ES2587191T3

ES2587191T3 - Métodos y composiciones para enfermedades y afecciones cardiovasculares

Info

Publication number: ES2587191T3
Application number: ES10840169.6T
Authority: ES
Inventors: Michael R. Bristow; J. David Port
Original assignee: Arca Biopharma Inc
Current assignee: Arca Biopharma Inc
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2016-10-21
Anticipated expiration: 2030-12-23
Also published as: WO2011079273A3; CA2822747A1; DK2515899T3; EP2515899A2; US20130131161A1; EP2515899A4; EP2515899B1; WO2011079273A2

Abstract

El compuesto S-(6-Nitro-oxi-hexahidro-furo[3,2-b]furan-3-1-il)tioacetato para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección cardiovascular, en el que una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto se administra al paciente después de haber sometido a ensayo al paciente y determinar que es homocigoto de tipo silvestre (G/G) en la posición 894 en el gen de la óxido nítrico sintasa (NOS3) endotelial.

Description

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FIG. 3. Efectos comparativos de LA-419 e ISDN en la liberación de ONOO-de células HUVEC aisladas de donantes de raza blanca no hispanos. Las células se incubaron con LA-419 o ISDN, cada uno a 500 nM, durante 12 horas antes de estimulación con CaI (1,0 μM). Los valores se informan como media ± D.T. (N = 5). *p < 0,01 con respecto al control (ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett; ANOVA global: p < 0,0001; F = 34,909). Análisis de ensayo de t de Student de tratamiento con dinitrato de isosorbida con respecto a LA-419: p = 0,0995.

FIG. 4. Efectos comparativos de LA-419 e ISDN en la proporción de liberación de NO/ONOO-de células HUVEC aisladas de donantes de raza blanca no hispanos. Las células se incubaron con LA-419 o ISDN, cada uno a 500 nM, durante 12 horas antes de estimulación con CaI (1,0 μM). Los valores se informan como media ± D.T. (N = 5). *p < 0,01 con respecto al control (ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett; ANOVA global: p < 0,0001; F = 20,154); †p = 0,0024 con respecto al tratamiento con LA-419 (Ensayo de t de Student).

FIG. 5. Efectos comparativos de LA-419 e ISDN en liberación de NO de células HUVEC aisladas de donantes afroamericanos. Las células se incubaron con LA-419 o ISDN, cada uno a 500 nM, durante 12 horas antes de estimulación con CaI (1,0 μM). Los valores se informan como media ± D.T. (N = 5). *p < 0,01 con respecto al control (ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett; ANOVA global: p = 0,0036; F = 8,361); †p = 0,0252 con respecto al tratamiento con LA-419 (Ensayo de t de Student).

FIG. 6. Efectos comparativos de LA-419 e ISDN en liberación de ONOO-de células HUVEC aisladas de donantes afroamericanos. Las células se incubaron con LA-419 o ISDN, cada uno a 500 nM, durante 12 horas antes de estimulación con CaI (1,0 μM). Los valores se informan como media ± D.T. (N = 5). *p < 0,01 con respecto al control (ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett; ANOVA global: p < 0,0001; F = 21,422). Análisis de ensayo de t de Student de tratamiento con dinitrato de isosorbida con respecto a LA-419: p = 0,4034.

FIG. 7. Efectos comparativos de LA-419 e ISDN en la proporción de liberación de NO/ONOO-de células HUVEC aisladas de donantes afroamericanos. Las células se incubaron con LA-419 o ISDN, cada uno a 500 nM, durante 12 horas antes de estimulación con CaI (1,0 μM). Los valores se informan como media ± D.T. (N = 5). *p < 0,01 con respecto al control (ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett; ANOVA global: p = 0,0001; F = 17,921);

†p = 0,0476 con respecto al tratamiento con LA-419 (Ensayo de t de Student).

Descripción detallada de la invención

El tratamiento con fármacos que actúan como donantes de NO está extendido. Sin embargo, su eficacia es limitada debido a la tolerancia que inducen en los pacientes. De forma ideal, un fármaco que no indujera la tolerancia observada en la actualidad se podría usar para tratar pacientes con necesidad de los efectos del óxido nítrico. Como se muestra a continuación, se demuestra que el S-(6-Nitro-oxi-hexahidro-furo[3,2-b]furan-3-1-il)tioacetato (LA-419) tiene estas propiedades ideales. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento implican el tratamiento de los pacientes con LA-419, en particular, los pacientes cuyo genotipo es homocigoto de tipo silvestre (G/G) en la posición 894 en el gen de la óxido nítrico sintasa endotelial, NOS3.

La presente invención por lo general se refiere a la determinación de un polimorfismo de NOS3 en un individuo y a la determinación de la capacidad de respuesta del paciente al tratamiento con LA-419. Se desvela que la eficacia de LA-419 se puede predecir basándose en el genotipo del paciente. De forma específica, se desvela la determinación del genotipo para un individuo en el gen de NOS3 (por ejemplo, determinar si el sujeto es homocigoto de tipo silvestre en la posición 894).

La farmacogenómica permite que un profesional clínico o médico dirija tratamientos profilácticos o terapéuticos a individuos que se beneficiarán en la mayor medida del tratamiento y evitar el tratamiento de los individuos que experimenten efectos secundarios sintomáticos. Por lo tanto, un profesional médico o clínico puede considerar la aplicación del conocimiento obtenido en el análisis farmacogenómico relevante en la determinación de si administrar LA-419 así como modificar la dosificación, el régimen y/o cantidades terapéuticamente eficaces a administrar para conseguir el efecto deseado con el tratamiento. Se desvela que un profesional médico o clínico puede alterar el tratamiento del sujeto por adición de una terapia adicional o mediante el uso de una terapia alternativa al tratamiento con LA-419.

I. TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES Y AFECCIONES CARDIOVASCULARES

El tratamiento de enfermedades y afecciones cardiovasculares, que por lo general se entiende que hacen referencia a enfermedades, afecciones o trastornos que implican al corazón o los vasos sanguíneos, incluye una diversidad de opciones, tales como estatinas, diuréticos, anticoagulantes, beta bloqueadores, vasodilatadores, inhibidores de ACE o bloqueadores de canales de calcio. Los vasodilatadores causan una relajación del músculo liso que rodea a un vaso sanguíneo. Se consigue principalmente reduciendo la concentración del calcio intracelular o mediante la desfosforilación de miosina. Una forma para conseguir la vasodilatación es inducir óxido nítrico.

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A. Donantes de NO

El BiDil es un fármaco relativamente nuevo que se ha aprobado recientemente para el tratamiento de insuficiencia cardiaca en individuos afroamericanos. El BiDil consiste en una combinación de dosis fija de dinitrato de isosorbida (vasodilatador) e hidralazina (antihipertensivo). La insuficiencia cardiaca, o enfermedad cardiovascular en fase terminal, afecta aproximadamente a cinco millones de americanos. Algunos estudios epidemiológicos indican una prevalencia más elevada de factores de riesgo para insuficiencia cardiaca entre individuos afroamericanos en Estados Unidos (Burt et al. 1995). Las complicaciones asociadas con estas enfermedades, tales como ictus, insuficiencia cardiaca y renal, contribuyen a tasas más elevadas de mortalidad en esta población. Algunos análisis recientes de ensayos clínicos de insuficiencia cardiaca muestran que la tasa de mortalidad y la tasa de hospitalización para individuos afroamericanos son significativamente más elevadas que para los individuos no afroamericanos.

El dinitrato de isosorbida es un donante de NO directo y causar tolerancia con uso prolongado. La hidralazina es un diurético con una supuesta actividad antioxidante que puede contribuir a reducir la pérdida de NO a través de su reacción en niveles de superóxido. El fabricante (Nitromed) ha permitido reivindicar, en su marca aprobada, que el BiDil funciona a través de un aumento de la biodisponibilidad de NO en el vaso. Este mecanismo puede proporcionar ventajas preferentes para los pacientes afroamericanos con insuficiencia cardiaca que padecen de una deficiencia de NO más elevada que los individuos no afroamericanos.

El beneficio clínico de BiDil en individuos afroamericanos con insuficiencia cardiaca se sometió a ensayo en el ensayo de A-HeFT, un estudio controlado con placebo, con doble ocultación con 1.050 pacientes en 169 sitios en Estados Unidos. El ensayo se detuvo en julio de 2004 basándose en la recomendación del Data and Safety Monitoring Board independiente y el comité directivo para el ensayo debido a un beneficio de supervivencia significativo observado en los pacientes que ingerían el fármaco. Los resultados del ensayo con BiDil se presentaron en la reunión anual de la American Heart Association el 8 de noviembre de 2004. El ensayo inscribió un total de 1.050 pacientes afroamericanos que presentaban insuficiencia cardiaca de clase III o IV de la Nueva York Heart Association con ventrículos dilatados, constituyendo niveles moderadamente graves y graves de insuficiencia cardiaca. El criterio de valoración principal para el ensayo era la muerte por cualquier causa, hospitalización por insuficiencia cardiaca y cambio en la calidad de vida. El estudio de A-HeFT terminó pronto debido a una tasa de mortalidad significativamente más elevada en el grupo de placebo que en el grupo de tratamiento. Una tasa de mortalidad de un 10,2 por ciento se mostró en el grupo de placebo en comparación con una tasa de mortalidad de un 6,2 por ciento en el grupo de BiDil, p = 0,02. La puntuación media del compuesto para el criterio de valoración principal era significativamente mejor en el grupo al que se le administraba BiDil que en el grupo del placebo, p = 0,01, como fueron sus componentes individuales: una reducción de un 43 por ciento en la tasa de mortalidad por cualquier causa, p = 0,01; una reducción relativa de un 33 por ciento en la tasa de primera hospitalización por insuficiencia cardiaca, p = 0,0001; y una mejora estadísticamente significativa de la calidad de vida, p = 0,02, medido con el cuestionario de Minnesota Living with Heart Failure. Algunos sucesos adversos informados en el ensayo incluían síntomas de dolor de cabeza y mareos, que eran significativamente más frecuentes en el grupo al que se le administraba BiDil, y agravamientos de la insuficiencia cardiaca congestiva (tanto moderada como grave), que eran significativamente más frecuentes en el grupo de placebo.

