 (6 equ¡v./OH, 1,43 mmol, 227 mg) y la mezcla fue ag¡tada durante la noche a una temperatura de 60°C. La mezcla fue enfr¡ada en un baño de agua fría antes de que se agregara 5M NaOH (613 j l) de una vez para neutral¡zar la soluc¡ón. El solvente fue evaporado. El res¡duo fue descolorado con un cartucho C18 SPE y desalado por d¡ál¡s¡s, ut¡l¡zando un cartucho de d¡ál¡s¡s MWCO 2000 durante 48 horas con tres camb¡os de agua, segu¡do por la l¡of¡l¡zac¡ón para produc¡r el producto 20 como un sól¡do blanco (19,2 mg, 44 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 85,52-5,46 (m, 3H), 5,26-5,20 (m, 2H), 5,04 (m, 1H), 4,88 (m, 1H), 4,84- 4,15 (m, 21H), 3,76 (m, 1H, C-3), 2,00-0,81 (m, 31H, colestanol), 0,91 (d, 3H, CHa), 0,86 (d, 6H, J= 6,2, CHa), 0,81 (s, 3H, CHa), 0,66 (s, 3H, CHa).
Ejemplo 6. 2,a,4,6-Tetra-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-a,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranós¡do de 3-az¡doprop-1-¡lo (21)
BFa Et2O (78 mg, 550 pmol) fue agregado a una soluc¡ón de peracetato 13 (276 mg, 220 pmol) y 3-az¡dopropan-1-ola1 (67 mg, 660 pmol) en DCE anh¡dro (8 ml). Esta soluc¡ón fue ag¡tada a una temperatura de 60°C en un frasco sellado durante 2 horas, antes de que fuera agregada una porc¡ón ad¡c¡onal de BFa Et2O (115 mg, 810 pmol) y la soluc¡ón fue calentada durante a horas ad¡c¡onales. La soluc¡ón fue enfr¡ada a temperatura amb¡ente y vert¡da en un mezcla de h¡elo tr¡turado, NaHCOa (sat. aq.) y salmuera. La mezcla fue extraída con EtOAc y la capa orgán¡ca fue lavada de manera ad¡c¡onal con 1:1 salmuera:NaHCOa (sat. aq.), y poster¡ormente secada (Na2SO4), evaporada y codest¡lada con tolueno anh¡dro. Se agregó DCM anh¡dro (5 ml), anhídr¡do acét¡co (66 mg, 648 pmol), EtaN (89 mg, 875 pmol) y DMAP (cr¡stal) y la soluc¡ón fue almacenada a una temperatura de -20 °C durante la noche. La soluc¡ón fue apl¡cada d¡rectamente a una columna de cromatogradía flash preparada (17 x 2 cm de gel de síl¡ce, grad¡ente de eluc¡ón 60:40 a 75:25 EtOAc:Hx) para proporc¡onar el glucós¡do 21 (176 mg, 61 %) como un ace¡te. ESMS: m/z 1a19,69 ([M+Na]+).
1H RMN (400 MHz, CDCla) 85,a1-5,12 (m, 7H), 5,00-4,87 (m, 6H), 4,26-a,94 (m, 11H), a,90-a,81 (m, 2H), a,77 (dt, 1H, J= 9,9, 6,0), a,47 (dt, 1H, J= 9,9, 6,0), a,42-a,a2 (m, 2H), 2,14(1), 2,1a(5), 2,10, 2,08 x 2, 2,06 x 2, 2,05, 2,0a(2), 2,02(5), 1,99, 1,98, 1,9a (13xs, 13x3H, OAc x 1a), 1,84 (qu¡ntete, 1H, J= 6,2). 1aC RMN (100 MHz, CDCla) 8:170,6, 170,5, 170,4, 170,a, 170,1(4), 170,0(9), 169,9(2), 169,8(8), 169,7, 169,6, 169,5(4), 169,4(5), 169,a, 99,4, 98,9, 98,8, 98,1, 76,8, 75,1(5), 75,1(1), 70,9, 70,8, 70,1, 69,6, 69,5, 69,4, 69,2, 68,5, 68,a, 67,a, 66,6, 66,1,65,5, 64,7, 62,5, 61,9, 61,7, 48,0, 28,5, 20,8(4), 20,7(6), 20,7, 20,6, 20,5(4), 20,5(2), 20,4(9), 20,4(7).
2,a,4,6-Tetra-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(^a)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a).2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-a,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranós¡do de a-estearam¡doprop¡lo (22)
1. (a) El glucós¡do 21 (500 mg, a86 pmol) fue d¡suelto en THF (10 ml). Se agregó tr¡fen¡lfosf¡na enlazada a un polímero (725 mg) y la mezcla fue ag¡tada a temperatura amb¡ente durante 1 hora. Agua (210 pl) fue agregada, y la mezcla fue ag¡tada a una temperatura de 50°C durante 4 horas. La mezcla fue enfr¡ada, f¡ltrada, y el solvente evaporado para produc¡r un sól¡do blanco el cual fue ut¡l¡zado s¡n una pur¡f¡cac¡ón o caracter¡zac¡ón ad¡c¡onal en el s¡gu¡ente paso.
2. (b) La am¡na descr¡ta anter¡ormente (250 mg, 197 pmol) fue d¡suelta en DCM (6 ml). Se agregó cloruro de estearo¡lo (2 equ¡valentes, a94 pmol, 119 mg, 1aa pl), segu¡do por tr¡et¡lam¡na, y la mezcla fue ag¡tada a temperatura amb¡ente durante 5 horas. El solvente fue evaporado, y al res¡duo fue añad¡do DCM, antes de ser lavado con NaHCOa (sat.), secado (Na2SO4), y el solvente evaporado. El producto crudo fue pur¡f¡cado por cromatografía de columna (SO 2: DCM ^ 4 % MeOH/DCM) para proporc¡onar la am¡da 22 como un ace¡te claro (102 mg, aa %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 85,86 (ancho m, 1H, NH), 5,a2-5,12 (m, 7H), 5,02-4,88 (m, 6H), 4,28-a,96 (m, 15H), a,7a (m, 1H, CH2O), a,45 (m, 1H, CH2O), a,a2 (m, 2H, CH2N), 2,15 (s, aH, OAc), 2,15 (s, aH, OAc), 2,12 (m, 2H, CH2CO), 2,11 (s, aH, OAc), 2,10 (s, 6H, OAc), 2,08 (s, 6H, OAc), 2,06 (s, aH, OAc), 2,04 (s, 6H, OAc), 2,00 (s, aH, OAc), 1,99 (s, aH, OAc), 1,95 (s, aH, OAc), 1,79 (m, 2H, CH2), 1,58 (m, 2H, CH2), 1,28-1,20 (m, 28H, CH2), 0,84 (t, aH, CHa).
a-D-Manop¡ranos¡l-(1^a)-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a)-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-a-D-manop¡ranós¡do de a-estearam¡doprop¡lo (2a)
La am¡da 22 (101,6 mg) fue desacet¡la de acuerdo con el proced¡m¡ento general para proporc¡onar el pol¡ol 2a (61 mg, 9a %) como un sól¡do blanco que fue reacc¡onado s¡n una pur¡f¡cac¡ón o caracter¡zac¡ón ad¡c¡onal.
2,a,4,6-Tetra-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a)-2,4,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a)-2,4,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-a,4,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-manop¡ranós¡do de aestearam¡doprop¡lo (24)
El pol¡ol 2a (60,9 mg, 62 pmol) fue d¡suelto en DMF (0,02 M, a,1 ml). Se agregó SOa.p¡r¡d¡na (a equ¡v/OH, 2,42 mmol, a85 mg) y la soluc¡ón fue ag¡tada a una temperatura de 60°C durante la noche. La mezcla fue enfr¡ada en un baño de agua fría y se agregó 5M NaOH (2,1 equ¡v/SOa.p¡r¡d¡na, 5,08 mmol, 1,02 ml) de una vez antes de que el solvente se evaporara. Al compuesto fue añad¡do 1 % MeOH en agua y pur¡f¡cada en un cartucho C18 SPE. El compuesto fue poster¡ormente d¡al¡zado durante dos noches ut¡l¡zando un cartucho de d¡ál¡s¡s 2000 MWCO, antes de ser l¡of¡l¡zado para produc¡r el producto 24 (11a mg, 79 %) como un sól¡do color blanco. 1H RMN (400 MHz, D2O) 85,56 (m, 1H), 5,48 (m, 2H), 5,28 (m, 1H), 5,11 (m, 1H), 5,06 (m, 1H), 4,91-4,1a (m, 22H), a,87 (m, 1H, CH2O), a,70 (m, 1H, CH2O), a,a2 (m, 2H, CH2N), 2,29 (t, 2H, CH2CO), 1,88 (m, 2H, CH2), 1,62 (m, 2H, CH2), 1,aa-1,28 (m, 28H, CH2), 0,90 (t, aH, CHa).
Ejemplo 7. 2,a,4,6-Tetra-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡lo-(1^a)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^a)-2,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranos¡l-(1^2)-a,4,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-manop¡ranós¡do de ap-colestan¡lo (25)
El tricloroacetimidato 1 (165 mg, 0,1 mmol), colestanol (78 mg, 2 eq, 0,2 mmol) y tamices moleculares 3 A (100 mg) fueron agitados en Dc M seco durante 2 horas. Una solución de triflato-TMS en DCM seco (0,4 M, 0,075 ml, 0,03 mmol, 0,3 eq) fue agregada en forma de gotas a una temperatura de 0°C y continuo agitándose durante 40 minutos a la misma temperatura. La reacción fue desactivada agregando Et3N (5 jl), diluida con EtOAc (100 ml), sonicada (3 minutos) y decantada. La solución orgánica fue lavada con solución NaHCO3 (3 X 20 ml) sat., la fase orgánica fue extraída nuevamente con EtOAc (3 x 20 ml), lavada con salmuera (1 x 20 ml), secada (Na2SO4) y concentrada al vacío para producir la glucósido como una espuma incolora. El producto fue purificado en una columna de gel de sílice (20 x 2 cm, tolueno: EtOAc, 1 : 2). La purificación dio 2 fracciones (A, B) en donde la fracción A (90 mg, 48 % de producción) contenía el producto puro pero la fracción B fue una mezcla del producto puro y un producto desacilatado (1 : 1, 74 mg). Para mejorar la producción de la glucósido deseada, la fracción secada B y DMAP (cat) fue disuelta en piridina seca (2 ml) y acetilada agregando Ac2O (0,1 ml) a una temperatura de 0°C y la agitación continuó durante 30 minutos a TA. La solución fue concentrada al vacío y coevaporada con tolueno (3 x 20 ml) para producir el glicosido puro 25 (71 mg, 38 % de producción) para proporcionar una producción total de 86 %. 1H r Mn (400 MHz, CDCb): 85,14-5,32 (m, 9 H, 5 H-4, 2 H-3, H-2IV), 4,90-5,05 (m, 8 H, 5 H-1, 3 H-3), 3,90-4,31 (m, 19 H, H-2, H-31, H-311, H-311, 5 H-5, 5 H-6a, 5 H-6b), 3,80 (ddd, 1 H, H- 5), 3,52 (m, 1 H, H-3 Col.), 2,18, 2,17, 2,14, 2,12, 2,11,2,10, 2,08, 2,07, 2,06, 2,03, 2,01, 1,98, (s, 48H, 16 x Ac), 0,55-1,82 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,89 (d, 3H, J= 6,8, colestanilo-CHs), 0,857 (d, 3H, J= 6,8, colestanilo-CH3), 0,853 (d, 3H, J= 6,6, colestanilo-CH3), 0,79 (s, 3h , colestanilo-CH3), 0,64 (s, 3H, colestanilo-CH3).
a-D-Manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (26)
El glucósido 25 (181 mg, 0,097 mmol) fue desacetilado de acuerdo con el procedimiento general para proporcionar un poliol cristalino blanco 26 (116 mg, 100 %), utilizado sin una purificación o caracterización adicional en el siguiente paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^2)-3.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (27)
El poliol seco 26 (40 mg, 0,033 mmol) fue disuelto en DMF seco (0,83 ml) y SO3.piridina recién lavada y secada (250 mg, 3 eq por grupo OH, 1,85 mmol) fue agregada y agitada 16 horas a una temperatura de 60°C. La reacción fue desactivada agregando en forma de gotas una solución NaOH acuosa (5 M, 2,1 eq SO3, 0,66 mmol) a una temperatura de 0°C (pH 12) y una concentración al vacío a una temperatura de 40°C para producir un polvo color amarillo. El polvo fue disuelto en agua (calidad HPLC, 12 ml) y dializado en un cartucho 2K contra el agua purificada durante 36 horas. Después de 16 horas una solución acuosa de NH4HCO3 (0,1 M, 0,5 ml) fue agregada al cartucho para garantizar un pH mayor a 7. El producto fue purificado mediante HPLC de fase inversa utilizando un gradiente de 10 % MeCN-agua ^ 35 % MeCN-agua y rango de flujo de 5 ml/min con la detección por ELS. Las fracciones que contenían el producto puro fueron combinadas y liofilizadas para producir 27 como un polvo esponjoso color blanco (23,8 mg, 25 % de producción). 1H RMN (400 MHz, D2O): 1H RMN (400 MHz, CDCls) 85,48-5,57 (m, 4 H, 4 H-2), 5,29, 5,23 (bs, 4 H, H-1', H-1", H-1'", H-1""), 4,35-4,90 (m, 23 H, H-1, 5 H-3, 5 H-4, 2 H-5, 5 H-6a, 5 H-6b, 4,28 (t, 1 H, H-2), 4,15-4,24 (m, 3 H, 3 H-5), 3,81 (m, 1 H, H-3 Col.), 0,66-2,05 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,96, 0,94, 0,90, 0,88, 0,85, 0,70 (s, 15 H, CH3).
0,85 (d, 3H, J= 6,8, colestanilo-CHs), 0,88 (d, 6H, J= 6,8, 2 x colestanilo-CHs), 0,85 (s, 3H, colestanilo-CHs), 0,70 (s, 3H, colestanilo-CH3).
Ejemplo 8.2,3,4,6-Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de bencilo (28)
Se disolvió 2,3,4,6-Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil tricloroacetimidato32 (0,609 g, 0,822 mmol, 1,1 eq) y bencil 3.4.6- tri-O-benzoil-a-D-manopiranosida33 (0,435 g, 0,747 mmol) en DCM anhidro (6 ml). Se agregó MS 3A en polvo (80 mg recién activado). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 40 minutos. Una solución de TMSOTf (0,027 ml, 0,149 mmol, 0,2 eq) en DCM (1,5 ml) fue agregada en forma de gotas. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C mientras la reacción fue monitoreada por TLC (hexano EtOAc = 65:35). Tras 40 minutos, la reacción fue completada y Et3N (0,3 ml, 2,15 mmol) fue agregado. La mezcla cruda fue combinada con la forma cruda de otro lote (TCA: 1,42 g, 2,098 mmol; 2-alcohol; 1,22 g, 2,098 mmol, TMSOTf: 0,114 ml, 0,629 mmol, 0,3 eq, 0°C, 40 minutos). La mezcla fue filtrada a través de un lecho de Celite y enjuagada con DCM (3 x 1 ml). A los lavados y filtrado combinados se les agregó piridina (0,121 ml, 1,494 mmol, 2 eq) y cloruro de benzoilo (0,130 ml, 1,212 mmol, 1,5 eq). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente o/n, evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna (gel de sílice 3 x 20 cm, gradiente de elución con hexano-EtOAc 200:20, 200:80, 200,50, 240:80, 200:90, 200:100) para proporcionar el disacárido 28 como una goma incolora (594 mg, 68 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 8 8,15-7,88 (m, 14H, Ph), 7,59-7,25 (m, 26H, Ph), 6,16-5,94 (m, 5H), 5,30-5,27 (m, 2H), 4,82 (d, 1H, J= 11,7), 4,68-4,39 (m, 8H).
2.3.4.6- tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-benzoil-D-manopiranosa (29)
El disacárido 28 (670 mg, 0,577 mmol) fue disuelto en MeOH (3 ml) y EtOAc (30 ml). Paladio en carbón vegetal (5 %, 80 mg) fue agregado. La mezcla fue agitada bajo 50 psi de hidrógeno a temperatura ambiente o/n. TLC indicó ~605 de conversión. Se agregó más paladio sobre carbón vegetal (5 %, 80 mg). La agitación fue continuada a 50 psi durante 3 días. TLC indicó la conversión completa. La mezcla fue filtrada a través de un lecho de Celito y lavada con EtOAc (5 x 1 ml). Los lavados y filtrado combinados fueron evaporados a sequedad para proporcionar el compuesto de título 29 como una espuma incolora (609 mg, 99 %). El producto fue utilizado directamente para el siguiente paso sin purificación.
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-benzoil-D-manopiranosilo (30)
A una solución preenfriada (0°C) de 29 (609 mg, 0,569 mmol) en DCM anhidro (2,8 ml, 0,2 M) se le agregó tricloroacetonitrilo (114 pl, 1,138 mmol, 2 eq). Una solución de DBU (4,3 pl, 0,05 eq, 0,0285 mmol) en DCM anhidro (0,3 ml) fue agregada. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 4 horas y TLC (hexano-EtOAc = 65:35) indicó una conversión completa. La mezcla cruda fue evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna de sílice (2,5 x 14 cm, gradiente de elución con hexano-EtOAc-Et3N 210:20:0,5, 200:50:0,5, 180:60:0,5, 150:70:0,5). Las fracciones del producto fueron combinadas, evaporadas y secadas en un disecador de vacío sobre P2O5 o/n para proporcionar el tricloroacetimidato 30 como una espuma blanca (530 mg, 77 %), utilizado sin una purificación adicional en el siguiente paso.
2.3.4.6- tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-benzoil-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (31)
A una solución de tricloroacetimidato 30 (260 mg, 0,214 mmol) y 3p-colestanol (166 mg, 0,428 mmol, 2 eq) en DCM anhidro (3,8 ml) se le agregó tamices moleculares 3Á en polvo recién activados (50 mg). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 0,5 h y una solución de TMSOTf (7,7 pl, 0,0428 mmol, 0,2 eq) en DCM anhidro (0,3 ml) fue agregada en forma de gotas a una temperatura de 0°C. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 1,5 horas y el TLC indicó la terminación de la reacción. Et3N (150 pl) fue agregado y la mezcla fue evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna de sílice (2 x 15 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 210 :20, 200:50, 180:60, 180:90) para proporcionar el glucósido 31 como una espuma color blanca (301 mg, 98 %). 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 88,11-7,28 (m, 35H, Bz), 6,09 (dd o t, 1H, Jh3(¡¡)-H4(¡¡) = 10,3, JH4(Ii)-Ha(I¡) = 9,6, H4n), 5,97-5,87 (m, 3H, H2n, H31 y H41), 5,28 (d, 1H, Jh1-h2 = 2,2, H1), 5,28 (d, 1H, Jh1-h2 = 1-5, H1), 4,69-4,44 (m, 6H, H51, H5n, H61 y H6n), 4,33 (s a, 1H, H21), 3,59 (m, 1H, OCH-col), 3,02 (dd, 1H, Jh2(Ü)-H3(tt) = 2,9, H3n), 1,99-0,47 (m, 31H, colestanilo), 0,91 (d, 3H, J= 6,6, colestanilo-CH3), 0,872 (d, 3H, J= 6,6, colestanilo-CH3), 0,867 (d, 3H, J= 6,6, colestanilo-CH3), 0,75 (s, 3H, colestanilo-CH3), 0,65 (s, 3H, colestanilo-CH3).
a-D-Manopiranosil-(1^2)- D-manopiranósido de 3p-colestanilo (32)
Una solución de 31 (293 mg, 0,203 mmol) en THF anhidro (4 ml) y MeOH (6 ml) fue tratada con una solución de 11 M NaOMe en MeOH (0,1 ml, 1,1 mmol, 5,4 eq). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente o/n. La suspensión fue tratada con AcOH (50 pl) para proporcionar una solución clara instantánea. Se agregó la resina AG50WX8 (forma H+) para ajustar el pH a 6. La mezcla fue filtrada y la resina fue lavada con MeOH (2 x 2 ml). Los lavados y el filtrado combinados fueron evaporados a sequedad y fueron disecados en un disecador de vacío o/n para proporcionar el poliol 32 como un polvo color amarillo claro (171 mg, 118 %), utilizado sin una purificación adicional en el siguiente paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^ 2)-3,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (33)
El poliol 32 (96 mg, 0,135 mmol) fue disuelto en un DMF anhidro (3,4 ml, 0,04 M). El complejo de trióxido de azufre y piridina (451 mg, 2,835 mmol, 3 eq por hidroxilo, recién lavado con agua, tolueno, EtOH, DCM y secado con P2O5 en un disecador de vacío durante 1 hora) fue agregado. La mezcla fue agitada a una temperatura de 60°C o/n enfriada hasta 0°C. Se agregaron 5 M NaOH (794 pl, 3,969 mmol, 1,4 eq basado en SO3) y sat. Na2CO3 (2,5 M, 690 ml, 1,701 mmol, 0,6 eq basado en SO3). El color se tornó un poco más oscuro (amarillo-anaranjado). La mezcla fue evaporada hasta que se secara. El residuo fue disuelto en 4 ml de agua (pH > 9) y purificado por cromatografía en olumna Bio-Gel P-2 (eluído con 0,1 M NH4HCO3 a 196 ml/h, 6 minutos por colección). Las fracciones de producto fueron identificadas por MBT y CE. La liofilización proporcionó el producto 33 como un polvo amarillo pálido (33 mg, 20 % para dos pasos). 1H RMN (D2O, 300 MHz) 85,27 (s, 1H), 4,98 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,64-4,48 (m, 4H), 4,38-4,18 (m, 4H), 4,08-3,85 (m, 4H), 3,50 (m, 1H, OCH), 1,75-0,49 (m, 46H, colestanilo).
Ejemplo 9. Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-acetilo-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosilo (36)
El trisacárido 3430 fue peracetilado (Ac2O, piridna, DMAP, TA, 4 días) y purificado por cromatogradía flash (gel de sílice, gradiente de hexano-EtOAc) para proporcionar el peracetato 35 como un aceite. El ácido acético glacial (0,65 mmol, 0,038 ml) fue agregado en forma de gotas en una solución de etilendiamina (1,2 mmol, 0,08 ml) en THF seco (15 ml) a una temperatura de 0°C, resultando en una formación inmediata de un precipitado, el cual permanece presente hasta un desarrollo de solución acuosa. El peracetato 35 (500 mg, 0,52 mmol) fue agregado a una temperatura de 0°C y la mezcla fue agitada durante 2,5 horas a temperatura ambiente y almacenada durante la noche a una temperatura de -20°C. El TLC (tolueno / EtOAc, 1:2) posteriormente mostró la ausencia del material de partido y la presencia de un producto que se movía más lento, el cual aparece en su mayoría como una mezcla anomérica.
La solución fue neutralizada agregando ácido acético (0,12 ml) para alcanzar un pH de 6. El solvente fue evaporado bajo una corriente de aire, el residuo fue disuelto en EtOAc (100 ml), lavado con solución NaHCO3 sat. (3 x 50 ml), agua (3 x 10 ml), salmuera (30 ml), secado (Na2SO4) y concentrado al vacío para obtener el hemiacetal como una espuma color amarillo (500 mg), utilizada sin purificación adicional. El hemiacetal (500 mg, ~ 0,54 mmol)) fue disuelto en DCM seco (4 ml), K2CO3 (0,95 g, 6,81 mmol) y tricloroacetonitrilo (0,67 ml, 6,63 mmol) fue agregado a una temperatura de 0 °C y la agitación continuó a temperatura ambiente durante 120 minutos. La mezcla fue directamente purificada en una columna de gel de sílice (30 x 2,5 cm, tolueno - EtOAc, 1:1 ^ 1:2 ^ EtOAc) y se obtuvo el tricloroacetimidato 36 como un polvo esponjoso blanco (300 mg, 65 %). El compuesto fue secado sobre P2O5 durante la noche a una temperatura de -20°C.
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (37)
El imidato 36 (195 mg, 0,20 mmol), colestanol (210 mg, 2 eq, 0,56 mmol) y tamices moleculares 3 A (100 mg) fueron agitados en DCM seco durante 0,5 horas. Una solución de triflato de TMS en DCM seco (0,4 M, 0,21 ml, 0,084 mmol, 0,3 eq) fue agregada en forma de gotas a una temperatura de 0°C y la agitación continuó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción fue desactivada agregando Et3N (0,02 ml) a una temperatura de 0°C (pH 5), diluida con DCM (25 ml), sonicada (3 min) y decantada. La solución orgánica fue lavada con solución NaHCO3 sat. (3 x 20 ml), la fase acuosa fue reextraída con EtOAc (50 ml), lavada con salmuera (20 ml), secada (Na2SO4) y concentrada al vacío para producir el glucósido crudo como un sólido color blanco (564 mg). El producto fue purificado en una columna de gel de sílice (20 x 2 cm, tolueno:EtOAc 3:2 ^ 1:1 ^1 :2 ). La purificación proporcionó una fracción de mezcla A (56 mg, ~80 % glucósido) y la fracción B que contenía el glucósido puro 37 como un sólido blanco (170 mg, 58 % de producción). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 85,26-5,34 (m, 3H, 2 x H4, H3), 5,17-5,24 (m, 3H, H21, H3n,H4), 5,28 (dd, 1H, JH1-H2 = 2,0, H2n), 5,05 (d, 1H, JH1-H2 = 2,0, H1), 5,02 (d, 1H, H1"), 4,93 (d, 1H, Jhi-h2 = 2,0, H11), 4,30 (dd, 1H, JH6a-H6b = -12,7, JH6-H7 = 3,9, H6a), 3,97-4,22 (m, 9H, 2 x H6a, 3 x H6b, H31, 3 x H5, 3,95 (dd, 1H, H2), 3,53 (m, 1H, colestanilo-H3), 2,19, 2,15, 2,14, 2,11,2,10, 2,08, 2,07, 2,03, 2,03, 2,02, 1,99 (s, 30H, 10 x Ac), 0,55-1,85 (m, 33H, 12 CH2, 9 CH), 0,89 (d, 3H, J= 6,8, colestanilo-CH3), 0,860 (d, 3H, J= 6,8, colestanilo-CH3), 0,854 (d, 3H, J= 6,6, colestanilo-CH3), 0,80 (s, 3H, colestanilo-CH3), 0,64 (s, 3H, colestanilo-CH3).
a-D-Manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (38)
El peracetato 37 (165 mg, 0,127 mmol) fue desacetilado de acuerdo con el procedimiento general para producir el poliol cristalino blanco 38 (107 mg, 96 % de producción), utilizado sin una purificación o caracterización adicional en el siguiente paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^2)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^2)-3.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (39)
El poliol seco 38 (50 mg, 0,058 mmol) fue disuelto en DMF seco (2,9 ml, 0,02 M) y piridina SO3 recién lavada y secada fue añadida (1:1,277 mg, 3 eq por grupo OH, 1,74 mmol). La mezcla fue agitada durante 16 horas a una temperatura de 60°C y posteriormente fue enfriada hasta una temperatura de 0°C durante 15 minutos y neutralizada agregando una solución de NaOH acuosa helada (5 M, 2,1 eq/SO3, 0,731 ml, 3,65 mmol) a una temperatura de 0°C en una porción (a pH 12). La suspensión fue agitada durante 15 minutos a una temperatura de 0°C, diluida con agua (10 ml) transferida a un frasco de fondo redondo de 500 ml y concentrada al vacío a una temperatura de 40°C. Un polvo amarillo pálido fue producido, el cual fue disuelto en agua (10 ml) obteniendo una solución con pH 10. La solución fue establecida a un pH 12 agregando una solución acuosa de NaOH (5 M, 5 gotas), dializada contra agua (4 l) utilizando un cassete Slide-A-Lyzer® (2000 MWCO, 4-12 ml) durante 16 horas a temperatura ambiente. La diálisis continuó a una temperatura de 0°C contra agua (4 l) durante 3 días, en donde cada 24 horas una solución acuosa de NH4HCO3 (3 M, 0,6 ml) fue agregada al agua para establecer el pH a ~ 6,5. La solución desalada fue posteriormente liofilizada para producir el persulfato 39 como un polvo esponjoso blanco (91 mg, 83 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 5,50 (m, 2 H, H1 o H2), 5,23, 5(m, 2 H, H1 o H2), 4,12-4,92 (m, 17 H, H1, 1 x H2, 3 x H-3, 3 x H-4, 3 x H-5, 3 H-6a, 3 H-6b) 3,80 (m, 1 H, H-3 Col.), 0,66-2,04 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,95 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,887 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,882 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,85 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,70 (s, 3H, colestanil-CH3).
