ES2599953T3 - Tratamiento de infecciones microbianas - Google Patents

Abstract

Un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o una secuencia con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO. 1 o un fragmento de la misma que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión a fibrinógeno (Región A), caracterizado por al menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 para producir una proteína de unión a fibrinógeno recombinante con capacidad reducida o que carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno que estimula una mayor respuesta inmunitaria que la proteína ClfA natural, para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas.

Description

Tratamiento de infecciones microbianas

5 INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere a vacunas de antígenos microbianos mejoradas, composiciones farmacéuticas, composiciones inmunógenas y anticuerpos y a su uso en el tratamiento de infecciones microbianas, especialmente las de origen bacteriano, incluido el origen estafilocócico.

10 La resistencia a múltiples fármacos (RMF) es un problema creciente entre bacterias grampositivas, especialmente en hospitales. El uso extendido de antibióticos y otros agentes para tratar infecciones bacterianas ha conducido al rápido desarrollo de bacterias resistentes a los agentes que tienen resistencia a múltiples fármacos. Así, existe actualmente la necesidad de proporcionar terapias mejoradas para tratar con dichas infecciones resistentes a los

15 fármacos.

Los estafilococos son bacterias grampositivas de forma esférica, normalmente dispuestas como grupos irregulares a modo de racimos. Algunos son miembros de la flora normal de la piel y las membranas mucosas de los seres humanos, otros provocan supuración, formación de abscesos, diversas infecciones piógenas e incluso septicemia

20 letal. Los estafilococos patógenos a menudo hemolizan la sangre, coagulan el plasma y producen diversas enzimas y toxinas extracelulares.

El género Staphylococcus tiene al menos 30 especies. Las tres especies principales de importancia clínica son Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus es 25 positivo a la coagulasa, lo que le diferencia de las otras especies. S. aureus es un patógeno importante en seres humanos. Casi todas las personas tienen algún tipo de infección por S. aureus durante su vida, con gravedad variable desde la intoxicación alimentaria o infecciones cutáneas menores a infecciones graves que amenazan la vida. Los estafilococos negativos a la coagulasa forman parte de la flora humana normal y a veces provocan infección, asociada a menudo con dispositivos implantados, especialmente en pacientes muy jóvenes, ancianos e 30 inmunodeprimidos. Aproximadamente el 75% de las infecciones causadas por estafilococos negativos a la coagulasa se deben a S. epidermidis. Las infecciones debidas a Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis y otras especies son menos comunes. S. saprophyticus es una causa relativamente común de infecciones de las vías urinarias en mujeres jóvenes. Los estafilococos producen catalasa, que los diferencia de los estreptococos. S. lugdunensis también es relevante en la clínica y está presente en aproximadamente el 5 al 10% de los casos de

35 endocarditis infecciosa.

La colonización por S. aureus del cartílago articular, del cual el colágeno es un componente principal, dentro del espacio articular parece ser un factor importante que contribuye al desarrollo de artritis séptica. La artritis bacteriana adquirida por vía hematógena se mantiene como un problema médico grave. Esta enfermedad de las articulaciones

40 rápidamente progresiva y altamente destructiva es difícil de erradicar. Normalmente, menos del 50% de los pacientes infectados no consiguen recuperarse sin una lesión articular grave. S. aureus es el patógeno predominante aislado de pacientes adultos con osteomielitis hematógena y secundaria.

En pacientes hospitalizados, las bacterias de Staphylococcus tales como S. aureus son una causa principal de

45 infección. Las infecciones localizadas iniciales de heridas o dispositivos médicos integrados pueden conducir a infecciones invasivas más grandes como septicemia, osteomielitis, mastitis y endocarditis. En infecciones asociadas con dispositivos médicos, las superficies de plástico y metal se recubren de plasma y proteínas de matriz del hospedador tales como fibrinógeno y fibronectina poco después de la implantación. Esta capacidad de S. aureus y otras bacterias estafilocócicas de adherirse a estas proteínas es esencial para el inicio de la infección. Los injertos

50 vasculares, los catéteres intravenosos, las válvulas cardiacas artificiales y los dispositivos de asistencia cardiaca son trombógenos y proclives a la colonización bacteriana. De las bacterias estafilocócicas, S. aureus es generalmente el patógeno más perjudicial para dichas infecciones.