Otros fármacos de los que se ha informado que tienen actividad donante de NO incluyen: GEA 3162; 1,1-dietil-2-hidroxi-2-nitrosohidrazina; dietilentriamina; Molsidomina; isosorbida-5-mononitrato; S-Nitrosotioles; aducto de óxido dinítrico de dietilamina; S-nitrosomercaptoetanol; 3-morfolino-sidnonimina; S-nitrosocisteína; complejo de espermina y óxido nítrico; NOC 18; 2,2'-(hidroxinitrosohidrazono)bis-etanamina; S-Nitroso-N-Acetilpenicilamina; S-Nitrosoglutatión; S-nitro-N-acetilpenicilamina; PAPA NONOato; 3-(2-hidroxi-1-metil-2-nitrosohidrazino)-N-metil-1-propanamina; Nitroprusiato; Dinitrato de Isosorbida; FK 409.

B. LA-419

El fármaco S-(6-Nitro-oxi-hexahidro-furo[3,2-b]furan-3-1-il)tioacetato, que también se conoce como LA-419, es un donante de óxido nítrico que en la actualidad está en ensayos clínicos como un tratamiento para trastornos cardiovasculares. También se ha informado de que es una terapia candidata para el tratamiento de glaucoma y trastornos intestinales (Megson et al., 2009). LA-419 tiene la siguiente estructura química:

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II. DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS

El polimorfismo descrito en el presente documento está presente en la posición 894 en el gen de NOS3. La presencia del polimorfismo se puede determinar a partir de la secuencia del gen o mediante el uso de características específicas del polimorfismo, por ejemplo, sitio de reconocimiento de enzima de restricción. Como resultado, se puede usar una diversidad de metodologías diferentes con el fin de detectar polimorfismos en el gen de NOS3. Como alternativa, el producto genético de proteína se puede evaluar para determinar el genotipo del paciente.

A. Ácidos Nucleicos

La presente divulgación se refiere a diversos ácidos nucleicos, incluyendo cebadores de amplificación, sondas de oligonucleótido y otros elementos de ácido nucleico implicados en el análisis del ADN genómico. En ciertos aspectos, un ácido nucleico comprende un ácido nucleico de tipo silvestre, de tipo mutante o polimórfico.

El término polimorfismo de “NOS3” se refiere a un polimorfismo en el gen de NOS3. Una secuencia de tipo silvestre de la región codificante de NOS3 se proporciona como SEQ ID NO: 1; esta secuencia tiene una G en la posición 894. La secuencia del NOS3 con un polimorfismo en la posición 894 (una T en lugar de una G) se muestra como SEQ ID NO: 3. El número de registro NM_000603.4 en Genbank, que se incorpora por la presente por referencia, muestra una T en la posición 894. La posición 894 corresponde al número de nucleótido 1187 en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3. Los inventores contemplan y los expertos en la materia entienden que un genotipo de un paciente puede incluir otros Polimorfismos además del polimorfismo en la posición 894 (1187 desde la primera posición de la secuencia de ADNc). Estas variaciones de secuencia se pueden acomodar en la medida en la que cebadores y sondas se diseñan para detectar la secuencia en la posición 894. Alguien con una experiencia habitual en la materia podría conocer cómo identificar estos polimorfismos, que se conocen fácilmente, por ejemplo, en la base de datos de NCBI con el número de registro de NOS3 en Internet en ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgj?showRare=on&chooseRs=coding&locusId=4846&mrna=NM000603.3&ctg=NT_00 7914.14&prot=NP_000594.2&orien=forward&refresh=refresh. Parece que los 43 SNP están identificados en la actualidad en NOS3.

La posición de un polimorfismo se puede diseñar basándose en el número total de nucleótidos en la secuencia partiendo como el nucleótido 1 (que coincide con el primer nucleótido que codifica el primer aminoácido) y progresando en incrementos de uno hasta el final de la secuencia, es decir, nucleótido 894 de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3. La secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de 894 de tipo silvestre se muestra en la SEQ ID NO: 2; tiene una GIu en el aminoácido 298. La secuencia polimórfica de 894 que tiene una T codifica lo que se muestra en la SEQ ID NO: 4; tiene una Asp en el aminoácido 298.

Se desvela que algunos ácidos nucleicos usados en el presente documento pueden comprender o son complementarios con 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1165, 1200, 1300, 1400, 1500, 1840, 1870 o más nucleótidos contiguos, o cualquier intervalo derivable de los mismos, de la secuencia de NOS3 humana proporcionada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o cualquier otra secuencia proporcionada en el presente documento. Un experto en la materia sabe cómo diseñar y usar cebadores y sondas para hibridación y amplificación de una secuencia en el gen de NOS3. La secuencia puede ser la secuencia codificante de NOS3 (o su complemento) o se basa en la transcripción de NOS3, tal como un ADNc de esta secuencia.

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Por lo general, estas definiciones hacen referencia a una molécula monocatenaria, pero en algunas realizaciones específicas también incluirá una hebra adicional que es parcial, sustancial o totalmente complementaria con la molécula monocatenaria. Por lo tanto, un ácido nucleico puede incluir una molécula bicatenaria o una molécula tricatenaria que comprende una o más hebras(s) complementarias o "complemento(s)" de una secuencia en particular que comprende una molécula. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico monocatenario se puede indicar con el sufijo "mc", un ácido nucleico bicatenario con el sufijo "bc", y un ácido nucleico tricatenario con el prefijo "tc."

1. Preparación de Ácidos Nucleicos

Un ácido nucleico se puede preparar con cualquier técnica conocida por un experto habitual en la materia, tal como por ejemplo, síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Algunos ejemplos no limitantes de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un oligonucleótido sintético), incluyen un ácido nucleico preparado mediante síntesis química in vitro usando química de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita y técnicas en fase sólida tales como las que se describen en el documento de Patente Europea 266.032, o a través de compuestos intermedios de desoxinucleósido H-fosfonato como lo describen Froehler et al., 1986 y en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 5.705.629.

En los métodos de la presente invención, se puede usar uno o más oligonucleótidos. En ciertos aspectos, la amplificación de oligonucleótidos se puede diseñar en cualquier lado o solapándose con los límites del sitio de inserción. En un aspecto más, se puede diseñar un oligonucleótido específico para la secuencia en 894, ya sea una G

o una T. Estos oligonucleótidos pueden tener una longitud que varía de 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, nucleótidos o más, incluyendo todos los valores e intervalos entre los mismos. Por ejemplo, se han desvelado diferentes mecanismos de síntesis de oligonucleótidos en los documentos de Patente de Estados Unidos 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.

Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido por vía enzimática incluye uno producido por enzimas en reacciones de amplificación tales como PCR™ (véase por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos n.º

4.683.202 y el documento de Patente de Estados Unidos n.º 4.682.195, o la síntesis de un oligonucleótido descrita en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 5.645.897, incorporados en el presente documento por referencia. Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido por vía biológica incluye un ácido nucleico recombinante producido (es decir, replicado) en una célula viva, tal como un vector de ADN recombinante replicado en bacterias (véase por ejemplo, Sambrook et al. 2001).

2. Purificación de Ácidos Nucleicos

Un ácido nucleico se puede purificar en geles de poliacrilamida, gradientes de centrifugación con cloruro de cesio, columnas de cromatografía o mediante cualquier otro medio conocido por alguien con una experiencia habitual en la materia (véase por ejemplo, Sambrook et al., 2001).

También se desvela un ácido nucleico que es un ácido nucleico aislado. Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN y o ADN) que se ha aislado del, o de otro modo está libre del, volumen de los ácidos nucleicos genómicos y transcritos totales de una o mas células. "Ácido nucleico aislado" puede hacer referencia a un ácido nucleico que se ha aislado del, o que de otro modo está libre del, volumen de componentes celulares o componentes de reacción in vitro tales como por ejemplo, macromoléculas tales como lípidos o proteínas, moléculas biológicas pequeñas, y similares.

3. Segmentos de Ácidos Nucleicos

El ácido nucleico puede ser un segmento de ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, la expresión "segmento de ácido nucleico", son fragmentos de un ácido nucleico, tales como, para un ejemplo no limitante, los que codifican solamente parte de una secuencia de NOS3, o parte del locus del gen o secuencia genética de NOS3. Por lo tanto, un "segmento de ácido nucleico" puede comprender cualquier parte de una secuencia genética, que incluye de aproximadamente 2 nucleótidos al gen de longitud completa incluyendo regiones promotoras para la señal de poliadenilación y cualquier longitud que incluye toda la región codificante.

Diversos segmentos de ácido nucleico se pueden diseñar basándose en una secuencia de ácidos nucleicos en particular, y pueden ser de cualquier longitud. Al asignar valores numéricos a una secuencia, por ejemplo, el primer resto es 1, el segundo arresto es 2, etc., se puede crear un algoritmo que define todos los segmentos de ácidos nucleicos:

n an+y

en el que n es un número entero de 1 al último número de las secuencias e y es la longitud del segmento de ácido nucleico menos uno, en el que n + y no supera el último número de la secuencia. Por lo tanto, para un 10-mero, los segmentos de ácido nucleico corresponden a las bases 1 a 10, 2 a 11, 3 a 12... y así sucesivamente. Para un 15-mero, los segmentos de ácido nucleico corresponden a las bases 1 a 15, 2 a 16, 3 a 17... y así sucesivamente. Para un

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completas. Cuando se usa ARN, se puede desear convertir primero el ARN en un ADN complementario.

