ES2588155T3 - Anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 específico entre especies - Google Patents

Abstract

Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a un epítopo de la cadena de CD3ε (épsilon) de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8, y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión que se une al antígeno de membrana específico de próstata (PSMA).

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 específico entre especies

La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un

primer dominio de unión que se une específicamente a un epítopo de cadena de CD3 épsilon de ser humano y

5 Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de

aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en SEQ ID NO. 2, 4, 6 y 8, y un segundo dominio de unión que

se une a antígeno de membrana específico de próstata (PSMA). La invención también proporciona ácidos nucleicos

que codifican para dicha molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla así como vectores y células

huésped y un procedimiento para su producción. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas 10 que comprenden dicha molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla y a usos médicos de dicha molécula

de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla.

El reconocimiento de células T está mediado por receptores de células T (TcR) alfa, beta y gamma con distribución

clonotípica que interaccionan con las moléculas cargadas con péptidos del péptido MHC (pMHC) (Davis y Bjorkman,

Nature 334 (1988), 395-402). Las cadenas específicas de antígeno del TcR no presentan dominios de señalización 15 sino que se acoplan al aparato de señalización multisubunidades conservado CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967-979,

Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7-27). El mecanismo por el cual el

ligamiento al TcR se comunica directamente al aparato de señalización sigue siendo una cuestión fundamental en la

biología de las células T (Alarcon, loc. cit.; Davis, Cell 110 (2002), 285-287). Parece evidente que las respuestas de

células T sostenidas implican la participación de un correceptor, la oligomerización del TcR y una disposición de 20 orden superior de complejos de TcR-pMHC en la sinapsis inmunológica (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11

(2001), R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224). Sin embargo, la señalización de TcR muy temprana se

produce en ausencia de estos acontecimientos y puede implicar un cambio conformacional inducido por ligando en

CD3 épsilon (Alarcon, loc. cit., Davis (2002), loc. cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179, Gil, Cell 109

(2002), 901-912). Las subunidades épsilon, gamma, delta y zeta del complejo de señalización se asocian entre sí 25 para formar un heterodímero de CD3 épsilon-gamma, un heterodímero de CD3 épsilon-delta y un homodímero de

CD3 zeta-zeta (Call, loc. cit.).

Diversos estudios han revelado que las moléculas CD3 son importantes para la expresión correcta en la superficie

celular del TcR alfa beta y el desarrollo normal de las células T (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536,

Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447). La resolución de la 30 estructura de los fragmentos del ectodominio del heterodímero de CD3 épsilon gamma de ratón mostró que ambas

subunidades épsilon gamma son dominios Ig de tipo C2 que interactúan entre sí para formar una configuración

yuxtapuesta inusual del dímero (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Aunque parece que el tallo rico en cisteína

desempeña un papel importante en el control de la dimerización de CD3 (Su, loc. cit., Borroto, J. Biol. Chem. 273

(1998), 12807-12816), la interacción por medio de los dominios extracelulares de CD3 épsilon y CD3 gamma es 35 suficiente para el ensamblaje de estas proteínas con el TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92,

Manolios y Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). Aunque todavía es controvertido, lo más probable es que la

estequiometría dominante del TcR comprenda un TcR alfa beta, un heterodímero de CD3 épsilon gamma, un

heterodímero de CD3 épsilon delta y un homodímero de CD3 zeta zeta (Call, loc. cit.). Dado el papel clave del

heterodímero de CD3 épsilon gamma humana en la respuesta inmunitaria, se ha dilucidado recientemente la 40 estructura cristalina de este complejo unido al anticuerpo terapéutico OKT3 (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675

7680).

Varias estrategias terapéuticas modulan la inmunidad de células T dirigiéndose a la señalización de TcR, en

particular, los anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD3 humana que se usan ampliamente en el ámbito clínico en

regímenes inmunosupresores. El Acm de ratón específico frente a CD3 OKT3 fue el primer Acm autorizado para su 45 uso en seres humanos (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) y se usa ampliamente en el ámbito clínico como agente

inmunosupresor en trasplantes (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430, Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3

(2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), diabetes de tipo 1 (Chatenoud (2003), loc. cit) y

psoriasis (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913). Además, los Acm anti-CD3 pueden inducir señalización de

células T parcial y anergia clonal (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). En la bibliografía se ha descrito el 50 OKT3 como un potente mitógeno de células T (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) y como un potente

destructor de células T (Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). El OKT3 presenta estas dos actividades de

manera dependiente del tiempo; después de la activación temprana de células T que conduce a la liberación de

citocinas, tras la administración adicional, el OKT3 bloquea posteriormente todas las funciones de células T

conocidas. Se debe a este bloqueo posterior de la función de células T por lo que el OKT3 ha encontrado una 55 aplicación tan amplia como inmunosupresor en regímenes terapéuticos para la reducción o incluso la eliminación del

rechazo tisular de aloinjertos.

Lo más probable es que el OKT3 revierta el rechazo tisular de aloinjertos mediante el bloqueo de la función de todas

las células T, que desempeñan un papel principal en el rechazo agudo. El OKT3 reacciona con y bloquea la función

del complejo CD3 de la membrana de células T humanas, que se asocia con la estructura de reconocimiento de 60 antígenos de las células T (TCR) y es esencial para la transducción de señales. A qué subunidad del TCR/CD3 se

une el OKT3 ha sido objeto de múltiples estudios. Aunque algunas pruebas han apuntado a una especificidad de OKT3 por la subunidad épsilon del complejo de TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). Pruebas adicionales han mostrado que la unión de OKT3 al complejo de TCR/CD3 requiere que estén presentes otras subunidades de este complejo (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

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Otros anticuerpos bien conocidos específicos para la molécula CD3 se enumeran en Tunnacliffe, Int. Immunol. 1

5 (1989), 546-50. Tal como se indicó anteriormente, tales anticuerpos específicos frente a CD3 pueden inducir diversas respuestas de células T tales como producción de linfocinas (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337), proliferación (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) e inducción de células T supresoras (Kunicka, en “Lymphocyte Typing II” 1 (1986), 223). Esto es, en función de las condiciones experimentales, el anticuerpo monoclonal específico frente a CD3 puede inhibir o inducir citotoxicidad (Leewenberg,

10 J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

Aunque se ha informado de que muchos de los anticuerpos frente a CD3 descritos en la técnica reconocen la

15 subunidad CD3 épsilon del complejo CD3, la mayoría de ellos se unen en realidad a epítopos conformacionales y, por tanto, sólo reconocen CD3 épsilon en el contexto nativo del TCR. Los epítopos conformacionales se caracterizan por la presencia de dos o más residuos de aminoácido diferenciados que están separados en la secuencia primaria, pero se juntan sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Los epítopos conformacionales unidos a anticuerpos

20 frente a CD3 épsilon descritos en la técnica pueden separarse en dos grupos. En el grupo principal, dichos epítopos están formados por dos subunidades CD3, por ejemplo, por la cadena CD3 épsilon y la cadena CD3 gamma o CD3 delta. Por ejemplo, se ha descubierto en varios estudios que los anticuerpos monoclonales frente a CD3 épsilon de uso más extendido, OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 y Leu-4, no se unían a células transfectadas únicamente con la cadena CD3-épsilon. Sin embargo, estos anticuerpos tiñeron células doblemente transfectadas con una combinación

25 de CD3 épsilon más CD3 gamma o CD3 delta (Tunnacliffe, loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). En un segundo grupo más pequeño, el epítopo conformacional se forma dentro de la propia subunidad CD3 épsilon. Por ejemplo, un miembro de este grupo es el Acm APA 1/1 que se ha obtenido contra CD3 épsilon desnaturalizada (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Tomados en conjunto, la mayoría de los anticuerpos frente a CD3 épsilon descritos en la técnica

30 reconocen epítopos conformacionales situados en dos o más subunidades de CD3. De este modo, los residuos de aminoácido diferenciados que forman la estructura tridimensional de estos epítopos pueden estar situados o bien en la propia subunidad CD3 épsilon o bien en la subunidad CD3 épsilon y otras subunidades de CD3 tales como CD3 gamma o CD3 delta.

Otro problema con respecto a los anticuerpos frente a CD3 es que se ha descubierto que muchos anticuerpos frente

35 a CD3 son específicos de especie. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3, como sigue siendo cierto en general con cualquier otro anticuerpo monoclonal, funcionan por medio de reconocimiento altamente específico de sus moléculas diana. Sólo reconocen un único sitio, o epítopo, en su molécula de CD3 diana. Por ejemplo, uno de los anticuerpos monoclonales de uso más extendido y mejor caracterizados específicos para el complejo CD3 es OKT-3. Este anticuerpo reacciona con CD3 de chimpancé pero no con el homólogo de CD3 de otros primates, tales como

40 macacos, o con CD3 de perro (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). De manera similar, los documentos WO2005/118635 o WO2007/033230 describen anticuerpos frente a CD3 épsilon monoclonales humanos que reaccionan con CD3 épsilon humana pero no con CD3 épsilon de ratón, rata, conejo o primates distintos de chimpancé tales como mono Rhesus, macaco cinomolgo o babuino. El anticuerpo monoclonal anti-CD3 UCHT-1 también reacciona con CD3 de chimpancé pero no con CD3 de macacos (datos propios). Por otro lado,

45 también existen ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de macaco, pero no sus homólogos humanos. Un ejemplo de este grupo es el anticuerpo monoclonal FN-18 dirigido a CD3 de macacos (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). Es interesante el hecho de que se ha descubierto que los linfocitos periféricos de aproximadamente el 12 % de los macacos cinomolgos carecen de reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 de mono Rhesus (FN-18) debido a un polimorfismo del antígeno CD3 en macacos. Uda et al.

50 describieron una sustitución de dos aminoácidos en la secuencia de CD3 de macacos cinomolgos, que no reaccionan con anticuerpos FN-18, en comparación con CD3 derivados de animales que reaccionan con anticuerpos FN-18 (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34-7). El documento WO 2007/042261 describe anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra CD3 y un antígeno de superficie celular que muestra especificidad entre especies.

55 La capacidad discriminatoria, es decir, la especificidad de especie, aunque inherente no sólo de los anticuerpos monoclonales frente a CD3 (y fragmentos de los mismos), sino también de los anticuerpos monoclonales en general, es un impedimento significativo para su desarrollo como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades en seres humanos. Para obtener la autorización para su comercialización, cualquier nueva medicación candidata debe pasar por pruebas rigurosas. Estas pruebas pueden subdividirse en las fases preclínica y clínica. Mientras que

60 esta última, dividida además en las fases clínicas I, II y III generalmente conocidas, se realiza en pacientes humanos, la primera se realiza en animales. El objetivo de las pruebas preclínicas es demostrar que el candidato fármaco a tiene la actividad deseada y, lo más importante, es seguro. Sólo cuando se han establecido la seguridad en animales y la posible eficacia del candidato a fármaco en pruebas preclínicas, la autoridad reguladora

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correspondiente aprobará este fármaco candidato para pruebas clínicas en seres humanos. Puede probarse la seguridad de los candidatos a fármaco en animales de las tres maneras siguientes: (i) en una especie relevante, es decir, una especie en la que los candidatos a fármaco puedan reconocer los antígenos ortólogos, (ii) en un animal transgénico que contenga los antígenos humanos y (iii) mediante el uso de un sustituto del candidato a fármaco que 5 pueda unirse a los antígenos ortólogos presentes en el animal. Las limitaciones de los animales transgénicos son que esta tecnología se limita normalmente a los roedores. Entre los roedores y el ser humano existen diferencias significativas en la fisiología y no pueden extrapolarse fácilmente los resultados de seguridad a seres humanos. Las limitaciones de un sustituto para el candidato a fármaco son la diferente composición de materia en comparación con el candidato a fármaco real y que, a menudo, los animales usados son roedores con la limitación comentada anteriormente. Por lo tanto, los datos preclínicos generados en roedores tienen una potencia predictiva limitada con respecto al candidato a fármaco. El enfoque de elección para las pruebas de seguridad es el uso de una especie relevante, preferiblemente un primate inferior. La limitación ahora de los anticuerpos monoclonales adecuados para intervención terapéutica en el ser humano descrita en la técnica es que las especies relevantes son primates superiores, en particular chimpancés. Los chimpancés se consideran una especie en peligro de extinción y, debido a 15 su naturaleza parecida a los seres humanos, se ha prohibido el uso de tales animales para pruebas de seguridad de fármacos en Europa y está altamente restringido en otros lugares. También se ha usado satisfactoriamente CD3 como diana para anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla para redirigir células T citotóxicas a células patológicas, dando como resultado la reducción de las células enfermas del organismo respectivo (documentos WO 99/54440; WO 04/106380). Por ejemplo, Bargou et al. (Science 321 (2008):974-7) han informado recientemente sobre la actividad clínica de un constructo de anticuerpo biespecífico CD19xCD3 denominado blinatumomab, que tiene el potencial de comprometer todas las células T citotóxicas en pacientes humanos para la lisis de células cancerosas. Dosis de tan sólo 0,005 miligramos por metro cuadrado al día en pacientes con linfoma no Hodgkin condujeron a una eliminación de células diana en la sangre. Se observaron por primera vez regresiones tumorales parciales y completas a un nivel de dosis de 0,015 miligramos, y los siete pacientes tratados a un nivel de dosis de

25 0,06 miligramos experimentaron regresión tumoral. Blinatumomab también condujo al aclaramiento de células tumorales de la médula ósea y el hígado. Aunque este estudio estableció la prueba de concepto clínica para la potencia terapéutica del formato de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla en el tratamiento de cáncer derivado de células sanguíneas, todavía existe la necesidad de conceptos satisfactorios para terapias de otros tipos de cáncer.

En 2008, se diagnosticará a una estimación de 186.320 hombres con cáncer de próstata en los Estados Unidos y aproximadamente 28.660 hombres morirán debido a la enfermedad. El informe más reciente disponible sobre la mortalidad del cáncer muestra que, en 2004, la tasa de mortalidad global debida a cáncer de próstata entre los hombres estadounidenses era de 25 por cada 100.000. A finales de los años 1980, la adopción extendida de la prueba del antígeno específico de próstata (PSA) representó una mejora importante en el manejo del cáncer de 35 próstata. Esta prueba mide la cantidad de proteína PSA en la sangre, que a menudo está elevada en pacientes con cáncer de próstata. En 1986, la Administración de Alimentos y Fármacos de los EE.UU. aprobó el uso de la prueba de PSA para monitorizar pacientes con cáncer de próstata y, en 1994, aprobó adicionalmente su uso como prueba de examen para esta enfermedad. Debido a la implementación extendida de las pruebas de PSA en los Estados Unidos, aproximadamente el 90 por ciento de todos los cánceres de próstata se diagnostican actualmente en una fase temprana, y, por consiguiente, los hombres sobreviven más tiempo después del diagnóstico. Sin embargo, será necesario que los resultados de dos ensayos clínicos en marcha, el ensayo de examen de próstata, pulmón, colorrectal y ovarios (PLCO) patrocinado por NCI y el estudio europeo para el examen del cáncer de próstata (ERSPC) determinen si el examen de PSA realmente salva vidas. Los ensayos clínicos en marcha a lo largo de los últimos 25 años han investigado la eficacia de compuestos naturales y sintéticos en la prevención del cáncer de 45 próstata. Por ejemplo, el ensayo de prevención del cáncer de próstata (PCPT), que incluyó casi 19.000 hombres sanos, encontró que finasterida, un fármaco aprobado para el tratamiento de hiperplasia benigna de la próstata (BPH), que es un agrandamiento no canceroso de la próstata, reducía el riesgo de desarrollar cáncer de próstata en el 25 por ciento. Otro ensayo, el ensayo de prevención del cáncer con selenio y vitamina E (SELECT), está estudiando a más de 35.000 hombres para determinar si complementos diarios de selenio y vitamina E pueden reducir la incidencia de cáncer de próstata en hombres sanos. Otros ensayos de prevención del cáncer de próstata están evaluando actualmente el potencial de protección de multivitaminas, vitaminas C y D, soja, té verde y licopeno, que es un compuesto natural que se encuentra en los tomates. En un estudio, notificado en 2005, se mostró que genes específicos estaban fusionados en del 60 al 80 por ciento de los tumores de próstata analizados. Este estudio representa la primera observación de reorganizaciones génicas no aleatorias en cáncer de próstata. Esta alteración 55 genética puede usarse eventualmente como biomarcador para ayudar en el diagnóstico y, posiblemente, el tratamiento de esta enfermedad. Otros estudios han mostrado que variaciones genéticas en una región específica del cromosoma 8 pueden aumentar el riesgo de que un hombre desarrolle cáncer de próstata. Estas variaciones genéticas representan aproximadamente el 25 por ciento de los cánceres de próstata que se producen en hombres de raza blanca. Son las primeras variantes genéticas validadas que aumentan el riesgo de desarrollar cáncer de próstata y pueden ayudar a los científicos a entender mejor las causas genéticas de esta enfermedad. También hay una investigación en marcha que examina cómo pueden usarse proteínas que circulan en la sangre de un paciente para mejorar el diagnóstico de cáncer de próstata y otros cánceres. En 2005, los científicos identificaron un grupo de proteínas específicas que produce el sistema inmunitario de un paciente en respuesta a tumores de próstata. Estas proteínas, un tipo de autoanticuerpo, pudieron detectar la presencia de células de cáncer de próstata en muestras de 65 sangre con una exactitud de más del 90 por ciento. Cuando se usan en combinación con PSA, estas y otras

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proteínas sanguíneas pueden usarse eventualmente para reducir el número de resultados falsos positivos obtenidos con las pruebas de PSA solas y, por tanto, reducir el gran número de biopsias de próstata innecesarias que se realizan cada año debido a resultados de la prueba de PSA falsos positivos.

Aparte de PSA, se han identificado varios otros marcadores para el cáncer de próstata, incluyendo por ejemplo el

5 antígeno epitelial con seis dominios transmembrana de la próstata (STEAP) (Hubert et al., PNAS 96 (1999), 1452314528), el antígeno de células madre de próstata (PSCA) (Reiter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735-1740, 1998) y el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA; PSM) (Israeli et al., Cancer Res. 53 (1993). PSMA se definió originariamente mediante el anticuerpo monoclonal (AcM) 7E11 derivado de la inmunización con una preparación de membrana parcialmente purificada de la línea celular de adenocarcinoma de próstata en ganglio

10 linfático (LNCaP) (Horoszewicz et al., Anticancer Res. 7 (1987), 927-35). Se clonó un fragmento de ADNc de 2,65 kb que codificaba para la proteína de PSMA y posteriormente se mapeó en el cromosoma 11p11.2 (Israeli et al., loc. cit.; O’Keefe et al., Biochem. Biophys. Acta 1443 (1998), 113-127). El análisis inicial de PSMA demostró una expresión generalizada dentro de las células del epitelio secretor de la próstata. La tinción inmunohistoquímica demostró que la expresión de PSMA era de ausente a moderada expresada en tejidos hiperplásicos y benignos,

15 mientras que los tejidos malignos se tiñeron con la mayor intensidad (Horoszewicz et al., loc. cit.). Investigaciones posteriores han recapitulado estos resultados y han demostrado la expresión de PSMA como característica universal en prácticamente todos los tejidos de próstata examinados hasta la fecha. Estos informes demuestran además que la expresión de PSMA aumenta de manera vertiginosa proporcional a la agresividad del tumor (Burger et al., lnt. J. Cancer 100 (2002), 228-237; Chang et al., Cancer Res. 59 (1999), 3192-98; Chang et al., Urology 57 (2001), 1179

20 83), Kawakami y Nakayama, Cancer Res. 57 (1997), 2321-24; Liu et al., Cancer Res. 57 (1997), 3629-34; Lopes et al., Cancer Res. 50 (1990), 6423-29; Silver et al., Clin. Cancer Res. 9 (2003), 6357-62; Sweat et al., Urology 52 (1998), 637-40; Troyer et al., lnt. J. Cancer 62 (1995), 552-558; Wright et al., Urology 48 (1996), 326-334). De manera acorde a la correlación entre la expresión de PSMA y el estadio tumoral, se asocian niveles aumentados de PSMA con cáncer de próstata independiente de andrógenos (PCa). El análisis de muestras de tejido de pacientes

25 con cáncer de próstata han demostrado niveles elevados de PSMA después de castración física o terapia de privación androgénica. A diferencia de la expresión del antígeno específico de próstata, que está regulado por disminución después de ablación androgénica, la expresión de PSMA aumenta significativamente en muestras de tumor tanto primario como metastásico (Kawakami et al., Wright et al., loc. cit.). De manera acorde a la expresión elevada en tumores independientes de andrógenos, se sabe también que la transcripción de PSMA está regulada

30 por disminución por esteroides, y la administración de testosterona media en una drástica reducción de los niveles de ARNm y proteína de PSMA (Israeli et al., Cancer Res. 54 (1994), 1807-11; Wright et al., loc. cit.). PSMA se expresa también altamente en tumores de próstata secundarios y enfermedad metastásica oculta. El análisis inmunohistoquímico ha revelado una expresión relativamente intensa y homogénea de PSMA dentro de lesiones metastásicas localizadas en los ganglios linfáticos, hueso, tejido blando y pulmones en comparación con tejidos de

35 próstata benignos (Chang et al. (2001), loc. cit.; Murphy et al., Cancer 78 (1996), 809-818; Sweat et al., loc. cit.). Algunos informes han indicado también la expresión limitada de PSMA en tejidos extraprostáticos, incluyendo un subconjunto de túbulos proximales renales, algunas células de la membrana intestinal de borde en cepillo, y células poco comunes en las criptas colónicas (Chang et al. (1999), Horoszewicz et al., Israeli et al. (1994), Lopes et al., Troyer et al., loc. cit.). Sin embargo, los niveles de PSMA en estos tejidos son generalmente de dos a tres órdenes

40 de magnitud menores que los observados en la próstata (Sokoloff et al., Prostate 43 (2000), 150-157). PSMA se expresa también en la neovasculatura asociada a tumor de la mayor parte de cánceres sólidos examinados pero está ausente en el endotelio vascular normal (Chang et al. (1999), Liu et al., Silver et al., loc. cit.). Aunque se desconoce la importancia de la expresión de PSMA dentro de la vasculatura, la especificidad por endotelio asociado a tumor hace que PSMA sea una diana potencial para el tratamiento de muchas formas de tumor maligno.

45 El documento WO 2006/089230 proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen específicamente a PSMA con alta afinidad y su uso para tratar el cáncer. El documento WO 2006/125481 da a conocer diacuerpos aislados dirigidos a PSMA y su uso en el tratamiento del cáncer. Bühler et al. (2007), Cancer Immunology, Immunotherapy, Springer Berlin, vol. 57, n.º 1, págs. 43-52, se refiere a un diacuerpo biespecífico dirigido contra PSMA y CD3, induciendo lisis mediada por células T de células de cáncer de próstata.

50 Aunque se ha hecho un gran esfuerzo por identificar dianas novedosas para enfoques terapéuticos para el cáncer, el cáncer es aún una de las enfermedades diagnosticadas con mayor frecuencia. A la luz de esto, sigue habiendo la necesidad de tratamientos eficaces para el cáncer.

La presente invención proporciona una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a un epítopo de la cadena de CD3 (épsilon) de ser humano y

55 Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en SEQ ID NO. 2, 4, 6 y 8 y comprende al menos las secuencias de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu; y un segundo dominio de unión que se une a antígeno de membrana específico de próstata (PSMA).

Aunque los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla captadores de células T descritos en la técnica tienen gran

60 potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades malignas, la mayor parte de estas moléculas biespecíficas están limitadas porque son específicas de la especie y reconocen sólo antígeno humano, y, debido a similitud genética, probablemente el homólogo de chimpancé. La ventaja de la presente invención es la provisión de un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un dominio de unión que muestra especificidad entre especies con los homólogos de ser humano y primate distinto de chimpancé de la cadena de CD3 épsilon.

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En la presente invención, se identificó de forma sorprendente un fragmento polipeptídico N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido del dominio extracelular de la CD3 épsilon que, en contraste con todos los demás epítopos de CD3 5 épsilon conocidos descritos en la técnica, mantiene su integridad estructural tridimensional cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3 (y opcionalmente se fusiona con una secuencia de aminoácidos heteróloga tal como EpCAM o una parte Fc de inmunoglobulina). Por tanto, la presente invención prevé una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a un epítopo de un fragmento de polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal del dominio extracelular de 10 CD3 épsilon (CD3 épsilon que se saca, por ejemplo, de su entorno nativo y/o se compone de (presentado en la superficie de) una célula T de cadena de CD3 épsilon de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en SEQ ID NO. 2, 4, 6 y 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu; y un segundo dominio de unión que se une al antígeno de membrana específico de próstata (PSMA). Se mencionan 15 primates distintos de chimpancé preferidos en otra parte en el presente documento. Al menos uno de (o una selección de los mismos o todos) el/los primate(s) seleccionado(s) de Callithrix jacchus; Saguinus oedipus, Saimiri sciureus, y Macaca fascicularis (o bien SEQ ID XY o bien YZ o ambas), se da(n) a conocer en el presente documento. Se da a conocer también Macaca mulatta, también conocido como mono Rhesus como otro primate preferido. Por tanto, se prevé que anticuerpos de la invención se unan (que puedan unirse a) al epítopo 20 independiente del contexto de un fragmento de polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal del dominio extracelular de CD3 épsilon de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus, Saimiri sciureus y Macaca fascicularis (o bien SEQ ID XY o bien YZ o ambas), y opcionalmente también a Macaca mulatta. Una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión tal como se define en el presente documento puede obtenerse (es obtenible mediante) o puede fabricarse según el protocolo expuesto en los

25 ejemplos adjuntos (en particular el ejemplo 2). Para ello, se prevé (a) inmunizar ratones con un fragmento de polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal del dominio extracelular de CD3 épsilon de ser humano y/o Saimiri sciureus; (b) generar una biblioteca de scFv de anticuerpos murinos inmunitarios; (c) identificar elementos de unión específicos de CD3 épsilon sometiendo a prueba la capacidad para unirse a al menos las SEQ ID NO. 2, 4, 6 y 8.

30 La independencia del contexto del epítopo CD3 proporcionado en el presente documento corresponde a los primeros 27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon o fragmentos funcionales de este tramo de 27 aminoácidos. La expresión “independiente del contexto,” tal como se usa en el presente documento en relación con el epítopo CD3 significa que la unión de las moléculas de unión/moléculas de anticuerpo de la invención descritas en el presente documento no conduce a un cambio o una modificación de la conformación, secuencia o estructura que

35 rodea al determinante antigénico o epítopo. En cambio, el epítopo CD3 reconocido por una molécula de unión a CD3 convencional (por ejemplo tal como se da a conocer en los documentos WO 99/54440 o WO 04/106380) se localiza en la cadena de CD3 épsilon de manera C-terminal con respecto a los 1-27 aminoácidos N-terminales del epítopo independiente del contexto, donde sólo adopta la conformación correcta si se incluye dentro de la parte restante de la cadena épsilon y se mantiene en la posición estérica adecuada mediante heterodimerización de la cadena épsilon

40 con cualquiera de la cadena gamma o delta de CD3. Dominios de unión de anticuerpos anti-CD3 como parte de moléculas de cadena sencilla biespecíficas tal como se proporcionan en el presente documento y se generan (y dirigen) contra un epítopo CD3 independiente del contexto prevén una mejora clínica sorprendente con respecto a la redistribución de células T y, por tanto, un perfil de seguridad más favorable. Sin querer restringirse por la teoría, puesto que el epítopo CD3 es independiente del contexto, formando un subdominio autosuficiente autónomo sin

45 mucha influencia sobre la parte restante del complejo CD3, el dominio de unión a CD3 de las moléculas de cadena sencilla biespecíficas proporcionadas en el presente documento induce menos cambios alostéricos en la conformación de CD3 que las moléculas de unión a CD3 convencionales (como las moléculas proporcionadas en los documentos WO 99/54440 o WO 04/106380), que reconocen epítopos CD3 dependientes del contexto.

La independencia del contexto del epítopo CD3 que se reconoce por el dominio de unión a CD3 de los anticuerpos

50 biespecíficos de cadena sencilla de la invención, aislados respectivamente mediante el método de la invención, se asocia con menos o sin redistribución de células T (la redistribución de células T equivale a un episodio inicial de disminución y posterior recuperación de los recuentos absolutos de células T) durante la fase inicial de tratamiento con dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla. Esto da como resultado un mejor perfil de seguridad de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla de la invención en comparación con moléculas de unión a CD3

55 convencionales conocidas en la técnica, que reconocen epítopos CD3 dependientes del contexto. Particularmente, dado que la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 es un factor de riesgo importante para acontecimientos adversos, como acontecimientos adversos del SNC, los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla de la invención al reconocer un epítopo CD3 independiente del contexto en vez de uno dependiente del contexto, tiene una ventaja de seguridad sustancial con respecto a las

60 moléculas de unión a CD3 conocidas en la técnica. Los pacientes con tales acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales padecen habitualmente confusión y desorientación, en algunos casos también incontinencia urinaria. La confusión es un cambio en el estado mental en el que el paciente no puede pensar con su nivel de claridad

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habitual. El paciente tiene habitualmente dificultades para concentrarse y el pensamiento no sólo es difuso y poco claro sino que a menudo se ralentiza significativamente. Los pacientes con acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden padecer también pérdida de memoria. Con frecuencia, la confusión conduce a la pérdida de 5 la capacidad para reconocer personas, lugares, la hora o la fecha. Son comunes sensaciones de desorientación en la confusión, y se ve alterada la capacidad para tomar decisiones. Los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden comprender además habla farfullante y/o dificultades para encontrar las palabras. Este trastorno puede afectar tanto la expresión como la comprensión del lenguaje así como de la lectura y la escritura. Además de la incontinencia urinaria, también pueden acompañar vértigo y mareo a los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales en algunos pacientes. La confusión es un cambio en el estado mental en el que el paciente no puede pensar con su nivel de claridad habitual. El paciente tiene habitualmente dificultades para concentrarse y el pensamiento no sólo es difuso y poco claro sino que a menudo se ralentiza significativamente. Los pacientes con

15 acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden padecer también pérdida de memoria. Con frecuencia, la confusión conduce a la pérdida de la capacidad para reconocer personas, lugares, la hora o la fecha. Son comunes sensaciones de desorientación en la confusión, y se ve alterada la capacidad para tomar decisiones. Los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden comprender además habla farfullante y/o dificultades para encontrar las palabras. Este trastorno puede afectar tanto la expresión como la comprensión del lenguaje así como de la lectura y la escritura. Además de la incontinencia urinaria, también pueden acompañar vértigo y mareo a los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales en algunos pacientes.

25 El mantenimiento de la estructura tridimensional dentro del fragmento de polipéptido de 27 aminoácidos N-terminal de CD3 épsilon mencionado puede usarse para la generación de dominios de unión, preferiblemente humanos, que pueden unirse al fragmento de polipéptido de CD3 épsilon N-terminal in vitro y al complejo CD3 nativo (subunidad de CD3 épsilon del mismo) en células T in vivo con la misma afinidad de unión. Estos datos indican fuertemente que el fragmento N-terminal tal como se describe en el presente documento forma una conformación terciaria, que es similar a su estructura que existe normalmente in vivo. Se realizó una prueba muy sensible de la importancia de la integridad estructural de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido N-terminal de CD3 épsilon. Los aminoácidos individuales de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido N-terminal de CD3 épsilon se cambiaron a alanina (barrido de alanina) para someter a prueba la sensibilidad de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido N-terminal de CD3 épsilon para perturbaciones menores. Los dominios de unión específica

35 a CD3 como parte del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención se usaron para someter a prueba la unión de los mutantes de alanina de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido Nterminal de CD3 épsilon (véase el ejemplo 5 adjunto). Los intercambios individuales de los primeros cinco residuos de aminoácido en el mismo extremo N-terminal del fragmento y dos de los aminoácidos en las posiciones 23 y 25 de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido N-terminal de CD3 épsilon fueron críticos para la unión de las moléculas de anticuerpo. La sustitución de residuos de aminoácido en la región de las posiciones 1-5 que comprende los residuos Q (glutamina en la posición 1), D (ácido aspártico en la posición 2), G (glicina en la posición 3), N (asparagina en la posición 4) y E (ácido glutámico en la posición 5) por alanina suprimieron la unión del, anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano de la invención a dicho fragmento. Aunque, para al menos parte del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano

45 de la invención, dos residuos de aminoácido en el extremo C-terminal del fragmento T mencionado (treonina en la posición 23) e I (isoleucina en la posición 25) redujeron la energía de unión al anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano de la invención.

Inesperadamente, se ha encontrado que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, preferiblemente humano, así aislado de la invención no sólo reconoce el fragmento N-terminal humano de CD3 épsilon, sino también los fragmentos homólogos correspondientes de CD3 épsilon de diversos primates, incluyendo monos del nuevo mundo (tití, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) y monos del viejo mundo (Macaca fascicularis, también conocido como macaco cinomolgo; o Macaca mulatta, también conocido como mono Rhesus). Por tanto, se detectó especificidad por múltiples primates del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención. Los siguientes análisis de secuencia confirmaron que los seres humanos y los primates comparten un tramo de

55 secuencia altamente homóloga en el extremo N-terminal del dominio extracelular de CD3 épsilon.

Se representan las secuencias de aminoácidos de fragmentos N-terminales de CD3 épsilon en SEQ ID No. 2 (ser humano), SEQ ID No. 4 (Callithrix jacchus); SEQ ID No. 6 (Saguinus oedipus); SEQ ID No. 8 (Saimiri sciureus); SEQ ID No. 1047 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTILTC o SEQ ID No. 1048 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT (Macaca fascicularis, también conocido como macaco cinomolgo), y SEQ ID No. 1049 QDGNEEMGSITQTPYHVSISGTTVILT (Macaca mulatta, también conocido como mono Rhesus).

El segundo dominio de unión del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención se une al antígeno de membrana específico de próstata (PSMA). Preferiblemente, el segundo dominio de unión del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la presente invención se une al PSMA humano o a un PSMA de

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primate distinto de chimpancé; más preferido se une al PSMA humano y a un PSMA de primate distinto de chimpancé y por tanto es específico entre especies; incluso más preferido al PSMA humano y al PSMA de macaco (y por tanto es específico entre especies también). Particularmente preferido, el PSMA de macaco es el PSMA de macaco cinomolgo y/o el PSMA de mono Rhesus. Sin embargo, no se excluye del alcance de la presente invención, que el segundo dominio de unión también pueda unirse a homólogos de PSMA de otras especies, tales como al homólogo de PSMA en roedores.

El cáncer de próstata es el segundo mayor cáncer en hombres. Para 2008, se estima que a 186.320 hombres se les acabará de diagnosticar cáncer de próstata en los Estados Unidos y aproximadamente 28.660 hombres morirán debido a la enfermedad. El riesgo de cáncer de próstata está fuertemente relacionado con la edad: se registran muy pocos casos en hombres con menos de 50 años y tres cuartas partes de los casos se producen en hombres con más de 65 años. El mayor número de casos se diagnostica entre aquellos con una edad comprendida entre 70-74 años. Actualmente, la tasa de crecimiento de la población de mayor edad es significativamente mayor que la de la población total. Hacia 2025-2030, las proyecciones indican que la población con más de 60 años habrá crecido 3,5 veces más rápido que la población total. Se proyecta la proporción de personas ancianas a más del doble en todo el mundo en los próximos 50 años, lo que significa que ha de esperarse un aumento adicional de la incidencia de cáncer de próstata diagnosticado en el futuro. La expresión altamente restringida de PSMA y su regulación por incremento en fases avanzadas y enfermedad metastásica del cáncer de próstata así como su papel como neoantígeno en la vasculatura tumoral de muchos tipos diferentes de otros tumores sólidos califica el PSMA como antígeno diana atractivo para la terapia del cáncer basada en anticuerpos. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención proporciona una herramienta ventajosa para destruir células cancerosas humanas que expresan PSMA, tal como se ejemplifica mediante la línea celular de cáncer de próstata humano LNCaP. Además, la actividad citotóxica del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención es mayor que la actividad citotóxica de anticuerpos descritos en la técnica. Puesto que preferiblemente el dominio de unión tanto a CD3 como a PSMA del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos humanos y de primates distintos de chimpancé, puede usarse para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates y (de forma idéntica) como fármaco en seres humanos.

Ventajosamente, la presente invención proporciona también anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla PSMAxCD3 que comprenden un segundo dominio de unión que se une tanto al PSMA humano como al homólogo de PSMA de macaco, es decir el homólogo de un primate distinto de chimpancé. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende por tanto un segundo dominio de unión que presenta especificidad entre especies para el PSMA de ser humano y de un primate distinto de chimpancé. En este caso, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla idéntica puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como fármaco en seres humanos. Dicho de otro modo, la misma molécula puede usarse en estudios preclínicos en animales así como en estudios clínicos en seres humanos. Esto conduce a resultados altamente comparables y un poder de predicción muy aumentado de los estudios en animales en comparación con moléculas sustitutas específicas de la especie. Puesto que tanto el CD3 como el dominio de unión a PSMA del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y de primates distintos de chimpancé, puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates así como (en forma idéntica) como fármaco en seres humanos. Se entenderá que en una realización preferida, la especificidad entre especies de los dominios de unión primero y segundo de los anticuerpos de la invención es idéntica.

Se ha encontrado en la presente invención que es posible generar un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano en el que puede usarse la molécula idéntica en pruebas preclínicas en animales, así como estudios clínicos e incluso en terapia en seres humanos. Este se debe a la identificación inesperada del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, que además de unirse a CD3 épsilon humano y PSMA, respectivamente, (y debido a similitud genética probablemente con el homólogo de chimpancé), también se une a los homólogos de dichos antígenos de primates distintos de chimpancé, incluyendo los monos del nuevo mundo y monos del viejo mundo. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención puede usarse como agente terapéutico contra diversas enfermedades, incluyendo, pero sin limitarse, a cáncer. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención es particularmente ventajoso para la terapia del cáncer, preferiblemente tumores sólidos, más preferiblemente carcinomas y cáncer de próstata. En vista de lo anterior, desaparece la necesidad de construir un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 sustituto para pruebas en una especie filogenética distante (de los seres humanos). Como resultado, puede usarse la molécula idéntica en pruebas preclínicas en animales tal como pretende administrarse a seres humanos en pruebas clínicas así como tras la aprobación para la comercialización y la administración terapéutica de fármacos. La capacidad para usar la misma molécula para pruebas preclínicas en animales como en la administración posterior a seres humanos elimina prácticamente, o al menos reduce enormemente, el peligro de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tengan una aplicabilidad limitada al caso humano. Brevemente, la obtención de datos de seguridad preclínicos en animales usando la misma molécula que se administrará realmente a seres humanos no garantiza en gran medida la aplicabilidad de los datos a un escenario relevante para seres humanos.

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En cambio, en enfoques convencionales que usan moléculas sustitutas, dichas moléculas sustitutas han de adaptarse de manera molecular al sistema de prueba en animales usado para la evaluación preclínica de la seguridad. Por tanto, la molécula que va a usarse en terapia en seres humanos difiere de hecho en la secuencia y también probablemente en la estructura de la molécula sustituta usada en pruebas preclínicas en parámetros farmacocinéticos y/o actividad biológica, con la consecuencia de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tienen aplicabilidad / capacidad de transferencia limitada al caso humano. El uso de moléculas sustitutas requiere la construcción, producción, purificación y caracterización de un constructo completamente nuevo. Este conduce a tiempo y costes de desarrollo adicionales necesarios para obtener esa molécula. En suma, tienen que desarrollarse sustitutos por separado además del fármaco que va a usarse en realidad en terapia en seres humanos, de modo que tienen que llevarse a cabo dos líneas de desarrollo para dos moléculas. Por tanto, una ventaja importante del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención que muestra especificidad entre especies descrito en el presente documento es que puede usarse la molécula idéntica para agentes terapéuticos en seres humanos y en pruebas preclínicas en animales.

Se prefiere que al menos uno de dichos dominios de unión primero o segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención esté injertado con CDR, sea humanizado o humano, tal como se expone en más detalle a continuación. Preferiblemente, ambos dominios de unión primero y segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención están injertados con CDR, son humanizados o humanos. Para el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención, se excluye la generación de una reacción inmunitaria frente a dicha molécula de unión en el máximo grado posible tras la administración de la molécula a pacientes humanos.

Otra ventaja importante del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención es su aplicabilidad para pruebas preclínicas en diversos primates. El comportamiento de un candidato a fármaco en animales debe ser indicativo de manera ideal del comportamiento esperado de este candidato a fármaco tras la administración a seres humanos. Como resultado, los datos obtenidos a partir de tales pruebas preclínicas deben tener por tanto generalmente un alto poder de predicción para el caso humano. Sin embargo, tal como se aprendió a partir del trágico desenlace del reciente ensayo clínico de fase I con TGN1412 (un anticuerpo monoclonal frente a CD28), un candidato a fármaco puede actuar de diferente manera en una especie de primate que en seres humanos: aunque en pruebas preclínicas de dicho anticuerpo no se han observado efectos adversos o sólo limitados en estudios en animales realizados con macacos cinomolgos, seis pacientes humanos desarrollaron fallo multiorgánico tras la administración de dicho anticuerpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Los resultados de estos acontecimientos no deseados, dramáticos sugieren que puede no ser suficiente limitar las pruebas preclínicas a una sola especie (primate distinto de chimpancé). El hecho de que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención se une a una serie de monos del nuevo mundo y del viejo mundo puede ayudar a superar los problemas encarados en el caso mencionado anteriormente. Por consiguiente, la presente invención proporciona medios y métodos para minimizar diferencias entre especies en los efectos cuando están desarrollándose y sometiéndose a prueba fármacos para terapia en seres humanos.

Con el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 preferiblemente humano, específico entre especies de la invención, tampoco es necesario ya adaptar el animal de prueba al candidato a fármaco destinado para la administración a seres humanos, tal como por ejemplo la creación de animales transgénicos. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención que presenta especificidad entre especies según los usos y los métodos de invención puede usarse directamente para pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancé, sin ninguna manipulación genética de los animales. Tal como saben bien los expertos en la técnica, los enfoques en los que el animal de prueba se adapta al candidato a fármaco siempre corren el riesgo de que los resultados obtenidos en las pruebas preclínicas de seguridad sean menos representativos y predictivos para seres humanos debido a la modificación del animal. Por ejemplo, en animales transgénicos, las proteínas codificadas por los transgenes a menudo se sobreexpresan altamente. Por tanto, los datos obtenidos para la actividad biológica de un anticuerpo contra este antígeno de proteína pueden estar limitados en cuanto a su valor de predicción para seres humanos en los que la proteína se expresa a niveles mucho menores, más fisiológicos.