En hospitales de todo el mundo se ha observado un aumento importante en aislados de S. aureus que muestran

55 resistencia a la mayor parte de los antibióticos disponibles en la actualidad para tratar infecciones. El desarrollo de la penicilina para combatir a S. aureus fue un avance trascendental en el control y el tratamiento de infecciones. Por desgracia, rápidamente aparecieron organismos resistentes a la penicilina y se hizo fundamental desarrollar nuevos antibióticos. Con la introducción de cada nuevo antibiótico, S. aureus ha podido ser contrarrestado con βlactamasas, proteínas de unión a la penicilina alteradas y proteínas de membrana de células mutadas que permiten

la persistencia de la bacteria. En consecuencia, han aparecido S. aureus resistente a la meticilina (SARM) y organismos resistentes a múltiples fármacos y se han establecido con fuerza en hospitales y residencias de la tercera edad de todo el mundo (Chambers, H.F., Clin Microbiol Rev, 1:173, 1988; y Mulligan, M.E., y col., Am J Med, 94:313, 1993). Hoy en día, casi la mitad de las cepas estafilocócicas que provocan infecciones nosocomiales son

5 resistentes a todos los antibióticos excepto la vancomicina, y al parecer es sólo cuestión de tiempo antes de que también la vancomicina pase a ser ineficaz.

Así, sigue existiendo una necesidad muy acusada y en rápido crecimiento de terapias para tratar infecciones por estafilococos tales como S. aureus que sean efectivas contra cepas resistentes a antibióticos de las bacterias.

10 En patógenos grampositivos, como estafilococos, estreptococos y enterococos, unas proteínas, llamadas adhesinas, median en dichas infecciones, por ejemplo promoviendo la colonización, la fijación a coágulos sanguíneos y tejido traumatizado. Estas adhesinas de superficie microbianas específicas reciben el nombre de MSCRAMM (moléculas de matriz adhesivas que reconocen componentes de superficies microbianas) (Patti, J., y col., Ann Rev Microbiol,

15 48:585-617, 1994; Patti, J. y Hook, M., Cur Opin Cell Biol., 6:752-758, 1994). Las MSCRAMM reconocen y se unen específicamente a componentes de la matriz extracelular (MEC), como fibronectina, fibrinógeno, colágeno y elastina. Estas MSCRAMM están presentes en muchos patógenos grampositivos y sus secuencias de aminoácidos están relacionadas, tienen un diseño modular similar y una organización común de dominios de unión.

20 Las MSCRAMM en la superficie de las células bacterianas y los ligandos en el tejido del hospedador interaccionan en una forma de llave y cerradura en la adherencia de bacterias en el hospedador. A menudo se necesita la adhesión para la supervivencia bacteriana y ayuda a las bacterias para eludir los mecanismos de defensa del hospedador y las pruebas de provocación de antibióticos. Una vez que las bacterias se han adherido con éxito y han colonizado los tejidos del hospedador, su fisiología se modifica drásticamente y se secretan componentes

25 perjudiciales como toxinas y enzimas. Por otra parte, las bacterias adherentes producen a menudo una biopelícula y se hacen resistentes rápidamente al efecto destructivo de la mayor parte de los antibióticos.

Una bacteria puede expresar MSCRAMM que reconocen diversas proteínas de matriz. Los sitios de unión a ligandos en las MSCRAMM parecen estar definidos por tramos contiguos relativamente cortos de secuencias de aminoácidos

30 (motivos). Dado que puede encontrarse un motivo similar en varias especies diferentes de bacterias, al parecer estos motivos funcionales están sujetos a la transferencia entre especies (Patti y Hook, Cur Opin Cell Biol, 6:752758, 1994). Además, en ocasiones una única MSCRAMM puede unirse a varios ligandos MEC.

Las MSCRAMM pueden mediar en la infección al unirse a proteínas que incluyen fibrinógeno (Fg) y/o fibronectina

35 (Fn), etc. El fibrinógeno y la fibronectina son proteínas presentes en el plasma sanguíneo que tienen un papel clave en la hemostasia y la coagulación.

El fibrinógeno está compuesto por seis cadenas de polipéptidos, dos cadenas Aa, dos Bβ y dos cadenas γ. La parte C-terminal de la cadena γ es importante en términos biológicos e interacciona con la integrina de plaquetas durante 40 la adherencia y agregación de plaquetas. A estas región se dirige también Staphylococcus aureus con el resultado de una aglutinación de células y una adherencia de tejidos dependiente de fibrinógeno.