Ejemplo 10. 2,3,4,6-Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 3-azidopropilo (41)
BF3 Et2O (115 mg, 810 pmol) se agregó a una solución de peracetato de pentasacárido 4028 (500 mg, 324 pmoll) y 3-azidopropan-1-ol (98 mg, 972 pmol) en DCE anh. (8 ml). La solución fue agitada a una temperatura de 60°C en un frasco sellado durante 2 horas, antes de que una porción adicional de BF3 Et2O (115 mg, 810 pmol) se agregara y la solución fue calentada durante 3 horas adicionales. La solución fue enfriada a temperatura ambiente y vertida en una mezcla de hielo triturado, NaHCO3 (sat. Aq.) y salmuera. La mezcla fue extraída con EtOAc y la capa orgánica fue lavada de manera adicional con 1:1 salmuera:NaHCO3 (sat. Aq.), y posteriormente secada (Na2SO4), evaporada y codestilada con Tolueno anh. DCM Anh. (5 ml), anhidrido acético (66 mg, 648 pmol), Et3N (89 mg, 875 pmol) y DMAp (cristal) fueron agregados y la solución fue almacenada a una temperatura de -20°C durante la noche. La solución fue aplicada directamente a una columna de cromatogradía flash preparada (17 x 2 cm de gel de sílice, elución gradiente 60:40 a 75:25 EtOAc:Hx) para proporcionar el glucósido 41 (387 mg, 75 %) como un aceite. ESMS: 1601,81, [M+NHJ*. 1H RMN (400 MHz, CDCls) 8: 5,30-5,13 (m, 8H), 5,02-4,88 (m, 8H), 4,28-3,75 (m, 20H), 3,49 (dt, 1H, J= 9,8, 6,1, OCH2CH2B), 3,42-3,35 (m, 2H, CH2N3), 2,16, 2,14(9), 2,14(7), 2,11, 2,10, 2,09(2), 2,08(8), 2,08(7), 2,08, 2,07, 2,06, 2,05, 2,04, 2,00, 1,99, 1,95 (16s, 16x3H, AcOx16), 1,89-1,84 (m, 2H, CCH2C). 13C RMN (100 MHz, CDCla) 8: 170,4, 170.3, 170,2, 170,1, 169,9, 169,8(2), 169,7(7), 169,6, 169,5, 169,4, 169,3, 169,2, 99,1(2), 99,1(0), 98,8(4), 98,7(7), 98,1, 76,7, 75,0, 74,9, 74,7, 71,0, 70,8, 70,7, 70,0, 69,5, 69,3, 69,2, 68,5, 68,2, 67,2, 66,7, 66,6, 66,0, 65,4, 64,6, 62,4, 62.3, 61,9, 61,5, 47,9, 28,5, 20,7(4), 20,7(2), 20,6(9), 20,6, 20,4(9), 20,4(6), 20,4.
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 3-estearamidopropilo (42)
La azida 41 (460,5 mg, 291 pmol) fue disuelta en THF (10 ml). Trifenilfosfina enlazada a un polímero (725 mg) fue agregada y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. Se agregó agua (200 pl), y la mezcla fue agitada a una temperatura de 50°C durante 4 horas. La mezcla fue enfriada, filtrada, y el solvente evaporado para proporcionar un sólido color blanco (APCIMS: 1558,25 [M+H]+). El producto fue disuelto en DCM (10 ml). Cloruro de estearoilo (2 equivalentes, 580 pmol, 176 mg, 196 pl) fue agregado, seguido por trietilamina (2 equiv, 580 pmol, 80 pl), y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 6 horas. El solvente fue evaporado, y al residuo fue añadido DCM, antes de ser lavado con NaHCO3 (sat.), secado (Na2SO4), y el solvente fue evaporado. El producto crudo fue purificado por cromatografía de columna (SO 2: DCM ^-2 % MeOH/DCM) para producir la amida 42 como un aceite transparente (232 mg, 44 %, dos pasos). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 86,10 (ancho m, 1H, NH), 5,24-5,09 (m, 8H), 4,96-4,83 (m, 8H), 4,22-3,71 (m, 19H), 3,68 (m, 1H, CH2O), 3,40 (m, 1H, CH2O), 3,26 (m, 2H, CH2NH), 2,12­ 2,09 (m, 2H, CH2CO), 2,11 (s, 3H, OAc), 2,10 (s, 6H, OAc), 2,06 (s, 3H, OAc), 2,04 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 12H, OAc), 2,02 (s, 3H, OAc), 2,01 (s, 3H, OAc), 1,99 (s, 6H, OAc), 1,95 (s, 3H, OAc), 1,94 (s, 3H, OAc), 1,90 (s, 3H, OAc), 1,74 (m, 2H, CH2CH2N), 1,53 (m, 2H, CH2CH2CO), 1,23-1,16 (m, 28H, CH2), 0,79 (t, 3H, CH3).
a-D-Manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósiodo de 3-estearamidopropilo (43)
La amida 42 (231,5 mg) fue desacetilade de acuerdo con el procedimiento general para proporcionar el poliol 43 (140 mg, 96 %) como un sólido color blanco que se hizo reaccionar sin una purificación o caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)- 2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^2)-3.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 3-estearamidopropilo (44)
El poliol 43 (140 mg, 122 pmol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 6,1 ml). Se agregó SO3.piridina (3 equiv/OH, 5,83 mmol, 928 mg) y la solución fue agitada a una temperatura de 60°C durante la noche. La mezcla fue enfriada en un baño de agua fría y se agregaron 5M NaOH (2,1 equiv/SO3.piridina, 2,45 ml) de una vez antes de que el solvente fuera evaporado. Al compuesto se añadió 1 % MeOH en agua y se purificó sobre un cartucho C18 SpE. El compuesto fue posteriormente dializado por dos noches utilizando un cartucho de diálisis MWCO, antes de que fuera liofilizado para producir el producto 44 (220 mg, 65 %) como un sólido color blanco. 1H RMN (400 MHz, D2O) 85,55 (d, 1H, H-1), 5,53 (d, 1H, H-1), 5,50 (d, 1H, J12 = 1,8, H-1), 5,49 (d, 1H, H-1), 5,28 (m, 1H), 5,12 (m, 1H), 5,08 (m, 1H), 4,90-4,12 (m, 28H), 3,85 (ddd, 1H, J = 6,2, J= 7,0, J = 10,5, CH2O), 3,68 (ddd, 1H, J= 6,2, J = 6,2, J= 9,7, CH2O), 3,31 (m, 2H, CH2N), 2,29 (t, 2H, J = 7,0, CH2CO), 1,88 (t, 2H, J = 6,2, CH2CH2N), 1,62 (m, 2H, CH2CH2CO), 1,31 (m, 28H, CH2), 0,90 (t, 3H, J= 7,0, CH3).
Ejemplo 11. 3p-(Prop-2-iniloxi)colestanol
3p-colestanol (1,23 g, 3,16 mmol) fue disuelto completamente en tolueno anhidrido (7 ml, 0,45 M) a temperatura ambiente. Se añadió t-butóxido de potasio en polvo (1,06g, 9,49 mmol, 3 eq) de una vez. La mezcla se agitó a TA durante 3 horas. Se añadió una solución de bromuro de propargilo (80 p% en tolueno, 0,94g, 6,32 mmol, 2 eq). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla fue diluida con hexano (30 ml) y EtOAc (10 ml), lavada con agua (2 x 60 ml) y salmuera (60 ml). La fase acuosa fue extraída una vez con EtOAc (20 ml). Las fases orgánicas combinadas fueron secadas (Na2SO4), filtradas y el filtrado fue evaporado en gel de sílice y purificado por cromatografía de columna (gel de sílice 2,5 x 24 cm, elución gradiente con hexano 250 ml, hexano EtOAc 125:5) para producir el producto como un sólido color amarillo. La recristalización de EtOAc (3 ml) proporcionó cristales blanquecinos (736 mg, 55 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 84,18 (d, 2H, J= 2,2), 3,45 (m, 1H), 2,38 (t, 1H, J= 2,2), 1,99-0,57 (m, 31H), 0,89 (d, 3H, J= 6,6), 0,86 (d, 3H, J= 6,6), 0,86 (d, 3H, J= 6,6), 0,79 (s, 3H), 0,64 (s, 3H).
2,3,4,6-Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1^3)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 3-azidopropilo (45)
El peracetato 35 (1000 mg, 1,03 mmol) y 3-azidopropanol (1,2 eq., 124 mg, 1,24 mmol) fue disuelto en DCM seco (5 ml) y posteriormente a una temperatura de 0°C BF3-esterato (5 eq., 0,546 ml, 5,17 mmol) fue agregado en forma de gotas y la mezcla fue agitada durante 3 horas a una temperatura de 60°C. La reacción fue detenida agregando Et3N (2,2 ml, 15,5 mmol) a una temperatura de 0°C. La mezcla de reacción cruda fue posteriormente acetilada agregando piridina (1 ml), DMAP (cat.) y Ac2O (0,585 ml) a una temperatura de 0°C y la agitación continuó o/n a temperatura ambiente. La solución color rojo oscuro se desactivó agregando MeOH seco (5ml) a 0°C y se agitó durante 2 horas a TA. Posteriormente a la coevaporación con tolueno (50 ml), el residuo fue disuelto en EtOAc (100 ml), lavado con solución NaHCO3 sat. (3 x 20 ml), agua (50 ml), la fase acuosa fue reextraída con EtOAc (3 x 20 ml), combinada con el otro extracto orgánico, lavada con salmuera (20 ml), secada (Na2SO4) y concentrada al vacío para producir el glucósido crudo como una goma (~ 1 g). El producto crudo fue purificado en una columna de gel de sílice (20 x 2 cm, tolueno - EtOAc, 2:1 —»1:1 —^ 1:2) y el glucósido deseado 45 fue obtenido como una espuma color blanquecino (374 mg, 36 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 85,19-5,38 (m, 6H, 3 x H4, H211, ID'-ID111), 5,08 (dd 1H, Jh2-h3 = 3,3, H2111), 5,04 (d, 1H, Jm-H2 = 1,7, H1111), 4,94 (m, 2H, H 1', H-111), 4,31 (dd, 1H, JH6a-H6b = 12,5, Jh6-h5 = 4,2, H6a), 3,93- 4,26 (m, 9H, 2 x H6a, 3 x H6b, H21, H311, HS'.HS11 o H5111), 3,93 (ddd, 1H, H511 o H5111), 3,82 (dt, 1H, Jgem = 10,0, J= 6,6, OCH2), 3,53 (dt, 1H, J= 6,6, OCH2), 3,43 (t, 2H, J= 6,6, CH2N3), 2,20, 2,161, 2,157, 2,12, 2,11, 2,10, 2,19, 2,05, 2,04, 2,00 (s, 30H, 10 x Ac), 1,90 (quintete, 2H, J= 6,6, CH2).
2.3.4.6- tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1—■3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranosil-(1—2)-3,4,6-tri-O-acetil-a-D-manopiranósido de 3-{4-(colestan-3p-il-oximetil)-[1,2,3]triazol-1-il}propilo (46)
3p-(Prop-2-iniloxi)colestanol (156 mg, 2 eq., 0,367 mmol) y la azida 45 (185 mg, 0,183 mmol) fueron disueltos en una mezcla de DCM / t-BuOH (3 : 2, p/p, 0,4 M, 0,562 ml). A la mezcla se le agregaron una solución acuosa de CuSO4 (0,3 M, 0,1 eq., 0,061 ml) y una solución acuosa de ascorbato de sodio (1 M, 0,3 eq., 0,055 ml) y la mezcla fue agitada vigorosamente sin luz durante 48 horas. El análisis TLC (tolueno : EtOAc, 1:1) mostró la finalización de la reacción con la aparición de un producto más polar que la azida inicial. La mezcla fue diluida con DCM (50 ml) y lavada con solución NaHCO3 sat. (3 X 30 Ml). La fase acuosa fue reextraída con EtOAc (3 x 20 ml), los extractos orgánicos fueron combinados, lavados con salmuera (20 ml), secados (Na2SO4) y concentrados al vacío para producir el producto crudo como una espuma color amarilla (475 mg). El producto crudo fue purificado en una columna de gel de sílice (25 x 2,5 cm, tolueno - EtOAc, 1:2 — 1:3 —1:4) para producir el triazolo 46 como una espuma blanca (214 mg, 81 %). 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 87,76 (s, 1 H5=CH), 5,18-5,36 (m, 6H, 3xH4, H211, IB1-ID111), 5,06 (dd 1H, Jh2-h3 = 3,2, H2m), 5,02 (d, 1H, JH1-H2 = 1,7, H1111), 4,94 (d, 2H, Jh1-h2 = 1,6, H-111), 4,92 (d, 1H, Jh1-h2 = 1,6, H11), 4,71 (s, 2H, OCH2), 4,49 (t, 2H, J= 6,6, CH2N), 4,30 (dd, 1H, JH6a-H6b = -11,9, Jh6-h5 = 4,0, H6a), 3,96-4,26 (m, 9H, 2 x H6a, 3 x H6b, H21, H311, H51, H511 o H5111), 3,92 (ddd, 1H, H511 o H5111), 3,43 (m, 2H, OCH2, H-3 Choi), 2,31 (m, 2H, CH2), 2,19, 2,145, 2,142, 2,11, 2,09, 2,08, 2,06, 2,04, 1,99 (s, 3OH, 10 x Ac), 1,90 (quintete, 2H, J= 6,6, CH2), 0,56-2,04 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,89 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,858 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,855 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,79 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,64 (s, 3H, colestanil-CH3).
a-D-Manopiranosil-(1—3)-a-D-manopiranosil-
Figure imgf000016_0001
2)-a-D-manopiranósido de 3-{4-(colestan-3p-il-oximetil)-[1,2,3]triazol-1-il}propilo (47)
El peracetato seco 46 (202 mg, 0,141 mmol) fue desacetilado de acuerdo con el procedimiento general para producir el poliol 47 como un sólido cristalino blanco (138 mg, 97 %), utilizado sin una purificación o caracterización adicional en el siguiente paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1—3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1—2)-3.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 3-{4-(colestan-3p-il-oximetil)-[1,2,3]triazol-1-il}propilo (48)
El poliol seco 47 (50 mg, 0,49 mmol) fue disuelto en DMF seco (2,45 ml, 0,02 M) y se agregó un complejo de SO3.piridina recién lavado y secado (234 mg, 3 eq por grupo de OH, 1,47 mmol) y la mezcla fue agitada durante 16 horas a una temperatura de 60°C. La mezcla de reacción fue enfriada a una temperatura de 0°C durante 15 minutos, posteriormente neutralizada agregando solución NaOH acuosa helada (5M, 2,1 eq/SO3, 0,617 ml, 3,09 mmol) a una temperatura de 0°C en una porción (hasta pH 12). La suspensión fue agitada durante 15 minutos a una temperatura de 0°C, diluida con agua (10 ml) y coevaporada con agua (3 x 20 ml) al vacío a una temperatura de 40°C. El sólido amarillo fue disuelto en agua (9 ml, — pH10,5), posteriormente la solución fue establecida en un pH 12 agregando una solución acuosa de NaOH (5 M, 5 gotas) y dializada contra agua (4 l) durante 16 horas a temperatura ambiente utilizando cassette Slide-A-Lyzer® (2000 MWCO, 4-12 ml). La diálisis continuó a una temperatura de 0°C contra agua (4 l) durante 2 días, en donde después de cada 24 horas una solución acuosa NH4HCO3 (3 M, 0,6 ml) fue agregada al agua cambiada (4 l) para establecer el pH a 6-6,5. La solución desalada fue posteriormente liofilizada para producir el producto 48 como un polvo esponjoso blanco (94 mg, 94 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 88,08 (s, 1H, =CH), 5,50 (m, 2 H, H211, H2i11), 5,22, 5(m, 1 H, H111 o H1111), 5,07 (m, 1H, H11), 4,33-4,93 (m, 19 H, H111 o H1111, 3 x H3, 3 x H4, 3 x H4, CH2N, 4 H6, H2, OCH2), 4,15 (m, 4 H, 2 x H6, 2 x H-5), 4,02 (m, 1H, H-5), 3,83 (m, 1H, OCH2), 3,71 (m, 1H, OCH2), 3,51 (m, 1H, H-3 Col.), 2,28 (m, 2H, CH2), 0,62-2,06 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,94 (d, 3H, J= 5,8, colestanil-CH3), 0,86 (d, 9H, J= 6,7, colestanil-CH3), 0,70 (s, 3H, colestanil-CH3).
Ejemplo 12. 3-O-Alil-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1—3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de bencilo (49)
Se disolvió tricloroacetimidato34 de 3-O-alil-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosilo (0,504 g, 0,744 mmol, 1,05 eq) y 2.4.6- tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de bencilo (0,413 g, 0,709 mmol) en DCM anhidro (6,4 ml, 0,11 M). Se agregó MS 3Á en polvo (70 mg recién activado). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 30 minutos. Una solución de TMSOTf (26 pl, 0,142 mmol, 0,2 eq) en DCM (0,6 ml) fue agregada en forma de gotas (concentración final: 1M). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C mientras que la reacción fue monitoreada por TLC (hexano-EtOAc = 65:35). Después de 60 minutos, la conversión fue completada y se agregó Et3N (0,15 ml). La mezcla cruda fue tratada con piridina (0,115 ml, 1,418 mmol, 2 eq) y cloruro de benzoilo (0,124 ml, 1,064 mmol, 1,5 eq). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente o/n y filtrada. El sólido fue lavado con DCM (6 x 1 ml). Los lavados y el filtrado combinados fueron evaporados en gel de sílice y purificados por cromatografía de columna (gel de sílice 2,5 x 24 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 200:20, 210:40, 200:50, 180:60, 170:85) para proporcionar el producto puro 49 como una goma color amarillo pálido (0,738 g, 95 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 88,20-8,06 (m, 8H, Ph), 7,90-7,80 (m, 4H, Ph), 7,67-7,23 (m, 23H, Ph), 5,98 (dd o t, 1H, Jh3(I)-h4(I) = 9,8, Jh4(I)-h5jj) (D = 9,8, H41)> 5,75 (dd o t, 1H, Jh3(ii)-h4(ii) = 9,8, Jh4(h)-h5(ii) = 9,8, H411), 5,41 (m, 1H, alil-2'), 5,23 (d, 1H, J= 2,0), 5,18-5,15 (m, 2H), 4,87-4,71 (m, 3H), 4,64­ 4,56 (m, 4H), 4,48 (dd o t, 1H, J= 12,7, J= 4,9), 4,34-4,27 (M, 2H), 4,22 (dd, 1H, J= 12,7, J= 3,9), 3,87 (dd, 1H, J= 9,8, J= 2,9), 3,74 (dd, 1H, J= 12,7, J= 5,9), 3,59 (dd, 1H, J= 12,7, J= 5,9).
2.4.6- tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de bencilo (50)
Una solución de éter de alilo 49 (688 mg, 0,627 mmol) en MeOH (6 ml) y 1,2-dicloroetano (6 ml) (0,05 M) fue tratada con cloruro de paladio sólido (25 mg). La mezcla fue agitada a una temperatura de 70°C (baño de aceite externo) durante 2 horas. El TLC indicó la conversión completa. La mezcla fue evaporada en sílice y purificada por cromatografía de columna (sílice 2,7 x 17 cm, elución gradiente con hexano-EtoAc 200:20, 200:40, 200:50, 210:70, 200:100) para proporcionar el alcohol 50 como una goma incolora (0,539 mg, 81 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 8 8,18-8,03 (m, 8H, Ph), 7,85-7,81 (m, 4H, Ph), 7,68-7,25 (m, 23H, Ph), 5,97 (dd o t, 1H, Jh3(I)-h4(I) = 9,8, Jh4(I)-h5(I) = 9,8, H41), 5,68 (dd, 1H, Jh1(I)-h2(I) = 2,0, Jh2(I)-h3(I) = 2,9, H21), 5,60 (dd o t, 1H, Jh3(M)-h4(M) = 9,8, Jh4(M)-h5(M) = 9,8, H411), 5,28 (s a, 1H, H1"), 5,15 (d, 1H, Jm(M)-H2(M) = 2,0, H11), 5,05 (dd, 1H, Jm(M)-H2(M) = 2,0, Jh2(M)-h3(M) = 2,9, H211), 4,77 (d, 1H, Jgem = 11,7, CH2), 4,65-4,56 (m, 4H, CH2, H61eq, H31 y H611), 4,44 (dd, 1H, Jgem = 12,7, JH5(i)-H6(i)ax = 4,9, H61ax), 4,34 (m, 1H, H511), 4,32 (dd, 1H, Jgem = 10,7, Jh5(M)-hc(M) = 2,9, H611), 4,28 (ddd, 1H, JH5(i)-H6(i)eq = 4,9, JH5(i)-H6(i)eq = 2,9, H51), 4,17 (dd, 1H, H311).
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de bencilo (51)
Una solución de alcohol 50 (242 mg, 0,401 mmol) y tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil (357 mg, 0,481 mmol, 1,2 eq) en DCM anhidro (7,5 ml) fue agitada con tamices moleculares en forma de polvo 3Á (50 mg) a una temperatura de 0°C durante 1 hora. Una solución de TMSOTf (15 pl, 0,0802 mmol, 0,2 eq) en Dc M (0,5 ml) fue agregada en forma de gotas a través de una jeringa. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 2 horas y el TLC indicó la conversión completa. Se agregó Et3N (100 pl). Se agregaron piridina (65 pl, 0,802 mmol) y cloruro de benzoilo (47 pl, 0,401 mmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente o/n y evaporada en gel de sílice. La purificación por cromatografía de columna (sílice 2,5 x 17 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 210:30, 200:50, 180:60, 160:80 y 150:100) proporcionó el trisacárido 51 como una goma incolora (392 mg, 60 %). 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 88,19-7,89 (m, 16H, Ph), 7,68-7,63 (m, 4H, Ph), 7,61-7,15 (m, 35H, Ph), 6,00 (dd o t, 1H, Jh3-h4 = 10.7, Jh4-h5 = 9,8, H4), 5,98 (dd o t, 1H, Jh3-h4 = 9,8, J= 9,8, H4), 5,92 (dd o t, 1H, J= 10,7, J= 9,8, H4), 5,72 (dd, 1H, JH1-H2 = 2,0, JH2-H3 = 3,9, H2), 5,56 (dd, 1H, Jh2-h3 = 2,9, H3), 5,33 (d, 1H, J= 2,0, H1), 5,26 (dd, 1H, J= 2,0, H2), 5,19 (d, 1H, J= 2,0, J= 3,9, H2), 5,16 (d, 1H, J= 2,0, H1), 4,90 (d, 1H, H1), 4,78 y 4,62 (AB quartete, 2H, Jgem = 11,7, CH2), 4,65-4,56 (m, 3H), 4,45 (dd, 1H, Jgem = 12,7, Jh5-h6 = 3,9, H6), 4,35 (dd, 1H, H3), 4,34-4,28 (m, 2H), 4,24 (dd, 1H, J= 12.7, Jh5-h6 = 2,9, H6), 4,10 (dt o dm, 1H, H5), 4,01 (dd, 1H, J= 12,7, H6), 3,95 (dd, 1H, Jh5-h6 = 2.O, H6).
2.3.4.6- tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosa (52)
El glucósido de bencilo 51 (385 mg, 0,235 mmol) fue disuelto en MeOH (5 ml) y cloroformo (5 ml). Paladio y carbón vegetal (5 %, 538 mg) fueron agregado. La mezcla fue agitada bajo hidrógeno a 100 psi durante 3 días. El t Lc indicó una conversión completa. La mezcla fue filtrada a través de un lecho de Celito y lavada con EtOAc (5 x 1 ml). Los lavados y el filtrado combinados fueron evaporados a sequedad, co-evaporados con DCM (3 ml) para proporcionar hemiacetal 52 como una espuma amarilla pálida (338 mg, 93 %), utilizada sin una purificación o caracterización adicional en el siguiente paso.
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2.4.6- tri-O-benzoil-a-D-manopiranosilo (53)
El hemiacetal 52 (330 mg, 0,214 mmol) fue disuelto en DCM anhidro (1,1 ml, 0,2 M). A una solución se le agregó tricloroacetonitrilo (43 pl, 0,427 mmol, 2 eq). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C mientras que una solución de DBU (1,6 pl, 0,05 eq, 0,0107 mmol) en DCM anhidro (0,15 ml) fue agregada. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 4 horas y TLC (hexano-EtOAc = 65,35) indicó la conversión completa. El producto crudo fue evaporado en gel de sílice y purificado por cromatografía de columna de sílice (2 x 14 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 200:20, 150:30, 120:30, 150:50 y hexano-EtOAc-Et3N 140:70:0,3) para proporcionar el tricloroacetimidato 53 como una espuma blanca (261 mg, 72 %) la cual fue utilizada directamente sin una caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (54)
A una solución del tricloroacetimidato 53 (128 mg, 0,0757 mmol) y 3p-colestanol (59 mg, 0,151 mmol, 2 eq) en DCM anhidro (2 ml) se le agregó tamices moleculares en polvo recién activados 3Á (50 mg). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 0,5 h y una solución de TMSOTf (2,7 pl, 0,0151 mmol, 0,2 eq) en DCM anhidro (0,15 ml) fue agregado en forma de gotas a una temperatura de 0°C. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 2 horas y TLC indicó la finalización de la reacción. Se agregó Et3N (150 pl). La mezcla fue evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna de sílice (2 x 14 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 180:20, 150:30, 120:30, 120:40 y 120:60) para proporcionar el glicosido 54 como una goma incolora (74 mg, 51 %). 1H RMN (CDCb, 300 MHz) 88,21-7,15 (m, 5OH, Bz), 6,00 (dd o t, 1H, Jh3(¡¡)-h4(¡¡) = 10,0, Jh4(¡¡)-h5(¡¡) = 10,0, H411), 5,93 (dd o t, 1H, Jh3-h4 = 10,0, JH4-H5 = 10,0, H41 y H4111), 5,61 (dd, 1H, Jh2H2(I)-h3(I) = 3,0, Jm(M)-H2(M) = 1,5, H21), 5,57 (dd, 1H, Jh3(¡¡¡)-H4(¡¡¡) = 10,0, Jh2(¡¡¡)-h3(¡¡¡) = 3,0, H3 ), 5,36 (d, 1H, JH1(ii)-H2(in = 1,5, H1 ), 5,26 (dd, 1H, Jh2(¡¡)-h3(M) = 3,0, H211), 5,21 (m, 2H, H11 y H2111), 4,91 (s, 1H, H1111), 4,68-3,90 (m, 11H), 3,62 (m, 1H, OCH-col), 1,99-0,50 (m, 31H, colestanil), 0,90 (d, 3H, J= 6,9, colestanil-CH3), 0,87 (d, 3H, J= 6,9, colestanil-CH3), 0,86 (d, 3H, J= 6,9, colestanil-CH3), 0,80 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,65 (s, 3H, colestanil-CH3).
