ES2586850T3 - Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo dirigido a una proteína IRT3 humana, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína IRTA3 humana es la secuencia de 734 aminoácidos expuesta en la Figura 18C1-18C2 (SEQ ID NO: 5) con la condición de que el anticuerpo no se una a los aminoácidos 1-186 de la proteína.

Description

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Figuras 18C-1-18C-2. ADNc de IRTA3 y secuencia de aminoácidos de la proteína IRTA3 codificada.

Figuras 18D-1-18D-2. ADNc de IRTA4 y secuencia de aminoácidos de la proteína IRTA4 codificada.

Figuras 18E-1-18E-2. ADNc de IRTA5 y secuencia de aminoácidos de la proteína IRTA5 codificada.

Descripción detallada de la invención

Las siguientes abreviaturas convencionales se utilizan en toda la memoria para indicar nucleótidos específicos: C = citosina; A = adenosina; T = timidina y G = guanosina.

Esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína receptora de inmunoglobulina, Asociada a la Translocación de Receptores de la superfamilia de Inmunoglobulinas, IRTA3.

Según se utiliza en la presente memoria los genes "Asociados a la Translocación de Receptores de Inmunoglobulinas", "IRTA" son moléculas de ácido nucleico que codifican los receptores de la superficie celular novedosos de la superfamilia de inmunoglobulinas en las células B que son importantes en el desarrollo de células B, y cuya expresión anormal, p. ej., expresión desregulada, perturba las respuestas inmunológicas de las células B en la superficie celular y por lo tanto están implicadas en las neoplasias malignas de las células B, incluyendo la linfomagénesis.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas denominadas proteínas "MUM-2" y "MUM-3" en la Primera Serie de Experimentos que ahora se denominan genes "IRTA-1" e "IRTA-2", es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas IRTA-1 e IRTA-2, respectivamente. Las proteínas IRTA-3, 4 y 5 son miembros de la misma la superfamilia de genes de inmunoglobulina como son las proteínas IRTA-1 e IRTA-2.

En una realización de la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente ,la proteína IRTA codificada es la proteína IRTA2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 18C-1-18C-2 (SEQ ID NO: 5).

En otra realización de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente, la molécula de ácido nucleico es ADN. En realizaciones adicionales, el ADN es ADNc. En realizaciones adicionales, el ADN es ADN genómico. En otra realización, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN. En otra realización más, la molécula de ADN es ADNc que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 18A (SEQ ID NO: 2).

En una realización preferida de la molécula de ácido nucleico aislada, las moléculas de ácido nucleico codifican la proteína IRTA3 humana.

En otra realización preferida, las moléculas aisladas de ácido nucleico están unidas operativamente a un promotor de la transcripción de ADN. En otra realización preferida más de la molécula de ácido nucleico aislada, el promotor comprende un promotor bacteriano, de levadura, de insectos, de planta o de mamífero.

Esta invención proporciona un vector que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente que codifican la proteína IRTA3, incluyendo pero no limitada a la proteína IRTA3 de mamífero, de las cuales se prefieren la humana y la murina.

En una realización, el vector es un plásmido.

Esta invención proporciona una célula anfitriona que comprende el vector descrito anteriormente que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente que codifican la proteína IRTA3. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico aisladas en tales vectores están unidas operativamente a un promotor de la transcripción de ADN. En otra realización de la célula anfitriona, se selecciona la célula de un grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula vegetal, y una célula de insecto y una célula de mamífero.

Se proporciona un método para producir un polipéptido (proteína) IRTA que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una proteína receptora de inmunoglobulina, Asociada a la Translocación de Receptores de la superfamilia de Inmunoglobulinas, IRTA, en una célula anfitriona adecuada; y (b) cultivar la célula resultante con el fin de producir el polipéptido.

En realizaciones adicionales, la proteína IRTA producida por el método descrito anteriormente puede ser recuperada y en otra realización más, puede ser purificada total o parcialmente. En una realización, la proteína IRTA es IRTA3.

En una realización adicional, la proteína IRTA puede ser una proteína de mamífero. En otra realización adicional, la proteína de mamífero puede ser una proteína IRTA humana o de ratón.

Los genes IRTA (moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas IRTA IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4 e IRTA5) son útiles para la producción de las proteínas IRTA codificadas de ese modo. Las proteínas IRTA son útiles para la producción de anticuerpos; tales anticuerpos se utilizan como reactivos para el diagnóstico diferencial de los subtipos de linfoma en hematopatología. Los anticuerpos dirigidos contra las proteínas IRTA y que se unen específicamente a las proteínas IRTA también tienen usos terapéuticos, es decir, para dirigirse específicamente a las

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células tumorales, que pueden ser utilizados y administrados de manera similar a "Rituximab" (un anticuerpo anti-CD20), que es un anticuerpo aprobado por la FDA para el tratamiento de los linfomas positivos para CD20 con recaída (Foon K., Cancer J. 6 (5):273). Los anticuerpos anti-IRTA1, anti-IRTA2, anti-IRTA3, anti-IRTA4 y anti-IRTA5 también son marcadores útiles para el aislamiento de subconjuntos específicos de células B en estudios de investigación de la biología de células B normales y tumorales. Por otra parte, los anticuerpos anti-IRTA1, anti-IRTA2, anti-IRTA3, anti-IRTA4 y anti-IRTA5 son reactivos de investigación útiles para estudiar experimentalmente la biología de señalización en las células B normales y tumorales.

Los métodos para introducir moléculas de ácido nucleico en células son bien conocidos para los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, el uso de vectores virales y la co-precipitación con fosfato de calcio. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas IRTA IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4 e IRTA5 se pueden introducir en las células para la producción de estas proteínas IRTA.

Se pueden emplear numerosos vectores para la expresión de las proteínas de la invención IRTA3. Tales vectores, incluyendo los vectores plasmídicos, los vectores cósmidos, los vectores de bacteriófagos y otros virus, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una clase de vectores utiliza elementos de ADN que derivan de virus animales tales como virus del papiloma bovino, virus de polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MoMLV), virus del bosque Semliki o virus SV40. Adicionalmente, las células que han integrado de forma estable el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células anfitrionas transfectadas. Los marcadores pueden proporcionar, por ejemplo, prototrofía a un anfitrión auxótrofo, resistencia a biocidas o resistencia a metales pesados tales como el cobre. El gen marcador seleccionable puede ser directamente ligado a las secuencias de ADN que se van a expresar, o puede ser introducido en la misma célula por medio de transformación simultánea.

