ES2623633T3 - Marcadores de riesgo para enfermedad cardiovascular - Google Patents

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Eduardo Salas Pérez-Rasilla
Jaume Marrugat de la Iglesia
Roberto Elosua Llanos
Sergio CASTILLO FERNÁNDEZ
Joan Salgado Gómez
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Abstract

Procedimiento de determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular o de determinar la respuesta a una terapia cardiovascular en un sujeto que comprende las etapas de determinar en una muestra aislada de dicho sujeto la presencia de polimorfismos en las posiciones 27 dentro de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que la presencia en la posición 27 de una C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 es indicativa de un riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular o de una baja respuesta a una terapia cardiovascular.

Description

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DESCRIPCION
Marcadores de riesgo para enfermedad cardiovascular Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de enfermedades o trastornos cardiovasculares. Mas espedficamente, se refiere a marcadores y a procedimientos para determinar si un sujeto, particularmente un sujeto humano, esta en riesgo de desarrollar una enfermedad cardiovascular, tener una enfermedad cardiovascular o experimentar una complicacion de una enfermedad cardiovascular. La presente invencion tambien se refiere al uso de tales marcadores y procedimientos para monitorizar el estado de riesgo y/o enfermedad cardiovascular en un sujeto o los efectos de medidas/agentes preventivos y/o terapeuticos en sujetos con riesgo cardiovascular o enfermedad cardiovascular.
Antecedentes tecnicos
Enfermedad cardiovascular (CVD) es un termino para enfermedades del corazon y los vasos sangumeos, incluyendo, entre otros, cardiopatfa isquemica (que es el tipo de CVD mas frecuente en los pafses industrializados; este trastorno se refiere a problemas con la circulacion de la sangre al miocardio), enfermedad cerebrovascular (se refiere a un problema con la circulacion de la sangre en los vasos sangumeos del cerebro), y enfermedad vascular periferica (que afecta a la circulacion principalmente en las piernas). Los sujetos con CVD pueden desarrollar varias complicaciones (denominadas a continuacion en el presente documento complicaciones de CVD) que incluyen, pero no se limitan a, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardfaca congestiva, aneurisma de aorta y fallecimiento.
El estudio Framingham Heart Study (Kamel WB et al. Am J Cardiol 1988; 62:1109-1112., Wilson PWF et al., Circulation 1988; 97:1837-1847, Grundy S.M. et al. Circulation 1988; 97:1876-1887) fue un estudio pionero en el desarrollo del concepto de factores de riesgo, que actualmente se usa y esta aceptado ampliamente. Se ha reconocido que varios factores de riesgo independientes son la causa directa de enfermedad coronaria y son factores frecuentes en la poblacion, y su modificacion reduce el riesgo de acontecimientos coronarios (es decir, cardiovasculares) (Grundy S.C. et al., Circulation 2000; 101:e3-e11). Los principales factores de riesgo modificables son fumar, alta tension arterial, hipercolesterolemia (en particular alto colesterol LDL) y diabetes mellitus (Circulation 2000; 101:e3-e11).
La adaptacion de todas las acciones segun el riesgo absoluto (la probabilidad de que una persona desarrolle una enfermedad coronaria en un determinado periodo de tiempo) es importante, porque permite alcanzar un equilibrio adecuado entre eficacia, seguridad y costes de terapia. La estimacion del riesgo absoluto requiere sumar la contribucion de cada factor de riesgo y el resultado es “la determinacion del riesgo global”. El estudio Framingham Heart Study, tal como se menciono anteriormente, realizo una estimacion cuantitativa del riesgo global basandose en la contribucion de cada factor de riesgo que ha servido para que otras sociedades desarrollen otros algoritmos para otras poblaciones. La incidencia y aparicion de enfermedad cardiovascular en Europa difiere significativamente de los Estados Unidos, y se ha notificado que la escala de Framingham sobreestima el riesgo cardiovascular en la poblacion europea (Moreno J et al., Rev Med Univ Navarra 2005; 49:109-115).
Por este motivo, se han desarrollado dos escalas para estimar el riesgo cardiovascular en Europa: la escala PROCAM que estima el riesgo de complicaciones cardiovasculares (Assman G et al., Circulation 2002; 105:310-315) y el proyecto SCORE (Conroy R.M. et al., Eur Heart J 2003; 24:987-1003), que estima el riesgo de fallecimiento cardiovascular.
Sin embargo, a pesar de todos los esfuerzos realizados para estimar el riesgo y a pesar de la recomendacion de estimar el riesgo cardiovascular global en todos los pacientes, se produce un numero considerable de acontecimientos cardiovasculares en pacientes asintomaticos con un riesgo intermedio segun las herramientas de valoracion de riesgos (Circulation 2001; 104:1863-1867).
Los pacientes con un riesgo intermedio se beneficianan significativamente del uso de mas pruebas que permitan una estratificacion mas precisa de su riesgo (Circulation 2001; 104:1863-1867, Am J Cardiol 2006; 97 [supl.]: 28A- 32A).
Varios estudios han identificado marcadores geneticos que se asocian con el riesgo de padecer una CVD. En particular, se han publicado tres estudios que analizan si la incorporacion de informacion genetica en las funciones clasicas de riesgo mejora sus capacidades predictivas y discriminatorias. El primero, publicado por Morrison et al., (Am J Epidemiol. 1 de julio de 2007; 166(1):28-35) con un seguimiento de mas de 15.000 participates del estudio ARIC, construyo en esta cohorte una escala de riesgo genetico que inclma 11 polimorfismos. Sin embargo, esta funcion no mejora la capacidad de discriminacion de los factores de riesgo clasicos (el area bajo la curva ROC solo aumentaba ligeramente desde 0,764 hasta 0,766).
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El segundo, publicado por Kathiresan et al. (N Engl J Med. 20 de marzo de 2008; 358(12):1240-9) tambien uso una funcion de riesgo genetico que inclma 9 polimorfismos relacionados con el metabolismo de los lfpidos, tambien basandose en el numero de alelos de riesgo en cada sujeto. Esta funcion de riesgo genetico se relaciono independientemente con la aparicion de acontecimientos cardiovasculares en la cohorte de Malmo. Aunque esta puntuacion no mejoraba la capacidad de discriminacion de los factores de riesgo clasicos (area bajo la curva ROC de 0,8 con y sin la informacion genetica), se mejoro la reclasificacion.
El tercer artfculo, y el mas reciente, era un estudio realizado en una cohorte de enfermeros americanos. La incorporacion de la variabilidad genetica en el cromosoma 9p21.3 no mejora la capacidad de discriminacion (area bajo la curva ROC de desde 0,807 hasta 0,809) ni la reclasificacion de individuos con respecto a la obtenida con los factores de riesgo clasicos (Ann Intern Med. 20 de enero de 2009; 150(2):65-72).
Por tanto, a pesar de varios intentos realizados para mejorar el poder de prediccion de los CVRF, aun no se ha logrado este objetivo.
A partir de los siguientes documentos:
SCHUNKERT HERIBERT ET AL., CIRCULATION 1 APR 2008, vol. 117, n.° 13, 1 de abril de 2008 (), paginas 1675-1684;
KARVANEN JUHA ET AL., GENETIC EPIDEMIOLOGY APR 2009, vol. 33, n.° 3, abril de 2009 (04-2009), paginas 237-246;
SAMANI NILESH J ET AL., THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 2 AUG 2007, vol. 357, n.° 5, 2 de agosto de 2007 (), paginas 443-453; y
YE SHU ET AL., JOURNAL OF THE AMERICAN COLLEGE OF CARDIOLOGY 29 JUL 2008, vol. 52, n.° 5, 29 de julio de 2008 (), paginas 378-384;
se conocio una asociacion entre el SNP espedfico rs1333049 y el riesgo o diagnostico de enfermedad cardiovascular o respuesta a terapia. El documento WO 2008/102380 y WELLCOME TRUST CASE CONTROL CONSORTIUM: “Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls”. NATURE 7 JUN 2007, vol. 447, n.° 7145, 7 de junio de 2007 (), paginas 661-678 comprenden una divulgacion similar. Sin embargo, estos documentos no se refieren a una propuesta de combinaciones ventajosas particulares de SNP.
Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos marcadores, incluyendo nuevos marcadores geneticos y combinaciones de los mismos, que puedan predecir de manera satisfactoria y ventajosa quien presenta un riesgo mayor de desarrollar factores de riesgo cardiovascular clasicos de manera que puedan implementase medidas preventivas para mantener el riesgo cardiovascular al nivel mas bajo posible.
Resumen de la invencion
En un primer aspecto, la invencion proporciona un procedimiento de determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular o de determinar la respuesta a una terapia cardiovascular tal como se define en la reivindicacion 1.
La invencion proporciona ademas un procedimiento para identificar un sujeto que necesita terapia cardiovascular temprana y/o agresiva o que necesita terapia cardiovascular profilactica que comprende las etapas de determinar en una muestra aislada de dicho sujeto la presencia de polimorfismos en las posiciones 27 dentro de secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 es indicativa de tener una respuesta disminuida a una terapia cardiovascular o de necesitar terapia cardiovascular temprana y agresiva o necesitar tratamiento cardiovascular profilactico.
En un aspecto de referencia, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece una enfermedad cardiovascular con una terapia cardiovascular en el que el paciente se selecciona para dicha terapia basandose en la presencia, en una muestra aislada de dicho sujeto, de un polimorfismo en la posicion 27 en las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que dicho polimorfismo en dicha posicion 27 es C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11.
En aspectos adicionales, la invencion se refiere a procedimientos para la determinacion de la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina mortal o no mortal en un periodo de 10 anos tal como se define en las reivindicaciones 7, 8 o 9.
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En aun un aspecto adicional, la invencion se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar la identidad de los nucleotidos en la posicion 27 dentro de la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11.
Descripcion detallada de la invencion
Los autores de la presente invencion han identificado una serie de marcadores de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP) que, cuando se usan en combinacion, estan asociados con un riesgo de CVD y/o con un riesgo de complicaciones de CVD que incluyen, pero no se limitan a, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardfaca congestiva, aneurisma de aorta y fallecimiento. Estos marcadores polimorficos parecen mostrar valor predictivo independientemente de los factores de riesgo clasicos tales como altos niveles de LDL y VLDL, habitos de fumar, bajos niveles de HDL, altos niveles de lipoprotema A, hipertension, diabetes, altos niveles de homocistema, altos niveles de factores hemostaticos, smdrome metabolico, resistencia a la insulina, historia familiar y similares y son superiores a los polimorfismos usados individualmente o a los factores de riesgo cardiovascular convencionales.
Procedimiento para determinar si un sujeto tiene un riesgo alterado de tener una enfermedad cardiovascular adversa
En un primer aspecto, la invencion se refiere a un procedimiento (a continuacion en el presente documento el primer procedimiento de la invencion) de determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular o de determinar la respuesta a una terapia cardiovascular en un sujeto que comprende las etapas de determinar, en una muestra aislada de dicho sujeto, la identidad de los nucleotidos en la posicion 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11 (vease la tabla 1), en el que la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 es indicativa de un riesgo aumentado de tener enfermedad o trastorno cardiovascular o de una baja respuesta a una terapia cardiovascular.
Los terminos “polimorfismo” y “polimorfismo de un solo nucleotido” (SNP) se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a una variacion de secuencia de nucleotidos que se produce cuando un solo nucleotido en el genoma u otra secuencia compartida difiere entre miembros de especies o entre cromosomas emparejados en un individuo. Un SNP tambien puede designarse como una mutacion con baja frecuencia de alelo mayor que aproximadamente el 1% en una poblacion definida. Los polimorfismos de un solo nucleotido segun la presente solicitud pueden encontrarse dentro de secuencias codificantes de genes, regiones no codificantes de genes o las regiones intronicas entre genes.
La lista de polimorfismos que se usan en el procedimiento de la presente invencion se facilita en la tabla 1.
SEQ ID NO:
Secuencia que comprende el polimorfismo numero de registro en dbSNP Alelo de riesgo Crom. Posicion en crom. Cadena Numero de registro / version
1
TCATACTAACCATATGATCAACAGTT CAAAAGCAGCCACTCGCAGAGGTAAG rs1333049 C 9 22063860 + AC 000052/ 03.03.2008
2
AAAGAGAAAGAAATAGGAGCAGGAT CAACTTCCAGATATACAGAGAATATAA rs599839 A 1 109623689 + NC 000001/ 03.03.2008
3
AACCATAATAGTTATGCTGAGAAGT TCTTTTTTGTCATAGTGCAAGATAACA rs17465637 C 1 196042601 + AC 000044/ 03.03.2008
4
TTGAAAAAAATTAATTCTCACACT CCJAAGTGCATTTAATTTAAGCTACTTT rs501120 T 10 40757334 + AC 000053/ 03.03.2008
5
AAAAGCAAGCACATCTGTGGCATT ACCAACATTAAATATTTATATACATAGT rs2943634 C 2 220837297 + AC 000045/ 03.03.2008
6
ACAGTTTTTACTGTAACTGCCAAT AAATAATACTCATCTTAAAAAGACATC rs6922269 A 6 151294678 + NC 000006/ 03.03.2008
7
GGCAAGTACCTGGGCACAGGGCTGC TTCATGGCCTTGGACCTGGACAGTGGA rs9982601 T 21 20798690 + AC 000064/ 03,032008
8
ACATCTGCCTCTCTAGACTATAAAC TCTTTGGGGCTAGGTCTTCTTTGTCTT rs12526453 C 6 14155621 + AC 000049/ 03.03.2008
9
GCTATCATTTAAATTTGGTTGAGAC ACAATATGCTGTTGCACTTTCTATAAA rs6725887 C 2 197498571 + AC 000045/ 03.03.2008
10
CTGTGCTGCTTGGTGCCTCTCTGAT AJGAATACACTGACACGTCAAAGTAAC rs9818870 T 3 136547031 + AC 000046/ 03.03.2008
11
CTTGCTCCAGCATCCAGGAGGTCCG GTGGTGCACACGGCTTGAGATGCCTGA rs3184504 T 12 111511042 + AC 000055/ 03.03.2008
Tabla 1: Polimorfismos usados en el procedimiento de la invencion incluyendo SEQ ID NO:, las secuencias que
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flanquean el polimorfismo y la posicion polimorfica (subrayada), el numero de registro en dbSNP, el cromosoma y la posicion en el cromosoma en la que se encuentra el polimorfo y el numero de registro y version de la base de datos de la secuencia del fragmento cromosomico.
El termino “determinar si un sujeto tiene un riesgo alterado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la valoracion de la probabilidad segun la cual un sujeto padecera una enfermedad. El termino “determinar la respuesta a una terapia cardiovascular”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la valoracion de la probabilidad con la que un sujeto respondera a una terapia. Como entenderan los expertos en la tecnica, una valoracion de este tipo, aunque se prefiere que sea correcta, habitualmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que van a diagnosticarse o evaluarse. Sin embargo, el termino requiere que una porcion estadfsticamente significativa de sujetos pueda identificarse como que tienen un riesgo aumentado o que responden a la terapia. Si una porcion es estadfsticamente significativa puede determinarse sin mayores problemas por el experto en la tecnica usando diversas herramientas de evaluacion estadfstica bien conocidas, por ejemplo, determinacion de intervalos de confianza, determinacion del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann- Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, de 0,2, 0,1 o 0,05.