3p-Colestanilo a-D-manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosida (55)
El glucósido 54 (70 mg, 0,0365 mmol) fue desacetilado de acuerdo con el procedimiento general para proporcionar el poliol 55 como un polvo amarillo pálido, utilizado directamente en el siguiente paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 3'-colestanilo (56)
El polvo descrito anteriormente (55) fue disuelto en DMF anhidro (1,8 ml, 0,02 M). Se agregó complejo de SO3.piridina (174 mg, 1,096 mmol, 3 eq por hidroxilo, recién lavado con agua, tolueno, EtOH, DCM y secado sobre P2O5 en un disecador de vacío durante 1 hora). La mezcla fue agitada a una temperatura de 60°C o/n (18 h) y enfriada hasta una temperatura de 0°C. Se agregó 5 M NaOH hasta que el pH fuera de > 10. Se agregó EtOH (6 ml) y la mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 20 minutos. El precipitado fue aislado por centrifugación y evaporado a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo fue redisuelto en agua (1,5 ml). La solución fue cargada en un cassette de diálisis Slide-A-Lyzer® (2000 MWCO, 0,5-3,0 ml de capacidad). El matraz fue lavado con agua (2 x 0,5 ml) y los lavados también fueron cargados en el cassette. La diálisis fue llevada a cabo en 10 l de agua purificada a temperatura ambiente durante 4 horas. El agua fue cambiada (10 l) y la diálisis fue continuada a una temperatura de 0°C o/n. El agua fue cambiada (4 l) y la diálisis continuó por otro día más. La solución ligeramente amarilla fue removida y liofilizada para proporcionar el persulafto 56 como un polvo ligeramente anaranjado (46,8 mg). 1H RMN (D2O, 300 MHz) 85,28 (s, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,16 (s, 1H), 5,05 (s a, 1H), 4,76 (s a, 1H), 4,67-3,88 (m, 16H), 3,53 (m, 1H, OCH), 1,82-0,44 (m, 3 1H, colestanil), 0,74 (d, 3H, colestanil-CH3), 0,67 (d, 6H, colestanil-CH3), 0,65 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,49 (s, 3H, colestanil-CH3).
Ejemplo 13. 2,3,4,6-Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de 3-azidopropilo (57)
A una solución de tricloroacetimidato 53 (128 mg, 0,0757 mmol) y 3-azidopropanol (15 mg, 0,151 mmol, 2 eq) en DCM anhidro (2 ml) se le agregó tamices moleculares en forma de polvo recién activados 3Á (50 mg). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 0,5 horas y una solución de TMSOTf (2,7 pl, 0,0151 mmol, 0,2 eq) en DCM anhidro (0,15 ml) fue agregada en forma de gotas a una temperatura de 0°C. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 2 horas y el TLC indicó la finalización de la reacción. Se agregó Et3N (150 pl). La mezcla fue evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna de sílice (2 x 14 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 150:20, 150:30, 120:30, 120:40, 120:60 y 120:80) para proporcionar el glucósido 57 como una goma incolora (86 mg, 70 %). 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 88,22-7,16 (m, 50H, Bz), 6,02 (dd o t, 1H, Jhs(n)-h4(m) = 10,0, Jh4(¡¡)-h5(¡¡) = 9,5, H411), 6,00 (dd o t, 1 H,Jh3(I)-h4(I) = 10,0, Jh4(I)-h5(I) = 9,5, H41 ), 5,96 (dd o t, 1H, JH3(rn)-H4(rn) = 10,0, JH4(rn)-H5(rn) = 9,5,H4111), 5,69 (dd, 1H, Jh2(¡).h3(¡) = 3,2, Jh1(M)-h2(i¡) = 1,6, H21), 5,59 (dd, 1H, Jh3(¡¡¡)-h4(¡¡¡) = 10,3, JH2(rn)-H3(rn) = 3,2, H3111), 5,37 (d, 1H, Jh1(ii)-h2(ii) = 2,4, H111), 5,29 (dd, 1H, Jh1(¡¡)-h2(¡¡) = 1,6, Jh2(M)-h3(M) = 2,4, H2"), 5,23 (dd, 1H, Jh1(¡¡¡)-h2(¡¡¡) = 1,6, H2111), 5,09 (d, 1H, Jh1 (¡)-h2(¡) = 1,6, H11), 4,94 (d, 1H, Jh¡(M)-h2(i¡i) = 1,6, H1111), 4,71 (dd, 1H, Jgem = 11,9, J= 2,4, H6), 4,60 (dd, 1H, J= 11,9, J= 2,4, H6), 4,58 (dd, 1H, H31), 4,50 (dd, 1H, J= 4,8, H6), 4,38 (dd, 1H, Jh2(M)-h3(M) = 3,2, H311), 4,34-4,22 (m, 3H), 4,14­ 3,94 (m, 3H), 3,91 (dt, 1H, Jgem = 9,5, J= 6,4, J= 6,4, OCH2), 3,59 (dt, 1H, J= 6,4, J= 6,4, OCH2), 3,44 (t, 2H, J= 6,4, NCH2), 1,91 (quintete, 2H, J= 6,4, CH2).
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de 3-{4-colestano-3p-il-oximetil)-[1,2,3]triazol-1-il}propilo (58)
A una mezcla de 57 (81 mg, 0,0497 mol), 3p-(prop-2-iniloxi)colestanol (43 mg, 0,0994 mmol, 2 eq) en DCM (64 pl) y t-butanol (60 |jl) (0,4 M) se agregó una solución de CuSO4(0,3 M en agua, 33 jl, 0,00994 mmol, 0,2 eq) y una solución de ascorbato de sodio (1M en agua, 20 jl, 0,0199 mmol, 0,4 eq). La mezcla fue agitada vigorosamente a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla fue evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna de sílice (2 x 14 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 170:20, 150:30, 120:30, 120:40, 120:60, 120:80 y 100:100) para proporcionar el triazolo 58 como una goma incolora (74 mg, 72 %). 1H RMN (CDCb, 300 MHz) 88,19-7,88 (m, 16H, Bz), 7,69-7,15 (m, 35H, Bz y triazolo-CH), 5,99 (dd o t, 1H, Jh3-h4 = 9,9, Jh4-h5 = 9,9, H4), 5,98 (dd o t, 1H, J= 9,9, J= 9.9, H4), 5,94 (dd o t, 1H, H4), 5,66 (dd, 1H, Jh2(I)-h3(I) = 3,1, Jh1(í)-h2(í) = 1-6, H21), 5,57 (dd, 1H, JH3(m)-H4(m) = 10,0, Jh2(¡¡¡)-h3(iii) = 3,1, H3111), 5,36 (d, 1H, Jh1(M)-h2(M) = 1,6, H111), 5,28 (dd, 1H, Jh2(M)-h3(¡¡) = 3,1, H211), 5,21 (dd, 1H, Jm(m)-H2(m) = 1,6, H2111), 5,04 (d, 1H, H11), 4,94 (d, 1H, H1111), 4,70 (s, 2H, OCH2), 4,70-3,92 (m, 11H), 3,84 (dt o ddd, 1H, Jgem = 9.9, J= 6,3, J= 6,3, OCH2), 3,50 (dt o ddd, 1H, J= 5,5, J= 5,5, OCH2), 3,37 (m, 1H, OCH-chol), 2,26 (m, 2H, CH2), 1,99­ 0,53 (m, 31H, colestanil), 0,90 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,87 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,86 (d, 3H, J= 6,8, colestanil-CH3), 0,76 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,64 (s, 3H, colestanil-CH3).
a-D-Manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranosil-(1^3)-a-D-manopiranósido de 3-{4-colestano-3p-il-oximetil)-[1,2,3]triazol-1-il}propilo (59)
El perbenzoato 58 (70 mg, 0,0341 mmol) fue disuelto en THF anhidro (2 ml) en MeOH (2 ml.) La mezcla fue tratada con una solución de 11 M NaOMe en MeOH (0,2 ml, 2,2 mmol). Después de la agitación a temperatura ambiente durante 2 días, la suspensión blanca fue neutralizada mediante la adición de resina AG50WX8 (forma H+). La solución transparente fue separada de la resina por filtración. La resina fue lavada con MeOH (3 x 2 ml). Los lavados y el filtrado combinados fueron evaporados a sequedad y fueron secados en un disecador de vacío bajo P2O5 o/n para proporcionar el poliol 59, utilizado directamente en el siguiente paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranosil-(1^3)-3.4.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-manopiranósido de 3-{4-colestano-3p-il-oximetil)-[1,2,3]triazol-1-il}propilo (60)
El poliol 59 fue disuelto en DMF anhidro (1,7 ml, 0,02 M). Se agregó el complejo de SO3.piridina (163 mg, 1,023 mmol, 3 eq por hidroxilo, recién lavado con agua, tolueno, EtOH, DCM y secado bajo P2O5 en un disecador de vacío durante 1 hora). La mezcla fue agitada a una temperatura de 60°C o/n (19 h) y enfriada a una temperatura de 0°C. Se agregó 5 M NaOH hasta que el pH fue de >10. Se agregó EtOH (6 ml) y la mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 20 minutos. El precipitado fue aislado por centrifugación y fue lavado con EtOH (1 ml) y redisuelto en agua (1,5 ml). La solución color naranja fue cargada en un SPE C18 Waters® (200 mg, preacondicionado por elución de gravedad con MeOH, MeOH-H2O 50:50, 10:90, 5:95 y 1:99, 3 ml cada uno) y eluído con MeOH-H2O (1:99). Las fracciones de producto fueron cargadas en un cassete de diálisis Slide-A-Lyzer® (2000 MWCO, 0,5-3,0 ml de capacidad). La diálisis fue llevada a cabo en 10 l de agua purificada a temperatura ambiente durante 1 día. El agua fue cambiada (10 l) y la diálisis fue continuada a una temperatura de 0°C durante otro día. La solución ligeramente amarilla fue removida y liofilizada para proporcionar el persulfato 60 como un polvo ligeramente amarillo (43 mg, 62 %).
1H RMN (D2O, 300 MHz) 87,92 (s, 1H, triazolo), 5,27 (d, 1H, J= 1,8), 5,20 (d, 1H, J= 1,4), 5,04 (m, 1H), 4,89 (s a, 1H), 4,72 (m, 1H), 4,65-3,28 (m, 23H), 2,07 (m, 2H, CH2), 1,83-0,45 (m, 31H, colestanil), 0,73 (d, 3H, J= 6,4, CH3), 0,66 (d, 6H, J= 6,4, 2xCH3), 0,63 (s, 3H, CH3), 0,49 (s, 3H, CH3).
Ejemplo 14. 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^3)-2,4,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^3)-2,3,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-1,2,3,6-tetra-O-acetil-D-glucopiranosa (61)
Maltotetraosa seca (502 mg, 0,753 mmol) y DMAP (cat.) fueron disueltas en piridina seca (10 ml) posteriormente a una temperatura de 0°C una solución de Ac2O (2,8 g) en piridina (5 ml) fue agregada en forma de gotas a una temperatura de 0°C, agitada durante 4 horas a una temperatura de 0°C y dejada durante 48 horas a una temperatura de -20 °C. La reacción no fue completada, por lo tanto el Ac2O adicional (1 g, mmol) fue agregado a una temperatura de 0°C y después de 16 h a temperatura ambiente, la reacción fue desactivada agregando MeOH seco (10 ml) a una temperatura de 0°C y la agitación continuó durante 2 h a temperatura ambiente. La solución fue co-evaporada con tolueno (3 x 30 ml) para proporcionar el peracetato 6135 como un sólido color blanco (920 mg, 97 %).
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^3)-2.3.6- tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosilo (62)
A una solución de etilendiamina (1,66 mmol, 0,11 ml) en THF seco (15 ml), se le agregó ácido acético glacial (0,90 mmol, 0,053 ml) en forma de gotas a una temperatura de 0°C resultando en una formación inmediata de un precipitado, el cual permanece presente hasta el desarrollo acuoso. El peracetato 61 (900 mg, 0,717 mmol) fue agregado a una temperatura de 0°C y la mezcla fue agitada durante 2 horas a temperatura ambiente. El TLC (tolueno / EtOAc, 1:2) posteriormente mostró la ausencia del material de partida y la presencia de un producto que se movía más lentamente, el cual aparece en su mayoría como una mezcla anomérica. La solución fue neutralizada agregando ácido acético (0,15 ml) en forma de gotas para alcanzar un pH de 6. El solvente fue soplado con una corriente de aire, el residuo fue disuelto en EtOAc (100 ml), lavado con solución de NaHCO3 sat. (3 x 50 ml), agua ( 3 x 10 ml), salmuera (30 ml), secada (Na2SO4) y concentrada al vacío para proporcionar el hemiacetal como una espuma color amarilla (830 mg). El hemiacetal seco (830 mg, 0,648 mmol) fue disuelto en DCM seco (5 ml), K2CO3 (1,20 g, 8,60 mmol) y tricloroacetonitrilo (0,849 ml, 8,40 mmol) fue agregado a una temperatura de 0°C y la agitación continuó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla fue purificada en una columna de gel de sílice (20 x 1,5 cm, tolueno - EtOAc, 1:2 —■ EtOAc, conteniendo 0,2 % (v/v) Et3N) y el tricloroacetimidato 6235 deseado fue obtenido como un polvo esponjoso blanco (795 mg, 86 %). El compuesto fue secado sobre P2O5 durante la noche y almacenado a una temperatura de 20°C.
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tetra-O-acetil-p-D-glucopiranósido de colestanilo (63)
El tricloroacetimidato 62 (300 mg, 0,221 mmol), colestanol (2 eq, 172 mg, 0,442 mmol) y 3 tamices moleculares 3Á (100 mg) fueron agitados en DCM seco (1,5 ml) durante 0,5 horas. Una solución de TMS-triflato en DCM seco (0,5 eq., 0,4 M, 0,275 ml, 0,11 mmol), fue agregada en forma de gotas a una temperatura de 0°C. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, otra porción de TMS-triflato en DCM seco (0,36 eq., 0,4 M, 0,2 ml, 0,08 mmol) fue agregada y la agitación continuó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción fue desactivada agregando Et3N (0,025 ml) a una temperatura de 0°C durante 10 minutos, filtrada a través de un lecho de celito (0,5 cm), lavada con DCM (5 x 25 ml) y EtOAc (3 x 25 ml). Ambas fases orgánicas fueron lavadas separadamente con solución NaHCO3 sat. (3 X 25 ml) y salmuera (25 ml). Los extractos acuosos fueron combinados y reextraídos con EtOAc ( 3 x 30 ml), lavados con salmuera (30 ml), combinados con otros extractos orgánicos, secados (Na2SO4) y concentrados al vacío para producir la espuma color amarilla cruda (480 mg). El producto fue purificado en una columna de gel de sílice (30 x 5 cm, tolueno: EtOAc 3:2 — 1:1 —^ 1:2—» EtOAc, con 0,2 % Et3N (v/v)). La purificación resultó en el glucósido penlazado 63 deseado en la fracción A como una espuma color blanca (81 mg, 23 %) y fracción B con 77 % de glucósido a-enlazado desacetilado y 23 % de glucósido p-enlazado parcialmente desacetilado (118 mg). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 85,24-5,45 (m, 7H, 3 x H1,4 x H3), 5,08 (t, 3H, Jh3-h4 = Jh4-h59,80, H41111,) 4,86 (dd, 1H, Jh1-h2 = 4,1, - 41 -Jh2-H3 = 10,4, H21111), 4,70-4,80 (m, 3H, 3 x H2), 4,63 (d, 1H, Jh1-h2 = 7,7, H11), 4,33-4,54 (m, 4H, 4 x H6), 3,86-4,31 (m, 10 H, 3 x H4, 3 x H5, 4 x H6), 3,70 (ddd, 1H, H51), 3,56 (m, 1H, colesterilo-H3), 2,20, 2,19, 2,16, 2,11,2,07, 2,04, 2,03, 2,02, 2,015, 2,010, 2,00, 1,99 (s, 39H, 13 x Ac), 0,55-2,00 (m, 33H, 12 CH2, 9 CH ), 0,90 (d, 3H, J= 6,6, colestanil-CH3), 0,871 (d, 3H, J= 6,6, colestanil-CH3), 0,867 (d, 3H, J= 6,6, colestanil-CH3), 0,78 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,65 (s, 3H, colestanil-CH3).
a-D-Glucopiranosil-(1—4)-a-D-glucopiranosil-(1—4)-a-D-glucopiranosil-(1—4)-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (64)
El peracetato 63 (75 mg, 0,047 mmol) fue desacetilado de acuerdo con el procedimiento general para producir el poliol 64 como un sólido color blanco (48 mg, 98 %), utilizado sin una purificación adicional o caracterizadción en el siguiente paso.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2.3.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranos¡l-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3pcolestanilo (65)
El poliol 64 (48 mg, 0,046 mmol) fue disuelto en DMF seco (2,3 ml, 0,02 M) y se agregó el complejo de SO3.piridina recién lavado y secado (285 mg, 3 eq por grupo OH, 1,79 mmol) y la mezcla fue agitada durante 16 horas a una temperatura de 60°C. La mezcla de reacción fue enfriada a una temperatura de 0°C durante 10 minutos, posteriormente neutralizada agregando una solución NaOH acuosa helada (5 M, 2,1 eq/SO3, 0,725 ml, 3,76 mmol) a una temperatura de 0°C en una porción (hasta un pH 12). La suspensión fue agitada durante 15 minutos a una temperatura de 0°C, diluida con agua (10 ml) y concentrada al vacío a una temperatura de 40°C. Se produjo un polvo color amarillo pálido, el cual fue disuelto en agua (10 ml) obteniendo una solución con pH 11,5. La solución fue establecida a un pH 12,5 agregando una solución acuosa de NaOH (5 M, 5 gotas) y dializada contra agua (4 l) utilizando un cassette Slide-A-Lyzer® (2000 MWCO, 4-12 ml) durante 16 horas a temperatura ambiente. La diálisis contra agua (4 l) fue continuada a una temperatura de 0°C durante 3 días, en donde el agua fue cambiada cada 24 horas, así como una solución acuosa NH4HCO3 (3M, 0,6 ml) fue agregada al agua para establecer un pH de ~6,0-6,5. La solución desalada fue posteriormente liofilizada para producir el persulfato 65 como un polvo esponjoso blanco (97 mg, 89 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 85,72 (d, 1 H, Jh1-h2 = 3,3, 1H1), 5,69 (d, 1 H, Jh1-h2 = 3,6, H1), 5,59 (d, 1H, Jh1-H2 = 3,6, H1), 5,10 (d, 1H, Jh1-h2 = 4,8, H11), 4,19-5,02 (m, 23H, 4 x H2, 4 x H3, 4 x H-4, 3 x H5, 8 x H6), 4,14 (m, 1H, H51), 3,85 (m, 1 H, H-3 Col.), 0,63-2,06 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,95 - 42 -(d, 3H, J= 6,5, colestanil-CH3), 0,885 (d, 3H, J= 6,6, colestanil-CH3), 0,882 (d, 3H, J= 6,6, colestanil-CH3), 0,85 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,70 (s, 3H, colestanil-CH3).
Ejemplo 15. 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil -D-glucopiranosa (66)
El jarabe G4 (1,8 g, liofilizado, que contenía ~ 72 % Maltotetraosa (p/p), ~1,94 mmol), y DMAP (75 mg) fue disuelto en piridina seca (36 ml) y a una temperatura de 0°C una solución de cloruro de benzoilo (94,7 mmol, 11 ml) en piridina (8 ml) fue agregada en forma de gotas y la agitación continuó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla fue desactivada agregando MeOH (50 ml) a una temperatura de 0°C y se continuó agitando durante 2 horas. La mezcla fue co-evaporada con tolueno (3 x 50 ml) para producir un jarabe amarillo. El jarabe fue suspendido en EtOAc (150 ml), lavado con solución de bicarbonato de sodio sat. (5 x 50 ml), HCl acuoso (5 %, 5 x 50 ml), y agua (5 x 50 ml). La fase acuosa fue reextraída con EtOAc (2 x 50 ml), combinada con el extracto orgánico principal, lavada con salmuera (50 ml), secada (Na2SO4), filtrada y concentrada al vacío. Para remover la mayoría de las impurezas aromáticas, el jarabe fue lavado con -nhexano hirviendo (5 x 50 ml), sonicado y secado en vacío elevado o/n para producir una mezcla de maltooligosacáridos perbenzoilatados como una espuma ligeramente beige (6,0 g). El residuo fue disuelto en un volumen mínimo de una mezcla de tolueno / etilacetato (15:1, 25 ml) a una tenmperatura de 50°C y aplicado en una columna de gel de sílice (21 x 5,5 cm, preacondicionada con tolueno) eluyendo con un gradiente de tolueno / etilacetato 15:1, volúmenes de ~ 1 columna) a 10:1 (volúmenes de 1:5 columna) a 5:1 (volúmenes de 1:5 columna). Las fracciones fueron controladas en TLC por UV y manchado químico y fracciones puras de perbenzoato de maltotetraosa fueron combinados, concentrados al vacío y secados en un vacío elevado para producir el producto puro 66 como una espuma color blanca (3,04 g, 76 %, basándose en 72 % de maltotetraosa en un jarabe seco). 1H-RMN muestra la presencia de la mezcla anomérica (a ;p = 1 : 1) y la benzoilación completa de todos grupos OH (pureza > 95 %). 1H RMN (400MHz, CDCla): p-anómero: 8,26-7,09 (m, 65H, 13 x Bz), 6,33 (d, 1H, J1Ci)-2(i) = 7,5, H11), 6.19 (dd o t, 1H, J2(iv)-3(iv) = 10,2, J3(iv)-4(iv) = 10,2, H3IV), 6,07 (dd, 1H, J2CM)-3CM) = 10,2, J3(m)-4(N) = 8,9, H311), 5,96 (dd, 1H, J2(rn)-3(rn) = 10,2, J3(rn)-4(rn) = 8,2, H3m), 5,83 (d, 1H, J ^ ^ V ) = 4,1, H1IV), 5,82 (dd o t, 1H, J2a)-afl) = 6,8, J3(i)-4(i) = 8,2, H31), 5,76 (dd o t, 1H, J4(iv)-5(iv) = 9,6, H4IV), 5,71 (d, 1H, J1(m)-2(m) = 4,1, H111), 5,69 (d, 1H, J1(m)-2(m) = 4,1, H1111), 5,65 (dd, 1H, H21), 5,34 (dd, 1H, H2IV), 5,20 (dd, 1H, H211), 5,14 (dd, 1H, H2m), 5,03-4,22 (m, 15H, 3 x H4 a 4,70, 4,52 y 4,40 ppm, respectivamente, y 4 x H5 y 8 x H6). Nota: - 43 - Las asignaciones para anillos de azúcar II y III fueron ambiguas, a-anómero: 6,84 (d, 1H, J u )^ ) = 3,6, H11), 5,46 (dd, 1H, J1(I)-2(I) = 10,2, J2(i)-3(i) = 3,6, H21).
Azida de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranosilo (67)
El perbenzoato 66 (500 mg, 0,235 mmol) fue disuelto en DCM seco (2 ml) posteriormente a una temperatura de 0°C, una solución de 30 % HBr de ácido acético (0,5 ml) fue agregada y agitada bajo Ar durante 2 horas. La reacción fue desactivada vertiendo la solución en DCM y agua-hielo (100 ml), la fase orgánica fue lavada con agua-hielo (3 x 50 ml), solución-NaHCO3 sat. (3 x 3 ml), salmuera (25 ml), secada (Na2SO4) y concentrada al vacío a temperatura ambiente para producir bromuro crudo. El bromuro crudo fue disuelto en cloroforomo (2 ml), posteriormente NaN3 (130 mg, 2 mmol), bromuro de tetrabutilamonio (129 mg, 0,4 mmol), y finalmente solución NaHcO3 sat. (3,5 ml) fueron agregados y agitados vigorosamente a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente fue soplado con una corriente de aire. El residuo fue posteriormente disuelto en EtOAc (10 ml), lavado con agua (3 x 50 ml), solución NaHCO3 sat. (4 x 25 ml). La fase acuosa fue reextraída con EtOAc (2 x 50 ml), los extractos orgánicos fueron combinados, lavados con salmuera (2 x 25 ml), secados (Na2SO4) y concentrados al vacío. La glicosil-azida 67 fue obtenida como una espuma color amarilla (466 mg, 97 %), utilizada sin una purificación adicional en el siguiente paso.
1H RMN (CDCla, 400 MHz) 87,03-8,24 (m, 65 H, 13 x Bz), 6,10 (dd, 1H, Jh2-h3 = 10,4, Jh3-h49,9, H3Im,) 5,99 (dd, 1H, Jh2-h3 = 10,1, Jh3-h48,7, H3m), 5,84 (dd, 1H, Jh2-h3 = 9,9, Jh2- h3 = 8,2, H3n), 5,75 (d, 1H, Jh1-h2 = 3,9, H1mI), 5,67 (m, 2H, H3, H4mI), 5,63 (d, 1H, Jh1-h2 = 4,1, H1m), 5,58 (d, 1H, Jh1-h2 = 3,9, H1"), 5,26 (dd, 1H, Jh1-h2 = 4,1, Jh2-h3 = 10,4, H2mI), 5.20 (dd, 1H, Jh1-h2 = 8,4, Jh2-h3 = 9,2, H2), 5,10 (dd, 1H, Jh2-h3 = 10,1, H2mI), 5,04 (dd, 1H, H2"), 4,98 (dd, 1H, JH6b-H5 = 2,1, JH6b-H6a = -12,0, H6b), 4,88 (d, 1H, Jh1-h2 = 8,4, H1), 4,82 (dd, 1H, JH6b-H5 = 1,7, JH6bH6a = -12,0, H6b), 4,67-4,76 (m, 2H, H-6a, H-6b), 4,53-4,63 (m, 2H, H-6a, H-6b), 4,30-4,47 (m, 7H, 3 x H4, 2 x H6, 2 x H5), 4,10-4,21 (m, 2H, 2 x H5).
2,3,4,6-Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-il-oximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (68)
3p-(Prop-2-iniloxi)colestanol (84 mg, 2eq., 0,196 mmol) y la azida 67 (200 mg, 0,098 mmol) fueron disueltos en la mezcla de DCM / t-BuOH (3:2, p/p, 0,21 M, 0,200 ml). Una solución acuosa de CuSO4 (0,3 M, 0,1 eq., 0,033 ml) y una solución acuosa de ascorbato de sodio (1 M, 0,3 eq., 0,029 ml) fueron agregadas y la mezcla fue agitada vigorosamente sin luz durante 48 horas. Los análisis de TLC (tolueno: EtOAc, 1:1) mostraron la finalización de la reacción con la aparición de un producto más polar que la azida de partida. La mezcla fue diluida con DCM (100 ml), lavada con una solución NaHCOa sat. (3 X 50 ml). La fase acuosa fue reextraída con DCM (3 X 20 ml), los extractos orgánicos fueron combinados, lavados con salmuera (50 ml), secados (Na2SO4) y concentrados al vacío para proporcionar el producto crudo como una espuma color amarilla (279 mg). El producto crudo fue purificado en una columna de gel de sílice (30 x 5 cm, tolueno - EtOAc, 7:1 —^ 5:1—>-3:1) para proporcionar el triazolo 68 como una espuma ligeramente amarilla (153 mg, 63 %). 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 87,05-8,24 (m, 65 H, 13 x Bz), 6,14 (d, 1H, Jh1- H2 = 8,9, H11), 6,11 (dd, 1 H, Jh2-h3 = 10,6, Jh3-h49,8, H3mI), 6,00 (dd, 1H, Jh2-h3 = 10,1, Jh3-h4 = 8,6, H3mI), 5,86 (m, 2H, H31, H1111), 5,76 (d, 1H, Jh1-h2 = 3,8, H11111), 5,64- 5,71 (m, 3H, H1m, H2I, H4mI), 5,63 (d, 1H, Jh1-h2 = 3,8, H1"), 5,26 (dd, 1H, H2mI), 5,12 (dd, 1H, Jh1-h2 = 3,8, H2mI), 5,08 (dd, 1H, Jh2-h3 = 9,8, H2"), 4,98 (dd, 1H, JH6b-H5 = 1,7, JH6bH6a = -12,5, H6b), 4,87 (dd, 1H, H6b), 4,69-4,77 (m, 2H, H6a, H6b), 4,53-4,66 (m, 4H, 2 x H6, OCH2, H41), 4,29-4,50 (m, 7H, 2 x H4, 2H6,3 x H-5), 4,18 (m, 1H, H5), 4,10-4,21 (m, 2H, 2 x H5), 3,26 (m, 1H, H-3 Choi), 0,52-2,00 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,90 (d, 3H, J= 6,5, colestanil-CHa), 0,869 (d, 3H, J= 6,7, colestanil-CHa), 0,864 (d, 3H, J= 6,6, colestanil-CHa), 0,77 (s, 3H, colestanil-CHa), 0,65 (s, 3H, colestanil-CHa).
a-D-Glucopiranosil-(1—4)-a-D-glucopiranosil-(1—4)-1-deoxi-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (69)
El perbenzoato 68 (95 mg, 0,038 mmol) fue disuelto en la mezcla de MeOH /THF (4:1 (p/p), 7,5 ml) posteriormente a una temperatura de 0°C, una solución de NaOMe en MeOH (11 M, 0,040 ml) fue agregada y la agitación continuó a temperatura ambiente. Tras 16 horas, aún había compuestos parcialmente benzoilatados (TLC: MeOH: EtOAc, 3:1), de modo que se agregó más NaOMe en MeOH (11 M, 0,040 ml) y la agitación continuó durante otras 3 horas. La solución fue neutralizada agregando una resina de intercambio de catión fuertemente acídica (BioRad AG-X8, H+) para ajustar el pH a 7, antes la solución fue filtrada, lavada con MeOH (5 X 20 ml) y concentrada al vacío. El residuo fue purificado en una columna de gel de sílice (15 x 1 cm, EtOAc, ^ MeOH - EtOAc, 3:1^- MeOH, con 0,2 % Et3N) para producir el poliol 69 como un sólido color blanco (47 mg, 1005).
