ES2589928T3 - Procedimiento para la producción de circovirus porcino - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de circovirus, que comprende: sembrar un cultivo de células huésped con un cultivo de siembra de un circovirus; incubar el cultivo de células huésped en ausencia de suero de ternera fetal; controlar (i) la viabilidad de las células huésped, y (ii) la expresión de ORF1 y ORF2 por las células huésped; y recoger el circovirus del cultivo de células huésped cuando la expresión de ORF2 es aproximadamente la misma en las células no adherentes y las células adherentes del cultivo de células huésped; y en el que el circovirus es PCV2.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento para la produccion de circovirus porcino CAMPO DE LA INVENClON
[0001] La presente invencion se refiere a procedimientos de control durante el proceso del rendimiento viral durante procesos de produccion por incubacion discontinua utilizando analisis de clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes. La presente invencion se refiere ademas a procedimientos de control durante el proceso y la recogida de cultivos celulares infectados con circovirus en un medio que puede carecer de un componente de suero.
ANTECEDENTES DE LA INVENClON
[0002] El sfndrome del desmedro multisistemico post-destete (PMWS) es una enfermedad reconocida recientemente de cerdos jovenes. El sfndrome de PMWS detectado en Canada, Estados Unidos y Francia esta caracterizado clfnicamente por una perdida gradual de peso y por manifestaciones, tales como taquipnea, disnea e ictericia. Desde el punto de vista patologico, se manifiesta por infiltraciones linfocfticas o granulomatosas, linfadenopatfas y, mas raramente, por hepatitis y nefritis linfocftica o granulomatosa (Clark E.G. (1997) Proc Am Assoc Swine Prac 499-501; La Semaine veterinaire No. 26, suplemento de La Semaine veterinaire 1996 (834); La Semaine veterinaire 1997 (857): 54; Nayar et al (1997) Can Vet J. 38: 385-387). El tratamiento y prevencion de esta enfermedad no estan disponibles actualmente. Varias lfneas de evidencia, sin embargo, apuntan al circovirus porcino como el agente etiologico de PMWS (Ellis et al (1998) Can Vet J. 39: 44-51). Los circovirus se han recuperado de los cerdos con PMWS y se ha demostrado anticuerpos para circovirus porcino en cerdos con la enfermedad.
[0003] Una familia de virus, llamada Circoviridae, que se encuentra en una gama de especies de plantas y animales, y comunmente conocida como circovirus, se caracterizan por ser viriones redondos, no envueltos, con diametros promedio de 17 a 23,5 nm que contienen acido desoxirribonucleico de cadena simple circular (ssADN). El genoma de ssADN de los circovirus representa los replicones de ADN virales mas pequenos conocidos. Como se ha descrito en el documento WO 99/45956, se han identificado al menos seis virus como miembros de la familia segun el sexto informe del Comite Internacional para la Taxonomfa de los Virus (Lukert et al., 1995, The Circoviridae, pag. 166-168. en Murphy, et al. (eds.) Virus Taxonomy, Sexto Informe del Comite Internacional de Taxonomfa del Virus, Arch. Virol. 10 Supl.).
[0004] Los virus animales incluidos en la familia son el virus de la anemia del pollo (CAV); virus de la enfermedad del pico y las plumas (BFDV); circovirus porcino (PCV); y circovirus de paloma. El PCV se aislo originalmente de cultivos celulares de rinon porcino. El PCV se replica en el nucleo celular y produce grandes cuerpos de inclusion intranucleares. Vease Murphy et al. (1999, Circoviridae p. 357-361, Veterinary Virology, 3a ed., Academic Press, San Diego). Actualmente hay dos tipos reconocidos de PCV, PCV tipo 1 (PCV1) y PCV tipo 2 (PCV2). El PCV1, aislado como contaminante persistente de la lfnea celular de rinon porcino continua, PK-15 (ATCC CCL31), no causa efectos citopaticos detectables en el cultivo celular y no produce la enfermedad clfnica en cerdos despues de la infeccion experimental (vease Allan G. (1995). Vet Microbiol 44: 49-64; Tischer et al (1982), Nature 295: 64-66; y Tischer et al (1986) Arch Virol 91: 271-276).
[0005] Solo muy recientemente algunos autores han pensado que cepas de PCV podrfan ser patogenas y estar asociadas con el sfndrome de PMWS (Nayar et al (1997) Can Vet J. 38: 385-387 y Clark E.G. (1997) Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499-501). Nayar et al. han detectado ADN de PCV en cerdos que tienen el sfndrome PMWS usando tecnicas de PCR. PCV2, a diferencia de PCV1, esta estrechamente asociado con el sfndrome del desmedro multisistemico post-destete (PMWS) en cerdos destetados (vease Allan et al (1998) Eur J. Vet Diagn Investig. 10: 310; Ellis et al. (1998) Can Vet J. 39: 44-51 y Morozov et al (1998), J. Clin Microbiol 36: 2535-2541).
[0006] Las secuencias de nucleotidos para PCV1 se describen en Mankertz et al. (1997) J. Virol. 71: 2562-2566) y Meehan et al. (1997) J. Gen. Virol. 78: 221-227) y las secuencias de nucleotidos para PCV2 se describen en Hamel et al. (1998) J. Virol. 72: 5262-5267; Mankertz et al. (2000) Virus Res. 66: 65-77 y Meehan et al. (1998) J. Gen. Virol. 79: 2171-2179. Las cepas de PCV2 se dan a conocer en el documento WO 00/01409 y han sido depositadas en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares, Centro de Microbiologfa Aplicada e Investigacion, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OjG, Reino Unido e incluyen: N° de acceso V97100219; N° de acceso V970C218; N° de acceso V97100217; N° de acceso V98011608; y N° de acceso V98011609. El documento WO 00/77216 tambien describe PCV2.
[0007] Se han identificado hasta trece marcos de lectura abierta (ORF) en el genoma de PCV2. ORF1 (Meehan et al., (1998)), designado alternativamente como ORF4, comprende el nucleotido 398-1342 (GenBank N° de acceso AF055392) y tiene el potencial para codificar una protefna con un peso molecular predicho de 37,7 kD. ORF2 (Meehan et al, (1998); designado alternativamente como ORF13, comprende los nucleotidos 1381-1768 unidos a 1314 (GenBank N° de acceso AF055392) y puede codificar una protefna con un peso molecular predicho de 27,8 kD. La descripcion adicional del ORF 1 a 13 de PCV2 se puede hallar en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.368.601, 6.391.314, 6.660.272, 6.217.883, 6.517.843, 6.497.883, asf como AU 764379, EP 1019510, MX 221,562,
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MX 216996, RU 2237492 y NZ 505008.
[0008] ORF1 de PCV2 es muy similar (86% de identidad) con el ORF1 del aislado de PCV1 (Meehan et al., (1998)). La protema ORF1 de PCV1 se ha caracterizado parcialmente (Meehan et al, 1997; Mankertz et al, (1998) Virus genes 16: 267-276) y se ha demostrado que es esencial para la replicacion del virus, mas probablemente esta implicada en la replicacion del ADN viral.