El termino “enfermedad o trastorno cardiovascular”, tal como se usa en el presente documento, incluye enfermedades que afectan al corazon o a los vasos sangumeos o a ambos o asociadas con los aparatos cardiopulmonar y circulatorio incluyendo, pero sin limitarse a, isquemia, angina, estados edematosos, arterosclerosis, cardiopatfa coronaria, oxidacion de LDL, adhesion de monocitos a celulas endoteliales, formacion de macrofagos espumosos, desarrollo de estna grasa, adherencia plaquetaria y agregacion, proliferacion de celulas del musculo liso, lesion por reperfusion, alta tension arterial, enfermedad trombotica, arritmia (auricular o ventricular o ambas); trastornos del ritmo cardfaco; isquemia de miocardio; infarto de miocardio; aneurisma cardfaco o vascular; vasculitis, accidente cerebrovascular; arteriopatfa obstructiva periferica de una extremidad, un organo, o un tejido; lesion por reperfusion tras isquemia del cerebro, corazon u otro organo o tejido, choque endotoxico, quirurgico o traumatico; hipertension, valvulopatfa, insuficiencia cardfaca, tension arterial anomala; choque; vasoconstriccion (incluyendo la asociada con migranas); anomalfa vascular, inflamacion, insuficiencia limitada a un solo organo o tejido.
En un modo de realizacion preferido, la enfermedad cardiovascular cuyo riesgo va a detectarse se selecciona del grupo de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardfaca congestiva, aneurisma de aorta o una combinacion de los mismos.
El termino “terapia cardiovascular”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de tratamiento que da como resultado la mejora o reduce el riesgo de padecer cualquiera de las enfermedades cardiovasculares anteriormente mencionadas. Las terapias adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen, sin limitacion, anticoagulantes, antiagregantes plaquetarios, agentes tromboltticos, antitromboticos, agentes antianitmicos, agentes que prolongan la repolarizacion, agentes antihipertensores, vasodilatador, antihipertensores, diureticos, agentes inotropicos, agentes antianginosos y similares.
Los ejemplos no limitativos de anticoagulantes incluyen acenocumarol, ancrod, anisindiona, bromindiona, clorindiona, cumetarol, ciclocumarol, sulfato de dextrano sodico, dicumarol, difenadiona, biscumacetato de etilo, etilideno dicumarol, fluindiona, heparina, hirudina, liapolato sodico, oxazidiona, polisulfato de pentosano, fenindiona, fenprocumona, fosvitina, picotamida, tioclomarol y warfarina.
Los ejemplos no limitativos de antiagregantes plaquetarios incluyen aspirina, un dextrano, dipiridamol (persantina), heparina, sulfinpiranona (Anturane), clopidrogel y ticlopidina (Ticlid). Los ejemplos no limitativos de agentes tromboltticos incluyen activador del plasminogeno tisular (Activase), plasmina, pro-uroquinasa, uroquinasa (Abbokinase), estreptoquinasa (Streptase), anistreplasa/APSAC (Eminase).
En determinados modos de realizacion en las que un paciente padece de una hemorragia o una probabilidad aumentada de padecer una hemorragia, puede usarse un agente que pueda aumentar la coagulacion sangumea. Los ejemplos no limitativos de agentes que promueven la coagulacion sangumea incluyen antagonistas de agente trombolttico y antagonistas de anticoagulante. Los ejemplos no limitativos de antagonistas de anticoagulante incluyen protamina y vitamina K1.
Los ejemplos no limitativos de antagonistas de agente trombolftico incluyen acido aminocaproico (Amicar) y acido tranexamico (Amstat). Los ejemplos no limitativos de antitromboticos incluyen anagrelida, argatroban, cilstazol, daltroban, defibrotida, enoxaparina, fraxiparina, indobufeno, lamoparano, ozagrel, picotamida, plafibrida, tedelparina, ticlopidina y triflusal.
Los ejemplos no limitativos de agentes antiarntmicos incluyen agentes antiarntmicos de clase I (bloqueantes de canales de sodio), agentes antiarntmicos de clase II (bloqueantes beta-adrenergicos), agentes antiarntmicos de clase III (farmacos que prolongan la repolarizacion), agentes antiarntmicos de clase IV (bloqueantes de canales de
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calcio) y agentes antiamtmicos diversos.
Los ejemplos no limitativos de bloqueantes de canales de sodio incluyen agentes antiamtmicos de clase IA, clase IB y clase IC. Los ejemplos no limitativos de agentes antiamtmicos de clase IA incluyen dispiramida (Norpace), procainamida (Pronestyl) y quinidina (Quinidex). Los ejemplos no limitativos de agentes antiamtmicos de clase IB incluyen lidocama (Xylocaine), tocainida (Tonocard) y mexiletina (Mexitil). Los ejemplos no limitativos de agentes antiamtmicos de clase IC incluyen encainida (Enkaid) y fiecainida (Tambocor).
Los ejemplos no limitativos de beta-bloqueantes, tambien conocidos como bloqueante beta-adrenergico, antagonistas beta-adrenergicos o agentes antiamtmicos de clase II, incluyen acebutolol (Sectral), alprenolol, amosulalol, arotinolol, atenolol, befunolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bucumolol, bufetolol, bufuralol, bunitrolol, bupranolol, clorhidrato de butidrina, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, cloranolol, dilevalol, epanolol, esmolol (Brevibloc), indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nadoxolol, nifenalol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, practolol, pronetalol, propanolol (Inderal), sotalol (Betapace), sulfinalol, talinolol, tertatolol, timolol, toliprolol y xibinolol. En determinados modos de realizacion, el beta-bloqueante comprende un derivado de ariloxipropanolamina. Los ejemplos no limitativos de derivados de ariloxipropanolamina incluyen acebutolol, alprenolol, arotinolol, atenolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bunitrolol, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, epanolol, indenolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propanolol, talinolol, tertatolol, timolol y toliprolol.
Los ejemplos no limitativos de agentes con capacidades hipolipidemiantes incluyen, sin limitacion, secuestrantes de acido biliar tales como aminas cuaternarias (por ejemplo, colestiramina y colestipol); acido nicotmico y sus derivados; inhibidores de HMG-CoA reductasa tales como mevastatina, pravastatina y simvastatina; gemfibrozilo y otros acidos ffbricos, tales como clofibrato, fenofibrato, benzafibrato y cipofibrato; probucol; raloxifeno y sus derivados.
Los ejemplos no limitativos de agentes que prolongan la repolarizacion, tambien conocidos como agentes antiamtmicos de clase III, incluyen amiodarona (Cordarone) y sotalol (Betapace).
Los ejemplos no limitativos de bloqueante de canales de calcio, tambien conocidos como agente antiarrftmico de clase IV, incluyen una arilalquilamina (por ejemplo, bepridilo, diltiazem, fendilina, galopamilo, prenilamina, terodilina, verapamilo), un derivado de dihidropiridina (felodipina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina, nisoldipina, nitrendipina), un derivado de piperazinida (por ejemplo, cinarizina, flunarizina, lidoflazina) o un bloqueante de canales de calcio diverso tal como benciclano, etafenona, magnesio, mibefradil o perhexilina. En determinados modos de realizacion, un bloqueante de canales de calcio comprende un antagonista de calcio de dihidropiridina de accion prolongada (tipo nifedipino).
Los ejemplos no limitativos de agentes antiamtmicos diversos incluyen adenosina (Adenocard), digoxina (Lanoxin), acecainida, ajmalina, amoproxano, aprindina, tosilato de bretilio, bunaftina, butobendina, acido capobenico, cifenlina, disopiranida, hidroquinidina, indecainida, bromuro de ipatropio, lidocama, lorajmina, lorcainida, meobentina, moricizina, pirmenol, prajmalina, propafenona, pirinolina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina y viquidil.
Los ejemplos no limitativos de agentes antihipertensores incluyen agentes simpatolfticos, alfa/beta-bloqueantes, alfa- bloqueantes, agentes antiangiotensina II, beta-bloqueantes, bloqueantes de canales de calcio, vasodilatadores y antihipertensores diversos.
Los ejemplos no limitativos de alfa-bloqueante, tambien conocido como bloqueante alfa-adrenergico o un antagonista alfa-adrenergico, incluyen amosulalol, arotinolol, dapiprazol, doxazosina, mesilatos ergoloides, fenspirida, indoramina, labetalol, nicergolina, prazosina, terazosina, tolazolina, trimazosina y yohimbina. En determinados modos de realizacion, un a-bloqueante puede comprender un derivado de quinazolina. Los ejemplos no limitativos de derivados de quinazolina incluyen alfuzosina, bunazosina, doxazosina, prazosina, terazosina y trimazosina. En determinados modos de realizacion, un agente antihipertensor es un antagonista tanto alfa como beta-adrenergico. Los ejemplos no limitativos de un alfa/beta-bloqueante comprenden labetalol (Normodyne, Trandate).
Los ejemplos no limitativos de agentes antiangiotensina II incluyen inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y antagonistas del receptor de angiotensina II. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de ACE) incluyen alacepril, enalapril (Vasotec), captopril, cilazapril, delapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moveltopril, perindopril, quinapril y ramipril. Los ejemplos no limitativos de bloqueante del receptor de angiotensina II, tambien conocido como antagonista del receptor de angiotensina II, bloqueantes de receptor de ANG o bloqueantes de receptor tipo 1 de ANG-II (ARBS), incluyen angiocandesartan, eprosartan, irbesartan, losartan y valsartan. Los ejemplos no limitativos de agentes simpatolfticos incluyen agentes simpaticolfticos que actuan en el sistema nervioso central o agentes simpatolfticos que actuan en el sistema nervioso periferico. Los ejemplos no limitativos de agentes simpatolfticos que actuan en el sistema nervioso central,
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tambien conocidos como agentes simpatoltticos del sistema nervioso central (SNC), incluyen clonidina (Catapres), guanabenz (Wytensin), guanfacina (Tenex) y metildopa (Aldomet). Los ejemplos no limitativos de un simpatolftico de accion periferica incluyen agentes bloqueantes de ganglios, un agente bloqueante neuronales adrenergicos, un agente bloqueante beta-adrenergico o un agente bloqueante a-adrenergico. Los ejemplos no limitativos de agentes bloqueantes de ganglios incluyen mecamilamina (Inversine) y trimetapan (Arfonad). Los ejemplos no limitativos de agentes bloqueantes neuronales adrenergicos incluyen guanetidina (Ismelin) y reserpina (Serpasil). Los ejemplos no limitativos de bloqueantes beta-adrenergicos incluyen acenitolol (Sectral), atenolol (Tenormin), betaxolol (Kerlone), carteolol (Cartrol), labetalol (Normodyne, Trandate), metoprolol (Lopressor), nadanol (Corgard), penbutolol (Levatol), pindolol (Visken), propranolol (Inderal) y timolol (Blocadren). Los ejemplos no limitativos de bloqueantes alfa- adrenergicos incluyen prazosina (Minipress), doxazocina (Cardura) y terazosina (Hytrin).
En determinados modos de realizacion un agente terapeutico cardiovasculador puede comprender un vasodilatador (por ejemplo, un vasodilatador cerebral, un vasodilatador coronario o un vasodilatador periferico). En determinados modos de realizacion preferidos, un vasodilatador comprende un vasodilatador coronario. Los ejemplos no limitativos de vasodilatadores coronarios incluyen amotrifeno, bendazol, hemisuccinato de benfurodilo, benziodarona, cloracizina, cromonar, clobenfurol, clonitrato, dilazep, dipiridamol, droprenilamina, efloxato, tetranitrano de eritritilo, etafenona, fendilina, floredil, ganglefeno, herestrol bis(beta-dietilaminoetil eter), hexobendina, tosilato de itramina, kelina, lidoflanina, hexanitrato de manitol, medibazina, nicorglicerina, tetranitrato de pentaeritritol, pentrinitrol, perhexilina, pimefilina, trapidil, tricromilo, trimetazidina, fosfato de trolnitrato y visnadina.
En determinados modos de realizacion, un vasodilatador puede comprender un vasodilatador de terapia cronica o un vasodilatador de emergencia hipertensor. Los ejemplos no limitativos de un vasodilatador de terapia cronica incluyen hidralazina (Apresoline) y minoxidil (Loniten). Los ejemplos no limitativos de un vasodilatador de emergencia hipertensor incluyen nitroprusiato (Nipride), diazoxido (Hyperstat IV), hidralazina (Apresoline), minoxidil (Loniten) y verapamilo.
Los ejemplos no limitativos de antihipertensores diversos incluyen ajmalina, acido gamma-aminobutmco, bufeniode, cicletainina, ciclosidomina, un tanato de criptenamina, fenoldopam, flosequinan, ketanserina, mebutamato, mecamilamina, metildopa, tiosemicarbazona de metil 4-piridil cetona, muzolimina, pargilina, pempidina, pinacidilo, piperoxano, primaperona, una protoveratrina, raubasina, rescimetol, rilmenideno, saralasina, nitroprusiato de sodio, ticrinafeno, camsilato de trimetapan, tirosinasa y urapidil.
En determinados modos de realizacion, un antihipertensor puede comprender un derivado de ariletanolamina, un derivado de benzotiadiazina, un derivado de 7V-carboxialquil(peptido/lactama), un derivado de dihidropiridina, un derivado de guanidina, una hidrazina/ftalazina, un derivado de imidazol, un compuesto de amonio cuaternario, un derivado de reserpina o un derivado de sulfonamida. Los ejemplos no limitativos de derivados de ariletanolamina incluyen amosulalol, bufuralol, dilevalol, labetalol, pronetalol, sotalol y sulfinalol. Los ejemplos no limitativos de derivados de benzotiadiazina incluyen altizida, bendroflumetiazida, benzotiazida, bencilhidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clortalidona, ciclopentiazida, ciclotiazida, diazoxido, epitiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotizida, hidroflumetizida, meticlotiazida, meticrano, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclormetiazida y triclormetiazida. Los ejemplos no limitativos de derivados de N-carboxialquil(peptido/lactama) incluyen alacepril, captopril, cilazapril, delapril, enalapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moveltipril, perindopril, quinapril y ramipril. Los ejemplos no limitativos de derivados de dihidropiridina incluyen amlodipina, felodipina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nilvadipina, nisoldipina y nitrendipina. Los ejemplos no limitativos de derivados de guanidina incluyen betanidina, debrisoquina, guanabenz, guanaclina, guanadrel, guanazodina, guanetidina, guanfacina, guanoclor, guanoxabenz y guanoxan. Los ejemplos no limitativos de hidrazinas/ftalazinas incluyen budralazina, cadralazina, dihidralazina, endralazina, hidracarbazina, hidralazina, feniprazina, pildralazina y todralazina. Los ejemplos no limitativos de derivados de imidazol incluyen clonidina, lofexidina, fentolamina, tiamenidina y tolonidina. Los ejemplos no limitativos de compuestos de amonio cuaternario incluyen bromuro de azametonio, cloruro de clorisondamina, hexametonio, bis(metilsulfato) de pentacinio, bromuro de pentametonio, tartrato de pentolinio, cloruro de fenactropinio y metosulfato de trimetidinio. Los ejemplos no limitativos de derivados de reserpina incluyen bietaserpina, deserpidina, rescinamina, reserpina y sirosingopina. Los ejemplos no limitativos de derivados de sulfonamida incluyen ambusida, clopamida, furosemida, indapamida, quinetazona, tripamida y xipamida. Los vasopresores generalmente se usan para aumentar la tension arterial durante el choque, que puede producirse durante un procedimiento quirurgico. Los ejemplos no limitativos de un vasopresor, tambien conocido como antihipotensor, incluyen metilsulfato de amezinio, amida angiotensina, dimetofrina, dopamina, etifelmina, etilefrina, gepefrina, metaraminol, midodrina, norepinefrina, foledrina y sinefrina. Los ejemplos no limitativos de agentes para el tratamiento de insuficiencia cardfaca congestiva incluyen agentes antiangiotensina II, tratamiento de reduccion de despues de la carga-antes de la carga, diureticos y agentes inotropicos.