El término "cebador", como se usa en el presente documento, pretende incluir cualquier ácido nucleico que es capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente del molde. Por lo general, los cebadores son oligonucleótidos con una longitud de diez a veinte y/o treinta pares de bases, pero se pueden usar secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma de bicatenaria y/o monocatenaria, aunque es preferente la forma monocatenaria.

Los pares de cebadores diseñados para hibridarse de forma selectiva con ácidos nucleicos correspondientes al locus del gen de NOS3, o variantes de los mismos, y fragmentos de los mismos se ponen en contacto con el ácido nucleico molde en condiciones que permiten la hibridación selectiva. Dependiendo de la aplicación deseada, se pueden seleccionar condiciones de hibridación de alta rigurosidad que solamente permitirán la hibridación con secuencias que son totalmente complementarias con los cebadores. Se desvela que la hibridación se puede producir en condiciones de rigurosidad reducida para permitir la amplificación de ácidos nucleicos que contienen una o más faltas de coincidencia con las secuencias cebadoras. Una vez hibridado, el complejo de molde-cebador se pone en contacto con una o más enzimas que facilitan la síntesis de ácidos nucleicos dependiente de molde. Se realizan múltiples rondas de amplificación, también conocidas como "ciclos", hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificación.

El producto de amplificación se puede detectar, analizar o cuantificar. En ciertas aplicaciones, la detección se puede realizar por medios visuales. En ciertas aplicaciones, la detección puede implicar la identificación indirecta del producto a través de quimioluminiscencia, gammagrafía radiactiva de radioetiqueta incorporada o etiqueta fluorescente o incluso a través de un sistema que usa señales de impulsos eléctricos y/o térmicos (tecnología Affymax; Bellus, 1994).

Un número de procesos dependientes de molde están disponibles para amplificar las secuencias de oligonucleótidos presentes en una muestra de molde dada. Uno de los métodos de amplificación más conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (denominada PCR™) que se describen con detalle en los documentos de Patente de Estados Unidos n.ºs 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y en Innis et al., 1988, cada uno de los cuales se incorporar por referencia en el presente documento en su totalidad.

Otro método para amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR"), desvelado en la Solicitud Europea n.º 320 308, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. El documento de patente de Estados Unidos n.º 4.883.750 describe un método similar a la LCR para pares de sondas de unión a una secuencia diana. También se puede usar un método basado en PCR™ y ensayo de ligasa de oligonucleótido (OLA) (descrito con mayor detalle a continuación), que se desvela en el documento Patente de Estados Unidos n.º 5.912.148.

Algunos métodos alternativos para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos diana que se pueden usar en la práctica de la presente invención se desvelan en los documentos de Patente de Estados Unidos n.ºs 5.843.650, 5.846.709, 5.846.783, 5.849.546, 5.849.497, 5.849.547, 5.858.652, 5.866.366, 5.916.776, 5.922.574 , 5.928.905, 5.928.906, 5.932.451, 5.935.825, 5.939.291 y 5.942.391, Solicitud de Gran Bretaña n.º 2 202 328 y en la Solicitud de PCT n.º PCT/US89/01025. En la presente invención también se puede usar la Qbeta Replicasa, descrita en la solicitud de PCT n.º PCT/US87/00880 como un método de amplificación.

Un método de amplificación isotérmica, en el que se usan endonucleasas y ligasas de restricción para conseguir la amplificación de moléculas diana que contienen nucleótidos 5'-[alfa-tio]-trifosfatos en una hebra de un sitio de restricción también puede ser útil en la amplificación de ácidos nucleicos en la presente invención (Walker et al., 1992). La Amplificación por Desplazamiento de Hebra (SDA), desvelada en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 5.916.779, es otro método para realizar la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que implica múltiples rondas de desplazamiento y síntesis de hebra, es decir, traducción de cortes.

Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), incluyendo la amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) y 3SR (Kwoh et al., 1989; Solicitud de PCT WO 88/10315, incorporados en el presente documento por referencia en su totalidad). La Solicitud Europea n.º 329 822 desvela un método de amplificación de ácido nucleico que implica la síntesis cíclica de ARN monocatenario ("ARNmc"), ADNmc y ADN bicatenario (ADNbc), que se puede usar de acuerdo con la presente invención.

La solicitud PCT n.º WO 89/06700 desvela un esquema de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos basado en la hibridación de una secuencia de región de promotor/cebador a un ADN monocatenario diana ("ADNmc") seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen nuevos moldes a partir de las transcripciones de ARN resultantes. Otros métodos de amplificación incluyen "RACE" y "PCR unilateral" (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).

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c. Detección de Ácidos Nucleicos

Después de cualquier amplificación, puede ser deseable separar el producto de amplificación del monte y/o exceso de cebador. En una realización, los productos de amplificación se separan mediante por electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida usando métodos convencionales (Sambrook et al., 2001). Algunos productos de amplificación separados se pueden cortar y eluir del gel para una manipulación adicional. Usando geles de agarosa de bajo punto de fusión, la banda separada se puede retirar por calentamiento del gel, seguido de extracción del ácido nucleico.

La separación de los ácidos nucleicos también se puede realizar mediante columnas de centrifugación y/o técnicas de cromatografía conocidas en la técnica. Existen muchos tipos de cromatografía que se pueden usar en la práctica de la presente invención, incluyendo adsorción, reparto, intercambio iónico, hidroxilapatita, tamiz molecular, de fase inversa, columna, papel, en capa fina, y cromatografía de gases así como HPLC.

Los productos de amplificación se pueden visualizar, con o sin separación. Un método de visualización habitual implica la tinción de un gel con bromuro de etidio y la visualización de bandas con luz UV. Como alternativa, si los productos de amplificación se etiquetan de forma integral con nucleótidos etiquetados por vía radiométrica o fluorimétrica, los productos de amplificación separados se pueden exponer a una película de rayos X o se pueden visualizar con los espectros de excitación apropiados.

Después de la separación de los productos de amplificación, una sonda de ácido nucleico etiquetada se puede poner en contacto con la secuencia del marcador amplificado. Preferentemente, la sonda se conjuga con un cromóforo pero puede está radioetiquetada. La sonda también se puede conjugar con una pareja de unión, tal como un anticuerpo o biotina, u otra pareja de unión que porta un resto detectable.

La detección también se puede producir por transferencia de Southern e hibridación con una sonda etiquetada. Las técnicas implicadas en la transferencia de Southern son bien conocidas por los expertos en la materia (véase Sambrook et al., 2001). Un ejemplo de lo mencionado anteriormente se describe en el documento de patente de Estados Unidos n.º 5.279.721, que se incorpora por referencia en el presente documento, que desvela un aparato y un método para electroforesis automatizada y transferencia de ácidos nucleicos. El aparato permite la electroforesis y transferencia sin manipulación externa del gel y es ideal para realizar los métodos de acuerdo con la presente invención.

Otros métodos de detección de ácidos nucleicos que se pueden usar en la práctica de la presente invención se desvelan en los documentos de Patente de Estados Unidos n.ºs 5.840.873, 5.843.640, 5.843.651, 5.846.708, 5.846.717, 5.846.726, 5.846.729, 5.849.487, 5.853.990, 5.853.992, 5.853.993, 5.856.092, 5.861.244, 5.863.732, 5.863.753, 5.866.331, 5.905.024, 5.910.407, 5.912.124, 5.912.145, 5.919.630, 5.925.517, 5.928.862, 5.928.869, 5.929.227, 5.932.413 y 5.935.791.

d. Otros Ensayos

Otros métodos para identificación sistemática se pueden usar dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, para detectar mutaciones en muestras de ADN genómico, ADNc y/o ARN. Algunos métodos usados para detectar mutaciones puntuales incluyen electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante ("DGGE"), análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos por restricción ("RFLP"), métodos de escisión química o enzimática, secuenciación directa de regiones diana amplificadas mediante PCR™ (véase anteriormente), análisis de polimorfismo de conformación monocatenario ("SSCP") y otros métodos bien conocidos en la técnica.

Un método para identificar sistemáticamente mutaciones puntuales se basa en la escisión de ARNasa de faltas de coincidencias de pares de bases en heterodúplex de ARN/ADN o ARN/ARN. Como se usa en el presente documento, el término ''falta de coincidencias'' se define como una región de uno o más nucleótidos no emparejados o con faltas de coincidencias en una molécula de ARN/ARN, ARN/ADN ADN/ADN bicatenaria. Por lo tanto, esta definición incluye faltas de coincidencias debidas a mutaciones de inserción/deleción, así como mutaciones puntuales de base sencilla o múltiple.

El documento de patente de Estados Unidos n.º 4.946.773 describe un ensayo de escisión de falta de coincidencia de RNasa A que implica la hibridación de muestras de ensayo de ADN o ARN monocatenario a una sonda de ARN, y el tratamiento posterior de los dúplex de ácido nucleico con RNasa A. Para la detección de faltas de coincidencias, los productos monocatenarios del tratamiento con RNasa A, separados por electroforesis de acuerdo con el tamaño, se comparan con dúplex de control tratados del mismo modo. Las muestras que contienen fragmentos más pequeños (productos de escisión) no observados en el dúplex de control se puntúan como positivas.