[0009] La identidad de secuencia de protema entre los respectivos ORF2 fue menor (66% de identidad) que la existente entre los ORF1, pero cada uno de los ORF2 compartfa una region N-terminal basica muy conservada, similar a la observada en la region N-terminal de la principal protema estructural del virus del circovirus aviar virus de la anemia de pollo (CAV) (Meehan et al., 1998). Recientemente, Mankertz et al., en (1998) J, Gen. Virol. 79: 381-384 ha sugerido que el ORF2 del aislado con PCV1 (designado ORF1 en Mankertz et aL, 1998) codifica una protema de la capside. El analisis de la transcripcion del genoma de PCV2 no se ha publicado todavfa. Los datos recientes obtenidos con el aislado con PCV1 indicaron que la transcripcion de ORF2 esta empalmado (Mankertz et al., 1998).
[0010] Los estudios publicados hasta la fecha sobre PCV2 utilizaron un homogeneizado de tejido o virus cultivados derivados de aislados del campo. Tischer et al ((1987) Arch Virol. 96: 39-57) describen que las celulas de rinon de cerdo son estimuladas para entrar en la fase S en el ciclo celular mediante tratamiento con D-glucosamina. Sin embargo, el tratamiento debe realizarse con precaucion debido a que la D-glucosamina es toxica para el cultivo celular (vease, Allan et al (2000) J. Vet Diagn Investigation 12: 3-14).
[0011] Gilpin et al. 2003 divulga la deteccion de antfgeno de PCV2 en el citoplasma de los monocitos, macrofagos pulmonares y macrofagos derivados de monocitos expuestos al virus in vitro mediante analisis de inmunofluorescencia y el fenotipo de estas celulas se confirmo mediante deteccion los marcadores celulares de la superficie de celulas monodticas utilizando citometna de flujo.
[0012] McNeilly et al (2001) describen la produccion y caracterizacion de anticuerpos monoclonales para PCV2.
[0013] Meerts, P. et al. (2005) Arch. Virol. 150: 427-441 se refiere a un estudio in vitro de la cinetica de replicacion de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) en macrofagos alveolares porcinos (PAM), cardiomiocitos fetales (FCM) y celulas PK-15.
[0014] Existe aun la necesidad de procedimientos para el cultivo de circovirus incluyendo, por ejemplo, PCV1, PCV2 y otros circovirus, de manera que sea posible el circovirus con alto rendimiento. Dichos procedimientos sedan ventajosos, en particular para la preparacion, de antfgenos de PCV2 como vacunas dirigidas contra PMWS. La presente invencion aborda esta necesidad. La memoria se refiere a procedimientos para el crecimiento y la cuantificacion de una cantidad infecciosa o antigenica y la determinacion de anticuerpos contra el circovirus, en particular circovirus porcinos (PCV), que permiten un control durante el proceso del progreso de la produccion del virus en el cultivo discontinuo.
[0015] A pesar de que los circovirus porcinos pueden detectarse como un agente contaminante en los cultivos de tejidos de cerdo, los cultivos discontinuos a gran escala con exito del virus requieren ensayos rapidos para permitir el control continuo del progreso de la produccion viral para obtener rendimientos optimos. El objetivo de la presente memoria, por lo tanto, era desarrollar un procedimiento para el control del progreso del cultivo de un circovirus, tal como un circovirus porcino, in vitro para poder examinar la expresion cinetica de los ORF. Tambien se pretendfa aumentar el rendimiento del virus de un cultivo celular para la produccion de una vacuna que puede requerir PCV inactivado o una cepa de PCV no virulenta (por ejemplo, a traves de la seleccion de una cepa de PCV no virulenta despues de la adaptacion a diferentes cultivos celulares y/o despues del tratamiento de cultivos de celulas infectadas con mutagenos o despues de la modificacion genetica del PCV) como vacuna viva. Ademas, el material antigenico obtenido a partir de circovirus porcinos desarrollados tambien se puede emplear para fines de diagnostico. Existe la necesidad, por lo tanto, de poder controlar periodicamente y rapidamente el progreso de un cultivo celular discontinuo de un circovirus en condiciones que proporcionan partmulas virales adecuadas para la vacuna o para otros fines. Existe la necesidad de procedimientos de control que pueden dar resultados rapidos, en lugar de los procedimientos que requieren mucho tiempo y trabajo empleados en la actualidad para tal objetivo.
[0016] La cita o identificacion de cualquier documento en esta solicitud no es una admision de que dicho documento este disponible como tecnica anterior a la presente invencion.
DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
[0017] En un aspecto, la presente invencion proporciona un procedimiento para la produccion de circovirus, que comprende:
sembrar un cultivo de celulas huesped con un cultivo de siembra de un circovirus; incubar el cultivo de celulas huesped en ausencia de suero de ternera fetal;
controlar (i) la viabilidad de las celulas huesped, y (ii) la expresion de ORF1 y ORF2 por las celulas huesped; y recoger el circovirus del cultivo de celulas huesped cuando la expresion de ORF2 es aproximadamente la misma en
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las celulas no adherentes y las celulas adherentes del cultivo de celulas huesped; y en el que el circovirus es PCV2.
[0018] Esta memoria proporciona un procedimiento basado en FACS para el control durante el proceso y la determinacion rapida del punto de recogida util de un cultivo celular infectado con un circovirus, de manera que se puede obtener un rendimiento optimo del virus. Los procedimientos abarcan proporcionar un cultivo de siembra de celulas huesped infectadas con circovirus e inocular un cultivo discontinuo con las mismas, incubar el cultivo de siembra, extraer partes alfcuotas de las celulas cultivadas, separar las celulas sobrenadante y las celulas adherentes, liberar las celulas adherentes de su sustrato, determinar la viabilidad de las celulas huesped, y determinar el porcentaje de celulas positivas en ORF1 y ORF2 por FACS, determinando de este modo el punto de recogida del cultivo.
[0019] Un aspecto de la memoria proporciona un procedimiento basado en FACS para detectar la produccion de antfgeno de circovirus por un cultivo de celulas huesped, en el que el procedimiento puede comprender las etapas de obtener a partir de un cultivo de celulas huesped infectadas con un circovirus una muestra que comprende una poblacion de celulas huesped no adherentes y una poblacion de celulas huesped que se adhieren a un sustrato, aislar de la muestra las celulas huesped no unidas al mismo, aislar de la muestra las celulas huesped adherentes y el substrato de las mismas y liberar las celulas huesped adherentes del sustrato, determinar la cantidad de ORF1 en las celulas huesped no adherentes y adherentes liberadas mediante el contacto de dichas celulas con un anticuerpo especffico de ORF1, determinar el porcentaje de celulas infectadas en las celulas huesped no adherentes y adherentes liberadas mediante el contacto de dichas celulas con una anticuerpo especffico de ORF2, y relacionar el porcentaje de celulas positivas en ORF1 y ORF2 en la muestra con la cantidad de circovirus en la muestra.
[0020] En diversas realizaciones del procedimiento, los circovirus pueden ser PCV2. En diversas realizaciones, la cepa de celulas huesped puede ser PK-15 u otras lfneas celulares adecuadas. Se contempla, sin embargo, que los procedimientos de la memoria se pueden aplicar de manera util para la deteccion y el control durante el proceso de la produccion de cualquier circovirus cultivado en celulas huesped aisladas y para los que hay disponibles anticuerpos especfficos del antfgeno viral.
