ES2586422T3

ES2586422T3 - Identificación de anticuerpos atípicos en sangre y productos sanguíneos humanos

Info

Publication number: ES2586422T3
Application number: ES12816122.1T
Authority: ES
Inventors: Clark ZERVOS; Joann Hotta
Original assignee: Grifols SA
Current assignee: Grifols SA
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2016-10-14
Anticipated expiration: 2032-11-22
Also published as: IL231053A; AU2012327185B2; AU2012327185A1; PL2739976T3; MX348498B; EP2739976B1; HK1198205A1; IL231053A0; PT2739976T; CN103814296B; US9523694B2; JP2015504155A; UY34471A; JP6043807B2; ZA201401235B; BR112014007802B1; NZ621582A; MY185197A; EP2739976A1; RU2622984C2

Abstract

Método para identificar anticuerpos reactivos atípicos en un proceso de fabricación de productos sanguíneos, en el que los anticuerpos reactivos atípicos dan lugar a falsos positivos en el ensayo de pirógenos en conejo, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra de sangre o plasma; (b) analizar la muestra y un control utilizando alguno o más de uno entre aglutinación celular; microscopia de fluorescencia, inmunoprecipitación, inmunodifusión, inmunofluorescencia, ELISA, citometría de flujo, FACS o transferencia Western a fin de determinar si la muestra contiene anticuerpos atípicos que tienen reactividad cruzada con glóbulos blancos de conejos; (c) comparar los resultados de la muestra y la prueba de control; (d) determinar si la muestra contiene anticuerpos atípicos reactivos, y; (e) interceptar una unidad de sangre o plasma que era la fuente de la muestra si la muestra contiene anticuerpos atípicos reactivos. y en el que los anticuerpos reactivos atípicos tienen reactividad cruzada con antígenos de glóbulos blancos de conejo y provocan una respuesta pirogénica durante el ensayo de pirógenos en conejos.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Identificacion de anticuerpos atipicos en sangre y productos sangulneos humanos SECTOR TECNICO

En la presente invencion se dan a conocer metodos para identificar anticuerpos atipicos en sangre y productos sangulneos.

TECNICA ANTERIOR

El Documento D1 (WO2008/033164 A1) da a conocer un metodo que se puede utilizar para detectar anticuerpos atipicos como Rho (D), Kell (K), Duffy (Fya), y hr’ (c) en sangre basado en el uso de al menos dos fases liquidas en contacto fluido y con diferentes densidades para la separacion de materiales de interes de materiales que no son de interes.

ANTECEDENTES

Se han identificado anticuerpos humanos naturales que provocan respuestas pirogenicas durante las pruebas de pirogeno de USP. Algunos donantes humanos producen de manera natural estos “anticuerpos atipicos”, quizas como resultado de la exposicion a conejos, roedores o insectos parasiticos alimentandose en dichos animales huesped (es decir, pulgas). Los anticuerpos atipicos son anomalos y no comunes, pero no son daninos para los seres humanos. Los anticuerpos atipicos pueden reaccionar de manera cruzada con antigenos de globulos blancos de conejo y pueden provocar una respuesta pirogenica durante las pruebas de pirogeno de conejo. Sin embargo, la respuesta pirogenica es un resultado de “falso positivo” porque otros metodos, tales como los ensayos de lisado de amebocitos de limulus (LAL), mostraron que las muestras de plasma sospechosas que producen respuestas pirogenicas en los ensayos con conejos no contienen endotoxinas. Ademas, los resultados de pruebas de pirogeno in vitro (tambien conocidas como pruebas de activacion de monocitos) indican la ausencia de pirogenos que no son endotoxinas. Por consiguiente, los anticuerpos atipicos en sangre humana o plasma provocan resultados erroneos en pruebas de pirogenos de conejo y pueden dar lugar a la eliminacion de sangre o plasma de un individuo o grupos que en una prueba producen un falso positivo como “pirogenicos”.

Los metodos dados a conocer en la presente invencion permiten la identificacion de muestras de sangre o plasma que contienen anticuerpos atipicos que dan lugar a fasos positivos en ensayos de pirogenos. Este metodo es ventajoso porque las muestras que contienen anticuerpos atipicos se pueden eliminar antes de agruparse con otra sangre o plasma y contaminar el grupo. Por consiguiente, el metodo reduce el coste de fabrication previniendo la contamination innecesaria de los grupos de sangre o plasma con muestras que parecen “pirogenicas” debido a la presencia de anticuerpos atipicos. Los metodos de evaluation de alto rendimiento dados a conocer en la presente invencion permiten la identificacion de muestras sospechosas de falsos positivos. Dichas muestras se pueden descartar antes de agruparse con otras muestras y evitar la contaminacion del grupo con anticuerpos atipicos.

CARACTERISTICAS resumidas de la invencion

Un aspecto dado a conocer en la presente invencion es un metodo para identificar anticuerpos reactivos atipicos en un proceso de fabricacion de productos sangulneos, en el que los anticuerpos reactivos atipicos dan lugar a falsos positivos en el ensayo de pirogenos en conejo, comprendiendo el metodo: (a) obtener una muestra de sangre o plasma; (b) analizar la muestra y un control utilizando uno o mas entre aglutinacion celular, microscopia de fluorescencia, inmunoprecipitacion, inmunodifusion, inmunofluorescencia, ELISA, citometria de flujo, FACS o transferencia Western a fin de determinar si la muestra contiene anticuerpos atipicos que tienen reactividad cruzada con antigenos de globulos blancos de conejo; (c) comparar los resultados de la muestra y la prueba de control; (d) determinar si la muestra contiene anticuerpos atipicos reactivos, y; (e) interceptar una unidad de sangre o plasma que era la fuente de la muestra si la muestra contiene anticuerpos atipicos reactivos.