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-1-deoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-il-oximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (70)
El poliol 69 (45 mg, 0,040 mmol) fue disuelto en DMF seco (2 ml, 0,02 M) y el complejo de piridina SO3 recién lavado y seco (428 mg, 3 ep por grupo OH, 1,56 mmol) fue agregado y la mezcla fue agitada durante 16 horas a una temperatura de 60°C. La mezcla de reacción fue enfriada a una temperatura de 0°C durante 10 minutos, posteriormente neutralizada agregando una solución de NaOH acuosa helada (5 M, 2,1 eq/SO3, 0,656 ml, 3,28 mmol) a una temperatura de 0°C en una porción (a pH 12). La suspensión fue agitada durante 15 minutos a una temoeratura de 0° C, diluida con agua (20 ml) y concentrada al vacío a una temperatura de 40°C. El sólido fue disuelto en agua (11 ml) obteniendo una solución con un pH 10,5. La solución fue establecida a un pH 12 agregando una solución acuosa de NaOH (5M, 5 gotas) y dializada contra agua (4 l) utilizando un cassette Slide-A-Lyzer® (2000 MWCO, 4,12 ml) durante 16 horas a temperatura ambiente. La diálisis fue continuada a una temperatura de 0°C contra agua (4 l) durante 3 días, en donde el agua (4 l) fue cambiada cada 24 horas así como una solución acuosa NH4HCO3 (3 M, 0,6 ml) fue agregada al agua para establecer un pH~6,0-6,5. La solución desalada fue poteriormente liofilizada para producir el persulfato 70 como un polvo esponjoso blanco (80 mg, 82 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 88,31 (s, 1H, =CH), 6,25 (d, 1 H, Jh1-h2 = 6,9, 1H, H11), 5,70 (m, 2 H, 2 x H1), 5,65 (d, 1H, Jh1-h2 = 3,6, H1), 4,72-5,03 (m, 11H, 4 x H2, 4x H3, H4ml, OCH2), 4,13-4,69 (m, 15 H, 3 x H4, 4 x H5, 8 x H6), 3,58 (m, 1 H, H-3 Col.), 0,63-2,05 (m, 33 H, 12 CH2, 9 CH), 0,95 (d, 3H, J= 6,3, colestanil-CH3), 0,87 (d, 6H, 2 x colestanil-CH3), 0,84 (s, 3H, colestanil-CH3), 0,70 (s, 3H, colestanil-CH3).
Ejemplo 16. Bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2.3.6- tri-O-acetil-a-D-glucopiranosilo (72)
Al peracetato de maltotriosa (71)36 (200 mg, 207 pmol) se le añadió DCM (1 ml) y 33 % HBr/HOAc (0,7 ml) a una temperatura de 0°C. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante cuatro horas. La solución fue diluida con DCM y lavada con agua-hielo (x2), NaHCO3 (sat) (x2) y salmuera (x1), antes de ser secada (Na2SO4) y el solvente evaporado para producir el bromuro 72 como un sólido blanco el cual se hizo reaccionar sin una purificación adicional o caracterización.
Azida de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-acetilp-D-glucopiranosilo (73)
El bromuro 72 (~200 mg) fue agregado en una mezcla de EtOAc (5 ml) y NaHCO3) (sat.) (5 ml). Se agregó NaN3 (500 mg), seguido por Bu4NBr (cat.). La mezcla fue agitada vigorosamente durante la noche a temperatura ambiente. La solución fue diluida con EtOAc y lavada con NaHCO3 (sat.) (x2) y salmuera (x1), antes de ser secada (Na2SO4) y el solvente evaporado para producir la azida 73 como un sólido color blanco (198,9 mg, 100 %, dos pasos) el cual se hizo reaccionar sin una purificación adicional o caracterización.
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-acetil-1-deoxip-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-il-oximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (74)
La azida 73 (200 mg, 211 pmol), 3-(prop-2-iniloxi)colestanol (3 equiv., 267 mg), CHCl3 (2 ml), t-BuOH (2 ml), CuSO4 (50 |jl de un solución acuosa de 0,3 M) y ascorbato de sodio (62,5 j l de 1M solución acuosa) fueron agitados vigorosamente durante la noche a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado y el residuo purificado por cromatografía de columna (SiO2:Hexano a 2:3 Hexano:EtOAc) para producir el triazolo 74 (197 mg, 68 %). 1H RMN (300 MHz, CDCb) 87,66 (s, 1H, triazol-H), 5,85 (d, 1H, J1,2 = 9,3, H-11), 5,46-5,27 (m, 6H, H-111, H-1111, H-21, H-4"", H-3", H-3m), 5,03 (dd, 1H, J3,2 = 9,8, J3,4 = 9,8, H-31), 4,82 (dd, 1H, J2,1 = 4,1, J2,3 = 10,3, H-2), 4,72 (dd, 1H, H-2), 4,63 (s, 2H, CH2O), 4,47-4,41 (m, 2H), 4,32-3,88 (m, 9H), 3,31 (m, 1H, CHO), 2,12 (s, 6H, OAc), 2,06 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 3H, OAc), 2,00 (s, 3H, OAc), 1,99 (s, 3H, OAc), 1,98 (s, 3H, OAc), 1,96 (s, 3H, OAc), 1,96-0,83 (m, 31H), 1,82 (s, 3H, OAc), 0,85 (d, 3H, J= 6,7, CH3), 0,82 (m, 6H, CH3), 0,76 (s, 3H, CH3), 0,60 (s, 3H, CH3).
a-D-Glucopiranosil-(1^4) -a-D-glucopiranosil-(1^4)-1-deoxi -p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (75)
El peracetato 74 (197,2 mg) fue desacetilado de acuerdo con el procedimiento general para proporcionar el poliol 75 como un sólido blanco (131 mg, 96 %) el cual se hizo reaccionar sin una purificación adicional o caracterización.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)1-deoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-il-oximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (76)
El poliol 75 (131,2 mg, 137 |jmol) fue disuelto en DMF (0,02M, 6,9 ml). Se agregó SO3.piridina (3 equiv. por grupo hidroxilo, 4,12 mmol, 655 mg) y la solución fue agitada durante la noche a una temperatura de 60°C. La solución fue enfriada en agua-hielo antes de que fuera neutralizada con 5 M NaOH (2:1 equiv./SO3.piridina, 1,73 ml). El solvente fue evaporado y el producto crudo fue purificado en un cartucho C18 SPE (cartuchos 2 X 1g) seguido por diálisis (48 h, cartuchos 2000 MWCO). La solución color blanquecina fue secada por congelación para producir el persulfato 76 como un sólido color blanquecino (156 mg, 58 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 88,32 (s, 1H, triazol-H), 6,22 (d, 1H, J1,2 = 7,5, H-11), 5,69 (d, 1H, J1,2 = 3,4, H-1), 5,63 (d, 1H, H-1), 5,04-4,17 (m, 18H), 3,58 (m, 1H, CHO), 2,03-0,85 (m, 31H), 0,95 (d, 3H, J= 6,2, CH3), 0,88 (d, 6H, CH3), 0,85 (s, 3H, CH3), 0,71 (s, 3H, CH3).
Ejemplo 17. 2,3,4,6-Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (77)
Se disolvió tricloroacetimidato 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosida (0,372 g, 0,502 mmol) y 3p-colestanol (0,390 g, 1,004 mmol, 2 eq) en DCM anhidro (5 ml, 0,1 M). Se agregó MS 3Á en forma de polvo (120 mg recién activado). La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C durante 30 minutos. Una solución de TMSOTf (0,018 ml, 0,100 mmol, 0,2 eq) en DCM (0,3 ml) fue agregada en forma de gotas a través de una jeringa. La mezcla fue agitada a una temperatura de 0°C mientras la reacción fue monioreada por TLC (hexano-EtOAc = 83:17). Después de 1,5 horas, la conversión fue completada y Et3N (0,2 ml) fue agregado. La mezcla cruda fue filtrada y el sólido fue lavado con DCM (5 x 1,5 ml). El filtrado y los lavados combinados fueron evaporados en gel de sílice y purificados por cromatografía de columna (gel de sílice 2,5 x 22 cm, elución gradiente con hexano-EtOAc 200:20, 210:30, 400:80) para proporcionar el glucósido 77 como una espuma incolora (368 mg, 76 %).
a-D-Manopiranósido de 3p-colestanilo (78)
La espuma descrita anteriormente incolora (358 mg, 0,370 mg) fue disuelta en THF anhidro (5 ml) y MeOH (3 ml) y una solución de 11 M NaOMe en MeOH (0,4 ml) fue agregada. Se formó un precipitado blanco inmediatamente. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente o/n. más THF (3 ml) fue agregado y la suspensión espesa fue agitada a temperatura ambiente por otro día. La mezcla fue neutralizada por la adición de la resina AG50WX8 (forma H+) resultando en que la suspensión se convirtiera en una solución transparente. La resina fue removida por filtración y lavada con MeOH (4 x 1,5 ml). El filtrado y los lavados combinados se convirtieron en un gel dento de 5 minutos (semitransparente). La mezcla fue evaporada a un volumen pequeño y cristalizada a partir de EtOH (10 ml). La mezcla entera se convirtió en un gel a temperatura ambiente, la cual fue filtrada y prensada para escurrir el líquido. El residuo fue lavado con EtOH (1,5 ml), secado con aire, y secado bajo P2O5 bajo vacío o/n para proporcionar tetrol 78 como un polvo blanco (131 mg). El filtrado proporcionó un precipitado y fue calentado a reflujo. La solución transparente resultante fue evaporada en gel de sílice y purificada por cromatografía de columna de sílice (3 x 8 cm, elución gradiente con CHCl3 200 ml y MeOH-CHCb 20:200, 20:160, 30:150). Las fracciones del producto fueron juntadas, evaporadas y secadas sobre P2O5 bajo vacío durante 3 días para proporcionar una segunda cosecha del producto como un polvo color blanco (79 mg). 1H RMN (DMSO-d6, 300 Mh z ) 84,73 (d, 1 H, J= 1,5, H1 ), 4,64 (d, intercambiable con D2O, 1H, J= 4,6, OH), 4,61 (d a, intercambiable con D2O, 1H, J= 4,1, Oh ), 4,48 (d, intercambiable con D2O, 1H, J= 5,7, OH), 4,37 (t, intercambiable con D2O, 1H, J= 6,0, OH), 3,62 (dd, 1H, J= 10,3, 5,7), 3,56-3,29 (m, 6H, azúcar 5 x H y H3 para el colestanil), 1,95-0,56 (m, 46H, colestanil).
Sal de tetrasodio de 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato-a-D-manopiranósido de 3p-colestanilo (79)
El tetrol 78 (102,8 mg, 0,187 mmol) fue disuelto en DMF anhidro (4,67 ml, 0,04 M). Se agregó el complejo SO3.piridina (357 mg, 2,244 mmol, 3 eq por hidroxilo, recién lavado con agua, tolueno, EtOH, DCM y secado bajo P2O5 en un disecador de vacío durante 1 hora). La mezcla fue agitada a una temperatura de 60°C durante 18 horas y enfriada a una temperatura de 0°C. Se agregó 5M NaOH (3 x 0,45 ml). El color de la mezcla (pH > 10) se tornó a amarillo-naranja. La mezcla fue evaporada a sequedad. El residuo (polvo amarillo pálido) fue disuelto en 4 ml de agua (pH > 10) y purificado por el carucho SPE-C18 (800 mg, preacondicionado eluyendo con MeCN, MeCM-agua 1:1, 1:9, 1:99, 4 ml cada uno). Después de la carga, el SPE fue eluído con un derrochador (12 ml), 1 % MeCN en agua (4,04 ml), 5 % (4,2 ml), 10 % (4,4 ml), 20 % (4,8 ml), 30 % (5,2 ml), 40 % (5,6 ml), 50 % (6 ml), 60 % (4,8 ml) y 70 % (5,1 ml). Las fracciones fueron verificadas mediante MBT, análisis de Char, CE y posteriormente fueron juntadas y liofilizadas. Una pequeña cantidad del producto 79 (25 mg de polvo color café) fue obtenido de 1 %~5 % MeCN-agua. La mayoría del producto fue eluído con 10 %, 20 % y 30 % de MeCN en agua (polvo amarillo pálido, 120 mg, 67 %). Otra pequeña cantidad de producto eluído con 40 % de MeCN en agua (polvo amarillo pálido, 4 mg). 1H RMN (D2O, 400 Mh z ) 85,16 (s a, 1H, H1), 4,70 (s a, 1H, H2), 4,6 (superpuesto con HOD, 1H, H3), 4,35 (m a, 1H, H4), 4,22 (m a, 1H, H6), 4,14 (m a, 1H, H6), 3,96 (m a, 1H, H5), 3,54 (m a, 1H, colestanil-H3), 1,90-0,50 (m, 46H, colestanil).
Ejemplo 18. 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranosilamina (80)
La azida 67 (201 mg, 0,098 mmol) fue disuelta en EtOAc (10 ml) y agitada con Pd-C (10 %, (p/p), 100 mg) bajo una atmósfera de H2 durante 3 horas (TLC: tolueno :EtOAc, 7:1). H2 fue reemplazado por Ar, posteriormente la mezcla fue filtrada a través de celite (prelavada con MeOH y EtOAc, 5 ml), lavada con EtOAc (5 x 20 ml, sonicación) y finalmente concentrada al vacío a temperatura ambiente para obtener la amina 80 como un sólido blanco (200 mg, 100 %), utilizada sin un purificación adicional o caracterización en el siguiente paso.
N-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranosil)-4-((3R, 10S, 12S, 13R)-3,12-di-O-acetil-10,13-dimetilhexadecahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantreno-17-il) pentanamida (81)
Se disolvió ácido diacetildeoxicólico37 (53 mg, 0,111 mmol) y DMAP (cat.) en DCM seco (3 ml) y posteriormente a una temperatura de 0°C una solución de DCC en DCM (1 M, 1 eq, 0,111 ml) y HOBt (17 mg, 0,111 mmol) fue agregada y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución fue basificada por la adición de Et3N (2 gotas) para establecer el pH a 8 y posteriormente a una temperatura de 0°C una solución de amina 80 (150 mg, 0,074 mmol) en una mezcla de DCM / DMF (5:1, (p/p), 2,5 ml) fue agregada y la agitación continuó a temperatura ambiente durante 16 horas (pH 8). TLC (tolueno: EtoAc, 3:1) no mostró progreso, de modo que el ácido diacetildeoxicólico (53 mg, 0,111 mmol), DCC en DCM (1 M, 1 eq, 0,111 ml), HOBt (17 mg, 0,111 mmol) y Et3N (3 gotas) fueron agregados y la agitación continuó durante 56 horas. La TLC indicó la finalización de la reacción, de modo que la solución fue filtrada a través de celite (prelavada, 2 mm) y lavada con DCM (3 x 40 ml). La solución transparente fue lavada con una solución de NaHCO3 sat. (4 x 30 ml). La fase acuosa fue reextraída con DCM (2 x 20 ml), los extractos orgánicos fueron combinados, lavados con HCl acuoso (3 %, 5 x 30 ml), una solución de NaHCO3 sat. (20 ml), secados (NaSO4) y concentrados al vacío. El residuo fue purificado en una columna de gel de sílice (30 x 5 cm, tolueno - EtOAc, 7:1—^ 5:1—>-1:1) para producir la amida 81 como un sólido ligeramente amarillo (58 mg, 32 %). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 87,01-8,28 (m, 65 H, 13 x Bz), 6,31 (d, lH, Jh1-nh = 9,3, NH), 6,10 (dd, 1H, Jh2-h3 = Jh3-h410,1, H3""), 6,00 (dd, 1H, Jh2-h3 = 10,2, Jh3-h4 = 8,9, H31), 5,82 (m, 2H, H311, H3""), 5,74 (d, 1H, Jh1-h2 = 3,9, H11111), 5,67 (t, 1H, H4""), 5,61 (d, 1H, Jh1-h2 = 4,0, H1111), 5,57 (d, 1H, Jh1-h2 = 4,0, H111), 5,48 (t, 1H, Jh1-h2 = 9,4H11), 5,25 (dd, 1H, Jh2-h3 = 10,6, H2ml), 4,99-5,15 (m, 4H, 3 x H2, H3-Desoxicólico), 4,92 (dd, 1H, JH6b-H5 = 1,7, JH6bH6a = -12,4, H6b), 4,63-4,81 (m, 4H, 3 x H6, H12- Desoxicólico), 4,56 (dd, 1H, JH6b-H5 = 1,7, JH6bH6a = -12,6, H6b), 4,08-4,52 (m, 10H, 3 x H4, 4 x H5, 3 H6), 2,07 (s, 3H, Ac), 2,03 (s, 3H, Ac), 0,8-2,15 (m, 26H, 10x CH2, 6 x CH), 0,89 (s, 3H, CH3), 0,70 (d, 3H, J= 6,4, CH-CH3), 0,63 (s, 3H, CH3).
N-(a-D-glucopiranosil-(1—4)-a-D-glucopiranosil-(1—4)-a-D-glucopiranosil-(1—4)-p-D-glucopiranosil)-4-((3R, 10S, 12S, 13R)-12-O-acetil-10,13-dimetilhexadecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantreno-17-il) pentanamida (82)
El compuesto 81 (53 mg, 0,021 mmol) fue disuelto en una mezcla de MeOH /THF (7:1 (p/p), 4 ml) posteriormente a una temperatura de 0°C una solución de NaOMe en MeOH (11 M, 0,040 ml) se agregó y la agitación continuó a temperatura ambiente. Después de 16 horas, aún 10 % de un compuesto apolar parcialmente benzoilatado estaba presente (TLC: MeOH: EtoAc, 2:1) de modo que más NaOMe en MeOH (11 M, 0,050 ml) fue agregado y la agitación continuó durante 1 hora (pH 12). La solución fue neutralizada agregando una resina de intercambio de catión fuertemente acídica (BioRad AG-X8, H+) para ajustar el pH a 7, antes la solución fue filtrada, lavada con MeOH (3 X 30 ml, sonicación) y concentrada al vacío. El residuo, con un olor aromático fuerte, fue purificado en una columna de gel de sílice (10 x 1 cm, EtOAc, — MeOH-EtOAc, 2:1—MeOH, con 0,2 % de Et3N) para producir el poliol 82 como un sólido color blanco (23 mg, 100 %).
N-(2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranosil)-4-((3R, 10S, 12S, 13R)-3-O-sulfonato de sodio-O-acetil-10,13-dimetilhexadecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantreno-17-il) pentanamida (83)
El poliol 82 (22 mg, 0,020 mmol) fue disuelto en DMF seco (0,02 M, 1,05 ml) y complejo de SO3.piridina recién lavado y secado (3 eq por grupo OH, 150 mg, 0,945 mmol) fue agregado y la mezcla fue agitada durante 16 horas a una temperatura de 60°C. La reacción fue desactivada agregando una solución NaOH acuosa (5M, 2,1 eq SO3, 0,397 ml, 1,985 mmol) en una porción a 0°C (pH 12) y agitada durante 15 minutos a una temperatura de 0°C. La suspensión fue concentrada al vacío a una temperatura de 40°C para producir un polvo color amarillo. El polvo fue disuelto en agua (11 ml) (pH 11,5) y dializado contra agua (4 l) utilizando un cassette Slide-A-Lyzer® (2000 Mw CO, 4-12 ml) durante 2 horas a temperatura ambiente. La diálisis contra agua (4 l, con 0,6 ml de 3 M NH4HCO3 aq. pH 6) fue continuada a temperatura ambiente durante 16 horas. La diálisis fue continuada a una temperatura de 0°C durante 46 horas, en donde el agua (4 l) fue cambiada cada 24 horas así como una solución acuosa de NH4HCO3 (3M, 0,6 ml) fue agregada al agua para establecer el pH a ~6,0-6,5. La solución desalada fue posteriormente liofilizada para producir un polvo esponjoso blanco. El análisis de CE mostró la aparición de 3 compuestos, correspondiendo a 1 pico mayor a 5,228 min (80 %) y 2 picos menores a 5,121 (5 %) y 5,278 min (10 %). La mezcla (~54 mg) fue purificada en una columna de HPLC C18: solvente A: 100 % agua, solvente B: 100 % acetonitrilo, velocidad de flujo: 10 ml/min; tamaño de fracción: 5 ml; detector: ELS: gradiente: 5 % B. El producto se unió solo débilmente a la matriz C18 pero fracciones puras de 83 fueron recolectadas y analizadas por Ce . La liofilización produjo persulfato 83 como un polvo esponjoso blanco (12,1 mg, 24 %, 98 % puro por CE). 1H RMN (400 MHz, D2O) 85,96 (d, 1H, NH), 5,79 (d, 2H, 2 x H"", H1111), 5,68 (d, 1H, H111), 5,19 (s, 1H, H3-Desoxicólico), 5,00-5,10 (m, 3H1, 3 x H3), 4,67- 4,98 (m, 6H, H11, 4 x H2, H3), 4,18­ 4,60 (m, 16 H, 3 x H4, 4 x H5, 8 x H6, H12-Desoxicólico), 2,46 (m, 2H, OCH2), 2,28 (s, 3H, 12-0 Ac-desoxicólico), 1,08­ 2,13 (m, 24H, 9 x CH2, 6 x CH), 1,05 (s, 3H, CH3), 0,93 (d, 3H, J= 6,2, CH-CH3), 0,88 (s, 3H, CH3).
Bromuro de (2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucop¡ranos¡l)-(1^4)-(2,3,6-tr¡-O-benzo¡l-a-D-glucop¡ranos¡l)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosilo (84)
Se colocó perbenzoato de maltotriosa (200 mg, 207 |jmol) en DCM (1 ml) y HBr/HOAc (0,7 ml) a una temperatura de 0°C. La mezcla se agitó a una temperatura de 0°C durante 6 horas. La solución se diluyó con DCM y se lavó con hieloagua (x2), NaHCO3(sat.) (x2) y salmuera (x1), antes de secarse (Na2SO4) y el solvente se evaporó para producir el producto sólido color blanco (cuantitativo) el cual se hizo reaccionar sin purificación adicional. 1H r Mn (CDCl3, 400 MHz) 88,19 (m, 2H, Ar), 8,05 (m, 2H, Ar), 7,95 (m, 2H, Ar), 7,88-7,85 (m, 4H, Ar), 7,74-7,70 (m, 4H, Ar), 7,63-7,09 (m, 36H, Ar), 6,73 (d, 1H, J i,2 = 3,4, H-11), 6,13-6,08 (m, 2H, H-3m, H-31), 5,95 (m, 1H, H-3"), 5,76 (d, 1H, J i,2 = 4,1, H-1m), 5,67 (m, 1H, H-4m), 5,65 (d, 1H, J1,2 = 3,4, H-111), 5,27 (dd, 1H, H-2m), 5,11 (dd, 1H, H-211), 5,03 (dd, 1H, H-21), 4,99 (dd, 1H, H-61), 4,76-4,72 (m, 2H, H-6", H-61), 4,66-4,58 (m, 2H, H-611, H-51), 4,55-4,35 (m, 5H, H-41, H-4", H-5", H-5m, H-6m), 4,23 (dd, 1H, H-6111).
Ejemplo 19. 2,3,4,6-tetra-O-benzo¡l-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-benzoil-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (85)
Se colocaron bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-benzo¡l-a-D-glucop¡ranosil-(1^4)-2,3,6-tri-0-benzo¡l-a-D-glucop¡ranos¡lo 84 (200 mg, 124 jm ol),38 tamices moleculares (~50 mg) y colestanol (3 equiv., 370 jmol, 145 mg) en DCM seco bajo Ar y se enfriaron hasta una temperatura de 0°C. Se agregó AgOTf (1,5 equiv., 187 jmol, 48 mg), y la solución se agitó a una temperatura de 0°C durante 2 horas. Se agregó trietilamina (600 j l ) y la solución se templó a temperatura ambiente. La mezcla se pasó a través de un lecho corto de sílice (utilizando 1:1 EtOAc:Hex con 0,5 % (v/v) de trietilamina como el solvente de elución). El solvente se evaporó (se mantuvo a temperatura ambiente, la temperatura del baño de agua). La mezcla resultante se colocó en DMC seco bajo DCM bajo Ar con tamices moleculares, posteriormente se enfrió a una temperatura de 0°C antes de que se agregara lentamente TMSOTf (1,24 ml de una solución 0,1 M en DCM) durante 20 minutos. La solución se agitó a una temperatura de 0°C durante 1 hora, posteriormente a temperatura ambiente con 0,5 equivalentes extra de TMSOTf agregados durante 15 minutos. Después de 30 minutos adicionales, se agregó trietilamina (1 ml) y la solución se filtró y el solvente se evaporó. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna (SO 2: Hexano a 35 % Eto Ac/Hex) para proporcionar el glucósido puro 85 en la forma de un sólido color blanco (91 mg, 38 %). 1H RMN (300 MHz, CDCb) 8 8,17 (m, 2H, Ar), 8,06 (m, 2H, Ar), 7,96 (m, 2H, Ar), 7,88 (m, 2H, Ar), 7,82 (m, 2H, Ar), 7,72 (m, 4H, Ar), 7,57 (m, 4H, Ar), 7,52-7,09 (m, 32H, Ar), 6,10 (t, 1H, J= 9,7, H-3m), 5,92 (t, 1H, H-311), 5,75 (d, 1H, J1,2 = 3,8, H-1m), 5,71-5,64 (m, 2H, H-4m, H-31), 5,58 (d, 1H, J1,2 = 3,8, H-l11), 5,30-5,19 (m, 2H, H-2m, H-21), 5,10 (dd, 1H, H-2"), 4,95 (m, 1H, H-611), 4,84 (d, 1H, J1,2 = 7,7, H-11), 4,77-4,61 (m, 3H, H-61, H-61, H-6"), 4,49-4,34 (m, 5H, H-6m, H-51, H-5m, H-41, H-4"), 4,25 (m, 1H, H-6111), 4,06 (m, 1H, H-5"), 3,53 (m, 1H, CHO), 1,99-0,47 (m, 31H), 0,91 (d, 3H, CH3), 0,87 (m, 6H, CH3), 0,64 (s, 3H, CH3), 0,62 (s, 3H, CH3).
a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-p-D-glucop¡ranósido de 3p-colestanilo (86)
Se colocó el glucósido 85 (91 mg, 47,5 jm ol) en 1:1 MeOH:THF y se desacetiló de acuerdo con el procedimiento general para proporcionar poliol 86 (48 mg) en la forma de un sólido color blanco (que contiene residuos de benzoato de metilo) el cual se hizo reaccionar sin purificación o caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2.3.6- tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (87)
Se disolvió poliol 86 (47,8 mg, 54,6 jm ol) en DMF (0,02M, 2,73 ml). Se agregó SO3.piridina (3 equiv. por hidroxi, 1,64 mmol, 261 mg) y la solución se agitó a una temperatura de 60°C durante la noche. La solución se enfrió en hielo-agua y se neutralizó con 5 M NaOH (700 j l ) antes de que el solvente se evaporara. El residuo se colocó en agua y se purificó en un cartucho C18 SPE utilizando MeOH/agua como la fase móvil. Las fracciones que contenían el producto se reunieron y dializaron durante 48 horas con un cartucho de diálisis 2000 MWCO antes de filtrarse utilizando un filtro de jeringa de 40 micras y se liofilizaron para proporcionar el persulfato 87 en la forma de un sólido color blanquecino (43 mg, 48 % en dos pasos). 1H RMN (400 MHz, D2O) 85,68 (d, 1H, H-1), 5,58 (d, 1H, H-1), 5,05-4,03 (m, 19H), 3,82 (m, 1H, Colestanilo H-3), 2,05-0,65 (m, 31H), 0,96 (d, 3H, J= 5,6, CH3), 0,90 (d, 6H, J= 6,4, CH3), 0,86 (s, 3H, CH3), 0,71 (s, 3H, CH3).