[0021] Otro aspecto de la memoria proporciona un procedimiento basado en FACS para el control durante el proceso de la produccion de un circovirus a partir de celulas huesped cultivadas, que comprende las etapas de obtener a partir de un cultivo de celulas huesped infectadas con un circovirus una pluralidad de muestras dependiente del tiempo, comprendiendo cada muestra en la serie una poblacion de celulas huesped no adherentes y una poblacion de celulas huesped que se adhieren a un sustrato, aislar de cada muestra del cultivo celular las celulas no unidas al mismo, aislar de cada muestra de cultivo celular las celulas huesped adherentes y el substrato de las mismas y liberar las celulas huesped adherentes del substrato, determinar la viabilidad de las celulas huesped en las muestras mediante la medicion de la captacion de yoduro de propidio usando citometrfa de flujo, determinar el porcentaje de celulas positivas en ORF1 presentes en las celulas no adherentes y adherentes liberadas mediante la determinacion de la cantidad de ORF1 en las celulas huesped no adherentes y adherentes liberadas mediante el contacto de dichas celulas con un anticuerpo especffico de ORF1, determinar la cantidad de anticuerpo que se une a las celulas mediante FACS y relacionar la cantidad de anticuerpo unido a la cantidad de ORF1 presente en las celulas, determinar el porcentaje de celulas positivas en ORF2 presentes en las celulas no adherentes y adherentes liberadas mediante la determinacion de la cantidad de ORF2 en las celulas huesped no adherentes y adherentes liberadas mediante el contacto de dichas celulas con un anticuerpo especffico de ORF2, determinar la cantidad de anticuerpo que se une a las celulas mediante FACS y relacionar la cantidad de anticuerpo unido a la cantidad de ORF2 presente en las celulas, y representar los cambios en los niveles de viabilidad, ORF1 y ORF2, determinando, de este modo, la evolucion con el tiempo de la produccion del circovirus en el cultivo de celulas huesped.
[0022] En una realizacion de este procedimiento de la memoria, la viabilidad de las celulas se puede determinar con yoduro de propidio y citometrfa de flujo.
[0023] En las diversas realizaciones de este procedimiento de la memoria, el circovirus puede ser PCV2 y la cepa de celulas huesped puede ser PK-15, aunque los procedimientos no se deben interpretar como aplicables unicamente a esta combinacion de cepa de circovirus/celulas huesped.
[0024] Sin embargo, otro aspecto de la memoria es un procedimiento de produccion de circovirus con rendimiento que puede ser util, por ejemplo, la preparacion de una vacuna, que comprende las etapas de preparar un cultivo de siembra de un circovirus mediante el control durante el proceso de la expresion de ORF1 y sembrar un cultivo de celulas huesped con un cultivo de siembra de un circovirus, incubar el cultivo de celulas huesped en ausencia de suero de ternera fetal, controlar (i) la viabilidad de las celulas huesped, y (ii) la expresion de ORF1 y ORF2 por las celulas huesped y recoger el circovirus del cultivo de celulas huesped cuando la expresion de ORF2 es aproximadamente la misma en las celulas no adherentes y las celulas adherentes del cultivo de celulas huesped.
[0025] En diversas realizaciones de este aspecto de la memoria, el rendimiento de circovirus en el cultivo de siembra se puede determinar mediante el control de la expresion de antfgenos de ORF1 y ORF2 de circovirus en celulas huesped sobrenadante utilizando un procedimiento basado en la clasificacion de celulas con anticuerpos
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fluorescentes (FACS), y en el que el cultivo de siembra se recoge cuando ORF2 es expresado por las celulas no adherentes.
[0026] En las diversas realizaciones de este aspecto de la memoria, se puede determinar la viabilidad de las celulas mediante la medicion de la captacion de yoduro de propidio usando citometrfa de flujo.
[0027] En las diversas realizaciones de este procedimiento de la memoria, el circovirus puede ser PCV2 y la cepa de las celulas huesped puede ser PK-15, aunque los procedimientos no se deben interpretar como aplicables unicamente a esta combinacion de cepa de circovirus/celula huesped. Se contempla, sin embargo, que los procedimientos de la memoria se pueden aplicar de manera util para la deteccion y el control durante el proceso de la produccion de cualquier circovirus cultivado en celulas huesped aisladas y para los que hay disponibles anticuerpos especfficos de antfgeno viral.
[0028] Cabe indicar que en esta memoria y en particular en las reivindicaciones y/o parrafos, terminos, tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares, pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y terminos, tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en", tienen el significado que se le atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados explfcitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la tecnica anterior o que afectan a una caracterfstica basica o novedosa de la invencion.
[0029] Estas y otras realizaciones se describen o son evidentes a partir de y estan abarcadas por la siguiente descripcion detallada.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0030] La siguiente descripcion detallada, proporcionada mediante ejemplos, pero que no pretende limitar la invencion unicamente a las realizaciones especfficas descritas, puede entenderse mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 ilustra un esquema para la separacion de sobrenadante y celulas PK-15 adherentes a partir de un cultivo de celulas y determinacion de antfgenos virales ORF1 y ORF2 en el mismo;
la figura 2 ilustra el recuento por citometrfa de flujo de las celulas PK-15 totales en una suspension de celulas, incluyendo las celulas vivas y muertas;
la figura 3 ilustra la deteccion de la proporcion de celulas muertas en una poblacion de celulas PK-15 infectadas por PCV2 mediante el desplazamiento en la captacion de yoduro de propidio y FACS;
la figura 4 ilustra la evolucion con el tiempo de la viabilidad de un cultivo de siembra de trabajo de celulas PK-15 infectadas por PCV2 con suero de ternera fetal presente en todo el periodo de incubacion; la figura 5 ilustra la inmunodeteccion y medicion de ORF1 por FACS;
la figura 6 ilustra la produccion de los antfgenos ORF1 y ORF2 virales de PCV2 durante el periodo de incubacion de un cultivo de siembra de trabajo; y
la figura 7 ilustra la produccion de los antfgenos virales ORF1 y ORF2 en celulas PK-15 infectadas con virus PCV2 con la extraccion de FCS del medio de cultivo despues de 3 dfas.
DESCRIPCION DETALLADA
[0031] Varios documentos se citan en el texto siguiente, y varios documentos estan referenciados o citados en los documentos citados en el texto siguiente. No hay ninguna admision de que cualquiera de estos documentos sea de hecho tecnica anterior para la presente invencion.
[0032] El termino "citometro de flujo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier dispositivo que irradiara una partfcula suspendida en un medio fluido con luz a una primera longitud de onda, y es capaz de detectar una luz a la misma o diferente longitud de onda, en el que la luz detectada indica la presencia de una celula o un indicador sobre la misma. El "citometro de flujo" puede estar acoplado a un clasificador de celulas que es capaz de aislar la partfcula o celula de otras partfculas o celulas que no emiten la segunda luz. El indicador sobre la superficie celular puede ser un anticuerpo acoplado a un fluoroforo, tal como, pero no limitado a, FITC que proporciona la clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes (FACS).
[0033] El termino "celula huesped", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una celula aislada que es un huesped para la infeccion y replicacion de un virus, preferiblemente un circovirus.
[0034] Los terminos "celulas adherentes", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a celulas animales cultivadas in vitro y que se han unido a un sustrato. El sustrato puede ser la superficie de un recipiente de cultivo o, como en cultivos celulares discontinuos, puede ser un soporte solido particulado, tal como esferas CYTODEX® (Amersham Biosciences, Inc), o similares. Dichas celulas pueden extraerse del soporte solido subyacente mediante procedimientos que requieren la digestion enzimatica de la matriz subcelular, incluyendo la digestion en condiciones controladas utilizando una proteasa, tal como, pero no limitada a, tripsina. Por el contrario, el termino "celulas no
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adherentes" se refiere a aquellas celulas cultivadas que se han desprendido de un sustrato durante el transcurso del perfodo de cultivo.