Una ventaja adicional de los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 preferiblemente humano de la invención que presenta especificidad entre especies es el hecho de que se evitan los chimpancés como especie en peligro para las pruebas en animales. Los chimpancés son los parientes más cercanos de los seres humanos y se agruparon recientemente en la familia de los homínidos basándose en los datos de secuenciación del genoma (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Por tanto, se consideran generalmente los datos obtenidos con chimpancé como altamente predictivos para seres humanos. Sin embargo, debido a su estatus como especie en peligro, el número de chimpancés que puede usarse para experimentos médicos está altamente restringido. Tal como se estableció anteriormente, por tanto, el mantenimiento de chimpancés para pruebas en animales es tanto costoso como éticamente problemático. Los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención, evitan tanto las objeciones éticas como la carga económica durante pruebas preclínicas sin perjuicio de la calidad, es decir la aplicabilidad, de los datos obtenidos en las pruebas en animales. En vista de esto, los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención prevén una alternativa razonable a los estudios en chimpancés.

Una ventaja todavía adicional del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención es la capacidad para extraer múltiples muestras de sangre cuando se usa como parte de pruebas preclínicas en animales, por ejemplo en el transcurso de estudios farmacocinéticos en animales. Las múltiples extracciones de sangre pueden obtenerse mucho más fácilmente con un primate distinto de chimpancé que con animales inferiores, por ejemplo un ratón. La extracción de múltiples muestras de sangre permite someter a prueba

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5 de manera continua parámetros sanguíneos para la determinación de los efectos biológicos inducidos por el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención. Además, la extracción de múltiples muestras de sangre permite al investigador evaluar el perfil farmacocinético del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento. Además, pueden medirse posibles efectos secundarios, que pueden inducirse por dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención que se reflejen en parámetros sanguíneos en diferentes muestras de sangre extraídas durante el transcurso de la administración de dicho anticuerpo. Esto permite la determinación del posible perfil de toxicidad del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento.

Las ventajas del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención tal

15 como se define en el presente documento que presenta especificidad entre especies pueden resumirse brevemente tal como sigue:

En primer lugar, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento usado en pruebas preclínicas es el mismo que se usa en terapia en seres humanos. Por tanto, ya no es necesario desarrollar dos moléculas independientes, que pueden diferir en sus propiedades farmacocinéticas y actividad biológica. Esto es altamente ventajoso porque, por ejemplo, los resultados farmacocinéticos pueden transferirse y aplicarse más directamente al caso humano que, por ejemplo, en enfoques con sustitutos convencionales.

En segundo lugar, los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento para la preparación de agentes terapéuticos en ser

25 humano es menos costoso y requiere menos mano de obra que los enfoques con sustitutos.

En tercer lugar, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3, preferiblemente humano, de la invención tal como se define en el presente documento puede usarse para pruebas preclínicas no sólo en una especie de primate, sino en una serie de diferentes especies de primate, limitando de ese modo el riesgo de posibles diferencias entre especies entre primates y ser humano.

En cuarto lugar, puede evitarse el chimpancé como especie en peligro para pruebas en animales si se desea.

En quinto lugar, pueden extraerse múltiples muestras de sangre para estudios farmacocinéticos extensos.

En sexto lugar, debido al origen humano de las moléculas de unión, preferiblemente humanas, según una realización preferida de la invención, la generación de una reacción inmunitaria frente a dichas moléculas de unión se minimiza cuando se administran a pacientes humanos. Se excluye la inducción de una respuesta inmunitaria con

35 anticuerpos específicos para un candidato a fármaco derivado de una especie no humana como por ejemplo un ratón que conduce al desarrollo de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) contra moléculas terapéuticas de origen murino.

En último lugar, pero no menos importante, el uso terapéutico del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención proporciona un enfoque terapéutico novedoso e inventivo para cáncer, preferiblemente tumores sólidos, más preferiblemente carcinomas y cáncer de próstata. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención proporciona una herramienta ventajosa para destruir células de cáncer de próstata humano que expresan PSMA. Además, la actividad citotóxica del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención es mayor que la actividad de anticuerpos descritos en la técnica.

45 Tal como se indicó anteriormente en el presente documento, la presente invención proporciona polipéptidos, es decir anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla, que comprenden un primer dominio de unión que se une específicamente a un epítopo de cadena CD3 de ser humano y primate distinto de chimpancé Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus y un segundo dominio de unión que se une a PSMA. El segundo dominio de unión se une preferiblemente a PSMA humano y a un PSMA de primate distinto de chimpancé. La ventaja de las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla como candidatos a fármaco que satisfacen los requisitos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla preferido de la invención es el uso de tales moléculas en pruebas preclínicas con animales así como en estudios clínicos e incluso para terapia en seres humanos. En una realización preferida de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies de la invención, el segundo dominio de unión que se une a PSMA es humano. En una molécula biespecífica específica entre especies según la

55 invención, el dominio de unión que se une a un epítopo de cadena CD3 épsilon de ser humano y primate distinto de chimpancé está ubicado en el orden VH-VL o VL-VH en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la molécula biespecífica. Se describen ejemplos para moléculas biespecíficas específicas entre especies según la invención en diferentes disposiciones de la cadena VH y la VL en los dominios de unión primero y segundo en los

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ejemplos adjuntos.

Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo biespecífico de cadena sencilla” indica una única cadena de polipéptido que comprende dos dominios de unión. Cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo (“región VH”), en el que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente a la molécula de CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente a PSMA. Los dos dominios de unión se conectan opcionalmente entre sí mediante un espaciador de polipéptido corto. Un ejemplo no limitativo de un espaciador de polipéptido es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) y repeticiones del mismo. Cada dominio de unión puede comprender adicionalmente una región variable de una cadena ligera de anticuerpo (“región VL”), conectándose la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo entre sí a través de un ligador de polipéptido, por ejemplo del tipo dado a conocer y reivindicado en el documento EP 623679 B1, pero en cualquier caso lo suficientemente largo como para permitir que la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión se apareen unas con otras de tal manera que, conjuntamente, pueden unirse específicamente a los dominios de unión primero y segundo respectivos.

El término “proteína” se conoce bien en la técnica y describe compuestos biológicos. Las proteínas comprenden una

o más cadenas de aminoácidos (polipéptidos), mediante las cuales los aminoácidos se unen entre sí a través de un enlace peptídico. El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento describe un grupo de moléculas, que consiste en más de 30 aminoácidos. Según la invención, el grupo de polipéptidos comprende “proteínas” siempre que las proteínas consistan en una única cadena de polipéptido. También en línea con la definición, el término “polipéptido” describe fragmentos de proteínas siempre que estos fragmentos consistan en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar además multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman tales dímeros, trímeros etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de tales multímeros se denominan, por consiguiente, homo o heterodímeros, homo o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un hereteromultímero es una molécula de anticuerpo, que, en su forma que se produce de manera natural, consiste en dos cadenas ligeras de polipéptido idénticas y dos cadenas pesadas de polipéptido idénticas. Los términos “polipéptido” y “proteína” también se refieren a proteínas/polipéptidos modificados de manera natural en los que se efectúa la modificación, por ejemplo, mediante modificaciones postraduccionales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Tales modificaciones se conocen bien en la técnica.

El término “dominio de unión” caracteriza, en relación con la presente invención, un dominio de un polipéptido que se une específicamente a/interacciona con una estructura/antígeno/epítopo diana dado. Por tanto, el dominio de unión es un “sitio de interacción con antígeno”.

El término “sitio de interacción con antígeno” define, según la presente invención, un motivo de un polipéptido, que puede interaccionar específicamente con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos, por ejemplo el antígeno idéntico en diferentes especies. Dicha unión/interacción se entiende también que define un “reconocimiento específico”. El término “que reconoce específicamente” significa según esta invención que la molécula de anticuerpo puede interaccionar específicamente con y/o unirse a al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un antígeno, por ejemplo el antígeno CD3 humano y los antígenos diana tal como se definen en el presente documento. Tal unión puede ejemplificarse mediante la especificidad de un “principio de llave y cerradura”. Por tanto, motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno se unen entre sí como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria así como el resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar resultado también una unión sencilla de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del dominio de unión/sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado alternativamente la iniciación de una señal, por ejemplo debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. Un ejemplo preferido de un dominio de unión en línea con la presente invención es un anticuerpo. El dominio de unión puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal o derivarse de un anticuerpo monoclonal o policlonal.

El término “anticuerpo” comprende derivados o fragmentos funcionales del mismo que conservan todavía la especificidad de unión. Se conocen bien en la técnica técnicas para la producción de anticuerpos y se describen, por ejemplo en Harlow y Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Harlow y Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. El término “anticuerpo” también comprende inmunoglobulinas (Ig) de diferentes clases (es decir IgA, IgG, IgM, IgD e IGE) y subclases (tales como IgG1, IgG2 etc.).

La definición del término “anticuerpo” incluye también realizaciones tales como anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos de anticuerpo, como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo o derivados comprenden además fragmentos F(ab’)2, Fv, scFv o anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de un solo dominio variable o un solo dominio variable de inmunoglobulina que comprende únicamente un dominio variable, que podría ser VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otros dominios o regiones V; véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit. Un solo dominio variable de inmunoglobulina de este tipo engloba no sólo un polipéptido de un solo dominio de

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anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia de polipéptido de un solo dominio de anticuerpo.

Se conocen en la técnica diversos procedimientos y pueden usarse para la producción de tales anticuerpos y/o fragmentos. Por tanto, los derivados (de anticuerpo) pueden producirse también por peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, entre otros, la patente estadounidense 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para polipéptido(s) elegido(s). Además, pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados o humanos específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de esta invención. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos de tales técnicas incluyen la técnica del hibridoma (Köhler y Milstein Nature 256 (1975), 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Puede usarse resonancia por plasmones de superficie tal como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de anticuerpos de fago que se unen a un epítopo de un polipéptido diana, tal como CD3 épsilon o PSMA (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Se prevé también en el contexto de esta invención que el término “anticuerpo” comprenda constructos de anticuerpos, que pueden expresarse en un huésped tal como se describe a continuación en el presente documento, por ejemplo constructos de anticuerpos que pueden transfectarse y/o transducirse a través de, entre otros, virus o vectores de plásmido.

El término “interacción específica” tal como se usa según la presente invención significa que el dominio de unión no experimenta reacción cruzada o no lo hace significativamente con polipéptidos que tienen estructura similar a los que se unen por el dominio de unión, y que podrían expresarse por las mismas células que el polipéptido de interés. Puede someterse a prueba la reactividad cruzada de un panel de dominios de unión en investigación, por ejemplo, evaluando la unión de dicho panel de dominios de unión en condiciones convencionales (véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Los ejemplos de la interacción específica de un dominio de unión con un antígeno específico comprenden la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende particularmente la interacción de ligandos, que inducen una señal tras su unión a su receptor específico. Los ejemplos de dicha interacción, que está también particularmente comprendida por dicha definición, es la interacción de un determinante antigénico (epítopo) con el dominio de unión (sitio de unión antigénico) de un anticuerpo.

El término “especificidad entre especies” o “especificidad interespecies” tal como se usa en el presente documento significa la unión de un dominio de unión descrito en el presente documento a la misma molécula diana en seres humanos y primates distintos de chimpancé. Por tanto, “especificidad entre especies” o “especificidad interespecies” ha de entenderse como una reactividad interespecies con la misma molécula “X” expresada en diferentes especies, pero no con una molécula distinta de “X”. Puede determinarse la especificidad entre especies de un anticuerpo monoclonal que reconoce por ejemplo CD3 épsilon humano, con un CD3 épsilon de primate distinto de chimpancé, por ejemplo CD3 épsilon de macaco, por ejemplo, mediante análisis de FACS. El análisis de FACS se lleva a cabo de manera que el anticuerpo monoclonal respectivo se somete a prueba para determinar la unión a células de ser humano y primate distinto de chimpancé, por ejemplo células de macaco, que expresan dichos antígenos CD3 épsilon de ser humano y de primate distinto de chimpancé, respectivamente. Se muestra un ensayo apropiado en los siguientes ejemplos. El contenido mencionado anteriormente se aplica cambiando lo que se deba cambiar para los antígenos diana PSMA, FAP, endosialina (TEM1), c-MET e IGF-1R: puede determinarse la especificidad entre especies de un anticuerpo monoclonal que reconoce por ejemplo PSMA humano, por un PSMA de primate distinto de chimpancé, por ejemplo PSMA de macaco, por ejemplo, mediante análisis de FACS. El análisis de FACS se lleva a cabo de manera que el anticuerpo monoclonal respectivo se somete a prueba para determinar la unión a células de ser humano y primate distinto de chimpancé, por ejemplo células de macaco, que expresan dichos antígenos PSMA de ser humano y primate distinto de chimpancé, respectivamente.

Tal como se usa en el presente documento, CD3 épsilon indica una molécula expresada como parte del receptor de células T y tiene el significado que se le atribuye normalmente en la técnica anterior. En ser humano, engloba en forma combinada individual o independientemente todas las subunidades de CD3 conocidas, por ejemplo CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gamma, CD3 zeta, CD3 alfa y CD3 beta. Los antígenos CD3 no humanos, de primate distinto de chimpancé a los que se hace referencia en el presente documento son, por ejemplo, CD3 de Macaca fascicularis y CD3 de Macaca mulatta. En Macaca fascicularis, engloba CD3 épsilon negativo para FN-18 y CD3 épsilon positivo para FN-18, CD3 gamma y CD3 delta. En Macaca mulatta, engloba CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta. Preferiblemente, dicho CD3 tal como se usa en el presente documento es CD3 épsilon.

El CD3 épsilon humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_000733 y comprende SEQ ID NO. 1. El CD3 gamma humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_000073. El CD3 delta humano se indica en el n.º de registro GenBank NM_000732.

El CD3 épsilon “negativo para FN-18” de Macaca fascicularis (es decir CD3 épsilon no reconocido por el anticuerpo monoclonal FN-18 debido a un polimorfismo tal como se expuso anteriormente) se indica en el n.º de registro GenBank AB073994.

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El CD3 épsilon “positivo para FN-18” de Macaca fascicularis (es decir CD3 épsilon reconocido por anticuerpo monoclonal FN-18) se indica en el n.º de registro GenBank AB073993. El CD3 gamma de Macaca fascicularis se indica en el n.º de registro GenBank AB073992. El CD3 delta de Macaca fascicularis se indica en el n.º de registro

5 GenBank AB073991.

Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de los homólogos respectivos de CD3 épsilon, gamma y delta de Macaca mulatta pueden identificarse y aislarse mediante técnicas recombinantes descritas en la técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001). Esto se aplica cambiando lo que se deba cambiar a los homólogos de CD3 épsilon, gamma y delta de otros

10 primates distintos de chimpancé tal como se definen en el presente documento. La identificación de la secuencia de aminoácidos de Callithrix jacchus, Saimiri sciureus y Saguinus oedipus se describe en los ejemplos adjuntos. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del CD3 épsilon de Callithrix jacchus se representa en SEQ ID NO: 3, la de Saguinus oedipus se representa en SEQ ID NO: 5 y la de Saimiri sciureus se representa en SEQ ID NO: 7.

15 El PSMA humano se indica en el n.º de registro GenBank ’AY101595’. La clonación del homólogo de PSMA de macaco se demuestra en los siguientes ejemplos, las secuencias de ADNc y de aminoácidos correspondientes se muestran en SEQ ID NO. 385 y 386, respectivamente.

En línea con lo anterior, el término “epítopo” define un determinante antigénico, que se une/identifica específicamente por un dominio de unión tal como se define en el presente documento. El dominio de unión puede 20 unirse específicamente a/interaccionar con epítopos conformacionales o continuos, que son únicos para la estructura diana, por ejemplo la cadena de CD3 épsilon de ser humano y primate distinto de chimpancé o el PSMA de ser humano y primate distinto de chimpancé. Un epítopo conformacional o continuo se caracteriza para antígenos de polipéptido por la presencia de dos o más residuos de aminoácido diferenciados que están separados en la secuencia primaria, pero que se juntan en la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la 25 proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Los dos o más residuos de aminoácido diferenciados que contribuyen al epítopo están presentes en secciones independientes de una o más cadena(s) de polipéptido. Estos residuos se juntan en la superficie de la molécula cuando la(s) cadena(s) de polipéptido se pliega(n) en una estructura tridimensional para constituir el epítopo. En cambio, un epítopo continuo o lineal consiste en dos o más residuos de aminoácido diferenciados, que están presentes en un único segmento 30 lineal de una cadena de polipéptido. Dentro de la presente invención, un epítopo CD3 “dependiente del contexto” se refiere a la conformación de dicho epítopo. Un epítopo dependiente del contexto de este tipo, localizado en la cadena épsilon de CD3, sólo puede desarrollar su conformación correcta si se incluye dentro de la parte restante de la cadena épsilon y se mantiene en la posición adecuada mediante heterodimerización de la cadena épsilon con la cadena o bien gamma o bien delta de CD3. En cambio, un epítopo CD3 independiente del contexto tal como se 35 proporciona en el presente documento se refiere a un polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal o un fragmento funcional del mismo de CD3 épsilon. Este polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal o un fragmento funcional del mismo mantiene su integridad estructural tridimensional y conformación correcta cuando se extrae de su entorno nativo en el complejo CD3. La independencia del contexto del polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal o un fragmento funcional del mismo, que forma parte del dominio extracelular de CD3 40 épsilon, representa, por tanto, un epítopo que es completamente diferente a los epítopos de CD3 épsilon descritos en relación con un método para la preparación de moléculas de unión humanas en el documento WO 2004/106380. Dicho método usó CD3 épsilon recombinante expresado exclusivamente. La conformación de este CD3 épsilon recombinante expresado exclusivamente difería de la que adoptaba en su forma natural, es decir, la forma en la que existe la subunidad épsilon de CD3 del complejo TCR/CD3 como parte de un complejo no covalente con la 45 subunidad o bien CD3-delta o bien CD3-gamma del complejo TCR/CD3. Cuando tal proteína de CD3 épsilon recombinante expresado exclusivamente se usa como antígeno para la selección de anticuerpos a partir de una biblioteca de anticuerpos, se identifican anticuerpos específicos para este antígeno de la biblioteca aunque una biblioteca de este tipo no contenga anticuerpos con especificidad por antígenos propios/autoantígenos. Esto se debe al hecho de que la proteína de CD3 épsilon recombinante expresado exclusivamente no existe in vivo; no es un

50 autoantígeno. Por consiguiente, no se han reducido las subpoblaciones de células B que expresan anticuerpos específicos para esta proteína in vivo; una biblioteca de anticuerpos construida a partir de tales células B contendría material genético para anticuerpos específicos para la proteína de CD3 épsilon recombinante expresado exclusivamente.

Sin embargo, puesto que el polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal independiente del contexto o un

55 fragmento funcional del mismo es un epítopo, que se pliega en su forma nativa, no pueden identificarse dominios de unión en línea con la presente invención mediante métodos basados en el enfoque descrito en el documento WO 2004/106380. Por tanto, podría verificarse en pruebas que moléculas de unión tal como se dan a conocer en el documento WO 2004/106380 no pueden unirse a los 1-27 residuos de aminoácido N-terminales de la cadena de CD3 épsilon. Así, moléculas de unión anti-CD3 o moléculas de anticuerpo anti-CD3 convencionales (por ejemplo tal

60 como se dan a conocer en el documento WO 99/54440) se unen a la cadena de CD3 épsilon en una posición que está ubicada de manera más C-terminal que el polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal independiente del contexto o un fragmento funcional proporcionado en el presente documento. Las moléculas de anticuerpo OKT3

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y UCHT-1 de la técnica anterior también tienen una especificidad por la subunidad épsilon del complejo TCR/CD3 entre los residuos de aminoácido 35 a 85 y, por consiguiente, el epítopo de estos anticuerpos está ubicado también de manera más C-terminal. Además, UCHT-1 se une a la cadena de CD3 épsilon en una región entre los residuos de aminoácido 43 a 77 (Tunnacliffe, lnt. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52). Por tanto, las moléculas anti-CD3 de la técnica anterior no se unen a y no están dirigidas contra el epítopo de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal independiente del contexto definido en el presente documento (o un fragmento funcional del mismo). En particular, el estado de la técnica no puede proporcionar moléculas anti-CD3 que se unen específicamente al epítopo de 1-27 residuos de aminoácido Nterminal independiente del contexto y que son específicas entre especies, es decir se unen a CD3 épsilon de ser humano y de primate distinto de chimpancé.

Para la generación de un dominio de unión, preferiblemente humano, comprendido en una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales que se unen a CD3 épsilon tanto de ser humano como de primate distinto de chimpancé (por ejemplo, CD3 épsilon de macaco) o anticuerpos monoclonales que se unen a PSMA tanto de ser humano como de primate distinto de chimpancé.

Tal como se usa en el presente documento, “ser humano” y “hombre” se refiere a la especie Homo sapiens. En lo que respecta a los usos médicos de los constructos descritos en el presente documento, debe tratarse a los pacientes humanos con la misma molécula.

Se prefiere que al menos uno de dichos dominios de unión primero o segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención esté injertado con CDR, sea humanizado o humano. Preferiblemente, ambos dominios de unión primero y segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención están injertados con CDR, son humanizados o humanos.

El término anticuerpo “humano” tal como se usa en el presente documento ha de entenderse que significa que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento, comprende (una) secuencia(s) de aminoácidos contenida(s) en el repertorio de anticuerpos de línea germinal humana. Para los fines de definición en el presente documento, dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla puede considerarse por tanto humano si consiste en tal(es) secuencia(s) de aminoácidos de línea germinal humana, es decir si la secuencia(s) de aminoácidos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla en cuestión es/son idéntica(s) a (una) secuencia(s) de aminoácidos de línea germinal humana expresada(s). Un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento también puede considerarse humano si consiste en (una) secuencia(s) que se desvía(s) de su(s) secuencia(s) de línea germinal humana más próxima(s) en no más de lo que se esperaría debido a la huella de hipermutación somática. Adicionalmente, los anticuerpos de muchos mamíferos no humanos, por ejemplo roedores tales como ratones y ratas, comprenden secuencias de aminoácidos de CDR3 de VH que puede esperarse que existan también en el repertorio de anticuerpos humanos expresado. Cualquiera de tal(es) secuencia(s) de origen humano o no humano que puede esperarse que existan en el repertorio humano expresado se consideraría “humana” también para los fines de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término “humanizado”, “humanización”, “similar a humano” o variantes relacionadas gramaticalmente del mismo se usan de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende en al menos uno de sus dominios de unión al menos una región determinante de la complementariedad (“CDR”) de un anticuerpo no humano o fragmento del mismo. Se describen enfoques de humanización, por ejemplo, en los documentos WO 91/09968 y US 6.407.213. Como ejemplos no limitativos, el término engloba el caso en el que una región variable de al menos un dominio de unión comprende una única región CDR, por ejemplo la tercera región CDR de la VH (CDRH3), de otro animal no humano, por ejemplo un roedor, así como el caso en el que una o ambas región/regiones variable(s) comprende(n) en cada una de sus respectivas CDR primera, segunda y tercera, las CDR de dicho animal no humano. En el caso de que todas las CDR de un dominio de unión del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla se hayan reemplazado por sus equivalentes correspondientes de, por ejemplo, un roedor, se habla normalmente de “injerto de CDR”, y este término ha de entenderse como que está englobado por el término “humanizado” o variantes relacionadas gramaticalmente del mismo tal como se usan en el presente documento. El término “humanizado” o variantes relacionadas gramaticalmente del mismo engloba también casos en los que, además del reemplazo de una o más regiones CDR dentro de una VH y/o VL del primer y/o segundo dominio de unión, se ha(n) realizado mutación/mutaciones adicional(es) (por ejemplo, sustituciones) de al menos un único residuo de aminoácido dentro de las regiones de marco (“FR”) entre las CDR de tal manera que los aminoácidos en esa(s) posiciones corresponde(n) al/a los aminoácido(s) en esa(s) posiciones en el animal del que se derivan las regiones CDR usadas para el reemplazo. Tal como se conoce en la técnica, tales mutaciones individuales se realizan a menudo en las regiones de marco tras injerto de CDR para restaurar la afinidad de unión original del anticuerpo no humano usado como donador de CDR para su molécula diana. El término “humanizado” puede englobar además (una) sustitución/sustituciones de aminoácidos en las regiones CDR de un animal no humano al/a los aminoácido(s) de una región CDR correspondiente de un anticuerpo humano, además de las sustituciones de aminoácidos en las regiones de marco tal como se describió anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “homólogo” u “homología” ha de entenderse tal como sigue: se concluye a menudo homología entre proteínas y ADN basándose en la similitud de secuencia, especialmente en

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bioinformática. Por ejemplo, en general, si dos o más genes tienen secuencias de ADN altamente similares, es probable que sean homólogos. Pero puede surgir similitud de secuencia de diferentes ancestros: secuencias cortas pueden ser similares por casualidad, y pueden ser similares secuencias debido a que ambas se seleccionaron para unirse a una proteína particular, tal como un factor de transcripción. Tales secuencias son similares pero no homólogas. Las regiones de secuencia que son homólogas también se denominan conservadas. Esto no ha de confundirse con la conservación en secuencias de aminoácidos en las que el aminoácido en una posición específica ha cambiado pero las propiedades fisicoquímicas del aminoácido permanecen inalteradas. Las secuencias homólogas son de dos tipos: ortólogas y parálogas. Las secuencias homólogas son ortólogas si se separaron por un acontecimiento de evolución de las especies: cuando una especie diverge a dos especies independientes, las copias divergentes de un único gen en las especies resultantes se dice que son ortólogas. Ortólogos, o genes ortólogos, son genes en diferentes especies que son similares entre sí porque se originaron a partir de un ancestro común. La prueba más evidente de que dos genes similares son ortólogos es el resultado de un análisis filogenético del linaje del gen. Los genes que se encuentran dentro de un clado son ortólogos, descendieron de un ancestro común. Los ortólogos tienen a menudo, pero no siempre, la misma función. Las secuencias ortólogas proporcionan información útil en estudios de clasificación taxonómica de organismos. El patrón de divergencia genética puede usarse para seguir la pista a la relación de los organismos. Es probable que dos organismos que están relacionados de manera muy estrecha presenten secuencias de ADN muy similares entre dos ortólogos. A la inversa, es probable que un organismo que se ha retirado adicionalmente de manera evolutiva de otro organismo presente una mayor divergencia en la secuencia de los ortólogos que están estudiándose. Las secuencias homólogas son parálogas si se separaron por un acontecimiento de duplicación génica: si se duplica un gen en un organismo para ocupar dos posiciones diferentes en el mismo genoma, entonces las dos copias son parálogas. Un conjunto de secuencias que son parálogas se denominan parálogos entre sí. Los parálogos tienen normalmente la misma función o similar, pero a veces no: debido a la falta de la presión selectiva original sobre una copia del gen duplicado, esta copia tiene libertad para mutar y adquirir nuevas funciones. Puede encontrarse un ejemplo en roedores tales como ratas y ratones. Los roedores tienen un par de genes de insulina parálogos, aunque no está claro si se ha producido alguna divergencia en la función. Los genes parálogos pertenecen a menudo a la misma especie, pero esto no es necesario: por ejemplo, el gen de hemoglobina de seres humanos y el gen de mioglobina de los chimpancés son parálogos. Esto es un problema común en bioinformática: cuando se han secuenciado genomas de diferentes especies y se han encontrado genes homólogos, no puede concluirse inmediatamente que estos genes tienen la misma función o similar, ya que podrían ser parálogos cuya función ha divergido.

Tal como se usa en el presente documento, un “primate distinto de chimpancé” o “primate que no es chimpancé” o variantes gramaticales del mismo se refiere a cualquier animal primate (es decir no humano) distinto del chimpancé, es decir distinto de un animal perteneciente al género Pan, y que incluye las especies Pan paniscus y Pan troglodytes, también conocidos como Anthropopithecus troglodytes o Simia satyrus. Sin embargo, se entenderá que es posible que los anticuerpos de la invención puedan unirse también con su primer y/o segundo dominio de unión a los epítopos/fragmentos respectivos, etc. de dichos chimpancés. La intención es evitar meramente pruebas en animales que se llevan a cabo con chimpancés, si se desea. Por tanto también se prevé que, en otra realización, los anticuerpos de la presente invención también se unan con su primer y/o segundo dominio de unión a los epítopos de chimpancés respectivos. Un “primate”, “especie de primate”, “primates” o variantes gramaticales de los mismos indican un orden de mamíferos euterios dividido en los dos subórdenes de prosimios y antropoides y que comprenden simios, monos y lémures. Específicamente, “primates” tal como se usa en el presente documento comprende el suborden Strepsirrhini (prosimios no tarseros), incluyendo el infraorden Lemuriformes (que incluye a su vez las superfamilias Cheirogaleoidea y Lemuroidea), el infraorden Chiromyiformes (que incluye a su vez la familia Daubentoniidae) y el infraorden Lorisiformes (que incluye a su vez las familias Lorisidae y Galagidae). “Primates” tal como se usa en el presente documento también comprende el suborden Haplorrhini, que incluye el infraorden Tarsiiformes (que incluye a su vez la familia Tarsiidae), el infraorden Simiiformes (que incluye a su vez los Platyrrhini, o monos del nuevo mundo, y los Catarrhini, que incluyen los Cercopithecidea, o monos del viejo mundo).

La especie de primate distinto de chimpancé puede entenderse dentro del significado de la invención que es un lémur, un tarsero, un gibón, un tití (perteneciente a los monos del nuevo mundo de la familia Cebidae) o un mono del viejo mundo (perteneciente a la superfamilia Cercopithecoidea).

Tal como se usa en el presente documento, un “mono del viejo mundo” comprende cualquier mono que se encuentre en la superfamilia Cercopithecoidea, subdividida a su vez en las familias: los Cercopithecinae, que son principalmente africanos pero incluyen los diversos géneros de macacos que son asiáticos y norteafricanos; y los Colobinae, que incluyen la mayor parte de los géneros asiáticos pero también los monos colobos africanos.

Específicamente, dentro de la subfamilia Cercopithecinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede proceder de la tribu Cercopithecini, dentro del género Allenopithecus (mono de Allen, Allenopithecus nigroviridis); dentro del género Miopithecus (talapoin sureño, Miopithecus talapoin; talapoin norteño, Miopithecus ogouensis); dentro del género Erythrocebus (mono patas, Erythrocebus patas); dentro del género Chlorocebus (mono verde, Chlorocebus sabaceus; cercopiteco tota, Chlorocebus aetiops; cercopiteco de las montañas Bale, Chlorocebus djamdjamensis; cercopiteco tántalo, Chlorocebus tantalus; cercopiteco verde, Chlorocebus pygerythrus; cercopiteco Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); o dentro del género Cercopithecus (mono Dryas o cercopiteco Salongo, Cercopithecus dryas; cercopiteco Diana, Cercopithecus diana; cercopiteco de Roloway, Cercopithecus roloway; cercopiteco de nariz blanca, Cercopithecus nictitans; mono azul, Cercopithecus mitis; mono de plata, Cercopithecus

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doggetti; mono dorado, Cercopithecus kandti; cercopiteco de cuello blanco, Cercopithecus albogularis; cercopiteco mona, Cercopithecus mona; cercopiteco de Campbell, Cercopithecus campbelli; cercopiteco de Lowe, Cercopithecus lowei; cercopiteco coronado de Grey, Cercopithecus pogonias; cercopiteco de Wolf, Cercopithecus wolfi; cercopiteco de Dent, Cercopithecus denti; cercopiteco menor, Cercopithecus petaurista; cercopiteco de garganta blanca, Cercopithecus erythrogaster; cercopiteco de Sclater, Cercopithecus sclateri; cercopiteco de orejas rojas, Cercopithecus erythrotis; cercopiteco de hocico azul, Cercopithecus cephus; cercopiteco de cola roja, Cercopithecus ascanius; cercopiteco de L'Hoest, Cercopithecus Ihoesti; cercopiteco de Preuss, Cercopithecus preussi; cercopiteco de Gabón, Cercopithecus solatus; cercopiteco de Hamlyn o cercopiteco de cara de búho, Cercopithecus hamlyni; cercopiteco de Brazza, Cercopithecus neglectus).

Alternativamente, un primate distinto de chimpancé ventajoso, también dentro de la subfamilia Cercopithecinae pero dentro de la tribu Papionini, puede estar dentro del género Macaca (macaco de Gibraltar, Macaca sylvanus; macaco de cola de león, Macaca silenus; macaco cola de cerdo sureño o Beruk, Macaca nemestrina; macaco cola de cerdo norteño, Macaca leonina; macaco de Pagai o Bokkoi, Macaca pagensis; macaco de Siberut, Macaca siberu; macaco moro, Macaca maura; macaco calzado, Macaca ochreata; macaco de Togian, Macaca tonkeana; macaco de Heck, Macaca hecki; macaco de Gorontalo, Macaca nigriscens; macaco crestado de Célebes o “mono” negro, Macaca nigra; macaco cinomolgo o macaco cangrejero o macaco de cola larga o Kera, Macaca fascicularis; macaco cola de muñón o macaco rabón, Macaca arctoides; macaco Rhesus, Macaca mulatta; macaco de Formosa, Macaca cyclopis; macaco japonés, Macaca fuscata; macaco de Sri Lanka, Macaca sinica; macaco coronado, Macaca radiata; macaco de Gibraltar, Macaca sylvanmus; macaco de Assam, Macaca assamensis; macaco tibetano o macaco de Milne-Edwards, Macaca thibetana; macaco de Arunachal o Munzala, Macaca munzala); dentro del género Lophocebus (mangabeye de mejillas grises, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; mangabeye de cresta negra, Lophocebus aterrimus; mangabeye de Opdenbosch, Lophocebus opdenboschi; mangabeye de montaña, Lophocebus kipunji); dentro del género Papio (babuino hamadríade, Papio hamadryas; papión de Guinea, Papio papio; papión oliva, Papio anubis; papión amarillo, Papio cynocephalus; papión chacma, Papio ursinus); dentro del género Theropithecus (gelada, Theropithecus gelada); dentro del género Cercocebus (mangabeye gris, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus atys lunulatus; mangabeye de boina roja, Cercocebus torquatus; mangabeye ágil, Cercocebus agilis; mangabeye de vientre dorado, Cercocebus chrysogaster; mangabeye del río Tana, Cercocebus galeritus; mangabeye del río Sanje, Cercocebus sanjei); o dentro del género Mandrillus (mandril, Mandrillus sphinx; dril, Mandrillus leucophaeus).

El más preferido es Macaca fascicularis (también conocido como macaco cinomolgo y, por tanto, en los ejemplos denominado “cinomolgo”) y Macaca mulatta (mono Rhesus, denominado “Rhesus”).

Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser del grupo africano, dentro del género Colobus (colobo negro, Colobus satanas; colobo angoleño, Colobus angolensis; colobo rey, Colobus polykomos; colobo ursino, Colobus vellerosus; colobo oriental negro y blanco, Colobus guereza); dentro del género Piliocolobus (colobo rojo occidental, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; colobo de Pennant, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; colobo rojo de Preuss, Piliocolobus preussi; colobo rojo de Thollon, Piliocolobus tholloni; colobo rojo centroafricano, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; colobo rojo ugandés, Piliocolobus tephrosceles; colobo rojo de Udzungwa, Piliocolobus gordonorum; colobo rojo de Zanzíbar, Piliocolobus kirkii; colobo rojo del río Tana, Piliocolobus rufomitratus); o dentro del género Procolobus (colobo oliva, Procolobus verus).

Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser alternativamente del grupo de los langures (mono arbóreo), dentro del género Semnopithecus (langur gris de Nepal, Semnopithecus schistaceus; langur gris de Cachemira, Semnopithecus ajax; langur gris de Tarai, Semnopithecus hector, langur común, Semnopithecus entellus; langur gris de pies negros, Semnopithecus hypoleucos; langur gris de las planicies del Sur, Semnopithecus dussumieri; langur gris moñudo, Semnopithecus priam); dentro del grupo de T. vetulus o el género Trachypithecus (langur de cara púrpura, Trachypithecus vetulus; langur de Nilgiri, Trachypithecus johnii); dentro del grupo de T. cristatus del género Trachypithecus (lutung de Java, Trachypithecus auratus; langur plateado

o lutung plateado, Trachypithecus cristatus; lutung de Indochina, Trachypithecus germaini; lutung de Tenasserim, Trachypithecus barbei); dentro del grupo de T. obscurus del género Trachypithecus (langur oscuro o langur de anteojos, Trachypithecus obscurus; langur de Phayre, Trachypithecus phayrei); dentro del grupo de T. pileatus del género Trachypithecus (langur capuchino, Trachypithecus pileatus; langur de Shortridge, Trachypithecus shortridgei; langur dorado, Trachypithecus geei); dentro del grupo de T. francoisi del género Trachypithecus (langur de Francois, Trachypithecus francoisi; langur de Ha Tinh, Trachypithecus hatinhensis; langur de cabeza blanca, Trachypithecus polyocephalus; langur laosiano, Trachypithecus laotum; langur de Delacour, Trachypithecus delacouri; langur negro de Indochina, Trachypithecus ebenus); o dentro del género Presbytis (surili de Sumatra, Presbytis melalophos; surili de bandas, Presbytis femoralis; surili de Sarawak, Presbytis chrysomelas; surili de muslos blancos, Presbytis siamensis; surili de frente blanca, Presbytis frontata; surili de Java, Presbytis comata; langur de Thomas, Presbytis thomasi; langur de Hose, Presbytis hosei; langur marrón, Presbytis rubicunda; langur de Mentawai o colilargo, Presbytis potenziani; surili de la isla Natuna, Presbytis natunae).

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Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser alternativamente del grupo de los monos narigudos, dentro del género Pygathrix (duc de canillas rojas, Pygathrix nemaeus; duc de canillas negras, Pygathrix nigripes; duc de patas grises, Pygathrix cinerea); dentro del género Rhinopithecus (langur chato dorado, Rhinopithecus roxellana; langur negro de nariz chata, Rhinopithecus bieti; langur gris de nariz chata,

5 Rhinopithecus brelichi; langur de nariz chata de Tonkin, Rhinopithecus avunculus); dentro del género Nasalis (mono narigudo, Nasalis larvatus); o dentro del género Simias (langur cola de cerdo, Simias concolor).

Tal como se usa en el presente documento, el término “tití” indica cualquier mono del nuevo mundo del género Callithrix, por ejemplo pertenecientes a los titís atlánticos de subgénero Callithrix (sic) (tití común, Callithrix (Callithrix) jacchus; tití de pinceles negros, Callithrix (Callithrix) penicillata; tití de orejas negras, Callithrix (Callithrix) kuhlii; tití de 10 cabeza blanca, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; tití de cabeza amarilla, Callithrix (Callithrix) flaviceps; tití de orejas blancas, Callithrix (Callithrix) aurita); pertenecientes a los titís amazónicos del subgénero Mico (tití del río Acari, Callithrix (Mico) acariensis; tití de Manicoré, Callithrix (Mico) manicorensis; tití plateado, Callithrix (Mico) argentata; tití blanco, Callithrix (Mico) leucippe; tití de Snethlage, Callithrix (Mico) emiliae; tití de cabeza negra, Callithrix (Mico) nigriceps; tití de Marca, Callithrix (Mico) marcai; tití de cola negra, Callithrix (Mico) melanura; tití de Santarem,

15 Callithrix (Mico) humeralifera; tití de Maués, Callithrix (Mico) mauesi; tití dorado y blanco, Callithrix (Mico) chrysoleuca; tití de Aripuana, Callithrix (Mico) intermedia; tití de Satéré, Callithrix (Mico) saterei); tití enano de Roosmalen perteneciente al subgénero Callibella (Callithrix (Callibella) humilis); o el tití pigmeo perteneciente al subgénero Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).

Otros géneros de los monos del nuevo mundo comprenden tamarinos del género Saguinus (que comprende el grupo

20 de S. oedipus, el grupo de S. midas, el grupo de S. nigricollis, el grupo de S. mystax, el grupo de S. bicolor y el grupo de S. inustus) y monos ardilla del género Samiri (por ejemplo Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini).

En una realización preferida de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, el primate distinto de chimpancé es un mono del viejo mundo. En una realización más preferida de la molécula de anticuerpo 25 biespecífico de cadena sencilla de la invención, el mono del viejo mundo es un mono del género Papio, género Macaca. Lo más preferiblemente, los monos del género Macaca son macaco de Assam (Macaca assamensis), macaco de Gibraltar (Macaca sylvanus), macaco coronado (Macaca radiata), macaco calzado (Macaca ochreata), macaco crestado de Célebes (Macaca nigra), macaco de Formosa (Macaca cyclopsis), macaco japonés o macaco de cara roja (Macaca fuscata), mono cinomolgo o macaco cangrejero o macaco de cola larga o macaco de Java 30 (Macaca fascicularis), macaco de cola de león (Macaca silenus), macaco cola de cerdo (Macaca nemestrina), macaco Rhesus (Macaca mulatta), macaco tibetano (Macaca thibetana), macaco de Togian (Macaca tonkeana), macaco de Sri Lanka (Macaca sinica), macaco rabón o macaco de cara roja o macaco oso (Macaca arctoides), o macaco moro (Macaca maurus). Lo más preferiblemente, el mono del género Papio es Hamadryas Baboon, Papio hamadryas; Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio anubis; Yellow Baboon, Papio cynocephalus;

35 Chacma Baboon, Papio ursinus.

En una realización alternativamente preferida de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, el primate distinto de chimpancé es un mono del nuevo mundo. En una realización más preferida del polipéptido, el mono del nuevo mundo es un mono del género Callithrix (tití), el género Saguinus o el género Samiri. Lo más preferiblemente, el mono del género Callithrix es Callithrix jacchus, el mono del género Saguinus es

40 Saguinus oedipus y el mono del género Samiri es Saimiri sciureus.

El término “antígeno de superficie celular” tal como se usa en el presente documento indica una molécula, que se presenta sobre la superficie de una célula. En la mayor parte de los casos, esta molécula estará ubicada en o sobre la membrana plasmática de la célula de tal manera que al menos parte de esta molécula sigue siendo accesible desde el exterior de la célula en forma terciaria. Un ejemplo no limitativo de una molécula de superficie celular, que 45 está ubicada en la membrana plasmática es una proteína transmembrana que comprende, en su conformación terciaria, regiones de hidrofilicidad e hidrofobicidad. En este caso, al menos una región hidrófoba permite que se incluya la molécula de superficie celular, o se inserte en la membrana plasmática hidrófoba de la célula mientras que las regiones hidrófilas se extienden a ambos lados de la membrana plasmática en el citoplasma y el espacio extracelular, respectivamente. Ejemplos no limitativos de moléculas de superficie celular que están ubicadas sobre la 50 membrana plasmática son proteínas que se han modificado en un residuo de cisteína para que porte un grupo palmitoílo, proteínas modificadas en un residuo de cisteína C-terminal para que porte un grupo farnesilo o proteínas que se han modificado en el extremo C-terminal para que porten un anclaje de glicosil-fosfatidil-inositol (“GPI”). Estos grupos permiten la unión covalente de proteínas a la superficie externa de la membrana plasmática, donde siguen siendo accesibles para el reconocimiento por moléculas extracelulares tales como anticuerpos. Ejemplos de

55 antígenos de superficie celular son CD3 épsilon y PSMA. Tal como se describió anteriormente en el presente documento, PSMA es un antígeno de superficie celular que es una diana para la terapia del cáncer, incluyendo, pero sin limitarse a tumores sólidos, preferiblemente carcinomas y cáncer de próstata.