Staphylococcus aureus tiene varias proteínas expresadas en superficie que estimulan la activación y agregación de plaquetas. Las proteínas MSCRAMM de Staphylococcus aureus incluyen pero no se limitan a las siguientes:

45 -Factor de aglutinación A (ClfA) de proteína de unión a fibrinógeno; -Factor de aglutinación B (ClfB) de proteína de unión a fibrinógeno; -Proteína de unión a fibrinógeno-fibronectina A (FnBPA); -Proteína de unión a fibrinógeno-fibronectina B (FnBPB); y

50 -Proteínas de superficie de S. aureus SasA, SasG, SasK, etc.

La Tabla 1 mostrada a continuación recoge una selección de varias proteínas de superficie ancladas a la pared celular de Staphylococcus aureus.

TABLA 1

Proteína de superficie

aaa Ligando(s)b Motivoc Sortasad

Proteína A (Spa)

508 Inmunoglobulina, factor de von Willebrand, TNFRe LPETG A

Proteína de unión a fibronectina A (FnbpA)

1.018 Fibronectina, fibrinógeno, elastina LPETG A

Proteína de unión a fibronectina B (FnbpB)

914 Fibronectina, fibrinógeno, elastina LPETG A

Factor de aglutinación A (ClfA)

933 Fibrinógeno, factor de complemento I LPDTG A

Factor de aglutinación B (ClfB)

913 Fibrinógeno, citoqueratina 10 LPETG A

Adhesión a colágeno (Cna)

1.183 Colágeno LPKTG A

SdrC

947 Desconocido LPETG A

SdrD

1.315 Desconocido LPETG A

SdrE

1.166 Desconocido LPETG A

Pls

1.637 Desconocido LPDTG A

SasA

2.261 Desconocido LPDTG A

SasB

937 Desconocido LPDTG A

SasC

2.186 Desconocido LPNTG A

SasD

241 Desconocido LPAAG A

SasE/IsdA

354 Hemof LPKTG A

SasF

637 Desconocido LPKAG A

SasG/Aap

1.117 Desconocidog LPKTG A

SasH

308 Desconocido LPKTG A

Sasl/HarA/IsdH

895 Haptoglobina LPKTG A

SasJ/IsdB

645 Hemoglobina, hemo LPQTG A

SasK

211 Desconocido LPKTG A

IsdC

227 Hemo NPQTN B

a aa, longitud de proteínas en aminoácidos. b Componente(s) molecular(es) reconocido(s) y unido(s) por proteína. c Motivo de consenso reconocido por sortasa y presente en señal de clasificación de pared celular C-terminal. d Sortasa para la cual la proteína de superficie de pared celular es sustrato. e TNFR, receptor de factor de necrosis tumoral f se une también a proteínas en célula epitelial desescamada. Promueve la resistencia a lípidos bactericidas y lactoferrina g se une también a células epiteliales nasales desescamadas. Interviene en la formación de biopelícula.

Otras bacterias estafilocócicas expresan proteínas expresadas en superficie (MSCRAMM) que son similares a los factores de aglutinación o proteínas de unión enumerados anteriormente. Estos incluyen pero no se limitan a:

5 -SdrF, SdrG y SdrH de S. epidermidis donde se ha demostrado que SdrG/F se une a fibrinógeno y colágeno. -Fbl de Staphylococcus lugdunensis es una proteína de unión a fibrinógeno. Fbl es un miembro de la familia Sdr, un grupo de proteínas de superficie celular estafilocócicas que contienen una región de repetición de serina-aspartato característica. El dominio de unión a fibrinógeno de Fbl ha sido cartografiado en 313 aminoácidos, y muestra el 62%

10 de identidad a la región correspondiente en el factor de aglutinación A (ClfA) de Staphylococcus aureus.

Otras proteínas/adhesinas de unión a ligando incluyen proteínas Isd (determinantes de superficie regulados por hierro), que aunque no todos son MSCRAMM en sí (por ejemplo, IsdB y IsdH) promueven la adhesión de bacterias a componentes de la matriz extracelular y en la presente memoria descriptiva se refieren como "proteínas de tipo

15 MSCRAMM". Se sabe que IsdA promueve la adhesión a células escamosas, y tiene una baja afinidad por fibrinógeno y fibronectina, con lo que técnicamente puede definirse como MSCRAMM.