[0035] Tal como se utiliza en el presente documento, los loci de genes o transcripciones de los mismos tienen designaciones en cursiva; y las protefnas o polipeptidos expresados a partir de los mismos tienen designaciones no en cursiva.
[0036] Los terminos "ORF1" y "ORF2", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a antfgenos circovirales expresados a partir de los marcos de lectura abiertos ORF1 y ORF2 (tal como se ha designado por Meehan et al, (1998) J. Gen. Virol 78: 221 -227), respectivamente. ORF1 se cree que es una replicasa de etapa temprana y ORF2 un polipeptido que contribuye a la capside viral. Se han identificado trece marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma de PCV2. Una descripcion adicional de los ORF de PCV2 se puede encontrar en las patentes de Estados Unidos Nos. 6.368.601, 6.391.314, 6.660.272, 6.217.883, 6.517.843, 6.497.883, asf como AU 764379, EP 1019510, MX 221,562, MX 216996, RU 2237492 y NZ 505008.
[0037] La correspondencia entre las diversas denominaciones asignadas a cada ORF de PCV2 se muestra en el Ejemplo 1 a continuacion. Tal como se utiliza en el presente documento, ORF1 y ORF2 corresponden a ORF4 y ORF13 (tal como se han designado en las patentes mencionadas anteriormente), respectivamente.
[0038] El termino "durante el proceso" se refiere al control de los parametros que son caracterfsticos del cultivo celular y del virus, incluyendo un cultivo de celulas infectadas por virus, durante todo el perfodo del cultivo. El control puede ser continuo, tal como el control del pH o del contenido de oxfgeno del medio de cultivo, o puede ser un control periodico en el que las muestras se extraen del cutivo en los puntos de tiempo seleccionados, se detectan y miden parametros, tales como la viabilidad o contenido de antfgeno viral, y se representan los parametros frente al tiempo del cultivo
[0039] El termino "cultivo de siembra", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un cultivo de celulas huesped infectadas con un virus seleccionado, tal como un circovirus, y que se incuba a continuacion durante un perfodo para permitir que el tftulo del virus aumente. Normalmente, pero no necesariamente, el volumen de un cultivo de siembra es menor que el volumen del cultivo principal posterior o el medio de fermentacion que recibe el cultivo de siembra.
[0040] Siguiendo la convencion de la ley de hace mucho tiempo, los terminos "un" y "una", tal como se utilizan en el presente documento, incluyendo las reivindicaciones, se entiende que significan "uno" o "mas".
Abreviaturas: ORF, marco de lectura abierto; ORF, secuencia de nucleotidos que codifica un ORF; PK, rinon porcino; PCV, CircoVirus Porcino; PK-15, celulas de rinon porcino; FACS, clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes; ELISA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; Mab, anticuerpo monoclonal; FITC, isotiocianato de fluorescefna; IgG, inmunoglobulina G; PBS/BSA, solucion salina tamponada con fosfato/albumina de suero bovino.
[0041] La presente memoria proporciona procedimientos para la determinacion del rendimiento viral de un cultivo de celulas animales huesped infectadas con un circovirus, en particular un circovirus porcino. Los procedimientos de la memoria, sin embargo, son generalmente aplicables a cualquier otra cepa o tipo de circovirus que crezca en un cultivo celular, especialmente en los procedimientos de cultivos discontinuos. Los procedimientos de la invencion son particularmente utiles para el control de la produccion viral de cultivos discontinuos de la cepa de circovirus porcino PCV2.
[0042] Los procedimientos basados en FACS de la invencion comprenden la determinacion de la viabilidad de las celulas huesped en un sobrenadante del medio de cultivo celular y de las celulas que permanecen adheridas a un soporte solido tal como, pero no limitado a, CYTODEX® (Amersham Biosciences, Inc). La carga viral de las celulas huesped cultivadas se mide mediante la determinacion del porcentaje de celulas positivas en ORF1 presentes en las celulas no adherentes y adherentes liberadas, la determinacion del porcentaje de celulas positivas en ORF2 presentes en las celulas no adherentes y celulas adherentes liberadas, en relacion al porcentaje de celula spositivas en ORF1 y ORF2 en la muestra con respecto a la cantidad de circovirus en la muestra. El rendimiento del virus se establece mediante la deteccion y medicion de ambos antfgenos en las celulas del sobrenadante, por ejemplo 5 a 7 dfas desde cuando las celulas huesped se transfieren a un medio libre de suero.
[0043] Una realizacion de la memoria, por lo tanto, es un nuevo ensayo adecuado para la titulacion de PCV2 basado en la inmunodeteccion de celulas huesped PK-15 de protefna viral por citometrfa de flujo usando anticuerpos monoclonales especfficos para cualquiera de ORF1 o oRF2. Ademas, la cinetica del crecimiento de celulas PK-15 tambien se puede controlar mediante citometrfa de flujo. La rapidez de los procedimientos de la invencion permite la determinacion de un punto de recogida optimo para lograr altos rendimientos virales. Se puede seleccionar un punto de recogida que ofrece un rendimiento viral util, por ejemplo, para la produccion de una vacuna, a la vez que s eminimiza el perfodo de incubacion de las celulas con la reduccion de costes concomitantes. Los procedimientos de la invencion producen rapidamente datos cuantitativos. Esto permite el control repetido de la produccion viral a traves del transcurso del periodo de incubacion y la facil seleccion del punto de recogida mas apropiado.
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[0044] Los procedimientos tradicionales de medicion de tftulos virales son mucho mas lentos e implican un cultivo extenso de muestras de ensayo para formar placas contables. Los ensayos en placa convencional de virus que crecen en celulas PK-15 que se basan en la deteccion por inmunofluorescencia usando un ELISA basado en un anticuerpo monoclonal de ORF2 son lentos y con mucho trabajo, requiriendo varios dfas para obtener un resultado util.
[0045] Un aspecto de la memoria es un procedimiento para determinar rapidamente las caracterfsticas de viabilidad de celulas huesped cultivadas durante el transcurso del tiempo de un cultivo discontinuo. Aunque el procedimiento es util y adecuado para el control del cultivo de cualquier celula para la produccion viral, los procedimientos son particularmente utiles para el control durante el proceso de cultivos celulares de celulas PK-15 para la produccion de lotes de circovirus PCV2 para la produccion de vacunas.
[0046] En este aspecto de los procedimientos segun la memoria, y tal como se ilustra en la figura 1, las muestras de cultivos celulares discontinuos se dividen en una poblacion de celulas sobrenadantes (no adherentes) y una poblacion de celulas adherentes a un sustrato solido. Un sustrato para utilizar en un cultivo de celulas huesped PK- 15 es, por ejemplo, esferas CYTODEX® (Amersham Biosciences, Inc), aunque se puede seleccionar cualquier otro material adecuado conocido por los expertos en la tecnica del cultivo de tejidos. Las esferas de sustrato densas se dejan sedimentar por gravedad y se extrae el medio de cultivo sobrenadante con las celulas no adherentes mediante cualquiera de una variedad de procedimientos, tales como aspiracion, decantacion, centrifugacion y similares. Las celulas adherentes al sustrato pueden entonces liberarse del sustrato mediante, por ejemplo, tripsinizacion, controladose el grado de la liberacion de la digestion con un microscopio para establecer el punto de maxima liberacion de las celulas del substrato, con un dano mfnimo a las propias celulas. Las celulas liberadas se recogen para producir la segunda de las dos poblaciones de celulas deseadas.