Otro aspecto dado a conocer en la presente invencion es un metodo para identificar anticuerpos reactivos atipicos en un proceso de fabricacion de productos sangulneos, en el que los anticuerpos reactivos atipicos dan lugar a falsos positivos en el ensayo de pirogenos en conejo, tal como se menciono anteriormente, en el que en la etapa (b) la muestra y un control se analizan utilizando un ensayo de aglutinacion celular.

Otro aspecto dado a conocer en la presente invencion es un metodo para identificar anticuerpos reactivos atipicos en un proceso de fabricacion de productos sangulneos, en el que los anticuerpos reactivos atipicos dan lugar a falsos positivos en el ensayo de pirogenos en conejo, tal como se menciono anteriormente, en el que en la etapa (b) la muestra y un control se analizan utilizando citometria de flujo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Otro aspecto dado a conocer en la presente invencion es un metodo para identificar anticuerpos reactivos atipicos en un proceso de fabrication de productos sangulneos, en el que los anticuerpos reactivos atipicos dan lugar a falsos positivos en el ensayo de pirogenos en conejo, tal como se menciono anteriormente, en el que en la etapa (b) la muestra y un control se analizan utilizando transferencia Western.

Otro aspecto dado a conocer en la presente invencion es un metodo para identificar anticuerpos reactivos atipicos en un proceso de fabricacion de productos sanguineos, en el que los anticuerpos reactivos atipicos dan lugar a falsos positivos en el ensayo de pirogenos en conejo, tal como se menciono anteriormente, comprendiendo adicionalmente el metodo analizar la muestra y un control utilizando el ensayo de lisado de amebocitos de limulus (LAL).

DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Microscopia de ensayos de aglutinacion de WBC (globulos blancos) de conejo. Se incubaron el plasma de un donante X y de control con WBC de conejo y, a continuation, se observaron utilizando un microscopio. Fotomicrografias de luz (A, B) y contraste de fase (C, D) de globulos blancos de conejo incubados con plasma del donante X (A, C) o plasma de control (B, D). Se observo aglutinacion con plasma del donante X (A, C), pero no con el plasma de control (B, D).

Figura 2: Microscopia de ensayos de aglutinacion de WBC (globulos blancos) de ser humano. Se incubaron el plasma de un donante X y de control con WBC de ser humano y, a continuacion, se observaron utilizando un microscopio. Fotomicrografias de luz (A, B) y contraste de fase (C, D) de globulos blancos de ser humano incubados con plasma del donante X (A, C) o plasma de control (B, D). No se observo aglutinacion con plasma del donante X (A, C) o con el plasma de control (B, D).

Figura 3: Microscopia de contraste de fase y fluorescencia de la aglutinacion de WBC de conejo y donante X. Se incubaron el plasma de un donante X y de control con WBC de conejo, se hicieron reaccionar con IgG antihumana marcada con fluoresceina y, a continuacion, se observaron utilizando un microscopio de contraste de fase o fluorescencia. El panel (A) muestra una fotomicrografia de contraste de fases de WBC de conejo incubados con plasma del donante X. El panel (B) muestra una fotomicrografia fluorescente de WBC de conejo incubados con plasma del donante X y, a continuacion, se trataron con IgG antihumana marcada con fluoresceina. Se observo una fluorescencia intensa en los grupos de celulas aglutinadas, lo que indica que la IgG humana del plasma del donante X era responsable de la aglutinacion celular.

Figura 4: Microscopia de fluorescencia de ensayos de aglutinacion de WBC de conejo. Se incubaron el plasma de un donante X y de control con WBC de conejo y, a continuacion, se hicieron reaccionar con IgG antihumana marcada con fluoresceina. El panel (A) muestra una fluorescencia positiva de WBC de conejo. El panel (B) muestra los resultados con plasma de control.

Figura 5: Microscopia de fluorescencia de ensayos de aglutinacion de WBC de conejo. Se incubaron el plasma de un donante X y de control con WBC de conejo, se hicieron reaccionar con IgG antihumana marcada con fluoresceina y, a continuacion, se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia. El panel (A) muestra una fluorescencia positiva de WBC de conejo con IgG antihumana marcada con fluoresceina y una imagen con 40 aumentos de las celulas aglutinadas (panel inferior). Estos resultados indican que el plasma del donante X contiene IgG reactivas con antigeno de la superficie celular de WBC de conejo. El panel (B) muestra una fluorescencia debil observada con el plasma de control y una fotomicrografia de contraste de fase de los WBC de conejo que no muestran aglutinacion (panel inferior).

Figura 6: Microscopia de fluorescencia de ensayos de aglutinacion de WBC humanos. Se incubaron el plasma de un donante X y de control con WBC humanos, se hicieron reaccionar con IgG antihumana marcada con fluoresceina y, a continuacion, se observaron utilizando microscopia de fluorescencia. Ni (A, donante X) ni (B, plasma de control) presentan una fluorescencia o aglutinacion intensa (paneles inferiores), lo que indica que el plasma del donante X contiene IgG que no son reactivas a los antigenos de superficie celular de WBC humanos.