El factor de aglutinación A (ClfA) fue la primera adhesina de S. aureus de unión a cadena γ de fibrinógeno identificada. La proteína de unión a fibronectina-fibrinógeno A (FnBPA) y la proteína de unión a fibrinógeno

20 fibronectina B (FnBPB) se reconocieron posteriormente como proteínas bifuncionales para las que se encontró que se unían al mismo segmento peptídico C-terminal en la cadena γ de Fg. ClfA y FnBP tienen características estructurales que son comunes a todas las proteínas ancladas a la pared celular expresadas en bacterias grampositivas, incluyendo ClfB.

El factor de aglutinación A (ClfA), por ejemplo, es una proteína situada en superficie de Staphylococcus aureus. ClfA es un factor de virulencia importante de S. aureus. Contribuye a la patogenia de artritis séptica y endocarditis. ClfA es el arquetipo de una familia de proteínas asociadas a superficie con similar organización estructural/modular, lo que incluye pero no se limita a ClfB, SdrD, SdrE, etc.

5 El ClfA contiene un dominio A N-terminal de 520 aminoácidos (la región de unión a fibrinógeno), que comprende tres subdominios N1, N2 y N3 plegados por separado. El dominio A se sigue por una región de repetición dipeptídica de serina-aspartato y una región que cubre la membrana y la pared celular, que contiene el motivo LPDTG para anclaje promovido por la sortasa en la pared celular. El ClfA está presente prácticamente en todas las cepas de S. aureus

10 (Peacock SJ, Moore CE, Justice A, Kantzanou M, Story L, Mackie K, O’Neill G, Day NPJ (2002) Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus. Infect Immun 70:49874996). Se une al extremo C de la cadena γ de fibrinógeno, y por tanto es capaz de inducir la aglutinación de bacterias en solución de fibrinógeno (McDevitt D, Nanavaty T, House-Pompeo K, Bell E, Turner N, McEntire L, Foster T, Höök M (1997) Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus factor of clumping

15 (ClfA) and fibrinogen. Eur J Biochem 247:416-424 y McDevitt D, Francois P, Vaudaux P, Foster TJ (1994) Molecular characterization of the factor of clumping (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 11:237-248).

El análisis estructural en 3D de ClfA y las proteínas de unión a fibrinógeno relacionadas SdrG y ClfB ha revelado que el dominio A de unión a ligando en todas estas proteínas relacionadas está compuesto por tres subdominios N1, N2 20 y N3, siendo los residuos 221-559 que corresponden a las Regiones N2-N3 los mínimos truncamientos que conservan la capacidad de unirse a fibrinógeno. Se ha encontrado que los residuos de aminoácidos 532 a 538 corresponden a la región peptídica de cerradura de ClfA. Cada subdominio comprende nueve cadenas β que forman un nuevo plegamiento de tipo IgG. El sitio de unión peptídica a cadena γ de fibrinógeno en estas proteínas está situado en un surco hidrófobo en la unión entre N2 y N3. Se ha encontrado que existe una importante semejanza

25 estructural entre la estructura 3d de estas proteínas, que se debe a una o más de secuencias de aminoácidos relacionadas, un diseño modular similar y una organización común de los dominios de unión.

SdrC, SdrD, SdrE, FnBPA-A (las siete isoformas) y FnBPB-B (las siete isoformas) tienen una organización modular similar, con lo que usando modelización molecular PHYRE se esperaría que estas proteínas tuvieran la misma

30 estructura 3D.

IsdA e IsdB no tienen el mismo tipo de estructura que las proteínas Clf o Sdr. Tienen un nuevo motivo denominado NEAT que interviene en la unión a ligando. Sin embargo, el motivo NEAT es similar a la estructura 3D de Clf o Sdr, ya que está compuesto por la intercalación de cadenas beta (plegamiento de intercalación beta que consiste en dos 35 láminas beta antiparalelas de cinco cadenas) y es un miembro de la superfamilia Ig (Pilpa y col. "Solution Structure of the NEAT (NEAr Transported) Domain from IsdH/HarA: the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus"

J. Mol. Biol. (2006) 360:435-447). La estructura 3D del motivo NEAT de IsdH ha sido resuelta y se han predicho los residuos en bucle 1 b-2.