En vista de esto, PSMA pueden caracterizarse también como un antígeno tumoral. El término “antígeno tumoral” tal como se usa en el presente documento puede entenderse como aquellos antígenos que se presentan en células 60 tumorales. Estos antígenos pueden presentarse en la superficie celular con una parte extracelular, que se combina a menudo con una parte transmembrana y citoplasmática de la molécula. Estos antígenos pueden presentarse a

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veces sólo por células tumorales y nunca por las normales. Los antígenos tumorales pueden expresarse exclusivamente en células tumorales o podrían representar una mutación específica de tumor en comparación con células normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor. Más comunes son los antígenos que se presentan por células tumorales y células normales, y se denominan antígenos asociados a tumor. Estos antígenos asociados a tumor pueden sobreexpresarse en comparación con las células normales o son accesibles para la unión a anticuerpos en células tumorales debido a la estructura menos compacta del tejido tumoral en comparación con el tejido normal. Un ejemplo para un antígeno tumoral en línea con la presente invención es PSMA.

Tal como se describió anteriormente en el presente documento, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención se une específicamente con el primer dominio de unión a un epítopo de la cadena de CD3 (épsilon) de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en 27 residuos de aminoácido tal como se representa en SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E).

En línea con la presente invención se prefiere para la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención que dicho epítopo forme parte de una secuencia de aminoácidos que comprende 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 aminoácidos.

Tal como se menciona en el presente documento, el epítopo comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E).

Dentro de la presente invención, un “fragmento funcional de los residuos de aminoácido 1-27 N-terminales” significa que dicho fragmento funcional sigue siendo un epítopo independiente del contexto que mantiene su integridad estructural tridimensional cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3 (y se fusiona con una secuencia de aminoácidos heteróloga tal como EpCAM o una parte Fc de inmunoglobulina, por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo 3.1). El mantenimiento de la estructura tridimensional dentro del fragmento funcional o polipeptídico de 27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon puede usarse para generar dominios de unión que se unen al fragmento polipeptídico de CD3 épsilon N-terminal in vitro y al complejo CD3 nativo (su subunidad CD3 épsilon) en células T in vivo con la misma afinidad de unión. Dentro de la presente invención, un fragmento funcional de los 1-27 residuos de aminoácido N-terminales significa que los dominios de unión a CD3 proporcionados en el presente documento todavía pueden unirse a tales fragmentos funcionales de manera independiente del contexto. El experto en la técnica conoce los métodos de mapeo de epítopos para determinar qué residuos de aminoácido de un epítopo reconocen tales moléculas de unión anti-CD3 (por ejemplo, barrido de alanina; véanse los ejemplos adjuntos).

Dentro de la presente invención además se prefiere que el segundo dominio de unión se una al antígeno humano de superficie celular PSMA y/o a PSMA de primate distinto de chimpancé. De manera particularmente preferida, el segundo dominio de unión se une a PSMA humano y a PSMA de primate distinto de chimpancé, preferiblemente a PSMA de macaco. Ha de entenderse, que el segundo dominio de unión se une a al menos un PSMA de primate distinto de chimpancé, sin embargo, también puede unirse a dos, tres o más homólogos de PSMA de primate distinto de chimpancé. Por ejemplo, el segundo dominio de unión puede unirse a PSMA de mono cinomolgo y a PSMA de mono Rhesus.

Para la generación del segundo dominio de unión de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla tal como se define en el presente documento, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales que se unen a ambos de los respectivos antígenos de superficie celular humanos y/o de primate distinto de chimpancé, tal como PSMA. Pueden derivarse dominios de unión apropiados para el polipéptido biespecífico tal como se define en el presente documento, por ejemplo, a partir de anticuerpos monoclonales específicos entre especies mediante métodos recombinantes descritos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno de superficie celular humano y al homólogo de dicho antígeno de superficie celular en un primate distinto de chimpancé puede someterse a prueba mediante ensayos FACS como se expuso anteriormente. Es evidente para los expertos en la técnica que también pueden generarse anticuerpos específicos entre especies mediante técnicas de hibridoma descritas en la bibliografía (Köhler y Milstein, Nature 256 (1975), 495-7). Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones de forma alternativa con antígeno de superficie celular humano y de primate distinto de chimpancé, tal como PSMA. A partir de estos ratones, se aíslan células de hibridoma productoras de anticuerpos específicos entre especies por medio de tecnología de hibridoma y se analizan por FACS, tal como se expuso anteriormente. En los ejemplos siguientes se muestra la generación y el análisis de polipéptidos biespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que presentan especificidad entre especies tal como se describe en el presente documento. Las ventajas de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que presentan especificidad entre especie incluyen los puntos enumerados en el presente documento.

Se prefiere particularmente para la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención que el primer dominio de unión comprenda una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a)

CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 27, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 28 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 29;

(b)

CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 117, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 118 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 119; y

(c)

CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 153, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 154 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 155.

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5 En la técnica se entiende que las regiones variables, es decir, la cadena ligera variable (“L” o “VL”) y la cadena pesada variable (“H” o “VH”), proporcionan el dominio de unión de un anticuerpo. Estas regiones variables albergan las regiones determinantes de complementariedad. El término “región determinante de complementariedad” (CDR) se conoce bien en la técnica para determinar la especificidad de antígeno de un anticuerpo. El término “CDR-L” o “CDR L” se refiere a CDR de la VL, mientras que el término “CDR-H” o “CDR H” se refiere a las CDR de la VH.

10 En una realización alternativamente preferida de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 12, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 13 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 14;

15 (b) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 30, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 31 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 32;

(c) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 48, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 49 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 50;

(d) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 66, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 67 y CDR20 H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 68;

(e)

CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 84, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 85 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 86;

(f)

CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 102, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 103 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 104;

25 (g) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 120, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 121 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 122;

(h) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 138, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 139 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 140;

(i) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 156, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 157 y CDR30 H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 158; y

(j) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 174, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 175 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 176.

Además se prefiere que el dominio de unión comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 35, 39, 125, 129, 161 ó 165.

35 Se prefiere alternativamente que el primer dominio de unión comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ó 181.

Más preferiblemente, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la divulgación se caracteriza por el primer dominio de unión, que comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:

40 (a) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 17 ó 21 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 15 ó 19;

(b) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 35 ó 39 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 33 ó 37;

(c) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 53 ó 57 y una región VH tal como se representa en SEQ ID 45 NO. 51 ó 55;

(d)

una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 71 ó 75 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 69 ó 73;

(e)

una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 89 ó 93 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 87 ó 91;

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(f)

una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 107 ó 111 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 105 ó 109;

(g)

una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 125 ó 129 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 123 ó 127;

(h)

una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 143 ó 147 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 141 ó 145;

(i)

una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 161 ó 165 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 159 ó 163; y

(j)

una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 179 ó 183 y una región VH tal como se representa en SEQ

ID NO. 177 ó 181. Los pares de regiones VH y regiones VL en el primer dominio de unión que se une a CD3 épsilon de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención están en el formato de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv). Las regiones VH y VL se disponen en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH se sitúe en posición N-terminal con respecto a una secuencia ligadora. La región VL se sitúa en posición C-terminal con respecto a la secuencia ligadora. Dicho de otro modo, la disposición de dominios en el dominio de unión CD3 de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención es preferiblemente VH-VL, estando ubicado dicho dominio de unión CD3 en posición C-terminal con respecto al segundo (antígeno de superficie celular, tal como PSMA) dominio de unión. Preferiblemente VH-VL comprende o es SEQ ID NO. 185.

Una realización preferida de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla descrita anteriormente de la divulgación se caracteriza por el primer dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ó 187.

La invención se refiere además a un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla descrito anteriormente, en el que el

segundo dominio de unión se une al antígeno de superficie celular PSMA. Según una realización preferida de la invención, una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionadas del grupo que consiste en:

a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 394 -396 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 389-391; b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 408 -410 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 403-405; c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 422 -424 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 417-419; d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 436 -438 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 431-433; e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 445 -447 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 450-452; f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 464 -466 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 459-461; g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 478 -480 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 473-475; h) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 492 -494 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 487-489; i) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 506 -508 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 501-503; j) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 520 -522 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 515-517; k) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 534 -536 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 529-531; l) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 548 -550 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 543-545; m) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 562 -564 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 557-559; n) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 576 -578 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 571-573; o) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 590 -592 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 585-587; p) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 604 -606 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 599-601; q) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 618 -620 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 613-615; r) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 632 -634 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 627-629; s) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 646 -648 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 641-643;

imagen11

t) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 660 -662 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 655-657;

u) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 674 -676 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 669-671;

v) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 688 -690 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 683-685;

5 w) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 702 -704 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 697-699;

x) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 716 -718 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 711-713; e

y) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 729 -731 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 724-726.

Las secuencias de las regiones VL y VH correspondientes del segundo dominio de unión de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención así como de las scFv respectivas se muestran en la lista

10 de secuencias.

En la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención los dominios de unión están dispuestos en el orden VL-VHVH-VL, VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VL o VH-VL-VL-VH, tal como se ejemplifica en los ejemplos adjuntos. Preferiblemente, los dominios de unión están dispuestos en el orden VH PSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 o VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3.

15 Una realización particularmente preferida de la invención se refiere a una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente, en la que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende una secuencia seleccionada de:

(a) una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO.: 399, 413, 427, 441, 455,

469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 20 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 ó 989;

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO.: 400, 414, 428, 442, 456, 470, 484, 498, 512, 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736 735, 800, 818, 864, 850, 836, 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 ó 976;

25 (c) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96% a la secuencia de aminoácidos de (a) o (b).

La invención se refiere a una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO.: 399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 30 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 ó 989, así como a secuencias de aminoácidos idénticas en al menos el 90%, más preferido idénticas en al menos el 95%, lo más preferido idénticas en al menos el 96, el 97, el 98 o el 99% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 ó 989. La invención se refiere también a las secuencias de ácido nucleico correspondientes tal como

35 se representa en cualquiera de SEQ ID NO.: 400, 414, 428, 442, 456, 470, 484, 498, 512, 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736 735, 800, 818, 864, 850, 836, 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 ó 976.

Ha de entenderse que la identidad de secuencia se determina a lo largo de toda la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Para alineaciones de secuencias, pueden usarse por ejemplo, los programas Gap o BestFit 40 (Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453; Smith y Waterman, Adv. Appl. Math 2 (1981), 482-489), que están contenidos en el paquete de software GCG (Genetic Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711 (1991). Es un método de rutina para los expertos en la técnica determinar e identificar una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que tiene por ejemplo una identidad de secuencia del 85% (el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99%) con las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos del anticuerpo 45 biespecífico de cadena sencilla individual de la invención usando por ejemplo uno de los programas mencionados anteriormente. Por ejemplo, según la hipótesis del titubeo de Crick, la base en 5’ en el anticodón no está tan confinada espacialmente como las otras dos bases, y por tanto podría tener un apareamiento de bases no convencional. Dicho de otro modo: la tercera posición en un triplete de codón puede variar de modo que dos tripletes que difieren en esta tercera posición pueden codificar para el mismo residuo de aminoácido. Dicha hipótesis la

50 conoce bien el experto en la técnica (véase por ejemplo http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis; Crick, J Mol Biol 19 (1966): 548-55).

Disposiciones de dominios preferidas en los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMAxCD3 de la invención se muestran en los siguientes ejemplos.

5

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20

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40

45

50

55

En una realización preferida de la invención, los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla son específicos entre especies para CD3 épsilon y para el antígeno de superficie celular de primate distinto de chimpancé y ser humano PSMA, reconocido por su segundo dominio de unión.

La presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla descrita anteriormente de la invención.

La presente invención también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención.

Los expertos en biología molecular conocen muchos vectores adecuados, cuya elección dependerá de la función deseada e incluyen plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados convencionalmente en ingeniería genética. Pueden usarse métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir diversos plásmidos y vectores; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (loc cit.) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, pueden reconstituirse los polinucleótidos y vectores de la invención en liposomas para su administración a las células diana. Tal como se comenta con detalle adicional a continuación, se usó un vector de clonación para aislar secuencias de ADN individuales. Pueden transferirse secuencias relevantes a vectores de expresión cuando se requiere la expresión de un polipéptido particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.

Preferiblemente dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia reguladora operativamente unida a dicha secuencia de ácido nucleico definida en el presente documento.

El término “secuencia reguladora” se refiere a secuencias de ADN, que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes a las que se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotores, sitios de unión al ribosoma y terminadores. En eucariotas generalmente las secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. El término “secuencia de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también pueden incluir componentes ventajosos adicionales.

El término “operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida para ellos. Una secuencia de control “operativamente unida” a una secuencia codificante se liga de tal manera que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control. En caso de que la secuencia de control sea un promotor, resulta obvio para un experto en la técnica que se usa preferiblemente ácido nucleico bicatenario.

Por tanto, el vector citado es preferiblemente un vector de expresión. Un “vector de expresión” es un constructo que puede usarse para transformar un huésped seleccionado y proporciona la expresión de una secuencia codificante en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser por ejemplo vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico preferiblemente en un ARNm traducible.

Los expertos en la técnica conocen bien elementos reguladores que garantizan la expresión en células procariotas y/o eucariotas. En el caso de células eucariotas, comprenden normalmente promotores que garantizan la iniciación de la transcripción y opcionalmente señales de poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor PL, lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, de SV40, de VSR (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamífero y otros animales.

Además de elementos que son responsables de la iniciación de la transcripción, tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio de poli-A de SV40 o el sitio de poli-A de tk, en el sentido de 3’ del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, pueden añadirse secuencias líder que pueden dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo en el medio, a la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico citada y se conocen bien en la técnica; véanse también los ejemplos adjuntos. La(s) secuencia(s) líder se ensambla(n) en una fase apropiada con las secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder que puede dirigir la secreción de la proteína traducida, o una parte de la misma, en el espacio periplasmático o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que confiere características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado; véase anteriormente. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA o pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 y Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) o pSPORT1 (GIBCO BRL).

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Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas de promotor eucariota en vectores que pueden transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el huésped apropiado, se mantiene el

5 huésped en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y según se desee, puede seguir la recogida y purificación de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención; véanse, por ejemplo, los ejemplos adjuntos.

Un sistema de expresión alternativo, que puede usarse para expresar una proteína de interacción en el ciclo celular es un sistema de insecto. En un sistema de este tipo, se usa virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica 10 (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico citada puede clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción satisfactoria de dicha secuencia codificante volverá el gen de la polihedrina inactivo y producirá virus recombinante que carece de proteína de la cubierta. Entonces se usan los virus recombinantes para infectar células

15 de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa la proteína de la invención (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).

Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Ventajosamente, los vectores de la invención descritos anteriormente comprenden un marcador seleccionable y/o puntuable.

20 Los genes de marcador seleccionables útiles para la selección de células transformadas y, por ejemplo, tejido vegetal y plantas los conocen bien los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, resistencia antimetabolito como base para la selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Marsh, Gene 32

25 (1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, concretamente trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomerasa que permite que las células utilicen manosa (documento WO 94/20627) y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in

30 Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

Los expertos en la técnica también conocen marcadores puntuables útiles y están comercialmente disponibles. Ventajosamente, dicho marcador es un gen que codifica para luciferasa (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o 

35 glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta realización es particularmente útil para un examen sencillo y rápido de células, tejidos y organismos que contienen un vector citado.

Tal como se describió anteriormente, la molécula de ácido nucleico citada puede usarse sola o como parte de un vector para expresar la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención en células, para purificación, por ejemplo, pero también para fines de terapia génica. Las moléculas de ácido nucleico o los vectores 40 que contienen la(s) secuencia(s) de ADN que codifica(n) para una cualquiera de las moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla de la invención descritos anteriormente se introducen en las células que producen a su vez el polipéptido de interés. La terapia génica, que se basa en introducir genes terapéuticos en células mediante técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Se describen vectores, métodos o sistemas de inserción génica adecuados para terapia génica in vitro o in vivo en la bibliografía y 45 los conoce el experto en la técnica; véanse, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documento WO 94/29469; documento WO 97/00957,

50 documento US 5.580.859; documento US 5.589.466; o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635640, dos Santos Coura and Nardi Virol J. (2007), 4:99. Las moléculas de ácido nucleico y los vectores citados pueden diseñarse para la introducción directa o para la introducción mediante liposomas o vectores virales (por ejemplo, adenovirales, retrovirales) en la célula.

La invención también prevé una célula huésped transformada o transfectada con un vector de la invención tal como

55 se describe en el presente documento. Dicha célula huésped puede producirse introduciendo el vector de la invención descrito anteriormente o la molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente en el huésped. La presencia de al menos un vector o al menos una molécula de ácido nucleico en el huésped puede mediar en la expresión de un gen que codifica para los constructos de anticuerpos de cadena sencilla descritos anteriormente.

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La molécula de ácido nucleico o el vector de la invención descritos, que se introduce en la célula huésped puede o bien integrarse en el genoma de la célula huésped o bien puede mantenerse de manera extracromosómica.

El huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota.

El término “procariota” pretende incluir todas las bacterias, que pueden transformarse o transfectarse con moléculas

5 de ADN o ARN para la expresión de una proteína de la invención. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gram negativas así como gram positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término “eucariota” pretende incluir células de levadura, plantas superiores, insectos y preferiblemente de mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, la proteína codificada por el polinucleótido de la presente invención puede ser glicosilada o puede ser

10 no glicosilada. Se prefiere especialmente el uso de un plásmido o un virus que contiene la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención y fusionado genéticamente al mismo una etiqueta FLAG N-terminal y/o una etiqueta de His C-terminal. Preferiblemente, la longitud de dicha etiqueta FLAG es de aproximadamente 4 a 8 aminoácidos, lo más preferiblemente 8 aminoácidos. Puede usarse un polinucleótido descrito anteriormente para transformar o transfectar el huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas

15 comúnmente por los expertos habituales en la técnica. Además, se conocen bien en la técnica métodos para preparar genes fusionados, operativamente unidos y expresarlos en, por ejemplo, células de mamífero y bacterias (Sambrook, loc cit.).

Preferiblemente, dicho huésped es una bacteria o una célula de insecto, fúngica, vegetal o de animal.

Se prevé particularmente que el huésped citado puede ser una célula de mamífero. Las células huésped

20 particularmente preferidas comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mieloma como SP2/0 o NS/0. Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, se prefieren particularmente células CHO como huéspedes.

Más preferiblemente, dicha célula huésped es una célula humana o línea celular humana, por ejemplo per.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168).

La presente invención se refiere por tanto a un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo

25 biespecífico de cadena sencilla de la invención, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped de la invención tal como se define en el presente documento en condiciones que permitan la expresión de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención tal como se define en el presente documento y recuperar el polipéptido producido del cultivo.

Pueden hacerse crecer los huéspedes transformados en fermentadores y cultivarse según técnicas conocidas en la

30 técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. La molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención puede aislarse entonces del medio de crecimiento, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de, por ejemplo, moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla expresados de manera microbiana puede ser mediante cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos

35 monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra una etiqueta de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención o tal como se describe en los ejemplos adjuntos.

Se sabe en la técnica que las condiciones para el cultivo de un huésped, que permiten la expresión dependen del sistema de huésped y el sistema/vector de expresión usado en tal procedimiento. Los parámetros que han de modificarse para lograr condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante se conocen en la

40 técnica. Por tanto, pueden determinarse condiciones adecuadas por el experto en la técnica en ausencia de una entrada inventiva adicional.

Una vez expresado, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención puede purificarse según procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, “Protein Purification”, Springer45 Verlag, N.Y. (1982). Se prefieren polipéptidos sustancialmente puros de una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95%, y una homogeneidad del 98 al 99% o más son los más preferidos, para usos farmacéuticos. Una vez purificada, parcialmente o hasta la homogeneidad deseada, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención puede usarse entonces de manera terapéutica (incluyendo de manera extracorpórea) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo. Además, se describen los

50 ejemplos para métodos para la recuperación de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención de un cultivo con detalle en los ejemplos adjuntos. La recuperación también puede lograrse mediante un método para el aislamiento de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención que puede unirse a un epítopo CD3 épsilon de primate distinto de chimpancé o ser humano (CD3, comprendiendo el método las etapas de:

55 (a) poner en contacto el/los polipéptido(s) con un fragmento N-terminal del dominio extracelular de CD3 de cómo máximo 27 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 341) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO. 342), fijado a través de su extremo C-terminal a una fase sólida;

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(b)

eluir el/los polipéptido(s) de unión de dicho fragmento; y

(c)

aislar el/lo polipéptido(s) del eluato (b).

Se prefiere que el/los polipéptido(s) aislado(s) mediante el método anterior de la invención sea(n) de origen humano.

Este método o el aislamiento de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención se

5 entiende como un método para el aislamiento de uno o más polipéptidos diferentes con la misma especificidad por el fragmento de dominio extracelular de CD3 que comprende en su extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 341) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO. 342) a partir de una pluralidad de polipéptidos candidatos así como un método para la purificación de un polipéptido a partir de una disolución. Como ejemplo no limitativo para este último método para la purificación de una molécula de

10 anticuerpo biespecífico de cadena sencilla a partir de una disolución es por ejemplo la purificación de una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla expresada de manera recombinante a partir de un sobrenadante de cultivo o una preparación de tal cultivo.

Tal como se estableció anteriormente el fragmento usado en este método es un fragmento N-terminal del dominio extracelular de la molécula CD3 de primates. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la molécula 15 CD3 de diferentes especies se representa en SEQ ID NO.: 1, 3, 5 y 7. Las dos formas del octámero N-terminal se representan en SEQ ID NO.: 341 y 342. Se prefiere que este extremo N-terminal esté libremente disponible para la unión de los polipéptidos que van a identificarse mediante el método de la invención. El término “libremente disponible” se entiende en el contexto de la invención como libre de motivos adicionales tales como una etiqueta de His. La interferencia de una etiqueta de His de este tipo con una molécula de unión identificada mediante el método

20 de la invención se describe en los ejemplos adjuntos 6 y 20.

Según este método, dicho fragmento se fija a través de su extremo C-terminal a una fase sólida. El experto en la técnica elegirá fácilmente y sin ninguna adición inventiva un soporte en fase sólida adecuado dependiendo de la realización usada del método de la invención. Los ejemplos de soporte sólido comprenden, pero no se limitan a, matrices como perlas (por ejemplo, perlas de agarosa, perlas de Sepharose, perlas de poliestirol, perlas de 25 dextrano), placas (placas de cultivo o placas multipocillo) así como chips conocidos, por ejemplo, de Biacore®. La selección de los medios y métodos para la fijación/inmovilización del fragmento a dicho soporte sólido dependen de la elección del soporte sólido. Un método usado comúnmente para la fijación/inmovilización es un acoplamiento a través de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). El experto en la técnica conoce la química subyacente a este acoplamiento, así como métodos alternativos para la fijación/inmovilización, por ejemplo, a partir de Hermanson 30 “Bioconjugate Techniques”, Academic Press, Inc. (1996). Para la fijación a/inmovilización sobre soportes cromatográficos se usan comúnmente los siguientes medios: Sepharose activada con NHS (por ejemplo, HiTrap-NHS de GE Life Science -Amersham), Sepharose activada con CnBr (por ejemplo, GE Life Science -Amersham), perlas de dextrano activadas con NHS (Sigma) o polimetacrilato activado. Estos reactivos también pueden usarse en un enfoque de lotes. Además, pueden usarse perlas de dextrano que comprende óxido de hierro (por ejemplo,

35 disponibles de Miltenyi) en un enfoque de lotes. Estas perlas pueden usarse en combinación con un imán para la separación de las perlas de una disolución. Los polipéptidos pueden inmovilizarse sobre un chip de Biacore (por ejemplo, chips CM5) mediante el uso de carboximetildextrano activado con NHS. Ejemplos adicionales de un soporte sólido apropiado son las placas multipocillo reactivas con amina (por ejemplo, placas Nunc Immobilizer™).

Según este método, dicho fragmento del dominio extracelular de CD3 épsilon puede acoplarse directamente al

40 soporte sólido o a través de un tramo de aminoácidos, que podría ser un ligador u otro resto de proteína/polipéptido. Alternativamente, el dominio extracelular de CD3 épsilon puede acoplarse indirectamente a través de una o más molécula adaptadoras.

En la técnica se conocen bien medios y métodos para la elución de un péptido o polipéptido unido a un epítopo inmovilizado. Lo mismo se mantiene para métodos para el aislamiento del/de los polipéptido(s) identificado(s) del

45 eluato.

Un método para el aislamiento de una o más molécula(s) de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla diferente(s) con la misma especificidad por el fragmento del dominio extracelular de CD3 que comprende en su extremo Nterminal la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly (siendo X Met o Ile) a partir de una pluralidad de polipéptidos candidatos pueden comprender una o más etapas de los métodos siguientes para la selección de

50 entidades específicas de antígeno:

Pueden seleccionarse dominios de unión específicos de CD3 de repertorios derivados de anticuerpos. Puede construirse una biblioteca de presentación en fago basándose en procedimientos convencionales, tal como se divulga, por ejemplo, en “Phage Display: A Laboratory Manual”; Ed. Barbas, Burton, Scott y Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. El formato de los fragmentos de anticuerpo de la biblioteca de anticuerpos puede ser 55 scFv, pero en general también puede ser un fragmento Fab o incluso un fragmento de anticuerpo de dominio único. Para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos pueden usarse bibliotecas de fragmentos de anticuerpos indiferenciados. Para la selección de entidades de unión potencialmente poco inmunogénicas en el uso terapéutico posterior, pueden ser favorables bibliotecas de fragmentos de anticuerpos humanos para la selección directa de

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fragmentos de anticuerpo humano. En algunos casos pueden constituir la base para bibliotecas de anticuerpos 15 sintéticos (Knappik, et al. J Mol. Biol. 2000, 296:57 ff). El formato correspondiente puede ser Fab, scFv (tal como se describe a continuación) o anticuerpos de dominio (Acd, tal como se revisó en Holt et al., Trends Biotechnol. 2003,

21:484 ff).

5 También se conoce en la técnica que en muchos casos no existe ninguna fuente de anticuerpos humanos inmunitarios disponible contra el antígeno objetivo. Por lo tanto, se inmunizan animales con el antígeno diana y las bibliotecas de anticuerpos respectivas aisladas de tejido animal tal como, por ejemplo, el bazo o PBMC. El fragmento N-terminal puede estar biotinilado o unido covalentemente a proteínas como KLH o albúmina sérica bovina (BSA). Según enfoques comunes, se usan roedores para la inmunización. Algunos repertorios de anticuerpos

10 inmunitarios de origen no humano pueden ser especialmente favorables por otros motivos, por ejemplo, por la presencia de anticuerpos de dominio único (VHH) derivados de especies de camélidos (tal como se describe en Muyldermans, J Biotechnol. 74:277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30:187 ff). Por lo tanto, un formato correspondiente de la biblioteca de anticuerpos puede ser Fab, scFv (como se describe a continuación) o anticuerpos de dominio único (VHH).

15 En un posible enfoque, pueden inmunizarse ratones F1 a partir de cruces de balb/c x C57black de diez semanas de edad con células completas, por ejemplo, que expresan EpCAM transmembrana que presenta en el extremo Nterminal como fusión traduccional los aminoácidos 1 a 27 N-terminales de la cadena CD3 madura. Alternativamente, pueden inmunizarse ratones con la proteína de fusión 1-27 CD3 épsilon-Fc (se describe un enfoque correspondiente en el ejemplo 2 adjunto). Tras inmunización(es) de refuerzo, pueden extraerse muestras de

20 sangre y puede someterse a prueba el título sérico de anticuerpos contra las células T CD3+, por ejemplo, en análisis FACS. Habitualmente, los títulos séricos son significativamente más altos en animales inmunizados que en no inmunizados.

Los animales inmunizados pueden constituir la base para la construcción de bibliotecas de anticuerpos inmunitarios. Los ejemplos de tales bibliotecas comprenden bibliotecas de presentación en fago. En general, pueden construirse

25 bibliotecas de este tipo basándose en procedimientos convencionales, tal como se da a conocer, por ejemplo, en “Phage Display: A Laboratory Manual”; Ed. Barbas, Burton, Scott y Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Los anticuerpos no humanos también pueden humanizarse a través de presentación en fagos debido a la generación de bibliotecas de anticuerpos más variables que pueden enriquecerse posteriormente para agentes de

30 unión durante la selección.

En un enfoque de presentación en fagos, cualquiera de los conjuntos de fagos que presentan las bibliotecas de anticuerpos constituye una base para seleccionar entidades de unión usando el antígeno respectivo como molécula diana. La etapa central en la que se aíslan los fagos unidos a antígeno, específicos de antígeno, se denomina cribado. Debido a la presentación de los fragmentos de anticuerpo en la superficie de los fagos, este método general 35 se denomina presentación en fagos. Un método de selección preferido es el uso de proteínas pequeñas tales como el dominio N2 del fago filamentoso traduccionalmente fusionado al extremo N-terminal del scFv presentado por el fago. Otro método de presentación conocido en la técnica, que puede usarse para aislar entidades de unión es el método de presentación en ribosomas (revisado en Groves y Osbourn, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5:125 ff; Lipovsek y Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290:52 ff). Con el fin de demostrar la unión de partículas de fagos 40 de scFv a una proteína de fusión 1-27 CD3-Fc puede recogerse una biblioteca de fagos portadores del repertorio de scFv clonado del sobrenadante de cultivo respectivo mediante PEG (polietilenglicol). Pueden incubarse partículas de fagos de scFv con proteína de fusión CD3 Fc inmovilizada. La proteína de fusión CD3 Fc inmovilizada puede recubrirse sobre una fase sólida. Pueden eluirse entidades de unión y puede usarse el eluato para la infección de huéspedes bacterianos no infectados nuevos. Los huéspedes bacterianos transducidos satisfactoriamente con una 45 copia de fagémido, que codifica para un fragmento scFv humano, pueden seleccionarse de nuevo por su resistencia a carbenicilina e infectarse posteriormente con, por ejemplo, el fago cooperador VCMS 13 para iniciar la segunda ronda de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente se lleva a cabo un total de 4 a 5 rondas de selecciones. La unión de entidades de unión aisladas puede someterse a prueba en células Jurkat CD3+ épsilon, células HPBall, PBMC o células eucariotas transfectadas portadoras de la secuencia N-terminal de CD3 fusionada

50 a la EpCAM presentada en superficie usando un ensayo de citometría de flujo (véase el ejemplo 4 adjunto).

Preferiblemente, el método anterior puede ser un método, en el que el fragmento del dominio extracelular de CD3 consiste en uno o más fragmentos de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera representada en SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8. Más preferiblemente, dicho fragmento tiene una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 residuos de aminoácido.

55 Este método de identificación de una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla puede ser un método de examen de una pluralidad de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprenden un dominio de unión específico entre especies que se une a un epítopo CD3 de primate distinto de chimpancé y ser humano. Alternativamente, el método de identificación es un método de purificación/aislamiento de una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un dominio de unión específico entre especies que se

60 une a un epítopo CD3 de primate distinto de chimpancé y ser humano.

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Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención o un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla producido mediante el procedimiento tal como se define en el presente documento.

La invención proporciona también una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en

5 el presente documento, o producido según el procedimiento tal como se define en el presente documento, en la que dicha molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla es para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora del cáncer. Preferiblemente, dicho cáncer es un tumor sólido, más preferiblemente un carcinoma o cáncer de próstata. Se prefiere que la cadena sencilla biespecífica comprenda además formulaciones adecuadas de portadores, estabilizadores y/o excipientes. Además, se prefiere que dicha molécula de anticuerpo biespecífico de

10 cadena sencilla sea adecuado para administrarse en combinación con un fármaco adicional. Dicho fármaco puede ser un compuesto no proteico o un compuesto proteico y puede administrarse de manera simultánea o no con la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento.

Según la invención, el término “composición farmacéutica” se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica preferida particular de esta invención 15 comprende anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra y generados contra epítopos CD3 independientes del contexto. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de portadores, estabilizadores y/o excipientes. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o mediante inyección directa en el tejido. Se prevé en particular que dicha composición se administre a un paciente a 20 través de infusión o inyección. Puede efectuarse la administración de las composiciones adecuadas de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En particular, la presente invención prevé una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como ejemplo no limitativo, la administración ininterrumpida, es decir continua puede realizarse mediante un pequeño sistema de bomba que lleva puesto el paciente para dosificar el flujo de entrada de agente terapéutico 25 en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra y generados contra epítopos CD3 independientes del contexto de la invención puede administrarse usando dichos sistemas de bomba. Tales sistemas de bomba se conocen generalmente en la técnica, y comúnmente se basan en el cambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que va a infundirse. Cuando se cambia el cartucho en un sistema de bomba de este tipo, puede seguir una interrupción

30 temporal del flujo por lo demás ininterrumpido de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. En tal caso, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración tras el reemplazo del cartucho se considerarían todavía dentro del significado de los medios farmacéuticos y métodos de la invención componen conjuntamente una “administración ininterrumpida” de tal agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de estos anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra y

35 generados contra epítopos CD3 independientes del contexto de esta invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de administración de fluido o pequeño sistema de bomba que incluye un mecanismo de conducción de fluidos para conducir fluido fuera de un depósito y un mecanismo de accionamiento para accionar el mecanismo de conducción. Los sistemas de bomba para la administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar en la piel de un paciente y suministrar la composición adecuada en el cuerpo del paciente.

40 Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o adherirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo de ese modo un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba puede fijarse a la piel del paciente durante de 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de pequeño tamaño con un depósito para pequeños volúmenes. Como ejemplo no limitativo, el volumen del depósito para que se administre la composición farmacéutica adecuada puede ser de entre

45 0,1 y 50 ml.

La administración continua puede ser transdérmica por medio de un parche puesto sobre la piel y reemplazado a intervalos. Un experto en la técnica conoce sistemas de parche para la administración de fármacos adecuados para este fin. Ha de observarse que la administración transdérmica es especialmente propicia para la administración ininterrumpida, ya que puede lograrse ventajosamente el cambio de un primer parche agotado de manera

50 simultánea a la colocación de un nuevo, segundo parche, por ejemplo en la superficie de la piel de manera inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de la retirada del primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o fallo de pilas.

La composición de la presente invención, que comprende en particular anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra y generados contra epítopos CD3 independientes del contexto pueden comprender además un 55 portador farmacéuticamente aceptable. Se conocen bien en la técnica ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados e incluyen disoluciones, por ejemplo soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, liposomas, etc. Pueden formularse composiciones que comprenden tales portadores mediante métodos convencionales bien conocidos. Las formulaciones pueden comprender hidratos de carbono, disoluciones tampón, aminoácidos y/o 60 surfactantes. Los hidratos de carbono pueden ser azúcares no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol. Tales formulaciones pueden usarse para administraciones continuas que pueden ser intravenosas o subcutáneas con y/o sin sistemas de bomba. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina. Los surfactantes pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular de >1,2 KD y/o un poliéter, preferiblemente con un peso molecular de >3 KD. Ejemplos no limitativos de detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 o Tween 85. Ejemplos no limitativos de poliéteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 o PEG 5000. Los sistemas 5 tampón usados en la presente invención pueden tener un pH preferido de 5-9 y pueden comprender citrato, succinato, fosfato, histidina y acetato. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada que puede determinarse por ejemplo mediante estudios de ampliación de dosis mediante la administración de dosis crecientes de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención que presentan especificidad entre especies descrita en el presente documento a primates distintos de chimpancé, por ejemplo macacos. Tal como se expuso anteriormente, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención que presenta especificidad entre especies descrita en el presente documento puede usarse ventajosamente en forma idéntica en pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancé y como fármaco en seres humanos. Estas composiciones también pueden administrarse en combinación con otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse de manera simultánea a la composición que comprende la 15 molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención tal como se define en el presente documento

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o por separado antes o después de la administración de dicho polipéptido en dosis e intervalos definidos oportunamente. El régimen de dosificación lo determinará el médico encargado y factores clínicos. Tal como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño, el área superficial corporal, la edad del paciente, el compuesto particular que vaya a administrarse, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general, y otros fármacos que estén administrándose de manera concurrente. Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, 25 incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, Ringer con dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactado, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen agentes de reposición de fluidos y nutrientes, agentes de reposición de electrolitos (tales como los basados en Ringer con dextrosa), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición de la presente invención podría comprender portadores proteicos, como, por ejemplo, albúmina sérica o inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano. Se prevé que la composición de la invención podría comprender, además de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención definida en el presente documento, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Tales agentes podrían ser fármacos que actúan sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que

35 previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben reacciones inmunológicas (por ejemplo, corticosteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidas en la técnica.

La actividad biológica de la composición farmacéutica definida en el presente documento puede determinarse por ejemplo mediante ensayos de citotoxicidad, tal como se describen en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schleret et alin vivo” tal como se usan en el presente documento se refiere a la respuesta a la terapia mediante la composición farmacéutica de la invención, usando por ejemplo criterios de respuesta del NCI normalizados. El éxito o la eficacia in vivo de la terapia usando una composición farmacéutica de la invención se refiere a la efectividad de la composición para su fin pretendido, es decir la capacidad de la composición para producir su efecto deseado, es decir reducción de 45 células patológicas, por ejemplo células tumorales. La eficacia in vivo puede monitorizarse mediante métodos convencionales establecidos para las entidades de enfermedad respectivas incluyendo, pero sin limitarse a recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, pueden usarse diversos parámetros de bioquímica clínica específicos de enfermedad y otros métodos convencionales establecidos. Además, pueden usarse tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo para la evaluación de la respuesta basada en los criterios del Instituto Nacional del Cáncer [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connores JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for no Hodgkin’s lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), exploración

55 mediante tomografía de emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/histologías de ganglios linfáticos, y diversos parámetros de bioquímica clínica específicos de cáncer (por ejemplo lactato deshidrogenasa) y otros métodos convencionales establecidos.

Otro reto importante en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para ello, se establece un perfil farmacocinético del candidato a fármaco, es decir un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco particular para tratar un estado dado. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco para tratar una determinada entidad de enfermedad incluyen, pero no se limitan a: semivida, volumen de distribución, metabolismo hepático de primer paso y el grado de unión a suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede verse influida por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.

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“Semivida” significa el tiempo en el que se elimina el 50% de un fármaco administrado a través de procesos biológicos, por ejemplo metabolismo, excreción, etc.

Por “metabolismo hepático de primer paso” quiere decirse la propensión de un fármaco a metabolizarse tras el 5 primer contacto con el hígado, es decir durante su primer paso a través del hígado.

“Volumen de distribución” significa el grado de retención de un fármaco en la totalidad de los diversos compartimentos del cuerpo, como por ejemplo espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos.

“Grado de unión a suero sanguíneo” significa la propensión de un fármaco a interaccionar con y unirse a proteínas

10 del suero sanguíneo, tales como albúmina, lo que conduce a una reducción o pérdida de actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de demora (Tdemora), Tmáx, tasas de absorción, más el inicio y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrado.

“Biodisponibilidad” significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo.

15 “Tiempo de demora” significa la demora temporal entre la administración del fármaco y su detección y capacidad de medición en sangre o plasma.

“Tmáx” es el tiempo después de que se alcanza la concentración máxima en sangre del fármaco, y “Cmáx” es la concentración en sangre obtenida de manera máxima con un fármaco dado. El tiempo hasta alcanzar una concentración en sangre o tejido del fármaco que se requiere para su efecto biológico se ve influido por todos los

20 parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que presentan especificidad entre especies, que pueden determinarse en pruebas preclínicas en animales en primates distintos de chimpancé tal como se describió de forma breve anteriormente también se exponen por ejemplo en la publicación de Schleret et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 -12).

El término “toxicidad” tal como se usa en el presente documento se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco

25 manifestados en acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves. Estos acontecimientos secundarios podrían referirse a la falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos provocados por el fármaco.

El término “seguridad”, “seguridad in vivo” o “tolerabilidad” tal como se usa en el presente documento define la

30 administración de un fármaco sin inducir acontecimientos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un periodo de aplicación más prolongado del fármaco. La “seguridad”, “seguridad in vivo” o “tolerabilidad” pueden evaluarse por ejemplo a intervalos regulares durante el tratamiento y el periodo de seguimiento. Las mediciones incluyen evaluación clínica, por ejemplo manifestaciones orgánicas, y detección de anomalías de laboratorio. La evaluación clínica puede llevarse a cabo y registrarse/codificarse la

35 desviación con respecto a los hallazgos normales según los criterios de NCICTC y/o MedDRA. Las manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tal como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardiaca, coagulación y similares, tal como se expone por ejemplo en los Criterios Comunes de Terminología para acontecimientos adversos v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden someterse a prueba incluyen por ejemplo hematología, bioquímica clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros líquidos corporales tales como suero,

40 plasma, líquido linfoide o cefalorraquídeo, líquido intervalvular y similares. Por tanto, puede evaluarse la seguridad por ejemplo mediante examen físico, técnicas de obtención de imágenes (es decir ecografía, radiografía, exploraciones mediante TC, obtención de imágenes mediante resonancia magnética (IRM), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, mediante la medición de parámetros de laboratorio y el registro de acontecimientos adversos. Por ejemplo, pueden examinarse los acontecimientos

45 adversos en primates distintos de chimpancé en los usos y métodos según la divulgación mediante métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

El término “dosis eficaz y no tóxica” tal como se usa en el presente documento se refiere a una dosis tolerable del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento que es lo suficientemente alta como para producir la reducción de células patológicas, eliminación de tumores, contracción de tumores o

50 estabilización de enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Tales dosis eficaces y no tóxicas pueden determinarse por ejemplo mediante estudios de ampliación de dosis descritos en la técnica y deben estar por debajo de la dosis que induce acontecimientos secundarios adversos graves (dosis limitante de toxicidad, DLT).