Ejemplo 20. 2,3,4,6-Tetra-0-acetil-p-D-galactopiranos¡l-((1^4)-1,2,3,6-tetra-0-acet¡l-D-glucop¡ranosa (88)
Se suspendió lactosa (5,0221 g, 13,88 mmol) en piridina seca (40 ml) y se agregó DMAP (50 mg). Se agregó en forma de gotas anhídrido acético (26,24 ml, 277,6 mmol) a la suspensión a una temperatura de 0°C durante 15 minutos y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se extinguió con la adición en forma de gotas de metanol anhidro a una temperatura de 0°C y la solución se agitó. El solvente se evaporó seguido de elución junto con tolueno anhidro (3 x 50 ml) y el solvente restante se redujo durante la noche bajo vacío para producir un sólido color blanco (9 g, 13,26 mmol, 95 %) el cual se hizo reaccionar sin purificación o caracterización adicional.
Bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-p-D-galactop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-acet¡l-a-D-glucopiranos¡lo (89)
Se disolvió peracetato 88 (510,3 mg, 0,75 mmol) en DCM anhidro (1,5 ml) y HBr/ácido acético (30 %, 1 ml) fue agregado en forma de gotas a una temperatura de 0°C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas posteriormente se diluyó con DCM (30 ml), se lavo con hielo-agua (2 x 40 ml), una solución de NaHCO3 saturada enfriada con hielo (3 x 30 ml) y salmuera (2 x 30 ml). La solución se secó sobre Na2SO4 y se concentró bajo vacío para producir el bromuro crudo. La siguiente reacción procedió inmediatamente después de la concentración.
Azida de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-p-D-galactopiranosil-((1^4)-2,3,6-tri-O-acetil-p-D-glucopiranosilo (90)
Se disolvió bromuro de glucosilo crudo 89 (0,75 mmol) en CHCb (4 ml) y se agregaron Bu4NHBr (193,42 mg, 0,6 mmol), NaN3 (195,03 mg, 3,0 mmol) y una solución NaHCO3 saturada (7 ml). La reacción se agitó vigorosamente durante la noche a temperatura ambiente. Se redujo la reacción, se diluyó en EtOAc y se lavó con una solución NaHCO3 saturada (3 x 30 ml) y salmuera (3 x 30 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía flash utilizando EtOAc/Hexano (1:1) con 0,2 % Et3N para producir la azida (348 mg, 70 % en 2 pasos). 1H RMN (300 MHz, CDCb) 85,33 (dd, 1H, Jh4',h3' = 3,4 Hz, Jh4',h5' = 1,1 Hz, H-4'), 5,19 (dd, 1H, Jh3,h4 = 9,4 Hz, Jh2,h3 = 9,0 Hz, H-3), 5,09 (dd, 1H, Jh2',h3' = 10,4 Hz, Jh2',h1' = 7,8 Hz, H-2'), 4,94 (dd, 1H, Jh2'-,h3' = 10,4 Hz, Jh3',h4' = 3,4 Hz, H-3'), 4,84 (dd, 1H, Jh2,h3 = 9,5 Hz, Jh2,h1 = 8,8 Hz, H-2), 4,61 (d, 1H, Jh2,h1 = 8,8 Hz, H-1), 4,49 (dd, 1H, JH6a,H6b = 11,9 Hz, JH6a,H5 = 2,2 Hz, H-6a), 4,46 (d, 1H, jh',h2' = 7,8 Hz, H-1'), 4,14-4,03 (m, 3H, H-6b, H-6a', H-6b'), 3,87 (dd, 1H, Jh5,h4' = 1,1 HZ, H-5'), 3,80 (t, 1H, Jh4,h5 y H4,H3 = 9,4 Hz, H-4), 3,68 (ddd, 1H, JH6a,H5 = 2,0 HZ, JH6b,H5 = 5,0 HZ, Jh4,h5 = 9,9 Hz, H-5), 2,13 (s, 3H, OAc), 2,12 (s, 3H, OAc), 2,05 (s, 3H, OAc), 2,05 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 3H, OAc), 2,02 (s, 3H, OAc), 1,95 (s, 3H, OAc).
2,3,4,6-Tetra-O-acetil-p-D-galactopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-acetil-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (91)
Se disolvieron azida seca 90 (100 mg, 0,15 mmol) y colestanol 3p-(prop-2-iniloxi) (129 mg, 0,302 mmol, 2eq) en DCM/t-BuOH (3:2, 0,21M). Se agregó una solución acuosa de CuSO4 (0,3M, 0,1 eq, 0,015 mmol, 50 pl) a la mezcla seguido de una solución acuosa de Na-ascorbato (1M, 0,3 eq, 0,045 mmol, 45,3 pl). La reacción se cubrió de la luz y se agitó vigorosamente. La mezcla se diluyó en DCM (100 ml) y se lavó con una solución de NaHCO3 saturada (3 x 30 ml). La fase acuosa se volvió a extraer con DCM (20 ml) y las capas orgánicas combinadas posteriormente se lavaron con salmuera (2 x 30 ml) y se secaron sobre Na2SO4. El solvente se evaporó al vacío para producir el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía flash utilizando Hexano/EtOAc (3:2) con 0,2 % Et3N para producir el producto en la forma de un sólido color blanco (135,3 mg, 82 %). 1H RMN (300 MHz, CDCb) 87,67 (s, 1H, CH-N), 5,79 (d, 1H, J H1,H2 = 9,2, H-1), 5,43-5,37 (m, 2H, H-2, H-3), 5,35 (dd, 1H, Jh3,h4' = 3,4, Jh4,h5' = 0,8, H-4'), 5,11 (dd, 1H, JH2',H3' = 10,4, JH2'-,H1' = 7,8, H-2'), 4,95 (dd, 1H, Jh2,h3' = 10,4, Jh3,h4' = 3,4, H-3'), 4,64 (s, 2H, CH2-N), 4,50 (d, 1H, Jh1,h2' = 7,9, H-1'), 4,46 (dd, 1H, JH6a',H6b' = 12,4, J H6a',H5' = 1,6, H-6a'), 4,16-4,04 (m, 3H, H-6b', H-6a, H-6b), 3,96­ 3,85 (m, 3H, H-4, H-5, H-5'), 3,39-3,28 (m, 1H, H-Chol), 2,14 (s, 3H, OAc), 2,09 (s, 3H, OAc), 2,06 (s, 3H, OAc), 2,05 (s, 3H, OAc), 2,04 (s, 3H, OAc), 1,95 (s, 3H, OAc), 1,88-1,80 (m, 31H), 1,85 (s, 3H, OAc), 0,88-0,80 (m, 3H, CH3-CH), 0,85 (d, 3H, J = 1,3, CH3-CH), 0,83 (d, 3H, J = 1,2, CH3-CH), 0,77 (s, 3H, CH3), 0,62 (s, 3H, CH3).
p-D-Galactopiranosil-(1^4)-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-il-oximetil)[1,2,3]triazoI-1-ilo (92)
Se disolvió N-glucósido seco 91 (100 mg, 0,092 mmol) en CH3OH anhidro y se agregó en forma de gotas a la mezcla una solución de NaOMe/CH3OH (11M, 30 pl) a una temperatura de 0°C bajo argón. La solución se dejó en agitación durante la noche a TA. Después de monitorear mediante TLC, se agregó más CH3OH anhidro (2 ml) y NaOMe/CH3OH (11M, 50 pl) y la mezcla de reacción se encontró con un pH de 11. Al término, la reacción fue neutralizada a un pH de 6 mediante la adición de resina de intercambio de iones Dowex H+, y la suspensión resultante se disolvió en CHCb/CH3OH (1:1) a una temperatura de 40°C. La solución se filtró, se concentró y secó sobre P2O5 para producir el producto crudo.
2,3,4,6-Tetra-O-sulfo-p-D-galactopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo, sal de heptasodio (93)
Se agregó SO3-Pyr (124,89 mg, 0,785 mmol, 3eq/OH, lavado previamente y secado) en una parte a poliol seco 92 (29,7 mg, 0,037 mmol) en DMF anhidro (0,02M, 1,85 ml) a una temperatura de 0°C. La reacción se dejó en agitación durante la noche. La reacción se enfrió a una temperatura de 0°C y se agregó una solución enfriada de 5M NaOH (329,7pl, 1,65 mmol, 2,1 eq de SO3-Pyr) en una parte con agitación. El pH se revisó inmediatamente y se encontró únicamente ligeramente básico. Se agregó una solución adicional de NaOH 5M frío (50 pl) a la reacción y se encontró un pH de aproximadamente 13. La suspensión se agitó a una temperatura de 0°C durante 15 minutos, posteriormente se diluyó con H2O grado HPLC (100 ml) y el solvente se evaporó lentamente. El producto se desaló C18 (WatersSepPak, 1g) mediante un gradiente de elución de H2O grado HPLC al 100 % a ACN/H2O (1:1). Las fracciones fueron mantenidas básicas por la agregación de 0,1 M NH4HCO3, y una prueba de quemado fue llevada a cabo en todas las fracciones. Las fracciones positivas quemadas fueron analizadas por CE y las fracciones que contienían JR254_33 combinadas y separadas en una Cromatografía Líquida C18 que utiliza un gradiente de elución de 5 a 50 % de ACN en H2O durante 35 minutos. Se analizó el contenido de azúcar de todas las fracciones utilizando 10 pl de la muestra con 40 pl de una solución acuosa azul de 1,9-dimetilmetileno, las fracciones de azúcar positivas fueron analizadas por CE. Las fracciones puras fueron recolectadas y liofilizadas para obtener el producto como un polvo blanquecino (21,1 mg, 37 % de rendimiento) 98 % puro por CE. 1H RMN (300 MHz, D2O) 8: 8,29 (s, 1H, CH=C-), 6,27 (d, 1H, Jhi,h2 = 8,1 Hz, H-1), 5,14 (d, 1H, Jh3-,h4-= 3,0 Hz, H-41), 4,98 (t, 1H, Jhi,h2 = 7,8 Hz, H-2), 4,91-4,82 (m, 1H, H-3), 4,89 (d, 1H, J H1,H2- = 7,5 Hz, H-11), 4,74 (s, 2H, CH2), 4,57 (dd, 2H, Jh2',h3'- = 10,2 Hz, Jh3',h4'- = 3,0 Hz, H-3', H-5), 4,46 (dd, 1H, Jh2'-;H3' = 9,9, J h',h2- = 7,5, H-2), 4,36 (m, 5H, H-4,H-5,H-6a,H-6a' H-6b'), 4,18-4,14 (m, 1H, H-6b), 3,63­ 3,49 (m, 1H, Chol-H), 2,04-0,98 (m, 31H, Choi), 0,97-0,83 (m, 12H, CH3), 0,70 (s, 3H, CH3).
Ejemplo 21. Azida de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-acetil-p-D-glucopiranosilo (94)
Peracetato de maltosa (200 mg, 295 jm ol) fue colocado en DCM (1 ml) y HBr/HOAC (0,7 ml) a 0°C. La mezcla fue agitada a 0°C durante 4 horas. La solución fue diluida con DCM y lavada con agua-hielo (x 2), NaHCO3 (saturado) (x 2 ) y salmuera (x 1 ), antes de ser secada (Na2SO4) y el solvente evaporado para obtener el producto de bromuro sólido blanco el cual se colocó en una mezcla de EtOAc (5 ml) y NaHCO3 (saturado) (5 ml). NaN3 (2,0 g) fue agregado, seguido por BuNBr4(cat.). La mezcla fue agitada de forma vigorosa durante la noche a temperatura ambiente. La solución fue diluida con EtOAc y lavada con NaHCO3 (saturado) (x 2) y salmuera (x 1), antes de ser secada (Na2SO4) y el solvente evaporado para obtener el producto sin procesar el cual fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SO 2: Hexano a 50 % EtOAc/Hexano, cargado con tolueno) para obtener 170,6 mg del producto sólido blanco (87 %, dos pasos), el cual fue reaccionado sin una caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-acetil-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (95)
Azida 94 (170 mg, 257 jmol), 3p-(prop-2-iniloxi)colestanol (2 equivalente, 219 mg), CHCb (2 ml) de t-BuOH (2 ml), CuSO4 (50 |jl de una solución acuosa 0,3 M) y ascorbato de sodio (62,5 j l de una solución acuosa 1M) fueron agitados de forma vigorosa durante la noche a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado y el residuo fue cargado sobre una columna de sílice (SO 2: Hexano a 50 % de EtOAc/Hexano) para obtener 190 mg del material puro 95 (68 %). H RMN (300 MHz, CDCb) 8: 7,67 (s, 1H, Triazol-H), 5,85 (d, 1H, J1,2 = 9,3, H-11), 5,46-5,29 (m, 4H, H-111, H-21, H-411, H-311), 5,04 (t, 1H, J2,3 = 10,3, J3,4 = 10,3, H-31), 4,85 (dd, 1H, J1,2 = 4,1, J2,3 = 10,8, H-2"), 4,63 (s, 2H, CH2), 4,45 (ddd, 1H, H-61), 4,25-4,19 (m, 2H, H-51, H-6"), 4,14-3,92 (m, 4H, H-511, H-61, H-611, H-41), 3,32 (m, 1H, CHO), 2,31-0,53 (m, 31H), 2,10 (s, 3H, OAc), 2,08 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 3H, OAc), 2,00 (s, 6H, OAc), 1,98 (s, 3H, OAc), 1,82 (s, 3H, OAc), 0,83 (d, 3H, J= 1,0, CH3), 0,81 (d, 3H, J= 1,5, CH3), 0,76 (s, 3H, CH3), 0,61 (s, 3H, CH3).
a-D-Glucopiranosil-(1^4)-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (96)
El peracetato 95 (190 mg) se disolvió en THF/MeOH (1:1). Se añadió NaOMe en MeOH (11 M, 20 j l) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se neutralizó con una resina H+, se filtró y se evaporó el disolvente para proporcionar 125 mg (90 %) del producto sólido blanquecino que se hizo reaccionar sin una purificación o caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo , sal de heptasodio (97)
El poliol 96 (124,5 mg, 157 jm ol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 7,84 ml). SO3-piridina (3 equivalente/OH, 3,3 mmol, 525 mg) fue agregado y la solución agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada a 0°C y neutralizada con 5M NaOH (2,1 equivalente/SO3 piridina, 1,4 ml). La mezcla fue transferida a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporada y dializada (cartucho 2000 MWCO, Pierce) contra agua purificada (5 l, el agua se cambia cada 12 horas) durante 24 horas. La solución fue liofilizada y colocada en agua antes de ser purificada en un sistema de C18 RP-HPLC prep. (5 % a 95 % de acetonitrilo en agua durante 20 minutos). La CE fue utilizada para determinar la pureza de cada fracción recolectada después de una purificación por HPLC. Fracciones con una pureza mayor al 90 % fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el producto como un sólido blanco (55 mg, 23 %). 1H RMN (300MHz, D2O) 8: 8,25 (s, 1H, triazol), 6,20 (d, 1H, J1,2 = 6,0, H-11), 5,65 (d, 1H, H-111), 5,04-4,94 (m, 3H, H-31, H-311, H-21), 4,80 (s, 2H, CH2), 4,73 (m, 1H, H-211), 4,58 (dd, 1H, H-411), 4,49-4,23 (m, 7H, H-41, H-51, H-511, 4 x H-6), 3,57 (m, 1H, CHO), 2,09-0,56 (m, 46H).
Ejemplo 222,3,4,6-Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)1,2,3,6,-tetra-O-benzoil-D-glucopiranosa (98)
Maltosa (2,0 g, 5,84 mmol) fue disuelta en piridina seca (40 ml) a 0°C. DMAP (cat.) fue agregado. Cloruro de benzoilo (2,5 equivalente, 14,6 mmol, 16,4 g, 13,6 ml) fue agregado en forma de gotas y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La solución fue vertida sobre una mezcla de agua-hielo y DCM. La capa orgánica fue lavada con NaHCO3 (saturado) (x 7), salmuera, H2SO4 (5 %) (x 2), seguido por salmuera. La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente evaporado. El producto fue pasado mediante un lecho de sílice corto para remover el cloruro de benzoilo restante y el solvente fue evaporado para obtener 3,5 g (51 %) del producto sólido blanco, el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)2,3,6-tri-O-benzoil-D-glucopiranosilo (99) Perbenzoato 98 (0,5 g) fue disuelto en piridina (5 ml). Dimetilamina (3,5 ml, 5,6 M en EtOH) fue agregada. La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. Tolueno (10 ml) fue agregado y la solución fue lavada con salmuera, H2SO4 (5 %) (x 2), salmuera, NaHCO3 (saturado) y salmuera. La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente fue evaporado. El hemiacetal sin procesar fue colocado en DCM seco con tamices moleculares, carbonato de potasio (200 mg) y carbonato de cesio (70 mg). La solución fue enfriada a 0°C antes de que fuera agregado tricloroacetonitrilo (120 jl). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla fue filtrada y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SiO2:Hexano a 50 % de EtOAc/Hexano) para obtener el producto como un sólido blanco (336 mg, 66 % en dos pasos) el cual fue reaccionado sin una caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-acetil-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo (100)
Tricloroacetimidato 99 (336,2 mg, 280 jm ol) colestanol (3 equivalente, 326 mmol) y tamices moleculares fueron colocados en DCM seco bajo Ar. La solución fue agitada durante 15 minutos antes de que TMSOTf (0,1 M solución en DCM, 0,33 equivalente, 924 j l ) fue agregado lentamente. Después de 30 minutos un equivalente adicional de TMSOTf (2,77 ml de una solución 0,1 M en DCM) fue agregado lentamente y la solución se dejó en agitación durante 40 minutos adicionales. Trietilamina (200 j l) fue agregada y el solvente fue evaporado. El producto sin procesar fue purificado por una cromatografía de columna (SO 2: Hexano a 15 % de EtOAc/Hexano) pero eluido cerca al material de partida del colestanol en exceso. Además, la mezcla fue desbenzoilatada, acetilada y repurificada para proporcionar la separación adecuada. El compuesto fue colocado en MeOH/THF (1:1). 11M NaOMe en MeOH (50 j l ) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. La solución fue neutralizada con una resina H+, filtrada y el solvente evaporado. El producto poliol sin procesar se colocó en piridina (5 ml) y anhídrido acético (5 ml). DMAP (cat.) fue agregado y la solución fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla fue agregada a agua-hielo y extraída con DCM antes de ser lavada con 5 % de H2SO4, seguido por salmuera. La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente evaporado, antes de que la muestra sin procesar haya sido purificada utilizando una cromatografía de columna (SiO2: Hexano a 50 % de EtOAc/Hexano) para obtener 118 mg del producto sólido blanco peracetilado (42 %) 1H RMN (300MHz, CDCb) 8: 5,40 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H-111), 5,35 (dd, 1H, Ja,2 = 10,6, J3,4 = 9,5, H-311), 5,23 (dd, 1H, J3,2 = 9,0, J3,4 = 9,0, H-31), 5,03 (dd, 1H, J4,a = 10,0, J4,5 = 10,0, H-411), 4,83 (dd, 1H, J2,1 = 3,9, J2,a = 10,3, H-211), 4,76 (dd, 1H, J2,1 = 8,0, J2,3 = 9,3, H-21), 4,60 (d, 1H, Jl,2 = 8,0, H-11), 4,42 (dd, 1H, H-61), 4,26-4,20 (m, 2H, H-61, H-611), 4,04-3,92 (m, 3H, H-41, H-511, H-611), 3,64 (ddd, 1H, H-51), 3,53 (m, 1H, CHO), 2,12 (s, 3H, OAc), 2,09 (s, 3H, OAc), 2,03 (s, 3H, OAc), 2,01 (s, 3H, OAc), 2,00 (s, 3H, OAc), 1,99 (s, 3H, OAc), 1,98 (s, 3H, OAc), 1,96­ 0,52 (m, 31H), 0,87 (d, 3H, J= 6,4, CH3), 0,86 (d, 3H, J= 1,5, CH3), 0,83 (d, 3H, J= 1,3, CH3), 0,76 (s, 3H, CH3), 0,63 (s, 3H, CH3).
a-D-Glucopiranosil-(1-4)-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo (101)
Glucósido 100 (118 mg) fue disuelto en THF/MeOH (1:1). NaOMe en MeOH (11 M, 30 j l ) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución fue neutralizada con una resina H+, filtrada y el solvente evaporado para proporcionar un rendimiento cuantitativo de un sólido blanquecino, el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo, sal de heptasodio (102)
Poliol 101 (99,5 mg, 140 jm ol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 7 ml). SO3-pirid¡na (3 equivalente/OH, 2,9 mmol, 467 mg) fue agregado y la solución fue agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada a 0°C y neutralizada con 5M NaOH (2,1 equivalente/SOa.piridina, 1,23 ml). La mezcla fue transferida a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporada y dializada (cartucho 2000 MWCO, Pierce) con agua purificada (5 l, el agua cambia cada 12 horas) durante 48 horas. La solución fue liofilizada y colocada en agua antes de ser purificada en un sistema de C18 RP-HPLC prep. (5 % a 95 % de acetonitrilo en agua durante 20 minutos). La CE fue utilizada para determinar la pureza de cada fracción recolectada después de la purificación por HPLC. Las fracciones con una pureza mayor a 90 % fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto como un sólido blanco (27 mg, 14 %). 1H RMN (400MHz, D2O) 8: 5,59 (d, 1H, J1,2 = 3,4, H-111), 5,09 (d, 1H, J1,2 = 5,0, H-11), 4,89 (m, 1H, H-3"), 4,73 (m, 1H, H-31), 4,61 (dd, 1H, H-2"), 4,53-4,42 (m, 3H, H-21, H-4", H-611), 4,37-4,14 (m, 6H, H-41, H-5", H-51, 3 x H-6), 3,85 (m, 1H, CHO), 2,08­ 0,64 (m, 46H).
Ejemplo 232,3,4,6-Tetra-O-benzoil-p-D-glucopiranosil-(1-4)-1,2,3,6-tetra-O-benzoil-D-glucopiranosa (103)
Celobiosa (1,0 g, 2,92 mmol) fue disuelto en piridina seca (20 ml) a 0°C. DMAP (cat.) fue agregada. Cloruro de benzoilo (2,5 equivalente, 58 mmol, 6,8 ml) fue agregado en forma de gotas y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La solución fue vertida sobre una mezcla de agua-hielo y DCM. La capa orgánica fue lavada con NaHCO3 (saturado) (x 7), salmuera, H2SO4 (5 %) (x 2), seguido por salmuera. La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente evaporado. El producto se pasó mediante un lecho de sílice corto para remover el cloruro de benzoilo restante y el solvente fue evaporado para obtener 740 mg (22 %) del producto sólido blanco, el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-p-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-d-glucopiranosilo (104)
Perbenzoato 103 (740 mg, 0,63 mmol) fue disuelto en piridina (5 ml). La solución fue enfriada a 0°C, antes de que dimetilamina (3,1 ml, 5,6 M en EtOH) fuese agregada. La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. Tolueno (20 ml) fue agregado y la solución fue lavada con salmuera, H2SO4 (5 %) (x 2), salmuera, NaHCO3 (saturado) y salmuera. La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente fue evaporado. El hemiacetal sin procesar fue colocado en DCM seco (5 ml) con tamices moleculares y carbonato de potasio (1,17 g). La solución fue enfriada a 0°C antes de que tricloacetonitrilo (782 pl) fuera agregado. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla fue filtrada y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SO 2: Tolueno: EtOAc (5:1) a 100 % de EtOAc) para obtener el producto como una espuma blanca (566 mg, 75 % durante 2 pasos) el cual fue reaccionado sin una caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-p-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo (105)
Tricloroacetamidato 104 (250 mg, 210 pmol), colestanol (2 equivalente, 163 mg) y tamices moleculares fueron colocados en DCM seco bajo Ar. La solución fue agitada durante 30 minutos a 0°C antes de que TMSOTf (solución de 0,4 M DMC, 0,5 equivalente, 260 pl) fuera agregado lentamente. Después de 30 minutos un equivalente adicional de TMSOTf (130 pl de una solución de 0,4M en DCM) fue agregado lentamente y la solución se dejó en agitación durante 20 minutos. Trietilamina (15 pl) fue agregado y la solución filtrada antes de que el solvente fuera evaporado. El producto sin procesar fue purificado por una cromatografía de columna (SiO2; Tolueno: EtOAc, 10:1 a 5:1) para obtener 208 mg del producto sólido blanco (69 %). 1H RMN (300MHz, CDCla) 8: 7,99-7,16 (m, 35H, Ar), 5,73 (m, 2H, H-31, H-311), 5,51 (dd, 1H, J2,1 = 7,9, J2,3 = 9,8, H-2"), 5,37 (m, 2H, H-411, H-21), 4,93 (d, 1H, J1,2= 7,9, H-111), 4,76 (d, 1H, J1,2 = 7,9, H-11), 4,59 (dd, 1H, H-6), 4,45 (dd, 1H, H-6), 4,19 (dd, 1H, J4,3 = 9,5, J4,5 = 9,5, H-41), 4,07 (dd, 1H, H-6), 3,84-3,79 (m, 2H, 2 x H-5), 3,72 (dd, 1H, H-6), 3,46 (m, 1H, CHO), 1,95-0,45 (m, 31H), 0,88 (d, 3H, J= 7,3, CH3), 0,86 (d, 3H, J= 1,4, CH3), 0,84 (d, 3H, J= 1,4, CH3), 0,62 (s, 3H, CH3), 0,60 (s, 3H, CH3).
p-D-Glucopiranosil-(1-4)-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo (106)
Glicósido 105 (152 mg) fue disuelto en THF/MeOH (1:1). NaOMe en MeOH (11M, 30 pl) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución fue neutralizada con una resina H+, filtrada y el solvente evaporado para proporcionar 23 mg (30 %) del sólido blanquecino, el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-p-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo, sal de heptasodio (107)
Poliol 106 (23 mg, 32 pmol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 1,6 ml). SO3-piridina (3 equivalente/OH, 672 pmol, 107 mg) fue agregado y la solución agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada hasta 0°C y neutralizada con 5M NaOH (2,1 equivalente/SO3-piridinda, 0,282 ml). La mezcla fue transferida a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporada y dializada (cartucho 2000 MWCO, Pierce) contra agua purificada (5 l, el agua se cambia cada 12 horas) durante 48 horas. La solución fue lioflizada y colocada en agua antes de ser purificada por un sistema de C18 RP-HPLC prep. (5 a 95 % de acetonitrilo en agua durante 20 minutos). La CE fue utilizada para determinar la pureza de cada fracción recolectada después de una purificación por HPLC. Las fracciones con una pureza mayor a 90 % fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el producto como un sólido blanco (11,6 mg, 25 %). 1H RMN (400MHz, D2O) 8: 5,06 (d, 1H, J1,2 = 6,3, H-111), 4,86 (d, 1H, J1,2 = 6,3, H-11), 4,72-4,66 (m, 2H, H-31, H-311), 4,57-4,48 (m, 2H, H-411, H-6), 4,40-4,35 (m, 3H, H-21, H-211, H-6), 4,30 (dd, 1H, H-6), 4,24-4,20 (m, 2H, H-41, H-6), 4,08 (m, 2H, H-51, H-5"), 3,62 (m, 1H, CHO), 2,00-0,67 (m, 31H), 0,93 (d, 3H, CH3), 0,87 (d, 3H, CH3), 0,86 (d, 3H, CH3), 0,83 (s, 3H, CH3), 0,68 (s, 3H, CH3).