Figura 7: Histogramas de citometria de flujo por fluorescencia. Se incubaron WBC de conejo con plasma del donante X o de control, se hicieron reaccionar con IgG antihumana marcada con fluoresceina y, a continuacion, se analizaron mediante citometria de flujo. Los histogramas muestran la fluorescencia relativa observada. Los paneles A y B muestran dos experimentos separados. El plasma del donante X produjo la senal mas amplia con una fluorescencia relativa, como minimo, tres veces la del plasma de control. Veanse las tablas 4 y 5 para resultados cuantitativos.

Figura 8: Histogramas de citometria de flujo por fluorescencia. Se incubaron WBC de humano con plasma del donante X o de control, se hicieron reaccionar con IgG antihumana marcada con fluoresceina y, a continuacion, se analizaron mediante citometria de flujo. Los histogramas muestran la fluorescencia relativa observada. Los paneles A y B muestran dos experimentos separados. El plasma del donante X no era significativamente diferente del plasma de control. Vease las tablas 6 y 7 para resultados cuantitativos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Figura 9: Analisis por Electroforesis y transferencia Western de muestras de aislados de plasma de un donante X que contienen IVIG-C pirogenico. Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: IGIV-C pirogenica (donante X); Carril 3: IGIV-C no pirogenica; Carril 4: suero de conejo; Carril 5: suero bovino fetal; Carril 6: suero de caballo. (A) Gel tenido con Instant Blue. (B) Control de transferencia Western (sin anticuerpo primario) sondado con inmunoconjugado de IgG antihumana y fosfatasa alcalina (IgG-AP). (C) Transferencia Western que utiliza aislados de plasma de un donante X que contienen IGIV-C pirogenica como anticuerpo primario e IgG antihumana-AP. (D) Transferencia Western que utiliza IGIV-C no pirogenica como anticuerpo primario e IgG antihumana-AP.

Figura 10: Analisis por Electroforesis y transferencia Western de muestras de aislados de plasma de un donante X que contienen IVIG-C pirogenica. Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: suero bovino fetal; Carril 3: suero de conejo; Carril 4: suero de conejo, diluido 1:5; Carril 5: suero de conejo, diluido 1:10; Carril 6: suero de conejo, diluido 1:50. (A) Control de transferencia Western (sin anticuerpo primario) sondado con inmunoconjugado de IgG antihumana y fosfatasa alcalina (IgG-AP). (B) Transferencia Western que utiliza aislados de plasma de un donante X que contienen IGIV-C pirogenica como anticuerpo primario e IgG antihumana-AP. (C) Transferencia Western que utiliza IGIV-C no pirogenica como anticuerpo primario e IgG antihumana-AP. (D) Gel tenido con Instant Blue.

Figura 11: El plasma de un donante X reacciona de forma cruzada con WBC de rata: Microscopla de fluorescencia de ensayos de aglutinacion de WBC de rata. Se incubaron WBC de rata con plasma del donante X o de control, se hicieron reaccionar con IgG antihumana marcada con fluorescelna y, a continuacion, se observaron mediante microscopla de fluorescencia. El panel (A) muestra una fluorescencia positiva y la aglutinacion de EWBC de rata incubados con IgG antihumana marcada con fluorescelna y una imagen de 40 aumentos de las celulas aglutinadas (panel inferior). Estos resultados indican que el plasma de un donante X contiene IgG reactivas con antigenos de la superficie celular de WBC de rata. El panel (B) muestra una fluorescencia debil observada con el plasma de control y una imagen de 40 aumentos de los WBC de rata que no muestran aglutinacion (panel inferior).

DESCRIPCION DETALLADA

En la presente invencion se dan a conocer metodos para identificar anticuerpos atipicos en sangre y productos sangulneos. Un individuo, referido en la presente invencion como “donante X”, dono plasma que se agrupo con otras unidades para la fabricacion de productos proteicos bioterapeuticos. Durante el procesado, se analizo la pirogenicidad el plasma agrupado utilizando el ensayo para conejo de pirogenicidad de la USP. Inesperadamente, el plasma agrupado dios positivo como pirogenico en la prueba de USP para conejos. Ensayos adicionales localizaron el agente pirogenico en el plasma del donante X. Los ensayos de lisado de amebocitos limulus (LAL) mostraron que el plasma del donante X no estaba contaminado con endotoxinas bacterianas. En cambio, los ensayos dados a conocer en la presente invencion demostraron que el plasma del donante X contenia anticuerpos atipicos que eran responsables de la respuesta pirogenica. De manera especifica, los examenes microscopicos de luz y fluorescencia mostraron que el plasma del donante X aglutinaba WBC de conejo y rata, pero no WBC humanos. La reactividad cruzada de los WBC de conejo era especifica del donante X porque el plasma de los padres, hermanos e hijos del donante X no reaccionaba. Los experimentos de citometria de flujo fluorescente mostraron que el plasma del donante X contenia anticuerpos IgG reactivos con antigenos de la superficie celular de WBC de conejo y los experimentos de transferencia Western confirmaron la reactividad de las IgG con el suero de conejo. De manera colectiva, estos resultados sugieren que el donante X se puede haber expuesto a roedores o portadores de insectos de roedores que podrian haber inducido una inmunidad humoral reactiva de manera cruzada con WBC de conejo. De este modo, el plasma de algunos individuos puede dar positivo en las pruebas de pirogeno de USP para conejos, no porque este contaminado de bacterias, sino porque contienen anticuerpos atipicos que son reactivos de manera cruzada con antigenos de WBC de conejo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Ensayos de pirogenos segun la Farmacopea de los Estados Unidos (USP)