También se hace referencia a los términos anteriores por ejemplo en the Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting

55 de 16 de julio de 1997.

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Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de esta invención o producida según el procedimiento según la invención para la prevención, el tratamiento o la mejora del cáncer. Preferiblemente, dicho cáncer es un tumor sólido, preferiblemente un carcinoma o cáncer de próstata. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica comprende además

5 formulaciones adecuadas de portadores, estabilizadores y/o excipientes.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla/polipéptido tal como se definió anteriormente en el presente documento o producida según un procedimiento definido anteriormente en el presente documento, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad. Preferiblemente, dicha enfermedad es cáncer. Más

10 preferiblemente, dicho cáncer es un tumor sólido, preferiblemente un carcinoma o cáncer de próstata.

En otra realización preferida de uso de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención dicha composición farmacéutica es adecuada para administrarse en combinación con un fármaco adicional, es decir como parte de coterapia. En dicha coterapia, puede incluirse opcionalmente un agente activo en la misma composición farmacéutica que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, o puede 15 incluirse en una composición farmacéutica diferente. En este último caso, dicha composición farmacéutica diferente es adecuada para su administración antes de, simultáneamente o después de la administración de dicha composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención. El fármaco o la composición farmacéutica adicional puede ser un compuesto no proteico o un compuesto proteico. En el caso de que el fármaco adicional sea un compuesto proteico, es ventajoso que el compuesto proteico pueda

20 proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias.

Preferiblemente, dicho compuesto proteico o compuesto no proteico puede administrarse de manera simultánea o no con la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, una molécula de ácido nucleico tal como se definió anteriormente en el presente documento, un vector tal como se definió anteriormente en el presente documento, o un huésped tal como se definió anteriormente en el presente documento.

25 Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad en un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, dicha enfermedad es cáncer. Preferiblemente, dicho cáncer es un tumor sólido, preferiblemente un carcinoma o cáncer de próstata.

En otra realización preferida de la composición farmacéutica para su uso tal como se describió anteriormente, dicha

30 composición farmacéutica es adecuada para administrarse en combinación con un fármaco adicional, es decir como parte de una coterapia. En dicha coterapia, puede incluirse opcionalmente un agente activo en la misma composición farmacéutica que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, o puede incluirse en una composición farmacéutica diferente. En este último caso, dicha composición farmacéutica diferente es adecuada para su administración antes de, simultáneamente o después de la administración de dicha

35 composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención. El fármaco o composición farmacéutica adicional puede ser un compuesto no proteico o un compuesto proteico. En el caso de que el fármaco adicional sea un compuesto proteico, es ventajoso que el compuesto proteico pueda proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias.

Preferiblemente, dicho compuesto proteico o compuesto no proteico puede administrarse de manera simultánea o

40 no simultánea con la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, una molécula de ácido nucleico tal como se definió anteriormente en el presente documento, un vector tal como se definió anteriormente en el presente documento, o un huésped tal como se definió anteriormente en el presente documento.

Se prefiere para la composición farmacéutica descrita anteriormente para su uso tal como se describió anteriormente que dicho sujeto sea un ser humano.

45 En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit que comprende una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de la invención o una célula huésped de la invención.

Estas y otras realizaciones se dan a conocer y están englobadas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Se describen técnicas y métodos recombinantes en inmunología por ejemplo en Sambrook et al. 50 Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Puede recuperarse bibliografía adicional referente a uno cualquiera de los anticuerpos, métodos, usos y compuestos que van a emplearse según la presente invención de bibliotecas y bases de datos públicas, usando por ejemplo dispositivos 55 electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública “Medline”, disponible en Internet, puede utilizarse, por ejemplo en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Además las bases de datos y direcciones tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ o enumeradas en la página inicial de EMBL-services en http://www.embl.de/services/index.html las conoce el experto en la técnica y también pueden obtenerse usando, por

imagen20

ejemplo, http://www.google.com.

Las figuras muestran:

Figura 1

Fusión de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de primate a una proteína soluble heteróloga.

5 Figura 2

La figura muestra los valores de absorción promedio de muestras por cuadruplicado medidos en un ensayo ELISA de detección de la presencia de un constructo que consiste en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura fusionados a la parte de bisagra y gamma Fc de lgG1 humana y una etiqueta de 6 histidinas C-terminal en un sobrenadante de células 293 transfectadas de forma transitoria. La primera columna etiquetada “27

10 aa huCD3Ε” muestra el valor promedio de la absorción para el constructo, la segunda columna etiquetada “SN no pert.” muestra el valor promedio para un sobrenadante de células 293 transfectadas con un constructo no pertinente como control negativo. La comparación de los valores obtenidos para el constructo con los valores obtenidos para el control negativo demuestra claramente la presencia del constructo recombinante.

Figura 3

15 La figura muestra los valores de absorción promedio de muestras por cuadruplicado medidos en un ensayo ELISA de detección de la unión de las moléculas de unión anti-CD3 específicas entre especies en forma de preparaciones en bruto de anticuerpos de cadena sencilla expresados en el periplasma frente a un constructo comprende los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura fusionados a la parte de bisagra y gamma Fc de la IgG1 humana y una etiqueta de 6 His C-terminal. Las columnas muestran, de izquierda a derecha,

20 los valores de absorción promedio para las especificidades denominadas A2J HLP, I2C HLP, E2M HLP, F7O HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1L HLP, F12Q HLP, F6A HLP y H1E HLP. La columna más a la derecha etiquetada “contr. neg.” muestra el valor de absorción promedio para la preparación de cadena sencilla de un anticuerpo murino anti-CD3 humano como control negativo. La comparación de los valores obtenidos para las especificidades anti-CD3 con los valores obtenidos para el control negativo demuestra claramente la unión fuerte de las especificidades anti-CD3

25 a los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura.

Figura 4

Fusión de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de primate a una proteína unida a membrana heteróloga.

Figura 5

30 Solapamientos de histograma de diferentes transfectantes sometidos a prueba en un ensayo FACS de detección de la presencia de proteínas de fusión transmembrana recombinantes que consisten en EpCAM de cinomolgo y los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino, mono ardilla y cerdo doméstico, respectivamente. Los solapamientos de histograma, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan los constructos que comprenden el 27 mero humano, el 27 mero de

35 tití, el 27 mero de tamarino, el 27 mero de mono ardilla y el 27 mero de cerdo, respectivamente. En los solapamientos individuales, la línea delgada representa una muestra incubada con PBS con FCS al 2 % en lugar de anticuerpo anti-Flag M2 como control negativo y la línea en negrita representa una muestra incubada con el anticuerpo anti-Flag M2. Para cada constructo, el solapamiento de histogramas muestra la unión del anticuerpo anti-Flag M2 a los transfectantes, lo que demuestra claramente la expresión de los constructos recombinantes en los

40 transfectantes.

Figura 6

Solapamientos de histograma de diferentes transfectantes sometidos a prueba en un ensayo FACS de detección de la unión de moléculas de unión anti-CD3 específicas entre especies en forma de preparaciones en bruto de anticuerpos de cadena sencilla expresados en el periplasma frente a los aminoácidos 1-27 N-terminales de la

45 cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino y mono ardilla, respectivamente, fusionados a EpCAM de cinomolgo.

Figura 6A:

Los solapamientos de histograma, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero humano sometida a prueba con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

50 Figura 6B:

Los solapamientos de histograma, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de tití sometida a prueba con las

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

Figura 6C:

Los solapamientos de histograma, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de tamarino sometida a prueba con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

Figura 6D:

Los solapamientos de histograma, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de mono ardilla sometida a prueba con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

Figura 6E:

Los solapamientos de histograma, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de cerdo sometida a prueba con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

En los solapamientos individuales, la línea delgada representa una muestra incubada con una preparación de cadena sencilla de un anticuerpo murino anti-CD3 humano como control negativo y la línea en negrita muestra una muestra incubada con las moléculas de unión anti-CD3 respectivas indicadas. Teniendo en cuenta la falta de unión a los transfectantes con 27 mero de cerdo y los niveles de expresión de los constructos mostrados en la figura 5, los solapamientos de los histogramas muestran unión específica y fuerte de las especificidades anti-CD3 sometidas a prueba de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla humanos con total especificidad entre especies a células que expresan las proteínas de fusión transmembrana recombinantes que comprenden los aminoácidos 1-27 Nterminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino y mono ardilla, respectivamente, fusionados a EpCAM de cinomolgo y, por lo tanto, muestran las especificidad entre especies de múltiples primates de las moléculas de unión anti-CD3.

Figura 7

Ensayo FACS para la detección de CD3 épsilon humana en células T EL4 murinas transfectadss. El análisis gráfico muestra un solapamiento de histogramas. La línea en negrita muestra células transfectadas incubadas con el anticuerpo anti-CD3 humano UCHT-1. La línea delgada representa células incubadas con un control de isotipo de IgG1 murina. La unión del anticuerpo anti-CD3 UCHT1 muestra claramente la expresión de la cadena CD3 épsilon humana en la superficie celular de células T EL4 murinas transfectadas.

Figura 8

Unión de anticuerpos anti-CD3 específicos entre especies a mutantes de alanina en un experimento de barrido de alanina. En las figuras individuales, las columnas muestran, de izquierda a derecha, los valores de unión calculados en unidades arbitrarias de escala logarítmica para el transfectante silvestre (WT) y para todos los mutantes de alanina, de la posición 1 a la 27. Los valores de unión se calculan usando la fórmula siguiente:

Muestra(x,y) Contr._neg(x)valor _muestra(x,y) WT (y) Contr._neg(wt)(UCHT 1(x) Contr._neg(x))* UCHT 1(wt) Cont._neg(wt)

En esta ecuación valor_muestra significa el valor en unidades arbitrarias de unión que representa el grado de unión de un anticuerpo anti-CD3 específico a un mutante de alanina específico tal como se muestra en la figura, Muestra significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico sometido a ensayo en un transfectante de barrido de alanina específico, Contr._neg significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el control negativo sometido a ensayo en un mutante de alanina específico, UCTH-1 significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el anticuerpo UCHT-1 sometido a ensayo en un mutante de alanina específico, WT significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico sometido a ensayo en el transfectante silvestre, x especifica el transfectante respectivo, y especifica el anticuerpo anti-CD3 respectivo y wt especifica que el transfectante respectivo es el silvestre. Las posiciones de mutantes de alanina individuales se etiquetan con el código de una sola letra del aminoácido natural y el número de la posición.

Figura 8A:

La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico entre especies A2J HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa actividad de unión reducida para mutaciones a alanina en la posición 4 (asparagina), en la posición 23 (treonina) y en la posición 25 (isoleucina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones a alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

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Figura 8B:

5 La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico entre especies E2M HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa actividad de unión reducida para mutaciones a alanina en la posición 4 (asparagina), en la posición 23 (treonina) y en la posición 25 (isoleucina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones a alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

10 Figura 8C:

La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico entre especies H2C HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa actividad de unión reducida para mutaciones a alanina en la posición 4 (asparagina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones a alanina de glutamina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

15 Figura 8D:

Muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico entre especies F12Q HLP, sometido a prueba como anticuerpo de cadena sencilla expresado en el periplasma. Se observa una pérdida total de unión para mutaciones a alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

20 Figura 9

Ensayo FACS de detección de la unión de la molécula de unión anti-CD3 específica entre especies H2C HLP a CD3 humano con y sin etiqueta de 6 His N-terminal.

Se realizan solapamientos de histograma de la línea celular EL4 transfectada con la cadena CD3 épsilon humana silvestre (histograma de la izquierda) o la cadena CD3 épsilon humana con una etiqueta de 6 His N-terminal

25 (histograma de la derecha) sometida a prueba en un ensayo FACS de detección de la unión de la molécula de unión específica entre especies H2C HLP. Las muestras se incuban con un control de isotipo apropiado como control negativo (línea delgada), con el anticuerpo anti-CD3 humano UCHT-1 como control positivo (línea discontinua) y con el anticuerpo anti-CD3 específico entre especies H2C HLP en forma de molécula de IgG quimérica (línea gruesa).

Los solapamientos de histograma muestran una unión comparable del anticuerpo UCHT-1 a ambos transfectantes

30 en comparación con el control de isotipo, lo que demuestra la expresión de ambos constructos recombinantes. Los solapamientos de histograma también muestran la unión de la molécula de unión anti-CD3 H2C HLP sólo a la cadena CD3 épsilon humana silvestre, pero no a la cadena CD3 épsilon humana con 6 His. Estos resultados demuestran que un extremo N-terminal libre es esencial para la unión de la molécula de unión anti-CD3 específica entre especies H2C HLP.

35 Figura 10

Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cinomolgo y una línea de células T de macaco 4119 LnPx. La tinción FACS se realiza tal como se describe en el ejemplo 10. La línea gruesa representa células incubadas con 2 g/ml de proteína

40 purificada que se incuban posteriormente con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea delgada del histograma refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.

Figura 11

Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados a

45 células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cinomolgo y una línea de células T de macaco 4119 LnPx. La tinción FACS se realiza tal como se describe en el ejemplo 10. La línea gruesa representa células incubadas con 2 g/ml de proteína purificada que se incuban posteriormente con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea delgada del histograma refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpo anti-His y el

50 anticuerpo de detección.

Figura 12

Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cinomolgo y una línea de células T de macaco 4119 LnPx. La tinción FACS se realiza tal como se describe en el ejemplo 10. La línea gruesa representa células incubadas con 2 g/ml de proteína monomérica purificada que se incuban posteriormente con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea delgada del histograma refleja el control negativo: células incubadas sólo con el

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5 anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.

Figura 13

Actividad de citotoxicidad inducida por constructos de cadena sencilla específicos de MCSP específicos entre especies designados redirigidos a líneas celulares diana indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células diana. B) Se

10 usa la línea de células T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cinomolgo como células diana. El ensayo se realiza tal como se describe en el ejemplo 11.

Figura 14

Actividad de citotoxicidad inducida por constructos de cadena sencilla específicos de MCSP específicos entre especies designados redirigidas a líneas celulares diana indicadas. A) y B) Se usa la línea de células T de macaco

15 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cinomolgo como células diana. El ensayo se realiza tal como se describe en el ejemplo 11.

Figura 15

Actividad de citotoxicidad inducida por constructos de cadena sencilla específicos de MCSP específicos entre especies designados redirigidos a líneas celulares diana indicadas. A) y B) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56

20 estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células diana. El ensayo se realiza tal como se describe en el ejemplo 11.

Figura 16

Actividad de citotoxicidad inducida por constructos de cadena sencilla específicos de MCSP específicos entre especies designados redirigidos a líneas celulares diana indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56

25 estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células diana. B) Se usa la línea de células T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células diana. El ensayo se realiza tal como se describe en el ejemplo 11.

Figura 17

Actividad de citotoxicidad inducida por constructos de cadena sencilla específicos de MCSP específicos entre

30 especies designados redirigidos a líneas celulares diana indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células diana. B) Se usa la línea de células T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células diana. El ensayo se realiza tal como se describe en el ejemplo 11.

Figura 18

35 Estabilidad en plasma de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies frente a MCSP y CD3 sometida a prueba mediante la medición de la actividad de citotoxicidad inducida por muestras de los constructos de cadena sencilla designados incubados con el 50% de plasma humano a 37ºC y a 4ºC durante 24 horas, respectivamente, o con la adición del 50% de plasma humano inmediatamente antes de las pruebas de citotoxicidad o sin la adición de plasma. Se usan células CHO transfectadas con MCSP humana como línea de

40 células diana y se usan PBMC humanas CD4-/CD56-como células efectoras. El ensayo se realiza tal como se describe en el ejemplo 12.

Figura 19

Disminución y recuperación iniciales (es decir redistribución) de recuentos absolutos de células T (cuadrados en blanco), en sangre periférica de pacientes con B-NHL (números de pacientes 1, 7, 23, 30, 31 y 33 de la tabla 4), que

45 no tenían esencialmente células B diana positivas para CD19 circulantes (triángulos coloreados), durante la fase inicial de infusión intravenosa con la molécula de unión a CD3, CD19xCD3, que reconoce un contexto convencional dependiente de epítopo CD3. Se facilitan recuentos absolutos de células en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de nivel inicial inmediatamente antes del comienzo de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se facilita entre paréntesis junto al número de paciente.

50 Figura 20

(A) Redistribución de células T repetida (cuadrados en blanco) en el paciente con B-NHL n.º 19 (tabla 4) que no tenía células B diana positivas para CD19 circulantes (triángulos coloreados) y desarrolló síntomas en el SNC con infusión intravenosa continua con CD19xCD3 a una dosis inicial de 5 g/m2/24 h durante un día seguido por un aumento repentino de dosis hasta 15 g/m2/24 h. Los recuentos absolutos de células se facilitan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra los recuentos de nivel inicial inmediatamente antes del comienzo de la infusión. Tras la recuperación de células T circulantes del primer episodio de redistribución desencadenado por el comienzo del tratamiento a 5 g/m2/24 h el aumento gradual de la dosis desde 5 hasta

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5 15 g/m/24 h desencadenó un segundo episodio de redistribución de células T que se asoció con el desarrollo de síntomas en el SNC dominados por confusión y desorientación.

(B) Redistribución de células T repetida en un paciente con B-NHL, que desarrolló síntomas en el SNC con infusión en bolo intravenosa repetida con CD19xCD3 a 1,5 g/m2. Los recuentos absolutos de células se facilitan en 1000 células por microlitro de sangre. El tiempo de infusión para cada administración en bolo fue de 2 a 4 horas. Las

10 flechas verticales indican el comienzo de las infusiones en bolo. Los puntos de datos al inicio de cada administración en bolo muestran los recuentos de células T inmediatamente antes del comienzo de la infusión en bolo. Cada infusión en bolo desencadenó un episodio de redistribución de células T seguido por recuperación de los recuentos de células T antes de la siguiente infusión en bolo. Finalmente el tercer episodio de redistribución de células T se asoció con el desarrollo de síntomas en el SNC en este paciente.

15 Figura 21

Patrón complejo de redistribución de células T (cuadrados en blanco) en el paciente con B-NHL n. º 20 (tabla 4) sin células B diana positivas para CD19 circulantes (triángulos coloreados), durante el inicio en rampa de la infusión de CD19xCD3 es decir con el aumento gradual uniforme de la velocidad de flujo desde casi cero hasta 15 g/m2/24 h durante las primeras 24 horas de tratamiento. Los recuentos absolutos de células se facilitan en 1000 células por

20 microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra los recuentos de nivel inicial inmediatamente antes del comienzo de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se facilita entre paréntesis junto al número de paciente. Las células T que reaparecen en la sangre circulante tras la redistribución inicial desencadenada por la primera exposición a CD19xCD3 se inducen parcialmente a volver a desaparecer de nuevo de la sangre circulante aumentando todavía los niveles de CD19xCD3 durante la fase de rampa.

25 Figura 22

Recuentos de células T y B durante el tratamiento con CD19xCD3 del paciente con B-NHL n.º 13 (tabla 4) que tenía un número significativo de células B diana positivas para CD19 circulantes (linfoma) (triángulos coloreados). Los recuentos absolutos de células se facilitan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra los recuentos de nivel inicial inmediatamente antes del comienzo de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se

30 facilita entre paréntesis junto al número de paciente. Las células T (cuadrados en blanco) desaparecen completamente de la circulación con el comienzo de la infusión de CD19xCD3 y no reaparecen hasta que se reducen las células B positivas para CD19 circulantes (linfoma) (triángulos coloreados) de la sangre periférica.

Figura 23

Redistribución de células T repetida (cuadrados en blanco) en el paciente con B-NHL n.º 24 (tabla 4), que

35 esencialmente no tenía células B diana positivas para CD19 circulantes (triángulos coloreados) y desarrolló síntomas en el SNC con el inicio de la infusión de CD19xCD3 sin HSA adicional tal como se requiere para la estabilización del fármaco (panel superior). Tras la primera recuperación de células T circulantes de la redistribución inicial, el flujo de fármaco irregular debido a la falta de HSA de estabilización desencadenó un segundo episodio de redistribución de células T que se asoció con el desarrollo de síntomas en el SNC dominados por confusión y

40 desorientación. Cuando se reanudó en el mismo paciente correctamente la disolución de CD19xCD3 que contenía HSA adicional para la estabilización del fármaco, no se observó redistribución de células T repetida (panel inferior) y el paciente no desarrolló de nuevo ningún síntoma en el SNC. Los recuentos absolutos de células se facilitan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra los recuentos de nivel inicial inmediatamente antes del comienzo de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se facilita entre paréntesis junto al número de paciente.

45 Figura 24

Modelo de adhesión de células T a células endoteliales inducida por unión monovalente a epítopos de CD3 dependientes del contexto. La interacción monovalente de una molécula de unión de CD3 convencional a su epítopo dependiente del contexto en CD3 épsilon puede conducir a un cambio alostérico en la conformación de CD3 seguido por el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplasmático de CD3 épsilon (Gil et al. (2002) Cell 109: 901). Puesto que 50 Nck2 se une directamente a integrinas a través de PINCH y ILK (Legate et al. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7: 20), el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplasmático de CD3 épsilon tras un cambio alostérico en la conformación de CD3 a través de la unión de una molécula de unión de CD3 convencional (como CD19xCD3 del ejemplo 13) a su epítopo dependiente del contexto en CD3 épsilon, puede aumentar la capacidad de adhesión de las células T a células endoteliales cambiando de manera transitoria las integrinas sobre la superficie de las células T por su

55 isoforma más adhesiva a través de señalización dentro-fuera.

Figura 25

Actividad citotóxica del material de prueba CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL usado para el estudio in vivo en monos cinomolgos tal como se describe en el ejemplo 14. Se determinó la lisis específica de células diana positivas para CD33 en un ensayo de liberación de 51Cromo convencional a concentraciones crecientes de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL. La duración del ensayo fue de 18 horas. Se usó la línea de células T de macaco 4119 LnPx como fuente de células efectoras. Células CHO transfectadas con CD33 de cinomolgo sirvieron como células diana. La razón de

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5 células efectoras con respecto a diana (razón E:T) fue de 10:1. Se calculó la concentración de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL requerida para la mitad de la lisis máxima de las células diana (CE50) a partir de la curva de respuesta a la dosis con un valor de 2,7 ng/ml.

Figura 26

(A) Reducción dependiente de la dosis y del tiempo de monocitos positivos para CD33 de la sangre periférica de

10 monos cinomolgos a través de infusión continua intravenosa de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL tal como se describe en el ejemplo 14. Se muestra el porcentaje en relación con el nivel inicial (es decir el 100%) de recuentos de monocitos positivos para CD33 circulantes absolutos tras la duración de tratamiento tal como se indica en la parte superior de las columnas para cada uno de dos monos cinomolgos por nivel de dosis. El nivel de dosis (es decir la velocidad de flujo de infusión) se indica debajo de las columnas. No se observó reducción de monocitos positivos

15 para CD33 circulantes en los animales 1 y 2 tratados durante 7 días a una dosis de 30 g/m2/24 h. En los animales 3 y 4 tratados durante 7 días a una dosis de 60 g/m2/24 h se redujeron los recuentos de monocitos positivos para CD33 circulantes hasta el 68% y el 40% del nivel inicial, respectivamente. A 240 g/m2/24 h, los monocitos positivos para CD33 circulantes se habían reducido casi completamente de la sangre periférica tras 3 días de tratamiento (animales 5 y 6). A 1000 g/m2/24 h la reducción de monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre

20 periférica se completó ya tras 1 día de tratamiento (animales 7 y 8).

(B) Curso de recuentos de células T y monocitos CD33 en sangre periférica de dos monos cinomolgos durante infusión continua de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL durante 14 días a 120 g/m2/24 h. Los recuentos absolutos de células se facilitan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra los recuentos de nivel inicial inmediatamente antes del comienzo de la infusión. Tras la movilización inicial de monocitos CD33 durante las

25 primeras 12 horas tras el comienzo de la infusión, los monocitos CD33 en sangre periférica (triángulos coloreados) se reducen en dos tercios (animal 10) y en el 50% (animal 9) en relación con los recuentos de nivel inicial respectivos durante el transcurso adicional de la infusión. Los recuentos de células T circulantes (cuadrados en blanco) muestran una disminución inicial limitada seguida todavía por recuperación durante la presencia de células diana monocíticas positivas para CD33 circulantes.

30 Figura 27

Actividad citotóxica del material de prueba de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL usado para el estudio in vivo en monos cinomolgos tal como se describe en el ejemplo 15. Se determinó la lisis específica de células diana positivas para MCSP en un ensayo de liberación de 51Cromo convencional a concentraciones crecientes de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL. La duración del ensayo fue de 18 horas. Se usó la línea de células T de macaco 4119 LnPx como fuente de

35 células efectoras. Células CHO transfectadas con MCSP de cinomolgo sirvieron como células diana. La razón de células efectoras con respecto a diana (razón de E:T) fue de 10:1. Se calculó la concentración de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL requerida para la mitad de la lisis máxima de las células diana (CE50) a partir de la curva de respuesta a la dosis con un valor de 1,9 ng/ml.

Figura 28

40 Ausencia de episodios iniciales de disminución y recuperación posterior de recuentos absolutos de células T (es decir redistribución) en sangre periférica de monos cinomolgos durante la fase inicial de infusión intravenosa con la molécula de unión a CD3 MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL que reconoce un epítopo CD3 esencialmente independiente del contexto. Los recuentos absolutos de células se facilitan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra los recuentos de nivel inicial inmediatamente antes del comienzo de la infusión. La

45 dosis de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL se facilita entre paréntesis junto al número de paciente. En la ausencia conocida de células diana positivas para MCSP de la sangre circulante de monos cinomolgos no hay inducción de redistribución de células T (es decir un episodio inicial de disminución y recuperación posterior de recuentos absolutos de células T) a través de reticulación mediada por células diana de CD3. Además, la inducción de redistribución de células T (es decir un episodio inicial de disminución y recuperación posterior de recuentos

50 absolutos de células T) a través de una señal, que las células T pueden recibir a través de la interacción exclusiva con un sitio de unión a CD3 únicamente, puede evitarse mediante el uso de moléculas de unión a CD3 como MCSP-G4 VHVL x I2C VH-VL que reconocen un epítopo CD3 esencialmente independiente del contexto.

Figura 29

Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos específicos entre especies designados a células CHO

55 transfectadas con CD33 humano, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas con CD33 de macaco y PBMC de macaco respectivamente. La tinción de FACS se realiza tal como se describe en el ejemplo 16.4. Las líneas en negrita representan células incubadas con 5 g/ml de constructo biespecífico de cadena sencilla purificado o sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos específicos entre especies. Los histogramas rellenos reflejan los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a CD33 humano y de macaco y a CD3 humano y de macaco.

imagen26

5 Figura 30

Los diagramas muestran resultados de ensayos de liberación de cromo que miden la actividad citotóxica inducida por constructos específicos de cadena sencilla frente a CD33 específicos entre especies designados redirigidos hacia las líneas de células diana indicadas. También se usaron células efectoras tal como se indica. Los ensayos se realizan tal como se describe en el ejemplo 16.5. Los diagramas demuestran claramente para cada constructo el

10 potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras humanas y de macado contra células CHO transfectadas con CD33 humano y de macaco, respectivamente.

Figura 31

Gel de SDS PAGE e inmunotransferencia de tipo Western que monitorizan la purificación de la molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies designada E292F3 HL x I2C HL. Se analizaron muestras del eluato, el 15 sobrenadante de cultivo celular (SN) y el flujo a través de la columna (FT) tal como se indica. Se aplicó un marcador de proteína (M) como referencia de tamaño. Una fuerte banda de proteína con un tamaño molecular de entre 50 y 60 kDa en el gel de SDS PAGE demuestra la purificación eficaz de la molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies hasta un grado de pureza muy alto con el método de purificación de una etapa descrito en el ejemplo 17.2. La inmunotransferencia de tipo Western que detecta la etiqueta de 6 histidinas confirma la identidad

20 de la banda de proteína en el eluato como la molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies. La débil señal para la muestra de flujo continuo en este método de detección sensible muestra además la captura casi completa de moléculas biespecíficas de cadena sencilla mediante el método de purificación.

Figura 32

Gel de SDS PAGE e inmunotransferencia de tipo Western que monitorizan la purificación de la molécula biespecífica

25 de cadena sencilla específica entre especies designada V207C12 HL x H2C HL. Se analizaron muestras del eluato, el sobrenadante de cultivo celular (SN) y el flujo a través de la columna (FT) tal como se indica. Se aplicó un marcador de proteína (M) como referencia de tamaño. Una fuerte banda de proteína con un tamaño molecular de entre 50 y 60 kDa en el gel de SDS PAGE demuestra la purificación eficaz de la molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies hasta un grado de pureza muy alto con el método de purificación de una etapa

30 descrito en el ejemplo 17.2. La inmunotransferencia de tipo Western que detecta la etiqueta de 6 histidinas confirma la identidad de la banda de proteína en el eluato como la molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies. La débil señal para la muestra de flujo continuo en este método de detección sensible muestra además la captura casi completa de moléculas biespecíficas de cadena sencilla mediante el método de purificación.

Figura 33

35 Gel de SDS PAGE e inmunotransferencia de tipo Western que monitorizan la purificación de la molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies designada AF5HLxF12QHL. Se analizaron muestras del eluato, el sobrenadante de cultivo celular (SN) y el flujo a través de la columna (FT) tal como se indica. Se aplicó un marcador de proteína (M) como referencia de tamaño. Una fuerte banda de proteína con un tamaño molecular de entre 50 y 60 kDa en el gel de SDS PAGE demuestra la purificación eficaz de la molécula biespecífica de cadena sencilla

40 específica entre especies hasta un grado de pureza muy alto con el método de purificación de una etapa descrito en el ejemplo 17.2. La inmunotransferencia de tipo Western que detecta la etiqueta de 6 histidinas confirma la identidad de la banda de proteína en el eluato como la molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies. La señal en la muestra de flujo continuo en este método de detección sensible se explica por la saturación de la columna de afinidad debido a la alta concentración de moléculas biespecíficas de cadena sencilla en el

45 sobrenadante.

Figura 34

Curva patrón de AF5HLxI2CHL en el 50% de suero de mono macaco. El diagrama superior muestra la curva patrón generada para el ensayo tal como se describe en el ejemplo 18.2. El diagrama inferior muestra los resultados para muestras de control de calidad de AF5HLxI2CHL en el 50% de suero de mono macaco. Las tasas de recuperación

50 son superiores al 95% para la muestra de CC alta y media y por encima del 80% para la muestra de baja CC.

Por tanto, el ensayo permite la detección de AF5HLxI2CHL en muestras de suero en el intervalo de desde 10 ng/ml hasta 200 ng/ml (antes de la dilución).

Figura 35

Curva patrón de MCSP-G4 HL x I2C HL en el 50% de suero de mono macaco. El diagrama superior muestra la 55 curva patrón generada para el ensayo tal como se describe en el ejemplo 18.2.

imagen27

El diagrama inferior muestra los resultados para muestras de control de calidad de MCSP-G4 HL x I2C HL en el 50% de suero de mono macaco. Las tasas de recuperación son superiores al 98% para la muestra de CC alta y media y superiores al 85% para la muestra de baja CC.

Por tanto el ensayo permite la detección de MCSP-G4 HL x I2C HL en muestras de suero en el intervalo de desde 5 10 ng/ml hasta 200 ng/ml (antes de la dilución).

Figura 36

Análisis de unión de FACS de un anticuerpo anti-Flag a células CHO transfectadas con los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon de las especies designadas fusionadas a EpCAM de cinomolgo. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 19.1. Las líneas en negrita representan células incubadas con el

10 anticuerpo anti-Flag. Los histogramas rellenos reflejan los controles negativos. Se usó PBS con FCS al 2% como control negativo. Los histogramas muestran unión fuerte y comparable del anticuerpo anti-Flag a todos los transfectantes, lo que indica expresión fuerte e igual de los constructos transfectados.

Figura 37

Análisis de unión de FACS del constructo I2C IgG1 a células CHO que expresan los aminoácidos 1-27 N-terminales

15 de CD3 épsilon de las especies designadas fusionadas a EpCAM de cinomolgo. La tinción de FACS se realiza tal como se describe en el ejemplo 19.3. Las líneas en negrita representan células incubadas con 50 l de sobrenadante de cultivo celular de células que expresan el constructo I2C IgG1. Los histogramas rellenos reflejan el control negativo. Las células que expresan los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de cerdo fusionados a EpCAM de cinomolgo se usaron como control negativo. En comparación con el control negativo los histogramas

20 demuestran claramente unión del constructo I2C IgG1 a los 1-27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon de ser humano, tití, tamarino y mono ardilla.

Figura 38

Análisis de unión de FACS del constructo I2C IgG1 tal como se describe en el ejemplo 19.2 a CD3 humano con y sin etiqueta de 6 His N-terminal tal como se describe en los ejemplos 6.1 y 5.1 respectivamente. Las líneas en negrita

25 representan células incubadas con el anticuerpo anti-CD3 humano UCHT-1, el anticuerpo frente a penta-His (Qiagen) y sobrenadante de cultivo celular de células que expresan el constructo I2C IgG1, respectivamente tal como se indica. Los histogramas rellenos reflejan células incubadas con un anticuerpo IgG1 murino irrelevante como control negativo.

Los dos solapamientos de histogramas superiores muestran unión comparable del anticuerpo UCHT-1 a ambos

30 transfectantes en comparación con el control de isotipo que demuestra expresión de ambos constructos recombinantes. Los solapamientos de histogramas centrales muestran unión del anticuerpo frente a penta-His a las células que expresan la cadena de His6-CD3 épsilon humano (His6-CD3) pero no las células que expresan la cadena de CD3 épsilon silvestre (WT-CD3). Los solapamientos de histogramas inferiores muestran la unión del constructo I2C IgG1 a la cadena de CD3 épsilon humano silvestre pero no a la cadena de His6-CD3 épsilon

35 humano. Estos resultados demuestran que un extremo N-terminal libre es esencial para la unión del anticuerpo antimolécula de unión a CD3 específico entre especies I2C a la cadena de CD3 épsilon.

Figura 39

Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO 40 transfectadas con MCSP D3 de macaco y la línea de células T de macaco 4119 LnPx, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 10. La línea en negrita representa células incubadas con 2 g/ml de constructo biespecífico de cadena sencilla purificado o sobrenadante de células que contiene el constructo biespecífico de cadena sencilla, respectivamente. Los histogramas rellenos reflejan los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo para la unión a las líneas de

45 células T. Se usó un constructo de cadena sencilla con especificidad diana irrelevante como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con MCSP D3. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a MCSP D3 humana y de macaco y CD3 humano y de macaco.

Figura 40

50 Actividad citotóxica inducida por constructos de cadena sencilla específicos para MCSP D3 específicos entre especies designados redirigidos hacia las líneas de células diana indicadas. También se usaron células efectoras y la razón de células efectoras con respecto a diana tal como se indica. El ensayo se realiza tal como se describe en el ejemplo 11. Los diagramas demuestran claramente un potente reclutamiento específico entre especies de actividad citotóxica por cada constructo.

55 Figura 41 Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados a células CHO transfectadas con CD33 humano, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas con CD33 de macaco y PBMC de macaco, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 21.2. Las líneas en negrita representan células incubadas con sobrenadante de cultivo

imagen28

5 celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos específicos entre especies. Los histogramas rellenos reflejan los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a CD33 humano y de macaco y CD3 humano y de macaco.

10 Figura 42

Los diagramas muestran resultados de ensayos de liberación de cromo que miden la actividad citotóxica inducida por constructos específicos de cadena sencilla frente a CD33 específicos entre especies designados redirigidos hacia las líneas de células diana indicadas. También se usaron células efectoras tal como se indica. Los ensayos se realizan tal como se describe en el ejemplo 21.3. Los diagramas demuestran claramente para cada constructo el

15 potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras humanas y de macado contra células CHO transfectadas con CD33 humano y de macaco, respectivamente.

Figura 43

Redistribución de células T en un chimpancé con infusión en bolo intravenosa semanal con PBS/HSA al 5% y PBS/HSA al 5% más constructo de anticuerpo biespecífico frente a EpCAM CD3 de cadena sencilla a dosis de 1,6, 20 2,0, 3,0 y 4,5 g/kg. El tiempo de infusión para cada administración en bolo fue de 2 horas. Las flechas verticales indican el comienzo de las infusiones en bolo. Los puntos de datos al inicio de cada administración en bolo muestran los recuentos de células T inmediatamente antes del comienzo de la infusión en bolo. Cada infusión en bolo del constructo de anticuerpo biespecífico frente a EpCAM CD3 de cadena sencilla, que reconoce un epítopo CD3 dependiente del contexto convencional, desencadenó un episodio de redistribución de células T seguido por

25 recuperación de células T hasta valores de nivel inicial antes de la siguiente infusión en bolo.

Figura 44

Análisis ELISA específico frente a CD3 de preparaciones periplasmáticas que contienen fragmentos de proteína de scFv marcados con Flag de clones seleccionados. Se añadieron preparaciones periplasmáticas de fragmentos de proteína scFv solubles a los pocillos de una placa de ELISA, que se habían recubierto con proteína de fusión CD3

30 épsilon humano soluble (aminoácidos 1-27)-Fc y se habían bloqueado adicionalmente con PBS – BSA al 3%. La detección se realizó mediante un anticuerpo monoclonal anti-Flag marcado con biotina seguido por estreptavidina conjugada con peroxidasa. El ELISA se reveló mediante una disolución de sustrato de ABTS. Se midieron los valores de DO (eje y) a 405 nm mediante un lector de ELISA. Los nombres de los clones se presentan en el eje x.

Figura 45

35 Análisis ELISA de preparaciones periplasmáticas que contienen fragmentos de proteína de scFv marcados con Flag de clones seleccionados. Se añadieron las mismas preparaciones periplasmáticas de fragmentos de proteína de scFv soluble que en la figura 44 a los pocillos de una placa de ELISA que no se había recubierto con proteína de fusión CD3 épsilon humano (aminoácidos 1-27)-Fc sino con hulgG1 (Sigma) y se había bloqueado con BSA al 3% en PBS.

40 La detección se realizó mediante un anticuerpo monoclonal anti-Flag marcado con biotina seguido por estreptavidina conjugada con peroxidasa. El ELISA se reveló mediante una disolución de sustrato de ABTS. Se midieron los valores de DO (eje y) a 405 nm mediante un lector de ELISA. Los nombres de los clones se presentan en el eje x.

Figura 46

Análisis de unión de FACS de los constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies

45 designados a células CHO transfectadas con el PSMA humano, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas con PSMA de macaco y una línea de células T de macaco 4119 LnPx. La tinción de FACS se realiza tal como se describe en el ejemplo 24.4. La línea gruesa representa células incubadas con sobrenadante de cultivo celular que posteriormente se incuba con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea delgada del histograma refleja el control negativo: se incuban las células sólo con el

50 anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.

Figura 47

Actividad citotóxica inducida por constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados redirigidos hacia líneas de células diana indicadas. A) y B) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56-estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con PSMA humano como células diana. El ensayo se realiza tal como

55 se describe en el ejemplo 24.5.

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Figura 48

Actividad citotóxica inducida por constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados redirigidos hacia líneas de células diana indicadas. A) y B) Se usa la línea de células T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con PSMA de macaco como células diana. El ensayo se realiza tal

5 como se describe en el ejemplo 24.5.

Figura 49

Análisis de unión de FACS de los constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados para la línea de células de cáncer de próstata positiva para PSMA humano LNCaP, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL y para la línea de células T de macaco 4119LnPx, respectivamente. La tinción de FACS 10 se realizó tal como se describe en el ejemplo 24.7. La línea en negrita representa células incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos específicos entre especies. Los histogramas rellenos reflejan los controles negativos. Se usó el medio de cultivo celular como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies mostrado, el solapamiento de los histogramas demuestra la unión del constructo a PSMA humano y CD3 humano y

15 de macaco.

Figura 50

Los diagramas muestran resultados de ensayos de liberación de cromo que miden la actividad citotóxica inducida por constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados redirigidos hacia la línea de células diana indicada. También se usaron células efectoras tal como se indica. Los ensayos se realizaron tal como

20 se describe en el ejemplo 24.8. Los diagramas demuestran claramente para los constructos mostrados el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras humanas o de macaco contra células de cáncer positivas para PSMA mediante el ejemplo de la línea de células de cáncer de próstata humano LNCaP o la línea de células de macaco 4119LnPx.

Figura 51

25 Análisis de unión de FACS de los constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados a células positivas para PSMA. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 24.7. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies mostrado, el solapamiento de los histogramas demuestra la unión del constructo a PSMA humano y CD3 humano y de macaco.

Figura 52

30 Los diagramas muestran resultados de ensayos de liberación de cromo que miden la actividad citotóxica inducida por constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies designados redirigidos hacia la línea de células diana indicada. También se usaron células efectoras tal como se indica. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el ejemplo 24.8. Los diagramas demuestran claramente para los constructos mostrados el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras humanas o de macaco contra células positivas para

35 PSMA.

Figura 53

Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla designados a células CHO que expresan quimeras de PSMA humano / de rata designadas tal como se describe en el ejemplo 25.1. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 25.2. Las líneas en negrita representan células incubadas con 40 sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Los histogramas rellenos muestran los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a los constructos quiméricos huPSMArat140-169, huPSMArat191-258, huPSMArat281-284, huPSMArat683-690 y huPSMArat716-750. En comparación con las señales obtenidas para el

45 otro constructo biespecífico de cadena sencilla hay una clara ausencia de unión para los constructos de anticuerpo biespecíficos de cadena sencilla PM84-D7 x I2C, PM29-G1 x I2C y PM49-B9 x I2C al constructo quimérico huPSMArat300-344 Además, en comparación con las señales obtenidas para los otros constructos biespecíficos de cadena sencilla, hay una clara falta de unión para el constructo de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PM34-C7 x I2C al constructo huPSMArat598-617.