Otros investigadores han descrito el uso de RNasa I en ensayos de faltas de coincidencias. El uso de ARNasa I para la detección de falta de coincidencias se describe en la bibliografía de Promega Biotech. Promega comercializa un kit que contiene RNasa I de la que se informa que escinde tres de cada cuatro faltas de coincidencias. Otros han descrito el uso de la proteína MutS u otras enzimas de reparación de ADN para detección de faltas de coincidencias de una sola

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de alelo superiores a un 10 % se cuantifican de forma fiable mediante este método. Frecuencia alélicas = 0 (cero) significa que el alelo se encontró entre individuos, pero el pico correspondiente no se ve en el examen de la combinación. Frecuencia alélica = 0-0,1 indica que los alelos minoritarios se detectan en la combinación, pero los picos son demasiado bajos para cuantificar de forma fiable.

En aún otro método identificado como KYUGEN (Método 1), los productos de PCR se etiquetan posteriormente con colorantes fluorescentes y se analizan mediante un sistema automatizado de electroforesis capilar en condiciones de SSCP (PLACE-SSCP). Cuatro o más ADN individuales se analizan con o sin dos ADN combinados (combinación japonesa y combinación de precursores de CEPH) en una serie de experimentos. Los alelos se identifican mediante inspección visual. Los ADN individuales con diferentes genotipos se secuencian y los SNP se identifican. Las frecuencias alélicas se calculan a partir de alturas de los picos en las muestras combinadas después de la corrección del sesgo de la señal usando alturas de los picos en heterocigotos. Para la PCR, los cebadores se etiquetan para que tengan 5'-ATT o 5'-GTT en sus extremos para etiquetado posterior de ambas hebras. Las muestras de ADN (10 ng/ul) se amplifican en mezclas de reacción que contienen el tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3 o 9,3, KCl 50 mM, MgCl2 2,0 mM), 0,25 µM de cada cebador, 200 μM de cada dNTP, y 0,025 unidades/µl de Taq ADN polimerasa mezclados previamente con el anticuerpo anti-Taq. Las dos hebras de los productos de PCR se etiquetan de forma diferencial con nucleótidos modificados con R110 y R6G mediante una reacción de intercambio de fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. La reacción se detiene añadiendo EDTA, y los nucleótidos no incorporados se desfosforilan mediante la adición de fosfatasa alcalina intestinal de ternero. Para el SSCP: una alícuota de productos de PCR etiquetados con fluorescencia y marcadores internos etiquetados con TAMRA se añade a formamida desionizada y desnaturalizada. La electroforesis se realiza en un capilar usando un Analizador Genético ABI Prism 310. Los software de Genescan (P-E Biosystems) se usan para recogida de datos y procesamiento de datos. El ADN de individuos (de dos a once) incluyendo los que presentaban diferentes genotipos en SSCP se someten a secuenciación directa usando química de terminador big-dye, en secuenciadores ABI Prism 310. Se procesan múltiples archivos de trazas de secuencia obtenidos a partir de ABI Prism 310 y se alinean con Phred/Phrap y se visualizan usando el visor Consed. Los SNP se identifican con el software PolyPhred e inspección visual.

Además, en otro método identificado como KYUGEN (Método 2), se buscan individuos con diferentes genotipos mediante HPLC desnaturaliza ante (DHPLC) o PLACE-SSCP (Inazuka et al., 1997) y sus secuencias se determinan para identificar los SNP. La PCR se realiza con cebadores etiquetados con 5'-ATT o 5'-GTT en sus extremos para el etiquetado posterior de ambas hebras. El análisis de DHPLC se realiza usando el sistema de análisis de fragmentos de WAVE ADN (Transgenomic). Los productos de PCR se inyectan en la columna de DNASep, y se separan en las condiciones determinadas usando al programa WAVEMaker (Transgenomic). Las dos hebras de los productos de PCR que se etiquetan de forma diferencial con nucleótidos se modifican con R110 y R6G mediante una reacción de intercambio de fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. La reacción se detiene mediante la adición de EDTA, y los nucleótidos no incorporados se desfosforilan mediante la adición de fosfatasa alcalina de intestino de ternera. SSCP seguido por electroforesis se realiza en un capilar usando un Analizador Genético ABI Prism 310. software GeneScan (P-E Biosystems). El ADN de los individuos, incluyendo aquellos que presentaban diferentes genotipos en DHPLC o SSCP se someten a secuenciación directa usando química de terminador big-dye, en el secuenciador ABI Prism 310. Se procesan múltiples archivos de traza de secuencia obtenidos a partir de ABI Prism 310 y se alinean mediante Phred/Phrap y se visualizan usando el visor Consed. Los SNP se identifican con el software PolyPhred e inspección visual. Los datos de cromatograma de trazas de secuencias EST en Unigene se procesan con PHRED. Para identificar los SNP similares, las faltas de coincidencia de bases individuales forman a partir de múltiples alineamientos de secuencias producidos por los programas PHRAP, BRO y POA para cada grupo de Unigene. BRO corregía las posibles orientaciones de EST mal informadas, mientras que POA identificaba y analizaba estructuras de alineamiento no lineales indicativas de mezclas/quimeras genéticas que podrían producir SNP falsos. La inferencia bayesiana se usa para ponderar la evidencia de polimorfismo verdadero en comparación con el error, falta de alineación o ambigüedad de la secuenciación, formación de grupos erróneos o secuencias quiméricas de EST, evaluación de datos tales como altura del cromatograma sin procesar, nitidez, solapamiento y espaciado; tasas de error de secuenciación; sensibilidad al contexto; origen de la biblioteca de ADNc, etc.

En el método identificado como MARSHFIELD (Método B), el solapamiento de secuencias de ADN humano que contenían los supuestos polimorfismos de inserción/deleción se identifican a través de búsquedas en bases de datos públicas. Los cebadores de PCR que flanqueaban cada sitio polimórfico se seleccionan entre las secuencias consenso. Los cebadores se usan para amplificar ADN genómico humano individual o combinado. Los productos de PCR resultantes se resuelven en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se usa un PhosphorImager para calcular las frecuencias alélicas de los grupos de ADN.

f. Desequilibrio de la unión

Los polimorfismos en desequilibrio de unión con otro polimorfismo en el que la identificación de un polimorfismo son predictivos de la identidad del polimorfismo relacionado. “Desequilibrio de unión” (“LD”, como se usa en el presente documento, aunque en la técnica también se denomina “LED”) se refiere a una situación en la que una combinación de alelos en particular (es decir, una forma variante de un gen dado) o polimorfismos en dos loci aparecen de forma más frecuente de lo que se podría esperar al azar. “Significativo” como se usa con respecto al desequilibrio de unión, tal como lo determina un experto en la materia, se contempla que es un valor p o α estadísticamente significativo que

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profiláctico o terapéutico de un individuo. Este conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o selección de fármacos, puede evitar reacciones adversas o fracaso terapéutico y de este modo puede aumentar la eficacia terapéutica o profiláctica cuando se trata un individuo con un modulador del receptor de niacina, tal como niacina o un análogo de la misma.

Se desvela que la diferencia en la secuencia de proteínas puede proporcionar una base para determinar la secuencia de nucleótidos en la posición 894. La secuencia de NOS3 de tipo silvestre codifica una Glu en la posición 298, al contrario que la Asp en esa posición cuando hay una T en la posición 894. Un experto en la materia observa que hay disponibilidad de reactivos y ensayos para detectar las diferentes proteínas. En algunas realizaciones, un método o kit implica un anticuerpo que reconoce ambas formas de la proteína o solamente una forma. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

Se desvelan kits para su uso en los métodos de la invención, por ejemplo, un kit para determinar un nivel de probabilidad de respuesta a la terapia con LA-419 para un individuo con una afección, un kit para uso de una cigocidad de NOS3 de un individuo para determinar una idoneidad o una falta de idoneidad de un individuo para su inclusión en un ensayo clínico, o un kit para determinar un nivel de probabilidad para una afección asociada con la insuficiencia cardiaca. Un kit puede comprender reactivos e instrucciones para realizar los métodos que se describen en el presente documento. Por ejemplo, un kit puede incluir reactivos a la formación de genotipos tales como reactivos para el aislamiento de moléculas de ácido nucleico y reactivos para la amplificación de moléculas de ácido nucleico tales como cebadores. Un kit también puede incluir, por ejemplo, un ensayo de NOS3 tal como un ELISA. Además, un kit puede contener muestras de control, por ejemplo, para mostrar que las reacciones de amplificación no están contaminadas.

Los contenidos del kit están contenidos en el material de envasado, preferentemente para proporcionar un ambiente estéril, libre de contaminantes. Además, el material de envasado contiene instrucciones que indican cómo se pueden usar los materiales dentro del kit. Las instrucciones de uso por lo general incluyen una expresión tangible que describe la concentración de reactivo o al menos un parámetro del método de ensayo, tal como las cantidades relativas de reactivo y muestra a mezclar, los periodos de tiempo de mantenimiento para las mezclas de reactivo/muestra, temperatura, condiciones de tampón, y similares .

III. MÉTODOS DE TRATAMIENTO DE LA HIPERTROFIA CARDIACA

Una vez que se determina el genotipo de NOS3 del individuo, un curso terapéutico de tratamiento se puede individualizar. En el método como se desvelan el presente documento, el rasgo de interés es una respuesta clínica mostrada por un paciente a algún tratamiento terapéutico, por ejemplo, la respuesta a un fármaco donante de NO tal como, pero no limitado a, un LA-419. La expresión "respuesta clínica" se refiere a una medición cuantitativa de la eficacia o potencia de la terapia y sucesos adversos (es decir, efectos secundarios).

Por lo tanto, individuos homocigotos para un polimorfismo de inserción en el gen de NOS3 que tienen o se sospecha que tienen o están en riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca se pueden colocar en una terapia que incluye donantes de NO, tales como, pero no limitados a, LA-419. El donante de NO se puede administrar solo o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante.