En determinados modos de realizacion, un animal, por ejemplo un paciente humano, que no puede tolerar un antagonista de angiotensina puede tratarse con una terapia combinacion. Tal terapia puede combinar la administracion de hidralazina (Apresoline) y dinitrato de isosorbida (Isordil, Sorbitrate).
Los ejemplos no limitativos de diureticos incluyen un derivado de tiazida o benzotiadiazina (por ejemplo, altiazida, bendroflumetazida, benzotiazida, bencilhidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clorotiazida, clortalidona,
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ciclopentiazida, epitiazida, etiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, meticrane, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclorometiazida, triclorometiazida), un organomercurio (por ejemplo, clormerodrina, meralurida, mercamfamida, mercaptomerina sodica, acido mercumaUlico, mercumatilina sodica, cloruro mercuroso, mersalilo), una pteridina (por ejemplo, furtereno, triamtereno), purinas (por ejemplo, acefilina, 7-morfolinometilteofilina, pamobrom, proteobromina, teobromina), esteroides incluyendo antagonistas de aldosterona (por ejemplo, canrenona, oleandrina, espironolactona), un derivado de sulfonamida (por ejemplo, acetazolamida, ambusida, azosemida, bumetanida, butazolamida, cloraminofenamida, clofenamida, clopamida, clorexolona, 4,4'-disulfonamida de difenilmetano, disulfamida, etoxzolamida, furosemida, indapamida, mefrusida, metazolamida, piretanida, quinetazona, torasemida, tripamida, xipamida), un uracilo (por ejemplo, aminometradina, amisometradina), un antagonista ahorrador de potasio (por ejemplo, amilorida, triamtereno) o un diuretico diverso tal como aminozina, arbutina, clorazanilo, acido etacrmico, etozolina, hidracarbazina, isosorbida, manitol, metocalcona, muzolimina, perexilina, ticrnafen y urea.
Los ejemplos no limitativos de agentes inotropicos positivos, tambien conocidos como cardiotonicos, incluyen acefilina, una acetildigitoxina, 2-amino-4-picolina, amrinona, hemisuccinato de benfurodilo, bucladesina, cerberosina, camfotamida, convalatoxina, cimarina, denopamina, deslanosido, digitalina, digitalis, digitoxina, digoxina, dobutamina, dopamina, dopexamina, enoximona, eritroflema, fenalcomina, gitalina, gitoxina, glicociamina, heptaminol, hidrastinina, ibopamina, un lanatosido, metamivam, milrinona, nerifolina, oleandrina, ouabama, oxifedrina, prenalterol, proscilaridina, resibufogenina, escilareno, escilarenina, estrofantina, sulmazol, teobromina y xamoterol.
En modos de realizacion particulares, un agente inotropico es un glucosido cardfaco, un agonista beta-adrenergico o un inhibidor de la fosfodiesterasa. Los ejemplos no limitativos de glucosidos cardiacos incluyen digoxina (Lanoxin) y digitoxina (Crystodigin). Los ejemplos no limitativos de agonistas beta-adrenergicos incluyen albuterol, bambuterol, bitolterol, carbuterol, clenbuterol, clorprenalina, denopamina, dioxetedrina, dobutamina (Dobutrex), dopamina (Intropin), dopexamina, efedrina, etafedrina, etinorepinefrina, fenoterol, formoterol, hexoprenalina, ibopamina, isoetarina, isoproterenol, mabuterol, metaproterenol, metoxifenamina, oxifedrina, pirbuterol, procaterol, protoquilol, reproterol, rimiterol, ritodrina, soterenol, terbutalina, tretoquinol, tulobuterol y xamoterol. Los ejemplos no limitativos de un inhibidor de la fosfodiesterasa incluyen amrinona (Inocor).
Los agentes antianginosos pueden comprender organonitratos, bloqueantes de canales de calcio, beta-bloqueantes y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de organonitratos, tambien conocidos como nitrovasodilatadores, incluyen nitroglicerina (Nitro-bid, Nitrostat), dinitrato de isosorbida (Isordil, Sorbitrate) y nitrato de amilo (Aspirol, Vaporole). La endotelina (ET) es un peptido de 21 aminoacidos que tiene potentes efectos fisiologicos y fisiopatologicos que parecen estar implicados en el desarrollo de la insuficiencia cardfaca. Los efectos de ET estan mediados a traves de la interaccion con dos clases de receptores de superficie celular. El receptor de tipo A (ET-A) esta asociado con vasoconstriccion y crecimiento celular mientras que el receptor de tipo B (ET-B) esta asociado con vasodilatacion mediada por celulas endoteliales y con la liberacion de otras neurohormonas, tales como aldosterona. En la tecnica se conocen agentes farmacologicos que pueden inhibir o bien la produccion de ET o bien su capacidad para estimular celulas relevantes. La inhibicion de la produccion de ET implica el uso de agentes que bloquean una enzima denominada enzima convertidora de endotelina que esta implicada en el procesamiento del peptido activo a partir de su precursor. La inhibicion de la capacidad de ET para estimular celulas implica el uso de agentes que bloquean la interaccion de ET con sus receptores. Los ejemplos no limitativos de antagonistas de receptores de endotelina (ERA) incluyen bosentan, enrasentan, ambrisentan, darusentan, tezosentan, atrasentan, avosentan, clazosentan, edonentan, sitaxentan, TBC 3711, BQ 123 y BQ 788.
El termino “muestra”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra de una fuente biologica e incluye, sin limitacion, cultivos celulares o extractos de los mismos, material de biopsia obtenido de un marnffero o extractos de los mismos, y sangre, saliva, orina, heces, semen, lagrimas, u otros lfquidos corporales o extractos de los mismos.
Los expertos en la tecnica reconoceran facilmente que el analisis de los nucleotidos presentes segun el procedimiento de la invencion en el acido nucleico de un individuo puede realizarse mediante cualquier procedimiento o tecnica que sea capaz de determinar nucleotidos presentes en un sitio polimorfico. Tal como resulta obvio en la tecnica, los nucleotidos presentes en los marcadores polimorficos pueden determinarse a partir de cualquier cadena de acido nucleico o de ambas cadenas.
Una vez que se ha obtenido una muestra biologica de un sujeto (por ejemplo, un lfquido corporal, tal como orina, saliva, plasma, suero, o una muestra de tejido, tal como muestra de tejido bucal o celula bucal) normalmente se emprende la deteccion de una variacion de secuencia o variante alelica de SNP. Se emplea practicamente cualquier procedimiento conocido por el experto en la tecnica. Quizas el procedimiento mas directo es determinar realmente la secuencia de o bien ADN genomico o bien ADNc y comparar estas secuencias con alelos conocidos de SNP del gen. Esto puede ser un proceso bastante caro y que requiere mucho tiempo. No obstante, esta tecnologfa es bastante comun y bien conocida.
Puede usarse cualquiera de una variedad de procedimientos que existen para detectar variaciones de secuencia en
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los procedimientos de la invencion. El procedimiento particular usado no es importante en la estimacion de riesgo cardiovascular o seleccion del tratamiento.
Existen otros procedimientos disponibles comercialmente posibles para la identificacion de SNP de alto rendimiento que no usan tecnologfas de secuenciacion directa. Por ejemplo, la tecnolog^a Veracode de Illumina, la qmmica de genotipado de SNP Taqman® y la qmmica de genotipado de SNP KASPar.
Una variacion en el procedimiento de determinacion de secuencia directo es el procedimiento Gene Chip(TM) disponible de Affymetrix. Alternativamente, tambien estan disponibles comercialmente modos robustos y mas economicos de detectar la variacion de la secuencia de ADN. Por ejemplo, Perkin Elmer adapto su ensayo TAQman Assay(TM) para detectar la variacion de secuencia. Orchid BioSciences tiene un procedimiento denominado SNP-IT (TM) (tecnologfa de identificacion de SNP) que usa extension con cebador con analogos de nucleotidos marcados para determinar que nucleotido se produce en la posicion inmediatamente en 3' de una sonda de oligonucleotidos, entonces se identifica la base extendida usando fluorescencia directa, ensayo colorimetrico indirecto, espectrometna de masas o polarizacion de fluorescencia. Sequenom usa una tecnologfa de captura de hibridacion mas MALDI-TOF (espectrometna de masas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz - tiempo de vuelo) para detectar genotipos de SNP con su sistema MassARRAY(TM). Promega proporciona el sistema de SNP/genotipado READIT(TM) (patente estadounidense n.° 6.159.693). En este procedimiento, se hibridan sondas de ADN o ARN con secuencias de acido nucleico diana. Las sondas que son complementarias a la secuencia diana en cada base se despolimerizan con una mezcla propietaria de enzimas, mientras que las sondas que difieren de la diana en la posicion de interrogacion permanecen intactas. El procedimiento usa qmmica de pirofosforilacion en combinacion con deteccion de luciferasa para proporcionar un sistema de puntuacion de SNP altamente sensible y adaptable. Third Wave Technologies tiene el procedimiento Invader OS(TM) que usa enzimas Cleavaseg propietarias, que reconocen y cortan unicamente la estructura espedfica formada durante el proceso Invader. Invader OS se basa en la amplificacion lineal de la senal generada por el proceso Invader, en vez de en amplificacion exponencial de la diana. El ensayo Invader OS no utiliza PCR en ninguna parte del ensayo. Ademas, existen varios laboratorios de pruebas de ADN forenses y muchos laboratorios de investigacion que usan PCR espedfica para el gen, seguido por digestion con endonucleasas de restriccion y electroforesis en gel (u otra tecnologfa de separacion por tamanos) para detectar polimorfismos de longitud del fragmento de restriccion (RFLP).
En diversos modos de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores, se identifica la presencia o ausencia de los SNP amplificando o no logrando amplificar un producto de amplificacion a partir de la muestra. Las amplificaciones de polinucleotido son normalmente dependientes de la plantilla. Tales amplificaciones se basan generalmente en la existencia de una cadena de plantilla para realizar copias adicionales de la plantilla. Los cebadores son acidos nucleicos cortos que son capaces de cebar la smtesis de un acido nucleico naciente en un proceso dependiente de la plantilla, que se hibrida con la cadena de la plantilla. Normalmente, los cebadores tienen una longitud de desde diez hasta treinta pares de bases, pero pueden emplearse secuencias mas largas. Pueden proporcionarse cebadores en forma de cadenas sencillas y/o cadenas dobles, aunque generalmente se prefiere la forma de cadenas sencillas. A menudo, se disenan pares de cebadores para hibridarse de manera selectiva con regiones diferenciadas de un acido nucleico de plantilla, y se ponen en contacto con el ADN de plantilla en condiciones que permiten hibridacion selectiva. Segun la aplicacion deseada, pueden seleccionarse condiciones de hibridacion de alta rigurosidad que unicamente permitiran la hibridacion con secuencias que son totalmente complementarias a los cebadores. En otros modos de realizacion, puede producirse hibridacion con rigurosidad reducida para permitir la amplificacion de acidos nucleicos que contienen uno o mas apareamientos erroneos con las secuencias de cebador. Una vez hibridado, el complejo de plantilla-cebador se pone en contacto con una o mas enzimas que facilitan la smtesis de acido nucleico dependiente de la plantilla. Se llevan a cabo multiples rondas de amplificacion, tambien denominadas “ciclos”, hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificacion.
Reaccion en cadena de la polimerasa
Estan disponibles varios procesos dependientes de la plantilla para amplificar las secuencias de oligonucleotidos presentes en una muestra de plantilla dada. Uno de los procedimientos de amplificacion mejor conocidos es la reaccion en cadena de la polimerasa. En PCR, se usan pares de cebadores que se hibridan de manera selectiva con acidos nucleicos en condiciones que permiten la hibridacion selectiva. El termino cebador, tal como se usa en el presente documento, abarca cualquier acido nucleico que es capaz de cebar la smtesis de un acido nucleico naciente en un proceso dependiente de la plantilla. Pueden proporcionarse cebadores en forma de cadenas sencillas o cadenas dobles, aunque se prefiere la forma de cadenas sencillas. Se usan cebadores en uno cualquiera de varios procesos dependientes de la plantilla para amplificar las secuencias de genes diana presentes en una muestra de plantilla dada. Uno de los procedimientos de amplificacion mejor conocidos es PCR, que se describe en detalle en las patentes estadounidenses n.os 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, cada una incorporada en el presente documento como referencia. En PCR, se preparan dos secuencias de cebadores que son complementarias a regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia de gen(es) diana. Los cebadores se hibridaran para formar un complejo de acido nucleico:cebador si la secuencia de gen(es) esta presente en una muestra. Se anade un exceso de desoxirribonucleosido trifosfatos a una mezcla de reaccion junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, Taq polimerasa, que facilita la smtesis de acido nucleico dependiente de la plantilla. Si se ha formado el
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complejo de secuencia de gen(es) diana:cebador, la polimerasa hara que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia de gen(es) diana anadiendo nucleotidos. Al elevar y bajar la temperatura de la mezcla de reaccion, los cebadores extendidos se disociaran del/de los gen(es) diana para formar productos de reaccion, los cebadores en exceso se uniran al/a los gen(es) diana y a los productos de reaccion y se repite el proceso. Se llevan a cabo estas multiples rondas de amplificacion, denominadas “ciclos”, hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificacion.
El producto de amplificacion puede digerirse con una enzima de restriccion antes del analisis. En todavfa otros modos de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores se identifica la presencia o ausencia del SNP hibridando la muestra de acido nucleico con un cebador marcado con un resto detectable. En otros modos de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores el resto detectable se detecta en un ensayo enzimatico, radioensayo, inmunoensayo o detectando fluorescencia. En otros modos de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores se marca el cebador con un tinte detectable (por ejemplo, SYBR Green I, YO-PRO-I, naranja de tiazol, Hex, pico green, edans, fluorescema, FAM, o TET). En otros modos de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores los cebadores se ubican sobre un chip. En otros modos de realizacion de cualquiera de los aspectos anteriores los cebadores para la amplificacion son espedficos para dichos SNP.
Otro procedimiento para la amplificacion es la reaccion en cadena de la ligasa (“LCR”). LCR difiere de PCR porque amplifica la molecula de sonda en vez de producir amplicon mediante polimerizacion de nucleotidos. En LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de una secuencia diana, cada par se unira a cadenas complementarias opuestas de la diana de manera que esten en contacto. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se uniran para formar una sola unidad. Al realizar ciclos de temperatura, como en PCR, se disocian unidades ligadas unidas de la diana y entonces sirven como “secuencias diana” para el ligamiento de pares de sondas en exceso. La patente estadounidense n.° 4.883.750, incorporada en el presente documento como referencia, describe un procedimiento similar a LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.