[0047] En el presente documento se describen procedimientos para la produccion de los anticuerpos capaces de reconocer especfficamente uno o mas epftopos de la protefna ORF1 o ORF2 de un circovirus, tal como, pero no limitado a, PCV2. Dichos anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), anticuerpos quimericos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab, anticuerpos anti-idiotipo (anti-ID) y fragmentos de union a epftopo de cualquiera de los anteriores. Ventajosamente, los anticuerpos para su uso en la presente invencion son anticuerpos monoclonales especfficos para la protefna ORF1 u ORF2 expresada por los genes ORF1 y ORF2 de un circovirus. Lo mas ventajosamente, las protefnas ORF1 u ORF2 se expresan por el circovirus PCV2.
[0048] Para la produccion de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales huesped mediante inyeccion con un polipeptido ORF1 u ORF2 aislado o un peptido inmunogenico de los mismos. Dichos animales huesped pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones y ratas, por nombrar unos pocos. Se pueden utilizar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica, dependiendo de la especie huesped, incluyendo, pero no limitados a, Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidroxido de aluminio, sustancias activas de superficie, tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente utiles, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Despues de la terminacion de las etapas de inmunizacion, se pueden recoger los antisueros reactivos con las protefnas ORF1 u ORF2 y, si se desea, anticuerpos policlonales anti-protefna ORF1 (o anti-protefna ORF2) aislados.
[0049] Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogeneas de moleculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antfgeno, tal como un producto genico diana, o un derivado funcional antigenico del mismo. Para la produccion de anticuerpos policlonales, los animales huesped, tales como los descritos anteriormente, se pueden inmunizar mediante inyeccion con las protefnas ORF1 u ORF2 suplementadas con adyuvantes como tambien se ha descrito anteriormente.
[0050] Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogeneas de anticuerpos para un antfgeno particular, pueden obtenerse mediante cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo mediante lfneas celulares continuas en un cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a, la tecnica del hibridoma de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497; y la patente de los Estados Unidos No. 4.376.110), la tecnica de hibridoma de celulas B humanas (Kosbor et al (1983)), Immunology Today 4: 72; Cole et al (1983) Proc Natl Acad Sci USA. 80: 2026-2030), y la tecnica de hibridoma de EBV (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pag. 77-96). Brevemente, se recogen celulas del bazo de un raton inmunizado y se fusionan con celulas inmortalizadas (es decir, celulas de mieloma) para producir hibridomas productores de anticuerpos. Los hibridomas se pueden cribar inmunoqufmicamente para la produccion de anticuerpos monoclonales especfficamente reactivos con las protefnas ORF1 u ORF2. Las fuentes comerciales para la obtencion de antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales necesarios estan tambien disponibles. Por ejemplo, HTI Bio-Products, Inc. (Ramona, California.) produce a medida anticuerpos, antisueros, lfquido ascftico y lfneas de hibridoma.
[0051] Los protocolos para la produccion, aislamiento y purificacion de anticuerpos convencionales y monoclonales pueden ser analogos a los descritos en Cassone et al. (1988) J. Med. Microbiol. 27: 233-238; Hancock y Evan Production and Characterization of Antibodies against Synthetic Peptides. Pag. 23-33 en Immunochemical Protocols
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ed. MM Manson, (1992) (Humana Press, Totowa, NJ); Goding, JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2a ed, (1986) (Academic Press Ltd., Londres) y Lam & Mutharia, "Antigen-Antibody Reactions," pag. 104-132 en Methods for General and Molecular Bacteriology, ed. P. Gerhardt, (1994) (ASM Press, Washington, DC).
[0052] Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. El hibridoma que produce los MAb de la presente invencion puede cultivarse in vitro o in vivo. La produccion de tftulos elevados de mAb in vivo hace de este el procedimiento de produccion preferido actualmente.
[0053] Alternativamente, las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla, tales como, pero no unciamente, la patente de Estados Unidos No. 4.946.778; Bird (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5.879-5883; y Ward et al. (1989) Nature 334: 544-546, se pueden adaptar para producir los anticuerpos especfficos de las protefnas ORF1 u ORF2. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la region Fv mediante un puente de aminoacidos, dando como resultado un polipeptido de cadena sencilla.
[0054] Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epftopos especfficos pueden generarse mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, pero no se limitan a: fragmentos F(ab')2 que pueden producirse mediante digestion con pepsina de la molecula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse mediante la reduccion de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, se pueden construir bibliotecas de expresion de Fab (Huse et al (1989) Science 246: 1275-1281) para permitir la identificacion rapida y facil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.
[0055] Un anticuerpo fabricado de acuerdo con la presente memoria se puede utilizar para detectar la protefna ORF1 (u ORF2) en o sobre las celulas, extractos celulares, o en otras preparaciones biologicas que pueden contener las protefnas ORF1 u ORF2. Ademas, dicho anticuerpo se puede marcar con una molecula detectora para permitir la deteccion de un complejo antfgeno/anticuerpo. Los marcadores adecuados incluyen diversas enzimas, moleculas fluorescentes, marcadores radiactivos, moleculas quimioluminiscentes y similares. Por ejemplo, las enzimas utiles para marcar anticuerpos incluyen la peroxidasa de rabano picante y la fosfatasa alcalina. Los marcadores fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, fluorescefna, rodamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina.
[0056] La viabilidad de las dos poblaciones de celulas se determina, tal como se describe en el Ejemplo 2 a continuacion, mediante la mezcla de alfcuotas de las poblaciones de celulas aisladas con yoduro de propidio que se capta en los nucleos de las celulas solamente por las celulas no viables. Las celulas tenidas se analizan mediante citometrfa de flujo para obtener el total de celulas, tal como se muestra por ejemplo, en la figura 2, asf como las proporciones de celulas vivas y muertas en la poblacion de las muestras, tal como se muestra en la figura 3.
[0057] Ademas de las mediciones de la viabilidad de las celulas huesped, los procedimientos de la invencion comprenden ademas las etapas de poner en contacto las poblaciones de celulas aisladas con anticuerpos especfficos para los antfgenos virales ORF1 y ORF2, tambien tal como se describe en el Ejemplo 2 a continuacion. Las celulas se lavan posteriormente y se pueden poner en contacto con antisuero anti-IgG marcado con un fluoroforo, tal como, pero no limitado a, FITC antes de medir la fluorescencia unida a celula mediante un citometro de flujo, tambien tal como se describe en el Ejemplo 2.
[0058] Los resultados de viabilidad de ejemplo para el crecimiento del virus PCV2 en celulas PK-15 cultivadas en un cultivo discontinuo de litros con suero de ternera fetal en el medio se muestran en las figuras 2, 3 y 4. Por ejemplo, en un experimento despues de cinco dfas de incubacion, aproximadamente el 50% de la poblacion total de celulas cultivadas se encuentra en el sobrenadante del medio y estaban predominantemente muertas. Esto contrastaba con el 50% restante de las celulas que eran adherentes al sustrato CYTODEX® (Amersham Biosciences, Inc) y que eran viables.