Los elementos reguladores requeridos para la expresión incluyen secuencias promotoras que se van a unir a ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripción para la unión al ribosoma. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima del ARNm. Estos elementos adicionales pueden incluir señales de empalme, así como potenciadores y señales de terminación. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano incluye un promotor tal como el promotor lac y para el inicio de la transcripción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG. De un modo similar, un vector de expresión eucariótico incluye un promotor heterólogo u homólogo para la ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación aguas abajo, el codón de inicio AUG, y un codón de terminación para la separación del ribosoma. Tales vectores se pueden obtener comercialmente o se pueden ensamblar a partir de las secuencias descritas por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo los métodos descritos anteriormente para construir vectores en general.

Estos vectores se pueden introducir en una célula anfitriona adecuada para formar un sistema vector anfitrión para producir las proteínas de la invención. Los métodos de elaboración de sistemas de vectores anfitriones son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las células anfitrionas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas (incluyendo células Gram positivas), células de levadura, células fúngicas, células de insecto y células animales. Las células animales adecuadas incluyen, pero no se limitan a células HeLa, células Cos, células CV1 y diversas células de mamíferos primarias. Se pueden utilizar numerosas células de mamíferos como anfitriones, incluyendo, pero no limitadas a, fibroblastos de ratón, células NIH-3T3, células CHO, células HeLa, células Ltk y células COS. Las células de mamíferos pueden ser transfectadas por métodos bien conocidos en la técnica tales como precipitación con fosfato cálcico, electroporación y microinyección.

Se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos capaces de hibridar específicamente con una secuencia única incluida dentro de la secuencia de la molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína IRTA3, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 18C-1-18C-2. En otros aspectos, las moléculas de ácido nucleico aisladas se marcan con un marcador detectable. En otras realizaciones adicionales de las moléculas de ácido nucleico aisladas, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un isótopo radiactivo, enzima, colorante, biotina, una marca fluorescente o una marca quimioluminiscente.

Se describe un método para detectar una neoplasia maligna de las células B o un tipo de neoplasia maligna de las células B en una muestra de un sujeto en donde la neoplasia maligna de las células B comprende una reordenación cromosómica Iq21, que comprende:

a) poner en contacto la muestra de ARN obtenida del sujeto con la molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos capaces de hibridar específicamente con una secuencia única incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la proteína IRTA3 humana en condiciones que permiten la hibridación del ARN de la etapa (a) con la molécula de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con una secuencia única incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la proteína IRTA3 humana, en donde la molécula de ácido nucleico está marcada con un marcador detectable; y b) detectar cualquier hibridación en la etapa (a) en donde la detección de hibridación indica la presencia de neoplasia maligna de las células B o un tipo de neoplasia maligna de las células B en la muestra.

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Esta invención proporciona una proteína IRTA3 purificada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 18C-1-18C-2 (SEQ ID NO: 5). En una realización de la proteína IRTA3 purificada, la proteína IRTA3 es IRTA3 humana.

Con el fin de facilitar la comprensión de la sección de Detalles Experimentales siguiente, ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia se describen mejor en Sambrook, et al. (1989) y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York: 1988.

Esta invención proporciona uno o varios anticuerpos dirigidos a un epítopo de proteína IRTA3 purificada, o uno o varios fragmentos de los mismos, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 18C-1-18C-2.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" incluye, pero no se limita a, anticuerpos tanto de origen natural como de origen no natural. Específicamente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos de unión de los mismos. Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos y anticuerpos completamente sintéticos, y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos policlonales y monoclonales pueden ser "purificados", lo que significa que los anticuerpos policlonales y monoclonales están libres de cualquier otro anticuerpo. Según se utiliza en la presente memoria, anticuerpo parcialmente purificado significa una composición de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen específicamente a la proteína IRTA de la invención sujeto, y consta de menos impurezas de proteína que el suero del cual derivan los anticuerpos. Una impureza de proteína es una proteína distinta de los anticuerpos específicos para la proteína IRTA de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos parcialmente purificados pueden ser una preparación de IgG.

Los anticuerpos policlonales (anticuerpos anti-IRTA) se pueden producir mediante la inyección a un animal anfitrión tal como un conejo, rata, cabra, ratón u otro animal del inmunógeno o los inmunógenos de esta invención, p. ej. una IRTA3 humana purificada descrita más abajo. Los sueros se extraen del animal anfitrión y se escrutan para obtener anticuerpos policlonales que son específicos para el inmunógeno. Los métodos de escrutinio de anticuerpos policlonales son bien conocidos para los expertos normales en la técnica tales como los descritos en Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York: 1988)

Los anticuerpos monoclonales anti-IRTA de la presente invención pueden ser producidos mediante la inmunización, por ejemplo, de ratones con un inmunógeno (el polipéptido IRTA o fragmentos del mismo descritos en la presente memoria). A los ratones se les inocula por vía intraperitoneal una cantidad inmunogénica del inmunógeno descrito anteriormente y a continuación se refuerza con cantidades similares de inmunógeno. Se recogen los bazos de los ratones inmunizados unos pocos días después del refuerzo final y se prepara una suspensión de células a partir de los bazos para su uso en la fusión.

Los hibridomas se pueden preparar a partir de los esplenocitos y un compañero tumoral murino utilizando la técnica de hibridación de células somáticas general de Kohler, B. y Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497. Se pueden utilizar en la hibridación las líneas de mieloma murino disponibles, tales como las de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA. Básicamente, la técnica implica la fusión de las células tumorales y los esplenocitos utilizando un fusógeno tal como polietilenglicol. Después de la fusión las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, tal como medio HAT, para eliminar células parentales no hibridadas. Los hibridomas se pueden expandir, si se desea, y los sobrenadantes se pueden analizar por procedimientos de inmunoanálisis convencionales, por ejemplo radioinmunoanálisis, utilizando el agente inmunizante como antígeno. Los clones positivos se pueden caracterizar adicionalmente para determinar si satisfacen los criterios de los anticuerpos de la invención.

Los hibridomas que producen tales anticuerpos se pueden hacer crecer in vitro o in vivo utilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los medios de cultivo o de los fluidos corporales, según corresponda, por medio de procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea.