Ejemplo 242,3,4,6-Tetra-O-benzoil-p-D-galactopiranosil-(1-4)-1,2,3,6-tetra-O-benzoil-D-glucopiranosa (108)
Lactosa (1,0 g, 2,92 mmol) fue disuelta en piridina seca (20 ml) a 0°C. DMAP (cat.) fue agregada. Cloruro de benzoilo (2,5 equivalente, 58 mmol, 6,8 ml) fue agregado en forma de gotas y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La solución fue vertida sobre una mezcla de agua-hielo y DCM. La capa orgánica fue lavada con NaHCO3 (saturado) (x 7), salmuera, H2SO4 (5 %), seguido por salmuera. La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente evaporado. El producto fue pasado mediante un lecho de sílice corto para remover el cloruro de benzoilo restante y el solvente fue evaporado para obtener 3,67 (cuantitativo) del producto sólido blanco, el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-p-D-galactopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-D-glucopiranosilo (109)
Perbenzoato 108 (500 mg, 0,43 mmol) fue disuelto en piridina (3,5 ml) La solución fue enfriada a 0°C, antes de que dimetilamina (2,1 ml, 5,6 M en EtOH) fuese agregado. La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. Tolueno (20 ml) fue agregado y la solución lavada con salmuera, H2SO4 (5)% (x2), salmuera, NaHCO3 (saturado) y salmuera. La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente fue evaporado. Al hemiacetal sin procesar se añadió DCM seco (5 ml) con tamices moleculares y carbonato de potasio (871 mg). La solución fue enfriada a 0°C antes de que tricloroacetonitrilo (582 |jl) fuese agregado. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla fue filtrada y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SO 2; Tolueno: EtOAc (5:1) a 100 % de EtOAc) para obtener el producto como una espuma blanca (152 mg, 29 % en dos pasos) el cual se hizo reaccionar sin una caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-p-D-galactopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo (110)
Tricloroacetamidato 109 (250 mg, 210 jmol), colestanol (2 equivalente, 163 mg) y los tamices moleculares fueron colocados en DCM seco bajo Ar. La solución fue agitada durante 30 minutos a 0°C antes de que TMSOFTf (solución 0,4 M en DCM, 0,5 equivalente, 260 j l) fuera agregado lentamente. Después de 30 minutos un equivalente adicional de TMSOFTf (130 j l de solución 0,4 M en DCM) fue agregado lentamente y la solución se dejó enfriar para agitarse por otros 20 minutos. Trietilamina (12 j l ) fue agregada y la solución filtrada antes de que el solvente fuera evaporado. El producto sin procesar fue purificado por una cromatografía de columna (SiO2; Tolueno: EtOAc, 15:1 a 7:1) para obtener 237 mg del producto sólido blanco (78 %). 1H RMN (400MHz, CDCb) 8: 8,02-7,11 (m, 35H, Ar), 5,77 (dd, 1H, Ja,2 = 9,6, Ja,4 = 9,6, H-31), 5,74-5,69 (m, 2H, H-211, H-411), 5,43-5,35 (m, 2H, H-21, H-311), 4,86 (d, 1H, J1,2 = 7,9, H-111), 4,78 (d, 1H, J1,2 = 7,9, H-11), 4,57 (dd, 1H, H-61), 4,47 (dd, 1H, H-61), 4,20 (dd, 1H, J4,3 = 9,6, J4,5 = 9,6, H-41), 3,89 (ddd, 1H, H-511), 3,83 (ddd, 1H, H-51), 3,75 (dd, 1H, H-611), 3,65 (dd, 1H, H-611), 3,49 (m, 1H, CHO), 1,94-0,47 (m, 31H), 0,88 (d, 3H, J= 6,5, CH3), 0,86 (d, 3H, J= 1,7, CH3), 0,84 (d, 3H, J= 1,9, CH3), 0,63 (s, 3H, CH3), 0,60 (s, 3H, CH3).
p-D-Galactopiranosil-(1-4)-p-glucopiranósido de 3'-colestanilo (111)
Glicósido 110 (231 mg) fue disuelto en THF/MeOH (1:1). NaOMe en MeOH (11M, 150 j l) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución fue neutralizada con una resina H+, filtrada y el solvente evaporado para proporcionar 61 mg (54 %) del sólido blanco, el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-p-D-galactopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-colestanilo, sal de heptasodio (112)
Poliol 111 (30 mg, 42 jm ol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 2,1 ml). SO3.piridina (3 equivalente/OH, 882 jmol, 140 mg) fue agregado y la solución fue agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada a 0°C y neutralizada con 5M NaOH (2,5 equivalente/SO3.piridina, 0,442 ml). La mezcla fue transferida a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporada y dializada (cartucho 2000 MWCO, Pierce) con agua purificada (5 l, el agua se cambia cada 12 horas) durante 48 horas. La solución fue lioflizada y fue añadida agua antes de ser purificada en un sistema de C18 RP-HPLC prep. (5 a 95 % de acetonitrilo en agua durante 20 minutos). La CE fue utilizada para determinar la pureza de cada fracción recolectada después de una purificación por HPLC. Las fracciones con una pureza mayor a 90 % fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el producto como un sólido blanquecino (13 mg, 22 %). 1H RMN (300 MHz, D2O) 8: 5,15 (d, 1H, H-1), 4,70 (d, 1H, H-1), 4,55-3,88 (m, 12H), 3,50 (m, 1H, CHO), 1,88-0,44 (m, 46H).
Ejemplo 25 1,2,3,4-Tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosa (113)
6-O-Tritil-1,2,3,4-tetra-O-benzoil-a-D-manopiranosa (5 g, 6,0 mmol), fue disuelto en MeOH. H2SO4 (concentrado) (150 j l) fue agregado lentamente, y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La solución fue vertida en agua-hielo (300 ml) y extraída con EtOAc (80 ml). La capa orgánica fue separada y lavada con salmuera (80 ml), seguido por NaHCO3 (saturado). La solución fue secada (Na2SO4), filtrada y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SiO2, Hex:EtOAc, 500:50 a 200:200) para obtener 1,79 g del producto sólido blanco (50 %). 1H RMN (300MHz, CDCla) 8: 8,20-8,12 (m, 4H, Ar), 8,02-7,98 (m, 2H, Ar), 7,87-7,84 (m, 2H, Ar), 7,70-7,26 (m, 27H, Ar), 6,63 (d, 1H, J1,2 = 2,1, H-1), 6,12 (dd, 1H, J3,2 = 3,3, J3,4 = 10,2, H-3), 6,02 (dd, 1H, J4,3 = 10,0, J4,5 = 10,0, H-4), 5,89 (dd, 1H, J2,1 = 1,8, J2,3 = 3,1, H-2), 4,25 (ddd, 1H, H-5), 3,90-3,76 (m, 2H, H-6).
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2.3.6- tri-O-benzoil-D-glucopiranosilo (114)
Perbenzoato de maltotriosa (400 mg) fue disuelto en THF (3 ml) a 0°C. Una solución saturada de NH3 en MeOH (6 ml) fue agregada y la solución agitada a 0°C durante 4 horas. La solución fue diluida con DCM, lavada con 0,5 M HCl frío, luego lavada con salmuera antes de que el solvente fuera evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SO 2: 10 a 50 % de EtOAc/Hexano) para obtener 211 mg del hemiacetal puro, al cual fue añadido DCM seco con tamices moleculares, carbonato de potasio (129 mg) y carbonato de cesio (45 mg). La mezcla fue agitada a 0°C, antes tricloroacetonitrilo (93 j l ) fue agregado. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y fue agitada durante 5 horas. La solución fue filtrada y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SiO2 Hexano a 50 % de EtOAc/Hexano) para obtener 149,2 mg del producto sólido blanco (36 %, dos pasos) el cual fue reaccionado sin una caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-Dglucopiranosil-(1-6)-1,2,3,4-tetra-O-benzoil-D-manopiranosa (115)
Tricloroacetimidato 114 (279 |jmol, 435 mg), 1,2,3,4-tetra-O-benzoil manopiranosa 113 (1,2 equivalente, 200 mg, 335 |jmol) y tamices moleculares fueron colocados en DCM y agitados a 0°C durante 30 minutos antes de que TMSOFt (1,1 equivalente, 68,2 mg, 56 j l en 600 j l DCM) fuera agregado lentamente en forma de gotas. La mezcla fue agitada a 0°C durante 90 minutos, antes de ser neutralizada con trietilamina (200 jl), filtrada y el solvente fue evaporado para obtener el producto sin procesar, el cual fue purificado por una cromatografía de columna ( S O Hexano a 50 % de EtOAc) para obtener 312,8 mg del producto sólido sin procesar (53 %) el cual fue reaccionado sin una caracterización adicional.
Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2.3.6- tri-O-benzoil-p-D-glucopiranosil-(1-6)-2,3,4-tri-O-benzoil-D-manopiranosilo (116)
Perbenzoato 115 (312,8 mg) fue disuelto en piridina (4,5 ml). Dimetilamina (3 ml, 5,6 M en EtOH) fue agregado. La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. DCM (10 ml) fue agregado y la solución fue lavada con salmuera, H2SO4 (5 %) (x 2), salmuera y NaHCO3 (saturado). La solución fue secada (Na2SO4) y el solvente evaporado. Al hemiacetal sin procesar fue añadido DCM seco con tamices moleculares, carbonato de potasio (600 mg) y carbonato de cesio (100 mg). La solución fue enfriada a 0°C antes de que tricloroacetonitrilo (200 j l) fuera agregado. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla fue filtrada y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna ( S O Hexano a 60 % de EtOAc/Hexano) para obtener el producto como un sólido blanco (153,9 mg, 48 % en dos pasos) el cual fue reaccionado sin una caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranosil-(1-6)-2,3,4-tri-O-benzoil-a-D-manopiranósido de 3'-colestanilo (117)
Tricloroacetimidato 116 (153,9 mg, 71,1 jmol), colestanol (3 equivalente, 83 mg) y tamices moleculares fueron colocados en DCM seco bajo Ar. La solución fue agitada a 0°C durante 15 minutos antes de que TMSOTf (1,1 equivalente, 17,4 j l en 200 j l DCM) fuera agregado lentamente. La solución se dejó agitar durante 90 minutos a 0°C. Trietilamina (20 j l ) fue agregada y el solvente fue evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SiO2: Hexano a 40 % de EtOAc /Hexano; cargado con tolueno) para obtener 71,4 mg del producto sólido blanco (42 %). 1H RMN (300MHz, CDCla) 8: 8,00-6,94 (m, 65H, Ar), 5,94 (dd, 1H, Ja,2 = 9,7, J3,4 = 9,7, H-3IV), 5,76 (dd, 1H, J3,2 = 10,0, J3,4 = 7,9, H-3m), 5,68 (dd, 1H, J3,2 = 3,3, J3,4 = 10,0, H-31), 5,59 (d, 1H, J1,2 = 3,8, H-1IV), 5,57-5,49 (m, 3H, H-311, H-4IV, H-41), 5,42 (d, 1H, J1,2 = 3,8, H-1111), 5,35 (dd, 1H, J2,1 = 1,8, J2,a = 3,3, H-21), 5,16 (dd, 1H, J2,1 = 7,4, J2,3 = 9,5, H-211), 5,12 (dd, 1H, J2,1 = 3,8, J2,3 = 10,5, H-2IV), 4,93 (dd, 1H, J2,1 = 3,8, J2,3 = 10,0, H-2111), 4,76 (dd, 1H, H-6""), 4,73 (d, 1H, J1,2 = 1,8, H-11), 4,71 (d, 1H, J1,2 = 7,7, H-111), 4,53 (dd, 1H, H-6"), 4,48-4,41 (m, 2H, H-611, H-6111), 4,32-4,16 (m, 6H, H-5IV, H-511, H-51, H-411, H-4m, H-6IV), 4,11-4,03 (m, 2H, H-61, H-6IV), 3,88 (ddd, 1H, H-5111), 3,60 (dd, 1H, H-61), 3,23 (m, 1H, CHO), 1,87-0,38 (m, 31H), 0,77 (d, 3H, J= 6,4, CH3), 0,74 (d, 3H, J= 1,3, CH3), 0,72 (d, 3H, J= 1,5, CH3), 0,61 (s, 3H, CH3), 0,51 (s, 3H, CH3).
a-D-Glucopiranosil-(1-4)-a-D-glucopiranosil-(1-4)-p-D-glucopiranosil-(1-6)-a-D-manopiranósido de 3'-colestanilo (118)
Glucósido 117 (80 mg) fue disuelto en MeOH/THF 1:1. NaOMe (200 j l de una solución 11M) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla fue neutralizada con resina acídica y la solución filtrada antes de que el solvente fuera evaporado para obtener el producto sólido blanco, el cual fue triturado con EtOAc y el solvente decantado (x3). El sólido fue secado bajo un vació para obtener una cantidad cuantitativa de producto sólido blanco, el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranosil-(1-6)-2,3,4-tri-O-sulfo-a-D-manopiranósido de 3'-colestanilo, sal tridecasodio (119)
Poliol 118 (72,8 mg, 70,2 jm ol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 3,5 ml), SO3.pirid¡na (3 equivalentes/OH, 2,7 mmol 463 mg) fue agregado y la solución agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada a 0°C y neutralizada con 5M NaOH (2,1 equivalentes/SOa.piridina, 1,15 ml). La mezcla fue transferida a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporado y dializado (cartucho 2000 MWCO, Pierce) con agua purificada (5 l, el agua se cambia cada 12 horas) durante 24 horas. La solución fue lioflizada y se añadió agua antes de ser purificada en un sistema de C18 RP-HPLC prep. (5 % a 95 % de acetonitrilo en agua durante 20 minutos). La CE fue utilizada para determinar la pureza de cada fracción recolectada después de la purificación por HPLC. Las fracciones con una pureza mayor a 90 % fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el producto como un sólido blanco (25 mg, 15 %). 1H r Mn (300MHz, D2O) 8: 5,70 (d, 1H, J1,2 = 3,5, H-1), 5,55 (d, 1H, H-1), 5,36 (m, 2H, H2 x H-1), 5,03-4,05 (m, 24H), 3,88 (m, 1H, CHO), 2,00­ 0,70 (m, 31H), 0,94 (d, 3H, J= 6,4, CH3), 0,89 (d, 3H, J= 1,3, CH3), 0,86 (s, 3H, CH3), 0,86 (d, 3H, J= 1,3, CH3), 0,70 (s, 3H, CH3).
Ejemplo 26 2,3,4-Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 3-azidopropilo (120)
Tricloroacetamida 114 (2 g, 1,3 mmol) 3-azidopropanol (2 equivalentes, 260 mg) y tamices moleculares fueron colocados en DCM (10 ml) y enfriados a 0°C. TMSOFt (1,1 equivalente., 318 mg, 260 j l ) fue agregado en forma de gotas (1/3 por vez cada 30 minutos, en forma de gotas, en 2,6 ml de DCM). La solución fue agitada durante 90 minutos a 0°C, antes de ser neutralizada con trietilamina (300 jl), filtrada, lavada con agua, secada (Na2SO4), y el solvente fue evaporado para proporcionar el producto sin procesar. Esto fue purificado por una cromatografía de columna (SiO2: tolueno a 5 % de EtOAc/tolueno, cargado con tolueno) para obtener 2,06 g del producto como un aceite transparente 120 (97 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8: 8,18 (m, 2H, Ar), 8,04 (m, 2H, Ar), 7,95 (m, 2H, Ar), 7,87 (m, 2H, Ar), 7,84 (m, 2H, Ar), 7,74-7,70 (m, 4H, Ar), 7,61-7,10 (m, 36H, Ar), 6,09 (t, 1H, Ja,2 = 10,2, Ja,4 = 10,2, H-3m), 5,92 (dd, 1H, J3,2 = 9,9, J3,4 = 8,2, H-311), 5,75 (d, 1H, J1,2 = 3,8, H-1111), 5,70-5,64 (m, 2H, H-31, H-4m), 5,60 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H-111), 5,30­ 5,23 (m, 2H, H-2m, H-21), 5,08 (dd, 1H, J2,1 = 3,8, J2,3 = 9,9, H-2"), 4,99 (dd, 1H, H-61), 4,75-4,59 (m, 3H, H2 x H-6", H-61), 4,74 (d, 1H, J1,2 = 7,5, H-11), 4,48-4,36 (m, 5H, H-5m, H-511, H-41, H-4", H-6m), 4,23 (dd, 1H, H-6m), 4,05 (ddd, 1H, H-51), 3,92 (m, 1H, CH2O), 3,57 (m, 1H, CH2O), 3,19 (m, 2H, CH2N3), 1,74 (m, 2H, CH2).
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo (121)
Glucósido 120 (2 g, 1,23 mmol) fue disuelto en THF (10 ml). Trifenilfosfina (3 equivalentes, 966 mg) fue agregada y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora bajo Ar. Agua (30 equivalentes, 665 j l) fue agregada y la solución fue agitada a 50°C durante 4,5 horas. El solvente fue evaporado y a la amina sin procesar se añadió d Cm . Cloruro de estearoilo (3 equivalentes, 1,18 g, 1,25 ml) fue agregado, seguido por trietilamina (3,1 equivalentes, 386 mg, 532 j l) y la solución fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado y el producto sin procesar fue purificado por una cromatografía de columna (SO 2: tolueno a 8:1 tolueno: EtOAc, cargado con tolueno) para obtener 1,65 g del producto como un aceite transparente 121 (72 %, en 2 pasos). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 8,16 (m, 2H, Ar), 8,05 (m, 2H, Ar), 7,95 (m, 2H, Ar), 7,86 (m, 2H, Ar), 7,82 (m, 2H, Ar), 7,74-7,70 (m, 4H, Ar), 7,63-7,10 (m, 36H, Ar), 6,10 (t, 1H, J3,2 = 10,2, J3,4 = 10,2, H-3m), 5,98-5,91 (m, 2H, H-311, NH), 5,76 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H-1111), 5,73-5,65 (m, 2H, H-3',H-4m), 5,61 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H-111), 5,29-5,20 (m, 2H, H-2m, H-21), 5,11-5,05 (m, 2H, H-211, H-61), 4,79 (dd, 1H, H-611), 4,71 (d, 1H, J1,2 = 7,5, H-11), 4,68-4,61 (m, 2H, H-611, H-61), 4,49-4,38 (m, 5H, H-5m, H-5", H-41, H-411, H-6111), 4,23 (dd, 1H, H-6111), 4,04 (ddd, 1H, H-51), 3,92 (m, 1H, CH2O), 3,57 (m, 1H, CH2O), 3,27 (m, 1H, CH2N), 3,13 (m, 1H, CH2N), 2,11 (t, 2H, CH2CO), 1,72 (m, 2H, CH2), 1,56 (m, 2H, CH2), 1,30-1,24 (m, 28H, 14 x CH2), 0,88 (t, 3H, CH3).
a-D-Glucopiranosil-(1-4)-a-D-glucopiranosil-(1-4)-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo (122)
Glucósido 121 (1,61 mg, 861 jm ol) fue disuelto en MeOH/THF 1:1 (40 ml). NaOMe (1 ml de una solución 6M) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 48 horas. La mezcla fue neutralizada con una resina acídica y la solución fue filtrada antes de que el solvente fuera evaporado para obtener el producto sólido blanco, el cual fue triturado con EtOAc y el solvente decantado (x 3). El sólido fue secado bajo vacío para obtener 651 mg del producto sólido blanco (91 %), el cual fue reaccionado sin una purificación o caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de decasodio (123)
Poliol 122 (200 mg, 242 jm ol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 12,1 ml). SO3-piridina (3 equivalentes/OH, 7,26 mmol, 1,16 g) fue agregado y la solución fue agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada a 0°C y neutralizada con 5M NaOH (3 equivalentes/SO3.piridina, 4,4 ml). La mezcla fue enfriada a -20°C durante 1 hora. El sobrenadante fue decantado y desechado. El precipitado fue transferido a un matraz de fondo redondo grande con agua, evaporado y dializado (cartucho 2000 MWCo , Pierce) contra agua purificada (5 l, que contiene 1 ml de 1,7 M NH4HCO3) durante 72 horas. La solución fue liofilizada para proporcionar el producto como un sólido amarillo (177 mg, 40 %). 1H RMN (D2O, 400 MHz) 85,69 (d, 1H, J1,2 = 3,4, H-1), 5,59 (d, 1H, J1,2 = 2,7, H-1), 4,99-4,92 (m, 2H), 4,85-4,08 (m, 17H), 4,01 (ddd, 1H, CH2O), 3,75 (ddd, 1H, CH2O), 3,32 (t, 2H, J= 6,7, CH2N), 2,27 (t, 2H, CH2CO), 1,87 (m, 2H, CH2), 1,61 (m, 2H, CH2), 1,37-1,29 (m, 28H, CH2), 0,91 (t, 3H, CH3).
Ejemplo 27. Tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-D-glucopiranosilo (124)
Perbenzoato de maltotetraosa 66 (12,4 g) fue disuelto en piridina (47 ml) a 0°C. Dimetilamina (5,6 M en EtOH) (28,3 ml) fue agregada y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución fue vertida sobre 0,5 M HCl enfriado con hielo y el precipitado resultante fue filtrado y lavado con agua antes de ser secado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SO 2, 5 a 70 % de EtOAc/Hexano) para obtener 6,7 g de hemiacetal puro, al cual fue añadido DCM seco con tamices moleculares y carbonato de potasio (6,6 g). La mezcla fue agitada a 0°C, antes fue agregado tricloroacetonitrilo (4,4 ml). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y fue agitada durante 2 horas. La solución fue filtrada y el solvente fue evaporado. El producto sin procesar (7,2 g, 57 %) fue reaccionado sin una purificación o caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 3-azidopropilo (125)
A tricloroacetamida 124 (1,476 g, 0,682 mmol), 3-azidopropanol (2 equivalentes, 137 mg) y tamices moleculares fue añadido DCM (10 ml) y enfriados a 0°C. TMSOTf (0,5 equivalente, 62 j l en 850 j l DCM) fue agregado en forma de gotas. La solución fue agitada durante 90 minutos a 0°C, antes de ser neutralizada con trietilamina (300 jl), filtrada, lavada con agua, secada (Na2SO4) y el solvente fue evaporado para proporcionar el producto sin procesar. Este fue purificado por una cromatografía de columna (SO 2: tolueno a 24:3 tolueno: EtOAc, cargado con tolueno) para obtener 600 mg del producto sólido blanco (46 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 8,25-7,05 (m, 35H, Ar), 6,12 (dd, 1H, Ja,2 = 9,9, J3,4 = 9,9, H-3IV), 6,00 (dd, 1H, H-3), 5,87 (dd, 1H, H-3), 5,76 (d, 1H, J1,2 = 3,7, H-1IV), 5,71-5,64 (m, 3H, H-1, H-31, H-4IV), 5,60 (d, 1H, J1,2 = 3,7, H-1), 5,29-5,23 (m, 2H, H-21, H-2IV), 5,14-5,05 (m, 2H, 2 x H-2), 5,01 (dd, 1H, H-6), 4,85 (dd, 1H, H-6), 4,76-4,69 (m, 2H, 2 x H-6), 4,75 (d, 1H, J1,2 = 7,5, H-11), 4,59 (m, 2H, 2 x H-6), 4,47-4,33 (m, 7H, 3 x H-4, 3 x H-5, H-6), 4,19 (dd, 1H, H-6), 4,05 (ddd, 1H, H-51), 3,91 (m, 1H, CH2O), 3,57 (m, 1H, CH2O), 3,19 (m, 2H, CH2N), 1,74 (m, 2H, CH2).
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-2)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo (126)
Glicósido 125 (660 mg, 0,314 mmol) fue disuelto en ACN (21 ml). Trifenilfosfina (3 equivalentes, 247 mg) fue agregada y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora bajo Ar. Agua (30 equivalentes, 169 j l) fue agregada y la solución fue agitada a 50°C durante 7 horas. El solvente fue evaporado y a la amina sin procesar fue añadido DCM. Cloruro de estearilo (3 equivalentes, 317 j l) fue agregado, seguido por trietilamina (3 equivalente, 131 j l ) y la solución fue agitada durante 3 días a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado y el producto sin procesar fue purificado mediante una cromatografía de columna (SiO2: tolueno a 15:3 tolueno: EtOAc, cargado con tolueno) para obtener 403 mg del producto como un aceite transparente. (55 % , en dos pasos). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 8,21­ 7,05 (m, 35H, Ar), 6,09 (dd, 1H, J3;2 = 9,8, J3,4 = 9,8, H-3IV), 6,02 (t, 1H, NH), 5,97 (dd, 1H, H-3), 5,90 (dd, 1H, H-6), 5,86 (dd, 1H, H-3), 5,75 (d, 1H, J1,2 = 3,9, H-1IV), 5,71-5,63 (m, 3H, H-1, H-31, H-4IV), 5,59 (d, 1H, J1,2 = 3,9, H-1), 5,27­ 5,18 (m, 2H, H-21, H-2IV), 5,12-5,04 (m, 3H, H-61, 2 x H-2), 4,72-4,66 (m, 2H, 2 x H-6), 4,70 (d, 1H, J1,2 = 7,8, H-11), 4,58 (m, 2H, H2 x H-6), 4,45-4,31 (m, 6H, 3 x H-4, 3 x H-5, H-6), 4,17 (dd, 1H, H-6), 4,02 (ddd, 1H, H-51), 3,91 (m, 1H, CH2O), 3,56 (m, 1H, CH2O), 3,28 (m, 1H, CH2N), 3,13 (m, 1H, CH2N), 2,13 (m, 2H, CH2CO), 1,76-1,58 (m, 4H, CH2), 1,26-1,24 (m, 28H, CH2), 0,88 (t, 3H, CHa).
a-D-Glucopiranosil-(1-4)-a-D-glucopiranosil-(1-4)-a-D-glucopiranosil-(1-4)-p-}D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo (127)
Glicósido 126 (377 mg, 161 jm ol) fue disuelto en MeOH/THF 1:1 (10 ml). NaOMe (60 j l de una solución 11M) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla fue neutralizada con una resina acídica y la solución fue filtrada antes de que el solvente fuera evaporado para obtener el producto sólido blanco, el cual fue triturado con EtOAc y el solvente decantado (x3). El sólido fue secado bajo vacío para obtener 159 mg del producto sólido blanco (cuantitativo), el cual fue reaccionado sin una purificación adicional o caracterización.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-sulfo-O-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de tridecasodio (128)
Poliol 127 (159 mg, 161 jm ol) fue disuelto en DMF (0,02 M, 8,1 ml). SO3.pirid¡na (3 equivalentes/OH, 6,3 mmol, 1,0 g) fue agregado y la solución fue agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada hasta 0°C y neutralizada con 5M NaOH (3 equivalentes/SOa.piridina, 3,8 ml). La mezcla fue enfriada a -20°C durante 1 hora. El sobrenadante fue decantado y descartado. El precipitado fue transferido a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporado y dializado (cartucho 2000 MWCO, Pierce) con agua purificada (5 l, que contiene 1 ml de 1,7 M NH4HCO3) durante 72 horas. La solución fue lioflizada para proporcionar el producto como un sólido amarillo (227 mg, 61 %). H RMN (D2O, 400 MHz) 85,89 (d, 1H, J1,2= 3,4, H-1), 5,72 (d, 1H, J1,2 = 2,7, H-1), 5,67 (d, 1H, H-1), 5,06-4,09 (m, 18H), 4,01 (ddd, 1H, CH2O), 3,75 (ddd, 1H, CH2O), 3,33 (t, 2H, J= 6,1, CH2N), 2,28 (t, 2H, J= 7,4, CH2CO), 1,87 (m, 2H, CH2), 1,62 (m, 2H, CH2), 1,37-1,29 (m, 28H, CH2), 0,91 (t, 3H, CH3).