[0059] La medicion de la produccion viral en los cultivos discontinuos que contenfan suero de ternera fetal mostro que ORF1 se expreso transitoriamente durante los dfas 1 y 2, y solo en las celulas adheridas a sustrato. ORF1 se detecto en las celulas del sobrenadante (o no adherentes) solo de los dfas 3 a 5, tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 6. El antfgeno de la capside viral ORF2 era detectable solo en las celulas del sobrenadante, no adherentes, con un aumento continuo durante el perfodo de incubacion despues del primer dfa de incubacion, tal como se muestra en la figura 6.
[0060] El procedimiento de la invencion permite la deteccion y el control de un circovirus y celulas infectadas mediante la deteccion de ORF1 y ORF2 expresadas en celulas del sobrenadante (y por lo tanto predominantemente muertas) hasta el punto de recogida. La rapidez con la que se obtienen estos datos permite el control periodico frecuente del progreso de la infeccion del cultivo celular. El cultivo puede entonces recogerse en un punto que proporciona un alto rendimiento de virus adecuados para la siembra de un gran cultivo discontinuo de celulas huesped para la produccion final de virus de calidad y cantidad suficientes para su uso en, por ejemplo, el desarrollo y produccion de vacunas.
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[0061] Los cultivos de siembra desarrollados como resultado de la utilizacion de los procedimientos de la invencion se pueden usar para sembrar cultivos de celulas de gran volumen, del orden de volumenes de 100-1000 litros. En este procedimiento, el cultivo de siembra recogido en el dfa 5 u otro punto de tiempo, tal como se indica particularmente mediante la expresion de ORF2, tal como se determino anteriormente, se inocula en un cultivo celular a gran escala que comprende medio de cultivo celular que contiene suero de ternera fetal. La viabilidad de las celulas huesped, tales como celulas PK-15, se controla a continuacion de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 a continuacion. Despues de un perfodo de incubacion inicial que puede ser, pero no se limita a, aproximadamente 3 dfas, el medio de cultivo celular se puede intercambiar con medio que no incluye suero de ternera fetal, y se continua la incubacion, de nuevo con un muestreo y determinacion periodicos durante el proceso, tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 7.
[0062] Otro aspecto, por lo tanto, de la memoria es el control durante el proceso de la produccion de circovirus en cultivos de celulas huesped a gran escala mediante el control de la produccion de ORF1 y ORF2 utilizando FACS. Usando los procedimientos de la invencion, tal como se describen en el Ejemplo 2, los cultivos celulares se pueden controlar rapidamente y con mas frecuencia en comparacion con los procedimientos basados en cultivo convencionales, de manera que el cultivo se puede recoger una vez se ha conseguido un rendimiento viral deseado. Los cultivos se pueden controlar por la expresion de los antfgenos virales especfficos de ORF1 y ORF2, tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 7. Habitualmente, la produccion de antfgeno ORF1 y ORF2 total, tal como se muestra en la figura 7, imita el patron de crecimiento de celulas huesped, tal como se ilustra en la figura 7. Por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 5 a continuacion, los marcadores de ORF1 y ORF2 de PCV2 cultivado en celulas PK-15 aumentan linealmente desde el dfa 4 al dfa 7 y muestran patrones similares de aumento para las celulas adherentes unidas a un sustrato y para las celulas no adherentes en el sobrenadante del medio.
[0063] La extraccion del suero del medio de cultivo reduce y retrasa el inicio de la expresion de antfgeno viral, particularmente destacable si el cultivo se recoge en el dfa 5. La continuacion del cultivo mas alla del dfa 5 (tal como se determina desde el punto de la siembra del cultivo) puede, sin embargo, aumentar significativamente el rendimiento del antfgeno ORF2, es decir, de las partfculas virales maduras (vease la figura 7).
[0064] Esta memoria, por lo tanto, proporciona un procedimiento de FACS para el control durante el proceso y la determinacion rapida del punto de recogida util de un cultivo celular infectado con un circovirus, de manera que se puede obtener un rendimiento optimo del virus. Los procedimientos comprenden proporcionar un cultivo de siembra de celulas huesped infectadas con circovirus e inocular un cultivo discontinuo con las mismas, incubar el cultivo de siembra, extraer partes alfcuotas de las celulas cultivadas, separar las celulas del sobrenadante y las celulas adherentes, liberar las celulas adherentes de su sustrato, determinar la viabilidad de las celulas huesped, determinar el porcentaje de ORF1 y ORF2 en la muestra de celulas mediante FACS y determinar el punto de recogida del cultivo.
[0065] Un aspecto de la memoria proporciona un procedimiento basado en la clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes (FACS) para la deteccion de la produccion de antfgeno de circovirus mediante un cultivo de celulas huesped infectadas por virus, en el que la produccion de antfgeno de circovirus esta relacionada con el porcentaje de celulas positivas en el marco de lectura abierto 1 (ORF1) y el marco de lectura abierto 2 (ORF2), que comprende aislar (i) celulas huesped no adherentes y (ii) celulas huesped adherentes liberadas del sustrato de una muestra que comprende una poblacion de celulas huesped no adherentes y una poblacion de celulas huesped que se adhieren a un sustrato de un cultivo de celulas huesped infectadas con un circovirus, y determinar (i) el porcentaje de celulas positivas en el marco de lectura abierto 1 (ORF1) y (ii) el porcentaje de celulas positivas en el marco de lectura abierto 2 (ORF2) presentes en las celulas huesped no adherentes aisladas y las celulas huesped adherentes liberadas del sustrato.
[0066] En diversas realizaciones de este aspecto del procedimiento, el circovirus puede ser PCV2. En diversas realizaciones, la cepa de celulas huesped puede ser PK-15. Se contempla, sin embargo, que los procedimientos de la memoria se pueden aplicar de manera util para la deteccion y el control durante el proceso de la produccion de cualquier circovirus cultivado en celulas huesped de mamffero aisladas y para los que hay disponibles anticuerpos especfficos de antfgeno viral.
[0067] Otro aspecto de la memoria proporciona proporciona un procedimiento basado en la clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes (FACS) para el control durante el proceso de la produccion de un circovirus a partir de celulas huesped infectadas cultivadas, en el que los cambios en la representacion en los niveles de viabilidad, ORF1 y ORF2, determina la evolucion con el tiempo de la produccion de circovirus en un cultivo de celulas huesped que comprende aislar (i) celulas huesped no adherentes y (ii) celulas huesped adherentes liberadas del sustrato de una muestra que comprende una poblacion de celulas huesped no adherentes y una poblacion de celulas huesped que se adhieren a un sustrato de un cultivo de celulas huesped infectadas con un circovirus, determinar la viabilidad de las celulas huesped no adherentes y de las celulas huesped adherentes, y determinar (i) el porcentaje de celulas positivas en el marco de lectura abierto 1 (ORF1) y (ii) el porcentaje de celulas positivas en el marco de lectura abierto 2 (ORF2) presentes en las celulas huesped no adherentes aisladas y las celulas huesped adherentes liberadas del sustrato.
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[0068] En una realizacion de este procedimiento de la memoria, la viabilidad de las celulas se determina mediante la medicion de la captacion de yoduro de propidio usando citometna de flujo.