40 La expresión de ClfA en S. aureus obstaculiza la fagocitosis por macrófagos y neutrófilos (Palmqvist N, Patti JM, Tarkowski A, Josefsson E (2004) Expression of staphylococcal clumping factor A impedes macrophage phagocitosis. Microb Infect 6:188-195 y Higgins J, Loughman A, van Kessel KPM, van Strijp JAG, Foster TJ (2006) Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocitosis by human polymorphonuclear leukocytes. FEMS Microbiol Lett 258:290-296). En neutrófilos se debe a un mecanismo dependiente del fibrinógeno y a un mecanismo independiente

45 del fibrinógeno. En cambio, las plaquetas son activadas por bacterias que expresan ClfA a través de su interacción con GPIIb/IIIa que conduce a agregación. Esto se lleva a cabo con la máxima eficiencia cuando está presente el fibrinógeno, pero existe también una vía independiente del fibrinógeno para la activación de plaquetas (Loughman A, Fitzgerald JR, Brennan MP, Higgins J, Downer R, Cox D, Foster TJ (2005). Roles of fibrinogen, immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A. Mol Microbiol 57:804-818 y

50 O’Brien L, Kerrigan SW, Kaw G., Hogan M., Penadés J., Litt D., Fitzgerald D.J., Foster T.J. & Cox D. (2002) Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation by Staphylococcus aureus: roles for the clumping factors ClfA and ClfB, the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A. Mol Microbiol 44, 1033-1044).

ClfA es un factor de virulencia para la inducción de artritis séptica en ratones (Josefsson E., Hartford O., O’Brien L,

55 Patti JM, Foster T (2001) Protection contra experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J Infect Dis 184:1572-1580). Además, la eliminación de ClfA junto con otra proteína de unión a fibrinógeno ClfB protegía frente a inflamación sistémica en fases tempranas de la infección (Palmqvist N, Foster T, Fitzgerald R, Josefsson E, Tarkowski A (2005) Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation. J Inf Dis

191:791-798).

La proteína de unión a fibrinógeno ClfA de Staphylococcus aureus ha sido aislada y caracterizada y es objeto, por ejemplo, de las patentes de EE.UU. nº 6.008.341 y 6.177.084.

5 ClfA y ClfB tienen una organización estructural (3D) idéntica y aproximadamente el 27% de identidad de aminoácidos. FnBPA tiene una identidad de aminoácidos de aproximadamente el 25% con ClfA.

En la actualidad no existen vacunas basadas en MSCRAMM aprobadas y en el mercado. Veronate®, ClfA y SdrG de

10 direccionamiento intravenoso de globulina inmunitaria (IGIV) humana estafilocócica seleccionada por donante, tuvo un desempeño deficiente en ensayos clínicos en fase III y fue retirado de los ensayos. En la actualidad es objeto de reevaluación para determinar si es un tratamiento viable para infecciones estafilocócicas.

El documento WO-2005/116.064 está dirigido a FnBPA, que es una proteína de unión multifuncional de S. aureus. El

15 dominio A N-terminal de FnBPA se asemeja a ClfA y se ha encontrado que se une a fibrinógeno. Sin embargo. Los dominios BCD C-terminales de FnBPA se unen a fibronectina, con lo que FnBPA es una MSCRAMM bifuncional.

El documento WO-2005/116.064 se basa en el hallazgo de que en presencia de transglutaminasa, se forman uniones covalentes entre la FnBPA de adhesina bacteriana y la fibronectina proteínica del hospedador, lo que hace

20 la asociación mucho más fuerte y esencialmente irreversible. El fibrinógeno es un componente principal (∼ 3 mg/ml) en la sangre donde actúa como objeto final de la cascada de la coagulación. La fibronectina es menos abundante, ∼ 0,3 mg/ml o una molécula de Fn por cada 10-15 de fibrinógeno. No se cree que el fibrinógeno y la fibronectina se asocien en la sangre donde circulan independientemente.