La actual Farmacopea de los Estados Unidos § 151 explica resumidamente el ensayo de pirogenos. La prueba implica la medicion del aumento de la temperatura de los conejos despues de la inyeccion intravenosa de una solucion de prueba. Este ensayo se disena para determinar si los productos pueden ser tolerados por el conejo de prueba en una dosis que no supere los 10 mL por kg inyectado de manera intravenosa en un periodo no superior a 10 minutos. Inicialmente, se inyectan tres conejos. Si alguno de los conejos muestra un aumento de la temperatura individual superior o igual a 0,5°C, se continua con la prueba utilizando cinco conejos adicionales. Si tres o mas de los ocho conejos muestran aumentos individuales en la temperatura superiores o iguales a 0,5°C y/o la suma de los aumentos de temperatura de ocho individuos supera los 3,3°C, el material bajo examen se considera pirogenico.

Se diluyo 1:100 una muestra de plasma del donante X o una muestra agrupada sin plasma del donante X en 10 mL de una solucion de cloruro sodico (NaCl al 0,9%) y se inyectaron en las venas de la oreja de tres conejos maduros sanos. Se midieron por via rectal las temperaturas de los conejos a los 10 minutos de la inyeccion. Los datos de las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

temperaturas se muestran en la tabla 1. La muestra sin plasma del donante X no indujo un aumento de la temperature en ninguno de los conejos. En cambio, cuando se analizo el plasma del donante X, se midieron aumentos de temperatura entre 1,1-1,2°C. Dado que el incremento total de la temperatura para los 3 conejos fue de 3,4°C, se considero que el plasma del donante X era pirogenico y no existia la necesidad de extender las pruebas a otros 5 conejos.

Se capturaron las inmunoglobulinas en un grupo que contenia el 0% o el 10% de plasma del donante X utilizando una columna de protelna A y se analizo la pirogenicidad. La muestra sin plasma del donante X no indujo un incremento en la temperatura, pero las muestras que contenia plasma del donante X eran altamente pirogenicas. Estos resultados indicaron que la respuesta pirogenica en conejos podria estar relacionada con las inmunoglobulinas en el plasma del donante X.

Tabla 1: El plasma del donante X provoca respuestas pirogenicas en conejos

Muestra: Incremento maximo de temperatura de pirogenos segun USP (°C) AT total

Conejo 1: Conejo 2 Conejo 3

Plasma de donante X (1:100): 1,1 1,1 1,2 3,4

Plasma agrupado sin donante X (1:100): 0,0 0,0 0,0 0,0

Eluato de Mab agrupados con 10% de donante X: 2,0 2,4 1,6 6,0

Eluato de Mab sin donante X: 0,0 0,1 0,0 0,1

Ejemplo 2

Se realizaron una serie de experimentos utilizando plasma del donante X para entender mejor la naturaleza de su pirogenicidad.

Experimentos de aglutinacion de globulos blancos y microscopia

Se realizaron experimentos de aglutinacion para evaluar las interacciones entre el plasma del donante X y los globulos blancos (WBC) de conejo o ser humano. Se recogieron los WBC de la sangre completa de conejo y ser humano mediante centrifugacion de gradiente de densidad utilizando Histopaque® (Sigma-Aldrich) y se suspendieron en solucion salina tamponada normal complementada con BSA. A continuacion, los WBC de conejo y ser humano se incubaron con plasma del donante X y de control en una microplaca de 96 pocillos. Despues de la incubacion y el lavado, se anadio IgG antihumana marcada con fluorescente y se incubaron las microplacas, se lavaron y se examinaron microscopicamente. Se examino cada pocillo por la aglutinacion utilizando microscopia de luz visible y contraste de fase y, a continuacion, se observaron utilizando microscopia de fluorescencia (resultados discutidos en la seccion siguiente).

Se observo una aglutinacion significativa en los pocillos de ensayo que contenian plasma del donante X y WBC de conejo (figuras 1A y 1C), pero no en los pocillos de ensayo que contenia plasma del donante X y WBC humanos (figuras 2A y 2C). No se observo aglutinacion en pocillos que contenian plasma de control y WBC de conejo (figuras 1B y 1D) o plasma de control y WBC humanos (figuras 2B y 2D). Estos resultados se reprodujeron en numerosos ensayos e indican que la IgG del donante X se une a WBC de conejo, pero no a WBC humanos. Vease la figura 2.

Durante varios experimentos de aglutinacion, se observo citotoxicidad en muestras que contenian WBC de conejo y plasma del donante X, pero no en pocillos que contenian plasma de control y WBC de conejo, ni en pocillos que contenian WBC humanos con plasma del donante X o de control. La observation de que el plasma del donante X es toxico para los WBC de conejo sugirio una union especifica de las inmunoglobulinas del donante X a estas celulas. Veanse las figuras 1-3.