[0069] En las diversas realizaciones de este procedimiento de la memoria, el circovirus puede ser PCV2 y la cepa de celulas huesped puede ser PK-15, aunque los procedimientos no se deben interpretar como aplicables unicamente a esta combinacion de cepa de circovirus/celulas huesped. Por ejemplo, los procedimientos de la memoria pueden ser aplicables, en general, al virus de la anemia del pollo o virus de la enfermedad del pico y las plumas y celulas huesped, tales como una celula huesped aviar adecuada y similares.
[0070] Aun otro aspecto de la memoria es un procedimiento de produccion de circovirus en condiciones libres de suero y, por lo tanto, utiles para la preparacion de una vacuna, que comprende las etapas de preparar un cultivo de siembra de un circovirus mediante el control durante el proceso de la expresion de ORF1 y la siembra de un cultivo de celulas huesped con un cultivo de siembra de un circovirus, incubar el cultivo de celulas huesped en ausencia de suero de ternera fetal, controlar (i) la viabilidad de las celulas huesped, y (ii) la expresion de oRF1 y ORF2 por las celulas huesped, y recoger el circovirus del cultivo de celulas huesped cuando la expresion de ORF2 es aproximadamente la misma en las celulas no adherentes y las celulas adherentes del cultivo de celulas huesped.
[0071] En diversas realizaciones de este aspecto de la memoria, el rendimiento de circovirus en el cultivo de siembra se puede determinar mediante el control de la expresion de los antfgenos ORF1 y ORF2 de circovirus en celulas huesped del sobrenadante utilizando un procedimiento basado en la clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes (FACS), y en el que el cultivo de siembra se recoge cuando ORF2 se expresa por las celulas no adherentes.
[0072] En las diversas realizaciones de este aspecto de la memoria, la viabilidad de las celulas se puede determinar mediante la medicion de la captacion de yoduro de propidio usando citometna de flujo.
[0073] En las diversas realizaciones de este procedimiento de la memoria, la expresion de los antfgenos ORF1 y ORF2 en un cultivo de celulas huesped infectadas con un virus puede controlarse usando un procedimiento basado en la clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes (FACS), en el que la produccion de antfgeno de circovirus esta relacionada con el porcentaje de celulas positivas en el marco de lectura abierto 1 (ORF1) y el marco de lectura abierto 2 (ORF2).
[0074] En las diversas realizaciones de este procedimiento de la memoria, el circovirus puede ser PCV2 y la cepa de celulas huesped puede ser PK-15, aunque los procedimientos no se deben interpretar como aplicables unicamente a esta combinacion de cepa de circovirus/celulas huesped. Se contempla, sin embargo, que los procedimientos de la memoria pueden ser aplicables de manera util para la deteccion y el control durante el proceso de cualquier circovirus cultivado en celulas huesped de mairnfero aisladas y para los que hay disponibles anticuerpos espedficos de antfgeno viral.
[0075] Debe entenderse que la presente invencion no se limita a las composiciones, equipos o procedimientos espedficos descritos en el presente documento y que cualquier composicion que tiene una formula o etapas de procedimiento equivalentes a las descritas se encuentran dentro del alcance de la presente invencion. Las etapas del procedimiento para determinar el porcentaje de celulas infectadas en un cultivo celular son meramente de ejemplo para permitir que un experto ordinario en la tecnica fabrique la composicion y la utilice de acuerdo con el proceso descrito y sus equivalentes. Tambien se entendera que aunque la forma de la invencion mostrada y descrita en el presente documento constituye las realizaciones preferidas de la invencion, no se pretenden ilustrar todas las formas posibles de la invencion. Las palabras usadas son palabras de descripcion mas que de limitacion.
[0076] La invencion se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos:
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Correspondencia entre las designaciones de ORF de circovirus PCV2
[0077] Los ORF de circovirus PCV2, sus designadores equivalentes, y las respectivas fuentes de los mismos, se muestran en la Tabla 1 a continuacion. ORF1 y ORF2, tal como se describen por Meehan et al. (1997; 1998) han sido designados alternativamente como ORF 4 y 13, respectivamente.
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Tabla 1: Numeration y equivalentes de ORF de PCV2
- Numeracion de ORF Designaciones alternativas
- Fuente
- Meehan et al. J. Gen. Virol. 78: 221-227 (1997) Solicitud de patente de Estados Unidos n° de serie 20020106639 de Wang et al al. Patentes de Estados Unidos n° de serie 6.368.601,6.391.314, 6.660.272, 6.217.883, 6.517.843, 6.497.883.
- 1 1 4
- 2 6 13
- 3 2 7
- 4 3 10
- 5 4 5
- 6 5 3
- 7 1
- 8 2
- 9 6
- 10 8
- 11 9
- 12 11
- 13 12
Ejemplo 2: Ensayo de viabilidad, deteccion de ORF1 y ORF2 en celulas PK-15 infectadas con PCV2
(A) Determination de los recuentos de celulas y la viabilidad celular
[0078] Se utilizo yoduro de propidio para evaluar la integridad de la membrana plasmatica. El yoduro de propidio es un colorante vital fluorescente que tine el acido nucleico. Las celulas muertas incorporan yoduro de propidio que se detecto como una mancha roja mediante citometrfa de flujo utilizando un citometro Galaxy (se pueden utilizar otros modelos de citometro de flujo que funcionan de manera similar). Este citometro tiene la capacidad de diferenciar, detectar y contar las celulas que estan sin tenir (viable) o estan tenidas de yoduro de propidio (muertas). El numero de celulas en un volumen de 200 pl se determina de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el modelo particular de citometro utilizado.
[0079] Se preparo 1 ml de suspension celular en PBS en un tubo especffico para el citometro Galaxy. La dilucion de la suspension celular se ajusto para tener entre aproximadamente 2 x 104 a aproximadamente 1 x l06 celulas por ml (correspondiente al valor de la linealidad del recuento del citometro). A la suspension celular se anadieron 5 pl de yoduro de propidio (50 pg/ml). La suspension se mezclo a continuacion en vortex durante varios segundos y se analizo inmediatamente en el citometro. La configuracion tfpica para el citometro fueron: Umbral en la escala de linaje de FSC; fluorescencia de las celulas detectada en escala logarftmica FL3 (correspondiente al canal de yoduro de propidio). El software del citometro produjo los resultados de los recuentos automaticamente como graficos de puntos, tales como los que se muestran en las figuras 2 y 3.
(B) Determination del porcentaje de celulas infectadas mediante la medicion de ORF1 y/o ORF2
[0080] Se requirieron aproximadamente 3 x 106 celulas para un unico ensayo, se dividio en alfcuotas de 1 x 106 para un control negativo, 1 x 106 para la deteccion de ORF1 y 1 x 106 para la deteccion de ORF2. Para una cantidad diferente de celulas, los volumenes de los reactivos se adaptaron en consecuencia.
(i) Fijacion: Se utilizo BD CytofixCytoperm (BD Biosciences, ref. 554714). La fijacion se realizo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del fijador. Brevemente, se centrifugaron 3 x 106 celulas durante 6 minutos a 400 g en un tubo conico de 15 ml o 50 ml. Se desecho el sobrenadante, las celulas se resuspendieron con 750 pl de Cytofix y se incubaron durante 20 minutos sobre hielo. Las celulas se lavaron dos veces con 1 ml de PBS que contenfa BSA al 1% y se resuspendieron en 1 ml de PBS/BSA al 1%. Las muestras se almacenaron a 5°C durante hasta 15 dfas antes de la tincion.