Amplificacion isotermica
Un procedimiento de amplificacion isotermica, en el que se usan ligasas y endonucleasas de restriccion para lograr la amplificacion de moleculas diana que contienen nucleotido 5'-[[alfa]-tio]-trifosfatos en una cadena de un sitio de restriccion tambien puede ser util en la amplificacion de acidos nucleicos en la presente invencion. En un modo de realizacion, se usa el procedimiento de amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP) para tipificar polimorfismos de un solo nucleotido (SNP).
Amplificacion con desplazamiento de la cadena
La amplificacion con desplazamiento de la cadena (SDA) es otro procedimiento de llevar a cabo la amplificacion isotermica de acidos nucleicos que implica multiples rondas de smtesis y desplazamiento de la cadena, es decir, traslacion de mella. Un procedimiento similar, denominado reaccion de reparacion en cadena (RCR), implica hibridar varias sondas a lo largo de una region seleccionada como diana para la amplificacion, seguido por una reaccion de reparacion en la que unicamente dos de las cuatro bases estan presentes. Las otras dos bases pueden anadirse como derivados biotinilados para una facil deteccion.
Amplificacion basada en la transcripcion
Otros procedimientos de amplificacion de acido nucleico incluyen sistemas de amplificacion basada en la transcripcion, incluyendo amplificacion basada en secuencias de acido nucleico. En la amplificacion basada en secuencias de acido nucleico, los acidos nucleicos se preparan para la amplificacion mediante extraccion con fenol/cloroformo convencional, desnaturalizacion termica de una muestra clmica, tratamiento con tampon de lisis y columnas minispin para aislamiento de ADN y ARN o extraccion con cloruro de guanidinio de ARN. Estas tecnicas de amplificacion implican hibridar un cebador que tiene secuencias espedficas para la diana. Tras la polimerizacion, se digieren hforidos de ADN/ARN con ARNasa H mientras que las moleculas de ADN bicatenario se vuelven a someter a desnaturalizacion termica. En cualquier caso, el ADN monocatenario se vuelve totalmente bicatenario mediante la adicion de un segundo cebador espedfico para la diana, seguido por polimerizacion. Entonces se transcriben de manera multiple las moleculas de ADN bicatenario por una polimerasa tal como T7 o SP6. En una reaccion dclica isotermica, los ARN se someten a transcripcion inversa para dar ADN bicatenario, y se transcriben una vez contra una polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, tanto si son truncados o completos, indican secuencias espedficas para la diana.
Pueden usarse otros procedimientos de amplificacion segun la presente invencion. En un modo de realizacion, se usan cebadores “modificados” en una smtesis dependiente de las enzimas y la plantilla, de tipo PCR. Los cebadores pueden modificarse mediante marcaje con un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un resto de deteccion (por ejemplo, enzima). En presencia de una secuencia diana, la sonda se une y se escinde de manera catalftica. Despues de la escision, la secuencia diana se libera intacta para unirse con la sonda en exceso. La escision de la sonda marcada indica la presencia de la secuencia diana. En otro enfoque, un proceso de amplificacion de acido nucleico implica sintetizar de manera dclica ARN monocatenario (“ARNmc”), ADNmc, y ADN bicatenario (ADNbc),
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que puede usarse segun la presente invencion. El ARNmc es una primera plantilla para un primer oligonucleotido de cebador, que se alarga mediante transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de aRn). Entonces se retira el ARN del duplex de ADN:ARN resultante mediante la accion de ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa espedfica para ARN en el duplex con o bien ADN o bien ARN). El ADNmc resultante es una segunda plantilla para un segundo cebador, que tambien incluye las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (mostrada a modo de ejemplo mediante ARN polimerasa T7) en 5' de su homologfa con la plantilla. Este cebador se extiende luego mediante ADN polimerasa (mostrada a modo de ejemplo por el fragmento de “Klenow” grande de ADN polimerasa I de E. coli), dando como resultado una molecula de ADN bicatenario (“ADNbc”), que tiene una secuencia identica a la del ARN original entre los cebadores y que tiene adicionalmente, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor puede usarse mediante la ARN polimerasa adecuada para hacer muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden entonces volver a entrar en el ciclo conduciendo a una amplificacion muy rapida. Con la eleccion adecuada de enzimas, esta amplificacion puede realizarse de manera isotermica sin adicion de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza dclica de este proceso, la secuencia de inicio puede elegirse para estar en forma de o bien ADN o bien ARN.
Procedimientos para la separacion de acidos nucleicos
Puede ser deseable separar productos de acido nucleico de otros materiales, tales como plantilla y cebador en exceso. En un modo de realizacion, los productos de amplificacion se separan mediante electroforesis en gel agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida usando procedimientos convencionales (Sambrook et al., 1989). Los productos de amplificacion separados pueden cortarse y eluirse del gel para manipulacion adicional. Usando geles de agarosa de bajo punto de fusion, puede retirarse la banda separada calentando el gel, seguido por extraccion del acido nucleico. La separacion de acidos nucleicos tambien puede efectuarse mediante tecnicas cromatograficas conocidas en la tecnica. Hay muchos tipos de cromatograffa que pueden usarse en la practica de la presente invencion, incluyendo adsorcion, division, intercambio ionico, hidroxilapatita, tamiz molecular, fase inversa, columna, papel, capa fina y cromatograffa de gases, asf como HPLC. En determinados modos de realizacion, se visualizan los productos de amplificacion. Un procedimiento de visualizacion tfpico implica la tincion de un gel con bromuro de etidio y la visualizacion de bandas bajo luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificacion estan marcados mtegramente con nucleotidos radiomarcados o fluorometricamente marcados, los productos de amplificacion separados pueden exponerse a una pelfcula de rayos X o visualizarse con luz que presente los espectros de excitacion apropiados.
Alternativamente, la presencia de las posiciones polimorficas segun el procedimiento de la invencion puede determinarse mediante hibridacion o falta de hibridacion con una sonda de acido nucleico adecuada espedfica para un acido nucleico polimorfico pero no con el acido nucleico no mutado. Con “hibridar” quiere decirse un par para formar una molecula bicatenaria entre secuencias de polinucleotido complementarias, o partes de las mismas, en diversas condiciones de rigurosidad. Por ejemplo, la concentracion de sal rigurosa sera normalmente menor que aproximadamente NaCl 750 mM y citrato de trisodio 75 mM, preferiblemente menos de aproximadamente NaCl 500 mM y citrato de trisodio 50 mM y mas preferiblemente menos de aproximadamente NaCl 250 mM y citrato de trisodio 25 mM. Puede obtenerse hibridacion de baja rigurosidad en ausencia de disolvente organico, por ejemplo, formamida, mientras que puede obtenerse hibridacion de alta rigurosidad en presencia de al menos aproximadamente el 35% de formamida y mas preferiblemente al menos aproximadamente el 50% de formamida. Las condiciones de temperatura rigurosas incluiran normalmente temperaturas de al menos aproximadamente 30°C, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 37°C, y lo mas preferiblemente de al menos aproximadamente 42°C. Los expertos en la tecnica conocen bien la variacion de parametros adicionales, tales como el tiempo de hibridacion, la concentracion de detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), y la inclusion o exclusion del ADN portador. Se consiguen diversos niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones segun sea necesario. En un modo de realizacion preferido, la hibridacion se producira a 30°C en NaCl 750 mM, citrato de trisodio 75 mM y SDS al 1%. En un modo de realizacion mas preferida, la hibridacion se producira a 37°C en NaCl 500 mM, citrato de trisodio 50 mM, SDS al 1%, formamida al 35% y ADN de esperma de salmon desnaturalizado 100 [mu]g/ml (ADNes). En el modo de realizacion mas preferido, la hibridacion se producira a 42°C en NaCl 250 mM, citrato de trisodio 25 mM, SDS al 1%, formamida al 50% y ADNes 200 [mu]g/ml. Variaciones utiles en estas condiciones resultaran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica.
Para la mayona de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridacion tambien variaran en cuanto a la rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad de lavado pueden definirse mediante la concentracion de sal y mediante la temperatura. Como antes, puede aumentarse la rigurosidad de lavado disminuyendo la concentracion de sal o aumentando la temperatura. Por ejemplo, una concentracion de sal rigurosa para las etapas de lavado sera preferiblemente de menos de aproximadamente NaCl 30 mM y citrato de trisodio 3 mM y lo mas preferiblemente menos de aproximadamente NaCl 15 mM y citrato de trisodio 1,5 mM. Las condiciones de temperatura rigurosas para las etapas de lavado incluiran normalmente una temperatura de al menos aproximadamente 25°C, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 42°C, e incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 68°C. En un modo de realizacion preferido, las etapas de lavado se produciran a 25°C en NaCl 30 mM, citrato de trisodio 3 mM y SDS al 0,1%. En un modo de realizacion mas preferido, las etapas de lavado se produciran a 42°C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1,5 mM y SDS al 0,1%. En un modo de realizacion mas preferido, las etapas de lavado se produciran a 68°C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1,5 mM y SDS al 0,1%. Variaciones adicionales en
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estas condiciones resultaran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica. Los expertos en la tecnica conocen bien tecnicas de hibridacion y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72: 3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.
Las moleculas de acido nucleico utiles para la hibridacion en los procedimientos de la invencion incluyen cualquier molecula de acido nucleico que presenta identidad sustancial de modo que sea capaz de hibridarse espedficamente con los acidos nucleicos diana. Los polinucleotidos que tienen “identidad sustancial” con respecto a una secuencia endogena son normalmente capaces de hibridarse con al menos una cadena de una molecula de acido nucleico bicatenario. Por “sustancialmente identico” quiere decirse un polipeptido o molecula de acido nucleico que presenta al menos el 50% de identidad con respecto a una secuencia de aminoacidos o una secuencia de acido nucleico de referencia. Preferiblemente, una secuencia de este tipo es identica en al menos el 60%, mas preferiblemente el 80%
0 el 85%, y mas preferiblemente el 90%, el 95% o incluso el 99% a nivel de aminoacidos o acido nucleico con respecto a la secuencia usada para comparacion. La identidad de secuencia se mide normalmente usando software de analisis de secuencias (por ejemplo, el paquete de software de analisis de secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLaSt, BESTFIT, GAP o PILEUP/PRETTYBOX). Tal software hace coincidir secuencias identicas o similares asignando grados de homologfa a diversas sustituciones, deleciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras incluyen normalmente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; acido aspartico, acido glutamico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque a modo de ejemplo para determinar el grado de identidad, puede usarse un programa BLAST, indicando una puntuacion de probabilidad de entre e<“3> y e<“100> una secuencia estrechamente relacionada.
Puede usarse un sistema de deteccion para medir la ausencia, presencia y cantidad de hibridacion para todas las secuencias distintas simultaneamente. Preferiblemente, se usa un dispositivo de exploracion para determinar los niveles y patrones de fluorescencia.
Se entiende que la expresion “riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular adverso” muestra una propension a padecer una enfermedad de este tipo mas alta que el promedio en la poblacion.
La expresion “baja respuesta a una terapia cardiovascular” quiere decir que tiene una reaccion reducida a la terapia. Cuando un sujeto tiene un grado de respuesta reducido a la terapia, se requiere una cantidad o numero de agentes terapeuticos aumentado para lograr un efecto terapeutico dado. Se han descrito en detalle anteriormente terapias cardiovasculares adecuadas que van a aplicarse a sujetos seleccionados segun el procedimiento de la presente invencion.
Procedimiento para identificar un sujeto que necesita terapia cardiovascular temprana y/o agresiva o que necesita terapia cardiovascular profilactica
En otro aspecto, la invencion se refiere a un procedimiento (a continuacion en el presente documento el segundo procedimiento de la invencion) para identificar un sujeto que necesita terapia cardiovascular temprana y/o agresiva o que necesita terapia cardiovascular profilactica que comprende las etapas de determinar, en una muestra aislada de dicho sujeto, la identidad del nucleotido en la posicion 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO:
1 a 11, en el que la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 es indicativa de tener una respuesta disminuida a una terapia cardiovascular o de necesitar terapia cardiovascular temprana y agresiva o de necesitar terapia cardiovascular profilactica.
El termino “terapia cardiovascular” se ha definido en detalle en el primer procedimiento de la invencion.
Con “terapia cardiovascular temprana y agresiva” quiere decirse un enfoque de tratamiento que tiene el objetivo de controlar la tension arterial rapidamente, lo que para algunos individuos requerira el uso de multiples farmacos antihipertensores. Si se desea, tal terapia tambien puede incluir control de glucosa, control de metabolismo de los lfpidos, control de perdida de peso y cese del tabaquismo.
Tal como se describio anteriormente, los procedimientos o composiciones espedficos usados para detectar polimorfismos (por ejemplo, SNP, RFLP) no son significativos. La invencion emplea practicamente cualquier procedimiento para detectar una variacion de alelos que se conoce en la tecnica.
La clave en la determinacion del riesgo y la seleccion del tratamiento es la identificacion de un SNP alelico particular y la correlacion de estos SNP de secuencia con la seleccion del tratamiento, el beneficio de la terapia o el riesgo de un acontecimiento cardiovascular adverso. Esta informacion genetica es util de manera aislada, pero puede ser
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incluso mas util cuando se combina con otros factores de importancia clmica para la salud cardiovascular. Tales factores incluyen edad, raza, sexo, mdice de masa corporal, tension arterial, tabaquismo, historia de consumo de alcohol, historia de tabaquismo, historia de ejercicio, dieta, historia familiar de enfermedad cardiovascular, nivel de colesterol de lipoprotemas de baja densidad (LDL) o lipoprotemas de alta densidad (HDL), tension arterial sistolica, tension arterial diastolica, historia de insuficiencia cardfaca, diabetes, insuficiencia renal o hipertrofia ventricular izquierda. Por tanto, en otro aspecto, el primer y el segundo procedimiento de la invencion pueden incluir ademas la determinacion de factores de riesgo clasicos.
Los factores de riesgo clasicos adecuados para su uso en los procedimientos de la presente invencion incluyen, sin limitacion, edad, raza, sexo, mdice de masa corporal, tension arterial, tabaquismo, historia de consumo de alcohol, historia de tabaquismo, historia de ejercicio, dieta, historia familiar de enfermedad cardiovascular, nivel de colesterol de lipoprotemas de baja densidad (LDL) o lipoprotemas de alta densidad (HDL), tension arterial sistolica, tension arterial diastolica, historia de insuficiencia cardfaca, diabetes, insuficiencia renal o hipertrofia ventricular izquierda.