50 Figura 54

Unión de scFv MP9076-A9, el elemento de unión diana de PSMA del anticuerpo BiTE frente a PSMA PM 76-A9 x I2C a péptidos de 15 meros que se extienden a lo largo del dominio extracelular de PSMA humano y que se solapan con los péptidos vecinos en 14 aminoácidos. Los números de péptido se representan en el eje X. Las señales de ELISA usando detección de His se representan en el eje Y.

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Figura 55

Unión de scFv MP9076-B10, el elemento de unión diana de PSMA del anticuerpo BiTE frente a PSMA PM 76-B10 x I2C a péptidos de 15 meros que se extienden a lo largo del dominio extracelular de PSMA humano y que se solapan con los péptidos vecinos en 14 aminoácidos. Los números de péptido se representan en el eje X. Las señales de

5 ELISA usando detección de His se representan en el eje Y.

Figura 56

Unión de scFv F1-A10, el elemento de unión diana de PSMA del anticuerpo BiTE frente a PSMA PM F1-A10 x I2C a péptidos de 15 meros que se extienden a lo largo del dominio extracelular de PSMA humano y que se solapan con los péptidos vecinos en 14 aminoácidos. Los números de péptido se representan en el eje X. Las señales de ELISA

10 usando detección de His se representan en el eje Y.

Figura 57

Posibles epítopos dominantes de los scFv MP 9076-A9, MP 9076-B10 y F1-A10. Los posibles aminoácidos de unión centrales en la estructura tridimensional de PSMA humano están rodeados por una línea discontinua. Códigos de color representan los scFvs y los epítopos respectivos. Davis et al. en 2005 (PNAS, 102: 5981-6) notificó la

15 estructura cristalina de PSMA humano.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos ilustrativos que proporcionan una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas.

Ejemplos

1. Identificación de secuencias de CD3épsilon a partir de muestras de sangre de primates no humanos

20 Se usaron muestras de sangre de los siguientes primates no humanos para la identificación de CD3épsilon: Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y Saimiris sciureus. Se prepararon muestras de sangre completa tratadas con heparina recién preparada para aislar el ARN celular total de acuerdo con el protocolo del fabricante (kit QIAamp RNA Blood Mini, Qiagen). El ARNm extraído se transcribió en ADNc de acuerdo con protocolos publicados. En resumen, se incubaron 10 l de ARN precipitado con 1,2 l de mezcla de hexanucleótidos 10x (Roche) a 70ºC durante 10

25 minutos y se almacenaron en hielo. Se añadió una mezcla de reacción que consistía en 4 l de tampón Superscript II 5x, 0,2 l de ditiotreitol 0,1 M, 0,8 l de Superscript II (Invitrogen), 1,2 l de desoxirribonucleósidos trifosfato (25 M), 0,8 l de inhibidor de ARNasa (Roche) y 1,8 l de agua sin ADNasa y ARNasa (Roth). Se incubó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos seguido por incubación a 42ºC durante 50 minutos y después a 90ºC durante 5 minutos. Se enfrió la reacción en hielo antes de añadir 0,8 l de ARNasaH (1 U/l, Roche)

30 y se incubó durante 20 minutos a 37ºC.

Se sometieron los ADNc de la primera hebra de cada especie a reacciones en cadena de la polimerasa de 35 ciclos por separado usando la ADN polimerasa Taq (Sigma) y la siguiente combinación de cebadores diseñados de acuerdo con la búsqueda en bases de datos: cebador directo 5’-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3’ (SEQ ID NO:253); cebador inverso 5’-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3’ (SEQ ID NO:254). Se purificaron en gel las bandas amplificadas

35 de 550 pb (kit de extracción en gel, Qiagen) y se secuenciaron (Sequiserve, Vaterstetten/Alemania, véase la lista de secuencias).

CD3épsilon de Callithrix jacchus

Nucleótidos

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40 Aminoácidos (SEQ ID NO: 3)

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CD3épsilon de Saguinus oedipus

Nucleótidos

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Aminoácidos (SEQ ID NO: 7)

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10 2. Generación de fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) específicos entre especies que se unen a los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3épsilon humana y de diferentes primates distintos de chimpancé

2.1. Inmunización de ratones usando el extremo N-terminal de CD3épsilon separado de su contexto de CD3 nativo mediante fusión a una proteína soluble heteróloga

Se inmunizaron ratones F1 a partir de cruces balb/c x C57black de diez semanas de edad con la proteína de fusión

15 CD3épsilon-Fc portadora de los aminoácidos 1-27 más próximos al extremo N-terminal de la cadena CD3épsilon madura (1-27 CD3-Fc) humana y/o de Saimiris sciureus. Con este fin, se inyectaron 40 g por ratón de la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc con 10 nmol de un CpG-oligonucleótido modificado con tioato (5’-tccatgacgttcctgatgct-3’) en 300 l de PBS por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21, 42 y opcionalmente 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se tomaron

20 muestras de sangre y se sometió a prueba el título sérico de anticuerpo contra la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc mediante ELISA. Adicionalmente, se sometió a prueba el título contra la línea de linfocitos T positiva para CD3 humana HPBall en citometría de flujo de acuerdo con protocolos convencionales. Los títulos séricos fueron significativamente más altos en animales inmunizados que en no inmunizados.

2.2. Generación de una biblioteca inmunitaria de scFv de anticuerpos murinos: Construcción de una biblioteca de 25 anticuerpos combinatoria y presentación en fagos

Tres días después de la última inyección se recogieron las células de bazo murinas para la preparación de ARN total de acuerdo con protocolos convencionales.

Se construyó una biblioteca de fragmentos de ADN de región variable de cadena ligera (kappa) (VK) de inmunoglobulina (Ig) y de región variable de cadena pesada (VH) de Ig murinos mediante RT-PCR sobre ARN de

30 bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetizó ADNc de acuerdo con protocolos convencionales.

Los cebadores se diseñaron de manera que dieran lugar a un sitio de reconocimiento 5’-Xhol y uno 3’-BstEII para los fragmentos V de cadena pesada amplificados y a un sitio de reconocimiento 5’-Sacl y uno 3’-Spel para fragmentos

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de ADN VK amplificados.

Para la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN VH se combinaron cada uno de ocho cebadores específicos de la familia 5’-VH diferentes (MVH1(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT (SEQ ID No. 344); MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT (SEQ ID No. 345); MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG 5 CAG CCT GGG GCT (SEQ ID No. 346); MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA (SEQ ID No. 347); MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA (SEQ ID No. 348); MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT (SEQ ID No. 349); MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA (SEQ ID No. 350); MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT (SEQ ID No. 351)) con un cebador de 3’-VH (3’MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g (SEQ ID No. 352)); para la amplificación por PCR de los fragmentos de cadena 10 VK se combinaron cada uno de siete cebadores específicos de la familia 5’-VK diferentes (MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT (SEQ ID No. 353); MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC (SEQ ID No. 354); MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA (SEQ ID No. 355); MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA (SEQ ID No. 356); MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA (SEQ ID No. 357); MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC

15 CA (SEQ ID No. 358); MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA (SEQ ID No. 359)) con un cebador de 3’-VK (3’MuVkHindlll/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat etc aag ctt ggt ccc (SEQ ID No. 360)).

Se usó el programa de PCR siguiente para la amplificación: desnaturalización a 94ºC durante 20 s; apareamiento cebadores a 52ºC durante 50 s y extensión de cebadores a 72ºC durante 60 s y 40 ciclos, seguido por una extensión final de 10 minutos a 72ºC.

20 Se ligaron 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Se transformó entonces la biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante en 300 l de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad Gen Pulser) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionaron

25 transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml de cultivo en Super Broth líquido (SB) durante la noche. Después, se recogieron las células por centrifugación y se llevó a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).

Se ligaron 2800 ng de este ADN de plásmido que contenía la biblioteca VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transformaron de nuevo

30 en dos alícuotas de 300 ul de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño total de biblioteca de scFv VH-VK (fragmento variable monocatenario) de más de 107 clones independientes.

Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, se transfirieron las células de E. coli que contenían la biblioteca de anticuerpos a medio de selección SB-carbenicilina (50 ug/ml). Después, se infectaron 35 las células de E. coli que contenían la biblioteca de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago auxiliar VCSM13, dando como resultado la producción y secreción de fago filamentoso M13, en el que la partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codificaba para un fragmento scFv murino y presentaba la proteína scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína de cubierta III del fago. Este conjunto de fagos que presentaban la biblioteca de anticuerpos se usó posteriormente para la selección de entidades de unión a

40 antígeno.

2.3. Selección de agentes de unión específicos de CD3 basada en presentación en fagos

Se recogió la biblioteca de fagos que portaba el repertorio de scFv clonado del respectivo sobrenadante de cultivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspendieron de aproximadamente 1011 a 1012 partículas de fagos con scFv en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1% y se incubaron con de 105 a 107 células Jurkat (una 45 línea de células T humana positiva para CD3) durante 1 hora en hielo bajo agitación lenta. Estas células Jurkat se hicieron crecer previamente en medio RPMI enriquecido con suero de ternera fetal (al 10%), glutamina y penicilina/estreptomicina, se recogieron mediante centrifugación, se lavaron en PBS y se resuspendieron en PBS/FCS al 1% (que contenía azida de Na). Los fagos con scFv que no se unieron específicamente a las células Jurkat se eliminaron mediante cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Después del 50 lavado, se eluyeron entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina pH 2,2 (10 min de incubación con agitación en vórtex posterior) y tras la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usó el eluato para la infección de un cultivo recién preparado de células de E. coli XL1 Blue no infectadas (DO600 > 0,5). El cultivo de E. coli que contenía células de E. coli transducidas exitosamente con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento scFv humano, se seleccionaron de nuevo por su resistencia a carbenicilina y se infectaron posteriormente

55 con fago auxiliar VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevaron a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.

2.4. Examen de agentes de unión específicos de CD3

Se aisló ADN de plásmido correspondiente a 4 y 5 ciclos de cribado a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína scFv soluble, se escindieron fragmentos de ADN VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Estos fragmentos se clonaron por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His que difería del pComb3H5BHis original en que el constructo de expresión (por ejemplo, scFv) incluye una etiqueta Flag (TGD YKDDDDK) entre el scFv y la etiqueta de His6 y las proteínas de fago adicionales se

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5 delecionaron. Después de la ligación, se transformó cada conjunto (distintos ciclos de cirbado) de ADN de plásmido en 100 l de E. coli TG1 o XLI Blue competentes para choque térmico y se sembraron en placa sobre LB-agar con carbenicilina. Se tomaron colonias individuales en 100 l de LB carb (50 ug/ml).

Las E. coli transformadas con pComb3H5BHis que contenían un segmento VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM. Debido a una

10 secuencia señal adecuada, se exportó la cadena scFv al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional.

Se tomaron colonias bacterianas individuales de E. coli TG1 de las placas de transformación para preparaciones periplásmicas a pequeña escala y se hicieron crecer en medio SB (por ejemplo, 10 ml) complementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 g/ml (y se redisolvieron en PBS (por ejemplo, 1 ml) después de recogerlas. Mediante

15 cuatro ciclos de congelación a -70ºC y descongelación a 37ºC, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque térmico y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidas los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los residuos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los scFv humanos anti-CD3 humana y se usó para examen adicional.

2.5. Identificación de agentes de unión específicos de CD3

20 Se sometió a prueba la unión de los scFv aislados mediante citometría de flujo en células eucariotas, que en su superficie expresan una proteína heteróloga que presenta en su extremo N-terminal los primeros 27 aminoácidos Nterminales de CD3épsilon.

Tal como se describe en el ejemplo 4, los primeros aminoácidos 1-27 de la secuencia N-terminal de la cadena CD3 épsilon madura del complejo receptor de linfocitos T humanos (secuencia de aminoácidos:

25 QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT SEQ ID No. 2) se fusionaron al extremo N-terminal de la proteína transmembrana EpCAM de forma que el extremo N-terminal se situó en la superficie exterior de la célula. Adicionalmente, se insertó un epítopo FLAG entre la secuencia 1-27 N-terminal de CD3épsilon y la secuencia de EpCAM. Este producto de fusión se expresó en células de riñón embrionario humano (HEK) y de ovario de hámster chino (CHO).

30 Se prepararon de la misma manera células eucariotas que presentaban los 27 aminoácidos más próximos al extremo N-terminal de CD3épsilon madura de otras especies de primates para Saimiri sciureus (mono ardilla) (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID No. 8), para Callithrix jacchus (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID No. 4), para Saguinus oedipus (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon:

35 QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID No. 6).

Para citometría de flujo se incuban 2,5x105 células con 50 ul de sobrenadante o con 5 g/ml de los constructos purificados en 50 l de PBS con FCS al 2%. Se detectó la unión de los constructos con un anticuerpo anti-His (anticuerpo Penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 g/ml en 50 l de PBS con FCS al 2 %. Como reactivo de segunda etapa se usó un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de cabra

40 anti-IgG de ratón (específico de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 l de PBS con FCS al 2 % (Dianova, Hamburgo, RFA). Las muestras se midieron en un instrumento FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).

La unión se confirmó siempre por citometría de flujo tal como se describe en el párrafo anterior en células T primarias humanas y de diferentes primates (por ejemplo, Saimiris sciureus, Callithrix jacchus, Saguinus oedipus).

2.6. Generación de equivalentes humanos/humanizados de scFv específicos de CD3épsilon no humanos

45 Se alineó la región VH del scFv anti-CD3 murino contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpos humanos. Se escogió la secuencia VH de línea germinal de anticuerpos humanos que tenía la mayor homología con la VH no humana y se realizó una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Se observaron una serie de residuos de entramado de la VH no humana que diferían de las regiones de entramado de la VH humana (“diferentes posiciones estructurales”). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y la actividad del

50 anticuerpo frente a su diana.

Para construir una biblioteca que contiene las CDR murinas y, en cada posición de entramado que difiere de la secuencia de VH humana elegida, ambas posibilidades (el residuo de aminoácido humano y murino materno), se sintetizaron oligonucleótidos degenerados. Estos oligonucleótidos incorporan en las posiciones que difieren el residuo humano con una probabilidad del 75% y el residuo murino con una probabilidad del 25%. Para una VH 55 humana, por ejemplo, tuvieron que sintetizarse seis de estos oligonucleótidos que se solapaban en un tramo terminal de aproximadamente 20 nucleótidos. Con este fin cada segundo cebador era un cebador antisentido. Se

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delecionaron los sitios de restricción necesarios para la clonación posterior del interior de los oligonucleótidos.

Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótidos, dependiendo del número de cebadores que eran necesarios para abarcar toda la secuencia V.

Estos seis cebadores, por ejemplo, se mezclaron en cantidades iguales (por ejemplo, 1 

5 (soluciones madre de cebador de 20 a 100 M) a una reacción de PCR de 20 l) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94ºC durante 3 minutos, a 65ºC durante 1 minuto, a 62ºC durante 1 minuto, a 59ºC durante 1 minuto, a 56ºC durante 1 minuto, a 52ºC durante 1 minuto, a 50ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de una tamaño de desde

10 200 hasta 400 a partir del gel de acuerdo con métodos convencionales.

Entonces se usó este producto de PCR como molde para una reacción de PCR convencional usando cebadores que incorporan sitios de restricción de clonación N-terminales y C-terminales adecuados. Se aisló el fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH, aproximadamente 350 nucleótidos) mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con métodos convencionales. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VH. Este

15 fragmento de VH era en ese momento un conjunto de fragmentos de VH, cada uno con una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las respectivas posiciones de entramado (conjunto de VH humanizadas). Se realizó el mismo procedimiento para la región VL de los scFv murinos anti-CD3 (conjunto de VL humanizadas).

Se combinó entonces el conjunto de VH humanizadas con el conjunto de VL humanizadas en el vector de presentación en fagos pComb3H5Bhis para formar una biblioteca de scFv funcionales a partir de la cual, después de 20 la presentación en fagos filamentosos, se seleccionaron, examinaron, identificaron y confirmaron agentes de unión anti-CD3 tal como se describió anteriormente para los scFv anti-CD3 no humanos (murinos) originales. Después, se analizaron clones individuales para detectar propiedades y secuencias de aminoácidos favorables. Se prefieren aquellos scFv que se encontraban más próximos en homología de secuencia de aminoácidos a los segmentos V de línea germinal humana, particularmente aquellos en los que al menos una CDR entre las CDR I y II de VH y las CDR

25 I y II de VLkappa o las CDR I y II de VLIambda muestra más del 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la CDR más próxima respectiva de todos los segmentos V de línea germinal humana. Se convirtieron los scFv anti-CD3 en anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos recombinantes tal como se describe en los ejemplos 9, 16 y 24 siguientes.

3. Generación de una proteína de fusión recombinante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 30 épsilon humana fusionados con la parte Fc de una lgG1 (1-27 CD3-Fc).

3.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-Fc

La secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados a la región de bisagra y la Fc gamma de la inmunoglobulina humana lgG1, así como una etiqueta de 6 histidinas, se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y la 35 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante se enumeran en las SEQ ID NO. 230 y 229). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera un primer sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante de los primeros 27 aminoácidos de la parte extracelular de la cadena CD3 épsilon humana madura, seguido en marco por la secuencia codificante de la región bisagra y la parte Fc gamma de la lgG1 humana, seguido 40 en marco por la secuencia codificante de una etiqueta de 6 histidinas y un codón de terminación (figura 1). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica para la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y SaiI en el extremo 3’, se utilizan en los procedimientos de clonación siguientes. Se clonó el fragmento de síntesis génica a través de EcoRI y SaiI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. 45 Acad. Sci. 55 USA 92 (1995) 7021-7025) siguiendo protocolos convencionales. Se usó un plásmido de secuencia verificada para la transfección en el sistema de expresión Freestyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular de los transfectantes y se sometió a prueba la presencia del constructo recombinante en un ensayo ELISA. Se diluyó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana específico de fragmento Fc-gamma (obtenido de Jackson ImmunoResearch 50 Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) en PBS hasta 5 g/ml y se recubrió con 100 l por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos MaxiSorp (Nunc GmbH y Co. KG, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4ºC. Se lavaron los pocillos con PBS con Tween 20 al 0,05% (PBS/Tween y se bloquearon con BSA al 3% en PBS (albúmina bovina, fracción V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA). Posteriormente, se lavaron los pocillos de nuevo con PBS/Tween y después se incubaron con sobrenadantes de 55 cultivo celular durante 60 minutos a TA. Después del lavado, se incubaron los pocillos con un anticuerpo anti-His6 conjugado con peroxidasa (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) diluido 1:500 en PBS con BSA al 1% durante 60 minutos a TA. Posteriormente, se lavaron los pocillos con 200 l de PBS/Tween y se añadieron 100 l de OPD SIGMAFAST (disolución de sustrato de OPD [diclorhidrato de o-fenilendiamina] SIGMAFAST (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La 60 reacción se detuvo mediante la adición de 100 l de H2SO4 1 M. Se midió la reacción de color en un

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espectrofotómetro para microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EE.UU.) a 490 nm y restando la absorción de fondo a 620 nm. Tal como se muestra en la figura 2, la presencia del constructo en comparación con el sobrenadante no relevante de células HEK 293 con transfección simulada usadas como control negativo era claramente detectable.

5 3.2. Ensayo de unión de anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies a 1-27 CD3-Fc.

Se sometió a prueba la unión de preparaciones en bruto de anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies expresados en el periplasma específicos para CD3 épsilon a 1-27 CD3-Fc en un ensayo ELISA. Se diluyó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana específico de fragmento Fc-gamma (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) en PBS hasta 5 g/ml y se recubrió con 100 l por pocillo en una placa de ELISA de 10 96 pocillos MaxiSorp (Nunc GmbH y Co. KG, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4ºC. Se lavaron los pocillos con PBS con Tween 20 al 0,05% (PBS/Tween y se bloquearon con PBS con BSA al 3% (albúmina bovina, fracción V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) durante 60 minutos a TA. Posteriormente, se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con sobrenadantes de células que expresaban el constructo de 1-27 CD3-Fc durante 60 minutos a TA. Se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con preparaciones en bruto de 15 anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies expresados en el periplasma tal como se describió anteriormente durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS/Tween, se incubaron los pocillos con anticuerpo anti-Flag M2 conjugado con peroxidasa (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido 1:10000 en PBS con BSA al 1% durante 60 minutos a TA. Se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con 100 l de OPD SIGMAFAST (disolución de sustrato de OPD [diclorhidrato de o-fenilendiamina] 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se detuvo la reacción de color con 100 l de H2SO4 1 M y se midió en un espectrofotómetro para microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EE.UU.) a 490 nm y restando la absorción de fondo a 620 nm. Se observó una unión fuerte anticuerpos de cadena sencilla humanos específicos entre especies específicos para CD3 épsilon al constructo de 1-27 CD3-Fc en comparación con un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 murino (figura

25 3).

4. Generación de proteínas de fusión transmembrana recombinantes de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé fusionados a EpCAM de mono cynomolgus (1-27 CD3-EpCAM).

4.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-EpCAM

30 Se aisló la CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé (tití, tamarino, mono ardilla) y de cerdo. Las secuencias codificantes de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura, de tití común (Callithrix jacchus), de tamarino cabeza de algodón (Saguinus oedipus), de mono ardilla común (Saimiri sciureus) y de cerdo doméstico (Sus scrofa; usado como control negativo) fusionadas al extremo N-terminal de EpCAM de cynomolgus etiquetada con Tag se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos

35 convencionales. La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión recombinantes se enumeran bajo las SEQ ID NO. 231 a 240). Se diseñaron los fragmentos de síntesis génica para que contuvieran en primer lugar un sitio BsrGI para permitir la fusión en el marco de lectura correcto con la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos ya presente en el vector de expresión diana, que va seguido en marco por la secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la parte extracelular de las cadenas

40 CD3 épsilon maduras, que va seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta Flag y seguida en marco por la secuencia codificante de la proteína EpCAM transmembrana de cynomolgus madura (figura 4). Los fragmentos de síntesis génica también se diseñaron para introducir un sitio de restricción al final del ADNc que codifica para la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, BsrGI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Se clonaron entonces los fragmentos de síntesis

45 génica a través de BsrGI y SaiI en un derivado del plásmido denominado pEF DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), que ya contenía la secuencia codificante del péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos siguiendo protocolos convencionales. Se usaron plásmidos de secuencia verificada para transfectar de manera transitoria células HEK-293 usando el reactivo MATra-A (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) y 12 g de ADN de plásmido para células HEK-293 adherentes en frascos de cultivo

50 celular de 175 ml de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días de cultivo celular, se sometieron a prueba los transfectantes para determinar la expresión en la superficie celular de la proteína transmembrana recombinante por medio de un ensayo FACS de acuerdo con protocolos convencionales. Para ese fin, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 g/ml en PBS con FCS al 2%. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad

55 conjugado con R-ficoeritrina de cabra anti-IgG de ratón específico de fragmento Fc-gamma diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un instrumento FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). La expresión de las proteínas de fusión transmembrana recombinantes etiquetadas con Flag que consistían en EpCAM de cynomolgus y los aminoácidos 127 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino, de mono ardilla y de cerdo,

60 respectivamente, en células transfectadas era claramente detectable (figura 5).

4.2. Unión de anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 específicos entre especies a la 1-27 CD3-EpCAM.

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Se sometió a prueba la unión de preparaciones en bruto de anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 específicos entre especies expresados en el periplasma a los aminoácidos 1-27 N-terminales de las cadenas CD3 humana, de tití, de tamarino y de mono ardilla, respectivamente fusionados con EpCAM de cynomolgus en un ensayo FACS de acuerdo con protocolos convencionales. Con ese fin, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con preparaciones 5 en bruto de anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 específicos entre especies expresados en el periplasma (la preparación se realizó tal como se describió anteriormente y de acuerdo con protocolos convencionales) y un anticuerpo de cadena sencilla murino anti-CD3 humana como control negativo. Como anticuerpo secundario se usó el anticuerpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemania) a 5 g/ml en 50 l de PBS con FCS al 2%. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de cabra anti-IgG de ratón específico de fragmento Fc-gamma diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se midieron las muestras en un instrumento FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). Tal como se muestra en las figuras 6 (A a E), se observó unión de anticuerpos de cadena sencilla a los transfectantes que expresaban las proteínas de fusión transmembrana recombinantes consistentes en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino o de

15 mono ardilla fusionados a EpCAM de cynomolgus. No se observó unión de anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies a una proteína de fusión consistente en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de cerdo fusionados a EpCAM de cynomolgus usada como control negativo. Se mostró la especificidad entre especies multiprimate de los anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3. Las señales obtenidas con el anticuerpo anti-Flag M2 y los anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies eran comparables, lo que indica una fuerte actividad de unión de los anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies a los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon.

5. Análisis de la unión de anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 específicos entre especies mediante exploración de alanina de células de ratón transfectadas con la cadena CD3 épsilon humana y de sus mutantes de alanina

5.1. Clonación y expresión de CD3 épsilon humana de tipo natural

25 Se obtuvo la secuencia codificante de la cadena CD3 épsilon humana mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la cadena CD3 épsilon humana se enumeran en las SEQ ID NO. 242 y 241). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo y sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica para la CD3 épsilon humana. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó después por medio de EcoRI y SaII en un plásmido denominado pEF NEO siguiendo protocolos convencionales. pEF NEO se derivó de pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) reemplazando el ADNc del DHFR por el ADNc de la resistencia a neomicina mediante clonación molecular convencional. Se usó un plásmido de secuencia verificada para transfectar la línea de células T murina EL4 (n.º de la ATCC TIB-39) cultivada en RPMI

35 con L-glutamina estabilizada complementado con FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, HEPES al 1%, piruvato al 1%, aminoácidos no esenciales al 1% (todos de Biochrom AG Berlín, Alemania) a 37ºC, el 95% de humedad y el 7% de CO2. Se realizó la transfección con el reactivo de transfección SuperFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 2 g de ADN de plásmido de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas, se lavaron las células con PBS y se cultivaron de nuevo en el medio de cultivo celular mencionado anteriormente con G418 600 g/ml para la selección (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). De 16 a 20 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después otros 7 a 14 días se sometieron a prueba las células para determinar la expresión de CD3 épsilon humana mediante análisis FACS de acuerdo con protocolos convencionales. Se incubaron 2,5x105 células con anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1 (BD biosciences, Heidelberg, Alemania) a 5 g/ml en PBS con FCS al 2%. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento

45 F(ab’)2 purificado por afinidad de cabra anti-IgG de ratón conjugado con R-ficoeritrina específico de fragmento Fcgamma diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un instrumento FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). La expresión CD3 de tipo natural humana en células EL4 transfectadas se muestra en la figura 7.

5.2. Clonación y expresión de los anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 específicos entre especies como anticuerpos lgG1

Con el fin de proporcionar medios mejorados de detección de la unión de los anticuerpos anti-CD3 de cadena sencilla específicos entre especies H2C HLP, A2J HLP y HLP E2M, se convirtieron en anticuerpos lgG1 con lgG1 murina y regiones constantes lambda humanas. Se obtuvieron las secuencias de ADNc que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos IgG respectivos mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos 55 convencionales. Los fragmentos de síntesis génica para cada especificidad se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota del constructo, que va seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos (SEQ ID NO. 244 y 243), que va seguido en marco por la secuencia codificante de la respectiva región variable de cadena pesada o la respectiva región variable de cadena ligera, seguida en marco por la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de IgG1 murina (SEQ ID N.º 246 y 245) o la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera lambda humana (SEQ ID NO. 248 y 247), respectivamente. Se introdujeron sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica para la

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proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron mediante EcoRI y SaiI en un plásmido denominado pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) para los constructos de cadena pesada y pEF ADA (pEF ADA se describe en Raum et al., Cancer Immunol lmmunother.,

5 50(3), (2001), 141-50) para los constructos de cadena ligera) de acuerdo con protocolos convencionales. Se usaron plásmidos de secuencia verificada para la cotransfección de los respectivos constructos de cadena ligera y cadena pesada en el sistema de expresión Freestyle 293 (invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular de los transfectantes y se usaron para el experimento de exploración de alanina.

10 5.3. Clonación y expresión de mutantes de alanina de CD3 épsilon humana para exploración de alanina

Se obtuvieron por síntesis génica 27 fragmentos de ADNc que codifican para la cadena CD3 épsilon humana con un intercambio de un codón de la secuencia de tipo natural de CD3 épsilon humana por un codón que codifica para alanina (GCC) para cada aminoácido de los aminoácidos 1-27 del dominio extracelular de la cadena CD3 épsilon humana madura, respectivamente. Excepto por el codón intercambiado, los fragmentos de ADNc eran idénticos al 15 fragmento de ADNc de CD3 de tipo natural humana mencionado anteriormente. Sólo se reemplazó un codón en cada constructo en comparación con el fragmento de ADNc de CD3 de tipo natural humana descrito anteriormente. Se introdujeron los sitios de restricción EcoRI y SaII en los fragmentos de ADNc en posiciones idénticas en comparación con el constructo de tipo natural. Se clonaron todos los constructos de exploración de alanina en pEF NEO y se transfectaron plásmidos de secuencia verificada en células EL4. La transfección y la selección de los

20 transfectantes se realizaron tal como se describió anteriormente. Como resultado, se obtuvo un panel de constructos expresados en los que el primer aminoácido de la cadena CD3 épsilon humana, glutamina (Q, Gln) en la posición 1, se reemplazó por alanina. El último aminoácido reemplazado por alanina fue la treonina (T, Thr) en la posición 27 de la CD3 épsilon de tipo natural humana madura. Para cada aminoácido entre la glutamina 1 y la treonina 27, se generaron los transfectantes respectivos con un intercambio de aminoácido de tipo natural por alanina.

25 5.4. Experimento de exploración de alanina

Se sometieron a prueba anticuerpos IgG quiméricos tal como se describió en 5.2 y anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies específicos para CD3 épsilon en un experimento de exploración de alanina. Se sometió a prueba la unión de los anticuerpos a las líneas celulares EL4 transfectadas con los constructos mutantes de alanina de CD3 épsilon humana tal como se describió en 5.3 mediante un ensayo FACS de acuerdo con protocolos 30 convencionales. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes respectivos con 50 l de sobrenadante de cultivo celular que contenía los anticuerpos IgG quiméricos o con 50 l de preparaciones en bruto de anticuerpos de cadena sencilla expresados en el periplasma. Para las muestras incubadas con preparaciones en bruto de anticuerpos de cadena sencilla expresados en el periplasma se usó como anticuerpo secundario el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 g/ml en 50 l de PBS con FCS al 2%. Para las muestras 35 incubadas con los anticuerpos IgG quiméricos no fue necesario un anticuerpo secundario. Para todas las muestras, se detectó la unión de las moléculas de anticuerpo con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de cabra anti-IgG de ratón específico de fragmento Fc-gamma diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un instrumento FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). Se detectó una unión diferente de las moléculas de IgG 40 quiméricas o los anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies a las líneas celulares EL4 transfectadas con mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. Como control negativo se usaron, respectivamente, o bien un control de isotipo o bien una preparación en bruto de un anticuerpo de cadena sencilla expresado en el periplasma de especificidad irrelevante. Se usó anticuerpo UCHT-1 como control positivo para el nivel de expresión de los mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. Las líneas celulares EL4 transfectadas con los mutantes de alanina de

45 los aminoácidos tirosina en la posición 15, valina en la 55 posición 17, isoleucina en la posición 19, valina en la posición 24 o leucina en la posición 26 de la cadena CD3 épsilon madura no se evaluaron debido a niveles de expresión muy bajos (datos no mostrados). En la figura 8 (A-D) se muestra la unión de los anticuerpos de cadena sencilla específicos entre especies y los anticuerpos de cadena sencilla en formato IgG quimérico a las líneas celulares EL4 transfectadas con mutantes de alanina de la CD3 épsilon humana como unión relativa en unidades

50 arbitrarias con la media geométrica de los valores de fluorescencia de los respectivos controles negativos restada de todas las medias geométricas de los valores de fluorescencia respectivos. Para compensar los diferentes niveles de expresión, se dividieron después todos los valores de la muestra para un transfectante determinado entre la media geométrica del valor de fluorescencia del anticuerpo UCHT-1 para el transfectante respectivo. Para la comparación con el valor de la muestra de tipo natural de una especificidad, finalmente se dividieron todos los valores de las

55 muestras de la especificidad respectiva entre el valor de la muestra de tipo natural, fijando de ese modo el valor de la muestra de tipo natural en 1 unidad arbitraria de unión.

Los cálculos usados se muestran con detalle en la fórmula siguiente:

imagen44

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Muestra (x,y) cont._neg.(x)valor _muestra (x,y) WT (y) cont._neg.(wt)(UCHT 1(x)cont._neg.(x))* UCHT 1(wt) cont._neg.(wt)

En esta ecuación valor_muestra significa el valor en unidades arbitrarias de unión que representa el grado de unión de un anticuerpo anti-CD3 específico a un mutante de alanina específico tal como se muestra en la figura 8 (A-D), Muestra significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico sometido a ensayo en un transfectante de exploración de alanina específico, Contr._neg. significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el control negativo sometido a ensayo en un mutante de alanina específico, UCTH-1 significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el anticuerpo UCHT-1 sometido a ensayo en un mutante de alanina específico, WT significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico sometido a ensayo en el transfectante de tipo natural, x especifica el transfectante respectivo, y especifica el anticuerpo anti-CD3 respectivo y wt especifica que el transfectante respectivo es el tipo natural.

Tal como puede observarse en la figura 8 (A-D), el anticuerpo IgG A2J HLP mostró una pérdida de unión pronunciada para los aminoácidos asparagina en la posición 4, treonina en la posición 23 e isoleucina en la posición 25 de la cadena CD3 épsilon madura. Se observó una pérdida total de la unión del anticuerpo IgG A2J HLP para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo IgG E2M HLP mostró una pérdida de unión pronunciada para los aminoácidos asparagina en la posición 4, treonina en la posición 23 e isoleucina en la posición 25 de la cadena CD3 épsilon madura. El anticuerpo IgG E2M HLP mostró una pérdida total de unión para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo IgG H2C HLP mostró una pérdida de unión intermedia para el aminoácido asparagina en la posición 4 de la cadena épsilon CD3 madura y mostró una pérdida total de la unión 25 para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo de cadena sencilla F12Q HLP mostró una pérdida de unión esencialmente total para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 de la cadena épsilon CD3 madura y glutamato en la posición 5 de la cadena CD3 épsilon madura.

6. Análisis de unión de la molécula de unión anti-CD3 específica entre especies H2C HLP a la cadena CD3 épsilon humana con y sin etiqueta de His6 N-terminal transfectada en la línea de células T murina EL4.

6.1. Clonación y expresión de la cadena CD3 épsilon humana con etiqueta de seis histidinas (etiqueta de His6) Nterminal

Se obtuvo un fragmento de ADNc que codifica la cadena CD3 épsilon humana con una etiqueta de His6 N-terminal mediante síntesis génica. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo, que va seguido en marco por la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, que va seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta de His6 que va seguida en marco por la secuencia codificante de la cadena CD3 épsilon humana madura (las secuencias de ADNc y de aminoácidos del constructo se enumeran como SEQ ID NO. 380 y 379). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera sitios de restricción al principio y al final del ADNc. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó después por medio de EcoRI y SaII en un plásmido denominado pEF-NEO (tal como se describió anteriormente) siguiendo protocolos convencionales. Se usó un plásmido de secuencia verificada para transfectar la línea de células T murina EL4. La transfección y la selección de los transfectantes se realizaron tal como se describió anteriormente. Después de 34 días de cultivo celular, se usaron los transfectantes para el ensayo descrito a continuación.

6.2. Unión de la molécula de unión anti-CD3 específica entre especies H2C HLP a la cadena CD3 épsilon humana con y sin etiqueta de His6 N-terminal.

Se sometió a prueba un anticuerpo IgG quimérico con la especificidad de unión H2C HLP específica para CD3 épsilon para determinar la unión a CD3 épsilon humana con y sin etiqueta de His6 N-terminal. La unión del anticuerpo a las líneas celulares EL4 transfectadas con la CD3 épsilon-His6 humana y CD3 épsilon de tipo natural, respectivamente, se sometio a prueba mediante un ensayo FACS de acuerdo con protocolos convencionales. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes con 50 l de sobrenadante de cultivo celular que contenía los anticuerpos IgG quiméricos o 50 l de los anticuerpos de control respectivos a 5 g/ml en PBS con FCS al 2%. Se usaron respectivamente, como control negativo, un control de isotipo apropiado y como control positivo para la expresión de los constructos, el anticuerpo específico de CD3 UCHT-1. Se detectó la unión de los anticuerpos con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de cabra anti-IgG de ratón específico de fragmento Fc-gamma diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un instrumento FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). En comparación con la línea celular EL4 transfectada con CD3 épsilon humana de tipo natural, se detectó una clara pérdida de unión de la IgG quimérica con especificidad de unión H2C HLP a CD3 épsilon humana con una etiqueta de His6 N-terminal. Estos resultados mostraron que un extremo N-terminal libre de CD3 épsilon es esencial para la unión de la especificidad de unión H2C HLP anti-CD3 específica entre especies a la cadena CD3 épsilon humana (figura 9).

imagen45

5 7. Clonación y expresión de los dominios C-terminal, transmembrana y extracelular truncado de MCSP humana

Se obtuvo la secuencia codificante del dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana (aminoácidos 1538 -2322) mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos del constructo recombinante para la expresión del dominio Cterminal transmembrana y extracelular truncado de MCSP humana (denominado D3 humana) se enumeran en las 10 SEQ ID NO. 250 y 249). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota del constructo seguido por la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos seguida en marco por una etiqueta FLAG, seguida en marco por una secuencia que contiene varios sitios de restricción para fines de clonación y que codifica para un ligador artificial de 9 aminoácidos (SRTRSGSQL), seguida en marco por la secuencia codificante del dominio C-terminal, transmembrana 15 y extracelular truncado de MCSP humana y un codón de terminación. Se introdujeron sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADN. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento se digirió con EcoRI y SaII y se clonó en pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) siguiendo protocolos convencionales. Se usó un plásmido de secuencia verificada para transfectar células CHO/dhfr-(n.º de la ATCC: 20 CRL 9096). Se cultivaron las células en RPMI 1640 con glutamina estabilizada, suplementado con FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% (todos obtenidos de Biochrom AG Berlín, Alemania) y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) hasta una concentración final de adenosina 10 g/ml, desoxiadenosina 10 g/ml y timidina 10 g/ml, en un incubador a 37ºC, el 95% de humedad y el 7% de CO2. La transfección se realizó usando el reactivo de transfección PolyFect (Qiagen 25 GmbH, Hilden, Alemania) y 5 g de ADN de plásmido de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del cultivo durante 24 horas, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en RPMI 1640 con glutamina estabilizada y penicilina/estreptomicina al 1%. Por tanto, el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y, de ese modo, se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente de 14 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días, se sometieron a prueba 30 los transfectantes para determinar la expresión del constructo mediante análisis FACS. Se incubaron 2,5x105 células con 50 l de un anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido hasta 5 g/ml en PBS con FCS al 2%. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad de cabra anti-IgG de ratón conjugado con R-ficoeritrina específico de fragmento Fc-gamma diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un instrumento

35 FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania).

8. Clonación y expresión de los dominios C-terminal, transmembrana y extracelular truncado de MCSP de macaco

Se obtuvo la secuencia de ADNc del dominio C-terminal, transmembrana y extracelular truncado de MCSP de macaco (denominado D3 de macaco) mediante un conjunto de tres PCR sobre ADNc de piel de macaco (n.º de cat. C1534218-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania) usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a

40 94ºC, 3 min, 40 ciclos con 94ºC durante 0,5 min, 52ºC durante 0,5 min y 72ºC durante 1,75 min, ciclo final de 72ºC durante 3 min. Se utilizaron los siguientes cebadores:

cebador directo: 5’-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3’ (SEQ ID No. 361)

cebador inverso: 5’-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3’ (SEQ ID No. 362)

cebador directo: 5’-TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3’ (SEQ ID No. 363)

45 cebador inverso: 5’-CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3’ (SEQ ID No. 364)

cebador directo: 5’-GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3’ (SEQ ID No. 365)

cebador inverso: 5’-GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3’ (SEQ ID No. 366)

Esos fragmentos de PCR generaron tres fragmentos solapantes (A: 1-1329, B: 1229-2428, C: 1782-2547) que se aislaron y se secuenciaron de acuerdo con protocolos convencionales usando los cebadores de PCR y, de ese 50 modo, proporcionaron una parte de 2547 pb de la secuencia del ADNc de MCSP de macaco (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de esta parte de MCSP de macaco se enumeran en las SEQ ID NO. 252 y 251) desde 74 pb en el sentido de 5’ de la secuencia codificante del dominio C-terminal hasta 121 pb en el sentido de 3’ del codón de terminación. Se usó otra PCR usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94ºC durante 3 min, 10 ciclos con 94ºC durante 1 min, 52ºC durante 1 min y 72ºC durante 2,5 min, ciclo final de 72ºC durante 3 min

55 para fusionar los productos de PCR de las reacciones Ay B mencionadas anteriormente. Se usan los siguientes cebadores:

imagen46

cebador directo: 5’-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3’ (SEQ ID No. 367)

cebador inverso: 5’-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3’ (SEQ ID No. 368)

Los cebadores para esta PCR se diseñaron para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADNc que codifica para el dominio C-terminal, transmembrana y extracelular truncado de MCSP de macaco. Los 5 sitios de restricción introducidos, MfeI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de PCR se clonó después por medio de MfeI y SaII en un plásmido Bluescript que contenían el fragmento EcoRI/MfeI del plásmido pEF-DHFR mencionado anteriormente (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) reemplazando el dominio C-terminal, transmembrana y extracelular truncado de MCSP humana. El fragmento de síntesis génica contenía las secuencias codificantes del 10 péptido líder de inmunoglobulina y la etiqueta Flag, así como el ligador artificial (SRTRSGSQL) en marco con el extremo 5’ del fragmento de ADNc que codifica para el dominio C-terminal, transmembrana y extracelular truncado de MCSP de macaco. Este vector se usó para transfectar células CHO/dhfr-(n.º de la ATCC: CRL 9096). Las células se cultivaron en RPMI 1640 con glutamina estabilizada, complementado con FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% (todos de Biochrom AG Berlín, Alemania) y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para 15 cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de adenosina 10 g/ml, desoxiadenosina 10 g/ml y timidina 10 g/ml, en un incubador a 37ºC, el 95% de humedad y el 7% de CO2. La transfección se realizó con el reactivo de transfección PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 g de ADN de plásmido de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después el cultivo durante 24 horas, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en RPMI 1640 con glutamina estabilizada y 20 penicilina/estreptomicina al 1%. Por tanto, el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y, de ese modo, se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente 14 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días, se sometieron a prueba los transfectantes para determinar la expresión del constructo recombinante por medio de FACS. Se incubaron 2,5x105 células con 50 l de un anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido hasta 5 g/ml en PBS con

25 FCS al 2%. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad de cabra anti-IgG de ratón conjugado con R-ficoeritrina específico de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un instrumento FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania).