En la práctica de la presente invención cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente se puede marcar con un marcador detectable. En una realización, el anticuerpo marcado es un anticuerpo marcado purificado. El término "anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, anticuerpos tanto naturales como no naturales. Específicamente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos de los mismos. Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos y anticuerpos completamente sintéticos, y fragmentos de los mismos. Los "radicales detectables" que funcionan como marcas detectables son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, una marca fluorescente, un átomo radiactivo, un ion paramagnético, biotina, una marca quimioluminiscente o una marca que se puede detectar a través de una etapa enzimática secundaria o de unión. La etapa enzimática secundaria o de unión puede comprender el uso de digoxigenina, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, fluoresceína o estreptavidina/biotina. Los métodos de marcaje de anticuerpos son bien conocidos en la técnica.

Los métodos de recuperación de suero de un sujeto son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos de purificación parcial de anticuerpos también son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, a modo de ejemplo, filtración, cromatografía de intercambio iónico, y precipitación.

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humanos. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano.

Esta invención proporciona un método de diagnóstico de neoplasia maligna de células B que comprende una reordenación cromosómica Iq21 en una muestra de un sujeto que comprende:

a) poner en contacto la muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo dirigido a una proteína IRTA3 purificada capaz de unirse específicamente con una proteína IRTA3 humana sobre una superficie celular de una célula cancerosa en condiciones que permiten la unión del anticuerpo con la proteína IRTA3 humana sobre la superficie celular de la célula cancerosa, en donde el anticuerpo está marcado con un marcador detectable; y b) detectar cualquier unión en la etapa (a), en donde la detección de unión indica un diagnóstico de neoplasia maligna de células B en la muestra.

En una realización del método de diagnóstico descrito anteriormente de neoplasia maligna de células B, la proteína IRTA es IRTA3.

En otra realización del método, la proteína IRTA es la proteína IRTA humana o de ratón. En una realización adicional la proteína IRTA es purificada. En una realización preferida de este método, la neoplasia maligna de células B se selecciona entre el grupo que consiste en linfoma de células B, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de células grandes y linfoma folicular. En otra realización más de este método, el linfoma de células B es linfoma de células B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realización preferida de este método, el linfoma de células B es linfoma no Hodgkin.

Se describe un método para detectar la proteína IRTA humana en una muestra que comprende: a) poner en contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos anti-IRTA descritos anteriormente bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y la IRTA en la muestra; y b) detectar el complejo formado en la etapa (a), detectando de ese modo la presencia de IRTA humana en la muestra. En una realización la proteína IRTA detectada puede ser una proteína IRTA3, que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 18C-1-18C-2. Como se ha descrito anteriormente en este documento, la detección del complejo formado se puede conseguir mediante el uso de anticuerpos marcados con un marcador detectable y la determinación de la presencia del complejo marcado.

La detección de la proteína IRTA humana en una muestra de un sujeto es otro método de diagnóstico de neoplasia maligna de células B en un sujeto. En una realización de este método de diagnóstico, la neoplasia maligna de células B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de células B, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de células grandes y linfoma folicular. En otra realización adicional de este método, el linfoma de células B es linfoma de células B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realización preferida de este método, el linfoma de células B es linfoma no Hodgkin.

Esta invención proporciona la utilización de un tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer de células B, que comprende administrar al sujeto una cantidad de anticuerpo anti-IRTA eficaz para unirse a las células cancerosas que expresan una proteína IRTA con el fin de evitar el crecimiento de las células cancerosas y un portador farmacéuticamente aceptable, tratando de este modo al sujeto. El crecimiento y la proliferación de las células cancerosas es inhibido de ese modo y las células cancerosas mueren. En una realización de la utilización anteriormente descrita, la proteína IRTA es IRTA3 humana.

En una realización preferida de la utilización descrita anteriormente para el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer de células B, el anticuerpo anti-IRTA es un anticuerpo monoclonal. En otra realización del método, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino o un anticuerpo monoclonal humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico. En una realización adicional, el anticuerpo anti-IRTA es un anticuerpo policlonal. En una realización, el anticuerpo policlonal puede ser un anticuerpo policlonal murino o humano. En una realización preferida, el cáncer de células B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de células B, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de células grandes y linfoma folicular. En otra realización preferida, el linfoma de células B es linfoma de células B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En una realización preferida adicional, el linfoma de células B es linfoma no Hodgkin. En una realización preferida del método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer de células B descrito anteriormente, la administración de la cantidad de anticuerpo anti-IRTA eficaz para unirse a las células cancerosas que expresan una proteína IRTA es mediante liberación intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intralinfática, intramuscular, intralesional, parenteral, epidural, subcutánea; por infusión, por medio de liberación mediada por liposomas, liberación en aerosol; tópica, oral, nasal, anal, ocular u ótica. En otra realización preferida de los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo anti-IRTA se puede conjugar con un agente terapéutico. En otras realizaciones preferidas, el agente terapéutico es un radioisótopo, una toxina, un toxoide o un agente quimioterapéutico.

Se describe una utilización para tratar a un sujeto que tiene un cáncer de células B, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con una molécula de ARNm que codifica una proteína IRTA humana con el fin de evitar la expresión en exceso de la proteína IRTA humana, con el fin de detener el crecimiento celular o de inducir la muerte celular de las células cancerosas que expresan la proteína o las proteínas IRTA y un portador farmacéuticamente aceptable. Tratando de

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y 2x107 de líneas celulares restantes) se solubilizaron en tampón de lisis Triton X-100 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], TX-100 al 1%, BSA al 0,1%) en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Biochemicals). Los productos lisados se incubaron a 4°C durante 2 horas con 4 mg/ml del anticuerpo monoclonal Núm. 117-332-1 (Yu et al., 1990) (Tanox Biosystems, Inc, Houston, Texas) que se originaron contra la porción extracelular del péptido de membrana IgA. Los complejos inmunitarios se aislaron con proteína G-Sepharose (Pharmacia) antes de la electroforesis sobre geles en gradiente al 10-20% de Tris-HCl (BioRad) y de la inmunotransferencia, utilizando 15 mg/ml del anticuerpo Núm. 117-332-1. Los resultados se visualizaron por medio de ECL (Amersham).