Los conjuntos preferidos de marcadores de riesgo clasicos incluyen los que forman parte de modelos conocidos para predecir el riesgo de CVD tal como el original de Framingham y tambien los derivados del mismo tal como, pero sin limitarse a, los modelos REGICOR, y SCORE, PROCAM o QRISK. Los factores de riesgo clasicos usados en el modelo de Framingham y en los derivados del mismo incluyen edad, colesterol total, colesterol HDL, tension arterial, diabetes y tabaquismo. Los factores de riesgo clasicos usados en el modelo REGICOR incluyen edad, sexo, colesterol, colesterol HDL, tension arterial sistolica, estado diabetico y tabaquismo. Los factores de riesgo clasicos usados en el modelo SCORE incluyen edad, colesterol, tension arterial sistolica y tabaquismo. Los factores de riesgo clasicos usados en el modelo PROCAM incluyen edad, sexo, colesterol LDL, colesterol HDL, trigliceridos, tension arterial sistolica, estado diabetico, tabaquismo, historia familiar de infarto de miocardio. Los factores de riesgo clasicos usados en el modelo QRISK incluyen edad, razon de colesterol total/colesterol HDL, mdice de masa corporal, historia familiar de CVD prematura, tabaquismo, puntuacion de Townsend de la zona de resultados (output area), tension arterial sistolica, tratamiento para la hipertension e interaccion de SBP*tratamiento para la HTN.
La invencion puede emplear metricas (por ejemplo, procedimientos matematicos) para evaluar si existe una relacion entre informacion genetica y riesgo de un desenlace cardiovascular adverso. La precision predictiva de tales procedimientos se mejora generalmente cuando se considera el efecto de uno o mas de otros factores en el pronostico cardiovascular. Puede usarse un procedimiento matematico metrico, por ejemplo, para correlacionar una enfermedad cardiovascular o la probabilidad de propension a desarrollar una enfermedad o trastorno cardiovascular con un SNP de alelo (variante) de una molecula de acido nucleico de interes, solo o en combinacion con otros factores. En un modo de realizacion, se usa una metrica (por ejemplo, un algoritmo o formula matematica) para determinar si existe una correlacion entre la presencia de un sNp de variante de alelo y una enfermedad cardiovascular o un acontecimiento cardiovascular adverso.
Procedimientos de medicina personalizada de la invencion
La firma de SNP identificada por los autores de la presente invencion tambien es adecuada para seleccionar pacientes para aplicar un tratamiento cardiovascular a un paciente en el que dicho paciente se ha seleccionado previamente basandose en la presencia de un factor de riesgo para CVD calculado a partir de dicha firma de SNP. Por tanto, un objeto de la presente memoria descriptiva es proporcionar un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece una enfermedad cardiovascular con una terapia cardiovascular en el que el paciente se selecciona para dicha terapia basandose en la presencia, en una muestra aislada de dicho sujeto, de un polimorfismo en la posicion 27 en las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que dicho polimorfismo en dicha posicion 27 es C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11.
Otro objeto de la presente memoria descriptiva es proporcionar el uso de una terapia cardiovascular para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad cardiovascular en el que el paciente se selecciona para dicha terapia basandose en la presencia, en una muestra aislada de dicho sujeto, de un polimorfismo en la posicion 27 en las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que dicho polimorfismo en dicha posicion 27 es C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11.
Otro objeto de la presente memoria descriptiva es proporcionar una terapia cardiovascular para su uso en el tratamiento de un paciente de una enfermedad cardiovascular en el que el paciente se selecciona para dicha terapia basandose en la presencia, en una muestra aislada de dicho sujeto, de un polimorfismo en la posicion 27 en las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que dicho polimorfismo en dicha posicion 27 es C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11
Las expresiones “terapia cardiovascular” y “enfermedad cardiovascular” se han explicado en detalle previamente. En
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un modo de realizacion preferido, la terapia cardiovascular es una terapia con beta-bloqueante o terapia con verapamilo. En aun otro modo de realizacion, la enfermedad cardiovascular se selecciona del grupo de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardfaca congestiva, aneurisma de aorta o una combinacion de los mismos.
Los agentes que forman la terapia cardiovascular pueden administrate a humanos y otros animales mediante cualquier v^a de administracion adecuada, incluyendo por v^a oral, por via nasal, como, por ejemplo, un aerosol, por via rectal, por via intravaginal, por via parenteral, por via intracisternal y por via topica, como con polvos, unguentos o gotas, incluyendo por via bucal y por via sublingual. Pueden variarse los niveles de dosificacion reales del uno o mas agentes administrados en los procedimientos de la presente invencion de manera que se obtiene una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr una respuesta en un animal. La cantidad eficaz real puede determinarse por un experto en la tecnica usando experimentacion de rutina y puede variar segun el modo de administracion. Ademas, la cantidad eficaz puede variar segun una variedad de factores que incluyen el tamano, edad y sexo del individuo que se esta tratando. Ademas, la gravedad del estado que se esta tratando, asf como la presencia o ausencia de otros componentes con respecto al regimen de tratamiento individual influira en la dosificacion real. La cantidad eficaz o nivel de dosificacion dependera de una variedad de factores que incluyen la actividad del uno o mas agentes particulares empleados, la via de administracion, el tiempo de administracion, la tasa de excrecion de los agentes particulares que se estan empleando, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con los agentes particulares empleados, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historia clmica previa del animal, y factores similares bien conocidos en la tecnica medica.
El procedimiento de medicina personalizada de la memoria descriptiva tambien puede incluir la determinacion de factores de riesgo clasicos tales como edad, raza, sexo, mdice de masa corporal, tension arterial, tabaquismo, nivel de colesterol de lipoprotemas de baja densidad (LDL) o lipoprotemas de alta densidad (HDL), tension arterial sistolica, tension arterial diastolica, historia de insuficiencia cardfaca, diabetes, insuficiencia renal, o hipertrofia ventricular izquierda, historia de consumo de alcohol, historia de tabaquismo, historia de ejercicio, dieta e historia familiar de enfermedad cardiovascular; y correlacionar la presencia del SNP y uno o mas factores de riesgo de enfermedad cardiovascular con la necesidad de una terapia cardiovascular personalizada, posiblemente temprana y agresiva, en la que una correlacion positiva identifica al sujeto como que tiene un riesgo alterado, en particular aumentado, de una enfermedad o trastorno cardiovascular adversos. En un modo de realizacion, el procedimiento implica ademas seleccionar un regimen de tratamiento adecuado. En otro modo de realizacion, el procedimiento implica ademas administrar el regimen de tratamiento al sujeto.
Procedimientos para determinar el riesgo cardiovascular en un sujeto
Otro objeto de la presente invencion es la mejora de los CVRF que se usan en la actualidad introduciendo en la funcion el riesgo conferido por la combinacion particular de marcadores de SNP tal como se expone en la tabla 1 asociados con un riesgo de CVD y/o con un riesgo de complicaciones de CVD que incluyen, pero no se limitan a, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardfaca congestiva, aneurisma de aorta y fallecimiento. Los CVRF que se usan en la actualidad incluyen, pero no se limitan a, la funcion de Framingham original, la funcion Framingham adaptada (tal como, pero sin limitarse a, funcion REGICOR), funcion PROCAM, funcion SCORE y funcion QRISK. La mejora de las funciones de Framingham, PRoCaM, REGICOR y QRISK se muestra como funciones 1a y 1b.
Funcion 1a
Esta ecuacion general puede usarse para calcular el riesgo coronario o cardiovascular usando los factores de riesgo y efectos de los factores de riesgo incluidos y definidos en las funciones de Framingham (la original y/o la adaptada tal como, pero sin limitarse a REGICOR), PROCAM y QRISK:
imagen1
donde,
• prob(acontecimiento|CRF, SNP): probabilidad de presentar un acontecimiento coronario dada una combinacion de factores de riesgo coronario (CRF) y caractensticas geneticas (SNP).
a. acontecimientoi: acontecimiento coronario (infarto de miocardio o angina mortal o no mortal) en un periodo de 10 anos para un individuo “i”.
b. CRFpj: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”. La lista de factores de riesgo coronario incluidos en el modelo se muestra en la tabla A.
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c. SNPjj: numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para una variante genetica espedfica “j” incluida en la ecuacion para un individuo “i”. Las variantes incluidas actualmente en el modelo se muestran en la tabla B.
• S : supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion. Esta supervivencia se adaptara a las tasas regionales o nacionales.
• exp: exponenciacion natural.
p
z fW *CRFpj
p=i
donde
p
E
a. p=1 funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos.
b. Pcrfp logaritmo de la razon de riesgo correspondiente al factor de riesgo coronario clasico “p”. Los valores de p para cada factor de riesgo coronario “p” se muestran en la tabla A.
c. CRFpi: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”.
SPsnp/SNPW j“i J
: donde
j
a. J=t funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas.
b. Psnp; logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la variante genetica “j”. El posible intervalo de valores de p para cada variante genetica “j” se muestra en la tabla B.
c. SNPjj: numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para una variante genetica espedfica “j” incluida en la ecuacion para un individuo “i”.
• CFRp : valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion. Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
• SNPj : numero de copias de alelos de riesgo promedio para la variante genetica “j” en la poblacion.
Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
Tabla A. Lista de factores de riesgo coronario incluidos en el modelo, logaritmo de la razon de riesgo, Pcrfp, para cada factor de riesgo clasico por sexo, intervalo de los valores promedios para el factor de riesgo clasico “p” en la
poblacion, y tasa de supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion (S) (intervalo de posibles valores).
CRFp Pcrfp para hombres Pcrfp para mujeres CFRP
FRAMINGHAM (original o adaptacion)
Edad 0,048 0,338 35-74
Edad2 0 -0,003
Colesterol total (mg/dl)
<160 -0,659 -0,261 0-30
160-<200 0 0 0-30
200-<240 0,177 0,208 0-30
240-<280 0,505 0,244 0-30
>280 0,657 0,53 0-30
Colesterol HDL (mg/dl)
<35 0,497 0,843 0-30
35-<45 0,243 0,378 0-30
45-<50 0 0,198 0-30
50-<60 -0,051 0 0-30
>60 -0,487 -0,430 0-30
Tension arterial
Optima -0,002 -0,534 0-30
Normal 0 0 0-30
Lfmite-Alta 0,283 -0,068 0-30
Hipertension I 0,522 0,263 0-30
Hipertension II 0,619 0,466 0-30
Diabetes 0,428 0,597 0-30
Tabaquismo 0,523 0,292 0-60
PROCAM
Edad 0,103 - 35-74
Colesterol LDL (mg/dl) 0,013 - 100-250
Colesterol HDL (mg/dl) -0,032 - 35-65
Trigliceridos (mg/dl) 0,317 - 100-200
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,010 - 100-160
Historia familiar de MI 0,382 - 1-45
Diabetes 0,399 - 0-30
QRISK
Log(edad/10) 4,474 3,925 35-74
Colesterol total/col. HDL 0,001 0,001 2-10
indice de masa corporal (kg/m2) 0,015 0,022 22-32
Historia familiar de CVD prematura 0,206 0,262 1-45
Tabaquismo 0,425 0,349 0-60
Puntuacion de Townsend de la zona de resultados 0,034 0,017 -3-3
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,005 0,004 100-160
Tratamiento para la hipertension 0,550 0,614 0-40
Interaccion de SBP*tratamiento para la HTN -0,004 -0,007
Supervivencia media S 0,951 (0,01-9,00) 0,978 (0,01-9,00)
Tabla B. Variantes incluidas actualmente en el modelo. Logaritmo de la razon de riesgo (intervalo de posibles
valores), PSNPj, y numero de copias de alelos de riesgo promedio (intervalo de posibles valores), SNPj , para cada
variante genetica.
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SNPj
PSNPj
SNPj
rs1333049
0,30010 (0-0,80) 0,94 (0,3-2,8)
rs599839
0,16551 (0-0,60) 1,54 (0,3-2,8)
rs17465637
0,12222 (0-0,60) 1,44 (0,3-2,8)
rs501120
0,17395 (0-0,60) 1,74 (0,3-2,8)
rs2943634
0,19062 (0-0,60) 1,32 (0,3-2,8)
rs6922269
0,20701 (0-0,60) 0,50 (0,3-2,8)
rs9982601
0,1823 (0-0,60) 0,26 (0,3-2,8)
rs12526453
0,1133 (0-0,60) 1,10 (0,3-2,8)
rs6725887
0,1570 (0-0,60) 0,28 (0,3-2,8)
rs9818870
0,1398 (0-0,60) 0,34 (0,3-2,8)
rs3184504
0,1222 (0-0,60) 0,76 (0,3-2,8)
Otros SNP
0,1200 (0-0,60) 0,3-2,8 (0,3-2,8)
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Esta ecuacion general puede usarse para calcular el riesgo coronario o cardiovascular usando los factores de riesgo y efectos de los factores de riesgo incluidos y definidos en las funciones de Framingham (la original y/o la adaptada tal como, pero sin limitarse a REGICOR), PROCAM y QRISK:
prob(aconteci miento, | CRJFp s, GSQq,) = 1 - S
.exp
I(W/CRF)U ^h(iS%*^Q,iy
■ipeuR, *CRFP-I[iCSQ 'CSQq
p-i <$-■
donde
• prob(acontecimiento|CRF, GSQ): probabilidad de presentar un acontecimiento coronario dada una combinacion de factores de riesgo coronario (CRF) y caractensticas geneticas (GSQ).
a. acontecimientoi: acontecimiento coronario (infarto de miocardio o angina mortal o no mortal) en un periodo de 10 anos para un individuo “i”.
b. CRFpj: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”. La lista de factores de riesgo coronario incluidos en el modelo se muestra en la tabla C.
c. GSQqj: quintil de puntuacion genetica “q” segun la distribucion del numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para las variantes geneticas incluidas en la ecuacion en el nivel de poblacion para un individuo “i”. Las variantes incluidas actualmente en el modelo se muestran en la tabla D.
• S: supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion. Esta supervivencia se adaptara a las tasas regionales o nacionales.
• exp: exponenciacion natural.
imagen2
donde
p
I
a. p_l funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos.
b. Pcrfp logaritmo de la razon de riesgo correspondiente al factor de riesgo coronario clasico “p”. Los valores de p para cada factor de riesgo coronario “p” se muestran en la tabla C.
c. CRFpj: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”.
|pOSQq*GSQv
donde
Q
I
a. R-* funcion sumatoria a lo largo de los Q(5) quintiles.
b. PGSQq: logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a diferentes quintiles de puntuacion genetica (QSQ) “q”. El posible intervalo de valores de p para cada quintil “q” se muestra en la tabla D.
c. GSQqj: quintil de puntuacion genetica “q” segun la distribucion del numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para las variantes geneticas incluidas en la ecuacion en el nivel de poblacion para un individuo “i”.
• CFRp : valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion. Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
• GSQ : valores desde 1 hasta 5 de los diferentes quintiles para el quintil de puntuacion genetica “q” en la poblacion.
Tabla C. Lista de factores de riesgo coronario incluidos en el modelo, logaritmo de la razon de riesgo, Pcrfp, para cada factor de riesgo clasico por sexo, intervalo de los valores promedios para el factor de riesgo clasico “p” en la
poblacion, y tasa de supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion (S) (intervalo de posibles valores).