9. Generación y caracterización de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies de MCSP 30 y CD3

Se diseñaron moléculas de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio de unión específico entre especies para CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio de unión específico entre especies para MCSP humana y de primate distinto de chimpancé, tal como se expone en la siguiente tabla 1:

35 Tabla 1: Formatos de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de constructos proteicos (N → C)

190/189

MCSP-G4 HL x H2C HL

192/191

MCSP-G4 HL x F12Q HL

194/193

MCSP-G4 HL x I2C HL

196/195

MCSP-G4 HLP x F6A HLP

198/197

MCSP-G4 HLP x H2C HLP

202/201

MCSP-G4 HLP x G4H HLP

206/205

MCSP-G4 HLP x E1 L HLP

208/207

MCSP-G4 HLP x E2M HLP

212/211

MCSP-G4 HLP x F12Q HL

214/213

MCSP-G4 HLP x I2C HL

216/215

MCSP-D2 HL x H2C HL

218/217

MCSP-D2 HL x F12Q HL

220/219

MCSP-D2 HL x I2C HL

222/221

MCSP-D2 HLP x H2C HLP

224/223

MCSP-F9 HL x H2C HL

226/225

MCSP-F9 HLP x H2C HLP

228/227

MCSP-F9 HLP x G4H HLP

318/317

MCSP-A9 HL x H2C HL

320/319

MCSP-A9 HL x F12Q HL

322/321

MCSP-A9 HL x I2C HL

324/323

MCSP-C8 HL x I2C HL

328/327

MCSP-B7 HL x I2C HL

326/325

MCSP-B8 HL x I2C HL

imagen47

330/329

MCSP-G8 HL x I2C HL

332/331

MCSP-D5 HL x I2C HL

334/333

MCSP-F7 HL x I2C HL

336/335

MCSP-G5 HL x I2C HL

338/337

MCSP-F8 HL x I2C HL

340/339

MCSP-G10 HL x I2C HL

Se obtuvieron por síntesis génica los constructos mencionados anteriormente que contenían los dominios variable de cadena pesada (VH) y variable de cadena ligera (VH) específicos entre especies para MCSP D3 humana y de macaco y los dominios VH y VL específicos entre especies para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota del 5 constructo, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico respectivo, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta de 6 histidinas y un codón de terminación. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N-y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en 10 Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectaron los constructos manera forma estable o transitoria en células CHO deficientes en DHFR (n.º de la ATCC: CRL 9096) mediante electroporación o, de manera alternativa, en células HEK 293 (células de riñón embrionario humano, número de la ATCC: CRL-1573) de manera transitoria de acuerdo con

15 protocolos convencionales.

La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de los constructos se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio

20 líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F -68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20ºC.

Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (“IMAC”) usando un quelato Fractogel

25 EMD® (Merck) que se cargó con ZnCI2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:

30 Etapa 1: tampón al 20% en 6 volúmenes de columna

Etapa 2: tampón al 100% en 6 volúmenes de columna

Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y se adquirieron de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).

La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep. HiLoad 16/60 Superdex 200

35 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5%, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (velocidad de flujo de 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE convencional e inmunoanálisis de tipo Western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.

40 La proteína de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12% (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón de proteínas MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95%, tal como se determinó por SDS-PAGE.

45 El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, tal como se determina por filtración en gel en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Todos los constructos se purificaron de acuerdo con este método.

El análisis de inmunotransferencia de tipo Western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de inmunotransferencia de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección 50 de los anticuerpos de proteína de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico se usó un anticuerpo anti-etiqueta His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo de cabra anti-Ig de ratón marcado con

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fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo de cadena sencilla biespecífico purificado.

Alternativamente, los constructos se expresaron de manera transitoria en células CHO deficientes en DHFR. En resumen, se cultivaron 4 x 105 células por constructo en 3 ml de medio completo RPMI 1640 con glutamina 5 estabilizada complementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% y nucleósidos de una disolución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de adenosina 10 g/ml, desoxiadenosina 10 g/ml y timidina 10 g/ml, en un incubador a 37ºC, el 95% de humedad y el 7% de CO2 un día antes de la transfección. La transfección se realizó con reactivo de transfección Fugene 6 (Roche, n.º 11815091001) de acuerdo con el protocolo de fabricante. Se mezclan 94 l de 10 medio OptiMEM (Invitrogen) y 6 l de Fugene 6 y se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 1,5 g de ADN por constructo, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a 30 temperatura ambiente. Mientras tanto, se lavaron las células CHO deficientes en DHFR 1x con PBS y se resuspendieron en 1,5 ml de medio completo RPMI 1640. Se diluyó la mezcla de transfección con 600 l de medio completo RPMI 1640, se añadió a las células y se incubaron durante la noche a 37ºC, el 95% de humedad y el 7%

15 de CO2. El día después de la transfección, se aumentó el volumen de incubación de cada enfoque hasta 5 ml de medio completo RPMI 1640. Después de 3 días de incubación, se recogió el sobrenadante.

10. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3

Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre

20 especies con respecto a la capacidad de unión a MCSP D3 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se llevó a cabo un análisis FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con MCSP D3 humana (tal como se describe en el ejemplo 14) y la línea celular humana de leucemia de células T positiva para CD3 HPBALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para someter a prueba la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se sometió a prueba usando el transfectante de MCSP D3 de macaco generado (descrito en el ejemplo

25 15) y una línea de células T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 l de la proteína purificada de los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre especies (2 g/ml) o sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre

30 especies. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detectó la unión del constructo con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 l de PBS con FCS al 2%). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fc-gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de células T. Se usó un constructo de cadena sencilla con

35 especificidad de diana irrelevante como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con MCSP-D3.

Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medición de la intensidad de fluorescencia se realizaron tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan,

40 Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).

La unión biespecífica de las moléculas de cadena sencilla enumeradas anteriormente, que son específicas entre especies para MCSP D3 y específicas entre especies para CD3 humana y de macaco era claramente detectable, tal como se muestra en las figuras 10, 11, 12 y 39. En el análisis FACS, todos los constructos mostraron unión a CD3 y MCSP D3 en comparación con los correspondientes controles negativos. Se demostró la especificidad entre

45 especies de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y MCSP D3 humana y de macaco.

11. Bioactividad de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos específicos entre especies de EGFR y CD3

La bioactividad de los anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos generados se analizó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para MCSP D3 descritas en los ejemplos 7 y 8. Como células efectoras, se usan PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas,

50 PBMC humanas estimuladas o la línea de células T de macaco 4119LnPx, tal como se especifica en las respectivas figuras.

La generación de las PBMC con reducción de CD4/CD56 estimuladas se realizó tal como sigue:

Se recubrió previamente una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo, OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 g/ml durante 1 hora a 55 37ºC. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 -50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos convencionales. Se añadieron 3 -5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimularon durante 2

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días. En el tercer día se recogieron las células, se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a un concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Se enriquecieron linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ por disminución de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales.

5 Las células diana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 l de RPMI con FCS al 50% durante 45 minutos a 37ºC. Posteriormente, se lavaron las células diana marcadas 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 l de RPMI complementado (como anteriormente) con una razón E:O de 10:1. Se aplicaron 1 g/ml de las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies y 20

10 diluciones de tres veces de las mismas. Si se usa sobrenadante que contiene las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies, se aplicaron 21 diluciones de dos veces y 20 diluciones de tres veces de las mismas al ensayo de citotoxicidad en macaco y ser humano, respectivamente. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las

15 mediciones se realizaron por cuadruplicado. La medición de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Normalmente, las curvas sigmoidales de respuesta a la dosis tenían valores de R2 >0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la

20 comparación de la bioactividad.

Tal como se muestra en las figuras 13 a 17 y 40, todos los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies generados demostraron actividad citotóxica contra células diana positivas para MCSP D3 humana provocada por PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas o PBMC estimuladas y contra células diana positivas para MCSP D3 de macado provocada por la línea de células T de macaco 4119LnPx.

25 12. Estabilidad en plasma de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3

Se analizó la estabilidad de los anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos generados en plasma humano mediante la incubación de los anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos en plasma humano al 50% a 37ºC y a 4ºC durante 24 horas y la posterior realización de pruebas de bioactividad. Se estudió la bioactividad en un ensayo

30 de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando una línea de células CHO positiva para MCSP (que expresa MCSP clonado de acuerdo con el ejemplo 14 ó 15) como diana y células T humanas positivas para CD8 como células efectoras.

Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis descrito anteriormente se usaron para la comparación de la bioactividad de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos incubados con plasma humano al 50% durante 24

35 horas a 37ºC y a 4ºC respectivamente con anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos sin adición de plasma o mezclados con la misma cantidad de plasma inmediatamente antes del ensayo.

Tal como se muestra en la figura 18 y en la tabla 2, la bioactividad de los anticuerpos biespecíficos G4 H-L x I2C H-L, G4 H-L x H2C H-L y G4 H-L x F12Q H-L no disminuyó significativamente en comparación con los controles sin la adición de plasma o con la adición de plasma inmediatamente antes de realizar las pruebas de bioactividad.

40 Tabla 2: Bioactividad de los anticuerpos biespecíficos sin o con la adición de plasma

Constructo

Sin plasma Con plasma Plasma a 37ºC Plasma a 4ºC

G4 H-L x I2C H-L

300 796 902 867

G4 H-L x H2C H-L

496 575 2363 1449

G4 H-L x F12Q H-L

493 358 1521 1040

13. La redistribución de células T circulantes en ausencia de células diana circulantes mediante exposición en primer lugar a moléculas de unión a CD3 dirigidas a epítopos de CD3 convencionales, es decir, dependientes de contexto, es un factor de riesgo importante de acontecimientos adversos relacionados con el inicio del tratamiento

Redistribución de células T en pacientes con linfoma no Hodgkin de células B (B-NHL) tras el inicio del tratamiento 45 con la molécula de unión a CD3 convencional

Una molécula de unión a CD19xCD3 convencional es una molécula de unión a CD3 del formato de scFv en tándem específico (Loffler (2000, Blood, volumen 95, número 6) o el documento WO 99/54440). Consiste en dos partes de unión diferentes dirigida a (i) CD19 sobre la superficie de células B humanas normales y malignas y (ii) CD3 sobre células T humanas. Mediante la reticulación de CD3 en células T con CD19 en células B, este constructo

50 desencadena la lisis redirigida de células B normales y malignas por la actividad citotóxica de células T.

El epítopo de CD3 reconocido por una molécula de unión a CD3 convencional de este tipo se localiza en la cadena de CD3 épsilon, en donde sólo adopta la conformación correcta si está incrustado dentro del resto de la cadena épsilon y se mantiene en la posición correcta mediante heterodimerización de la cadena épsilon con la cadena o bien gamma o bien delta de CD3.

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La interacción de este epítopo altamente dependiente del contexto con una molécula de unión a CD3 convencional (véanse por ejemplo, Loffler (2000, Blood, volumen 95, número 6) o el documento WO 99/54440), incluso cuando se 5 produce de una forma puramente monovalente y sin ninguna reticulación, puede inducir un cambio alostérico en la conformación de CD3 que conduce a la exposición de una región rica en prolina de lo contrario escondida dentro del dominio citoplasmático de CD3 épsilon. Una vez expuesta, la región rica en prolina puede reclutar la molécula de transducción de señales Nck2, que puede desencadenar además señales intracelulares. Aunque esto no es suficiente para una activación de células T completa, que requiere definitivamente la reticulación de varias moléculas 10 CD3 sobre la superficie de células T, por ejemplo, mediante reticulación de varias moléculas anti-CD3 unidas a varias moléculas CD3 en una célula T por varias moléculas CD19 sobre la superficie de una célula B, la interacción monovalente pura de moléculas de unión a CD3 convencionales con su epítopo dependiente del contexto en CD3 épsilon no es todavía inerte para células T en cuanto a señalización. Sin querer restringirse a la teoría, las moléculas de unión a CD3 convencionales monovalentes (conocidas en la técnica) pueden inducir algunas reacciones de 15 células T cuando se infunden en seres humanos incluso en aquellos casos en los que no están disponibles células diana circulantes para la reticulación de CD3. Una reacción de células T importante para la infusión intravenosa de molécula de unión a CD19xCD3 convencional monovalente en pacientes con B-NHL que no tienen esencialmente células B positivas para CD19 circulantes es la redistribución de células T tras el inicio del tratamiento. Se ha encontrado en un ensayo clínico en fase I que esta reacción de células T se produce durante la fase inicial de la 20 infusión intravenosa de moléculas de unión a CD19xCD3 en todos los individuos sin células B diana positivas para CD19 de manera esencialmente independiente de la dosis de molécula de unión a CD19xCD3 (figura 19). Sin embargo, se ha encontrado que aumentos súbitos en la exposición a moléculas de unión a CD19xCD3 desencadenan prácticamente la misma reacción de redistribución de células T en estos pacientes tras la exposición inicial de células T a molécula de unión a CD19xCD3 al inicio del tratamiento (figura 20 A) e incluso aumentos 25 graduales en la exposición a moléculas de unión a CD19xCD3 pueden tener todavía efectos de redistribución sobre células T circulantes (figura 21). Además, se ha encontrado que esta reacción de redistribución de células T esencialmente independiente de la dosis en ausencia de células diana circulantes tal como se desencadena por moléculas de unión a CD3 convencionales como la molécula de unión a CD19xCD3 (por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento WO 99/54440) en el 100% de todos los individuos tratados es un factor de riesgo

30 importante de acontecimientos adversos relacionados con el inicio del tratamiento.

Según el protocolo del estudio, se reclutaron pacientes con linfoma no Hodgkin de células B (B-NHL) indolente con recidiva confirmada histológicamente incluyendo linfoma de células del manto en un ensayo de etiqueta abierta, multicéntrico, de aumento a escala de la dosis entre pacientes de fase I. El protocolo del estudio fue aprobado por los comités éticos independientes de todos los centros participantes y se envió para su notificación a la autoridad 35 reguladora responsable. Para su inclusión en el estudio, se requirió enfermedad medible (al menos una lesión  1,5 cm) tal como se documenta mediante exploración CT. Los pacientes recibieron molécula de unión a CD19xCD3 convencional mediante infusión intravenosa continua con un sistema de minibomba portátil a lo largo de cuatro semanas a velocidad de flujo constante (es decir, nivel de dosis). Se hospitalizaron los pacientes durante las primeras dos semanas de tratamiento antes de que se les diera el alta del hospital y continuaron el tratamiento en 40 casa. A los pacientes sin evidencia de progresión de la enfermedad tras cuatro semanas se les ofreció continuar el tratamiento durante cuatro semanas adicionales. Hasta la fecha se sometieron a prueba seis niveles de dosis diferentes sin alcanzar una dosis tolerada máxima (MTD): 0,5, 1,5, 5, 15, 30 y 60 g/m2/24 h. Las cohortes consistían en tres pacientes cada una si se observaron acontecimientos adversos definidos por el protocolo del estudio como DLT (toxicidad limitante de la dosis). En caso de una DLT entre los primeros tres pacientes, se 45 expandió la cohorte a seis pacientes, que, en ausencia de una segunda DLT, permitió además un aumento a escala de la dosis. Por consiguiente, los niveles de dosis sin DLT en cohortes con 3 pacientes o con una DLT en cohortes con 6 pacientes se consideraron seguros. Se detuvo el tratamiento del estudio en todos pacientes que desarrollaron una DLT. A 15 y 30 g/m2/24 h, se sometieron a prueba diferentes modos de inicio del tratamiento durante las primeras 24 h en varias cohortes adicionales: (i) aumento gradual tras una dosis de mantenimiento de 5 g/m2/24 h 50 durante las primeras 24 h hasta 15 g/m2/24 h (cohortes de pacientes con etapa de 15), (ii) aumento continuo uniforme de la velocidad de flujo desde casi cero hasta 15 ó 30 2/24 h (cohortes de pacientes con rampa de 15 y rampa de 30) e (iii) inicio de la dosis de mantenimiento desde el mismo comienzo (cohortes de pacientes con plano de 15, plano de 30 y plano de 60). Las cohortes de pacientes a los niveles de dosis de 0,5, 1,5 y 5 g/m2/24 h se iniciaron todas con la dosis de mantenimiento desde el mismo comienzo (es decir, inicio plano). Los transcursos de

55 tiempo de los recuentos de células B y T absolutos en sangre periférica se determinaron mediante análisis FACS de cuatro colores tal como sigue:

Recogida de muestras de sangre y análisis de rutina

En las cohortes de pacientes de rampa de 15, plano de 15, rampa de 30, plano de 30 y plano de 60, se obtuvieron muestras de sangre (6 ml) antes y 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48 horas tras el inicio de la infusión de la molécula de unión 60 a CD19xCD3 (tal como se da a conocer en el documento WO 99/54440) así como en los días de tratamiento 8, 15, 17, 22, 24, 29, 36, 43, 50, 57 y 4 semanas tras el inicio de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3 convencional usando tubos Vacutainer™ (Becton Dickinson) que contenían EDTA que se enviaron para su análisis a

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4ºC. En las cohortes de pacientes de etapa de 15, se obtuvieron muestras de sangre (6 ml) antes y 6, 24, 30, 48 horas tras el inicio de la infusión de la molécula de unión a CD19xCD3 así como en los días de tratamiento 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 y 4 semanas tras el inicio de la infusión de la molécula de unión a CD19xCD3. A niveles de dosis de 0,5, 1,5 y 5 g/m2/24 h, se obtuvieron muestras de sangre (6 ml) antes y 6, 24, 48 horas tras el inicio de la

5 infusión de molécula de unión a CD19xCD3 binding así como en los días de tratamiento 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 y 4 semanas tras el inicio de la infusión de la molécula de unión a CD19xCD3. En algunos casos se produjeron ligeras variaciones de estos puntos de tiempo por motivos operativos. El análisis FACS de subpoblaciones de linfocitos se realizó en el plazo de 24 -48 h tras la recogida de muestras de sangre. Se determinaron los números absolutos de subpoblaciones de leucocitos en las muestras de sangre a través de análisis de sangre diferencial en un instrumento CoulterCounter™ (Coulter).

Aislamiento de PBMC de muestras de sangre

Se realizó el aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) mediante un protocolo de separación en gradiente de Ficoll™ adaptado. Se transfirió sangre a temperatura ambiente a tubos Leucosep™ de 10 ml (Greiner) cargados previamente con 3 ml de disolución Biocoll™ (Biochrom).

15 Se llevó a cabo la centrifugación en un rotor articulado durante 15 min a 1700xg y 22ºC sin deceleración. Se aislaron las PBMC por encima de la capa de Biocoll™, se lavaron una vez con tampón de FACS (PBS / FBS al 2% [suero bovino fetal; Biochrom]), se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de FACS. La centrifugación durante todas las etapas de lavado se llevó a cabo en un rotor articulado durante 4 min a 800xg y 4ºC. Cuando resultó necesario, se realizó la lisis de eritrocitos incubando las PBMC aisladas en 3 ml de tampón de lisis de eritrocitos (8,29 g de NH4Cl, 1,00 g de KHCO3, 0,037 g de EDTA, y 1,0 l de H2Obidest, pH 7,5) durante 5 min a temperatura ambiente seguido por una etapa de lavado con tampón de FACS.

Tinción de PBMC con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de la superficie celular

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales de Invitrogen (1n.º de cat. MHCD1301, 2n.º de cat. MHCD1401), Dako (5n.º de cat. C7224) o Becton Dickinson (3n.º de cat. 555516, 4n.º de cat. 345766) usados según las recomendaciones de

25 los fabricantes. Se tiñeron 5x105-1x106 células con la siguiente combinación de anticuerpos: anti-CD131 / anti-CD142 (FITC) x anti-CD563 (PE) x anti-CD34 (PerCP) x anti-CD195 (APC). Se sedimentaron las células en placas de multititulación de 96 pocillos en forma de V (Greiner) y se retiró el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos celulares en un volumen total de 100 l que contenía los anticuerpos específicos diluidos en tampón de FACS. Se llevó a cabo la incubación en la oscuridad durante 30 min a 4ºC. Posteriormente, se lavaron las muestras dos veces con tampón de FACS y se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón de FACS para análisis de citometría de flujo.

Detección por citometría de flujo de linfocitos teñidos mediante FACS

Se realizó la recogida de datos con un instrumento BD FACSCalibur™ (Becton Dickinson) de 4 colores. Para cada medición se adquirieron 1x104 células de subpoblaciones de linfocitos definidas. Se realizó análisis estadístico con el

35 programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obtener los porcentajes de subpoblaciones de linfocitos y para clasificar la intensidad de expresión de moléculas de superficie celular. Posteriormente, se correlacionaron los porcentajes de subconjuntos de linfocitos individuales relacionados con los linfocitos totales (es decir, células B más T más NK excluyendo cualquier célula mieloide por medio de tinción con CD13/14) tal como se determina mediante FACS con el recuento de linfocitos a partir del análisis de sangre diferencial para calcular los números de células absolutos de células T (CD3+, CD56-, CD13/14-) y células B (CD19+, CD13/14-).

En la (figura 19) se muestra la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD19xCD3 convencionales (por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento WO 99/54440) en todos aquellos pacientes que no tenían esencialmente células B positivas para CD19 circulantes al inicio del tratamiento. Para comparación, en la figura 22 se muestra un ejemplo representativo de redistribución de células T durante la

45 fase inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD19xCD3 en un paciente con un número significativo de células B positivas para CD19 circulantes.

En ambos casos (es decir, esencialmente ninguna o muchas células B circulantes) los recuentos de células T circulantes disminuyen rápidamente tras el inicio del tratamiento. Sin embargo, en ausencia de células B circulantes, las células T tienden a regresar a la sangre circulante de manera muy temprana, mientras que el regreso de las células T a la sangre circulante de aquellos pacientes que tienen un número significativo de células B circulantes al inicio del tratamiento se retrasa habitualmente hasta que se reducen estas células B circulantes. Por tanto, los patrones de redistribución de células T difieren principalmente en la cinética de la reaparición de células T en la sangre circulante.

Se llevó a cabo la evaluación de la eficacia basándose en exploración CT mediante radiología de referencia central

55 tras 4 semanas de tratamiento y en pacientes que recibieron 4 semanas adicionales también tras 8 semanas de tratamiento más en todos los casos cuatro semanas tras el inicio del tratamiento.

La desaparición y/o normalización de tamaño de todas las lesiones conocidas (incluyendo un bazo agrandado) más el aclaramiento de la médula ósea de células de linfoma en casos de infiltración en la médula ósea se contó como respuesta completa (CR). La reducción en al menos el 50% desde el nivel inicial de la suma de productos de los dos diámetros mayores (SPD) de cada lesión objetivo predefinida se definió como respuesta parcial (PR); una reducción en al menos el 25% se consideró una respuesta mínima (MR). Se definió la enfermedad progresiva (PD) como 

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5 50% de aumento de SPD desde el nivel inicial. Las desviaciones de SPD desde el nivel inicial entre +50% y -25% se consideraron enfermedad estable (SD).

La demografía de pacientes, las dosis recibidas y el desenlace clínico en 34 pacientes se resumen en la tabla 3. La actividad antitumoral clínica de la molécula de unión a CD19xCD3 era claramente dependiente de la dosis: Se observó una reducción sistemática de células B positivas para CD19 (linfoma) de la sangre periférica desde

10 5 g/m2/24 h en adelante. A 15 g/m2g/m2/24 h se registraron las primeras respuestas clínicas objetivas (PR y CR) así como casos de eliminación parcial y completa de células B de linfoma de médula ósea infiltrada. Finalmente, a 60 g/m2/24 h la tasa de respuesta aumentó hasta el 100% (PR y CR) y el aclaramiento de la médula ósea de células B de linfoma era completo en todos los casos evaluables.

La molécula de unión a CD19xCD3 se toleró bien por la mayoría de los pacientes. Los acontecimientos adversos

15 más frecuentes de grados 1-4 en 34 pacientes, independientemente de la causa, se resumen en la tabla 4. Los acontecimientos adversos relacionados con la molécula de unión a CD19xCD3 habitualmente eran transitorios y completamente reversibles. En particular, hubo 2 pacientes (pacientes n.º 19 y n.º 24 en la tabla 3) esencialmente sin células B positivas para CD19 circulantes cuyo tratamiento se detuvo de manera temprana debido a acontecimientos adversos en el SNC (síntomas principales: confusión y desorientación) relacionados con una

20 redistribución de células T repetida durante la fase inicial de infusión de molécula de unión a CD19xCD3.

Uno de estos pacientes (n.º 19) estaba en la cohorte de etapa de 15. Recibió 5 g/m2/24 h de molécula de unión a CD19xCD3 durante las primeras 24 h seguido por un aumento súbito hasta una dosis de mantenimiento de 15 g/m2/24 h. El patrón correspondiente de redistribución de células T muestra que los recuentos de células T circulantes disminuyeron rápidamente tras el inicio de la infusión a 5 g/m2/24 h seguido por una reaparición 25 temprana de células T en la sangre circulante esencialmente sin células B positivas para CD19 circulantes. Como consecuencia, los recuentos de células T periféricas se habían recuperado completamente cuando se aumentó la dosis de molécula de unión a CD19xCD3 tras 24 h desde 5 hasta 15 g/m2/24 h. Por tanto, la etapa de dosis pudo desencadenar un segundo episodio de redistribución de células T tal como se muestra en la figura 20A. Esta redistribución de células T repetida estaba relacionada con efectos secundarios en el SNC (síntomas principales: 30 confusión y desorientación) en este paciente, que condujeron a la detención de la infusión. La relación entre redistribución de células T repetida y tales acontecimientos adversos en el SNC también se observó en ensayos clínicos en fase I previos en pacientes con B-NHL que recibieron molécula de unión a CD19xCD3 (por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento WO 99/54440) como infusión en bolo repetida durante 2 a 4 horas cada una seguida habitualmente por 2 días de intervalo libre de tratamiento (figura 20 B). Cada infusión en bolo individual 35 desencadenó un episodio de redistribución de células T que consiste en una disminución rápida en los recuentos de células T circulantes y la recuperación de células T antes de la siguiente infusión en bolo. En total, se observaron acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de células T repetida en 5 de 21 pacientes. La figura 20B muestra el ejemplo representativo de un paciente de los ensayos de infusión en bolo, que desarrolló síntomas en el SNC tras el tercer episodio de redistribución de células T. Normalmente, los pacientes con

40 acontecimientos adversos en el SNC en los ensayos de infusión en bolo también tenían bajos recuentos de células B circulantes.

El segundo paciente (n.º 24) del ensayo de infusión continua, cuyo tratamiento se detuvo de manera temprana debido a acontecimientos adversos en el SNC (síntomas principales: confusión y desorientación) relacionados con la redistribución de células T repetida durante la fase inicial de infusión de molécula de unión a CD19xCD3, estaba en 45 la cohorte de plano de 15. Por error, este paciente recibió una infusión de molécula de unión a CD19xCD3 sin HSA adicional tal como se requería para la estabilización del fármaco. El flujo de fármaco irregular resultante desencadenó episodios repetidos de redistribución de células T en lugar de sólo uno (figura 23A) con la consecuencia de que la infusión tuvo que detenerse debido al desarrollo de síntomas en el SNC. Aún, cuando el paciente reinició correctamente el tratamiento con disolución de molécula de unión a CD19xCD3 que contenía HSA 50 adicional para la estabilización del fármaco (por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento WO 99/54440), no se observó redistribución de células T repetida y el paciente no desarrolló de nuevo ningún síntoma en el SNC (figura 23B). Debido a que este paciente no tenía tampoco esencialmente células B circulantes, las células T circulantes pudieron reaccionar con cinética de redistribución rápida incluso a cambios sutiles en la exposición al fármaco tal como se observó. Los acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de células 55 T en pacientes que no tienen esencialmente células diana circulantes pueden explicarse por un aumento transitorio de la adhesión de células T a las células endoteliales seguido por una adhesión simultánea masiva de células T circulantes a las paredes de los vasos sanguíneos con una caída consecutiva de los números de células T en la sangre circulante tal como se observó. La unión simultánea masiva de células T a las paredes de los vasos sanguíneos puede provocar un aumento en la activación de células endoteliales y la permeabilidad endotelial. Las 60 consecuencias del aumento de la permeabilidad endotelial son desplazamientos de fluidos desde el compartimento intravascular a los compartimentos del tejido intersticial incluyendo el intersticio del SNC. La activación de células endoteliales por células T unidas puede tener efectos procoagulatorios (Monaco et al. J Leukoc Biol 71 (2002) 659668) con posibles alteraciones en el flujo de sangre (incluyendo flujo de sangre cerebral) particularmente con respecto a la microcirculación capilar. Por tanto, acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de células T en pacientes esencialmente sin células diana circulantes pueden ser la consecuencia de fuga capilar y/o alteraciones en la microcirculación capilar a través de la adherencia de células T a células 5 endoteliales. El estrés endotelial provocado por un episodio de redistribución de células T lo toleran la mayoría de los pacientes, mientras que el estrés endotelial potenciado provocado por la redistribución de células T repetida provoca frecuentemente acontecimientos adversos en el SNC. Más de un episodio de redistribución de células T puede ser menos peligroso sólo en pacientes que tienen bajos recuentos iniciales de células T circulantes. Sin embargo, también el estrés endotelial limitado provocado por un episodio de redistribución de células T puede

imagen53

10 provocar acontecimientos adversos en el SNC en casos raros de aumento de la susceptibilidad a tales acontecimientos tal como se observa en 1 de 21 pacientes en los ensayos de infusión en bolo con la molécula de unión a CD19xCD3.

Sin querer restringirse a la teoría, el aumento transitorio de adhesión de células T a las células endoteliales en pacientes que no tienen esencialmente células diana circulantes puede explicarse como una reacción de células T a 15 la interacción monovalente de una molécula de unión a CD3 convencional, como la molécula de unión a CD19xCD3 (por ejemplo, el documento WO 99/54440), a su epítopo dependiente del contexto en CD3 épsilon que da como resultado un cambio alostérico en la conformación de CD3 seguido por el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplasmático de CD3 épsilon tal como se describió anteriormente. Puesto que Nck2 se une directamente a integrinas por medio de PINCH e ILK (figura 28), el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplasmático de CD3 épsilon

20 que sigue a un cambio alostérico en la conformación de CD3 a través de la unión de una molécula de unión a CD3 convencional, como la molécula de unión a CD19xCD3, a su epítopo dependiente del contexto en CD3 épsilon, puede aumentar la adhesión de células T a células endoteliales por el cambio transitorio de integrinas en la superficie de células T a su isoforma más adhesiva por medio de señalización de dentro a fuera.

Tabla 3. Demografía de pacientes y desenlace clínico *Respuestas completa (CR) y parcial (PR) confirmadas de manera central mediante criterios de Cheson en negrita; MR, respuesta mínima (de 25 a <50%); SD, enfermedad estable; PD, enfermedad progresiva; duración desde la primera documentación de la respuesta entre paréntesis; + indica una respuesta en curso

Cohorte

Paciente Edad/ sexo Enfermedad (clasificación de Ann Arbor) Nivel de dosis [g/m2/día] Aclaramiento de la médula ósea Mejor respuesta* (duración de CR en meses o semanas)

1

1

71/m IC, Binet C 0,0005 Ninguno SD

2

67/f MCL, estadio IV/A/E 0,0005 n.d. PD

3

67/m CLL, estadio IV/B/E 0,0005 n.d. MR

2

4 69/m MCL, estadio IV/B 0,0015 n.i. SD

5

49/m MCL, estadio IV/A/S 0,0015 n.d. SD

6

71/m MCL, estadio IV/B/E 0,0015 n.i. PD

7

77/m MCL, estadio IV/B/E/S 0,0015 n.i. SD

8

65/m CLL, estadio IV/B/E/S 0,0015 n.d. PD

9

75/m FL, estadio II/B 0,0015 n.i. SD

3

10 58/m MCL, estadio III/B/S 0,005 n.i. PD

11

68/f FL, estadio IV/B 0,005 n.d. SD

12

65/m MCL, estadio III/A/E 0,005 n.i. SD

4a

13 60/m SLL, estadio IV/B/S 0,015 Completo PR

14

73/m MCL, estadio II/A/E 0,015 n.i. SD

15

44/m FL, estadio IV/B/E/S 0,015 Parcial PR

16

61/m FL, estadio IV/A/S 0,015 Completo CR (7mo)

17

67/m MZL, estadio IV/B/S 0,015 n.i. n.e.

18

64/m FL, estadio IV/A/E 0,015 n.i. PD

19

75/m MCL, estadio III/A 0,015 n.i. n.e.

20

65/f FL; estadio III/A 0,015 n.i. SD

21

60/m MCL, estadio IV/A/E 0,015 Ninguno SD

22

67/f FL, estadio IV/B 0,015 Completo MR

23

67/m DLBCL, estadio III/B 0,015 n.i. n.e.

24

65/f FL, estadio III/A 0,015 n.d. SD

25

74/f WD, estadio IV/B 0,015 Parcial SD

5

26 67/m MCL, estadio IV/A 0,03 Completo SD

27

48/m FL, estadio III/A 0,03 n.i. PD

28

58/m MCL, estadio III/A 0,03 n.i. CR (10mo+)

29

45/f MCL, estadio IV/B 0,03 Parcial PD

30

59/m MZL, estadio III/A 0,03 n.i. n.e.

31

43/m FL, estadio III/A 0,03 n.i. MR

6

32 72/m MCL, estadio IV/A 0,06 Completo PR

33

55/m MCL, estadio IV/B 0,06 Completo CR (4mo+)

34

52/m FL, estadio IV/A 0,06 n.i. CRb (1w+)

imagen54

aLa cohorte 4 se expandió para estudiar tres programas diferentes de inicio del tratamiento

5 bPR tras 8 semanas de tratamiento que se convirtió en una CR tras un ciclo de tratamiento adicional de 4 semanas a la misma dosis tras 7 semanas de intervalo libre de tratamiento n.e.: no evaluable, debido a que el periodo de tratamiento <7 d n.d.: no determinado (infiltrado, pero no se realizó una segunda biopsia al final del tratamiento) n.i.: no infiltrado al inicio del tratamiento

10 Tabla 4. Incidencia de acontecimientos adversos observados durante el tratamiento Las abreviaturas usadas son: AE, acontecimiento adverso; AP, fosfatasa alcalina; LDH, lactato deshidrogenasa; CRP, proteína C reactiva; ALT, alanina transaminasa; AST, aspartato transaminase; GGT, gamma-glutamil transferasa; no se incluyeron los datos de AE del ciclo de tratamiento adicional del paciente 34.

Acontecimientos adversos independientemente de la relación, que se producen en  3 pacientes (N=34)

Grado 1-4 N (%) Grado 3-4 N (%)

Pirexia

22 (64,7) 2 (5,9)

Leucopenia

21 (61,8) 11 (32,4)

Linfopenia

21 (61,8) 21 (61,8)

Coagulopatía (aumento de dímeros D)

16 (47,1) 6 (17,6)

Anomalía enzimática (AP, LDH, CRP)

16 (47,1) 10 (29,4)

Anomalía de la función hepática (ALT, AST, GGT)

16 (47,1) 1 (2,9)

Anemia

13 (38,2) 5 (14,7)

Escalofrío

13 (38,2) 0 (0,0)

Cefalea

12 (35,3) 1 (2,9)

Hipocalemia

12 (35,3) 2 (5,9)

Trombocitopenia

12 (35,3) 6 (17,6)

Aumento de peso

12 (35,3) 0 (0,0)

Hiperglucemia

11 (32,4) 2 (5,9)

Neutropenia

11 (32,4) 8 (23,5)

Hematuria

10 (29,4) 0 (0,0)

Edema periférico

10 (29,4) 2 (5,9)

Anorexia

9 (26,5) 1 (2,9)

Diarrea

9 (26,5) 0 (0,0)

Disminución de peso

9 (26,5) 0 (0,0)

Fatiga

8 (23,5) 1 (2,9)

Proteinuria

8 (23,5) 0 (0,0)

Hipocalcemia

7 (20,6) 2 (5,9)

Anomalía de enzimas pancreáticas

7 (20,6) 0 (0,0)

Tos

6 (17,6) 0 (0,0)

Disnea

6 (17,6) 0 (0,0)

Dolor de espalda

5 (14,7) 0 (0,0)

Dolor en el sitio del catéter

5 (14,7) 0 (0,0)

Hiperbilirubinemia

5 (14,7) 2 (5,9)

Hipoalbuminemia

5 (14,7) 0 (0,0)

Hipogammaglobulinemia

5 (14,7) 1 (2,9)

Hipoproteinemia

5 (14,7) 0 (0,0)

Efusión pleural

5 (14,7) 1 (2,9)

Vómitos

5 (14,7) 0 (0,0)

Astenia

4 (11,8) 1 (2,9)

Estado de confusión

4 (11,8) 0 (0,0)

Estreñimiento

4 (11,8) 0 (0,0)

Mareo

4 (11,8) 0 (0,0)

Hipertensión

4 (11,8) 0 (0,0)

Hiponatremia

4 (11,8) 2 (5,9)

Sequedad de la mucosa

4 (11,8) 0 (0,0)

Espasmos musculares

4 (11,8) 0 (0,0)

Náuseas

4 (11,8) 0 (0,0)

Sudores nocturnos

4 (11,8) 0 (0,0)

Dolor abdominal

3 (8,8) 1 (2,9)

Ascitis

3 (8,8) 0 (0,0)

Hipercoagulación

3 (8,8) 0 (0,0)

imagen55

Hiperhidrosis

3 (8,8) 0 (0,0)

Hipoglobulinemia

3 (8,8) 0 (0,0)

Insomnio

3 (8,8) 0 (0,0)

Trastorno hepático

3 (8,8) 1 (2,9)

Nasofaringitis

3 (8,8) 0 (0,0)

Prurito

3 (8,8) 0 (0,0)

Tal como se explicó anteriormente, las moléculas de unión a CD3 convencionales (por ejemplo, tal como se dan a

5 conocer en el documento WO 99/54440) que pueden unirse a un epítopo dependiente del contexto, aunque funcionales, conducen al efecto no deseado de redistribución de células T en pacientes que provoca acontecimientos adversos en el SNC. En cambio, las moléculas de unión de la presente invención, al unirse a los 127 aminoácidos N-terminales independientemente del contexto de la cadena de CD3 épsilon, no conducen a tales efectos de redistribución de células T. Como consecuencia, las moléculas de unión a CD3 de la invención están

10 asociadas con un mejor perfil de seguridad en comparación con moléculas de unión a CD3 convencionales.

14. Moléculas de unión a CD3 biespecíficas de la divulgación que inducen lisis de células diana mediada por células T reconociendo un antígeno diana de la superficie reducen células positivas para el antígeno diana in vivo

Una molécula de unión a CD3 biespecífica de la divulgación que reconoce CD33 como antígeno diana reduce monocitos circulantes positivos para CD33 de la sangre periférica de monos cynomolgus

15 Se produjo CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO. 267) mediante expresión en células CHO usando la secuencia de nucleótidos codificante SEQ ID NO. 268. Las secuencias codificantes de (i) un líder de cadena pesada de inmunoglobulina N-terminal que comprende un codón de iniciación incrustado dentro de una secuencia consenso de Kozak y (ii) una etiqueta de His6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unieron ambas en marco a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 268 antes de la inserción del fragmento de ADN

20 resultante tal como se obtuvo mediante síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevó a cabo la transfección estable de células CHO deficientes en DHFR, la selección de transfectantes positivos para DHFR que secretan la molécula de unión a CD3 CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL al sobrenadante de cultivo y la amplificación génica con metotrexato para aumentar los niveles de expresión tal como se describió (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995)

25 7021-7025). El perfil de SEC analítica de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL para su uso en monos cynomolgus reveló que el material de prueba consistía casi exclusivamente de monómero. Se midió la potencia del material de prueba en un ensayo de citotoxicidad tal como se describe en el ejemplo 16.5 usando células CHO transfectadas con CD33 de cynomolgus como células diana y la línea de células T de macaco 4119LnPx como fuente de células efectoras (figura 25). Se determinó que la concentración de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL requerida para lograr la mitad de la

30 lisis de células diana máxima por las células T efectoras (CE50) era de 2,7 ng/ml.

Se trataron monos cynomolgus (Macaca fascicularis) adultos jóvenes (aproximadamente 3 años de edad) mediante infusión intravenosa continua de molécula de unión a CD3 CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL a diferentes velocidades de flujo (es decir, niveles de dosis) para estudiar la reducción de monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica. Esta situación es equivalente al tratamiento con la molécula de unión a CD3 convencional 35 CD19xCD3 (específica para CD19 en células B y CD3 en células T) de esos pacientes con B-NHL, que tienen células B diana positivas para CD19 circulantes (véase por ejemplo, el documento WO99/54440). La reducción de células B diana positivas para CD19 circulantes de la sangre periférica se había convertido en un sustituido válido para la eficacia clínica general de la molécula de unión a CD3 convencional (CD19xCD3 tal como se proporciona en el documento WO99/54440) en pacientes con malignomas de células B positivos para CD19 como B-NHL.

40 Asimismo, la reducción de monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica se considera como un sustituto válido de la eficacia clínica general de moléculas de unión a CD3 dirigidas a CD33 de la divulgación como CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL en pacientes con malignomas mieloides positivos para CD33 como AML (leucemia mieloide aguda).

Se llevó a cabo infusión continua según el método de Swivel tal como sigue: Se cateterizaron los monos por medio

45 de la vena femoral al interior de la vena cava caudal usando un catéter venoso. El catéter se tunela subcutáneamente hasta la región del hombro dorsal y se saca al exterior en la escápula caudal. Entonces se hace pasar un tubo a través de una camisa y un resorte de protección. Se ajusta la camisa alrededor del animal y el catéter, por medio del tubo, se conecta a una bomba de infusión.