RESULTADOS

Clonación Molecular de la t(1;14)(q21;q32)

Las translocaciones cromosómicas que involucran al locus de la cadena pesada de Ig (IGH) se producen a menudo dentro o cerca de regiones de cambio de IgH como resultado de eventos de recombinación de cambio "ilegítimos" (Dalla-Favera et al., 1983; Chesi et al., 1996; Chesi et al., 1998). Los puntos de rotura se pueden detectar mediante análisis de hibridación por transferencia Southern como alelos reordenados en los que las secuencias de la región constante (CH) de IGH han perdido su asociación sinténica con las secuencias de la región de unión (JH) de IGH y de cambio 5' (S) (Dalla-Favera et al., 1983; Neri et al., 1988; Neri et al., 1991; Bergsagel et al., 1995). Este análisis ha llevado a la identificación de varios compañeros cromosómicos para el locus IgH en B-NHL y MM (Taub et al., 1982; Dalla-Favera et al., 1983; Neri et al., 1988; Neri et al., 1991; Ye et al., 1993; Chesi et al., 1996; Richelda et al., 1997; Iida et al., 1997; Dyomin et al., 1997; Dyomin et al., 2000). Los autores de la presente invención emplearon la misma estrategia con el fin de clonar la región del punto de rotura de 1q21 en FR4, una línea celular de mieloma que porta una t(1;14)(q21;q32), según lo determinado por análisis citogenético (Tagawa et al., 1990; Taniwaki M, resultados no publicados). Dos "fragmentos ilegítimamente reordenados se identificaron en el locus de la cadena pesada Cα en FR4 mediante análisis de transferencia Southern (datos no mostrados), y se clonaron a partir de bibliotecas de fagos construidas a partir de ADN genómico de FR4. El mapeo de restricción, la hibridación por transferencia Southern y la secuenciación de nucleótidos parcial de dos fagos genómicos (clones lambda FR4B-5 y λ FR4S-a, Figura 8A) demostraron que contenían los puntos de rotura cromosómicos de una translocación equilibrada recíproca entre el locus Cα1 en 14q32 y secuencias distintas de TGH. A continuación se utilizó una sonda (1.0EH) que representaba estas secuencias distintas de IgH (Figura 8A) para clonar el correspondiente locus genómico normal a partir bibliotecas genómicas humanas del cromosoma artificial del fago P1 (PAC), y el cromosoma artificial de levadura (YAC). El análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH) de las propagaciones de la metafase humana normal utilizando el clon PAC no quimérico de 100 kb 49A16 que abarca la región del punto de rotura (véase más abajo, Figura 13), identificó el locus cromosómico compañero como derivado de la banda 1q21 (Figura 8C). El mapeo de un único locus dentro del cromosoma 1 se confirmó por hibridación de dos sondas no repetitivas a ADN de un panel de híbridos de células somáticas representativo de cromosomas humanos individuales (datos no mostrados). Estos resultados fueron compatibles con la clonación de secuencias que abarcan la t(1;14)(q21;q32) en FR4.

El análisis de secuencia de las regiones de punto de rotura en los cromosomas derivados y el alineamiento con los loci 14q32 y 1q21 de la línea germinal revelaron que el punto de rotura se había producido en el intrón entre CH3 y el exón transmembrana de Cα1 en el cromosoma 14. Aunque la región del punto de rotura estaba desprovista de secuencias señal de recombinación (RSS) o secuencias de señal de cambio (Kuppers et al., 1999), la secuencia CTTAAC (subrayada en la Figura 8B) estaba presente en ambos cromosomas 14 y 1 de la línea germinal en la unión del punto de rotura. Una copia de esta secuencia estaba presente en cada uno de los cromosomas derivados, con una ligera modificación en la copia der(1) (mutación puntual en el último nucleótido: C a G). Los nucleótidos AT que preceden a CTTAAC en el cromosoma 1 también estaban presentes en ambos cromosomas derivados (Figura 8B). La translocación no dio lugar a ninguna pérdida de secuencias en el cromosoma 1. Por otro lado, en la porción del cromosoma 14 de der(1) los autores de la presente invención observaron dos deleciones aguas arriba de la unión del punto de rotura: una deleción de 16 nucleótidos (GGCACCTCCCCTTAAC) y una deleción de 4 nucleótidos (TGCA) 6 nucleótidos aguas arriba (Figura 8B). Estas observaciones indican que la t(1;14)(q21;q32) en las células FR4 representa una translocación recíproca equilibrada posiblemente facilitada por la presencia de secuencias homólogas. (CTTAAC) en ambos cromosomas.

La región del punto de rotura de 1q21 contiene genes que codifican nuevos miembros de la superfamilia de receptores de inmunoglobulina

Los autores de la presente invención investigaron a continuación si la región del cromosoma 1q21 que abarca el punto de rotura de la translocación en FR4 contiene una unidad transcripcional. El ADN de los clones de PAC parcialmente solapantes 49A16 y 210K22 (Figura 13) fueron clonados por medio de "pistola génica" en plásmidos, secuenciados y analizados para determinar la homología con genes conocidos en bases de datos del genoma humano. Paralelamente, se buscaron los genes candidato en el PAC 49A16 por medio de una estrategia de captura de exones (Church et al., 1994).

El mapeo de los exones candidato sobre los clones genómicos de 1q21 reveló que el punto de rotura de FR4 se había producido entre dos exones atrapados (véase más abajo, Figura 13), que pertenecían al mismo transcrito, ya que podrían estar conectados por RT-PCR utilizando ARN de bazo. A continuación, se utilizó este producto de RT

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PCR como sonda para escrutar una biblioteca de ADNc de bazo con el fin de aislar clones completos correspondientes a este transcrito. Se identificaron dos conjuntos de clones de ADNc, que pertenecían a dos transcritos distintos y que compartían una identidad de secuencia de ARNm de 76% dentro de la región de la sonda de 443 pb. Los clones de ADNc completos para ambos transcritos se obtuvieron mediante amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) en ADNc de bazo humano que generó productos de extensión 5' y 3'.