5
CRFp Pcrfp para hombres Pcrfp para mujeres CFRp
FRAMINGHAM (original o adaptacion)
Edad 0,048 0,338 35-74
Edad2 0 -0,003
Colesterol total (mg/dl)
<160 -0,659 -0,261 0-30
160-<200 0 0 0-30
200-<240 0,177 0,208 0-30
240-<280 0,505 0,244 0-30
>280 0,657 0,53 0-30
Colesterol HDL (mg/dl)
<35 0,497 0,843 0-30
35-<45 0,243 0,378 0-30
45-<50 0 0,198 0-30
50-<60 -0,051 0 0-30
>60 -0,487 -0,430 0-30
Tension arterial
Optima -0,002 -0,534 0-30
Normal 0 0 0-30
L^ite-Alta 0,283 -0,068 0-30
Hipertension I 0,522 0,263 0-30
Hipertension II 0,619 0,466 0-30
Diabetes 0,428 0,597 0-30
Tabaquismo 0,523 0,292 0-60
PROCAM
Edad 0,103 - 35-74
Colesterol LDL (mg/dl) 0,013 - 100-250
Colesterol HDL (mg/dl) -0,032 - 35-65
Trigliceridos (mg/dl) 0,317 - 100-200
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,010 - 100-160
Historia familiar de MI 0,382 - 1-45
Diabetes 0,399 - 0-30
QRISK
Log(edad/10) 4,474 3,925 35-74
Colesterol total/col. HDL 0,001 0,001 2-10
indice de masa corporal (kg/m2) 0,015 0,022 22-32
Historia familiar de CVD prematura 0,206 0,262 1-45
Tabaquismo 0,425 0,349 0-60
Puntuacion de Townsend de la zona de resultados 0,034 0,017 -3-3
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,005 0,004 100-160
Tratamiento para la hipertension 0,550 0,614 0-40
Interaccion de SBP*tratamiento para la HTN -0,004 -0,007
Supervivencia media S 0,951 (0,01-9,00) 0,978 (0,01-9,00)
Tabla D. Definicion de quintiles de puntuacion genetica (GSQq) segun el numero de alelos de riesgo y logaritmo de la razon de riesgo (intervalo de posibles valores), PGSQq, para los quintiles de puntuacion genetica.
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_________GSQq___________________PGSQq
1 (0-6/9 alelos de riesgo) 0
2 (7/10 alelos de riesgo) 0,2 (0-0,8)
3 (9/11 alelos de riesgo) 0,4 (0-1,2)
4 (10/12 alelos de riesgo) 0,6 (0-1,6)
5 (11/12-22 alelos de riesgo)_______________0,8 (0-2,0)
Estos quintiles se construiran segun las frecuencias de alelos de las siguientes variantes geneticas (vease la tabla 1) (rs1333049, rs599839, rs17465637, rs501120, rs2943634, rs6922269, rs9982601, rs12526453, rs6725887, rs9818870, rs3184504).
Funcion 1c
El riesgo coronario o cardiovascular se calculara usando las siguientes ecuaciones que usan la funcion de riesgo SCORE:
Primera etapa: calcular la combination lineal de factores de riesgo
-Pec *( colesterol, - 6) + PSPB* {^BP, -120) +
donde
• colesterol: nivel de colesterol para el individuo "i” en mmol/l.
• Poo/: logaritmo de la razon de riesgo correspondiente al colesterol (tabla E).
• SBP: tension arterial sistolica para el individuo "i” en mmHg.
• Psbp: logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la tension arterial sistolica (tabla E).
• actual: tabaquismo actual para el individuo "i” (1: actual, 0: antiguo/nunca).
• Pfumador'- logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la tension arterial sistolica (tabla E).
• j=1
x
a. j=i funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas.
b. Psnp/ logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la variante genetica "j”. El posible intervalo de valores de p para cada variante genetica "j” se muestra en la tabla B.
c. SNPj.i: numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para una variante genetica espedfica "j” incluida en la ecuacion para un individuo "i”.
d. SNPj : numero de copias de alelos de riesgo promedio para la variante genetica "j” en la poblacion. Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
Segunda etapa: calcular la supervivencia de referenda
So(edad) = exp{-exp(a)*(edad - 20)p}
So(edad + 10) = exp{-exp(a)*(edad - 10)p}
donde
• a, p: parametros de forma y escala de la distribucion de Weibull. Sus valores se muestran en la tabla F (parametros)
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• exp: exponenciacion natural Tercera etapa: calcular la supervivencia a los 10 anos S(edad) = {So(edad)}exp(w)
S(edad + 10) = {S0(edad + 10)}exp(w)
S-i0(edad) = S(edad + 10)/S(edad)
Cuarta etapa: calcular la probabilidad de tener el acontecimiento durante los 10 anos de seguimiento R/esgoio(edad) = 1 - Si0(edad)
Quinta etapa: calcular la probabilidad de tener un acontecimiento cardiovascular durante los 10 anos de seguimiento como la suma de riesgo cardiovascular coronario y no coronario.
R/esgo de CVD10 = [R/esgo de CHD^(edad)] + [R/esgo d/st/nto de CHD^(edad)]
Tabla E
CHD CVD distinta de CHD
Fumador actual, Pfumador
0,71 0,63
Colesterol (mmol/l), p col
0,24 0,02
Tension arterial sistolica (mmHg), Psep
0,018 0,022
CHD: cardiopatfa coronaria CVD: enfermedad cardiovascular Tabla F
CHD CVD distinta de CHD
Pafs
A p a p
Riesgo bajo
Hombres -22,1 4,71 -26,7 5,64
Mujeres -29,8 6,36 -31,0 6,62
Riesgo alto
Hombres -21,0 4,62 -25,7 5,47
Mujeres -28,7 6,23 -30,0 6,42
CHD: cardiopatfa coronaria CVD: enfermedad cardiovascular
De manera sorprendente, la combinacion de marcadores de SNP incluidos en la presente invencion y expuestos en la tabla 1 y que usan las funciones descritas en las funciones 1a a 1c anteriormente, han demostrado obtener una validez mas alta y una validacion superior a la hora de predecir una CVD y/o complicaciones de CVD que los obtenidos usando los factores de riesgo clasicos y usando las funciones que se usan actualmente o funciones publicadas incluyendo informacion genetica. Ademas, tambien se mejoro la reclasificacion.
Medios implementados por ordenador
Otro objeto de la presente memoria descriptiva es la provision de un programa informatico o medios legibles por ordenador que contienen medios para llevar a cabo cualquiera de los procedimientos de la invencion. La implementacion por ordenador puede lograrse usando un programa informatico que proporciona instrucciones en una forma legible por ordenador. El ordenador recogera los datos, analizara los datos de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, y despues proporcionara un resultado del analisis. Por tanto, en otro aspecto, la invencion de la memoria descriptiva se refiere a un programa informatico o un medio legible por ordenador que contiene medios para llevar a cabo un procedimiento de la invencion.
Se pueden usar diferentes tipos de lenguaje informatico para proporcionar instrucciones en una forma legible por ordenador. Por ejemplo, el programa informatico puede escribirse usando lenguajes tales como lenguajes de comando Shell en C, C++, Microsoft C#, Microsoft Visual Basic, FORTRAN, PERL, HTML, JAVA, S, UNIX o LINUX, tales como secuencia de comandos de Shell en C. “R”, un dialecto de lenguaje S, es un ejemplo de un dialecto con atributos que facilitan analisis como los presentados en el presente documento (vease
http://cran.us.r-project.org).
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Pueden usarse diferentes tipos de ordenadores para ejecutar un programa para realizar tecnicas de analisis descritas en el presente documento. Los programas informaticos para realizar tecnicas de analisis descritas en el presente documento pueden ejecutarse en un ordenador que tiene suficiente memoria y capacidad de procesamiento. Un ejemplo de un ordenador adecuado es uno que tenga un procesador basado en Intel Pentium (g) de 200 MHZ o superior, con 64 MB o mas de memoria principal. Se conocen bien en la tecnica sistemas informaticos equivalentes y superiores. Pueden emplearse sistemas operativos convencionales para diferentes tipos de ordenadores. Los ejemplos de sistemas operativos para un procesador basado en Intel Pentium (2) incluyen la familia de Microsoft Windows TM tal como Windows NT, Windows XP y Windows 2000 y LINUX. Los ejemplos de sistemas operativos para ordenadores Apple incluyen los sistemas operativos OSX, UNIX y LINUX. Otros ordenadores y sus sistemas operativos se conocen bien en la tecnica. En diferentes realizaciones, se usa el lenguaje R en un ordenador basado en Intel con procesadores Pentium m a 866 MHz dobles de 4 GB de RAM que ejecutan el sistema operativo LINUX o un ordenador IBM que ejecuta el sistema operativo AIX con un ordenador basado en Intel que ejecuta el sistema operativo Windows NT o XP como terminal de x-windows.
Kits de la invencion
La invencion se refiere ademas a un kit para determinar la presencia de los marcadores polimorficos usados en los procedimientos de la invencion, que comprende en su totalidad o en parte: reactivos de amplificacion para amplificar fragmentos de acido nucleico que contienen marcadores de sNp y reactivos de deteccion para genotipar marcadores de SNP.
Por tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar la identidad de los polimorfismos en las posiciones 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 10 tal como se definio en la tabla 1 anteriormente.
Un experto en la tecnica reconocera que, basandose en los SNP e informacion de secuencia asociada divulgada en el presente documento, pueden desarrollarse reactivos de deteccion y usarse para someter a ensayo cualquier SNP de la presente invencion de manera individual o en combinacion, y tales reactivos de deteccion pueden incorporarse facilmente en uno de los formatos de sistema o kit establecidos que se conocen bien en la tecnica. Los kits pueden comprender ademas un cuestionario de factores clmicos clasicos.
Se pretende que los terminos “kits” y “sistemas”, tal como se usan en el presente documento en el contexto de reactivos de deteccion de SNP, se refieran a objetos o dispositivos tales como combinaciones de multiples reactivos de deteccion de SNP, o uno o mas reactivos de deteccion de SNP en combinacion con uno o mas de otros tipos de elementos o componentes (por ejemplo, otros tipos de reactivos bioqmmicos, envases, presentaciones tales como presentaciones destinadas para venta comercial, sustratos a los que se unen reactivos de deteccion de SNP, componentes de hardware electronicos, etc.). Por consiguiente, la presente invencion proporciona ademas kits y sistemas de deteccion de SNP, que incluyen, pero no se limitan a, conjuntos de cebadores y sondas presentados para la venta (por ejemplo, conjuntos de cebadores/sondas TaqMan), matrices/micromatrices de moleculas de acido nucleico, y perlas que contienen una o mas sondas, cebadores, u otros reactivos de deteccion para detectar uno o mas SNP de la presente invencion. Los kits/sistemas pueden incluir opcionalmente diversos componentes de hardware electronicos; por ejemplo, matrices (“chips de ADN”) y sistemas microflmdicos (sistemas de “nanolaboratorio”) proporcionados por diversos fabricantes que comprenden normalmente componentes de hardware. Otros kits/sistemas (por ejemplo, conjuntos de cebadores/sondas) pueden no incluir componentes de hardware electronicos, sino que pueden estar compuestos por, por ejemplo, uno o mas reactivos de deteccion de SNP (junto con, opcionalmente, otros reactivos bioqmmicos) presentados en uno o mas envases.
En algunos modos de realizacion, un kit de deteccion de SNP contiene normalmente uno o mas reactivos de deteccion y otros componentes (por ejemplo, un tampon, enzimas tales como ADN polimerasas o ligasas, nucleotidos de extension de cadena tales como desoxirribonucleotido trifosfatos, y en el caso de reacciones de secuenciacion de ADN de tipo Sanger, nucleotidos de terminacion de cadena, secuencias de control positivo, secuencias de control negativo, y similares) necesarios para llevar a cabo un ensayo o reaccion, tal como amplificacion y/o deteccion de una molecula de acido nucleico que contiene SNP. Un kit puede contener ademas medios para determinar la cantidad de un acido nucleico diana, y medios para comparar la cantidad con un patron, y puede comprender instrucciones para usar el kit para detectar la molecula de acido nucleico que contiene SNP de interes. En un modo de realizacion de la presente invencion, se proporcionan kits que contienen los reactivos necesarios para llevar a cabo uno o mas ensayos para detectar uno o mas SNP divulgados en el presente documento. En un modo de realizacion preferido de la presente invencion, los kits/sistemas de deteccion de SNP estan en forma de matrices de acido nucleico, o kits compartimentalizados, incluyendo sistemas microflmdicos/de “nanolaboratorio”.
Los kits/sistemas de deteccion de SNP pueden contener, por ejemplo, una o mas sondas, o pares de sondas, que se hibridan con una molecula de acido nucleico en o cerca de cada posicion de SNP diana. Pueden incluirse multiples pares de sondas espedficas para alelos en el kit/sistema para someter a ensayo simultaneamente grandes numeros de SNP, al menos uno de los cuales es un SNP de la presente invencion. En algunos kits/sistemas, las sondas espedficas para alelos se inmovilizan en un sustrato tal como una matriz o perla. Por ejemplo, el mismo sustrato
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puede comprender sondas espedficas para alelos para detectar al menos 1; 10; 100; 1000; 10.000; 100.000; 500.000 (o cualquier otro numero entre medias) o sustancialmente todos los SNP divulgados en el presente documento.
Preferiblemente, el kit comprende varios oligonucleotidos que se hibridaran espedficamente con las secuencias de acido nucleico definidas en la tabla 1 o con secuencias que flanquean dichas regiones. Estos oligonucleotidos permitiran la amplificacion espedfica del polinucleotido en el que va a evaluarse la posicion polimorfica a partir de una plantilla de ADNc o ADN genomico humano, usando pCr. Lo mas preferiblemente, estos oligonucleotidos tambien permitiran el genotipado espedfico de estos sitios polimorficos actuando como cebadores, sondas, o sustratos de ligamiento que permiten la diferenciacion de alelos polimorficos. Alternativamente, estos oligonucleotidos pueden ser adecuados para su uso en procedimientos que no dependen de amplificacion previa del ADN de partida, tales como ensayos Invader y procedimientos de deteccion basados en ligamiento. Preferiblemente, los oligonucleotidos u otros componentes del kit incluiran una etiqueta detectable, por ejemplo, una etiqueta fluorescente, etiqueta de enzima, etiqueta de dispersion de luz, etiqueta de masa, u otra etiqueta. Alternativamente, puede lograrse la deteccion mediante procedimientos de RFLP. Ademas, el kit puede incluir una pluralidad de diferentes secuencias de acido nucleico que permiten la deteccion de secuencias de acido nucleico o productos genicos correspondientes a diferentes polimorfismos tal como se define en la tabla 1. El kit tambien puede contener opcionalmente instrucciones para su uso, que pueden incluir una lista de los polimorfismos que se correlacionan con un tratamiento o tratamientos particulares para una enfermedad o enfermedades y/o una declaracion o lista de las enfermedades para las que un polimorfismo o polimorfismos particulares se correlacionan con la eficacia y/o seguridad de un tratamiento.
Los terminos “matrices”, “micromatrices” y “chips de ADN” se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a una matriz de distintos polinucleotidos fijados a un sustrato, tal como vidrio, plastico, papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, chip, o cualquier otro soporte solido adecuado. Los polinucleotidos pueden sintetizarse directamente sobre el sustrato, o sintetizarse por separado del sustrato y entonces fijarse al sustrato. En un modo de realizacion, la micromatriz se prepara y se usa segun los procedimientos descritos en patente estadounidense n.° 5.837.832, Chee et al, solicitud PCT WO95/11995 (Chee et al.), Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) y Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619), todos los cuales se incorporan en el presente documento en su totalidad por referencia. En otros modos de realizacion, tales matrices se producen mediante los procedimientos descritos por Brown et al., patente estadounidense n.° 5.807.522.