25 De forma importante, el documento WO-2005/116.064 se refiere específicamente a reticulación covalente catalizada por el factor XIIIa. El documento WO-2005/116.064 aísla múltiples mutantes en una FnBPA recombinante donde residuos con cadenas laterales de carga positiva (es decir, sustratos de transglutaminasa) estaban alterados. Además, el documento WO-2005/116.064 se dirige a mutantes que poseen sólo propiedades de unión a fibronectina covalente alterada y no a fibrinógeno. Además, este documento no muestra experimentalmente si la unión de la

30 proteína mutante al ligando se reduce y no proporciona datos de soporte de inmunogenicidad.

Así, a la vista de la prevalencia de resistencia a múltiples fármacos en bacterias grampositivas y a la falta de terapias y vacunas exitosas para estas bacterias resistentes a múltiples fármacos, cualquier terapia alternativa que pueda manejar dichas infecciones bacterianas sin usar antibióticos tendrá un valor importante.

35 Además, cualquier mejora en la eficacia con respecto a cualquiera de los tratamientos o vacunas conocidos tendrá especial importancia, especialmente en un entorno clínico.

Así, la presente invención está dirigida a proporcionar una terapia alternativa y mejorada para dicho tratamiento de 40 dichas infecciones bacterianas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un primer aspecto general de la invención, se proporciona un factor de aglutinación A (ClfA)

45 estafilocócico recombinante de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o una secuencia con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO. 1 o un fragmento de la misma que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión a fibrinógeno (Región A), caracterizado por al menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 para producir una proteína de unión a

50 fibrinógeno recombinante con capacidad reducida o que carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno que estimula una mayor respuesta inmunitaria que la proteína ClfA natural, para su uso en el tratamiento

o profilaxis de infecciones estafilocócicas.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una vacuna que comprende un factor de 55 aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico, vector de expresión o célula hospedadora que expresa un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica inmunógena que comprende un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención.

5 DESCRIPCIÓN DETALLADA

En la presente memoria descriptiva, los términos "adhesina", "MSCRAMM" y "proteínas ancladas a la pared celular" se considerarán intercambiables y cubren todas las proteínas de unión a ligando de origen microbiano. Idealmente, estas proteínas se unen a fibrinógeno, hemo o hemoglobina, haptoglobina-hemoglobina, hemina, colágeno y otros 10 de dichos ligandos. El término proteínas "de tipo MSCRAMM" pretende cubrir las proteínas o adhesinas que tienen secuencias de aminoácidos relacionadas, diseño modular similar y/u organización de dominios de unión común/similar a dichas proteínas MSCRAMM, tales como proteínas Isd. Idealmente, las proteínas de tipo MSCRAMM tienen una organización de dominios de unión/diseño modular similares. Además, las proteínas de tipo MSCRAMM pueden tener al menos el 50%, preferentemente el 60%, preferentemente el 75%, más preferentemente

15 el 85%, más preferentemente todavía el 95%, aún más preferentemente el 99% o más de identidad de secuencias de aminoácidos con las proteínas MSCRAMM.

Se entenderá también que cualquiera de las identidades u homologías porcentuales a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se determina usando procedimientos convencionales disponibles en la longitud

20 entera/completa de la secuencia.

El término "microorganismo", "microbio", "microbiano" o similares incluye pero no se limita a organismos que incluyen bacterias, hongos, virus, levaduras y/o mohos.

25 El término "cantidad inmunológicamente efectiva" cubre aquellas cantidades que son capaces de estimular una respuesta de linfocitos B y/o linfocitos T.

De acuerdo con un primer aspecto general de la invención, se proporciona un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención para su uso en el tratamiento de infecciones microbianas, tal como el

30 tratamiento de sepsis, artritis séptica y/o endocarditis u otras enfermedades o estados patológicos similares. Dichas infecciones microbianas pueden estar causadas idealmente por estafilococos u otros microorganismos similares.

De acuerdo con una realización específica de este aspecto de la invención, el factor de aglutinación A (ClfA) recombinante de la invención tiene una capacidad reducida o ausente de unirse de forma no covalente a su ligando

35 hospedador.

Así, se entenderá que el factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención puede tener una unión reducida con su ligando hospedador o puede evitarse la unión con su ligando hospedador.