Experimentos de microscopia fluorescente

Se realizaron experimentos de microscopia fluorescente en paralelo con los estudios de aglutinacion y microscopia de luz descritos anteriormente y los resultados se presentan en la tabla 2. Los WBC de conejo eran intensamente fluorescentes en muestras incubadas con plasma del donante X (figuras 4A y 5A), en comparacion con un grado relativamente debil de fluorescencia para muestras incubadas con plasma de control (figura 4B) o con solo IgG antihumana marcada con fluorescente. Veanse las figuras 4 y 5. Estos hallazgos indicaron que la fluorescencia observada para WBC de conejo era especifica para la IgG presente en el donante X. Se observo un grado debil de fluorescencia para WBC humanos incubados tanto con plasma del donante X como con plasma de control (figura 6) o con solo la IgG antihumana marcada con fluorescente (sin plasma del donante X o de control anadido). Figura 6B.

5

10

15

20

25

30

Estos hallazgos indicaron que la fluorescencia observada con WBC humanos representaban una union no especifica, independiente de la presencia de la IgG del donante X o de control.

Tabla 2: Resultados de microscopia fluorescente

Origen del plasma: Huesped de WBC IgG antihumana marcada con fluorescente Valoracion de la fluorescencia (0-4)

Donante X: Conejo Si 3-4

Control: Conejo Si 0-2

Ninguno: Conejo Si 0-1

Donante X: Humano Si 0-1

Control: Humano Si 0-1

Ninguno: Humano Si 0-1

Ejemplo 3

Experimentos de citometria de flujo

A efectos de cuantificar la union a anticuerpo y la fluorescencia observada mediante el microscopio, se realizaron estudios de citometria de flujo. En estos experimentos, se incubaron WBC de conejo y ser humano con plasma de un donante X y de control y se lavaron antes de anadir e incubarse con IgG antihumana marcada con fluorescente. Las muestras celulares se lavaron, resuspendieron en solucion salina tamponada normal hasta una concentration que variaba a desde aproximadamente 3 x 106 a 5 x 106 celulas/mL y se analizaron mediante citometria de flujo.

La figura 7 contiene superposiciones de histogramas que muestran la intensidad fluorescente relativa de dos muestras de WBC de conejo diferentes incubadas con plasma del donante X o de control. Se incluyeron dos muestras adicionales como controles de ensayo, WBC de conejo no tenidos (celulas de control) y WBC de conejo tratados solo con IgG antihumana marcada con fluorescente. La fluorescencia mediana de la muestra de WBC de conejo incubada con plasma del donante X fue de 3264 en el experimento 1 y 922 en el experimento 2 y, fue significativamente superior a la observada despues de incubar WBC de conejo con plasma de control (fluorescencia mediana de 499 y 175 para los experimentos 1 y 2, respectivamente). Veanse las tablas 3 y 4. De este modo, aunque existia cierto solapamiento entre los WBC de conejo incubados con plasma del donante X y de control, existia una diferencia clara en la intensidad fluorescente. Estos resultados se correlacionaban perfectamente con los resultados de los estudios con microscopia, descritos anteriormente, en los que los WBC reaccionaban con plasma del donante X y producian una fluorescencia significativamente mas intensa que los incubados con plasma de control.

Tabla 3: Datos del histograma de citometria de flujo que muestran la fluorescencia relativa de WBC de conejo incubados con plasma del donante X o de control

Experimento 1: Fluorescencia relativa (N = 20.0000)

Tipo de celula: Promedio Mediana Modo Modo de recuento Desviacion estandar

Plasma del donante X: 4.507,4 3.263,8 10.000,1 1.632 3.688,4

Plasma de control: 1.508,9 498,9 9.003,1 509 2.404,3

IgG antihumana sola: 13,4 5,7 3,7 400 176,3

Celula de control: 4,3 3,0 3,4 630 49,7

Tabla 4: Datos del histograma de citometria de flujo que muestran la fluorescencia relativa de WBC de conejo incubados con plasma del donante X o de control

Experimento 2: Fluorescencia relativa (N = 20.0000)

Tipo de celula: Promedio Mediana

Plasma del donante X: 1752 922

Plasma de control: 501 175

IgG antihumana sola: 13 1

Celula de control: 1 1

Los experimentos de citometria de flujo se repitieron con WBC humanos y los resultados se muestran en la figura 8 y tablas 5 y 6. Los WBC humanos incubados con plasma del donante X y plasma de control presentaban histogramas similares, lo que indica que no habia una diferencia significativa en la intensidad fluorescente. Estos

resultados se correlacionaban con los resultados de los estudios de microscopia, descritos previamente, en que los WBC humanos tratados con plasma del donante X y de control produclan un grado similar de fluorescencia. La muestra de WBC humanos tenida con solo IgG antihumana marcada con fluorocromo tambien mostro un solapamiento significativo con muestras de plasma del donante X y de control y, de este modo, indicaban un grado 5 significativo de union no especifica por el anticuerpo secundario.