A. Vías de administración

La administración del donante de NO se puede realizar mediante cualquier número de vías que incluyen, pero no se limitan a oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, intradérmica, intratraqueal, intravesicular, intraocular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Algunos detalles adicionales con respecto a las técnicas para formulación y administración se pueden encontrar en la última edición de Pharmaceutical Sciences de Remington (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). En ciertas realizaciones LA-419 u otros donantes de NO se formulan para administración oral.

B. Formulaciones

Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, las composiciones farmacéuticas se prepararán en una forma apropiada para la aplicación deseada. Por lo general, esto supondrá la preparación de composiciones que están esencialmente libres de pirógenos, así como otras impurezas que puedan ser dañinas para seres humanos o animales.

En general, se deseará usar sales y tampones apropiados. Algunas composiciones acuosas comprenden una cantidad eficaz del fármaco disuelto o disperso en un vehículo farmacéuticamente aceptable o en un medio acuoso. Las expresiones “farmacéutica o farmacológicamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones desfavorables cuando se administran a un animal o un ser humano. Como se usa en el presente documento, un “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye disolventes, tampones, soluciones, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, aceptables para uso en la formulación de productos farmacéuticos, tal como los productos farmacéuticos adecuados para su administración a seres humanos. El uso de

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inhibidores de HDAC.

Las combinaciones se pueden conseguir mediante la puesta en contacto de células cardiacas con una única composición o formulación farmacológica que incluye los dos agentes o mediante la puesta en contacto de la célula 5 con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en la que una composición incluye la construcción de expresión y la otra incluye el agente. Como alternativa, la terapia con el uso de un donante de NO tal como LA-419 puede preceder o seguir a la administración del otro agente(s) en intervalos que varían de minutos a semanas. En las realizaciones en las que el otro agente y la construcción de expresión se administran por separado a la célula, por lo general sería necesario asegurarse de que no transcurre un periodo de tiempo significativo entre el tiempo de cada 10 administración, de modo que el agente y la construcción de expresión aún podrían ser capaces de ejercer un efecto combinado de forma ventajosa sobre la célula. En tales casos, por lo general se contempla se podría poner en contacto la célula con las dos modalidades dentro de un plazo de aproximadamente 12-24 horas entre ambas y más preferentemente, dentro de un plazo de aproximadamente 6-12 horas entre ambas, con un tiempo de retraso de solo aproximadamente 12 horas siendo el más preferente. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo

15 de tiempo del tratamiento de forma significativa, sin embargo, con lapsos de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.

También se puede concebir el deseo de más de una administración de cualquiera de LA-419, o del otro agente. En este sentido, se pueden usar diversas combinaciones. A modo de ilustración, cuando LA-419 es "A" y el otro agente es 20 “B”, las siguientes permutaciones basadas en 3 y 4 administraciones en total se usan a modo de ejemplo:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

25 Del mismo modo se contemplan otras combinaciones.

1. Agentes Terapéuticos Farmacológicos

30 Algunos agentes terapéuticos farmacológicos y métodos de administración, dosificaciones, etc., son bien conocidos por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, “Physicians Desk Reference”, “The Pharmacological Basis of Therapeutics” de Klaassen, “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, y “The Merck Index, Eleventh Edition”, y se pueden combinar con la invención a la vista de las divulgaciones en el presente documento. Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación, dependiendo del estado del sujeto que se está tratando. En cualquier

35 caso, la persona responsable de la administración determinará la dosis apropiada para el sujeto individual y tales determinaciones individuales están dentro de las capacidades de los expertos habituales en la materia.

Algunos ejemplos no limitantes de un agente terapéutico farmacológico que se puede usar en la presente invención incluyen un agente antihiperlipoproteinémico, un agente antiarterioesclerótico, un agente antitrombótico/fibrinolítico,

40 un coagulante sanguíneo, un agente antiarrítmico, un agente antihipertensivo, un vasopresor, un agente para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, un agente antianginoso, un agente antibacteriano o una combinación de los mismos.

a. Agentes Antihiperlipoproteinémicos

45 En ciertas realizaciones, la administración de un agente que reduce la concentración de uno más lípidos y/o lipoproteínas de la sangre, conocido en el presente documento como “agente antihiperlipoproteinémico”, se puede combinar con una terapia cardiovascular de acuerdo con la presente invención, en particular en el tratamiento de aterosclerosis y engrosamientos o bloqueos de tejidos vasculares. En ciertos aspectos, un agente

50 antihiperlipoproteinémico puede comprender un derivado de ácido ariloxialcanoico/fíbrico, un secuestrador de resina/ácido biliar, un inhibidor de la HMG CoA reductasa, un derivado de ácido nicotínico, una hormona tiroidea o un análogo de hormona tiroidea, un agente misceláneo o una combinación de los mismos.

(1) Derivados de Ácido Ariloxialcanoico/Ácido Fíbrico

55 Algunos ejemplos no limitantes de ácido ariloxialcanoico/fíbrico incluyen beclobrato, enzafibrato, binifibrato, ciprofibrato, clinofibrato, clofibrato (atromide-S), ácido clofíbrico, etofibrato, fenofibrato, gemfibrozilo (lobid), nicofibrato, pirifibrato, ronifibrato, simfibrato y teofibrato.

60 (2) Secuestradores de Resinas/Ácido Biliar

Algunos ejemplos no limitantes de secuestradores de resinas/ácido biliar incluyen colestiramina (cholybar, questran), colestipol (colestid) y polidexida.

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(1): Alfa Bloqueadores

Algunos ejemplos no limitantes de un alfa bloqueador, también conocido como un bloqueador α-adrenérgico o un antagonista α-adrenérgico, incluyen amosulalol, arotinolol, dapiprazol, doxazosina, mesilatos de ergoloides, fenspirida, indoramina, labetalol, nicergolina, prazosina, terazosina, tolazolina, trimazosina e yohimbina. En ciertas realizaciones, un alfa bloqueador puede comprender un derivado de quinazolina. Algunos ejemplos no limitantes de derivados de quinazolina incluyen alfuzosina, bunazosina, doxazosina, prazosina, terazosina y trimazosina.

(2): Alfa/Beta Bloqueadores

Se desvela que un agente antihipertensivo es un antagonista tanto alfa como beta adrenérgico. Algunos ejemplos no limitantes de un alfa/beta bloqueador comprenden labetalol (normodyne, trandate).

(3): Agentes Anti-Angiotensina II

Algunos ejemplos no limitantes de agentes anti-angiotensina II incluyen inhibidores de enzima convertidora de angiotensina y antagonistas de receptores de angiotensina II. Algunos ejemplos no limitantes de inhibidores de enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de ACE) incluyen alaceprilo, enalaprilo (vasotec), captoprilo, cilazaprilo, delaprilo, enalaprilat, fosinoprilo, lisinoprilo, moveltoprilo, perindoprilo, quinaprilo y ramiprilo. Algunos ejemplos no limitantes de un bloqueador de receptor de angiotensina II, también conocido como antagonista del receptor de angiotensina II, un bloqueador del receptor de ANG o un bloqueador del receptor de tipo 1 de ANG-II (ARBS), incluyen angiocandesartán, eprosartán, irbesartán, losartán y valsartán.

(4): Simpatolíticos

Algunos ejemplos no limitantes de un agente simpatolítico incluyen un agente simpatolítico de acción central o un agente simpatolítico de acción periférica. Algunos ejemplos no limitantes de un agente simpatolítico de acción central, también conocido como un agente simpatolítico del sistema nervioso central (SNC), incluyen clonidina (catapres), guanabenz (wytensin), guanfacina (tenex) y metildopa (aldomet). Algunos ejemplos no limitantes de un agente simpatolítico de acción periférica incluyen un agente de bloqueo de ganglios, un agente de bloqueo de neuronas adrenérgico, un agente de bloqueo β-adrenérgico o un agente de bloqueo alfa 1-adrenérgico. Algunos ejemplos no limitantes de un agente de bloqueo de ganglios incluyen mecamilamina (inversine) y trimetafán (arfonad). Algunos ejemplos no limitantes de un agente de bloqueo de neuronas adrenérgico incluyen guanetidina (ismelin) y reserpina (serpasilo). Algunos ejemplos no limitantes de un bloqueador β-adrenérgico incluyen acenitolol (sectral), atenolol (tenormin), betaxolol (kerlone), carteolol (cartrol), labetalol (normodyne, trandate), metoprolol (lopressor), nadanol (corgard), penbutolol (levatol), pindolol (visken), propranolol (inderal) y timolol (blocadren). Algunos ejemplos no limitantes de bloqueador alfa 1-adrenérgico incluyen prazosina (minipress), doxazocina (cardura) y terazosina (hytrin).

(5): Vasodilatadores

Se desvela que un agente terapéutico cardiovascular puede comprender un vasodilatador (por ejemplo, un vasodilatador cerebral, un vasodilatador coronario o un vasodilatador periférico). En ciertas realizaciones preferentes, un vasodilatador comprende un vasodilatador coronario. Algunos ejemplos no limitantes de un vasodilatador coronario incluyen amotrifeno, bendazol, hemisuccinato de benfurodilo, benziodarona, cloracizina, cromona, clobenfurol, clonitrato, dilazep, dipiridamol, droprenilamina, efloxato, tetranitrano de eritritilo, etafenona, fendilina, floredilo, ganglefeno, herestrol bis(β-dietilaminoetil éter), hexobendina, tosilato de itramina, kelina, LA-4195, lidoflanina, hexanitrano de manitol, medibazina, nicorglicerina, tetranitrato de pentaeritritol, pentrinitrol, perhexilina, pimefilina, trapidilo, tricromilo, trimetazidina, fosfato de trolnitrato y visnadina.