La estructura esquemática del ADNc que representa el primer transcrito se representa en la Figura 9A. El uso alternativo de los tres posibles sitios de poliadenilación en su región no traducida 3 da lugar a tres especies de ARNm de 2,6, 2,7 y 3,5 kb, que codifican la misma supuesta proteína de 515-aminoácidos (Figura 9A). Las características pronosticadas de esta proteína incluyen un péptido señal, de acuerdo con la regla [-3, -1] (von Heijne, 1986), cuatro dominios extracelulares de tipo Ig que llevan tres sitios de glicosilación potenciales unidos a (N) de asparragina (Figura 9A), uno transmembrana de 16 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 106 aminoácidos, con tres supuestos dominios de unión de homología 2 a Src (SH2) consenso (Unkeless y Jin, 1997) (Figura 10B). Estos dominios de unión a (SH2) muestran características de motivos tanto ITAM (Motivo Inmunorreceptor basado en la Activación de Tirosina D/EX7D/EX2YXXL/IX6-8YXXL/I; donde X indica los residuos no conservados) (Reth, 1989) como motivos ITIM (Motivo de Inhibición de Inmunorreceptor basado en Tirosina -5/V/L/IYXXL/V, donde X indica residuos no conservados) (Unkeless y Jin, 1997). Como se muestra en la Figura 10B, los primeros dos dominios de unión a SH2 están espaciados por 8 aminoácidos, en consonancia con el motivo ITAM consenso. A diferencia del consenso, el residuo glutamato (E) se posiciona cuatro en lugar de dos aminoácidos antes de la primera tirosina (Y) (Figura 10B), y la posición +3 con respecto a la tirosina (Y) está ocupada por valina (V) en lugar de leucina (L) o isoleucina (I) (Cambier, 1995). Los tres dominios se ajustan al consenso ITIM y cada uno está codificado por un exón separado, como es el caso de ITIM. Así, su disposición puede dar lugar a tres ITIM o posiblemente a un ITAM y un ITIM. La estructura general de esta proteína sugiere que representa un nuevo receptor transmembrana de la superfamilia de Ig y por lo tanto se denominó IRTA1 (gen 1 Asociado a la Translocación del Receptor Inmunitario 1).

El segundo ADNc comparte homología con IRTA1 (68% de identidad de nucleótidos para la longitud del mensaje de IRTA1 que codifica su dominio extracelular) y fue denominado IRTA2. El locus IRTA2 es más complejo que IRTA1 y se transcribe en tres isoformas de ARNm principales (IRTA2a, IRTA2b, IRTA2c) de diferente peso molecular (2,8, 4,7 y 5,4 kb respectivamente), cada uno con un propia única región no traducida 3' (Figura 9B). Adicionalmente, un transcrito de 0,6 kb (Figura 12A) surge del uso de una señal de poliadenilación temprana en el nucleótido 536 de IRTA2. Las tres isoformas de la proteína IRTA2 pronosticadas codificadas por estos transcritos comparten una secuencia de aminoácidos común hasta el residuo 560, que presenta un péptido señal común y seis dominios de tipo Ig extracelulares (Figura 9B). IRTA2a codifica una glicoproteína secretada de 759 aa con ocho dominios de tipo Ig seguido de 13 aminoácidos predominantemente polares únicos en su extremo C. IRTA2b diverge de IRTA2a en el residuo de aminoácido 560, y se extiende a lo largo de un corto tramo de 32 residuos adicionales, cuyo carácter hidrófobo es compatible con su acoplamiento a la membrana plasmática a través de un ancla de GPI (Ferguson y Williams, 1988). IRTA2c es la isoforma más larga cuya secuencia se desvía de IRTA2a en el aminoácido 746. Codifica una glicoproteína transmembrana de tipo I de 977 aa con nueve dominios de tipo Ig extracelulares, que alberga ocho sitios de glicosilación unidos a N potenciales, uno transmembrana de 23 aminoácidos y un dominio citoplásmico de 104 aminoácidos con tres motivos de unión a SH2 consenso (Figura 10B). Cada uno de los sitios de unión a SH2 en IRTA2c coincide con el consenso ITIM (Figura 10B) y es codificado por un exón separado. Estos rasgos sugieren que IRTA2c es un receptor transmembrana novedoso de la superfamilia de Ig con isoformas secretadas y unidas a GPI.

Homología entre las proteínas IRTA y los receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas

El alineamiento de aminoácidos de la totalidad de los dominios extracelulares de las proteínas IRTA1 e IRTA2 entre sí y con otros miembros de la superfamilia de Ig reveló una homología notable entre ellos (identidad de 47% y similitud de 51%) y una homología inferior, pero llamativa con la familia de proteínas receptoras de Fc gamma. Esta homología era más fuerte en las posiciones de aminoácidos conservados entre las diferentes clases de receptores de Fc. Entre los receptores de Fc, el receptor de IgG de la alta afinidad FCGRI (CD64) compartió los más altos niveles de homología con los tres primeros dominios Ig de IRTA1 e IRTA2 (identidad de 37% y similitud de 50%) a lo largo de toda su porción extracelular (Figura 10A). Se observaron niveles inferiores de homología entre las proteínas IRTA y los dominios extracelulares de otras moléculas de la superficie celular, incluyendo la molécula de adherencia endotelial de plaquetas humanas (PECAM1), la molécula de adherencia celular de linfocitos B (CD22) y la glicoproteína biliar 1 (BGP1) (22-25% de identidad, 38-41% de homología).

No existe homología aparente entre las IRTA y los miembros de la familia de receptores de Fc en sus dominios citoplásmicos. En contraste, existe una homología de aminoácidos significativa entre IRTA1 y PECAM1 (identidad de aminoácidos de 31% y homología de 45%), IRTA2c y BGP1 (identidad de 30%, homología de 35%) e IRTA2c y PECAM1 (28% de identidad, 50% de homología) (Figura 10B). Estas homologías sugieren el empleo de rutas de señalización aguas abajo similares por parte de estas proteínas diferentes.

IRTA1 e IRTA2 normalmente se expresan en subpoblaciones específicas de células B

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El patrón de expresión normal de los ARNm de IRTA1 e IRTA2 se analizó primero por hibridación de transferencia de Northern del ARN derivado de diferentes tejidos humanos normales y de las líneas celulares humanas que representan diferentes linajes hematopoyéticos y etapas de desarrollo de células B.

Se detectó la expresión de IRTA1 a un nivel muy bajo en ARN de bazo y ganglios linfáticos humanos (Figura 11A, panel izquierdo) y fue indetectable en todos los otros tejidos humanos analizados, incluyendo el hígado fetal, médula ósea, pulmón, placenta, intestino delgado, riñón, hígado, colon, músculo esquelético, corazón y cerebro (datos no mostrados). Entre las líneas de células B, la expresión de IRTA1 estaba ausente en líneas de células que representan células pre-B y células B del centro germinal, células plasmáticas y células de origen eritroide, células T y mieloide (datos no mostrados, véase Materiales y Métodos). La expresión fue detectable a niveles muy bajos solamente en líneas celulares linfoblastoides (LCL) inmortalizadas con EBV, que representan una subpoblación (inmunoblastos) situada aguas abajo de las células B del centro germinal en la diferenciación de células B. Sin embargo, la expresión se indujo en células ER/EB privadas de estrógeno que, al estar inmortalizadas por un genoma de EBV recombinante en el que el gen EBNA2 se fusiona con el receptor de estrógeno, proliferan en presencia de estrógeno, mientras se detienen en la fase G0/G1 tras la privación de estrógeno (Kempkes et al., 1995). La expresión de IRTA1 era apenas detectable en estas células en presencia de estrógeno, pero fue inducida (10 veces) después de la detención G0/G1 tras la retirada de estrógenos (Figura 11A, panel derecho). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que IRTA1 se expresa en una subpoblación linfoide presente en el bazo y los ganglios linfáticos y, presumiblemente, representada por células B en reposo.