40 De acuerdo con la invención, se postula que la unión no covalente que tiene lugar durante la unión, por anclaje-llavecerradura (DLL), de la proteína de la invención a su ligando puede reducirse o impedirse. Se establece que la primera etapa en la unión de una MSCRAMM a su ligando implica una interacción no covalente por medio del modelo DLL. Se trata de las interacciones MSCRAMM no covalentes primarias con el ligando. Las fases finales en la unión a ligando a MSCRAMM implican interacciones covalentes. En esta realización específica, el factor de

45 aglutinación A (ClfA) recombinante de la invención tiene una capacidad reducida o ausente de unirse de forma no covalente a su ligando hospedador debido a la alteración del anclaje-llave-cerradura. Pueden alterarse una o más de las etapas de anclaje, llave o cerradura.

El modelo DLL se obtuvo a partir de la estructura 3D de SdrG en complejo con su ligando. ClfA ha demostrado que

50 actúa por una variación menor del mecanismo DLL (Ganech y col. (2008) "A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics". PloS Pathog 4(11); e1000226). El modelo DLL se refiere específicamente a las interacciones no covalentes que intervienen en la unión a ligandos. El modelo DLL se infiere para todas las demás proteínas de tipo estructural similar (ya sea por semejanza/homología de aminoácidos u homología de organización estructural), lo que incluye

55 pero no se limita a MSCRAMM o proteínas de tipo MSCRAMM.

En relación con ClfA/ClfB de MSCRAMM en particular, se ha encontrado que el dominio unión a ligando mínimo comprende las subregiones N1 a N3 de la Región A, específicamente las subregiones N2 y N3 que comprenden una variante de plegamiento de Ig Dev-IgG. La variante de plegamiento de Ig Dev-IgG es la nueva variante del motivo de

inmunoglobulina también denominado variante DE. Se postula que una bolsa hidrófoba formada entre los dos dominios DEv-IgG de ClfA/B es el sitio de unión a ligando para la cadena γ de fibrinógeno. Esencialmente, el ligando se une al surco hidrófobo que separa N2 y N3. Específicamente, durante la unión a ligando el componente peptídico no plegado del ligando se inserta en el surco situado entre los subdominios N2 y N3. El péptido de cerradura en el

5 extremo C del subdominio N3 experimenta un cambio conformacional y se inserta entre dos cadenas beta en el subdominio N2, bloqueando así el ligando en su lugar. De hecho, la sustitución mutágena de residuos Tyr256, Pro336, Tyr338 y Lys389 en el factor de aglutinación, que se proponen para el contacto con los residuos terminales 408AGDV411 de la cadena γ de fibrinógeno, produjeron proteínas con afinidad marcadamente reducida o inexistente por fibrinógeno. Más adelante se ofrecen detalles adicionales de esta realización específica.

10 Así, con el fin de proporcionar el factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención, con unión reducida al ligando hospedador, puede alterarse la proteína de longitud completa, el dominio de unión a ligando, el dominio de unión a ligando mínimo o un fragmento de los mismos para reducir o evitar la unión a su ligando hospedador. Idealmente, para ClfA, las subregiones N2 y N3 de la Región A, que comprenden idealmente

15 una variante de plegamiento Ig Dev-IgG, pueden modificarse para evitar o reducir la unión a su ligando hospedador. Dicha alteración se diseña para evitar la unión a ligando en el surco hidrófobo que separa los dominios de unión a ligando mínimos necesarios para DLL.

Dichas alteraciones en el dominio de unión a ligando pueden tener lugar en el nivel de los aminoácidos, por

20 sustitución o deleción de aminoácidos, usando proteína de longitud completa, dominio de unión a ligando, dominio de unión a ligando mínimo o un fragmento de los mismos. Se entenderá que pueden usarse también proteínas o fragmentos de las mismas con una homología suficientemente alta con la proteína de unión a ligando. La alta homología tal como se define en la presente memoria descriptiva tiene lugar cuando al menos el 50%, preferentemente el 60%, preferentemente el 70%, preferentemente el 80%, más preferentemente el 90%, más

25 preferentemente todavía el 95%, más preferentemente aún del 95% al 99%, todavía más preferentemente del 99% o más de los nucleótidos se corresponden en toda la longitud de la secuencia de ADN o cuando se usan en conjunto con secuencias de aminoácidos cuando las secuencias de aminoácidos no son idénticas pero producen una proteína que tiene la misma funcionalidad y actividad. Se entenderá que estas observaciones acerca de la alta homología pueden relacionarse también con la estructura 3D de la proteína, es decir, la organización modular de los dominios

30 de unión.