En ciertos aspectos, un vasodilatador puede comprender un vasodilatador de terapia crónica o un vasodilatador de emergencia hipertensiva. Algunos ejemplos no limitantes de un vasodilatador de terapia crónica incluyen hidralazina (apresoline) y minoxidilo (loniten). Algunos ejemplos no limitantes de un vasodilatador de emergencia hipertensiva incluyen nitroprusiato (nipride), diazóxido (hiperstat IV), hidralazina (apresoline), minoxidilo (loniten) y verapamilo.

(6) Diversos Antihipertensivos

Algunos ejemplos no limitantes de diversos antihipertensivos incluyen ajmalina, ácido γ-aminobutírico, bufenioda, cicletainina, ciclosidomina, un tanato de criptenamina, fenoldopam, flosequinán, ketanserina, mebutamato, mecamilamina, metildopa, metil 4-piridil cetona tiosemicarbazona, muzolimina, pargilina, pempidina, pinacidilo, piperoxán, primaperona, una protoveratrina, raubasina, rescimetol, rilmenideno, saralasina, nitroprusiato sódico, ticrinafeno, camsilato de trimetafano, tirosinasa y urapidilo.

En ciertos aspectos, un agente antihipertensivo puede comprender un derivado de ariletanolamina, un derivado de benzotiadiazina, un derivado de N-carboxialquil(péptido/lactama), un derivado de dihidropiridina, un derivado de guanidina, una hidrazina/ftalazina, un derivado de imidazol, un compuesto de amonio cuaternario, un derivado de reserpina o un derivado de suflonamida.

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NO (control)

Variable: Nivel (n) Liberación máxima, nmoIes/l (media ± dt) Estadística de Chi-cuadrado valor p

Variante de Intrón 4

b/b (31): 353,53 (73,00) 3,1640 0,367

b/a (10): 320:67 (65,74)

a/a (3): 386,33 (72,90)

c/c (1): 368,67 (0)

Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

* El grupo de control es vehículo de LA-419.

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ONOO(control)

Variante de G894T

G/G (26): 363,01 (84,61) 3,3296 0,19

G/T (18): 3,65,94 (87,41)

T/T (5): 449,27 (111,48)

Variante de T-786C

T/T (22): 362,95 (86,39) 0,6190 0,73

T/C (23): 376,83 (91,28)

C/C (4): 404,92 (121,75)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 369,31 (86,00) 0,9010 0,825

b/a (10): 368,03 (100,38)

a/a (3): 395,00 (128,17)

c/c (1): 426,33 (0)

a3)

NO/ONOO(control)

Variante de G894T

G/G (26): 1,02 (0,34) 0,6330 0,73

G/T (18): 1,05 (0,37)

T/T (5): 0,85 (0,44)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,03 (0,33) 0,6682 0,72

T/C (23): 1,01 (0,39)

C/C (4): 0,92 (0,46)

39

NO/ONOO(control)

Variante de Intrón 4: imagen29 imagen30 imagen31 imagen32

imagen33: b/b (31) 1,03 (0,36) 0,2703 0,966

b/a(10): 0,97 (0,41) imagen34 imagen35

a/a (3): 1,07 (0,45) imagen36 imagen37

c/c (1): 0,86 (0)

Tablas b1 -b3) Efecto de genotipos de eNOS dentro del grupo de LA-419 5 μM 5 b1)

NO (LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 398,92 (71,74) 0,3530 0,84

G/T (18): 400,63 (80,27)

T/T (5): 390,47 (124,39)

Variante de T-786C

T/T (22): 405,83 (58,51) 0,5336 0,77

T/C(23): 396,81 (95,72)

C/C (4): 370,17 (86,78)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 400,83 (81,57) 2,5597 0,465

b/a (10): 375,20 (81,45)

a/a (3): 438,33 (79,68)

c/c (1): 432,67 (0)

b2)

ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 288,82 (78,22) 2,5405 0,28

G/T (18): 300,15 (75,86)

T/T (5): 366,40 (103,55)

Variante de T-786C

T/T (22): 286,47 (76,65) 1,5269 0,47

T/C (23): 310,97 (82,59)

C/C (4): 322,33 (110,70)

40

ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 298,99 (79,66) 1,4513 0,694

b/a (10): 295,73 (85,11)

a/a (3): 331,22 (117,30)

c/c (1): 328,33 (0)

b3)

NO/ ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 1,50 (0,51) 1,3707 0,50

G/T (18): 1,44 (0,49)

T/T (5): 1,21 (0,68)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,52 (0,45) 0,8254 0,66

T/C (23): 1,41 (0,56)

C/C (4): 1,32 (0,71)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 1,46 (0,51) 0,3979 0,941

b/a (10): 1,42 (0,61)

a/a (3): 1,48 (0,64)

c/c (1): 1,32 (0)

Tablas c1 -c3) Efecto de genotipos de eNOS dentro del grupo LA-419 1 μM c1)

NO (LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 367,13 (80,46) 4,6995 0,095

G/T (18): 413,28 (58,46)

T/T (5): 368,80 (75,73)

Variante de T-786C

T/T (22): 380,73 (75,61) 2,9185 0,23

T/C (23): 396,32 (73,63)

C/C (4): 334,25 (68,06)

41

NO (LA-419 1 μM)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 393,18 (77,21) 2,7011 0,440

b/a (10): 377,23 (69,05)

a/a (3): 360,56 (80,60)

c/c (1): 270,00 (0)

c2)

ONOO-(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 344,53 (83,88) 1,1225 0,57

G/T (18): 319,43 (81,89)

T/T (5): 332,67 (129,30)

Variante de T-786C

T/T (22): 335,82 (80,98) 3,5720 0,17

T/C (23): 315,74 (78,13)

C/C (4): 430,17 (124,82)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 317,60 (74,77) 3,6974 0,296

b/a (10): 330,47 (88,93)

a/a (3): 421,11 (124,25)

c/c (1): 423,67 (0)

c3)

NO/ONOO-(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 1,16 (0,45) 1,8020 0,41

G/T (18): 1,38 (0,38)

T/T (5): 1,29 (0,63)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,22 (0,43) 3,3685 0,19

T/C (23): 1,35 (0,44)

C/C (4): 0,88 (0,50)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 1,33 (0,42) 2,8821 0,410

b/a (10): 1,25 (0,46)

a/a (3): 0,97 (0,57)

c/c (1): 0,64 (0)

42

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

I3)

NO/ONOO(LA-419 1 μM)

Variable: Nivel (n) Liberación máxima, nmoIes/l (media ± dt) Estadística de t valor p

Genotipo

Referencia (18): 1,19 (0,43) -0,7155 0,48

Combinación (31): 1,29 (0,46)

Estadística de t generada a partir del ensayo U de Mann-Whitney No paramétrico

Aumento Neto con Respecto al Control

Tablas m1 -m3) Aumento neto en LA-419 5 μM con respecto al control – comparación entre genotipos m1) '

NO (LA-419 5 μM)

Variable: Nivel (n) Aumento neto, nmoles/l (media ± dt) Estadística de Chi-cuadrado valor p

Variante de G894T

G/G (26): 55,05 (21,03) 2,9488 0,23

G/T (18): 45,87 (19,24)

T/T(5): 42,40 (30,77)

Variante de T-786C

T/T (22): 55,91 (19,06) 3,1740 0,20

T/C(23): 47,26 (23,70)

C/C (4): 38,00 (17,39)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 47,30 (22,42) 1,2423 0,743

b/a (10): 54,53 (23,50)

a/a (3): 52,00 (16,74)

c/c (1): 64,00 (0)

Aumento neto = promedio de 5 μM -promedio de Control. Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

m2)

ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): -74,19 (29,80) 1,7603 0,41

G/T(18): -65,80 (26,77)

T/T (5): -82,87 (28,56)

Variante de T-786C

T/T (22): -76,48 (33,23) 1,7456 0,42

T/C (23): -65,86 (23,41)

C/C (4): -82,58 (26,16)

51

ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de Intrón 4

b/b (31): -70,32 (30,56) 1,4292 0,699

b/a (10): -72,30 (25,81)

a/a(3): -63,78 (14,11)

c/c (1): -98,00 (0)

m3)

NO/ONOO-(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): -0,85 (0,52) 2,3998 0,30

G/T(18): -0,94 (0,88)

T/T (5): -0,78 (1,05)

Variante de T-786C

T/T (22): -0,95 (0,67) 2,0061 0,37

T/C (23): -0,86 (0,80)

C/C (4): -0,52 (0,36)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 0,43 (0,20) 0,0468 0,997

b/a (10): 0,45 (0,22)

a/a (3): 0,41 (0,19)

c/c (1): 0,46 (0)

Tablas n1 -n3) Aumento neto en LA-419 1 μM con respecto al control – comparación entre genotipos 5 n1)

NO (LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 23,26 (70,68) 1,1059 0,58

G/T (18): 58,52 (72,43)

T/T (5): 20,73 (66,94)

52

NO (LA-419 1 μM)

Variante de T-786C

T/T (22): 30,80 (64,85) 2,6735 0,26

T/C (23): 46,77 (81,32)

C/C (4): 2,08 (39,61)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 39,66 (70,27) 3,6920 0,297

b/a (10): 56,57 (67,97)

a/a (3): -25,78 (104,49)

c/c (1): -98,67 (0)

Aumento neto = promedio de 1 μM -promedio de Control. Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

n2)

ONOO-(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): -18,49 (93,20) 3,2587 0,20

G/T (18): -46,52 (105,03)

T/T (5): -116,60(117,55)

Variante de T-786C

T/T (22): -27,14 (82,12) 2,5212 0,28

T/C (23): -61,09 (111,68)

C/C (4): 25,25 (135,63)

Variante de Intrón 4

b/b (31): -51,71 (108,03) 2,0897 0,554

b/a (10): -37,57 (99,15)

a/a (3): 26,11 (116,99)

c/c (1): -2,67 (0)