Ejemplo 282-(Colestan-3-iloxi)acetato de tere-butilo (129)
Colestanol (0,662 g, 1,703 mmol) fue disuelto en tolueno (13 ml). Terc-butóxido de potasio (573 mg, 5,11 mmol) fue agregado en una parte. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. Bromoacetato de terc-butilo (503 jl, 3,406 mmol) fue agregado en forma de gotas, y la mezcla fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. Tolueno (20 ml) fue agregado y la solución fue lavada con salmuera (50 ml). La fase acuosa fue extraída con tolueno (30 ml) antes de que todas las fases orgánicas fuesen combinadas, secadas (Na2SO4) y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SO 2: Hexano:EtOAc, 200:1 a 200:20) para obtener el producto sólido blanco (0,65 g, 76 % de rendimiento). H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 3,98 (s, 2H, CH2O), 3,30 (m, 1H, CHO), 1,97-0,56 (m, 31H), 1,46 (s, 9H, CH3), 0,89 (d, 3H, J= 6,1, CH3), 0,85 (d, 3H, J= 2,0, CH3), 0,84 (d, 3H, J= 1,4, CH3), 0,79 (s, 3H, CH3), 0,64 (s, 3H, CH3).
Ácido 2-(Colestan-3-iloxi)acético (130)
A terc-butil 2-(colestan-3-iloxi)acetato 129 (634 mg, 1,26 mmol) fue añadido DCM (4 ml) antes de que TFA (1 ml) fuera agregado. La solución fue agitada a temperatura ambiente durante 90 minutos. El solvente fue evaporado y el residuo purificado utilizando un lecho de sílice corto (SO 2: DCM a 100:5 DCM:MeOH) antes de ser recristalizado a partir del hexano para obtener 439 mg del producto sólido blanco (78 %). 1H RMN (400 Mh z , CDCb) 8: 4,25 (s, 2H, CH2O), 3,37 (m, 1H, CHO), 1,99-0,58 (m, 31H), 0,89 (d, 3H, J= 6,6, CH3), 0,85 (d, 3H, J= 2,0, CH3), 0,84 (d, 3H, J= 1,4, CH3), 0,80 (s, 3H, CH3), 0,64 (s, 3H, CH3).
Isotiocianato de 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranosilo (131)
A bromuro 84 (1,8 g, 1,12 mmol), KSCN (3 equivalentes, 326 mg), tamices moleculares y Bu4NI (Cat.) fue añadido acetonitrilo seco y agitado a 75°C durante la noche. El solvente fue evaporado y el residuo fue tomado en DCM y lavado con NaHCO3 (sat) antes de ser secado (Na2SO4) y el solvente evaporado. El producto sin procesar fue purificado utilizando una cromatografía de columna (SO 2: Hexano a 35 % de EtOAc/Hexano, cargado con tolueno) para obtener 1,15 g del producto sólido blanco (65 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 8,23-7,12 (m, 5OH, Ar), 6,16 (dd, 1H, J3,2 = 9,6, J3,4 = 9,6, H-3m), 5,96 (dd, 1H, J3,2 = 9,6, J3,4 = 8,2, H-3"), 5,81 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H- lm), 5,75-5,68 (m, 2H, H-31, H-4m), 5,65 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H-111), 5,40 (dd, 1H, J2,1 = 8,2, J2,3 = 8,2, H-21), 5,32 (dd, 1H, J2,1 = 4,1, J2,3 = 10,2, H-2111), 5,28 (d, 1H, J1,2 = 8,2, H-11), 5,13 (dd, 1H, J2,1 = 4,1, J2,3 = 10,2, H-211), 5,00 (dd, 1H, H-61), 4,77 (dd, 1H, H-611), 4,72-4,65 (m, 2H, H-61, H-6"), 4,53-4,41 (m, 5H, H-511, H-5m, H-41, H-4", H-6m), 4,30 (dd, 1H, H-6m), 4,13 (ddd, 1H, H-51).
2.3.4.6- Tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido de 2-colestan-3-iloxi)acetamido (132)
Isotiocianato 131 (0,5 g, 215 pmol) y ácido 2-(colestan-3-iloxi)acético 130 (141 mg, 315 pmol) fueron disueltos en tolueno (6,3 ml). Trietilamina (20 pl) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 4 días. El solvente fue evaporado y el residuo purificado por una cromatografía de columna (SiO2: Tolueno a 10 % de EtOAc/tolueno) para obtener 358 mg del producto sólido blanco (58 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 8,23-7,09 (m, 5OH, Ar), 7,50 (d, 1H, NH), 6,09 (dd, 1H, J3,2 = 10,2, J3,4 = 9,9, H-3m), 5,91 (dd, 1H, J3,2 = 9,9, J3,4 = 7,8, H-311), 5,82 (dd, 1H, J3,2 = 9,5, J3,4 = 9,2, H-31), 5,74 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H-1111), 5,67 (dd, 1H, J4,3 = 9,9, J4,5 = 9,9, H-4m), 5,60 (d, 1H, J1,2 = 4,1, H-1"), 5,51 (dd, 1H, J1,2 = 9,5, J1;nh = 8,5, H-11), 5,27 (dd, lH, J2,1 = 4,1, J2,3 = 10,6, H-2m), 5,24 (dd, 1H, J2,1 = 9,5, J2,3 = 9,5, H-21), 5,08 (dd, 1H, J2,1 = 4,1, J2,3 = 10,2, H-211), 4,92 (dd, 1H, H-6), 4,70-4,64 (m, 2H, H2 x H-6), 4,56 (dd, 1H, H-6), 4,46-4,31 (m, 5H, H-5111, H-41, H-411, 2 x H-6), 4,22 (ddd, 1H, H-511), 4,15 (ddd, 1H, H-51), 3,95 (dd, 1H, CH2O), 3,73 (dd, 1H, CH2O), 3,11 (m, 1H, CHO), 1,47-0,50 (31H), 0,90 (d, 3H, J= 6,8, CH3), 0,86 (d, 3H, J= 6,8, CH3), 0,86 (d, 3H, J= 6,8, CH3), 0,77 (s, 3H, CH3), 0,64 (s, 3H, CH3).
a-D-Glucopiranosil-(1-4)-a-D-glucopiranosil-(1-4)-p-D-glucopiranósido de 2-(colestan-3-iloxil)acetamido (133)
Amida 132 (345 mg, 175 pmol) fue disuelta en MeOH/THF 1:1 (16 ml). NaOMe (500 pl de una solución 6M) fue agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla fue neutralizada con una resina acídica y la solución filtrada antes de que el solvente fuera evaporado para obtener el producto sólido blanco, el cual fue triturado con EtOAc y el solvente decantado (x3). El sólido fue secado bajo vacío para obtener 124 mg del producto sólido blanco (76 %), el cual fue reaccionado sin una purificación o caracterización adicional.
2.3.4.6- Tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 2-(colestan-3-iloxi)acetamido, sal de decasodio (134)
Poliol 133 (118 mg, 127 pmol) fue disuelto en DMF (0,04 M, 4,4 ml). SO3.piridinda (3 equivalentes/OH, 5,3 mmol, 838 mg) fue agregado y la solución agitada a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada a 0°C y neutralizada con 5M NaOH (3 equivalente/SO3.piridina). La mezcla fue enfriada a -20°C durante 1 hora. El sobrenadante fue decantado y descartado. El precipitado fue transferido a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporado y dializado (cartucho 2000 Mw Co , Pierce) con agua purificada (5 l, que contiene 1 ml de 1,7 M NH4HCO3) durante 72 horas. La solución fue liofilizada para proporcionar el producto como una sólido amarillo (195 mg, 79 %). 1H RMN (D2O, 400MHz) 8: 5,67 (d, 1H, J1,2 = 2,9, H-1), 5,57 (d, 1H, J1,2 = 1,2, H-1), 5,35 (d, 1H, J1,2 = 7,3, H-11), 5,06-4,06 (m, 20H), 3,48 (m, 1H, CHO), 2,07-0,68 (m, 46H).
Ejemplo 29. 3-(Colestan-3-iloxi)propanonitrilo (135)
Colestanol (1,554 g, 3,998 mmol) fue disuelto en DCM (6 ml). A esta solución fue agregado KOH (40 % p/p en agua, 1,2 ml) y acetonitrilo (0,8 ml) seguido por 18-corona-6 (104 mg). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La capa orgánica fue lavada con salmuera y secada (Na2SO4) antes de que el solvente fuera evaporado. El residuo fue recristalizado a partir de MeOH caliente para obtener el producto puro como un sólido cristalino sin color (1,42 g, 80 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 3,68 (t, 2H, CH2O), 3,29 (m, 1H, CHO), 2,57 (t, 2H, CH2CN), 1,98-0,58 (m, 31H), 0,89 (d, 3H, J= 6,6, CH3), 0,87 (d, 3H, J= 1,8, CH3), 0,85 (d, 3H, J= 2,0, CH3), 0,79 (s, 3H, CH3), 0,64 (s, 3H, CH3).
1-Amino-3-(colestan-3-iloxi)-propano (136)
A 3-(colestan-3-iloxi)propanonitrilo 135 (442 mg, 1 mmol) fue añadido una mezcla de tolueno (1 ml), cloroformo (1,5 ml) EtOH (1 ml) y HCl concentrado (200 jl). Hidrato de óxido de platino (46 mg) fue agregado. La mezcla fue agitada bajo nitrógeno (80 psi) a temperatura ambiente durante 48 horas. El solvente fue evaporado y al residuo fue añadido DCM (40 ml) y NaHcO3 (saturado) (40 ml). La fase orgánico fue separada y lavada con NaHCO3 (saturado) (30 ml), seguido por salmuera (20 ml), antes de ser secada (Na2SO4) y el solvente evaporado para obtener el producto como una espuma blanca, el cual fue reaccionado sin una purificación o caracterización adicional.
Tiourea de 1-[(colestan-3-iloxi)propil]-3-[2,3,4,6-tetra-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tril-O-benzoil-p-D-glucopiranósido] (137)
A 3-(colestan-3-iloxi)propan-1-amina 136 (0,5 mmol) fue añadido tolueno (3 ml). Isotiocianato 131 (403 mg, 0,254 mmol) fue agregado. La solución fue agitada a temperatura ambiente durante 3 días. El solvente fue evaporado y el producto sin procesar purificado utilizando una cromatografía de columna (SiO2; tolueno a 180:30 tolueno: EtOAc) para obtener el producto puro como un sólido blanco (355 mg, 35 %). H RMN (400 MHz, CDCb) 8: 8,23-7,09 (m, 5OH, Ar), 6,90 (dd, 1H, J= 4,9, J= 4,9, NH), 6,09 (dd, 1H, J3,2 = 10,2, J3,4 = 9,8, H-3m), 5,89 (m, 2H, H-3", H-31), 5,74 (d, 1H, J1,2 = 3,9, H-1111), 5,67 (dd, 1H, J4,3 = 9,8, J4,5 = 9,8, H-4m), 5,58 (d, 1H, J1,2 = 3,9, H-111), 5,28 (dd, 1H, J2,1 = 3,9, J2,3 = 10,7, H-2111), 5,19 (dd, 1H, J2;1 = 9,3, J2;3 = 9,3, H-21), 5,09 (dd, 1H, J2;1 = 3,9, J2,3 = 10,2, H-2"), 4,92 (dd, 1H, H-6), 4,70 (dd, 1H, H-6), 4,67 (dd, 1H, H-6), 4,58 (dd, 1H, H-6), 4,46-4,34 (m, 5H), 4,27-4,18 (m, 2H), 3,50 (dd, 2H, CH2), 3,18 (m, 1H, CHO), 1,98-0,56 (35H), 0,90 (d, 3H, J= 6,8, CH3), 0,87 (d, 3H, J= 6,8, CH3), 0,86 (d, 3H, J= 6,8, CH3), 0,80 (s, 3H, CH3), 0,64 (s, 3H, CH3).
Tiourea de 1-[(colestan-3-iloxi)propil]-3-[a-D-glucopiranosil-(1-4)-a-d-glucopiranosil-(1-4)-p-D-glucopiranósido] (138)
Tiourea 137 (345 mg, 171 jm ol) fue disuelto en MeOH/THF 1:1 (16 ml). NaOMe (500 j l de un solución 6M) fu agregado y la solución fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla fue neutralizada con una resina acídica y la solución fue filtrada antes de que el solvente fuera evaporado para obtener el producto sólido blanco, el cual fue triturado con EtOAc y el solvente decantado (x3). El sólido fue secado bajo vacío para obtener 169 mg del producto sólido blanco (cuantitativo) el cual fue reaccionado sin una purificación o caracterización adicional.
Tiourea de 1-[(colestan-3-iloxi)propil-3-[2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopriansil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido], sal de decasodio (139)
Poliol 138 (169 mg, 171 jm ol) fue disuelto en DMF (0,04 M, 4,4 ml). SO3.piridina (3 equivalentes/OH, 5,13 mmol, 816 mg) fue agregado y el sodio agitado a 60°C durante la noche. La solución fue enfriada a 0° y neutralizada con 5M NaOH (3 equivalentes/SO3.piridina). La mezcla fue enfriada a -20°C durante 1 hora. El sobrenadante fue decantado y descartado. El precipitado fue transferido a un matraz con fondo redondo grande con agua, evaporado y dializado (cartucho 2000 MWCO, Pierce) contra agua purificada (5 l, que contiene 1 ml de 1,7 M NH4HCO3) durante 72 horas. La solución fue liofilizada y se añadió agua antes de ser purificada en un sistema de C18 RP-HPLC prep. (5 a 95 % de acetonitrilo en agua durante 20 minutos). La CE fue utilizada para determinar la pureza de cada fracción recolectada después de una purificación por HPLC. Las fracciones con una pureza mayor al 90 % fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el producto como un sólido blanco (7 mg, 2 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 8: 6,00-5,56 (m, 3H, 3 x H-1), 4,98-3,14 (m, 21H), 2,04-0,72 (m, 50H).
Ejemplo 302,3,4,6-Tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1-4)-((1-piridinio-il)-2,3,5,6-tetra-O-sulfo-D-glucósido de 3'-colestanilo, sal de tridecasodio (140)
El poliol 64 (3,552) fue disuelto en DMF seco (46 ml) y lavado y el complejo de SO3.piridina secado (21,24 g) agregado y la mezcla fue agitada durante 16 horas a 60°C. La mezcla de reacción fue enfriada a 0°C durante 10 minutos, luego neutralizada al agregar una solución de NaOH acuoso helado (5 M, 54 ml) a 0°C en una parte (un pH de 12). La suspensión fue agitada durante 15 minutos a 0°C, diluida con agua (10 ml) y concentrada bajo vacío a 40°C. Un polvo amarillo pálido fue conseguido, el cual fue disuelto en agua (10 ml) obteniendo una solución con un pH de 11,5. La solución fue ajustada a un pH de 12,5 al agregar una solución acuosa de NaOH (5 M, 5 gotas) y dializada con agua (4 l) utilizando cassettes 4 x Slide-A-Lyzer® (2000 MWCO, 4 a 12 ml) durante 16 horas a temperatura ambiente. La diálisis con agua (4 l) fue continuado a 0°C durante 3 días, donde el agua fue cambiada cada 24 horas, así como una solución acuosa de NH4HCO3 (3 M, 0,6 ml) fue agregada al agua para ajustar el pH a ~6,0 a 6,5. La solución desalada fue entonces liofilizada para proporcionar una mezcla de, principalmente 65 y 140, la cual fue purificada en un sistema de C18 RP-HPLC prep. (5 a 30 % de acetonitrilo en agua durante 20 minutos). La CE fue utilizada para determinar la pureza de cada fracción recolectada después de una purificación por HPLC. Las fracciones con una pureza mayor al 90 % fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el producto como un sólido blanco (30 mg, purificada a partir de aproximadamente 1 g del material sin procesar). 1H r Mn (400 MHz, D2O) 8: 9,09 (m, 2h , Ar), 8,39 (m, 1H, Ar), 7,93 (m, 2H, Ar), 6,40 (d, 1H, H-11), 5,56 (d, 1H, J1,2 = 3,4, H-111), 5,54 (d, 1H, J1,2 = 2,3, H-1111), 5,45 (d, 1H, J1,2 = 3,3, H-lIV), 5,00 (ddd, 1H, H-51), 4,86 (dd, 1H, H-311), 4,79 (dd, 1H, H-3m), 4,77 (dd, 1H, H-21), 4,77 (dd, 1H, H-41), 4,64 (dd, 1H, H-2m), 4,58 (dd, 1H, H-3IV), 4,49 (dd, 1H, H-31), 4,40 (m, 1H, H-61), 4,32 (m, 1H, H-61), 4,31 (dd, 1H, H-4IV), 4,29 (dd, 1H, H-211), 4,29 (dd, 1H, H-2IV), 4,20-4,10 (m, 6H, H6 x H-6), 4,13 (ddd, 1H, H-511), 4,12 (dd, 1H, H-411), 4,10 (dd, 1H, H-4111), 4,07 (ddd, 1H, H-5""), 3,81 (ddd, 1H, H-5IV), 2,00-0,67 (m, 31H), 0,93 (d, 3H, CHa), 0,87 (d, 3H, CHa), 0,86 (d, 3H, CHa), 0,83 (s, 3H, CHa), 0,68 (s, 3H, CHa).
Ejemplo a i. 2,a,4,6-Tetra-O-acetil-D-glucopiranósido de 8-pentadecanilo (141)
A una solución de peracetato de D-glucosa (250 mg, 640 |jmol) en DCE (1 ml) fue agregado 8-pentadecanol (220 mg, 960 jmol). B F a .O ^t^ (1a4 jl, 1,1 mmol) fue agregado y la mezcla agitada a temperatura ambiente durante la noche antes de ser vertida sobre un lecho de sílice corto y eluida con EtOAc. El solvente fue evaporado antes de que el material sin procesar fuera purificado por una cromatografía de columna (SiO2, cargada con DCM, elución con DCM (100 ml), luego 20 % de EtOAc/Hexano a a5 % de EtOAc/Hexano) para proporcionar el glicósido 141 como un sólido blanco (179 mg, 50 %). 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 8: 5,19 (dd, 1H, J2,a = 9,5, Ja,4 = 0,0, H-a), 5,06 (dd, 1H, J4,5 = 9,7, H-4), 4,96 (dd, 1H, J1,2 = 8,0, J2,a = 9,6, H-2), 4,52 (d, 1H, H-1), 4,21 (dd, 1H, Ja,6b = 5,2, J6a,6b = 12,1, H-6b), 4,12 (dd, 1H, Ja,6a = 2,6, H-6a), a,66 (ddd, 1H, J4,5 = 10,0, H-5), a,5a (m, 1H, CH2CHOCH2), 2,07 (s, aH, OCOCHa), 2,02 (s, 6H, OCOCHa), 2,00 (s, aH, OCOCHa), 1,60-1,20 (m, ~24H, CH2), 0,88 (t, aH, J= 7,0, CHa), 0,87 (t, aH, J= 7,0, CHa).
D-glucopiranósido de 8-pentadecanilo (142)
El glicósido 141 (70 mg) fue desacetilado de acuerdo con un procedimiento general para proporcionar el poliol 142 (59 mg, cuantitativo) como un sólido blanco que fue reaccionado sin una purificación o caracterización adicional.
2,a,4,6-tetra-O-sulfo-D-glucopiranósido de 8-pentadecanilo, sal de tetrasodio (14a)
Poliol 142 (50 mg) fue disuelto en DMF (5 ml). SOa.piridina (250 mg) fue agregado y la solución agitada a temperatura ambiente durante la noche. La solución fue enfriada a 0°C y neutralizada con 2M NaOH a un pH de 10. La solución fue evaporada hasta la sequedad. El residuo fue disuelto en 4 ml de agua y purificado por una cromatografía de columna Bio-Gel P-2 (eluida con 0,1 M NH4HCOa, a 196 ml/h, 6 minutos por recolección). Las fracciones del producto fueron identificadas por MBT y CE. La liofilización proporcionó el producto 14a como un polvo amarillo pálido (aa mg, a2 %). 1H RMN (400 MHz, D2O) 8: 4,79 (d, 1H, J1,2 = 5^, H-1), 4,67 (br, 1H), 4,45 (br, 1H, H-2), 4,28 (m, 2H), 4,28 (m, 2H), a,68 (s, 1H), 1,52-1^8 (m, 4H), 1,a2-1,10 (m, ~24H), 0,76-0,71 (m, 6H).
Prueba Biológica de los Compuestos
Prueba de Unión al Factor de Crecimiento
Las afinidades de unión de los compuestos para los factores de crecimiento FGF-1, FGF-2 y VEGF fueron medidas utilizando un análisis de afinidad de la solución basado en una resonancia de plasmones de superficie (SPR).9 Los chips de sensor recubiertos con heparina utilizados para esta prueba fueron preparados mediante la inmovilización de heparina-BSA biotinilada en un chip de sensor recubierto con estreptavidina, o mediante un acoplamiento de aldehido que utiliza ya sea un ácido adípico dehidrazida o 1,4-diaminobutano.9 Para cada medición Kd, las soluciones se prepararon de forma tal que contuvieran una concentración fija de proteína y concentraciones varias del ligando en un amortiguador. Los ligandos que se unieron a FGF-1 y VEGF fueron medidos en un amortiguador HBS-EP (10 mM HEPES, pH de 7,4, 150 mM NaCl, a,0 mM EDTA y 0,005 % (v/v) polisorbato 20), mientras que la unión a FGF-2 fue medida en un amortiguador HBS-EP que contenía 0,a M NaCl. Antes de la inyección, las muestras fueron mantenidas a 4°C para maximizar la estabilidad de la proteína. Para cada mezcla de la prueba, 50 a 200 j l de la solución fueron inyectados a 5 a 40 jl/m in y la respuesta de unión relativa medida. Todos los experimentos de unión a la superficie fueron llevados a cabo a 25°C. La superficie fue regenerada por la inyección de 40 j l de 4M NaCl a 40 jl/min, seguido por la inyección de 40 j l de amortiguador a 40 jl/min.
Los datos del sensograma fueron analizados utilizando el software de BIAevaluation (BIAcore) y los valores Kd determinados tal y como fue descrito previamente.9 Donde los valores Kd fueron medidos por duplicado, los valores representan el promedio de las mediciones por duplicado. Los resultados se presentan en la Tabla 1.
Prueba de Inhibición de Heparanasa
La actividad enzimática de la heparanasa puede ser detectada al medir la escisión del sustrato fondaparinux. a940 El disacárido reductor recientemente formado puede ser detectado al reaccionarlo con la sal mono-tetrazolio WST-1 (Ausprep Pty Ltd, Melbourne, Australia) para producir un color azul que puede ser medido con un lector de microplaca a 58a nm. En presencia de un inhibidor, la actividad catalítica de la heparanasa es reducida, y la cantidad de disacárido producido y la densidad óptica de la solución son ambas disminuidas. El porcentaje de inhibición presente y la IC50 del inhibidor son determinados a partir de las mediciones de la densidad óptica (OD) sobre un rango de concentraciones de inhibidor.
Las pruebas fueron llevadas a cabo en un amortiguador de acetato de sodio 40 mM, pH de 5,0, de la siguiente forma. Fondaparinux (100 jM ) y varias concentraciones del inhibidor y del amortiguador para proporcionar un volumen final de 100 j l fueron mezcladas en placas con 96 pocillos. (Costar EIZ/RIA, Corning) recubiertas previamente con BSA. La heparanasa humana recombinante purificada (2,55 nM) fue luego agregada para comenzar la prueba. La placa fue
a6
incubada a 37°C durante 24 horas y la prueba fue detenida mediante la adición de una solución WST-1 (100 |jl). Un color azul fue desarrollado por la incubación de las placas a 60°C durante 60 minutos. La OD fue determinada a 583 nm con un lector de microplaca (Fluostar) y cuantificado utilizando una curva estándar construida con D-galactosa azúcar reductor estándar. El valor IC50 para cada compuesto fue evaluado y convertido a K1 (constante de inhibición) utilizando la expresión
Figure imgf000037_0001
La Km (concentración del sustrato que lleva a una velocidad media-máxima) para fondaparinux fue determinada como de 33 ± 6 jM . Los resultados se presentan en la Tabla 1.
Prueba de Proliferación de Células Endoteliates Inducida por el Factor de Crecimiento
Cultivo de células endoteliales
Las células HUVEC fueron mantenidas y subcultivadas de acuerdo con los protocolos de cultivo celular estándar esencialmente descritos por Lonza. Brevemente, las células fueron mantenidas en el medio de crecimiento endotelial Lonza (EGM) con los suplementos y factores de crecimiento recomendados (VEGF, FGF2, EFG, IGF, hidrocortisona, suero bovino fetal (FBS), ácido ascórbico, heparina y gentamicina). Las células fueron subcultivadas cuando alcanzaron 70 a 80 % de confluencia por tripsinación y replantación en un medio de cultivo fresco en nuevos recipientes de cultivo 2500 a 5000 células/cm2 del área de la superficie del recipiente. Los conteos celulares fueron llevados a cabo utilizando un hemocitómetro, y las células viables fueron visualizadas con azul de tripano.
El medio para los estudios de la proliferación fue preparado utilizando EGM con 2 % de FBS y únicamente gentamicina. En un estudio posterior, el EGM completo fue utilizado para los grupos VEGF en un intento para mejorar el índice de proliferación de los grupos estimulados con VEGF. Para la prueba de formación de tubo, el medio completo fue utilizado, siendo únicamente omitida la heparina. Los compuestos en investigación fueron pesados a partir de reservas en polvo y diluidos en PBS para obtener soluciones patrón de 10 mM y almacenados a -80°C. Para los experimentos, los compuestos fueron subsecuentemente diluidos en un medio EBM-2 (suplementado con 2 % de FBS y gentamicina) a varias concentraciones de trabajo, según fue necesario.
Prueba de Proliferación
La proliferación fue inducida por HUVECs utilizando varias concentraciones de los factores de crecimiento VEGF, FGF-1 o FGF-2 durante un período de 72 horas. En la primera serie de experimentos, la prueba fue optimizada de forma adicional al examinar la densidad celular y la concentración de factor de crecimiento requerida para inducir una proliferación máxima por parte de los factores de crecimiento. Brevemente, 100 j l de células fueron agregados a cada pocillo a concentraciones de entre 1,3 x 103 por pocillo. Los factores de crecimiento y los compuestos de prueba fueron luego agregados en volúmenes de 50 ml a concentraciones especificadas para obtener un volumen final de 200 jl. Luego de incubar durante 70 horas, 20 j l de la Prueba de Proliferación Celular en Una Solución Acuosa CellT rite 96® (Promega) fue agregada durante 2 horas antes de leer la absorción a 490 nm para obtener valores de OD. Los datos se presentan en la Tabla 2.