Se revisan matrices de acido nucleico en las siguientes referencias: Zammatteo et al., “New chips for molecular biology and diagnostics”, Biotechnol Annu Rev. 2002; 8:85-101; Sosnowski et al., “Active microelectronic array system for DNA hybridization, genotyping and pharmacogenomic applications”, Psychiatr Genet. diciembre de 2002; 12(4): 181-92; Heller, “DNA microarray technology: devices, systems, and applications”, Annu Rev Biomed Eng. 2002; 4: 129-53. Epub de 22 de marzo de 2002; Kolchinsky et al., “Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips”, Hum Mutat. abril de 2002; 19(4):343-60; y McGall et al., “High-density genechip oligonucleotide probe arrays”, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2002; 77:21-42.
Cualquier numero de sondas, tales como sondas espedficas para alelos, puede implementarse en una matriz, y cada sonda o par de sondas puede hibridarse con una posicion de SNP diferente. En el caso de sondas de polinucleotido, pueden sintetizarse en areas designadas (o sintetizarse por separado y luego fijarse a areas designadas) sobre un sustrato usando un procedimiento qmmico dirigido por luz. Cada chip de ADN puede contener, por ejemplo, de miles a millones de sondas de polinucleotido sinteticas individuales dispuestas en un patron de tipo rejilla y miniaturizadas (por ejemplo, del tamano de una moneda de diez centavos). Preferiblemente, las sondas se unen a un soporte solido en una matriz dirigible, ordenada.
Una micromatriz puede estar compuesta por un gran numero de polinucleotidos monocatenarios unicos fijados a un soporte solido. Los polinucleotidos tfpicos tienen de manera preferible aproximadamente 6-60 nucleotidos de longitud, de manera mas preferible aproximadamente 15-30 nucleotidos de longitud, y de la manera mas preferible aproximadamente 18-25 nucleotidos de longitud. Para determinados tipos de micromatrices u otros kits/sistemas de deteccion, puede ser preferible usar oligonucleotidos que solo tienen aproximadamente 7-20 nucleotidos de longitud. En otros tipos de matrices, tales como matrices usadas junto con tecnologfa de deteccion quimioluminiscente, las longitudes de sonda preferidas pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente 15-80 nucleotidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 50-70 nucleotidos de longitud, mas preferiblemente de aproximadamente 5565 nucleotidos de longitud, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 60 nucleotidos de longitud. La micromatriz o kit de deteccion puede contener polinucleotidos que cubren la secuencia en 5' o 3' conocida del sitio de SNP diana, polinucleotidos secuenciales que cubren la secuencia completa de un gen/transcrito; o polinucleotidos unicos seleccionados de areas particulares a lo largo de la longitud de una secuencia de gen/transcrito diana, particularmente areas que corresponden a uno o mas SNP divulgados en el presente documento. Los polinucleotidos usados en la micromatriz o kit de deteccion pueden ser espedficos para un SNP o varios SNP de interes (por ejemplo, espedficos para un alelo de SNP particular en un sito de SNP diana, o espedficos para alelos de SNP particulares en multiples sitios de SNP diferentes), o espedficos para un gen/transcrito o genes/transcritos polimorficos de interes.
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Los ensayos de hibridacion basados en matrices de polinucleotido se basan en las diferencias de estabilidad de hibridacion de las sondas con respecto a variantes de secuencia diana perfectamente apareadas o con apareamiento erroneo. Para el genotipado de SNP, generalmente es preferible que las condiciones de rigurosidad usadas en ensayos de hibridacion sean lo suficientemente altas como para que puedan diferenciarse moleculas de acido nucleico que difieren entre sf en tan solo una sola posicion de SNP (por ejemplo, se disenan ensayos de hibridacion de SNP tfpicos de manera que solo se produzca hibridacion si esta presente un nucleotido particular en una posicion de SNP, pero no se producira si esta presente un nucleotido alternativo en esa posicion de SNP). Tales condiciones de alta rigurosidad pueden ser preferibles cuando se usan, por ejemplo, matrices de acido nucleico de sondas espedficas para alelos para deteccion de SNP. Tales condiciones de alta rigurosidad se describen en la seccion anterior, y las conocen bien los expertos en la tecnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
En otros modos de realizacion, las matrices se usan junto con tecnologfa de deteccion quimioluminiscente. Las siguientes patentes y solicitudes de patente, todas las cuales se incorporan en el presente documento como referencia, proporcionan informacion adicional perteneciente a la deteccion quimioluminiscente: las solicitudes de patente estadounidense con n.os de serie 10/620.332 y 10/620.333 describen enfoques quimioluminiscentes para la deteccion de micromatrices; las patentes estadounidenses n.os 6.124.478, 6.107.024, 5994073, 5981768, 5871938, 5843681, 5800999, y 5773628 describen procedimientos y composiciones de dioxetano para realizar deteccion quimioluminiscente; y la solicitud estadounidense publicada US2002/0110828 divulga procedimientos y composiciones para controles de micromatriz.
En un modo de realizacion de la invencion, una matriz de acido nucleico puede comprender una matriz de sondas de aproximadamente 15-25 nucleotidos de longitud. En realizaciones adicionales, una matriz de acido nucleico puede comprender cualquier numero de sondas, en las que al menos una sonda es capaz de detectar uno o mas SNP divulgados en las tablas 1-10 y/o al menos una sonda comprende un fragmento de una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las divulgadas en el presente documento, y secuencias complementarias a las mismas, comprendiendo dicho fragmento al menos aproximadamente 8 nucleotidos consecutivos, preferiblemente 10, 12, 15, 16, 18, 20, mas preferiblemente 22, 25, 30, 40, 47, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, o mas nucleotidos consecutivos (o cualquier otro numero entre medias) y que contiene (o que es complementario a) un SNP. En algunos modos de realizacion, el nucleotido complementario al sito de SNP esta a menos de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleotido(s) del centro de la sonda, mas preferiblemente en el centro de dicha sonda.
Puede sintetizarse una sonda de polinucleotido sobre la superficie del sustrato usando un procedimiento de acoplamiento qmmico y un aparato de aplicacion de chorro de tinta, tal como se describe en la solicitud PCT WO95/251116 (Baldeschweiler et al.) que se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia. En otro aspecto, puede usarse una matriz “enrejada” analoga a una inmunotransferencia por puntos (o ranuras) para disponer y unir oligonucleotidos o fragmentos de ADNc a la superficie de un sustrato usando un sistema a vado, procedimientos de union qrnmica, mecanica, por UV o termica. Una matriz, tal como las descritas anteriormente, puede producirse manualmente o usando dispositivos disponibles (aparato de inmunotransferencia por ranuras o inmunotransferencia por puntos), materiales (cualquier soporte solido adecuado) y maquinas (incluyendo instrumentos roboticos), y pueden contener 8, 24, 96, 384, 1536, 6144 o mas polinucleotidos, o cualquier otro numero que se preste al uso eficaz de instrumentos disponibles comercialmente.
Los usos de los kits segun la invencion implican normalmente incubar una muestra de prueba de acidos nucleicos con una matriz que comprende una o mas sondas que corresponden a al menos una posicion de SNP de la presente invencion, y someter a ensayo para determinar la union de un acido nucleico de la muestra de prueba con una o mas de las sondas. Las condiciones para incubar un reactivo de deteccion de SNP (o un kit/sistema que emplea uno o mas de tales reactivos de deteccion de SNP) con una muestra de prueba vanan. Las condiciones de incubacion dependen de factores tales como el formato empleado en el ensayo, los procedimientos de deteccion empleados, y el tipo y la naturaleza de los reactivos de deteccion usados en el ensayo. Un experto en la tecnica reconocera que uno cualquiera de los formatos de ensayo de matriz, amplificacion e hibridacion comunmente disponibles puede adaptarse facilmente para detectar los SNP divulgados en el presente documento.
Un kit/sistema de deteccion de SNP de la presente invencion puede incluir componentes que se usan para preparar acidos nucleicos a partir de una muestra de prueba para la amplificacion y/o deteccion posterior de una molecula de acido nucleico que contiene SNP. Tales componentes de preparacion de la muestra pueden usarse para producir extractos de acido nucleico, incluyendo ADN y/o ARN, a partir de cualquier lfquido corporal. En un modo de realizacion preferido de la invencion, el lfquido corporal es sangre, saliva o hisopos bucales. Las muestras de prueba usadas en los procedimientos descritos anteriormente variaran basandose en factores tales como el formato de ensayo, la naturaleza del procedimiento de deteccion, y los tejidos, celulas o extractos espedficos usados como muestra de prueba que va a someterse a ensayo. En la tecnica se conocen bien procedimientos de preparacion de acidos nucleicos y pueden adaptarse facilmente para obtener una muestra que sea compatible con el sistema utilizado.
En aun otra forma del kit, ademas de reactivos para la preparacion de acidos nucleicos y reactivos para la deteccion de uno de los SNP de esta invencion, el kit puede incluir un cuestionario que pregunta sobre factores clmicos no
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
geneticos tales como los que se sabe que estan asociados con CVD tales como edad, raza, sexo, mdice de masa corporal, tension arterial, tabaquismo, historia de consumo de alcohol, historia de tabaquismo, historia de ejercicio, dieta, historia familiar de enfermedad cardiovascular, colesterol total, niveles de colesterol de lipoprotemas de baja densidad (LDL) o lipoprotemas de alta densidad (HDL), tension arterial sistolica, tension arterial diastolica, historia de insuficiencia cardfaca, diabetes, insuficiencia renal, o hipertrofia ventricular izquierda.
Otra forma de kit contemplado por la presente invencion es un kit compartimentalizado. Un kit compartimentalizado incluye cualquier kit en el que los reactivos estan contenidos en envases separados. Tales envases incluyen, por ejemplo, pequenos envases de vidrio, envases de plastico, tiras de plastico, vidrio o papel, o material para matriz tal como sflice. Tales envases permiten que el usuario transfiera de manera eficaz reactivos de un compartimento a otro compartimento de manera que las muestras de prueba y los reactivos no se contaminan de manera cruzada, o de un envase a otro recipiente no incluido en el kit, y los agentes o disoluciones de cada envase pueden anadirse de manera cuantitativa de un compartimento a otro o a otro recipiente. Tales envases pueden incluir, por ejemplo, uno o mas envases que aceptaran la muestra de prueba, uno o mas envases que contienen al menos una sonda u otro reactivo de deteccion de SNP para detectar uno o mas SNP de la presente invencion, uno o mas envases que contienen reactivos de lavado (tales como solucion salina tamponada con fosfato, tampones Tris, etc.), y uno o mas envases que contienen los reactivos usados para revelar la presencia de la sonda unida u otros reactivos de deteccion de SNP. El kit puede comprender ademas opcionalmente compartimentos y/o reactivos para, por ejemplo, amplificacion de acido nucleico u otras reacciones enzimaticas tales como reacciones de extension del cebador, hibridacion, ligamiento, electroforesis (preferiblemente electroforesis capilar), espectrometna de masas y/o deteccion fluorescente inducida por laser. El kit tambien puede incluir instrucciones para usar el kit. Los kits compartimentalizados a modo de ejemplo incluyen dispositivos microflmdicos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Weigl et al., “Lab-on-a-chip for drug development”, Adv Drug Deliv Rev. febrero de 2003. 24; 55(3):349-77). En tales dispositivos microflmdicos, los envases pueden denominarse, por ejemplo, “compartimentos”, “camaras” o “canales” microflmdicos.
Los dispositivos microflmdicos, que tambien pueden denominarse sistemas de “nanolaboratorio”, sistemas microelectromecanicos biomedicos (bioMEM), o sistemas integrados multicomponentes, son kits/sistemas a modo de ejemplo de la presente invencion para analizar SNP. Tales sistemas miniaturizan y compartimentalizan procesos tales como reacciones de hibridacion de sonda/diana, amplificacion de acido nucleico y electroforesis capilar en un solo dispositivo funcional. Tales dispositivos microflmdicos usan normalmente reactivos de deteccion en al menos un aspecto del sistema, y tales reactivos de deteccion pueden usarse para detectar uno o mas SNP de la presente invencion. Se divulga un ejemplo de un sistema microflmdico en la patente estadounidense n.° 5.589.136, que describe la integracion de amplificacion por PCR y electroforesis capilar en chips. Los sistemas microflmdicos a modo de ejemplo comprenden un patron de microcanales disenado sobre una oblea de vidrio, silicio, cuarzo o plastico incluida en un microchip. Los movimientos de las muestras pueden controlarse mediante fuerzas electricas, electroosmoticas o hidrostaticas aplicadas a lo largo de diferentes zonas del microchip para crear bombas y valvulas microscopicas funcionales sin piezas moviles. Puede usarse la variacion de voltaje medio para controlar el flujo de lfquido en las intersecciones entre los microcanales micromecanizados y para cambiar la velocidad de flujo de lfquido para bombear a lo largo de diferentes secciones del microchip. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.153.073, Dubrow et al, y la patente estadounidense n.° 6.156.181, Parce et al.
Para genotipar SNP, un sistema microflmdico puede integrar, por ejemplo, amplificacion de acido nucleico, extension de cebador, electroforesis capilar, y un procedimiento de deteccion tal como deteccion de fluorescencia inducia por laser.
Procedimientos y kits para la deteccion de la predisposicion a desarrollar los factores de riesgo clasicos de CVD
Otro objeto de la presente invencion es una combinacion particular de marcadores de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP) asociados con la predisposicion a desarrollar los factores de riesgo clasicos de CVD y/o los factores de riesgo clasicos de complicaciones de CVD que incluyen, pero no se limitan a, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardfaca congestiva, aneurisma de aorta y fallecimiento. Los factores de riesgo clasicos de CVD y/o complicaciones de CVD incluyen, pero no se limitan a, diabetes mellitus, altos niveles de colesterol total, altos niveles de colesterol LDL, bajos niveles de colesterol HDL, altos niveles de trigliceridos, obesidad, adiccion al tabaco, hipertension y trombosis.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP incluida en la presente invencion tal como se expone en la tabla 2 ha demostrado obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de diabetes mellitus que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual expuesto en la tabla 2 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 2.
SNP
GEN Alelo de riesgo
rs4506565
TCF7L2 T
rs7903146
TCF7L2 T
rs12255372
TCF7L2 T
rs4132670
TCF7L2 T
rs734312
WFS1 A
rs10811661
CDKN2B C
rs7756992
CDKAL1 G
rs1111875
HHEX A
rs7923837
HHEX A
rs9465871
CDKAL1 C
rs4430796
TCF2 G
rs564398
CDKN2B G
rs5219
KCNJ11 C
rs13266634
SLC30A8 T
rs5215
KCNJ11 C
rs1801282
PPARG G
rs7501939
TCF2 C
rs1801208
WSF1 G
rs2383208
CDKN2B G
Tabla 2
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto 5 tiene un riesgo alterado de tener diabetes mellitus que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 2, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar diabetes mellitus.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP expuesta en la tabla 3 ha demostrado 10 obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de altos niveles de colesterol total que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual expuesto en la tabla 3 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 3.
SNP
GEN Alelo de riesgo
rs12664989
ESR1 C
rs1801177
LPL A
rs268
LPL G
rs328
LPL G
15 Tabla 3
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de tener altos niveles de colesterol total que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 3, en el que la presencia de los 20 alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar altos niveles de colesterol total.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP expuesta en la tabla 4 ha demostrado obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de altos niveles de colesterol LDL que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual 25 expuesto en la tabla 4 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 4.