53

imagen46

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

NO (LA-419 5 μM)

Variable: Nivel (n) % de Cambio (media ± dt) Estadística de Chi-cuadrado valor p

Variante de Intrón 4

b/b (31): 13,52 (6,80) 2,1674 0,538

b/a (10): 16,81 (6,88)

a/a (3): 13,60 (3,88)

c/c (1): 17,36 (0)

Raza

Asiática (1): 13,97 (0) 3,2768 0,66

Negra (12): 12,82 (5,82)

Blanca (26): 14,30 (6,78)

Blanca/Negra (2): 16,93 (4,34)

Hispana (6): 17,23 (7,65)

No Informada (2): 18,69 (5,53)

Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico % de Cambio -Respuesta media para todos los genotipos y razas (LA-419 5 μM)

% de Cambio = (promedio de 5 μM -promedio de control)/(promedio de control) *100 u2)

ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): -20,65 (7,38) 1,9795 0,37

G/T (18): -17,85 (6,26)

T/T (5): -19,03 (8,40)

Variante de T-786C

T/T (22): -20,98 (8,19) 0,9125 0,63

T/C (23): -17,73 (5,53)

C/C (4): -21,03 (7,77)

Variante de Intrón 4

b/b (31): -19,19 (7,76) 1,5576 0,669

b/a (10): -19,70 (5,79)

a/a (3): -16,60 (3,31)

c/c (1): -22,99 (0)

60

ONOO(LA-419 5 μM)

Raza

Asiática (1): -27,79 (0) 14,2033 0,01†

Negra (12): -16,43 (6,22)

Blanca (26): -17,84 (5,90)

Blanca/Negra (2): -25,30 (9,90)

Hispana (6): -25,17 (5,79)

No Informada (2): -31,56 (5,34)

% de Cambio = (promedio de 5 μM -promedio de control)/(promedio de control) *100 u3)

NO/ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 47,91 (17,67) 4,4466 0,11

G/T (18): 38,86 (13,20)

T/T (5): 39,03 (13,43)

Variante de T-786C

T/T (22): 49,09 (17,76) 2,9791 0,23

T/C (23): 38,74 (13,67)

C/C (4): 42,33 (13,21)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 42,24 (17,73) 0,9604 0,811

b/a (10): 45,81 (14,36)

a/a (3): 36,75 (3,58)

c/c (1): 52,87 (0)

Raza

Asiática (1): 57,83 (0) 16,6884 0,01†

Negra (12): 36,30 (14,59)

Blanca (26): 39,65 (12,24)

Blanca/Negra (2): 58,92 (16,01)

Hispana (6): 57,79 (12,24)

No Informada (2): 75,55 (20,43)

61

Tablas v1 -v3) % de Cambio -Respuesta media para todos los genotipos y razas (LA-419 1 μM) % de Cambio = (promedio de 1 μM -promedio de control)/(promedio de control) *100

v1)

NO (LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 7,77 (18,82) 0,5639 0,75

G/T (18): 20,99 (29,98)

T/T (5): 8,69 (18,85)

Variante de T-786C

T/T (22): 9,48 (17,79) 2,0563 0,36

T/C (23): 17,70 (29,53)

C/C (4): 1,91 (11,63)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 13,46 (23,13) 4,2767 0,233

b/a (10): 20,51 (28,08)

a/a (3): -4,57 (24,67)

c/c (1): -26,76 (0)

Raza

Asiática (1): 8,95 (0) 9,1530 0,10

Negra (12): -4,73 (18,81)

Blanca (26): 21,25 (25,58)

Blanca/Negra (2): 9,57 (6,43)

Hispana (6): 11,74 (17,99)

No Informada (2): 14,50 (2,19)

Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico % de Cambio -Respuesta media para todos los genotipos y razas (LA-419 1 μM)

% de Cambio = (promedio de 1 μM -promedio de control)/(promedio de control) *100 v2)

ONOO(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): -2,10 (27,33) 2,8861 0,24

G/T (18): -9,58 (26,95)

T/T (5): -25,44 (21,34)

Variante de T-786C

T/T (22): -5,17 (21,75) 3,9697 0,14

T/C (23): -12,40 (28,22)

C/C (4): 11,13 (43,85)

62

ONOO(LA-419 1 μM)

Variante de Intrón 4

b/b (31): -10,24 (27,17) 2,5320 0,470

b/a (10): -6,58 (30,92)

a/a (3): 9,62 (33,98)

c/c (1): -0,63 (0)

Raza

Asiática (1): -18,50 (0) 15,2522 0,01†

Negra (12): 16,25 (36,48)

Blanca (26): -18,41 (17,30)

Blanca/Negra (2): 9,37 (21,79)

Hispana (6): -6,29 (19,74)

No Informada (2): -16,55 (2,66)

% de Cambio = (promedio de 1 μM -promedio de control)/(promedio de control) *100

v3)

NO/ONOO(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 21,83 (51,78) 0,7130 0,70

G/T (18): 50,45 (77,28)

T/T(5): 61,97 (81,82)

Variante de T-786C

T/T (22): 25,48 (51,97) 2,6416 0,27

T/C (23): 52,82 (77,96)

C/C (4): 2,52 (35,64)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 43,27 (71,09) 3,4675 0,325

b/a (10): 42,92 (65,15)

a/a (3): -3,62 (44,56)

c/c (1): -26,15 (0)

Raza

Asiática (1): 33,68 (0) 15,0458 0,01†

Negra (12): -8,17 (36,37)

Blanca (26): 61,80 (74,46)

Blanca/Negra (2): 3,77 (26,27)

Hispana (6): 26,85 (45,85)

No Informada (2): 37,24 (1,75)

63

Tabla x1) Proporción de % de Cambio de NO / % de Cambio de ONOO-(LA-419 5 μM):

% de Cambio de NO / % de Cambio de ONOO(LA-419 5 μM)

Variable: Nivel (n) % de Proporción de Cambio (media ± dt) Estadística de Chi-cuadrado valor p

Variante de G894T

G/G (26): -0,82 (0,40) 0,5943 0,74

G/T (18): -0,88 (0,60)

T/T (5): -0,80 (0,73)

Variante de T-786C

T/T (22): -0,90 (0,47) 1,2795 0,53

T/C (23): -0,81 (0,56)

C/C (4): -0,62 (0,39)

Raza

Asiática (1): -0,50 (0) 1,9471 0,86

Negra (12): -0,79 (0,44)

Blanca (26): -0,92 (0,59)

Blanca/Negra (2): -0,76 (0,47)

Hispana (6): -0,73 (0,40)

No Informada (2): -0,59 (0,08)

Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico Tabla x2) Proporción de % de Cambio de NO / % de Cambio de ONOO-(LA-419 1 μM):

% de Cambio de NO / % de Cambio de ONOO(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 0,76 (8,64) 1,8736 0,39

G/T (18): -1,15,(0,91)

T/T (5): -0,66 (1,02)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,06 (9,40) 0,9272 0,63

T/C (23): -1,06 (0,82)

C/C (4): -0,80 (1,04)

Raza

Asiática (1): -0,48 (0) 2,2419 0,81

Negra (12): 2,81 (12,60)

Blanca (26): -1,09 (1,30)

Blanca/Negra (2): -1,07 (1,80)

Hispana (6): -0,90 (0,55)

No Informada (2): -0,90 (0,28)

Número de Veces de Diferencia

Tablas y1 -y3) Número de veces de diferencia de LA-419 5 μM – comparación entre genotipos Número de veces de diferencia = (LA-419 5 μM)/(control)

64

y1)

NO (LA-419 5 μM)

Variable: Nivel (n) Número de veces de diferencia (media ± dt) Estadística de Chi-cuadrado valor p

Variante de G894T

G/G (26): 1,16 (0,06) 4,1721 0,12

G/T (18): 1,13 (0,06)

T/T (5): 1,12 (0,07)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,16 (0,06) 3,0028 0,22

T/C (23): 1,14 (0,07)

C/C (4): 1,12 (0,06)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 1,14(0,07) 2,1674 0,538

b/a (10): 1,17 (0,07)

a/a (3): 1,14 (0,04)

c/c (1): 1,17 (0)

Número de veces de diferencia = promedio de 5 μM / promedio de Control. Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

5 y2)

ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 0,79 (0,07) 1,9795 0,37

G/T (18): 0,82 (0,06)

T/T (5): 0,81 (0,08)

Variante de T-786C

T/T (22): 0,79 (0,08) 0,9125 0,63

T/C (23): 0,82 (0,06)

C/C (4): 0,79 (0,08)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 0,81 (0,08) 1,5576 0,669

b/a (10): 0,80 (0,06)

a/a (3): 0,83 (0,03)

c/c (1): 0,77 (0)

65

y3)

NO/ONOO(LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 1,48 (0,18) 4,4466 0,108

G/T (18): 1,39 (0,13)

T/T (5): 1,39 (0,13)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,49 (0,18) 2,9791 0,226

T/C (23): 1,39 (0,14)

C/C (4): 1,42 (0,13)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 1,42 (0,18) 0,9604 0,811

b/a (10): 1,46 (0,14)

a/a (3): 1,37 (0,04)

c/c (1): 1,53 (0)

Tablas z1 -z3) Número de veces de diferencia de LA-419 1 μM) – comparación entre genotipos Número de veces de diferencia = (LA-419 1 μM)/(control)

z1)

NO (LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 1,08 (0,19) 0,5639 0,75

G/T (18): 1,21 (0,30)

T/T (5): 1,09 (0,19)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,09 (0,18) 2,0563 0,36

T/C (23): 1,18 (0,30)

C/C (4): 1,02 (0,12)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 1,13 (0,23) 4,276 0,233

b/a (10): 1,21 (0,28)

a/a (3): 0,95 (0,25)

c/c (1): 0,73 (0)