Se infundió de manera continua la disolución de administración (lisina 1,25 M, tween 80 al 0,1%, pH 7) sin material

50 de prueba a 48 ml/24 h durante 7 días antes del inicio del tratamiento para permitir la aclimatación de los animales a las condiciones de infusión. Se inició el tratamiento añadiendo material de prueba de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL a la disolución de administración a la cantidad requerida para cada nivel de dosis individual que iba a someterse a prueba (es decir, la velocidad de flujo de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL). Se cambió el depósito de infusión cada día a lo largo de toda la fase de aclimatación y tratamiento. La duración planeada del tratamiento fue de 7 días excepto para el nivel de dosis de 120 g/m2/24 h, en el que los animales recibieron 14 días de tratamiento.

imagen56

Se determinaron los transcursos de tiempo de los recuentos absolutos en células T circulantes y monocitos positivos para CD33 mediante análisis FACS de 4 ó 3 colores, respectivamente:

5 Recogida de muestras de sangre y análisis de rutina

Se obtuvieron muestras de sangre (1 ml) antes y 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 horas tras el inicio de la infusión continua con MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL así como tras 7 y 14 días (y tras 9 días en el nivel de dosis de 120 g/m2/24 h) de tratamiento usando tubos Vacutainer™ (Becton Dickinson) que contenían EDTA que se enviaron para su análisis a 4ºC. En algunos casos se produjeron ligeras variaciones de estos puntos de tiempo por motivos

10 operativos. Se realizó el análisis FACS de subpoblaciones de linfocitos en el plazo de 24 -48 h tras la recogida de muestras de sangre. Se determinaron los números absolutos de subpoblaciones de leucocitos en las muestras de sangre a través de análisis de sangre diferencial en un laboratorio veterinario de rutina.

Aislamiento de PBMC de muestras de sangre

Se aislaron PBMC (células mononucleares de sangre periférica) en analogía al protocolo descrito en el ejemplo 13, 15 anteriormente, con adaptaciones de los volúmenes usados.

Tinción de PBMC con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de superficie celular

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos de cynomolgus de Becton Dickinson (1n.º de cat. 345784, 2n.º de cat. 556647, 3n.º de cat. 552851, 6n.º de cat. 557710), Beckman Coulter (4n.º de cat. IM2470) y Miltenyi (5n.º de cat. 130-091-732) y se usaron según las recomendaciones de los fabricantes. Se tiñeron 5x105

20 1x106 células con las siguientes combinaciones de anticuerpos: anti-CD141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP) x anti-CD194 (APC) y anti-CD141 (FITC) x anti-CD335 (PE) x anti-CD166 (Alexa Fluor 647™). Se realizaron etapas adicionales tal como se describió en el ejemplo 13, anteriormente.

Detección por citometría de flujo linfocitos teñidos mediante FACS

Se realizó la recogida de datos con un instrumento BD FACSCalibur™ (Becton Dickinson) de 4 colores. Para cada

25 medición se adquirieron 1x104 células de subpoblaciones de linfocitos definidas. Se realizó análisis estadístico con el programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obtener los porcentajes de subpoblaciones de linfocitos y para clasificar la intensidad de expresión de moléculas de superficie celular. Posteriormente, se correlacionaron los porcentajes de subconjuntos de linfocitos individuales relacionados con los linfocitos totales (es decir, células B más T más NK excluyendo cualquier célula mieloide por medio de tinción con CD14) tal como se determina mediante

30 FACS con el recuento de linfocitos a partir del análisis de sangre diferencial para calcular los números de células absolutos de células T (CD3+, CD56-, CD14-). Se calcularon los números absolutos de monocitos positivos para CD33 multiplicando los recuentos de monocitos del análisis de sangre diferencial por las correspondientes razones de monocitos positivos para CD33 (CD33+, CD14+) con respecto a todos los monocitos (CD14+) tal como se determina mediante FACS.

35 En la figura 26A se muestra el porcentaje en comparación con el nivel inicial (es decir, el 100%) de recuentos absolutos de monocitos positivos para CD33 circulantes al final del tratamiento con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL en 4 cohortes de 2 monos cynomolgus con aumento a escala de la dosis entre cohortes desde 30 por encima de 60 y de 240 a 1000 g/m2/24 h.

Tal como se muestra en la figura 26A, la infusión intravenosa continua de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL induce

40 reducción de monocitos positivos para CD33 circulantes de una manera dependiente de la dosis. Mientras que no hubo todavía reducción detectable de monocitos positivos para CD33 circulantes a 30 g/m2/24 h, una primera tendencia hacia una reducción de los recuentos de monocitos positivos para CD33 se hizo visible a 60 g/m2/24 h tras 7 días de tratamiento.

A 240 g/m2/24 h los monocitos positivos para CD33 circulantes se redujeron casi completamente de la sangre

45 periférica tras 3 días de tratamiento. Esto se alcanzó incluso más rápido a 1000 g/m2/24 h, en donde la reducción de los monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica se completó ya tras 1 día de tratamiento.

Este hallazgo se confirmó mediante los resultados mostrados en la figura 26B que demuestran una reducción de monocitos positivos para CD33 circulantes en dos tercios y el 50% en comparación con el nivel inicial respectivo en dos monos cynomolgus tratados mediante infusión continua con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL a 120 g/m2/24 h

50 durante 14 días.

Este desenlace es una clara señal de eficacia clínica de las moléculas de unión a CD3 de la divulgación en general y moléculas de unión a CD3 biespecíficas dirigidas por CD33 de la divulgación para el tratamiento de malignomas positivos para CD33 como AML en particular.

imagen57

Además, la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL en presencia de células diana circulantes (es decir, monocitos positivos para CD33) parece ser menos pronunciada que la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con constructos de CD19xCD3 convencionales, tal como se describe en el documento WO99/54440 en pacientes con B-NHL con un número significativo de células diana circulantes (es decir, células B positivas para CD19) tal como se muestra en la figura 22. Aunque las células T desaparecen completamente de la circulación tras el inicio de la infusión de CD19xCD3 no reaparecen hasta que las células B diana positivas para CD19 circulantes se reducen de la sangre periférica (figura 22), la desaparición inicial de células T circulantes es incompleta tras el inicio de la infusión con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL y los recuentos de células T se recuperan todavía durante la presencia de células diana positivas para CD33 circulantes (figura 26B). Esto confirma que las moléculas de unión a CD3 de la divulgación (dirigidas contra y generadas contra un epítopo de cadena CD3 (épsilon) humana y de primates distintos de chimpancé y que es una parte o un fragmento

o la longitud completa de la secuencia de aminoácidos tal como se proporciona en SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8), al reconocer un epítopo de CD3 independiente del contexto muestran un perfil de redistribución de células T más favorable que moléculas de unión a CD3 convencionales que reconocen un epítopo de CD3 dependiente del contexto, como las moléculas de unión proporcionadas en el documento WO99/54440.

15. Moléculas de unión a CD3 de la divulgación dirigidas a epítopos de CD3 esencialmente independientes del contexto al inducir menos redistribución de células T circulantes en ausencia de células diana circulantes reducen el riesgo de aconstecimientos adversos relacionados con el inicio del tratamiento.

Redistribución de células T reducida en monos cynomolgus tras el inicio del tratamiento con una molécula de unión a CD3 específica entre especies de la divulgación

Se produjo MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO. 193) mediante expresión en células CHO usando la secuencia de nucleótidos codificante SEQ ID NO. 194. Las secuencias codificantes de (i) un líder de cadena pesada de inmunoglobulina N-terminal que comprende un codón de iniciación incrustado dentro de una secuencia consenso de Kozak y (ii) una etiqueta de His6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unieron ambas en marco a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 194 antes de la inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtuvo mediante síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevó a cabo la transfección estable de células CHO deficientes en DHFR, la selección de transfectantes positivos para DHFR que secretan la molécula de unión a CD3 MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL al sobrenadante de cultivo y la amplificación génica con metotrexato para aumentar los niveles de expresión tal como se describió (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). El material de prueba para el tratamiento de monos cynomolgus se produjo en un fermentador de 200 litros. La purificación de proteínas a parir de la cosecha se basó en cromatografía de afinidad IMAC seleccionando como diana la etiqueta de His6 C-terminal de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL seguida por cromatografía de exclusión molecular (SEC) preparativa. El rendimiento total de material de prueba libre de endotoxinas final fue de 40 mg. El material de prueba consistía en el 70% de monómero, el 30% de dímero y una pequeña contaminación de multímero superior. Se midió la potencia del material de prueba en un ensayo de citotoxicidad tal como se describe en el ejemplo 11 usando células CHO transfectadas con MCSP de cynomolgus como células diana y la línea de células T de macaco 4119LnPx como fuente de células efectoras (figura 27). Se determinó que la concentración de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL requerida para lograr la mitad de la lisis de células diana máxima por las células T efectoras (CE50) era de 1,9 ng/ml.

Se trataron monos cynomolgus (Macaca fascicularis) adultos jóvenes (aproximadamente 3 años de edad) mediante infusión intravenosa continua de molécula de unión a CD3 de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL a diferentes velocidades de flujo (es decir, niveles de dosis) para estudiar la redistribución de células T circulantes tras el inicio del tratamiento en ausencia de células diana circulantes. Aunque la molécula de unión a CD3 de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL puede reconocer tanto MCSP de cynomolgus como CD3 de cynomolgus, no hay células sanguíneas circulantes que expresen MCSP. Por tanto, la única interacción posible en la sangre circulante es la unión del brazo específico de CD3 de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL a CD3 en células T. Esta situación es equivalente al tratamiento con la molécula de unión a CD3 convencional (molécula de unión a CD19xCD3 específica para CD19 en células B y CD3 en células T) de esos pacientes con B-NHL, que no tienen células B diana positivas para CD19 circulantes tal como se describe en el ejemplo 13.

Se llevó a cabo infusión continua según el método de Swivel tal como sigue: Se cateterizaron los monos por medio de la vena femoral al interior de la vena cava caudal usando un catéter venoso. El catéter se tunela subcutáneamente hasta la región del hombro dorsal y se saca al exterior en la escápula caudal. Entonces se hace pasar un tubo a través de una camisa y un resorte de protección. Se ajusta la camisa alrededor del animal y el catéter, por medio del tubo, se conecta a una bomba de infusión.

Se infundió de manera continua la disolución de administración (lisina 1,25 M, tween 80 al 0,1%, pH 7) sin material de prueba a 48 ml/24 h durante 7 días antes del inicio del tratamiento para permitir la aclimatación de los animales a las condiciones de infusión. Se inició el tratamiento añadiendo material de prueba de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL a la disolución de administración a la cantidad requerida para cada nivel de dosis individual que iba a someterse a prueba (es decir, la velocidad de flujo de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL). Se cambió el depósito de infusión cada día a lo largo de toda la fase de aclimatación y tratamiento. La duración planeada del tratamiento fue de 7 días.

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Se determinaron los transcursos de tiempo de los recuentos absolutos de células T en sangre periférica mediante análisis FACS de cuatro colores tal como sigue:

Recogida de muestras de sangre y análisis de rutina

Se obtuvieron muestras de sangre (1 ml) antes y 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 horas tras el inicio de la infusión continua con MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL así como tras 7 días de tratamiento usando tubos Vacutainer™ (Becton Dickinson) que contenían EDTA que se enviaron para su análisis a 4ºC. En algunos casos se produjeron ligeras variaciones de estos puntos de tiempo por motivos operativos. Se realizó el análisis FACS de subpoblaciones de linfocitos en el plazo de 24 -48 h tras la recogida de muestras de sangre. Se determinaron los números absolutos de subpoblaciones de leucocitos en las muestras de sangre a través de análisis de sangre diferencial en un laboratorio veterinario de rutina.

Aislamiento de PBMC de muestras de sangre

Se aislaron PBMC en analogía al protocolo descrito en el ejemplo 13, anteriormente, con adaptaciones de los volúmenes usados.

Tinción de PBMC con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de superficie celular

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos de cynomolgus de Becton Dickinson (1n.º de cat. 345784, 2n.º de cat. 556647, 3n.º de cat. 552851) y Beckman Coulter (4n.º de cat. IM2470) y se usaron según las recomendaciones de los fabricantes. Se tiñeron 5x105 -1x106 células con la siguiente combinación de anticuerpos: anti-CD141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP) x anti-CD194 (APC). Se realizaron etapas adicionales tal como se describió en el ejemplo 13, anteriormente.

Detección por citometría de flujo linfocitos teñidos mediante FACS

Se realizó la recogida de datos con un instrumento BD FACSCalibur™ (Becton Dickinson) de 4 colores. Para cada medición se adquirieron 1x104 células de subpoblaciones de linfocitos definidas. Se realizó análisis estadístico con el programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obtener los porcentajes de subpoblaciones de linfocitos y para clasificar la intensidad de expresión de moléculas de superficie celular. Posteriormente, se correlacionaron los porcentajes de subconjuntos de linfocitos individuales relacionados con los linfocitos totales (es decir, células B más T más NK excluyendo células mieloides por medio de tinción con CD14) tal como se determina mediante FACS con el recuento de linfocitos a partir del análisis de sangre diferencial para calcular los números de células absolutos de células T (CD3+, CD56-, CD14-).

En la figura 28 se muestra la redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento con MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL en monos cynomolgus a niveles de dosis de 60, 240 y 1000 g/m2/24 h. Estos animales no mostraron signos en absoluto de cualquier redistribución de células T durante la fase inicial de tratamiento, es decir, recuentos de células T bastante aumentados que disminuyeron tras el inicio del tratamiento. Dado que la redistribución de células T se observa de manera sistemática en el 100% de todos los pacientes sin células diana circulantes, tras el inicio del tratamiento con la molécula de unión a CD3 convencional (por ejemplo, constructo de CD19xCD3 tal como se describe en el documento WO 99/54440) contra un epítopo de CD3 dependiente del contexto, se demostró que puede observarse una redistribución de células T sustancialmente menor en ausencia de células diana circulantes tras el inicio del tratamiento con una molécula de unión a CD3 de la divulgación dirigida a y generada contra un epítopo de cadena de CD3 épsilon de ser humano y primate distinto de chimpancé tal como se define mediante la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO.: 2, 4, 6 u 8 o un fragmento de las mismas. Esto está en claro contraste con moléculas de unión a CD3 dirigidas contra un epítopo de CD3 dependiente del contexto, como los constructos descritos en el documento WO 99/54440. Las moléculas de unión contra epítopos de CD3 independientes del contexto, tal como se proporcionan (entre otros) en una cualquiera de SEQ ID NO.: 2, 4, 6 u 8 (o fragmentos de estas secuencias) proporcionan una redistribución de células T sustancialmente menor (perjudicial y no deseada). Debido a que la redistribución de células T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 es un factor de riesgo principal para acontecimientos adversos en el SNC, las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento y que pueden reconocer un epítopo de CD3 independiente del contexto tienen una ventaja sustancial con respecto a las moléculas de unión a CD3 conocidas en la técnica y dirigidas contra epítopos de CD3 dependientes del contexto. De hecho ninguno de los monos cynomolgus tratados con MCSP-G4 VHVL x I2C VH-VL mostró ningún signo de síntomas en el SNC.

La independencia del contexto del epítopo de CD3 se proporciona en esta invención y corresponde a los primeros 27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon) o fragmentos de este tramo de 27 aminoácidos. Este epítopo independiente del contexto se toma de su entorno nativo dentro del complejo CD3 y se fusiona con secuencias de aminoácidos heterólogas sin pérdida de su integridad estructural. Las moléculas de unión anti-CD3 tal como se proporcionan en el presente documento y generadas (y dirigidas) contra un epítopo de CD3 independiente del contexto proporcionan una mejora clínica sorprendente con respecto a la redistribución de células T y, por tanto, un perfil de seguridad más favorable. Sin querer restringirse a la teoría, puesto que su epítopo de CD3 es independiente del contexto, formando un subdominio autosuficiente autónomo sin mucha influencia sobre el resto del complejo CD3, las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento inducen menos cambios alostéricos en la conformación de CD3 que las moléculas de unión a CD3 convencionales (como las moléculas proporcionadas en el documento WO 99/54440), que reconocen epítopos de CD3 dependientes del contexto como las moléculas proporcionadas en el documento WO 99/54440. Como consecuencia (de nuevo sin querer restringirse a la teoría), la inducción de reclutamiento de NcK2 intracelular por las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento también se reduce, dando como resultado menos cambio de isoforma de integrinas de células T y menos adhesión de células T a células endoteliales. Se prefiere que las preparaciones de moléculas de unión a CD3 de la divulgación (dirigidas contra y generadas contra un epítopo independiente del contexto tal como se define en el presente documento) consistan esencialmente en moléculas monoméricas.

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Estas moléculas monóméricas son incluso más eficaces (que las moléculas diméricas o multiméricas) evitando la redistribución de células T y por tanto el riesgo de acontecimientos adversos en el SNC durante la fase inicial de tratamiento.

16. Generación y caracterización de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies de CD33 y CD3

16.1. Generación de células CHO que expresan CD33 humana

La secuencia codificante de CD33 humana publicada en GenBank (número de registro NM_001772) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos convencionales. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviese en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante de la proteína CD33 humana madura, seguido en marco por la secuencia codificante de dipéptido de serina-glicina, una etiqueta de histidina6 y un codón de terminación (las secuencias de ADNc y aminoácidos del constructo se enumeran en las SEQ ID NO. 305 y 306). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SaII en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. Se realizó la expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación génica del constructo se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

16.2. Generación de CHO células que expresan el dominio extracelular de CD33 de macaco

Se obtuvo la secuencia de ADNc de CD33 de macaco mediante un conjunto de 3 PCR en ADNc de médula ósea de mono macaco preparado según protocolos convencionales. Se usaron las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94ºC durante 3 minutos seguido por 35 ciclos con 94ºC durante 1 minuto, 53ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos seguido por un ciclo terminal de 72ºC durante 3 minutos y los siguientes cebadores:

1.

cebador directo: 5’-gaggaattcaccatgccgctgctgctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggctatgg-3’ (SEQ ID No. 369)

cebador inverso: 5’-gatttgtaactgtatttggtacttcc-3’ (SEQ ID No. 370)

2.

cebador directo: 5’-attccgcctccttggggatcc-3’ (SEQ ID No. 371)

cebador inverso: 5’-gcataggagacattgagctggatgg-3’ (SEQ ID No. 372)

3.

cebador directo: 5’-gcaccaacctgacctgtcagg-3’ (SEQ ID No. 373)

cebador inverso: 5’-agtgggtcgactcactgggtcctgacctctgagtattcg-3’ (SEQ ID No. 374)

Esas PCR generaron tres fragmentos solapantes, que se aislaron y secuenciaron según protocolos convencionales usando los cebadores de PCR, y de ese modo proporcionaron una parte de la secuencia de ADNc de CD33 de macaco desde el segundo nucleótido del codón +2 hasta el tercer nucleótido del codón +340 de la proteína madura.

Para generar un constructo para la expresión de CD33 de macaco, se obtuvo un fragmento de ADNc mediante síntesis génica según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y aminoácidos del constructo se enumera en SEQ ID NO. 307 y 308). En este constructo se fusionó la secuencia codificante de CD33 de macaco desde el aminoácido +3 hasta +340 de la proteína CD33 madura con la secuencia codificante de CD33 humana reemplazando la secuencia codificante humana de los aminoácidos +3 a +340. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviese un sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento que contiene el ADNc que codifica para esencialmente todo el dominio extracelular de CD33, el dominio transmembrana de CD33 de macaco y un dominio de CD33 intracelular quimérico de macaco-ser humano. Los sitios de restricción introducidos Xbal en el extremo 5’ y Sall en el extremo 3’, se utilizaron en los siguientes procedimientos de clonación. Entonces se clonó el fragmento de síntesis génica por medio de XbaI y SalI en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se usó un clon de secuencia verificada de este plásmido para transfectar células CHO/dhfr-tal como se describió anteriormente.

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5 16.3. Generación de moléculas de anticuerpo biespecífico específico entre especies de CD33 y CD3

Clonación de moléculas de unión específicas entre especies

En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión entre especies específica para CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión entre especies específica para CD33 humana y de primate distinto

10 de chimpancé, tal como se expone en la siguiente tabla 5:

Tabla 5: Formatos de moléculas biespecíficas específicas entre especies anti-CD3 y anti-CD33

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de constructos proteicos (N → C)

276/275

AH11 HLxH2CHL

258/257

AH3HLxH2CHL

270/269

AC8HLxH2CHL

264/263

AF5HLxH2CHL

288/287

F2HLxH2CHL

300/299

E11 HLxH2CHL

282/281

B3HLxH2CHL

294/293

B10HLxH2CHL

278/277

AH11 HLxF12QHL

260/259

AH3HLxF12QHL

272/271

AC8HLxF12QHL

266/265

AF5HLxF12QHL

290/289

F2HLxF12QHL

302/301

E11 HLxF12QHL

284/283

B3HLxF12QHL

296/295

B10HLxF12QHL

280/279

AH11HLxI2CHL

262/261

AH3HLxI2CHL

274/273

AC8HLxI2CHL

268/267

AF5HLxI2CHL

292/291

F2HLxI2CHL

304/303

E11HLxI2CHL

286/285

B3HLxI2CHL

298/297

B10HLxI2CHL

Los constructos mencionados anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicos entre especies para CD33 humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas de CD3 específicas entre especies para CD3 humana y de macaco se obtuvieron mediante síntesis

15 génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron y la expresión de proteínas eucariotas se realizó de manera similar a la descrita en el ejemplo 9 para las moléculas de cadena sencilla específicas entre especies de MCSP y CD3.

Los mismo es cierto para la expresión y purificación de las moléculas de cadena sencilla específicas entre especies de CD33 y CD3.

20 En la inmunotransferencia de tipo Western se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo biespecífico purificado.

16.4. Análisis de unión mediante citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de CD33 y CD3

Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre

25 especies con respecto a la capacidad de unirse a CD33 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se realizó un análisis FACS similar al análisis descrito para el análisis de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3 en el ejemplo 10 usando células CHO que expresan los dominios extracelulares de CD33 humana

o de macaco (véanse los ejemplos 16.1 y 16.2).

La unión específica de CD3 humana y de primate distinto de chimpancé de las moléculas de unión a CD3 de la

30 divulgación era claramente detectable tal como se muestra en la figura 29. En el análisis FACS todos los constructos muestran que se unen a CD3 y CD33 en comparación con los controles negativos respectivos. Se demuestra la especificidad entre especies de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y CD33 humana y de macaco.

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16.5. Bioactividad de anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de CD33 y CD3

Se analizó la bioactividad de los anticuerpos biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para CD33 descritas en los ejemplos 16.1 y 16.2. Como células efectoras se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas o la línea de células T de macaco 4119LnPx tal como se especifica en las respectivas figuras. Se realizaron los ensayos de citotoxicidad de manera similar al entorno descrito para el análisis de bioactividad de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3 en el ejemplo 11 usando células CHO que expresan los dominios extracelulares de CD33 humana o de macaco (véanse los ejemplos 16.1 y 16.2) como células diana.

Tal como se muestra en la figura 30, todos los constructos biespecíficos específicos entre especies generados demostraron actividad citotóxica contra células diana positivas para CD33 humana provocada por PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas y contra células diana positivas para CD33 de macaco provocada por la línea de células T 4119LnPx.

17. Purificación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies mediante un procedimiento de afinidad basado en el epítopo de CD3 épsilon independiente del contexto correspondiente a los aminoácidos 1-27 N-terminales

17.1 Generación de una columna de afinidad que presenta el epítopo de CD3 épsilon humana independiente del contexto aislado correspondiente a los aminoácidos 1-27 N-terminales

El plásmido para la expresión del constructo 1-27 CD3-Fc que consiste en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena de CD3 épsilon humana fusionada a la región de bisagra y Fc gamma de inmunoglobulina IgG1 humana descrito anteriormente (ejemplo 3; la secuencia de ADNc y secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante se enumeran en SEQ ID NO. 230 y 229) se transfectó en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. Se realizó la expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo aumentando las concentraciones de metotrexato (MTX) a una concentración final de hasta MTX 20 nM. Tras dos pases de cultivo estacionario se hicieron crecer las células en frascos rotatorios con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F -68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la cosecha. Se retiraron las células mediante centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20ºC. Para el aislamiento de la proteína de fusión se preparó una columna de afinidad de anticuerpo de cabra anti-fc humano según protocolos convencionales usando un anticuerpo de cabra purificado específico anti-fragmento fc de IgG humana disponible comercialmente con reacción cruzada mínima frente a proteínas séricas bovinas, de caballo y de ratón (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Usando esta columna de afinidad se aisló la proteína de fusión del sobrenadante de cultivo celular en un sistema Äkta Explorer (GE Amersham) y se eluyó mediante ácido cítrico. Se neutralizó el eluato y se concentró. Tras la diálisis frente a tampón de acoplamiento libre de amina, se acopló la proteína de fusión purificada a una columna HiTrap de 1 ml activada con N-hidroxi-succinimida NHS (GE Amersham).

Tras el acoplamiento se bloquearon los grupos NHS restantes y se lavó la columna y se almacenó a 5ºC en tampón de almacenamiento que contenía azida de sodio al 0,1%.

17.2 Purificación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies usando una columna de afinidad de péptido de CD3 humano

Se esterilizaron por filtración a través de una membrana de 0,2 m 200 ml de sobrenadante de cultivo celular de células que expresan moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies y se aplicaron a la columna de afinidad de péptido de CD3 usando un sistema Äkta Explorer (GE Amersham).

Entonces se lavó la columna con solución salina tamponada con fosfato PBS pH 7,4 para eliminar por lavado la muestra no unida. Se realizó la elución con un tampón ácido pH 3,0 que contenía ácido cítrico 20 mM y cloruro de sodio 1 M. Se neutralizó la proteína eluida inmediatamente mediante trishidroximetilamina 1 M TRIS pH 8,3 contenida en los tubos de recogida del colector de fracciones.

Se realizó el análisis de proteínas mediante SDS PAGE e inmunotransferencia de tipo Western.

Para la SDS PAGE se usan geles BisTris al 4-12% (Invitrogen). El tampón de ejecución era 1 x MES-SDS-Puffer (Invitrogen). Como patrón de proteína se aplicaron 15 l de patrón Sharp Protein preteñido (Invitrogen). Se realizó la electroforesis durante 60 minutos a 200 voltios, 120 mA máx. Se lavaron los geles en agua desmineralizada y se tiñeron con Coomassie durante una hora. Se destiñeron los geles en agua desmineralizada durante 3 horas. Se tomaron fotografías Pictures con un sistema de documentación Syngene Gel.

Para la inmunotransferencia de tipo Western se generó un doble del gel de SDS PAGE y se sometieron las proteínas a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa. Se bloqueó la membrana con albúmina sérica bovina al 2% en PBS y se incubó con un anticuerpo Penta His murino biotinilado (Qiagen). Como reactivo secundario se usó un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (DAKO). Se revelaron las inmunotransferencias con disolución de sustrato BCIP/NBT (Pierce).

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Tal como se demuestra en las figuras 31, 32 y 33 el uso de una columna de afinidad de péptido de CD3 humano tal como se describió anteriormente permite la purificación altamente eficaz de las moléculas de cadena sencilla biespecíficas del sobrenadante de cultivo celular. Los anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 específicos entre especies en las moléculas de cadena sencilla biespecíficas permiten por tanto por medio de sus propiedades de unión específica un método de purificación de una etapa genérico eficaz para las moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies, sin la necesidad de ninguna etiqueta unida de manera única para fines de purificación.

18. Ensayo farmacocinético genérico para moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies

18.1 Producción de 1-27 CD3-Fc para su uso en el ensayo farmacocinético

La secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena de CD3 épsilon humana fusionada a la región de bisagra y Fc gamma de inmunoglobulina IgG1 humana se obtuvo mediante síntesis génica según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante se enumeran en SEQ ID NO. 309 y 310). Se diseñó el fragmento de síntesis génica para que contuviese en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante de los primeros 27 aminoácidos de la parte extracelular de la cadena humana madura de CD3 épsilon, seguido en marco por la secuencia codificante de la región de bisagra y parte de Fc gamma de IgG1 humana y un codón de terminación. El fragmento de síntesis génica también se diseñó y clonó tal como se describió en el ejemplo 3.1, mencionado anteriormente. Se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. Se realizó la expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describió en el ejemplo 9, mencionado anteriormente. Para el aislamiento de la proteína de fusión, se preparó una columna de afinidad de anticuerpo de cabra anti-fc humano según protocolos convencionales usando un anticuerpo de cabra purificado específico anti-fragmento fc de IgG humana disponible comercialmente con reacción cruzada mínima frente a proteínas séricas bovinas, de caballo y de ratón (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Usando esta columna de afinidad se aisló la proteína de fusión del sobrenadante decultivo celular en un sistema Äkta Explorer (GE Amersham) y se eluyó mediante ácido cítrico. Se neutralizó el eluato y se concentró.

18.2 Ensayo farmacocinético para moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies

El ensayo se basa en la tecnología de ECL-ELISA usando detección con marcaje con rutenio sobre placas de carbono medida en un dispositivo Sektor Imager (MSD). En una primera etapa, se recubrieron placas de carbono (MSD High Bind Plate de 96 pocillos, cat.: L15xB-3) con 5 l/pocillo a 50 ng/ml de la 1-27 CD3-Fc purificada descrita en el ejemplo 18.1. Entonces se secó la placa durante la noche a 25ºC. Posteriormente se bloquearon las placas con BSA al 5% (Paesel&Lorei n.º 100568) en PBS a 150 l/pocillo durante 1 h a 25ºC en un incubador mientras se agitaba (700 rpm). En la siguiente etapa se lavaron las placas tres veces con Tween al 0,05% en PBS. Se generó una curva patrón en suero de macaco al 50% en PBS mediante dilución 1:4 en serie comenzando a 100 ng/ml de la respectiva molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies que iba a detectarse en el ensayo. Se prepararon muestras de control de calidad (CC) en suero de macaco al 50% en PBS que oscilaban entre 1 ng/ml y 50 ng/ml de la respectiva molécula biespecífica de cadena sencilla específica entre especies dependiendo de las concentraciones en suero de muestras esperadas. Se transfirieron las muestras patrón, de CC o desconocidas a las placas de carbono a 10 l/pocillo y se incubaron durante 90 min a 25ºC en el incubador mientras se agitaba (700 rpm). Posteriormente se lavaron las placas tres veces con Tween al 0,05% en PBS. Para la detección se añadieron 25 l/pocillo de anticuerpo penta-His-Biotin (Qiagen, 200 g/ml en Tween al 0,05% en PBS) y se incubaron durante 1 h a 25ºC en un incubador mientras se agitaba (700 rpm). En una segunda etapa de detección se añadieron 25 l/pocillo de disolución de estreptavidina-SulfoTag (MSD; cat.: R32AD-1; lote: W0010903) y se incubaron durante 1 h a 25ºC en un incubador mientras se agitaba (700 rpm). Posteriormente se lavaron las placas tres veces con Tween al 0,05% en PBS. Finalmente se añadieron 150 l/pocillo de tampón de lectura MSD (MSD, cat.: R9ZC-1) y se leyeron las placas en el dispositivo Sektor Imager.

Las figuras 34 y 35 demuestran la viabilidad de la detección de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies en muestras de suero de monos macaco para moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies. Los anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 específicos entre especies contenidos en las moléculas de cadena sencilla biespecíficas permiten por tanto por medio de sus propiedades de unión específica un ensayo genérico altamente sensible para la detección de las moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies. El ensayo expuesto anteriormente puede usarse en el contexto de estudios toxicológicos formales que son necesarios para el desarrollo de fármacos y pueden adaptarse fácilmente para la medición de muestras de pacientes en relación con la aplicación clínica de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies.

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19. Generación de proteínas de fusión transmembranarias recombinantes de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé fusionados a EpCAM de mono cynomolgus (1-27 CD3-EpCAM).

19.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-EpCAM

Se aisló la CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé (tití, tamarino, mono ardilla) y de cerdo. Las secuencias codificantes de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura, de tití común (Callithrix jacchus), de tamarino cabeza de algodón (Saguinus oedipus), de mono ardilla común (Saimiri sciureus) y de cerdo doméstico (Sus scrofa; usado como control negativo) fusionadas al extremo N-terminal de EpCAM de cynomolgus etiquetada con Flag se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos convencionales. (La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión recombinantes se enumeran bajo las SEQ ID NO. 351 a 360). Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio BsrGI para permitir la fusión en el marco de lectura correcto con la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos ya presente en el vector de expresión objetivo, que va seguido en marco por la secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la parte extracelular de las cadenas CD3 épsilon maduras, que va seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta Flag y seguida en marco por la secuencia codificante de la proteína EpCAM transmembrana de cynomolgus madura. Los fragmentos de síntesis génica también se diseñaron para introducir un sitio de restricción al final del ADNc que codifica para la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, BsrGI en el extremo 5’ y SaII en el extremo 3’, se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron después a través de BsrGI y SaII en un derivado del plásmido denominado pEF DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150), que ya contenía la secuencia codificante del péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos siguiendo protocolos convencionales. Se usaron plásmidos de secuencia verificada para transfectar células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. Se realizó la expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

Se sometieron a prueba los transfectantes para determinar la expresión en la superficie celular de la proteína transmembrana recombinante por medio de un ensayo FACS de acuerdo con protocolos convencionales. Con ese propósito, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con 50 l del anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 g/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab+)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de cabra anti-IgG de ratón específico de fragmento Fcgamma 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson 5 ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se realizó citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur, se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medición de la intensidad de fluorescencia se realizaron tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-Interscience, 2002).

La expresión de las proteínas de fusión transmembrana recombinantes etiquetadas con Flag que consistían en EpCAM de cynomolgus y los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino, de mono ardilla y de cerdo, respectivamente, en células transfectadas era claramente detectable (figura 36).

19.2 Clonación y expresión del anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 específico entre especies I2C HL en forma de un anticuerpo IgG1

Con el fin de proporcionar medios mejorados de detección de la unión del anticuerpo anti-CD3 de cadena sencilla específico entre especies, se convierte la especificidad de I2C VHVL en un anticuerpo IgG1 con IgG1 murina y regiones constantes kappa murinas. Se obtuvieron secuencias de ADNc que codificaban para la cadena pesada del anticuerpo IgG mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseñaron los fragmentos de síntesis génica para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota del constructo, que va seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, que va seguido en marco por la secuencia codificante de la región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera, seguido en marco por la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de IgG1 murina tal como se publica en GenBank (número de registro AB097849) o la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera kappa murina tal como se publica en GenBank (número de registro D14630), respectivamente.

Se introdujeron sitios de restricción al comienzo y al final del ADNc que codifica para la proteína de fusión. Se usaron sitios de restricción EcoRI en el extremo 5’ y Sall en el extremo 3’ para los siguientes procedimientos de clonación. Se clonaron los fragmentos de síntesis génica por medio de EcoRI y Sall en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) para el constructo de cadena pesada y pEFADA (pEFADA se describe en Raum et al. loc cit.) para el constructo de cadena ligera según protocolos convencionales. Se usaron plásmidos de secuencia verificada para la cotransfección de constructos de cadena ligera y pesada respectivos en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. Se realizó la expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica de los constructos mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM y desoxicoformicina (dCF) hasta una concentración final de hasta dCF 300 nM. Tras dos pases de cultivo estacionario, se recogió el sobrenadante de cultivo celular y se usó en el experimento posterior.

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19.3 Unión del anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 específico entre especies I2C HL en forma de un anticuerpo IgG1 a 1-27 CD3-EpCAM

Se sometió a prueba la unión del constructo de I2C IgG1 generado a los aminoácidos 1-27 N-terminales de las cadenas CD3 humana, de tití, de tamarino y de mono ardilla, respectivamente fusionados con EpCAM de cynomolgus tal como se describe en el ejemplo 19.1 en un ensayo FACS según protocolos convencionales. Para ese propósito, se incubó un número de 2,5x105 células con 50 l de sobrenadante de cultivo celular que contenía el constructo I2C IgG1 tal como se describe en el ejemplo 19.2. Se detectó la unión del anticuerpo con fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, de cabra anti-Ig de ratón, específico de fragmento Fcgamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Se realizó citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur, se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medición de la fluorescencia se realizaron tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-Interscience, 2002).

Tal como se muestra en la figura 37, se observó unión del constructo I2C IgG1 a los transfectantes que expresan las proteínas de fusión transmembrana recombinantes que consisten en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino y de mono ardilla fusionados a EpCAM de cynomolgus en comparación con el control negativo que consiste en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de cerdo fusionados a EpCAM de cynomolgus. Por tanto, se demostró la especificidad entre especies de múltiples primates de I2C. Las señales obtenidas con el anticuerpo anti-Flag M2 y el constructo I2C IgG1 eran comparables, indicando una fuerte actividad de unión del I2C con especificidad específica entre especies a los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon.

20. Unión de la molécula de unión anti-CD3 específica entre especies I2C a la cadena de CD3 épsilon humana con y sin etiqueta de His6 N-terminal

Se sometió a prueba un anticuerpo IgG1 quimérico con la especificidad de unión I2C tal como se describe en el ejemplo 19.2 específico para CD3 épsilon para detectar la unión a CD3 épsilon humana con y sin etiqueta de His6 N-terminal. La unión del anticuerpo a las líneas celulares EL4 transfectadas con His6-CD3 épsilon humana tal como se describe en el ejemplo 6.1 y CD3 épsilon humana de tipo natural tal como se describe en el ejemplo 5.1 respectivamente se sometió a prueba mediante un ensayo FACS según protocolos convencionales. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes con 50 l de sobrenadante de cultivo celular que contenía el constructo I2C IgG1 o 50 l de los anticuerpos control respectivos a 5 g/ml en PBS con FCS al 2%. Se usaron respectivamente como control negativo un control de isotipo apropiado y como control positivo para la expresión de los constructos el anticuerpo específico de CD3 UCHT-1. La detección de la etiqueta de His6 se realizó con el anticuerpo penta His (Qiagen). Se detectó la unión de los anticuerpos con un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con Rficoeritrina, de cabra anti-IgG de ratón, específico de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2% (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se realizó citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur, se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medición de la intensidad de fluorescencia se realizaron tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-Interscience, 2002).

La unión comparable del anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1 a ambos transfectantes demuestra niveles aproximadamente iguales de expresión de los constructos. La unión del anticuerpo penta His confirmó la presencia de la etiqueta de His6 en el constructo His6-CD3 humana pero no en el constructo de tipo natural.

En comparación con la línea celular EL4 transfectada con CD3 épsilon humana de tipo natural, se detectó una clara pérdida de unión del constructo I2C IgG1 a CD3 épsilon humana con una etiqueta de His6 N-terminal. Estos resultados muestran que un extremo N-terminal libre de CD3 épsilon es esencial para la unión de la especificidad de unión anti-CD3 específica entre especies I2C a la cadena humana de CD3 épsilon (figura 28).

21. Generación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies de CD33 y CD3

21.1 Generación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies de CD33 y CD3

En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión entre especies específica para CD3 épsilon humana y de macaco así como un dominio con una especificidad de unión entre especies específica para CD33 humana y de macaco, tal como se expone en la siguiente tabla 6:

Tabla 6: Formatos de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies anti-CD3 y anti-CD33

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SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de constructos proteicos (N → C)

316/315

I2CHLxAF5HL

314/313

F12QHLxAF5HL

312/311

H2CHLxAF5HL

Los constructos mencionados anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicos entre especies para CD33 humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas de CD3 específicas entre especies para CD3 humana y de macaco se obtuvieron mediante síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron en analogía al procedimiento descrito en el ejemplo 9 para las moléculas de cadena sencilla específicas entre especies de MCSP y CD3. Se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. Se realizó la expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe también en el ejemplo 9 para las moléculas de cadena sencilla específicas entre especies de MCSP y CD3 y se usaron en los experimentos posteriores.

21,2 Análisis de unión mediante citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de CD33 y CD3

Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre especies con respecto a la capacidad de unirse a CD33 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se realizó un análisis FACS similar al análisis descrito para el análisis de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3 en el ejemplo 10 usando células CHO que expresan los dominios extracelulares de CD33 humana

o de macaco (véanse los ejemplos 16.1 y 16.2).

La unión biespecífica de las moléculas de cadena sencilla enumeradas anteriormente, que eran específicas entre especies para CD33 y específicas entre especies para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé era claramente detectable tal como se muestra en la figura 41. En el análisis FACS todos los constructos muestran que se unen a CD3 y CD33 en comparación con los controles negativos respectivos. Se demuestra la especificidad entre especies de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y CD33 humana y de macaco.

21.3. Bioactividad de anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de CD33 y CD3

Se analizó la bioactividad de los anticuerpos biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para CD33 descritas en los ejemplos 16.1 y 16.2. Como células efectoras se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas o la línea de células T de macaco 4119LnPx tal como se especifica en las respectivas figuras. Se realizaron los ensayos de citotoxicidad de manera similar al procedimiento descrito para el análisis de bioactividad de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3 en el ejemplo 11 usando células CHO que expresan los dominios extracelulares de CD33 humana o de macaco (véanse los ejemplos 16.1 y 16.2) como células diana.

Tal como se muestra en la figura 42, todos los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies generados demostraron actividad citotóxica contra células diana positivas para CD33 humana provocada por PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas y contra células diana positivas para CD33 de macaco provocada por la línea de células T de macaco 4119LnPx.