Tabla 5: Datos del histograma de citometria de flujo que muestran la fluorescencia relativa de WBC humanos incubados con plasma del donante X o de control

Experimento 3: Fluorescencia relativa (N = 20.0000)

Tipo de celula: Promedio Mediana Modo Modo de recuento Desviacion estandar

Plasma del donante X: 1004,9 47,7 16,1 304 1739,0

Plasma de control: 820,9 37,0 11,3 294 1472,1

IgG antihumana sola: 381,8 17,4 9,4 332 785,5

Celula de control: 5,6 2,8 2,9 695 2663,1

Tabla 6: Datos del histograma de citometria de flujo que muestran la fluorescencia relativa de WBC humanos incubados con plasma del donante X o de control

Experimento 4: Fluorescencia relativa (N = 20.0000)

Tipo de celula: Promedio Mediana

Plasma del donante X: 174 7

Plasma de control: 274 16

IgG antihumana sola: 76 4

Celula de control: 1 1

En resumen, los analisis de citometrla de flujo mostraron la union significativa de las inmunoglobulinas del donante X 10 (es decir, IgG) a WBC de conejo en comparacion con el plasma de control y una union minima a WBC humanos.

Ejemplo 4

Prueba complementaria de pirogenos de conejo

15

A efectos de evaluar una posible asociacion genetica para inmunoglobulinas de un donante X y su efecto en la pirogenicidad de conejo, se realizaron ensayos de pirogeno segun USP en sueros donados por parientes del donante X. Tambien se analizo como control una muestra de suero del donante X. Dado que estudios previos demostraron que el plasma del donante X producia una respuesta significativa de pirogeno a diluciones 1:100, todas 20 las muestras de prueba se diluyeron 1:100 en solucion salina normal esteril (NaCl al 0,9%, USP, para inyeccion) antes del analisis de pirogenos de conejo. Tambien se utilizo una alicuota de cada muestra en un ensayo LAL para examinar la contaminacion por endotoxinas como fuente de la respuesta de pirogenos. Los resultados de pirogenos y LAL se presentan en la tabla 7.

Tabla 7: Resultados de la prueba de pirogenos segun USP para el donante X y miembros de la familia inmediata

: Resultados de pirogenos de conejo segun USP (incremento maximo de temperatura en °C)

Muestras de suero (dilucion 1:100): Conejo 1 Conejo 2 Conejo 3 AT total

Donante X: 1,0 0,3 0,6 1,9

Padre: 0,0 0,1 0,0 0,1

Madre: 0,0 0,2 0,0 0,2

Hermana 1: 0,0 0,0 0,0 0,0

Hermano: 0,0 0,0 0,0 0,0

Hermana 2: 0,0 0,1 0,0 0,1

Hija 1: 0,0 0,1 0,1 0,2

Hija 2: 0,0 0,2 0,0 0,2

Hijo: 0,0 0,1 0,0 0,1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El suero del donante X produjo un incremento significativo de temperatura en dos de los tres conejos de prueba, con un incremento total de la temperatura de 1,9°C. Esta respuesta concordaba con las pruebas previas con plasma del donante X. El suero de los parientes del donante X, que incluyen padres, hermanos e hijos no produjo incrementos significativos de temperatura. Los resultados del Ensayo de Lisado de Amebocitos Limulus (LAL) para todas las muestras fueron negativos, lo que indica que la endotoxina exogena no contribula a las respuestas pirogenicas de conejo.

Ejemplo 5

Estudios de aglutinacion de globulos rojos

Se analizo el plasma de un donante X con globulos rojos de conejo en una serie de experimentos de aglutinacion para determinar si el plasma del donante X contiene inmunoglobulinas especificas para antigenos en RBC (globulos rojos) de conejo. La incompatibilidad entre las inmunoglobulinas del plasma del donante X y los RBV de conejo podia provocar potencialmente la hemolisis y pirogenicidad. Para estos estudios, se valoraron el plasma del donante X y de control frente a una suspension de RBC de conejo. La suspension se observo en tres puntos de tiempo: (1) inmediatamente; (2) despues de una incubacion de 30 minutos a 37°C; y (3) despues de anadir suero de anti- globulina humana.

Tanto el plasma del donante X como de control produjeron una aglutinacion intensa de RBC de conejo en todos los puntos de tiempo, y se observo un titulo equivalente para el donante X y el control positivo. Se observo una hemolisis a diluciones bajas tanto del donante X como del control positivo.

La presencia de inmunoglobulinas anti-A y/o inmunoglobulinas anti-B presentes en el plasma del donante X y del control podrian potencialmente reaccionar de forma cruzada con antigenos de RBC de conejo con epitopos similares a los antigenos A y B humanos. Por consiguiente, se preabsorbieron el plasma del donante X y del control con RBC A y/o RBC B humanos para eliminar la reaccion cruzada de anticuerpos anti-a y anti-B. A continuacion se analizo el plasma preabsorbido frente a los RBC de conejo tal como se ha descrito anteriormente. Tanto el plasma del donante X como el plasma del control produjeron una aglutinacion intensa, similar a los resultados iniciales. No se observaron diferencias en la reactividad ente el plasma del donante X y el plasma del control. Estos resultados mostraron la presencia de anticuerpos en el plasma del donante X con una amplia reactividad cruzada con antigenos/epitopos en RBC de conejo. Ademas, estos resultados sugieren que un proceso mediado por RBC no es responsable de la respuesta pirogenica en conejos.

Tambien se analizo el plasma del donante X por los anticuerpos para antigenos de RBC humanos utilizando un panel de identification de anticuerpos de RBC. Se obtuvieron resultados negativos para todos los paneles, lo que confirma que el plasma del donante X no contiene aloanticuerpos clinicamente significativos.