Número de veces de diferencia = promedio de 1 μM / promedio de Control. Estadística de Chi-cuadrado generada a 10 partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

66

z2)

ONOO(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 0,98 (0,27) 2,8861 0,24

G/T (18): 0,90 (0,27)

T/T (5): 0,75 (0,21)

Variante de T-786C

T/T (22): 0,95 (0,22) 3,9697 0,14

T/C (23): 0,88 (0,28)

C/C (4): 1,11 (0,44)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 0,90 (0,27) 2,5320 0,470

b/a (10): 0,93 (0,31)

a/a (3): 1,10 (0,34)

c/c (1): 0,99 (0)

Número de veces de diferencia = promedio de 1 μM / promedio de Control. Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

5 z3)

NO/ONOO(LA-419 1 μM)

Variante de G894T

G/G (26): 1,22 (0,52) 0,7130 0,700

G/T (18): 1,50 (0,77)

T/T (5): 1,62 (0,82)

Variante de T-786C

T/T (22): 1,25 (0,52) 2,6416 0,267

T/C (23): 1,53 (0,78)

C/C (4): 1,03 (0,36)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 1,43 (0,71) 3,4675 0,325

b/a (10): 1,43 (0,65)

a/a (3): 0,96 (0,45)

c/c (1): 0,74 (0)

Tablas aa1 -aa3) Número de veces de diferencia de LA-419 5 μM – comparación entre homocigotos del alelo 10 mayoritario y vehículos del alelo minoritario

Número de veces de diferencia = (LA-419 5 μM)/(control)

67

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ff3)

NO/ONOO(LA-419 1 μM)

Variable: Nivel (n) Número de veces de diferencia (media ± dt) Estadística de t valor p

Genotipo

Referencia (18): 1,28 (0,57) -0,0726 0,942

Combinación (31): 1,41 ,(0,71)

Número de veces de diferencia dentro de la raza blanca

Tablas gg1 -gg3) número de veces de diferencia en la raza blanca LA-419 5 μM – comparación entre genotipos Número de veces de diferencia = (LA-419 5 μM)/(controI)

gg1)

NO (LA-419 5 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 1,19 (0,07) 7,8918 0,02†

G/T (13): 1,12 (0,05)

T/T (3): 1,11 (0,07)

Variante de T-786C

T/T (10): 1,17 (0,08) 3,7379 0,15

T/C (15): 1,13 (0,06)

C/C (1): 1,08 (0)

Variante de Intrón 4

b/b (18): 1,13 (0,07) 1,1544 0,56

b/a (5): 1,16 (0,06)

a/a (1): 1,17 (0)

% de Control = promedio de 5 μM / promedio de Control. Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

gg2)

ONOO(LA-419 5 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 0,81 (0,04) 1,6319 0,44

G/T (13): 0,83 (0,06)

T/T (3): 0,80 (0,12)

Variante de T-786C

T/T (10): 0,82 (0,07) 3,2593 0,20

T/C (15): 0,83 (0,04)

C/C (1): 0,67 (0)

73

ONOO(LA-419 5 μM) Raza Blanca

Variante de Intrón 4

b/b (18): 0,82 (0,06) 0,4844 0,78

b/a (5): 0,83 (0,05)

a/a (1): 0,85 (0)

gg3)

NO/ONOO(LA-419 5 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 1,47 (0,12) 5,6513 0,06

G/T (13): 1,34 (0,09)

T/T (3): 1,39 (0,17)

Variante de T-786C

T/T (10): 1,49 (0,14) 5,1960 0,07

T/C(15): 1,35 (0,09)

C/C (1): 1,59 (0)

Variante de Intrón 4

b/b (18): 1,39 (0,13) 0,1518 0,93

b/a (5): 1,39 (0,12)

a/a (1): 1,39 (0)

Número de veces de diferencia = promedio de 5 μM / promedio de Control. Estadística de chi cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

Tablas hh1 -hh3) número de veces de diferencia en la raza blanca LA-419 1 μM – comparación entre genotipos Número de veces de diferencia = (LA-419 1 μM)/(controI)

hh1)

NO (LA-419 1 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 1,21 (0,12) 3,6332 0,16

G/T (13): 1,24 (0,33)

T/T (3): 1,08 (0,26)

Variante de T-786C

T/T (10): 1,20 (0,13) 3,1174 0,21

T/C(15): 1,24 (0,32)

C/C (1): 1,02 (0)

74

NO (LA-419 1 μM) Raza Blanca

Variante de Intrón 4

b/b (18): 1,21 (0,25) 0,4540 0,80

b/a (5): 1,28 (0,35)

a/a (1): 1,09 (0)

hh2)

ONOO(LA-419 1 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 0,86 (0,18) 5,1185 0,08

G/T (13): 0,83 (0,15)

T/T (3): 0,63 (0,19)

Variante de T-786C

T/T (10): 0,86 (0,18) 2,5840 0,27

T/C(15): 0,79 (0,17)

C/C (1): 0,83 (0)

Variante de Intrón 4

b/b (18): 0,79 (0,20) 0,5404 0,76

b/a (5): 0,85 (0,12)

a/a (1): 0,89 (0)

hh3)

NO/ONOO(LA-419 1 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 1,52 (0,61) 2,7557 0,25

G/T (13): 1,63 (0,82)

T/T (3): 1,90 (1,02)

Variante de T-786C

T/T (10): 1,50 (0,62) 0,1225 0,94

T/C(15): 1,72 (0,84)

C/C (1): 123 (0)

75

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Abundancia de proteína de eNOS

Tabla ss) % de cambio de eNOS, respuesta media para todos los genotipos y razas (LA-419 5 μM) % de Cambio = (promedio de 5 μM -promedio de control)/(promedio de control) *100 5 ss)

Abundancia de proteína de eNOS (LA-419 5 μM)

Variante de G894T

G/G (26): -1,07 (8,07) 0,0050 0,998

G/T (18): -0,79 (7,54)

T/T (5): -1,54 (6,56)

Variante de T-786C

T/T (22): -0,64 (5,88) 3,0416 0,219

T/C (23): -0,37 (9,0)

C/C (4): -6,82 (6,09)

Variante de Intrón 4

b/b (31): -1,78 (6,88) 1,5653 0,667

b/a (10): 0,68 (9,65)

a/a (3): 1,11 (10,89)

c/c (1): -5,66 (0)

Raza

Asiática (1): -17,56 (0) 15,1070 0,01†

Negra (12): -5,95 (6,82)

Blanca (26): 2,50 (6,89)

Blanca/Negra (2): -4,89 (0,49)

Hispana (6): -1,16 (4,99)

No Informada (2): -4,62 (0,81)

Estadística de Chi-cuadrado generada a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico Tablas tt1 -tt2) Efecto del genotipo en eNOS dentro del grupo de control y LA-419 5 μM; abundancia de proteína, pg/ug de proteína total 10 tt1)

Abundancia de proteína de eNOS (control)

Variable: Nivel (n) pg/ug (media ± dt) Estadística de Chi-cuadrado valor p

Variante de G894T

G/G (26): 6,32 (1,45) 1,4382 0,487

G/T (18): 5,82 (1,33)

T/T (5): 5,87 (1,83)

Variante de T-786C

T/T (22): 6,19 (1,43) 2,9222 0,232

T/C (23): 5,79 (1,38)

C/C (4): 7,22 (1,54)

Variante de Intrón 4

b/b (31): 5,89 (1,29) 3,2139 0,360

b/a (10): 5,97 (1,67)

a/a (3): 7,22 (1,85)

c/c (1): 7,83 (0)

85

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Número de veces de diferencia = (LA-419 5 μM)/(controI) I)

Tabla I) número de veces de diferencia en la raza blanca para abundancia de proteína de eNOS, LA-419 5 μM. Comparación entre genotipos:

Abundancia de proteína de eNOS (LA-419 5 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 1,06 (0,05) 3,8950 0,14

G/T(13): 1,00 (0,08)

T/T (3): 1,03 (0,02)

Variante de T-786C

T/T(10): 1,03 (0,06) 0,0564 0,97

T/C (15): 1,02 (0,08)

C/C (l): 1,01 (0)

Variante de Intrón 4

b/b (18): 1,00 (0,06) 6,5351 0,038†

b/a (5): 1,07 (0,06)

a/a (1): 1,14 (0)

Número de veces de diferencia = promedio de 5 μM / promedio de Control. Estadística de Chi-cuadrado generada

a partir del ensayo de Kruskal-Wallis para ANOVA No paramétrico

Tabla J) número de veces de diferencia en la raza blanca para abundancia de proteína de eNOS, LA-419 5 μM. Comparación entre homocigotos del alelo mayoritario y vehículos del alelo minoritario

Número de veces de diferencia = (LA-419 5 μM)/(controI)

J)

Abundancia de proteína de eNOS (5 μM) Raza Blanca

Variante de G894T

G/G (10): 1,06 (0,05) 1,7656 0,09

G/T y T/T (16): 1,01 (0,07)

Variante de T-786C

T/T (10): 1,03 (0,06) 0,1318 0,90

T/C y C/C (16): 1,02 (0,08)

Variante de Intrón 4

b/b (18): 1,00 (0,06) 2,4333 0,02†

b/a y a/a (6): 1,08 (0,06)

Número de veces de diferencia = promedio de 5 μM / promedio de Control. Estadística de t generada a partir del ensayo U de Mann-Whitney No paramétrico

Tabla K) Número de veces de diferencia en raza blanca para abundancia de proteína de eNOS, LA-419 5 μM 15 (combinación alélica individual) Grupo de referencia = G/G + T/T

Número de veces de diferencia = (LA-419 5 μM)/(control)

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Claims

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