Para investigar más el fenotipo y la distribución en los tejidos de las células que expresan IRTA1, los autores de la presente invención realizaron la hibridación in situ en tejido tonsilar humano utilizando una sonda de ADNc antisentido de IRTA1 (Figura 11B). Se procesaron las secciones seriadas para la hibridación in situ con una sonda de ADNc efectora de control (Panel Núm. 1 en la figura 11B), una sonda de ADNc antisentido (Panel Núm. 2) y tinción con hematoxilina y eosina (H & E) (Panel Núm. 3) para esbozar la arquitectura del tejido linfoide. La señal de hibridación de IRTA1 fue excluida del centro germinal y la zona de manto de los folículos y se concentró característicamente en la zona perifolicular con infiltraciones en la región intraepitelial (Figuras 11B-2, 11B-4). En esta región, sólo las células B fueron positivas tal como se documenta mediante la tinción con marcadores específicos de células B (IGD, no mostrado), y mediante análisis immnunohistoquímico con anticuerpos anti-IRTA1 y anti-B (CD20, PAX5), anti-T (CD3), y anti-monocitos (CD68) (no mostrados; G. Cattoretti et al., manuscrito en preparación.). Esta área perifolicular es la "zona marginal" equivalente a la amígdala, lo que representa un compartimiento de células B funcionalmente distinta que contiene la mayoría de las células B de memoria y las células B monocitoides (de Wolf-Peeters et al., 1997). Junto con el análisis de transferencia Northern de tejidos normales y líneas celulares, estos resultados indican que IRTA1 se expresa en una subpoblación de células B maduras en reposo topográficamente ubicada en la región perifolicular e intraepitelial, sitios ricos en células B de memoria.

En el caso de IRTA2, el análisis de transferencia Northern detectó todas las especies empalmadas alternativamente en ARNm de ganglio linfático, bazo, médula ósea e intestino delgado humanos, con una preponderancia relativa de la isoforma IRTA2a (Figura 12A, panel izquierdo). Entre las líneas de células hematopoyéticas de origen linfoide y no linfoide sometidas a ensayo, la expresión de IRTA2 se restringió a las líneas de células B con un fenotipo post-centro germinal inmunoblástico (Figura 12A, panel derecho). De manera similar a IRTA1, estaba ausente de las líneas celulares derivadas de células pre-B, centroblastos del centro germinal, células plasmáticas, células T, células eritroides y células mieloides (Figura 12A, panel derecho).

El análisis de hibridación in situ de tejido tonsilar humano, utilizando el ADNc de IRTA2 como sonda, fue compatible con los resultados del análisis de transferencia Northern. El ARNm de IRTA2 fue excluido en gran parte de la zona del manto del centro germinal, con la excepción de unas pocas células positivas (Figuras 12B-2, 12B4). Dentro del centro germinal, la zona oscura, representada por centroblastos, apareció negativa para IRTA2, mientras que la zona clara, rica en centrocitos, fue fuertemente positiva (Figuras 12B-2, 12B-4). Finalmente, el ARNm de IRTA2 se detectó en la región equivalente de la "zona marginal" fuera de los folículos de los centros germinales y en las regiones intraepiteliales e interfoliculares de la amígdala. Este patrón es compatible con la especificidad de IRTA2 para los centrocitos y las células post-B del centro germinal. Comparando sus patrones de expresión, los autores de la presente invención concluyen que ambos son específicos para las células B maduras, pero IRTA2 tiene un patrón más amplio de expresión que incluye centrocitos y células B interfoliculares, mientras IRTA1 está restringida a las células B de la zona marginal, muy probablemente células de memoria.

Organización genómica de los genes IRTA1 e IRTA2

Para entender las consecuencias de las anomalías 1q21 sobre la estructura y la expresión de los genes IRTA1 e IRTA2, los autores de la presente invención determinaron primero la organización de sus loci genómicos. El gen IRTA1 contiene 11 exones con un tamaño genómico total de 24,5 kb (Figura 13). Se encontró que el locus IRTA2 abarcaba una región genómica de aproximadamente 40 kb (Figura 13). Los tres productos empalmados alternativamente de IRTA2 comparten sus primeros 8 exones, en cuyo punto IRTA2b no utiliza el siguiente sitio de empalme, y termina introduciendo su región UTR 3'. Las isoformas IRTA2a y 2c se empalman en el exón 9, entrando IRTA2a en su UTR 3' después del exón 11 y empalmando IRTA2c en el exón 12 y extendiéndose hasta el exón 18 (Figura 13).

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Basándose en los datos de secuenciación, los autores de la presente invención determinaron que los genes IRTA1 e IRTA2 se encuentran a 21 kb el uno del otro, yuxtapuestos en la misma orientación transcripcional (Figura 13) que se extiende desde el telómero (5') hacia el centrómero (3'). En el locus 1q21, están estrechamente conectados el uno al otro, así como a tres genes adicionales que habían clonado recientemente los autores de la presente invención a través de su homología con las IRTA (I.M., manuscrito en preparación). Los cinco genes son contiguos, cubriendo una región de ~ 300 kb en 1q21. Esta región se encuentra en el intervalo entre los puntos de rotura de 1q21 referidos anteriormente. Basándose en la distancia entre clones genómicos que albergan los genes respectivos en el mapa Whitehead Institute Radiation Hybrid, se estima que el locus de IRTA1-2 se encuentra aproximadamente a 0,8 Mb de distancia del locus MUC1 hacia el telómero (N.P., datos no publicados; Dyomin et al., 2000; Gilles et al., 2000) y a menos de o igual a 7 Mb del locus FCGRIIB hacia el centrómero (N.P., datos no publicados).