SNP
GEN Alelo de riesgo
rs4420638
APOC1 G
rs287479
chr13 A
rs11591147
PCSK9 T
rs599839
PSRC1 G
rs780094
GCKR T
rs12664989
ESR1 C
rs9322331
ESR1 T
rs7412
APOE C
rs693
APOB T
Tabla 4
30 Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de tener altos niveles de colesterol LDL que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 4, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar altos niveles de colesterol LDL.
35 De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP expuesta en la tabla 5 ha demostrado
5
10
15
20
25
30
obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de bajos niveles de colesterol HDL que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual expuesto en la tabla 5 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 5.
SNP
GEN Alelo de riesgo
rs2066715
ABCA1 T
rs2066718
ABC1 A
rs2230808
ABCA1 A
rs505717
ZNF568 G
rs56937
Chr19 G
rs3734678
PDSS2 C
rs5882
CETP G
rs1800775
CETP C
rs708272
CETP T
rs7412
APOE T
rs328
LPL G
rs7007797
LPL G
rs2230806
ABCA1 A
Tabla 5
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de tener altos niveles de colesterol HDL que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 5, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar altos niveles de colesterol HDL.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP expuesta en la tabla 6 ha demostrado obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de altos niveles de trigliceridos que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual expuesto en la tabla 6 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 6.
SNP
GEN Alelo de riesgo
rs7007075
Chr8 T
rs9322331
ESR1 T
rs780094
GCKR G
rs7007797
LPL G
rs4420638
APOC1 G
rs662799
APOA5 G
rs6589566
APOA5 G
rs651821
APOA5 C
rs2072560
APOA5 T
rs693
APOB T
rs1800775
CETP C
rs328
LPL G
rs1801177
LPL A
rs268
LPL G
rs320
LPL G
rs2230806
ABCA1 A
rs7412
APOE C
Tabla 6
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de tener altos niveles de trigliceridos que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 6, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar altos niveles de trigliceridos.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP expuesta en la tabla 7 ha demostrado obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de obesidad que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual expuesto en la tabla 7 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 7.
SNP__________GEN_______Alelo de riesgo
rs10510422 PPARG C
rs10510423 PPARG G
5
10
15
20
25
rs299629
PPARG G
rs2938392
PPARG T
rs709157
PPARG A
rs963163
PPARG C
rs6602024
PFKP A
rs2229616
MC4R A
rs52820871
MC4R C
rs1106683
intergenico A
rs7566605
INSIG2 C
rs4471028
GDAP1 G
rs1121980
FTO T
rs1421085
FTO C
rs7193144
FTO C
rs8050136
FTO A
rs8050136
FTO A
rs9930506
FTO G
rs9939609
FTO A
rs9940128
FTO A
rs10484922
ESR1 T
rs3778099
ESR1 C
rs3853250
ESR1 C
rs6902771
ESR1 T
rs851982
ESR1 C
rs9322361
ESR1 G
rs1044498
ENPP1 C
rs10490628
CCDC93 A
rs3771942
CCDC93 C
rs9284719
CCDC93 T
rs4994
ADRB3 C
rs1042464
ADIPOQ T
Tabla 7
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de desarrollar obesidad que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 7, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar obesidad.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP expuesta en la tabla 8 ha demostrado obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de adiccion al tabaco que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier sNp individual expuesto en la tabla 8 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 8.
SNP
GEN Alelo de riesgo
rs4142041
CTNNA3 G
rs6474413
CHRNB3 C
rs1044397
CHRNA4 A
Tabla 8
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de desarrollar adiccion al tabaco que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 8, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar adiccion al tabaco.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP expuesta en la tabla 9 ha demostrado obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de hipertension que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual expuesto en la tabla 9 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 9.
SNP
GEN Alelo de riesgo
rs11739136
KCNMB1 T
rs4762
AGT T
rs699
AGT C
rs4343
ACE G
rs4961
ADD1 T
5
10
15
20
25
30
rs2484294
ADRB1 G
rs1042711
ADRB2 C
rs17778257
ADRB2 T
rs1042714
ADRB2 G
rs1800888
ADRB2 T
rs1801704
ADRB2 C
rs2933249
AGTR1 T
rs275652
AGTR1 C
rs387967
AGTR1 C
rs5186
AGTR1 C
rs11091046
AGTR2 A
rs1799983
NOS3 T
rs1800779
NOS3 G
rs1800780
NOS3 G
rs1800782
NOS3 T
rs1800783
NOS3 A
rs2070744
NOS3 C
rs867225
NOS3 A
Tabla 9
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de desarrollar hipertension que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 9, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar hipertension.
De manera sorprendente, la combinacion espedfica de marcadores de SNP tal como se expone en la tabla 10 ha demostrado obtener una capacidad mas alta para predecir el desarrollo de trombosis que la obtenida usando los procedimientos que se usan actualmente y/o mediante la consideracion de cualquier SNP individual expuesto en la tabla 10 y/o la consideracion de un subconjunto de los SNP expuestos en la tabla 10.
SNP
inclos GEN Alelo de riesgo
rs234706
1 CBS A
rs6025
1 F5 A
rs6064
1 F7 A
rs2070011
1 FGA A
rs1800789
1 FGB A
rs1764391
1 GJA4 T
rs1062535
0 ITGA2 A
rs1126643
1 ITGA2 T
rs5918
1 ITGB3 C
rs1801131
1 MTHFR C
rs1801133
1 MTHFR T
rs11178
1 SERPINE1 C
rs2227631
1 SERPINE1 G
rs2228262
1 THBS1 G
rs1866389
1 THBS4 G
rs7007329
1 PLAT C
rs917859
1 VWF A
Tabla 10
Por tanto, en otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para la determinacion de si un sujeto tiene un riesgo alterado de desarrollar trombosis que comprende determinar en una muestra biologica de dicho sujeto la presencia de los polimorfismos mostrados en la tabla 10, en el que la presencia de los alelos de riesgo es indicativa de un riesgo aumentado de desarrollar trombosis.
Otro objeto de la presente memoria descriptiva es un procedimiento para estimar la predisposicion a desarrollar los factores de riesgo clasicos de CVD y/o los factores de riesgo clasicos de complicaciones de CVD que incluyen, pero no se limitan a, diabetes mellitus, altos niveles de colesterol total, altos niveles de colesterol LDL, bajos niveles de colesterol HDL, altos niveles de trigliceridos, obesidad, adiccion al tabaco, hipertension y trombosis, que comprende la deteccion de la presencia de marcadores de SNP expuestos en las tablas 2 a 10.
Para calcular el riesgo genetico, se contara el numero de alelos de riesgo que porta un individuo en las diferentes variantes geneticas asociadas con cada ruta metabolica o factor de riesgo. Cuanto mas alto sea el numero de alelos de riesgo presentes, mas alto sera el riesgo de desarrollar cada factor de riesgo.

Claims (6)

10
2.
15
3.
20
25 4.
30
5. 35
6.
40
7.
45
50
55
REIVINDICACIONES
Procedimiento de determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular o de determinar la respuesta a una terapia cardiovascular en un sujeto que comprende las etapas de determinar en una muestra aislada de dicho sujeto la presencia de polimorfismos en las posiciones 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 es indicativa de un riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular o de una baja respuesta a una terapia cardiovascular.
Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la enfermedad cardiovascular se selecciona del grupo de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardfaca congestiva, aneurisma de aorta o una combinacion de los mismos.
Procedimiento para identificar un sujeto que necesita terapia cardiovascular temprana y/o agresiva o que necesita terapia cardiovascular profilactica que comprende las etapas de determinar en una muestra aislada de dicho sujeto la presencia de polimorfismos en las posiciones 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 es indicativa de tener una respuesta disminuida a una terapia cardiovascular o de necesitar terapia cardiovascular temprana y agresiva o necesitar tratamiento cardiovascular profilactico.
Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, que comprende ademas determinar uno o mas de un factor de riesgo de una enfermedad o trastorno cardiovascular seleccionado del grupo que consiste en edad, raza, sexo, mdice de masa corporal, tension arterial, tabaquismo, nivel de colesterol de lipoprotemas de baja densidad (LDL) o lipoprotemas de alta densidad (hDl), tension arterial sistolica, tension arterial diastolica, historia de insuficiencia cardfaca, diabetes, insuficiencia renal, hipertrofia ventricular izquierda, historia de consumo de alcohol, historia de tabaquismo, historia de ejercicio, dieta e historia familiar de enfermedad o trastorno cardiovascular.
Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra es una muestra de tejido bucal, raspado, o lavado o una muestra de lfquido biologico, preferiblemente saliva, orina o sangre.
Procedimiento segun una cualquiera o mas de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la presencia o ausencia del polinucleotido se identifica amplificando o no logrando amplificar un producto de amplificacion a partir de la muestra, en el que el producto de amplificacion se digiere preferiblemente con una enzima de restriccion antes del analisis y/o en el que el SNP se identifica hibridando la muestra de acido nucleico con una etiqueta de cebador que es un resto detectable.
Procedimiento de determinar la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina mortal o no mortal en un periodo de 10 anos, en el que el procedimiento comprende una etapa de determinar la presencia de 1 a P factores de riesgo clasicos y de 1 a J polimorfismos en las posiciones 27 en las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que dichos polimorfismos en dichas posiciones 27 se seleccionan del grupo de C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 usando la formula:
imagen1
donde,
- S es la supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion,
P
z
- p*1 es la funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos,
- Pcrfp es el logaritmo de la razon de riesgo correspondiente al factor de riesgo coronario clasico “p” tal como se muestra en la tabla A,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
- CRFpi es el valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”,
J
z
- es la funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas,
- PsNPj es el logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la variante genetica “j” tal como se muestra en la tabla B,
- SNPji es el numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para una variante genetica espedfica “j” incluida en la ecuacion para un individuo “i”,
- CFRp es el valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion,
- SNPj es el numero de copias de alelos de riesgo promedio para la variante genetica “j” en la poblacion.
Procedimiento de determinar la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina mortal o no mortal en un periodo de 10 anos, en el que el procedimiento comprende una etapa de determinar la presencia de 1 a P factores de riesgo clasicos diferentes y de 1 a Q variantes geneticas diferentes en el que dichas variantes geneticas son polimorfismos en las posiciones 27 en las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que dichos polimorfismos en dicha posicion 27 se seleccionan del grupo de C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 usando la formula:
donde
- S es la supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion, esta supervivencia se adaptara a las tasas regionales o nacionales,
p
I
- p=1 es la funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos,
- Pcrfp es el logaritmo de la razon de riesgo correspondiente al factor de riesgo coronario clasico “p” tal como se muestra en la tabla C,
imagen2
- CRFpi es el valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”,
imagen3
es la funcion sumatoria a lo largo de los Q(5) quintiles,
- PGSQq es el logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a diferentes quintiles de puntuacion genetica (GSQ) “q” tal como se muestra en la tabla D,
- GSQq i es el quintil de puntuacion genetica “q” segun la distribucion del numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para las variantes geneticas incluidas en la ecuacion en el nivel de poblacion para un individuo “i” construido segun las frecuencias de alelos de las variantes geneticas,
- CFRp es el valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion,
- GSQ son los valores de desde 1 hasta 5 de los diferentes quintiles para el quintil de puntuacion genetica “q” en la poblacion.
Procedimiento de determinar la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mortal o no mortal en un periodo de 10 anos, en el que el procedimiento comprende una etapa de determinar la presencia de 1 a P factores de riesgo clasicos diferentes y 1 a Q variantes geneticas diferentes en el que dichas variantes geneticas son polimorfismos en las posiciones 27 en las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 a 11, en el que dichos polimorfismos en dicha posicion 27 se seleccionan del grupo de C en SEQ ID NO: 1, A en SEQ ID NO: 2, C en SEQ ID NO: 3, T en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, A en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, C en SEQ ID NO: 8, C en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10 y T en SEQ ID NO: 11 usando las etapas de:
(i) calcular la combination lineal de factores de riesgo Wi usando la funcion
", = /»„, *(colesterol,-6) + psn*(SBP,-l20)+actual, + £
/-I
donde
• co/esterol: nivel de colesterol para el individuo “i” en mmol/l,
• Poo/: logaritmo de la razon de riesgo correspondiente al colesterol (tabla E),
• SBP: tension arterial sistolica para el individuo “i” en mmHg,
• Psbp: logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la tension arterial sistolica (tabla E),
• actual: tabaquismo actual para el individuo “i” (1: actual, 0: antiguo/nunca),
• Pfumador'- logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la tension arterial sistolica (tabla E),
• 7=1
J
z
a. j=1 funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas,
b. Psnp/ logaritmo de la razon de riesgo correspondiente a la variante genetica “j”, el posible intervalo de valores de p para cada variante genetica “j” se muestra en la tabla B,
c. SNPjj: numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para una variante genetica espedfica “j” incluida en la ecuacion para un individuo “i”,
d. SNPj : numero de copias de alelos de riesgo promedio para la variante genetica “j” en la poblacion, este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional,
(ii) calcular la supervivencia de referencia So para una edad dada usando la funcion So(edad) = exp{-exp(a)*(edad - 20)p}
So(edad + 10) = exp{-exp(a)*(edad - 10)p} donde
• a, p: parametros de forma y escala de la distribution de Weibull, sus valores se muestran en la tabla F (parametros)
• exp: exponentiation natural
(iii) calcular la supervivencia a los 10 anos S-\0(edad) usando la funcion S(edad) = {So(edad)}exp(w)
S(edad + 10) = {So(edad + 10)}exp(w)
S10(edad) = S(edad + 10)/S(edad)
5
10
15
20
25
30
(iv) calcular la probabilidad de tener el acontecimiento durante los 10 anos de seguimiento Riesgoio(edad) usando la funcion,
R/esgoio(edad) = 1 - Svo(edad)
y
(v) calcular la probabilidad de tener un acontecimiento cardiovascular durante los 10 anos de seguimiento, Riesgo de CVDlO, como la suma de riesgo cardiovascular coronario y no coronario usando la funcion
Riesgo de CVDvo = [Riesgo de CHDvo(edad)] + [Riesgo distinto de CHDvo(edad)].
Procedimiento segun las reivindicaciones 7 a 9, en el que se usa una pluralidad de factores de riesgo clasicos “p”, seleccionandose dicha pluralidad del grupo de:
- sexo, edad, colesterol total, colesterol HDL, tension arterial, diabetes y tabaquismo,
- edad, colesterol LDL, colesterol HDL, trigliceridos, tension arterial sistolica, historia familiar de infarto de miocardio y diabetes,
- sexo, Log(edad/10), colesterol total/colesterol HDL, mdice de masa corporal, historia familiar de CVD prematura, tabaquismo, puntuacion de Townsend de la zona de resultados, tension arterial sistolica, tratamiento para la hipertension e interaccion de SBP*tratamiento para la HTN.
Kit que comprende reactivos para detectar la identidad de los nucleotidos en la posicion 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11.
Kit segun la reivindicacion 11, que comprende uno o mas pares de cebadores espedficos para la amplificacion de una region que comprende al menos la posicion 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 11.
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