Tambien se realizo la determination del fenotipo de antigeno en RBC del donante X, incluido el tiraje para antigenos de RBC que pertenecen a los sistemas grupos sanguineos Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, MNS, P, y Luterano. Los RBC del donante X fueron de un fenotipo de RBC comun, y no hubo resultados inusuales.

Ejemplo 6

Se analizaron los productos del plasma cascada abajo que contenian plasma de un donante X para identificar el factor responsable de la generation de la respuesta pirogenica. Utilizando transferencia Western se analizo la inmunoglobulina humana Globulina, intravenosa, que contenia caprilato al 10%/purificada por cromatografia (por ejemplo, IGIV-C al 10%, es decir, Gamunex®, Grifols Therapeutics Inc., anteriormente Talecris Biotherapeutics, Inc.) que se produjo de grupos de plasma que contenian el plasma del donante X.

Transferencia Western

Se aplicaron muestras de IGIV-C “pirogenica” producida de grupos de plasma que contienen plasma del donante X, IGIV-C no pirogenica producida de grupos de plasma sin plasma del donante X, suero de conejo, suero bovino fetal, y suero de caballo en 4 geles de SDS-PAGE reductoras al 4-20%. Un gel se tino con Instant Blue (figura 9A), mientras que los otros tres se transfirieron a membranas de PVDF (figuras 9B-D). Se hizo reaccionar una membrana con solo IgG anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina (figura 9B). Las membranas restantes se hicieron reaccionar con IGIV-C pirogenica o con IGIV-C no pirogenica y, a continuacion, con el conjugado de IgG anti-humana y fosfatasa alcalina (figuras 9C-D). Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: IGIV-C pirogenica (donante X); Carril 3: IGIV-C no pirogenica; Carril 4: suero de conejo; Carril 5: suero bovino fetal; Carril 6: suero de caballo.

El gel tenido con Instant Blue mostro que se cargaron en el gel cantidades comparables de suero de conejo, suero bovino fetal y suero de caballo. Carriles 4-6 en la figura 9A. La membrana tenida con solo IgG anti-humana mostro que el anticuerpo secundario (IgG antihumana) era especifico y solo reaccionaba con IgG humana (IGIV-C pirogenica y no pirogenica). Carriles 2 y 3 en la figura 9b. La membrana reacciono con IGIV-C pirogenica y el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

conjugado de IgG anti-humana y fosfatasa alcalina mostro que la IGIV-C pirogenica reaccionaba fuertemente con suero de conejo y debilmente con suero bovino fetal y suero de caballo. Carriles 4-6 en la figura 9C. La membrana reacciono con IGIV-C no pirogenica y el conjugado de IgG anti-humana y fosfatasa alcalina mostro que la IGIV-C no pirogenica reaccionaba debilmente con los tres sueros de prueba, incluyendo suero de conejo. Carriles 4-6 en la figura 9D. De manera colectiva, estos resultados indican que la IGIV-C pirogenica reacciona fuertemente con suero de conejo, mientras que la IGIV-C no pirogenica no lo hace.

Se aplicaron muestras de suero bovino fetal y varias concentraciones de suero de conejo en cuatro geles de SDS- PAGE al 4-20%. Se transfirieron tres geles en membranas de PVDF (figuras 10A-C), y un gel se tino con Instant Blue (figura 10D). Se hizo reaccionar una membrana con solo IgG anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina (figura 10A). Las membranas restante se hicieron reaccionar con IGIV-C pirogenica o con IGIV-C no pirogenica y, a continuacion, con el inmunoconjugado de IgG anti-humana y fosfatasa alcalina (figuras 10B-C). Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: suero bovino fetal; Carril 3: suero de conejo; Carril 4: suero de conejo, diluido 1:5; Carril 5: suero de conejo, diluido 1:10; Carril 6: suero de conejo, diluido 1:50.

La transferencia Western fue negativa cuando la membrana se sondo con IgG anti-humana sola. Figura 10A. Sin embargo, cuando la IGIV-C pirogenica se utilizo como Ab primario, reacciono de manera especifica con suero de conejo no diluido y suero de conejo diluido 1:5 y 1:10. Veanse los carriles 3-5 en la figura 10B. La dilucion 1:50 del suero de conejo no era reactiva (Carril 6). Solo se detecto suero de conejo no diluido cuando se utilizo IGIV-C no pirogenica como anticuerpo primario. Carril 4 en la figura 10C. El gel tenido con Instant Blue mostro las cantidades relativas de suero bovino fetal y suero de conejo que se cargaron en los geles. Carriles 2-3 en la figura 10D. Sobretodo, estos resultados indican que la IGIV-C pirogenica contiene 10 veces mas anticuerpos contra suero de conejo que la IGIV-C no pirogenica.

Ejemplo 7

Microscopia de fluorescencia y aglutinacion de WBC de rata

Se aislaron WBC de rata de sangre completa mediante centrifugacion de gradiente de densidad utilizando Histopaque®. Los WBC de rata se hicieron reaccionar con plasma del donante X tal como se ha descrito en el ejemplo 2 anterior. El plasma del donante X produjo una aglutinacion y fluorescencia distinta con WBC de rata. Vease la figura 11.