(ii) Tincion de ORF1 y ORF2: Se centrifugaron las celulas fijadas durante 6 minutos a 400 g, se desecho el sobrenadante y se anadieron 300 pl de solucion 1 X BD Perm/Wash. Se dispensaron 100 pl de celulas fijadas en 3 pocillos de placas de 96 micropocillos y se centrifugaron durante 6 minutos a 400 g. Se desecho el sobrenadante y se anadieron 100 pl de solucion 1 X BD Perm/Wash. Se anadieron 5 pl de un anticuerpo (1 mg/ml) a cada pocillo. Habitualmente, 5 pg de anticuerpo monoclonal purificado Mab anti-PCV2 (ORF1) No 1991D3GA, Concentracion inicial = 1 mg/ml o Mab purificado anti-PCV2 (ORF2) No 1903A8BC, Concentracion inicial = 1 mg/ml fue suficiente para cada tincion. Mab purificado anti-clostridium No 101B9B o equivalente, concentracion inicial = 1 mg/ml, se uso como control negativo.
[0081] Los pocillos se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Las celulas se lavaron dos veces con solucion 1X
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
BD Perm Wash (200 pl/lavado/pocillo). A continuacion, se anadieron 100 pi de solucion 1X BD Perm Wash que contenfan 1 pl de FITC anti-raton (IgG anti-raton conjugada con FITC (por ejemplo, Beckman, ref no. 115-095-146) o el equivalente de la misma) por pocillo y los pocillos se incubaron de nuevo durante 30 minutos sobre hielo. Las celulas se lavaron dos veces con solucion 1X BD Perm Wash (200 pl/lavado/pocillo) y se resuspendieron en 200 pl de PBS/BSA al 1% por pocillo. (iii) Deteccidn mediante FCM: los parametros de configuracion para el citometro, tal como un citometro Galaxy (Partec), fueron habitualmente: Umbral en la escala de linaje FSC; fluorescencia de las celulas detectada en escala logarftmica FL1 (correspondiente al canal de FITC).
[0082] Los histogramas representativos que muestran la actividad de fluorescencia debido a la deteccion de ORF1 en una poblacion de celulas huesped PK-15 infectadas, en comparacion con una poblacion de celulas de control negativo, se muestran en la figura 3. Para calcular el porcentaje de celulas infectadas, se resto el porcentaje de celulas negativas del porcentaje de celulas ORF. En el histograma de la izquierda, habfa un 0% de celulas infectadas, mientras que en el ejemplo de la derecha de la figura 3, 88% de las celulas estaban infectadas.
[0083] Una distribucion tfpica de celulas vivas y muertas, tal como se determina por granulometrfa se muestra en la figura 2 y un desplazamiento en la senal de fluorescencia del yoduro de propidio debido a la muerte de una poblacion de celulas huesped infectadas se muestra en la figura 4. En este caso, el 80% de las celulas huesped estaban muertas.
Ejemplo 3: Recuento y viabilidad de PK-15 despues de la inoculacion de PCV2 en cultivos de siembra discontinuos
[0084] Tal como se muestra en la figura 3, en el dfa 5 del perfodo de incubacion de un cultivo de siembra discontinuo de virus PCV2 que crece en celulas PK-15, el 50% de las celulas huesped se encontraban en el sobrenadante y en su mayorfa estaban muertas (73%). En cambio, el 50% de las celulas huesped se encontraban en el soporte del sustrato CYTODEX® (Amersham Biosciences, Inc) y casi en su totalidad eran una poblacion viable (96%).
[0085] Se detectaron celulas PK-15 infectadas con PCV2 al final del cultivo en el dfa 5, pero solo en las celulas del sobrenadante usando citometrfa de flujo para detectar ORF1 y ORF2. Tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 6, la cinetica de la formacion de antfgeno especffico del virus era dependiente del ORF: ORF1 se produjo temprano y a niveles bajos, mientras que ORF se produjo mas tarde en el ciclo de incubacion y a niveles cada vez mayores.
Ejemplo 4: Tincion total de ORF1 y ORF2
[0086] Tal como se muestra en la figura 6, para ORF1 no habfa senal en la membrana celular detectada durante la fase posterior del perfodo de incubacion del cultivo. La Tabla 2, a continuacion, muestra que no se detectaron senales de membrana en las celulas adherentes a CYTODEX® (Amersham Biosciences, Inc). Las principales senales especfficas de ORF fueron sobre celulas del sobrenadante de cultivo y fueron aumentando desde el dfa 2 al dfa 5. Los resultados fueron similares para las celulas vivas o muertas, con un maximo de 60% en el dfa 4.
Tabla 2
- Celulas del sobrenadante Celulas adherentes
- % recuento (total/ml) de celulas totales
- 3,6 x 105 43% 4,7 x 105 57%
- Tincion
- Membrana Membrana + compartimentos intracelulares Membrana Membrana + compartimentos intracelulares
- ORF1
- < 3% 35% < 3% < 3%
- ORF2
- 37% 60% < LOQ < LOQ
Ejemplo 5: Cultivo de circovirus PCV2 en celulas PK-15 en cultivo discontinuo a gran escala con la extraccion de suero despues de 3 dfas
[0087] Se sembro un fermentador de 300 litros con un cultivo de celulas PK-15 incubadas previamente durante 5 dfas con virus PCV2, de acuerdo con los documentos citados en el presente documento. Despues de 3 dfas de cultivo, el medio se cambio por un medio de crecimiento que carecfa de suero de ternera fetal. Las muestras tomadas cada dfa se analizaron para la viabilidad de PK-15 y la expresion de ORF1 y ORF2, tal como se describe en los ejemplos anteriores.
[0088] La evolucion con el tiempo de la expresion de los antfgenos virales ORF1 y ORF2 se ilustra en la figura 7.
Claims (5)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la produccion de circovirus, que comprende:sembrar un cultivo de celulas huesped con un cultivo de siembra de un circovirus; incubar el cultivo de celulas huesped en ausencia de suero de ternera fetal;controlar (i) la viabilidad de las celulas huesped, y (ii) la expresion de ORF1 y ORF2 por las celulas huesped; y recoger el circovirus del cultivo de celulas huesped cuando la expresion de ORF2 es aproximadamente la misma en las celulas no adherentes y las celulas adherentes del cultivo de celulas huesped; y en el que el circovirus es PCV2.
- 2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el rendimiento del circovirus en el cultivo de siembra se determina mediante el control de la expresion de los antfgenos ORF1 y ORF2 del circovirus en celulas huesped del sobrenadante utilizando un procedimiento basado en la clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes (FACS).
- 3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la expresion de los antfgenos ORF1 y ORF2 en un cultivo de celulas huesped infectadas por virus se controla utilizando un procedimiento basado en la clasificacion de celulas con anticuerpos fluorescentes (FACS), y en el que la produccion de antfgeno de circovirus esta relacionada con el pocentaje de celulas positivas en el marco de lectura abierto 1 (ORF1) y en el marco de lectura abierto 2 (ORF2).
- 4. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la viabilidad de las celulas se determina mediante la medicion de la captacion de yoduro de propidio utilizando citometrfa de flujo.
- 5. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la celula huesped es PK-15.
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