La translocación t(1;14)(q21;q32) genera una proteína de fusión IRTA1/Ca1 en la línea celular de mieloma FR4

El análisis comparativo de restricción y de la secuencia de nucleótidos de la línea germinal frente a las secuencias reordenadas de los loci Ca1 e IRTA1 mostró que la translocación había fusionado las secuencias en el intrón 2 del gen IRTA1 a las secuencias intrónicas entre CH3 y el exón transmembrana de Ca1 en la misma orientación transcripcional (Figura 14A). Esto sugiere que, si las secuencias de IRTA1 se expresaban en el locus translocado, el sitio donante intacto en el límite 3' del exón IRTA1 y el sitio aceptor intacto en el 5' de Ca1 podrían ser utilizados para generar un ARNm de fusión IRTA1/Ca1, y posiblemente una proteína de fusión IRTA1/Ca1.

Con el fin de someter a ensayo esta predicción, los autores de la presente invención analizaron la expresión del ARNm de IRTA1 en FR4 por medio de análisis de transferencia Northern utilizando una sonda de ADNc de IRTA1 derivada del exón 1 (Figura 14A). Esta sonda detectaba un mensaje de 0,8 kb en FR4 que estaba ausente de otras líneas de células B, y era más corto que el mensaje normal de 2,5 kb detectable en células ER/EB (Figura 14B). Los autores de la presente invención clonaron este transcrito por medio de RT-PCR del ARNm de FR4 utilizando cebadores derivados de secuencias en el límite 5' del exón 1 de IRTA1 y el límite 3' del exón citoplásmico Cα (Figura 14A). Se obtuvo un producto de RT-PCR de FR4, pero no de la línea celular DAKIKI que expresa la IgA de la superficie de tipo salvaje, u otras líneas celulares que carecen de una translocación t(1;14) (datos no mostrados). El análisis de secuenciación directa del producto de PCR indicó que el empalme había ligado de manera precisa IRTA1 y Ca1 en los sitios de empalme canónicos y determinó que el transcrito de fusión tenía 820 pb de longitud.

El análisis del producto de proteína pronosticado indicó que el empalme IRTA1/Cα1 había dado lugar a una fusión entre el péptido señal IRTA1 y los dos primeros aminoácidos extracelulares, con el espaciador largo extracelular de 32 aminoácidos, el dominio transmembrana y la cola citoplasmática del receptor de IgA1 de membrana (mIgA1) (Figura 14C). Para el análisis de la expresión de esta proteína de fusión en extractos de proteína FR4, los autores de la presente invención utilizaron un anticuerpo dirigido contra residuos de aminoácidos extracelulares específicos para la isoforma transmembrana de Cα1 (Yu et al., 1990) para la inmunoprecipitación, seguido de transferencia Western. Los resultados de los autores de la presente invención demuestran que las células FR4, pero no una línea celular de control (DAKIKI) que expresa IgA de la superficie de tipo salvaje, expresan una proteína de 9,8 kDa acorde con el tamaño pronosticado de la proteína de fusión IRTA1/Cα1 (Figura 14D). Estos resultados muestran que el alelo translocado codifica una proteína de fusión, compuesta por el péptido señal y los dos primeros residuos extracelulares de IRTA1 (1,7 aminoácidos) fusionado a los dominios transmembrana y citoplásmicos codificados por Cα1 (71 aminoácidos). En contraste con la expresión en exceso de IRTA1/Ca1 en der(14), no se detectó expresión en FR4 para el transcrito recíproco Ca1/IRTA1 o para el gen IRTA2 intacto en der(1).

Con la excepción de FR4, no se detectó expresión de ARNm de IRTA1 en ninguna otra línea celular de mieloma o linfoma, independientemente del estatus de su banda cromosómica 1q21 (datos no mostrados). Por lo tanto, la fusión IRTA1/Ca representa un evento raro en las aberraciones de 1q21.

Desregulación frecuente de la expresión de IRTA2 en líneas celulares que portan anomalías de 1q21

Con el fin de establecer la relación física entre otros puntos de rotura de 1q21 y el locus de IRTA1/2, los autores de la presente invención realizaron un análisis FISH con el PAC 49A16 en el panel de líneas celulares BL y MM de los autores de la presente invención. De diez líneas celulares BL analizadas, siete con dup(1) (q21q32) y tres con translocaciones 1q21 (AS283A, BL104, B136), los autores de la presente invención detectaron tres señales correspondientes al locus de IRTA1/IRTA2 en siete de las primeras y dos de las últimas, en consonancia con dup(1)(q21q32) en el primer caso y dup(1) (q21q32) seguido de un punto de rotura de translocación en 1q21 en el segundo (Tabla 1). El análisis FISH de AS283A y BL136, utilizando sondas que abarcan el locus de IRTA y con clones genómicos vecinos, situó el punto de rotura de los cromosomas derivados fuera del locus de IRTA en ambas líneas celulares, a una distancia de >800 kb hacia el centrómero en AS283A y >800 kb hacia el telómero en BL136 (N.P., resultados no publicados). En consonancia con este hallazgo, el análisis de 30 casos de tumores primarios MM por medio de FISH de interfase con el YAC de 300 kb 23GC4 (Figura 13), mostró que 15 casos (50% del total analizado) tenían más de dos señales de FISH en interfase (datos no mostrados), mientras que el FISH de dos colores con dos clones de PAC que flanqueaban las fronteras centroméricas y teloméricas de YAC no detectó ninguna escisión de estas dos sondas en ninguno de los casos. Estos resultados indican que, con la excepción de FR4, los puntos de rotura de las aberraciones de 1q21 en BL o MM no están dentro de o en estrecha proximidad con la región genómica definida por IRTA1 e IRTA2. Sin embargo, el resultado coherente de cualquiera dup(1) (q21q32)

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Patrón de expresión diferencial de los genes de IRTA en células B maduras