Ejemplo 8

Resumen de resultados

Los resultados de los experimentos de microscopio (figuras 1-6) y citometrla de flujo (figuras 7-8) indicaron que la IgG del donante X se unia facilmente a WBC de conejo. Se demostro la union a anticuerpo mediante la aglutinacion y la intensidad fluorescente. Aunque el plasma de control produjo cierta fluorescencia con WBC de conejo, el grado de fluorescencia fue significativamente inferior que el observado con el donante X. El plasma de control no provoco aglutinacion de WBC de conejo en ninguno de los experimentos, mientras que el plasma del donante X produjo aglutinacion de manera sistematica. El plasma del donante X (IgG) no produjo aglutinacion con WBC humanos en ninguno de los experimentos, lo cual indica que la IgG del donante X no se unio a WBC humanos.

La union de la IgG del donante X a WBC de conejo es un probable desencadenante de la activacion de WBC de conejo y la liberacion de pirogenos endogenos (leucociticos), lo cual causaba la respuesta a la fiebre observada.

Los ensayos de pirogeno de conejo realizados sobre la familia inmediata del donante X (es decir, padres, hermanos e hijos) fueron, de manera uniforme, negativos. tabla 7. Estos resultados indicaron que las unicas propiedades de la IgG del donante X, con respecto a la respuesta de temperatura de los conejos, no se basaban en un alelo dominante, sino que eran especificas de anticuerpo para el donante X.

Los experimentos con RBC de conejo demostraron que tanto el plasma del donante X como el plasma de control contenlan anticuerpos con una amplia reactividad cruzada con un antigeno en RBC de conejo. El plasma del donante X y el plasma de control produjeron reacciones muy similares con RBC de conejo, lo que sugerla que un proceso mediado por RBC no es responsable de la respuesta pirogenica en conejos.

Los experimentos de transferencia Western mostraron que la IGIV-C pirogenica (que contenia aislados de plasma del donante X) reacciona de manera intensa con suero de conejo, mientras que la IGIV-C no pirogenica no lo hace. Esto indica que la presencia de IgG atipicas del donante X en la IGIV-C pirogenica era responsable para obtener una respuesta pirogenica en la prueba de pirogenos segun USP. Ademas, los experimentos de transferencia Western mostraron que la IGIV-C pirogenica contiene 10 veces mas anticuerpos contra el suero de conejo que la IGIV-C no pirogenica. Esto indicaba un probable efecto aleatorio de los anticuerpos atipicos del donante X que provocaba las respuestas pirogenicas.

Los experimentos con globulos blancos de rata muestran que el plasma del donante X es capaz de reaccionar de forma cruzada con WBC de rata y provocar la aglutinacion de los mismos. Estos resultados sugirieron que la exposicion directa a ratas o la exposicion indirecta por portadores de insectos de roedores (por ejemplo, pulgas), posela conducir a una inmunidad de inmunoglobulina IgG “atipica” con una reactividad cruzada tanto con celulas de 5 rata como de conejo.

Ejemplo 9

Ensayos de alto rendimiento

10

Se realizan experimentos ELISA, fluorescencia, o transferencia Western de alto rendimiento mediante la incubacion de muestras de prueba en placas de 96 pocillos, 192 pocillos, o 384 pocillos o membranas, el lavado, bloqueo, y sondeo de las muestras utilizando inmunoconjugados de enzima o fluoroforo y, a continuacion, el analisis de los resultados a traves de la fluorometrla, luminometrla, densitometrla, colorimetrla o absorbancia de UV/visible, entre 15 otros metodos de deteccion. Dichos ensayos de alto rendimiento permiten un analisis en linea de muestras de sangre o plasma o productos antes, durante y despues del procesado y pueden eliminar muestras de reactivos, tales como las que contienen inmunoblogulinas atipicas, las cuales pueden producir falsos positivos en los resultados de pirogenos de los ensayos.

20

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Metodo para identificar anticuerpos reactivos atipicos en un proceso de fabricacion de productos sangulneos, en el que los anticuerpos reactivos atipicos dan lugar a falsos positivos en el ensayo de pirogenos en conejo, comprendiendo el metodo:

(a) obtener una muestra de sangre o plasma;

(b) analizar la muestra y un control utilizando alguno o mas de uno entre aglutinacion celular; microscopia de fluorescencia, inmunoprecipitacion, inmunodifusion, inmunofluorescencia, ELISA, citometrla de flujo, FACS o transferencia Western a fin de determinar si la muestra contiene anticuerpos atipicos que tienen reactividad cruzada con globulos blancos de conejos;

(c) comparar los resultados de la muestra y la prueba de control;

(d) determinar si la muestra contiene anticuerpos atipicos reactivos, y;

(e) interceptar una unidad de sangre o plasma que era la fuente de la muestra si la muestra contiene anticuerpos atipicos reactivos.

y en el que los anticuerpos reactivos atipicos tienen reactividad cruzada con antigenos de globulos blancos de conejo y provocan una respuesta pirogenica durante el ensayo de pirogenos en conejos.
2. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que en la etapa (b) la muestra y un control se analizan utilizando un ensayo de aglutinacion celular.
3. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la etapa (b) la muestra y un control se analizan utilizando citometria de flujo.
4. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la etapa (b) la muestra y un control se analizan utilizando transferencia Western.
5. Metodo, segun la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente analizar la muestra y un control utilizando el ensayo de lisado de amebocitos de limulus (LAL).