Prueba de Formación de Microtúbulos Matrigel™
La prueba de formación de tubos fue llevada a cabo esencialmente tal y como es descrito por Malinda y otros, con modificaciones. 41 HUVECs en el cuarto o quinto pasaje a una confluencia de 70 a 80 % fueron cosechadas y resuspendidas en un medio de cultivo endotelial Lonza (EGM2) que contenía todos los suplementos indicados por el fabricante, excepto heparina, a una densidad celular de 4 x 105 células por ml. Para cada conjunto de pocillos triplicados, 200 j l de células (4 x 105/ml) fueron tratados con un volumen igual del compuesto para obtener las concentraciones finales de 10, 50 o 100 jM (asegurándose de esta forma que hubiera 1 x 300 j l disponible para cada condición). Una parte alícuota de células de 100 j l fue luego colocada sobre placas de 96 pocillos recubiertos previamente con Matrigel™ reducido en factor de crecimiento (50 j l durante 30 minutos seguido por unos 30 j l adicionales durante 1 hora) e incubada durante 18 a 22 horas. La formación de tubos fue examinada por una microscopía de contraste de fases y las imágenes fueron recolectadas utilizando una cámara digital Olympus C5050. La inhibición de la formación de tubos fue cuantificada manualmente a partir de imágenes registrando el número total de nodos que se conectan a 3 o más túbulos. Los resultados son expresados como un porcentaje de inhibición comparado con el control, y se presentan en la Tabla 2. Las HUVECs no tratados fueron utilizados como un control para el crecimiento celular normal, y la formación de tubos en Matrigel.
Prueba de Migración de células endoteliales
El Sistema de Angiogénesis BioCoat™ BD fue utilizado como una plataforma de prueba de migración de células endoteliales cuantitativa in vitro. Está compuesto de una Placa de Inserción con 24-MultipociMos BD Falcon™ (y una placa receptora de 24 pocillos no tratada con TC y una tapa), que contiene una membrana PET microporosa que bloquea la fluorescencia (3,0 pm tamaño de poro) (BD FluoroBlok™), recubierta uniformemente con fibronectina humana. La concentración de fibronectina y el procedimiento de recubrimiento está optimizado de forma que los poros de la membrana no sean ocluidos. Esto permite que las células endoteliales se adhieran a la membrana y migren libremente hacia un estímulo angiogénico en la cámara más baja de la placa. Un lector de placa fluorescente es utilizado para cuantificar las células que migran sin una manipulación adicional. En este caso, las células fueron marcadas con una tinta fluorescente después de la migración.
Brevemente, 200 pl de HUVECs a una concentración de 2,5 x 105/ml fueron colocadas en las cámaras superiores de cada pozo de la placa con 24 pocillos suministrada en el kit. Los compuestos fueron luego agregados con varias concentraciones (comúnmente 10 y/o 50 pg/(ml) con el medio solo (EBM-2) utilizado como el grupo de control no tratado. Debido a un desempeño de migración pobre de HUVEC estimuladas con FEG-2 o VEGF en nuestro laboratorio, 10 % del suero de becerro fetal (FCS) fue utilizado ya que aumentó más de 6 veces la migración de HUVEC en comparación con HUVEC cultivadas en el medio sin f Cs . Por lo tanto, 750 pl del medio con 10 % de FCS fue agregado a las cámaras inferiores para actuar como el estímulo migratorio y las placas fueron incubadas durante la noche a 37°C/5 % de CO2 durante 18 horas. Tras el tiempo de incubación, la placa superior fue transferida a una placa nueva con 24 pocillos inferior y 500 pl de calceína AM fue agregada para teñir las células migradas por debajo de la membrana porosa durante 90 minutos a 37°C. La fluorescencia fue medida utilizando un FLUOstar Optima (laboratorios BMG) con una excitación y filtro de emisión de 485 nm y 520 nm, respectivamente. Los datos son mostrados como el porcentaje de inhibición de migración en comparación con HUVEC inducidas por FCS (Tabla 3).
Prueba de Brote Angiogénico Ex Vivo
Los explantes de las aortas de rata fueron preparados mediante una modificación de los protocolos previamente descritos 42-45 En este modelo, el endotelio de la aorta de la rata fue expuesto a una matriz tridimensional de proteínas derivadas de ECM (Matrigel™), cambia a un fenotipo microvascular, y genera redes de trabajo de ramificación de microvasos. La angiogénesis es generada por la lesión provocada por el procedimiento de disección, y no requiere de la estimulación de factores de crecimiento exógenos.
Brevemente, las aortas torácicas fueron separadas de ratas Spargue Dawley de 2 a 4 meses y se les quitó la grasa y el tejido conectivo restante. Se tuvo mucho cuidado en cada etapa para reducir el daño físico de la aorta. El tejido fue transferido para completar el medio EBM-2 (Cambrex) que contenía 2 % de FCS y todos los reactivos (Cambrex) singlequots™, excepto heparina. Mientras tanto, Matrigel™ (BD Biosciences) se dejó enfriar en hielo y una vez que se encontró en forma líquida, 180 pl fue introducido dentro de placas de cultivo tisular de 48 pocillos (Nunc.). Las placas fueron incubadas a 37°C durante 30 minutos para permitir que el Matrigel™ se solidificara.
Las aortas fueron preparadas cortando secciones de anillo de 1 mm y luego diseccionando. Los segmentos aórticos fueron luego colocados cuidadosamente encima del Matrigel™ en el centro de coda pozo y una vez orientados tal y como fue requerido, 60 pl de Matrigel™ extra fue colocado encima y la placa fue regresada al incubador por unos 20 minutos adicionales. Cada pozo fue a continuación suplementado con un medio de 1,0 ml en la ausencia (control) o presencia de los compuestos de prueba, normalmente a dos concentraciones dentro del rango de 1 a 50 pM, dependiendo del compuesto/experimento particular. Los cultivos fueron rellenados de forma apropiada cada 48 horas y la puntuación de los microvasos fue llevada a cabo en varios momentos de 8 a 10 días. El grado de brote de microvasos fue determinado empleando un sistema de puntuación de 0 a 5, donde 0 = sin microvasos a 5= angiogénesis difusa, tal y como fue previamente descrito 45. El brote de los vasos fue fotografiado utilizando el objetivo 4x con una cámara Olympus C-7070 y un adaptador para el ocular.
En ciertos casos, para determinar la toxicidad potencial de los compuestos de esta prueba, la viabilidad del tejido fue evaluado retirando el compuesto/medio del cultivo en el día 6 o 7 y agregando un medio completo con VEGF (comúnmente 10ng/ml) durante hasta 7 días más. En la ausencia de toxicidad, el tejido viable deberá brotar microvasos en respuesta al factor de crecimiento exógeno.
El efecto de inhibición de los compuestos de la presente invención sobre la angiogénesis fue probado utilizando la prueba de brote angiogénico/formación de microvasos (aórtica de rata) descrita anteriormente. El incrustamiento del tejido aórtico de rata en Matrigel™ en ausencia de cualquier inhibidor (control) proporcionó un brote angiogénico extensivo (una puntuación de 5 indica una angiogénesis difusa), tal y como fue ilustrado por la Figura 1.
La agregación de PI-88 y PG524 (un análogo menos lipofílico) llevó a una respuesta de inhibición fuerte de 10 y 50 pM. Sin embargo, los compuestos de la presente invención demostraron una potencia adicional el inhibir la angiogénesis hasta 100 % a 10 pM. Los resultados son presentados en la Tabla 4 a continuación.
Para examinar la viabilidad del tejido aórtico, siguiendo el tratamiento con los compuestos mencionados anteriormente, la remoción de estos compuestos en el día 6 o 7 (dependiendo del experimento individual) fue seguido por el tratamiento con VEGF durante hasta e 7 días más. La aparición de brotes de microvasos demostró que los compuestos de la presente invención ejercen sus efectos de inhibición mediante un mecanismo antiangiogénico en lugar de la inducción de un efecto tóxico en el tejido (Figura 2 a continuación).
Actividad Anticoagulante
La actividad anticoagulante de los compuestos de prueba fue determinada midiendo el efecto de varias concentraciones del compuesto (0 a 100 pg/ml en PBS) en la elevación del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) de plasma humano normal combinado. Las mediciones de APTT fueron llevadas a cabo en un Aalizador de Coagulación Compacto STA STAGO utilizando protocolos estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La heparina no fraccionada (UFH) fue utilizada como un control. El rango normal de APTT para el plasma humano normal combinado es de 26 a 36 segundos. Los resultados se presentan en la Tabla 5, que muestra que los nuevos compuestos poseen únicamente una actividad anticoagulante leve y son significativamente menos potentes que PI-88.
Modelo de Melanoma de Ratón In Vivo
El melanoma B16 es una línea celular comúnmente utilizada para la inducción de tumores en ratones singénicos C57/BL6. Es un tumor no metastásico de rápido crecimiento que no responde a la mayoría de los agentes contra el cáncer.
Las células B16F1 fueron cultivadas en un medio DMEM completo con 10 % de FCS, penicilina/estreptomicina, lglutamina, piruvato de sodio, 2-mercapoetanol. Las células fueron cultivadas para una inoculación de tumor, las células B16F1 mediante disrupción con Tripsin/EDTA, lavadas con HBSS y centrifugadas durante 5 minutos a 1500 rpm. Las células fueron luego resuspendidas en PBS para asegurar que 5 x 105 células fuesen inyectadas en un volumen de 50 pl. El tumor fue implantado justo detrás del cuello. Tres días después de la inoculación del tumor, cada grupo de tratamiento fue inyectado de forma subcutánea en diferentes sitios cada día y con diferentes concentraciones en un volumen de inyección de 50 o 100 pl. Las inyecciones continuaron hasta el día 15, proporcionando un período de tratamiento de 12 días. Los ratones fueron monitoreados diariamente desde el inicio de las inyecciones y los tumores palpables fueron medidos diariamente. El tamaño del tumor fue determinado a partir de la medición en dos dimensiones, 1 x w, donde 1= la dimensión más larga y w = la dimensión más corta. Para estimar el volumen del tumor, la fórmula 0,5 x 1 x (w2) fue utilizada. Los datos son presentados tanto como mediana del crecimiento tumoral y como el porcentaje de la inhibición del crecimiento del tumor (%TGI). El cálculo de %TGI fue llevado a cabo para corregir las diferencias dentro de experimento.
Dado que se mostró que los compuestos de la presente invención inhiben la formación de brotes angiogénicos, y dado que la progresión del tumor depende de la angiogénesis, el efecto de estos compuestos en el crecimiento del tumor primario y la supervivencia general se analizaron tal y como fue descrito anteriormente. La Figura 3 proporciona una ilustración de la mediana de los volúmenes de tumor típicos a partir de varios estudios que examinaron los compuestos de la presente invención en el modelo de melanoma B16.
Para datos comparativos directos, los resultados mostrados en la Figura 4 indican el tamaño de tumor relativo disminuido de los ratones que tienen un tumor en comparación con el control relevante, y se muestra como un parámetro conocido como el porcentaje de inhibición de crecimiento tumoral (%TGI). Los valores de TGI fueron calculados utilizando la fórmula TGI = [1 - (AT/AC)] x 100, donde AT y AC representan el cambio en la masa del tumor media entre el último día de terapia y el primer día de terapia en el grupo tratado con el compuesto de la muestra (T) y el grupo de control de vehículo (C), respectivamente.
Modelo de Metástasis de Pulmón en Ratón In Vivo
Cuando las células B16F1, cultivadas tal y como fue descrito anteriormente para el modelo de melanoma de ratón de tumor sólido B16, son inyectadas mediante la vena de la cola dentro de los ratones, resulta la formación de nódulos metástásicos en los pulmones. Dado que las células de los tumores son negras, la observación de los nódulos metastásicos son fácilmente identificables. La Figura 5 muestra los pulmones de ratones de control y tratados con el compuesto, con obvias diferencias en la formación de colonias en el pulmón (manchas negras).
En el modelo de metástasis, las células B16 (2 x 105) fueron inyectadas mediante la vena de la cola de los ratones C57/BL6 en un volumen de 50 ml en el día 0. El tratamiento con los compuestos de prueba comenzó en el día 0 y continuó diariamente durante 12 días. El número de metástasis de pulmón fue enumarado en el día 12 del experimento. Los resultados mostrados en la figura 6 indican que los compuestos seleccionados mantienen la inhibición potente de la metástasis de pulmón exhibida por PI-88. Los datos son mostrados como el porcentaje de nódulos metastásicos observados en comparación con el control salino.
Modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal HT29 In vivo
Las células de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 (Pasaje 4 de la pila de trabajo 4 VP-Pila 325) fueron cultivadas en el medio de cultivo celular RPMI1640, el cual fue suplementado con 10 % de FBS y penicilinaestreptomicina (50 IU/ml de concentración final). Las células fueron cultivadas por la tripsinización, lavadas dos veces en HBSS y contadas. Las células fueron luego resuspendidas en HBSS y ajustadas a un volumen final que contenía 2 x 107 células/ml. Antes de la inoculación del sitio de inyección, el flanco derecho dorsal fue limpiado con abundante alcohol, y la aguja introducida a través de la piel dentro del espacio subcutáneo justo debajo del hombro derecho del animal, donde 100 pl de células (2 x 106 células) fueron descargadas. El tratamiento de los ratones comenzó con un promedio de volumen de tumor de aproximadamente 155 mm3. Los tumores fueron medidos en dos dimensiones (longitud y diámetro) y el volumen del tumor fue calculado utilizando la ecuación:
V(mm3) = longitud x diámetro2 x n/6
El control de vehículo, PBS estéril, fue administrado s.c., a un volumen de dosis de 10 ml/kg, una vez al día durante 21 días. El peso corporal de cada animal fue medido inmediatamente antes de la dosis de cada día. El volumen real administrado a cada ratón fue calculado y ajustado con base en el peso corporal. Los resultados presentados en la Figura 7 demuestran que los compuestos seleccionados poseen una actividad contra el cáncer utilizando el modelo de tumor de ratón de cáncer colorrectal. Todos los compuestos mostraron una actividad mejorada en comparación con PI-88, el cual no fue particularmente efectivo en este modelo.
Actividad Antiviral
Los resultados de las pruebas antivirales son presentados en las Tablas 6 a 10.
Células y virus
Las células de riñón de mono verde africano46 (GMK AH) fueron cultivadas en medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) suplementado con 2 % de suero de becerro, 0,05 % de una sustancia de Primaton RL (Kraft Inc., Norwich, EUA) y antiobióticos. Las células de carcinoma epidermoide humanas (HEp-2) fueron cultivadas en el EMEM modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10 % de suero de becerro fetal y antiobióticos. Las cepas de HSV utilizadas fueron HSV-1 KOS321, un aislado purificado en placa de la cepa de tipo salvaje KOS47, HSV-1 KOS gC- variante nula de gC'3948, y la cepa de HSV-233349. La cepa Rs V A-250 fue utilizada. La reserva de RSV fue preparada tal y como fue descrito por Hallak y otros51, y almacenado a -70°C en presencia de 40 % de sacarosa52.
Purificación de virus y prueba de unión de virus a células
Los viriones de HSV extracelulares marcados con metil-[3H]timidina HSV fueron purificados por centrifugración mediante un gradiente de sacarosa discontinuo de tres pasos tal y como fue previamente descrito 5354. El efecto del compuesto de prueba en la unión del virus marcado con metil-[3H]timidina purificado a las células GMK AH1 a 4°C fue probado tal y como fue descrito anteriormente17. Brevemente, las células fueron lavadas con PBS-A (PBS suplementado con 1mM CaCh y 0,5 mM MgCb) y luego bloqueadas con PBS-A que contenía 1 % de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Diluciones seriales de cinco veces el compuesto de prueba en el PBS-A fueron mezcladas con viriones modificados e incubadas durante 15 minutos a 4°C. Las células fueron lavadas una vez con PBS-A, y la mezcla de compuesto-virus agregada e incubada con las células bajo una agitación moderada durante 2 horas a 4°C. Subsecuentemente las células fueron lavadas tres veces con PBS-A, lisadas con 0,2 ml de PBS-A que contenía 5 % de SDS, y finalmente transferidas a frascos de centelleo para una cuantificación de radioactividad.
Prueba de desactivación de virus
Aproximadamente 105 unidades de formación de placa 105 de las manchas de HSV-1 KOS321 o HSV-2 333 y concentraciones específicas del compuesto de prueba en 200 pl de EMEM libre de suero fueron mezcladas e incubadas a 37°C durante 15 minutos. Las mezclas fueron diluidas a las concentraciones no inhibidoras del compuesto de prueba, y luego fueron sometidas a la determinación de titulación infecciosa tal y como fue descrito en la prueba de reducción de número de placas virales. En el caso de RSV, la prueba fue llevada a cabo de forma similar utilizando DMEM suplementado con 2 % de suero de becerro fetal desactivado por calor en lugar de EMEM. Para evaluar el efecto de un pH bajo o la presencia de secreciones cervicales, el virus (HSV-2333) y los compuestos fueron diluidos en un amortiguador de pH bajo (4,5) o las secreciones cervicales fueron agregadas a las diluciones del compuesto antes de ser mezclados con el virus (HSV-2333). Las secreciones cervicales fueron preparadas a partir de hisopados cervicales generados a partir de 3 individuos diferentes. Los hisopados se lavaron con agua destilada y centrifugados a 5000 x g durante 10 min. El sobrenadante fue mantenido a -20°C. En el caso de RSV, la prueba fue llevada a cabo de una forma similar utilizando DMEM suplementado con 2 % de suero de becerro fetal desactivado por calor en lugar de EMEM.
Pruebas de placas virales
La prueba de infección viral (la reducción de número de placa) y la prueba de reducción de tamaño de placa fueron llevadas a cabo tal y como fue descrito anteriormente17. Brevemente, para la prueba de reducción de número de placa, las mezclas de compuesto-virus se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la agregación a células y durante un período de 1 hora de infección de virus de células a 37°C. Subsecuentemente, las células fueron lavadas con 2 ml de EMEM y recubiertas con 1 % de una solución de metilcelulosa en EMEM. Las placas fueron visualizadas al mancharlas con una solución de violeta cristal después de 2 días (HSV-2) o 3 días (HSV-1) de incubación a 37°C. La concentración del compuesto de prueba que inhibió el número de placas virales un 50 % (IC50) fue interpolada a partir de las curvas de respuesta a la dosis. Cuando los compuestos fueron evaluados para la actividad anti-HSV o anti-RSV, las mezclas de 200 PFU del virus y el compuesto de prueba (100 pg/ml) en EMEM libre suero fueron incubadas durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la agregación a células y durante el período completo de infección viral de las células y el desarrollo de las placas virales. En la prueba de reducción de tamaño de placa, los compuestos fueron agregados a células (en un medio de revestimiento de metilcelulosa) después de un período de 2 horas de infección de virus de las células en ausencia del inhibidor. Después de 2 a 3 días de incubación a 37°C, las placas virales fueron visualizadas tiñiendo las células con 1 % de solución de violeta cristal. Para cada compuesto probado, las imágenes de veinte placas aledañas fueron capturadas utilizando una cámara digital Leica DC300 adherida al microscopio Leitz-Wetzlar Diavert. El área de cada placa fue determinada utiliando un software de imagen IM500 (Leica). Protocolos similares fueron utilizados para RSV, excepto que las pruebas fueron llevadas a cabo en células HEP-2 y DMEM suplementado con 2 % de suero de becerro fetal desactivado por calor fue utilizado en lugar de EMEM.
Prueba de citotoxicidad
La prueba fue llevada a cabo en células GMK AH1 que habían sido plantadas en placas de grupos de 96 pocillos y que alcanzaron aproximadamente de 80 a 90 % de confluencia en el día 2 de cultivo. Las células fueron lavadas con EMEM e incubadas durante 24 horas a 37°C con 100 pl de diluciones de dos veces en serie del compuesto de prueba en un EMEM libre de suero. El efecto del compuesto de prueba en la viabilidad celular fue medido utilizando la prueba CellTiter96 basada en tetrazolio de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega, Masidos, WI, EUA).
Las realizaciones anteriores son ilustrativas únicamente de los principios de la presente invención, y varias modificaciones y cambios se les ocurrirán fácilmente a aquellos expertos en la técnica. La presente invención es capaz de ser practicada y llevada a cabo en varias formas y en otras realizaciones. Deberá ser también entendido que la terminología empleada en la presente invención es para el propósito de descripción y no deberá de ser reconocida como limitante.
El término “comprende” y variantes de los términos tales como “comprende” o “que comprende” son utilizados en la presente invención para denotar la inclusión de un número entero expresado o números enteros expresados, pero no excluyen cualquier otro número entero o cualesquiera otros números enteros, a no ser que el contexto o el uso de una interpretación exclusiva del término sea requerido.
Tabla 1. Los resultados de las pruebas de unión al factor de crecimiento y de inhibición de heparanasa tal y como fueron descritas en las secciones anteriores.
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continuación
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Tabla 2. Datos para los compuestos seleccionados en la prueba de proliferación de células endoteliales inducida por el factor de crecimiento y la prueba de formación de microtúbulos Matrigel™ a) valores de IC50 ( |j M) para la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por FGF-1, FGF-2 y VEGF; b) % de Inhibición de la formación de microtúbulos a 10 M con relación a los controles.
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Tabla 3. Inhibición de la migración de HUVEC tal y como fue expresado por el porcentaje de inhibición del control por PI-88 un análo o menos li ofílico PG254 com uestos seleccionados con concentraciones de 10 50^ pM.
Figure imgf000043_0001
Tabla 4. Efecto de PI-88, un análogo menos lipofílico (PG524) y compuestos de prueba seleccionados en la f rm i n r n i ni n l r n i n i ri r .
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Tabla 5: Actividad anticoagulante de compuestos seleccionados. Tiempo que tarda el plasma humano combinado normal en coagular en las pruebas APTT y Heptest, después de la agregación de los compuestos de prueba a 0,1 m /ml.
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T l . A ivi ni-H V ni-R V l m n nr n n r i n i m i
Figure imgf000044_0001
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^
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T l . A ivi Ani-H V l m r
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continuación
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Tabla 10. Modulación de las actividades que desactivan el virus de PI-88 y el compuesto 20 a un pH bajo y en la resencia de secreciones cervicales humanas3.
Figure imgf000045_0002
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la fórmula general:
Figure imgf000047_0001
donde:
X e Y son cada uno una unidad monosacárida donde cada grupo hidroxilo no comprendido en un enlace glucosídico es sustituido independientemente por un grupo SO3M o H, donde M es cualquier catión farmacéuticamente aceptable;
X e Y son cualquiera de D- o l-hexosa o pentosa, en donde la hexosa se selecciona entre el grupo que consiste en glucosa, altrosa, alosa, talosa, galactosa, idosa y glucosa;
Y es una forma abierta de anillo o cíclica;
Z es O, S, un estado de oxidación mayor de S, o un enlace, y está enlazado al carbono anomérico cuando Y es un monosacárido reductor;
R1 es un conector seleccionado del grupo que incluye alquileno, alquenileno, alquinileno, arileno, heteroalquileno, heteroarileno, acileno, aroileno, alquilenamido, alquilentioamido, triazolileno, un conector de oximetil[1,2,3]-triazol-1-ilo o es un enlace;
R2 es un resto lipofílico seleccionado del grupo que incluye, colestanilo, colato, desoxicolato, propilestearamida; n es un número entero de 0 a 6;
el nivel de sulfatación de cada compuesto es de entre 70 y 100 % de los grupos hidroxilo totales.
2. El compuesto, tal y como fue descrito en la reivindicación 1, donde R2 es colestanilo.
3. El compuesto, tal y como fue descrito en la reivindicación 1, donde R2 es propilestearamida.
4. El compuesto, tal y como fue descrito en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, donde R1 es un conector de oximetil[1,2,3]-triazol-1-ilo.
5. El compuesto tal y como fue descrito en la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (compuesto 65); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-1-desoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (compuesto 70); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-1-desoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (compuesto 76); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2.3.6- tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3pcolestanilo (compuesto 87); 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2.3.6- tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de decasodio (compuesto 123); y 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2.3.6- tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de tridecasodio (compuesto 128).
6. El compuesto tal y como fue descrito en la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en:
2.3.4.6- tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1 >-4)-2,3,6-tri-0-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-( 1 - 4)-2,3,6-tri-0-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1- ->4)-2,3,6-tri-0-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (compuesto 65);
2.3.4.6- tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-desoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (compuesto 70);
2.3.4.6- tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-1-desoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo (compuesto 76);
2.3.4.6- tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (compuesto 87);
2.3.4.6- tetra-O-sulfo-p-D-galactopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3piloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo, sal de heptasodio (compuesto 93);
2.3.4.6- tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3piloximetil)[1,2,3]triazol-1-ilo, sal de heptasodio (compuesto 97);
2.3.4.6- tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo, sal de heptasodio (compuesto 102);
2.3.4.6- tetra-O-sulfo-p-D-glucopiranosil-(1—4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3'-colestanilo, sal de heptasodio (compuesto 107);
2.3.4.6- tetra-O-sulfo-p-D-galactop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucop¡ranós¡do de 3'-colestanilo, sal de heptasodio (compuesto 112);
2.3.4.6- tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearam¡doprop¡lo, sal de decasod¡o (compuesto 123); y
2.3.4.6- tetra-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-0-sulfo-p-D-glucop¡ranós¡do de 3-estearamidopropilo, sal de tridecasodio (compuesto 128).
7. Una composición farmacéutica o veterinaria para la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de melanoma, cáncer colorrectal o un trastorno que resulta del crecimiento tumoral, la angiogénesis tal como la proliferación o migración de células endoteliales, el esparcimiento de células tumorales (metástasis), inflamación, coagulación/trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovascular, cuya composición comprende al menos un compuesto, tal y como fue descrito en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, junto con un portador o diluyente farmacéutica o veterinariamente aceptable para al menos uno de dicho compuesto.
8. El uso de un compuesto, tal y como fue descrito en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 y 6 en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de melanoma, cáncer colorrectal o un trastorno que resulta del crecimiento tumoral, la angiogénesis tal como la proliferación o migración de células endoteliales, el esparcimiento de células tumorales (metástasis), inflamación, coagulación/trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovascular.
9. El uso de la reivindiación 8, donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-0-sulfonato de sod¡o-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-0-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-0-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (compuesto 65); 2.3.4.6- tetra-O-sulfonato de sod¡o-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-1-desoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3-iloximet¡l)[1,2,3]tr¡azol-1-¡lo (compuesto 70); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-1-desoxi-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximet¡l)[1,2,3]tr¡azol-1-¡lo (compuesto 76); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3p-colestanilo (compuesto 87); 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de decasodio (compuesto 123); y 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de tridecasodio (compuesto 128).
10. Un compuesto tal y como fue descrito en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 y la 6, para su uso en la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de melanoma, cáncer colorrectal o un trastorno resultado del crecimiento tumoral, angiogénesis tal como migración o proliferación de células endoteliales, esparcimiento de células tumorales (metástasis), inflamación, coagulación/trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovascular.
11. El compuesto para su uso tal como se ha definido en la reivindicación 10, seleccionado del grupo que consiste en 2.3.4.6- tetra-O-sulfonato de sod¡o-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-0-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2.3.6- tri-O-sulfonato de sod¡o-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-0-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3pcolestanilo (compuesto 65); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sod¡o-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfonato de sod¡o-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-1-desox¡-2,3,6-tr¡-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3-¡lox¡met¡l)[1,2,3]triazol-1-¡lo (compuesto 70); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-1-desox¡-2,3,6-tri-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 4-(colestan-3p-iloximet¡l)[1,2,3]tr¡azol-1-¡lo (compuesto 76); 2,3,4,6-tetra-O-sulfonato de sodio-a-D-glucopiranosil-(1^4)-2.3.6- tri-O-sulfonato de sod¡o-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfonato de sodio-p-D-glucopiranósido de 3pcolestanilo (compuesto 87); 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-a-D-glucopiranos¡l-(1^4)-2.3.6- tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de decasodio (compuesto 123); y 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2.3.6- tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido de 3-estearamidopropilo, sal de tridecasodio (compuesto 128), para su uso en la prevención o tratamiento en un sujeto mamífero de melanoma, cáncer colorrectal o un trastorno resultado del crecimiento tumoral, angiogénesis tal como migración o proliferación de células endoteliales, esparcimiento de células tumorales (metástasis), inflamación, coagulación/trombosis, niveles de triglicéridos en sangre elevados, infección microbiana y/o enfermedad cardiovascular.
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