Los genes IRTA muestran un patrón de expresión específico en diversos compartimentos de células B normales. IRTA1 está topográficamente restringida a las células B dentro de la región perifolicular, que se denominó originalmente zona marginal en el bazo, pero también es detectable en la mayor parte de los órganos linfoides (de Wolf-Peeters et al., 1997). Los datos de hibridación in situ que aquí se presentan han sido confirmados por análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos anti-IRTA1 que muestran que la proteína IRTA1 se expresa selectivamente en células B de la zona marginal, y, entre los NHL, en el linfoma de la zona marginal, los tumores derivados de estas células (G. Cattoretti et al., manuscrito en preparación). Por otra parte, IRTA2 tiene un patrón de expresión más amplio que incluye centrocitos GC, así como un amplio espectro de células perifoliculares, que pueden incluir inmunoblastos y células de memoria. Los datos iniciales sugieren que el patrón de expresión de IRTA3 es análogo al de IRTA2, mientras que IRTA4 e IRTA5 se expresan selectivamente en las células B de la zona del manto (I. Miller et al., manuscrito en preparación), el compartimiento pre-GC de las células B maduras (MacLennan, I.C., 1994). Esta restricción topográfica de la expresión génica de IRTA en los órganos linfoides sugiere que las moléculas de IRTA pueden desempeñar un papel en la migración o actividad de diversas subpoblaciones de células B en compartimentos específicos de células B funcionales. Además, la expresión de IRTA debería ser útil para el diagnóstico diferencial de los subtipos de NHL que derivan de diversos compartimentos de células B, en particular IRTA1 en el diagnóstico del linfoma de la zona marginal.

Locus de IRTA1 y anomalías de 1q21 en MM

En la línea celular FR4, la consecuencia de la translocación t(1;14) es la formación de un gen de fusión IRTA1/Cα1. A pesar del hecho de que este gen está dirigido por la región promotora de IRTA1, que normalmente es silencioso en las células plasmáticas, su expresión es alta en FR4, presumiblemente debido a la influencia de LCR 3' de Cα1, que es retenido aguas abajo del locus Cα1. El gen de fusión codifica una proteína de fusión IRTA1/Cα1 que contiene sólo el péptido señal y los primeros dos aminoácidos de IRTA1 unidos al receptor de IgA de la superficie. Este último ha sido desprovisto casi completamente de su dominio extracelular, pero conserva todos sus dominios transmembrana e intracelulares. Esta estructura indica que la proteína de fusión IRTA1/Cα1, aunque probablemente incapaz de unirse a cualquier ligando, puede conservar el potencial para la dimerización y la señalización. En particular, la porción extracelular derivada de IgA de membrana (m) contiene un residuo de cisteína, que puede estar implicado en enlaces disulfuro entre dos cadenas α o entre cadenas α y proteínas asociadas, tales como el receptor de la superficie coadyuvante CD19 (Leduc et al., 1997). La proteína de fusión también porta el dominio citoplásmico mIgA de 14 aminoácidos intacto, que está altamente conservado en evolución (Reth, 1992) y puede desempeñar un papel esencial en la proliferación, la supervivencia y la diferenciación de células B maduras, de forma análoga al papel de mIgG y mIgE (Kaisho et al., 1997). Por lo tanto, la aparición de la proteína IRTA1/Ca1 en FR4 puede haber proporcionado a las células una ventaja proliferativa y de supervivencia durante el desarrollo del tumor a través la activación independiente del ligando (antígeno) de la ruta de BCR. Este evento de fusión sin embargo, parece ser poco frecuente en las neoplasias malignas de células B, ya que hasta ahora los autores de la presente invención han sido capaces de detectarlo sólo en las células FR4.

Locus de IRTA2 y anomalías de 1q21 en MM y BL

La expresión anormal de IRTA2 es una consecuencia frecuente de las anomalías en 1q21. Aunque este gen no se expresa normalmente en centroblastos, las presuntas contrapartes normales de BL (Kuppers et al., 1999), ni en BL con 1q21 normal, sus niveles están regulados al alza un promedio de 10 veces en líneas celulares de BL con anomalías en 1q21. Esta desregulación parece ser específica para IRTA2 ya que todos los otros 4 genes de IRTA presentes dentro de 300 kb en 1q21, o bien no se expresan en BL (IRTA1), o bien su patrón de expresión no se corresponde con la presencia de anomalías en 1q21 (IRTA3, 4, 5, no mostrado). El mecanismo por el cual se produce este desregulación es difícil de determinar en ausencia de lesiones estructurales dentro o adyacentes al gen de IRTA2. Dado que las aberraciones heterogéneas que afectan a 1q21 ocasionan todas un número de copias en exceso del locus de IRTA, es posible que esto pueda conducir a trastornos de la regulación, como en el caso de un bajo nivel de amplificación de BCL2 en FL que carece de translocaciones (14;18) (Monni et al., 1997), REL en linfoma difuso de células grandes (Houldsworth et al., 1996; Rao et al., 1998) y desregulación de Ciclina D1 en algunos casos de MM con trisomía 11 (Pruneri et al., 2000). Por otra parte, las anomalías en 1q21, incluyendo translocaciones y duplicaciones, cambian el contexto genómico del locus de IRTA y pueden conducir a la desregulación de IRTA2 por elementos de organización de la cromatina potenciadores que actúan en cis distantes que actúan sobre su promotor como es el caso MYC en BL endémico (Pelicci et al., 1986) y MM (Shou et al., 2000) y para CCND1 en el linfoma de células del manto (Bosch et al., 1994; Swerdlow et al., 1995) y MM (Pruneri et al., 2000).

Las consecuencias biológicas de una expresión desregulada de IRTA2 son difíciles de predecir en esta etapa. La observación de que IRTA2 tiene homología con los receptores de adherencia CAM, junto con su distribución específica en la zona clara del GC sugieren que su expresión ectópica en centroblastos puede causar una interrupción en el desarrollo y la arquitectura del GC. Por otro lado, las observaciones iniciales de los autores de la presente invención de que IRTA2 se puede unir a complejos inmunitarios con IgG de una manera comparable a los receptores de Fc bona fide sugieren que su expresión inapropiada puede perturbar la dinámica de la regulación de la superficie celular de las respuestas inmunológicas de células B, conduciendo posiblemente a la expansión clonal. Se

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ha propuesto que la expresión desregulada de FCGR2B como consecuencia de la t(1;14)(q21;q32) en el linfoma folicular contribuye a la linfomagénesis en este tipo de tumor (Callanan et al., 2000), por medio de un mecanismo que implica la huida por parte de las células tumorales de la vigilancia inmunitaria anti-tumoral a través de su unión a Fc y de la inactivación de la IgG específica del tumor. Se han observado mecanismos de evasión similares en las células infectadas por herpesvirus que codifican Fc (Dubin et al., 1991). Es necesario probar el papel de la desregulación de IRTA2 en la "ganancia de función" de ratones transgénicos que expresan constitutivamente IRTA2 en el GC.

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