22. Redistribución de células T de chimpancé circulantes tras la exposición a molécula de unión a CD3 biespecífica dirigida a una molécula diana que está ausente de células sanguíneas circulantes

Se sometió un único chimpancé macho a aumento a escala de la dosis con constructo de EpCAM/CD3-anticuerpo biespecífico de cadena sencilla intravenoso (Schleret (2005) Cancer Res 65: 2882). Como en el constructo de CD19/CD3-anticuerpo biespecífico de cadena sencilla convencional (Loffler (2000, Blood, volumen 95, número 6) o el documento WO 99/54440), el brazo de CD3 de dicho constructo de EpCAM/CD3 también se dirige contra un epítopo dependiente del contexto convencional de CD3 humana y de chimpancé. En el día 0, el animal recibió 50 ml de PBS/HSA al 5% sin material de prueba, seguido por 50 ml de PBS/HSA al 5% más constructo de anticuerpo biespecífico EpCAM/CD3 de cadena sencilla a 1,6, 2,0, 3,0 y 4,5 g/kg en los días 7, 14, 21 y 28, respectivamente. El periodo de infusión fue de 2 horas por administración. Para cada infusión semanal, se sedó el chimpancé con telazol 2-3 mg/kg por vía intramuscular, se intubó y se puso en anestesia con isoflurano/O2 con tensiones arteriales medias estables. Se colocó un segundo catéter intravenoso en una extremidad opuesta para recoger (con heparina) muestras de sangre completa a los puntos de tiempo indicados en la figura 43 para el análisis FACS de células sanguíneas circulantes. Tras la lisis de eritrocitos convencional, se tiñeron células T con un anticuerpo marcado con FITC que reaccionaba con CD2 de chimpancé (Becton Dickinson) y se determinó el porcentaje de células T por linfocitos totales mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en la figura 43, cada administración de constructo de anticuerpo biespecífico Ep-CAM/CD3 de cadena sencilla indujo una caída rápida de células T circulantes tal como se observó con constructo de anticuerpo biespecífico CD19/CD3 de cadena sencilla en pacientes con B-NHL, que no tenían esencialmente células B diana (linfoma) circulantes. Puesto que no hay células diana positivas para EpCAM en la sangre circulante de seres humanos y chimpancés, la caída de células T circulantes tras la exposición al constructo de anticuerpo biespecífico EpCAM/CD3 de cadena sencilla puede atribuirse únicamente a una señal, que las células T reciben a través de la interacción pura del brazo de CD3 del constructo con un epítopo de CD3 dependiente de contexto convencional en ausencia de cualquier reticulación mediada por células diana. Como la redistribución de células T inducida a través de su exposición a un constructo de anticuerpo biespecífico CD19/CD3 de cadena sencilla en pacientes con B-NHL, que no tenían esencialmente células B diana (linfoma) circulantes, la redistribución de células T en el chimpancé tras la exposición al constructo de anticuerpo biespecífico Ep-CAM/CD3 de cadena sencilla puede explicarse mediante un cambio conformacional de CD3 tras el acontecimiento de unión a un epítopo de CD3 dependiente de contexto que da como resultado además el aumento transitorio de la adhesión de células T al endotelio de vasos sanguíneos (véase el ejemplo 13). Este hallazgo confirma que las moléculas de unión a CD3 convencionales dirigidas a epítopos de CD3 dependientes del contexto, únicamente a través de esta interacción, pueden conducir a un patrón de redistribución de células T de sangre periférica que está asociada con el riesgo de acontecimientos adversos en el SNC en seres humanos tal como se describe en el ejemplo 13.

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23. Unión específica de clones de scFv al extremo N-terminal de CD3 épsilon humana

23.1. Expresión bacteriana de constructos de scFv en E. coli XL1 Blue

Tal como se mencionó anteriormente, E. coli XL1 Blue transformada con pComb3H5Bhis/Flag que contenía un segmento VL y VH produce scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM. La cadena scFv se exporta al periplasma donde se pliega en una conformación funcional.

Para este experimento se escogieron los clones de scFv siguientes:

i) ScFv 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 y 3-271 descritos en el documento WO 2004/106380.

ii) ScFv de los clones humanos de unión anti-CD3 épsilon H2C, F12Q e I2C descritos en el presente documento.

Para las preparaciones periplásmicas, se hicieron crecer células bacterianas transformadas con los plásmidos que contenían los scFv correspondientes que permiten la expresión periplásmica en medio SB complementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 g/ml y se redisolvieron en PBS después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70ºC y descongelación a 37ºC, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque osmótico y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los residuos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los scFv humanos anti-CD3 humana y se usó para examinarlo adicionalmente. Estos sobrenadantes en bruto que contenían scFv se denominarán en lo sucesivo preparaciones periplásmicas (PPP).

23.2. Unión de scFv a la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc

Se llevaron a cabo experimentos ELISA recubriendo la proteína de fusión CD3 épsilon (aa 1-27)-Fc en los pocillos de placas de 96 pocillos de plástico (Nunc, maxisorb) normalmente a 4ºC durante la noche. Después, se retiró la disolución de recubrimiento de antígenos, se lavaron los pocillos una vez con PBS/Tween 20 al 0,05% y posteriormente se bloquearon con PBS/BSA al 3 % durante al menos una hora. Después de retirar la disolución de bloqueo, se añadieron las PPP y las disoluciones de control a los pocillos y se incubaron durante, normalmente, una hora a temperatura ambiente. Después, se lavaron los pocillos tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. La detección de scFv unidos a antígenos inmovilizados se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-etiqueta FLAG marcado con biotina (M2 anti-Flag-Bio, Sigma, normalmente a un concentración final de 1 g/ml de PBS) y se detectó con estreptavidina marcada con peroxidasa (Dianova, 1 g/ml de PBS). La señal se reveló mediante la adición de disolución de sustrato ABTS y se midió a una longitud de onda de 405 nm. La unión inespecífica de las muestras de prueba al agente de bloqueo y/o a la parte de IgG1 humana de la proteína de fusión CD3 épsilon (aa 1-27)-Fc se examinó llevando a cabo el mismo ensayo con los mismos reactivos y la misma secuencia temporal en placas de ELISA que se recubrieron con lgG1 humana (Sigma). Se usó PBS como control negativo.

Tal como se muestra en la figura 44, los scFv H2C, F12Q e I2C muestran fuertes señales de unión a la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc. Los scFv humanos 3-106, 3-114, 3-148, 3-190, 3-271, 4-10 y 4-48 (descritos en el documento WO 2004/106380) no muestran ninguna unión significativa por encima del nivel de control negativo.

Para excluir la posibilidad de que la unión positiva de los scFv H2C, F12Q e I2C a pocillos recubiertos con la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc pudiera deberse a la unión a BSA (usado como agente de bloqueo) y/o la parte Fc-gamma de lgG1 humana de la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc, se realizó un segundo experimento ELISA en paralelo. En este segundo experimento ELISA, todos los parámetros fueron idénticos a los del primer experimento ELISA, excepto porque en el segundo experimento ELISA se recubrió lgG1 humana (Sigma) en lugar de proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc. Tal como se muestra en la figura 45, ninguno de los scFv sometidos a prueba mostró ninguna unión significativa a BSA y/o a lgG1 humana por encima del nivel de fondo.

Tomados conjuntamente, estos resultados permiten concluir que las moléculas de unión a CD3 convencionales que reconocen un epítopo dependiente de contexto de CD3 épsilon (por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento WO 2004/106380) no se unen específicamente a la región de CD3 épsilon humana (aa 1-27), mientras que los scFv H2C, F12Q e I2C que se unen a un epítopo independiente del contexto de CD3 épsilon muestran claramente una unión específica a los 27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon humana.

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24. Generación y caracterización moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de CD3 y PSMA

24.1 Clonación y expresión de antígeno de PSMA humano en células CHO

Se usó la secuencia del antígeno de PSMA humano (“AY101595”, ARNm de antígeno de membrana específico de próstata de Homo sapiens, cds completa, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) para obtener una molécula sintética mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseñó también este fragmento de síntesis génica para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del ADN. Se utilizaron los sitios de restricción introducidos Xbal en el extremo 5’ y Sall en el extremo 3’ durante la etapa de clonación en el plásmido de expresión designado pEFDHFR tal como se describe en Mack et al. (Mack M et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92:7021-5. y Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3)). Tras la verificación de la secuencia, se usó el plásmido para transfectar células CHO/dhfr-tal como sigue. Se usó un plásmido de secuencia verificada para transfectar células CHO/dhfr-(n.º de la ATCC CRL 9096; cultivadas en RPMI 1640 con glutamina estabilizada obtenida de Biochrom AG Berlín, Alemania, complementado con FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% todos obtenidos de Biochrom AG Berlín, Alemania y nucleósidos de una disolución madre de reactivos de calidad para cultivo celular obtenidos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania, hasta una concentración final de adenosina 10 g/ml, desoxiadenosina 10 g/ml y timidina 10 g/ml, en un incubador a 37ºC, el 95% de humedad y el 7% de CO2). Se realizó la transfección usando el reactivo de transfección poliFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 g de ADN de plásmido según el protocolo del fabricante. Tras un cultivo de 24 horas, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en el medio de cultivo celular mencionado anteriormente excepto porque el medio no se complementó con nucleósidos y se usó FCS dializado (obtenido de Biochrom AG Berlín, Alemania). Por tanto el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y de ese modo se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente 14 días tras la transfección se observó el crecimiento de células resistentes. Tras de 7 a 14 días adicionales, se sometieron a prueba los transfectantes para detectar la expresión positiva del constructo por medio de FACS. La expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR se realiza tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM

24.2 Clonación y expresión de antígeno de PSMA de macaco en células CHO

Se obtuvo la secuencia de ADNc de PSMA de macaco (cynomolgus) mediante un conjunto de cinco PCR en ADNc de próstata de mono macaco preparada según protocolos convencionales. Se usaron las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos seguido por 40 ciclos con 94ºC durante 1 minuto, 52ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1,5 minutos seguido por un ciclo terminal de 72ºC durante 3 minutos y los siguientes cebadores:

4.

cebador directo: 5’-cactgtggcccaggttcgagg-3’ (SEQ ID NO. 375)

cebador inverso: 5’-gacataccacacaaattcaatacgg-3’ (SEQ ID NO. 376)

5.

cebador directo: 5’-gctctgctcgcgccgagatgtgg-3’ (SEQ ID NO. 377)

cebador inverso: 5’-acgctggacaccacctccagg-3’ (SEQ ID NO. 378)

6.

cebador directo: 5’-ggttctactgagtgggcagagg-3’ (SEQ ID NO. 379)

cebador inverso: 5’-acttgttgtggctgcttggagc-3’ (SEQ ID NO. 380)

7.

cebador directo: 5’-gggtgaagtcctatccagatgg-3’ (SEQ ID NO. 381)

cebador inverso: 5’-gtgctctgcctgaagcaattcc-3’ (SEQ ID NO. 382)

8.

cebador directo: 5’-ctcggcttcctcttcgggtgg-3’ (SEQ ID NO. 383)

cebador inverso: 5’-gcatattcatttgctgggtaacctgg-3’ (SEQ ID NO. 384)

Estas PCR generaron cinco fragmentos solapantes, que se aislaron y secuenciaron según protocolos convencionales usando los cebadores de PCR, y de ese modo proporcionaron una parte de la secuencia de ADNc que codifica para PSMA de macaco desde el codón 3 hasta el último codón de la proteína madura. Para generar un constructo para la expresión de PSMA de macaco, se obtuvo un fragmento de ADNc mediante síntesis génica según protocolos convencionales (la secuencia ADNc y de aminoácidos del constructo se enumera bajo SEQ ID 385 y 386). En este constructo, se fusionó en marco la secuencia codificante de PSMA de macaco desde el aminoácido 3 hasta el último aminoácido de la proteína PSMA madura seguida por un codón de terminación con la secuencia

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codificante de los primeros dos aminoácidos de la proteína PSMA humano. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento que contiene el ADNc. Los sitios de restricción introducidos, Xbal en el extremo 5’ y Sall en el extremo 3’, se utilizaron en los siguientes procedimientos de clonación. Se clonó el fragmento de síntesis 5 génica por medio de Xbal y Sall en un plásmido designado pEF-DHFR siguiendo protocolos convencionales. Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con una secuencia de nucleótidos de secuencia verificada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. Se realizó la expresión de proteínas

10 eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final hasta MTX 20 nM.

24.3 Generación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies de PSMA y CD3

En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, comprendiendo cada uno un

15 dominio con una especificidad de unión entre especies específica para el antígeno de CD3 humana y de macaco así como un dominio con una especificidad de unión para el antígeno de PSMA humano y de macaco, tal como se expone en la siguiente tabla 7:

Tabla 7: Formatos de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies anti-CD3 y anti-PSMA

SEQ ID NO. (nucl/prot)

Formatos de constructos proteicos (N → C)

400/399

PSMA-3 HL x I2C HL

414/413

PSMA-4 HL x I2C HL

428/427

PSMA-6 LH x I2C HL

442/441

PSMA-7 LH x I2C HL

456/455

PSMA-8 LH x I2C HL

470/469

PSMA-9 LH x I2C HL

484/483

PSMA-10 LH x I2C HL

498/497

PSMA-A LH x I2C HL

512/511

PSMA-B LH x I2C HL

526/525

PSMA-C LH x I2C HL

540/539

PSMA-D LH x I2C HL

554/553

PSMA-E LH x I2C HL

568/567

PSMA-F LH x I2C HL

582/581

PSMA-J LH x I2C HL

596/595

PSMA-L LH x I2C HL

20 Los constructos mencionados anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicos entre especies para PSMA humano y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas de CD3 específicas entre especies para CD3 humana y de macaco se obtuvieron mediante síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron y la expresión de proteínas eucariotas se realizó en analogía al procedimiento descrito en el ejemplo 9 para las moléculas de cadena sencilla específicas entre especies de

25 MCSP y CD3. Alternativamente los constructos pueden transfectarse en células CHO deficientes en DHFR de una manera transitoria según protocolos convencionales.

24.4 Análisis de unión mediante citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de PSMA y CD3

Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre

30 especies con respecto a su capacidad de unión a PSMA humano y de macaco y a CD3 humana y de macaco, se realizó un análisis FACS. Para este fin se usaron las células CHO transfectadas con PSMA humano tal como se describe en el ejemplo 24.1 y la línea celular de leucemia de células T positivas para CD3 humana HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para comprobar la unión a antígenos humanos. Se sometió a prueba la reactividad de unión a antígenos de macaco usando el transfectante de PSMA de macaco generado descrito en el ejemplo 24.2 y

35 una línea de células T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se realizó el análisis mediante citometría de flujo en analogía al procedimiento descrito en el ejemplo 10.

La capacidad de unión de todas las moléculas de cadena sencilla biespecíficas basadas en PSMA era claramente detectable tal como se muestra en la figura 46. En el análisis FACS, todos los constructos mostraron que se unían a

40 CD3 y PSMA en comparación con el control negativo usando medio de cultivo y anticuerpo de detección 1. y 2. En resumen, pudo demostrarse claramente la especificidad entre especies del anticuerpo biespecífico frente a CD3 humana y de macaco y frente a PSMA humano y de macaco.

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24.5 Bioactividad de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies de PSMA y CD3

Se analizó la bioactividad de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 usando las líneas celulares positivas para PSMA descritas en el ejemplo 24.1 y 24.2. Como células efectoras, se usaron células T positivas para CD8 humana estimuladas o la línea

5 de células T de macaco 4119LnPx. Se realizaron los ensayos de citotoxicidad de manera similar al procedimiento descrito para el análisis de bioactividad de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD3 en el ejemplo 11.

Tal como se muestra en las figuras 47 y 48, todos los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies representados revelaron actividad citotóxica contra células diana positivas para PSMA

10 humano provocada por células CD8+ humanas y contra células diana positivas para PSMA de macaco provocada por la línea de células T de macaco 4119LnPx. Como control negativo, se usó un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla irrelevante.

24.6 Generación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies PSMA y CD3

Se diseñaron moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, que comprende cada una un dominio que se

15 une al antígeno CD3 humano y de macaco así como un dominio que se une al antígeno PSMA humano, tal como se expone en la tabla 8 siguiente:

Tabla 8: Formatos de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies anti-CD3 y anti-PSMA.

SEQ ID NO. (nucl./prot.)

Formatos de constructos de proteínas (N  C)

610/609

PM99-A8 HL x I2C HL

624/623

PM86-A10 HL x I2C HL

638/637

PM86-B4-2 HL x I2C HL

652/651

PM98-B4 HL x I2C HL

666/665

PM86-C3 HL x I2C HL

680/679

PM86-E12 HL x I2C HL

694/693

PMF1-A10 HL x I2C HL

708/707

PM99-F1 HL x I2C HL

736/721

PM99-F5 HL x I2C HL

735/734

PM86-F6 HL x I2C HL

800/799

PM76-A9 HLx I2C HL

818/817

PM76-B10 HL x I2C HL

864/863

PM29-G1 HL x I2C HL

850/849

PM49-B9 HL x I2C HL

836/835

PM34-C7 HL x I2C HL

786/785

PM84-D7 HL x I2C HL

882/881

PM08-B6 HL x I2C HL

900/899

PM08-E11 HL x I2C HL

936/935

PM95-A8 HL x I2C HL

1018/1017

PM26-C9 HL x I2C HL

1032/1031

PM26-H4 HL x I2C HL

918/917

PM95-H6 HL x I2C HL

1004/1003

PM07-D3 HL x I2C HL

954/953

PM07-A12 HL x I2C HL

972/971

PM07-F8 HL x I2C HL

990/989

PM07-E5 HL x I2C HL

Los constructos mencionados anteriormente que comprenden cada uno una combinación de dominio de una cadena

20 ligera (L) variable y una cadena pesada (H) variable que se unen al antígeno CD3 humano y de macaco así como a una combinación de dominios de una cadena ligera (L) variable y una cadena pesada (H) variable que se unen al antígeno PSMA humano se obtuvieron mediante síntesis génica. Cada combinación de dominios de una cadena ligera (L) variable y una pesada (H) variable que se unen al antígeno PSMA humano se obtuvo a través de presentación en fabos a partir de una biblioteca de scFv mediante cribado en la línea de células de cáncer de

25 próstata humanas positivas para PSMA, LNCaP (n.º de la ATCC CRL-1740) seguido por examen basado en FACS para clones positivos usando la misma línea celular. Se diseñaron fragmentos de síntesis génica de las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla enumeradas anteriormente y se realizó expresión de proteínas en eucariotas en analogía al procedimiento descrito en el ejemplo 24.3, citado anteriormente, respectivamente para las moléculas de cadena sencilla específicas entre especies de MCSP y CD3 en el ejemplo 9. Lo mismo es cierto para

30 la expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de PSMA y CD3.

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24.7 Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de PSMA y CD3

Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre especies con respecto a la capacidad de unión a PSMA y CD3, se llevó a cabo un análisis FACS. Para este

5 propósito se usaron células positivas para PSMA para someter a prueba la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a CD3 de macaco se sometió a prueba usando la línea de células T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). El análisis de citometría de flujo se realizó en analogía al procedimiento descrito en el ejemplo 10.

10 La unión biespecífica de las moléculas de cadena sencilla generadas mostrada en la figura 49 y la figura 51, a PSMA y a CD3 humano y de primate distinto de chimpancé fue claramente detectable. En el análisis FACS todos los constructos mostrados demostraron unión a CD3 y PSMA en comparación con el control negativo.

24.8 Bioactividad de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla específicos entre especies de PSMA y CD3

La bioactividad del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla generado se analizó mediante ensayos de

15 citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para PSMA. Como células efectoras, se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas o la línea de células T de macaco 4119LnPx. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron de manera similar al procedimiento descrito para el análisis de bioactividad de los anticuerpos biespecíficos específicos entre especies de MCSP y CD33 en el ejemplo 11.

Los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla generados mostrados en las figuras 50 y 52 20 demostraron actividad citotóxica contra células diana positivas para PSMA.

24.9. Generación de moléculas biespecíficas de cadena sencilla específicas entre especies de PSMA y CD3 adicionales

Se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano VH3 3-11 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto de región de marco para CDRH1 (SEQ ID NO. 394, CDRH2 (SEQ ID NO. 395) y CDRH3 (SEQ ID 25 NO. 396). Asimismo, se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano VH1 1-02 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto de región de marco para CDRH1 (SEQ ID NO. 408), CDRH2 (SEQ ID NO. 409) y CDRH3 (SEQ ID NO. 410) así como la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano VH1 1-03 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto de región de marco para CDRH1 (SEQ ID NO. 445), CDRH2 (SEQ ID NO. 446) y CDRH3 (SEQ ID NO. 447). Para cada VH humana tienen que sintetizarse varios

30 oligonucleótidos generados que se solapan en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos. Para este fin cada segundo cebador es un cebador antisentido. Para VH3 3-11 se usan los siguientes conjuntos de oligonucleótidos:

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Para VH1 1-02 los oligonucleótidos son tal como sigue: Para VH1 1-03 se usan los siguientes oligonucleótidos:

imagen72

imagen73

imagen74

Cada uno de estos conjuntos de cebadores abarca toda la secuencia de VH correspondiente. Dentro de cada

5 conjunto, los cebadores se mezclan en cantidades iguales (por ejemplo 1 l de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 M) a una reacción de PCR de 20 l) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incuba a 94ºC durante 3 minutos, 65ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 1 minuto, 59ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto, 52ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente, se hace correr el producto en una

10 electroforesis en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 a partir del gel de acuerdo con métodos convencionales.

Se usa entonces cada producto de VH de PCR como molde para una reacción de PCR convencional usando cebadores que incorporan sitios de restricción de clonación N-terminales y C-terminales adecuados. El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH de aproximadamente 350 nucleótidos) se aísla mediante electroforesis en 15 gel de agarosa de acuerdo con métodos convencionales. De esta forma se amplifica un fragmento de ADN de VH

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suficiente.

Se elige la secuencia de VL de línea germinal de anticuerpo humano Vkl L1 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como

contexto de región de marco para CDRL1 (SEQ ID NO. 389), CDRL2 (SEQ ID NO. 390) y CDRL3 (SEQ ID NO. 391).

Asimismo, se elige la secuencia de VL de línea germinal de anticuerpo humano Vkll A17 (http://vbase.mrc

5 cpe.cam.ac.uk/) como contexto de región de marco para CDRL1 (SEQ ID NO. 403), CDRL2 (SEQ ID NO. 404) y

CDRL3 (SEQ ID NO. 405) así como la secuencia de VL de línea germinal de anticuerpo humano Vkll A1

(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto de región de marco para CDRL1 (SEQ ID NO. 450), CDRL2 (SEQ

ID NO. 451) y CDRL3 (SEQ ID NO. 452). Para cada VL humana tienen que sintetizarse varios oligonucleótidos

degenerados que se solapan en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos. Para este fin, cada 10 segundo cebador es un cebador antisentido. Se delecionan sitios de restricción necesarios para clonar

posteriormente dentro de los oligonucleótidos. Para Vkl L1, se usan los siguientes oligonucleótidos:

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Para Vkll A17, los oligonucleótidos son tal como sigue:

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15 Para Vkll A1, se usan los siguientes oligonucleótidos: Cada uno de estos conjuntos de cebadores abarca toda la secuencia de VL correspondiente. Dentro de cada conjunto, los cebadores se mezclan en cantidades iguales (por ejemplo 1 l de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 M) a una reacción de PCR de 20 l) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incuba a 94ºC durante 3 minutos, 65ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 1 minuto, 59ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto, 52ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente, se hace correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 a partir del gel de acuerdo con métodos convencionales.

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Se usa entonces cada producto de VL de PCR como molde para una reacción de PCR convencional usando cebadores que incorporan sitios de restricción de clonación N-terminales y C-terminales adecuados. El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VL de aproximadamente 350 nucleótidos) se aísla mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con métodos convencionales. De esta forma se amplifica un fragmento de ADN de VL suficiente.

Entonces se combina el producto final de PCR, VH basada en VH3 3-11 (es decir, el repertorio de VH humana/humanizada) con el producto final de PCR, VL basada en Vkl L1 (es decir, el repertorio de VL humana/humanizada), se combina el producto final de PCR, VL basada en VH1 1-02 (es decir, el repertorio de VH humana/humanizada) con el producto final de PCR, VL basada en Vkll A17 (es decir, el repertorio de VL humana/humanizada) y se combina el producto de final, VH basada en VH1 1-03 (es decir, el repertorio de VH humana/humanizada) con el producto final de PCR, VL basada en Vkll A1 (es decir, el repertorio de VL humana/humanizada) en el vector de presentación en fagos pComb3H5Bhis, respectivamente. Estas tres combinaciones de VH-VL forman tres bibliotecas diferentes de scFv funcionales de las que, tras la presentación en fagos filamentosos, se seleccionan, examinan, identifican y confirman elementos de unión anti-PSMA tal como se describe a continuación:

Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Se transforma entonces la biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante en 300 ul de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad Gen Pulser) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionan transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml de cultivo en Super Broth líquido (SB) durante la noche. Después, se recogen las células por centrifugación y se lleva a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).

Se ligan 2800 ng de este ADN de plásmido que contenía la biblioteca VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transforman de nuevo en dos alícuotas de 300 ul de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño total de biblioteca de scFv VH-VK (fragmento variable de cadena sencilla) de más de 107 clones independientes.

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Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, se transfieren las células de E. coli que contenían la biblioteca de anticuerpos a medio de selección SB-carbenicilina (SB con carbenicilina 50 ug/ml). Después, se infectan las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago auxiliar VCSM13, dando como resultado la producción y secreción de fago filamentoso M13, en el que la partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis de cadena sencilla que codifica para un fragmento scFv y presenta la proteína scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína de cubierta III del fago. Este conjunto de fagos que presenta la biblioteca de anticuerpos se usa posteriormente para la selección de entidades de unión a antígeno.

Para este fin se recoge la biblioteca de fagos que porta el repertorio de scFv clonado del respectivo sobrenadante de cultivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden de aproximadamente 1011 a 1012 partículas de fagos con scFv en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1% y se incuban con de 105 a 107 línea de células de cáncer de próstata humanas positivas para PSMA LNCaP (n.º de la ATCC CRL-1740) durante 1 hora en hielo bajo agitación lenta. Estas células LNCaP se recogen previamente mediante centrifugación, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na al 0,05%). Los fagos con scFv que no se unen específicamente a las células LNCaP se eliminan mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1 % (que contiene azida de Na al 0,05%). Después del lavado, se eluyen las entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina pH 2,2 (10 min de incubación con agitación en vórtex posterior) y tras la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usa el eluato para la infección de un cultivo recién preparado de células de E. coli XL1 Blue no infectadas (DO600 > 0,5). El cultivo de E. coli que contiene células de E. coli transducidas exitosamente con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento scFv humano, se selecciona de nuevo por su resistencia a carbenicilina y se infecta posteriormente con fago auxiliar VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevan a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.

Con el fin de seleccionar moléculas de unión específicas para PSMA se aísla ADN de plásmido correspondiente a 4 y 5 ciclos de cribado a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína scFv soluble, se escinden fragmentos de ADN VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Estos fragmentos se clonan por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His que difiere del pComb3H5BHis original en que el constructo de expresión (por ejemplo, scFv) incluye una etiqueta Flag (DYKDDDDK) entre el scFv y la etiqueta de 6 His y las proteínas de fago adicionales se delecionan. Después de la ligación, se transforma cada conjunto (distintos ciclos de cribado) de ADN de plásmido en 100 l de E. coli TG1 o XLI Blue competentes para choque térmico y se siembran en placa sobre LB-agar con carbenicilina. Se toman colonias individuales en 100 l de LB carb (50 ug/ml de carbenicilina).

Las E. coli transformadas con pComb3H5BHis que contienen un segmento VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la inducción con IPTG 1 mM. Debido a una secuencia señal adecuada, se exporta la cadena scFv al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional.

Se toman colonias bacterianas individuales de E. coli TG1 de las placas de transformación para preparaciones periplásmicas a pequeña escala y se hacen crecer en medio SB (por ejemplo, 10 ml) complementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 g/ml (y se redisuelven en PBS (por ejemplo, 1 ml) después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70ºC y descongelación a 37ºC, se destruye la membrana externa de las bacterias por choque térmico y se liberan las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los residuos celulares por centrifugación, se recoge el sobrenadante que contiene los scFv humanos anti-PSMA humano y se usan para la identificación de elementos de unión específicos para PSMA tal como sigue:

Se somete a prueba la unión de scFv a PSMA por citometría de flujo en la línea de células de cáncer de próstata humanas positivas para PSMA LNCaP (n.º de la ATCC CRL-1740). Se usa una preparación periplasmática tal como se describió anteriormente sin ninguna bacteria crecida como control negativo.

Para citometría de flujo se incuban 2,5x105 células con 50 ul de preparación periplasmática de scFV o con 5 g/ml de scFv purificado en 50 l PBS con FCS al 2%. Se detecta la unión de scFv con un anticuerpo anti-His (anticuerpo Penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 g/ml en 50 l de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa se usa un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, IgG de cabra antiratón (específico de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 l de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, RFA). Se miden las muestras en un instrumento FACS (BD biosciences, Heidelberg, RFA).

Se analizan entonces clones individuales para detectar propiedades y secuencias de aminoácidos favorables. Se convierten los scFv específicos para PSMA en anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla recombinantes uniéndolos a través de un ligador de Gly4Ser1 con el scFv I2C específico para CD3 (SEQ ID 185) o cualquier otro scFv específico para CD3 de la invención para dar como resultado constructos con la disposición de dominios VHPSMA -(Gly4Ser1)3 -VLPSMA-Gly4Ser1-VHCD3 -(Gly4Ser1)3 -VLCD3 o VLPSMA -(Gly4Ser1)3 -VHPSMA-Gly4Ser1-VHCD3 (Gly4Ser1)3 -VLCD3 o disposiciones de dominios alternativas. Para la expresión en células CHO, las secuencias codificantes de (i) un líder de cadena pesada de inmunoglobulina N-terminal que comprende un codón de iniciación incrustado dentro de una secuencia consenso Kozak y (ii) una etiqueta de 6 His C-terminal seguida por un codón de terminación se unen ambas en marco a la secuencia de nucleótidos que codifican para los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla antes de la inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtiene mediante síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se lleva a cabo la transfección de los plásmidos de expresión generados, la expresión de proteínas y la purificación de constructos de anticuerpo biespecífico específico entre especies tal como se describe

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5 en los capítulos 24.6 y 24.7 de este ejemplo. El resto de los procedimientos del estado de la técnica se llevan a cabo según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)).

La identificación de constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla funcional se lleva a cabo mediante análisis de unión por citometría de flujo de sobrenadante de cultivo a partir de células transfectadas que expresan

10 los constructos de anticuerpo biespecífico específico entre especies. El análisis de citometría de flujo se realiza en la línea de células de cáncer de próstata humanas positivas para PSMA LNCaP (n.º de la ATCC CRL-1740) tal como se describe en el capítulo 24.7 de este ejemplo. Sólo se seleccionan aquellos constructos que muestran unión biespecífica a CD· humano y de macaco así como a PSMA para su uso adicional.

La actividad citotóxica de los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies

15 generados contra células diana positivas para PSMA provocada por las células T efectoras se analiza tal como se describe en el capítulo 24.8 de este ejemplo. La línea de células de cáncer de próstata humanas positivas para PSMA LNCaP (n.º de la ATCC CRL-1740) se usa como fuente de células diana. Sólo se seleccionan aquellos constructos que muestran reclutamiento potente de actividad citotóxica de células T efectoras contra células diana positivas para PSMA para su uso adicional.

20 25. Mapeo de epítopos de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA y CD3

25.1 Generación de células CHO que expresan quimeras de PSMA de ser humano/rata

Para el mapeo de los epítopos de unión de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA, se generaron proteínas quiméricas de PSMA a partir de dos especies diferentes. Este enfoque 25 requiere que sólo la proteína de PSMA de una especie se reconozca por el anticuerpo. En este caso, se usó PSMA de Rattus norvegicus, que no se une a las moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA sometidas a prueba, para obtener quimeras con PSMA humano. Por tanto la creación de una quimera en la región que contiene el epítopo de unión de un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA conduce a pérdida de unión de dicho anticuerpo de cadena sencilla al constructo de PSMA

30 respectivo.

Se usaron la secuencia codificante de PSMA humano tal como se publica en GenBank (número de registro NM_004476) y la secuencia codificante de PSMA de rata (NM_057185, folato hidrolasa de Rattus norvegicus (Folh1), ARNm, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) para la generación de los constructos quiméricos.

35 Se diseñó un conjunto de 7 constructos quiméricos de ADNc y se generaron mediante síntesis génica según protocolos convencionales. En los constructos, se intercambiaron segmentos de las secuencias codificantes para los aminoácidos 140 a 169, 191 a 258, 281 a 284, 300 a 344, 589 a 617, 683 a 690 y 716 a 750, respectivamente, para las secuencias homólogas de PSMA de rata.

Los constructos quiméricos de PSMA se generaron tal como se describió anteriormente y se designaron tal como se 40 expone en la tabla 9 siguiente:

Tabla 9: Designación de constructos quiméricos de PSMA

SEQ ID (nucl/prot)

Designación

1033/1034

huPSMArat140-169

1035/1036

huPSMArat191-258

1037/1038

huPSMArat281-284

1039/1040

huPSMArat300-344

1041/1042

huPSMArat598-617

1043/1044

huPSMArat683-690

1045/1046

huPSMArat716-750

Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para contener en primer lugar un sitio de Kozak para expresión eucariota del constructo seguido por la secuencia codificante de las proteínas quiméricas de PSMA, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación. Los fragmentos de síntesis 45 génica también se diseñaron para introducir sitios de restricción al comienzo y al final de los fragmentos. Los sitios de restricción inducidos, EcoRl en el extremo 5’ y Sall en el extremo 3’, se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Se eliminaron sitios de restricción internos no deseados mediante mutación silenciosa de la

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secuencia codificante en los fragmentos de síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron por medio de EcoRl y Sall en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del constructo. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Method Enzymoll. 185, 537-566. Se indujo amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

25.2 Análisis de unión por citometría de flujo para mapeo de epítopos de moléculas de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA y CD3 usando proteínas quiméricas de PSMA

Con el fin de determinar el epítopo de unión de constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA, se realizó un análisis FACS. Para este fin, se usaron células CHO transfectadas con moléculas quiméricas de PSMA de ser humano/rata tal como se describe en el ejemplo 25.1. Se realizó análisis FACS con sobrenadante de células CHO que expresaban constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se describe en el presente documento. La detección de la unión de constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA se realizó usando un anticuerpo anti Penta-His murino y como reactivo de segunda etapa un anticuerpo específico frente a Fc gamma conjugado con ficoeritrina. Se usó el sobrenadante de células no transfectadas como control negativo.

Tal como se muestra en la figura 53, todos los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA sometidos a prueba mostraron unión a los constructos quiméricos huPSMArat140-169, huPSMArat191-258, huPSMArat281-284, huPSMArat683-690 y huPSMArat716-750. Tal como se muestra adicionalmente en la figura 53, hay una falta de unión para los constructos de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA, PM84-D 7 x I2C, PM29-G1 x I2C y PM49-B9 x I2C al constructo huPSMArat300-344, lo que demuestra la presencia de un epítopo de unión principal para estos constructos en la región de los aminoácidos 300 a 344 de PSMA humano. Tal como también se muestra en la figura 53, hay una falta de unión para el constructo de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla específico entre especies de PSMA, PM34-C7 x I2C, al constructo huPSMArat598-617, lo que demuestra la presencia de un epítopo de unión principal para este constructo en la región de los aminoácidos 598 a 617 de PSMA humano.

26. Mapeo de epítopos usando un enfoque de barrido de péptidos

Los dos anticuerpos de PSMA BiTE, PM 76-B10 x I2C y PM 76-A9 x I2C, presentaban reactividad cruzada con PSMA de rata, lo que los excluyó del mapeo al usar quimeras de PSMA de ser humano-rata. Asimismo, las señales de unión del anticuerpo de PSMA BiTE, PM F1-A10 x I2C, en las quimeras de PSMA de ser humano-rata fueron demasiado débiles para un mapeo de epítopos fiable. Estos tres anticuerpos de PSMA BiTE se sometieron a un enfoque alternativo de mapeo de epítopos basado en barrido de péptidos (Pepscan). Pepscan usa péptidos solapantes de una proteína dada y analiza la unión de anticuerpo a péptidos inmovilizados mediante ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Los experimentos de mapeo de epítopos con anticuerpos de PSMA BiTE se realizaron en la empresa Pepscan (Lelystad, Países Bajos). Una descripción detallada del método se encuentra en otra parte (Bernard et al. 2004, J. Biol. Chem., 279: 24313 -22; Teeling et al. 2006, J Immunol., 177: 362-71). En resumen, se sintetizaron 693 péptidos de 15 meros diferentes que abarcaban toda la secuencia extracelular de aminoácidos de PSMA humano y que solapaban con cada péptido vecino de 15 meros en 14 aminoácidos. Se recubrió con estos péptidos pocillos de ELISA en un formato de 384 pocillos. Para estos experimentos, se produjeron scFv anti-PSMA de los candidatos de anticuerpo BiTE respectivos (scFv MP 9076-A9 para el anticuerpo BiTE PM 76-A9 x I2C; scFv MP 9076-B10 para el anticuerpo BiTE PM 76-B10 x I2C; scFv F1-A10 para el anticuerpo BiTE PM F1-A10 x I2C) en E. coli y se usaron para ELISA como extractos periplasmáticos en bruto. Para este fin, se enviaron 7 ml de extractos periplasmáticos en bruto en hielo seco a Pepscan (Países Bajos). El uso de homólogos de scFv en este ensayo minimizó el riesgo de recoger señales de la segunda especificidad de unión distinta de PSMA de los anticuerpos BiTE, lo que podía conducir a mala interpretación de los epítopos de unión a PSMA de los elementos de unión diana. Se incubaron los scFv con los péptidos y se detectó la unión específica usando un anticuerpo anti-His. Se midieron las señales de unión en un lector de ELISA de 384 pocillos. Los resultados se muestran en las figuras 54, 55 y 56.

De los tres anticuerpos scFv anti-PSMA usados para generar anticuerpos BiTE frente a PSMA (scFv MP 9076-A9 para el anticuerpo BiTE PM 76-A9 x I2C; scFv MP 9076-B10 para el anticuerpo BiTE PM 76-B10 x I2C; scFv F1-A10 para el anticuerpo BiTE PM F1-A10 x I2C), aparentemente dos (MP 9076-A9 y MP 9076-B10) se unieron a un epítopo dominante similar de PSMA humano. Este hallazgo está respaldado por la estrecha homología de los dos anticuerpos scFv y la identidad de secuencia en sus seis CDR. Las señales de unión a péptido señalan a un epítopo central entre Thr334 y Thr339. Esta secuencia está ubicada en un bucle expuesto del dominio apical de PSMA humano tal como se muestra en la figura 57. Para scFv F1-A10, pudo detectarse un epítopo dominante dentro de la secuencia LFEPPPPGYENVS (aminoácidos 143-155 de PSMA humano), que también se ubica en el dominio apical. La fuerte unión de los tres fragmentos de anticuerpo MP 9076-A9, MP9076-B10 y F1-A10 a péptidos diferenciados indica el reconocimiento de un epítopo de proteína lineal más que un resto de hidrato de carbono.

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Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

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   1.

   Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a un epítopo de la cadena de CD3 (épsilon) de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8, y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión que se une al antígeno de membrana específico de próstata (PSMA).

2. 2.

   Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 1, en la que el primer dominio de unión comprende una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

   (a)

   CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 27, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 28 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 29;

   (b)

   CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 117, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 118 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 119; y

   (c)

   CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 153, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 154 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 155.

3. 3.

   Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 1 ó 2, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

   (a)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 12, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 13 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 14;

   (b)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 30, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 31 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 32;

   (c)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 48, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 49 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 50;

   (d)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 66, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 67 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 68;

   (e)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 84, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 85 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 86;

   (f)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 102, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 103 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 104;

   (g)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 120, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 121 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 122;

   (h)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 138, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 139 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 140;

   (i)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 156, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 157 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 158; y

   (j)

   CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 174, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 175 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 176.

4. 4.

   Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el segundo dominio de unión puede unirse a PSMA humano y/o a un PSMA de primate no humano.

5. 5.

   Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 4, en la que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionadas de:

   a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 394 -396 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 389 -391;

   b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 408 -410 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 403 -405;

   c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 422 -424 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 417 -419;

   d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 436 -438 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 431 -433;

   274

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   e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 445 -447 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 450 -452; f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 464 -466 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 459 -461; g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 478 -480 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 473 -475; h) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 492 -494 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 487 -489; i) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 506 -508 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 501 -503; j) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 520 -522 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 515 -517; k) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 534 -536 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 529 -531; l) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 548 -550 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 543 -545; m) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 562 -564 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 557 -559; n) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 576 -578 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 571 -573; o) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 590 -592 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 585 -587; p) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 604 -606 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 599 -601; q) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 618 -620 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 613 -615; r) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 632 -634 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 627 -629; s) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 646 -648 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 641 -643; t) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 660 -662 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 655 -657; u) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 674 -676 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 669 -671; v) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 688 -690 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 683 -685; w) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 702 -704 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 697 -699; x) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 716 -718 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 711 -713; y) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 729 -731 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 724 -726; z) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 788 -790 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 793 -795; aa) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 806 -808 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 811 -813; ab) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 852 -854 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 857 -859; ac) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 838 -840 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 843 -845; ad) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 824 -826 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 829 -831; ae) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 774 -776 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 779 -781; af) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 688 -690 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 683 -685; ag) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 870 -872 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 875 -877; ah) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 888 -890 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 893 -895; ai) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 924 -926 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 929 -931; aj) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 1019 -1021 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 1025 -1027; ak) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 1006 -1008 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 1011 -1013; al) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 906 -908 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 911 -913; am) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 992 -994 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 997 -999; an) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 942 -944 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 947 -949; ao) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 960 -962 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 965 -967;

   275

   imagen3

   y

   ap) CDR H1-3 de SEQ ID NO:978 -980 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 983 -985.

6. 6.

   Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 5, en la que los dominios de unión están dispuestos en el orden VH PSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 o VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3.

7. 7.

   Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 6, en la que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende una secuencia seleccionada de:

   (a)

   una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO.: 399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 ó 989;

   (b)

   una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO.: 400, 414, 428, 442, 456, 470, 484, 498, 512, 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736 735, 800, 818, 864, 850, 836, 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 ó 976; y

   (c)

   una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96% a la secuencia de aminoácidos de (a) o (b).

8. 8.

   Secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. 9.

   Vector, que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. 10.

    Célula huésped transformada o transfectada con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.

11. 11.

    Procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped según la reivindicación 10 en condiciones que permiten la expresión de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y recuperar el polipéptido producido del cultivo.

12. 12.

    Composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o producida según el procedimiento según la reivindicación 11.

13. 13.

    Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

    o producida según el procedimiento según la reivindicación 11, para su uso en la prevención, el tratamiento

    o la mejora del cáncer.

14. 14.

    Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 13, en la que dicho cáncer es un tumor sólido, preferiblemente un carcinoma o cáncer de próstata.

15. 15.

    Kit que comprende una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, un vector según la reivindicación 9, o una célula huésped según la reivindicación 10.

16. 16.

    Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 1, en la que dicho primer dominio de unión se une al fragmento de polipéptido de CD3 épsilon N-terminal in vitro y a la subunidad de CD3 épsilon nativa del complejo CD3 en células T in vivo con la misma afinidad de unión.

17. 17.

    Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 1, en la que dicho epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos que comprende 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 aminoácidos.

18. 18.

    Molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla según la reivindicación 1, en la que la homogeneidad de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla es de al menos el 90%, el 95%

    o el 98%.

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