Se entenderá que puede usarse la proteína de unión a ligando completa, el dominio de unión a ligando, el dominio de unión a ligando mínimo o un fragmento de los mismos.

35 El uso de proteínas truncadas de la proteína de unión a ligando tal como el dominio de unión a ligando, el dominio de unión a ligando mínimo o el uso de fragmentos de los mismos es ventajoso para facilitar la fabricación y superar otros problemas como la escisión no deseada de la proteína. Por ejemplo, el péptido de cerradura, presente en el dominio de unión a ligando mínimo, puede suprimirse/eliminarse o alterarse. Por ejemplo, el péptido de cerradura en ClfA corresponde a los aminoácidos 532 a 538 de la Región A. Estos residuos pueden ser alterados, sustituidos o

40 eliminados/suprimidos con el fin de impedir la unión a ligando en la MSCRAMM por medio de DLL. De esta forma se impide la "cerradura" de DLL de la MSCRAMM con su ligando. Esta "cerradura" tiene lugar por medio de una interacción no covalente. En una realización, el péptido de cerradura se elimina completamente junto con los residuos de aminoácidos en el extremo C de la Región A restantes. De acuerdo con otra realización, se elimina sólo la región del péptido de cerradura. De acuerdo con otra realización más, la región del péptido de cerradura

45 experimenta sustitución de aminoácidos para producir la reducción o prevención de unión a ligando/cerradura. Estas observaciones son aplicables a todas las MSCRAMM o proteínas de tipo MSCRAMM con ligandos de unión mediante el modelo DLL u otros similares.

Al modificar el factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención de esta manera, es posible

50 proporcionar una proteína de unión a ligando sin la capacidad de unirse con su ligando, lo que estimula una mayor respuesta inmunitaria en la inmunización que la proteína natural. Ventajosamente, así se reduce la inflamación sistémica, con lo que disminuye la virulencia microbiana. En consecuencia, esta proteína de unión a ligando alterada que carece de la capacidad de unirse con su ligando puede usarse ventajosamente en el tratamiento de infecciones microbianas. Así, estos hallazgos presentan una terapéutica de vacuna/inmunización nueva y valiosa frente a

55 infecciones bacterianas que proporciona mejores resultados que una terapéutica de vacuna o inmunización derivada de la proteína natural.

En la presente memoria descriptiva se divulga también un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo y/o tratar a un paciente que tiene una infección microbiana, que comprende la administración al

individuo de un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención, o una vacuna que comprende la proteína MSCRAMM o semejante a MSCRAMM estafilocócica recombinante, o un fragmento de la misma con unión reducida a su ligando hospedador.

5 De acuerdo con otra realización de este aspecto de la invención, se proporciona una vacuna que comprende un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención, con unión reducida a su ligando hospedador.

En la presente memoria descriptiva se divulga también un anticuerpo preparado contra un factor de aglutinación A 10 (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención, preferentemente en la forma de un suero hiperinmune

De acuerdo con otra realización de este aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica inmunógena que comprende un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención, con unión reducida a su ligando hospedador

15 De acuerdo con una realización preferida de la invención, se proporciona un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención que comprende al menos la parte de región de unión a fibrinógeno, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno para su uso en terapia.

20 Se entenderá que el factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención puede usarse en el tratamiento de infecciones estafilocócicas como en el tratamiento de sepsis, artritis séptica y/o endocarditis u otras enfermedades o estados patológicos similares.

La región de unión a fibrinógeno de la proteína se modifica de manera que deje de estar unida a fibrinógeno. Tal

25 como se indicó anteriormente, la alteración puede tener lugar en el nivel de nucleótidos o aminoácidos. Se entenderá que pueden usarse también proteínas o fragmentos de las mismas con homología suficientemente alta con la proteína de unión a fibrinógeno. La homología alta tal como se define en la presente memoria descriptiva tiene lugar cuando al menos el 50%, preferentemente el 60%, preferentemente el 70%, preferentemente el 80%, más preferentemente el 90%, más preferentemente todavía el 95%, aún más preferentemente del 95% al 99%, más

30 preferentemente todavía el 99% de los nucleótidos se corresponden en toda la longitud de la cadena de ADN o cuando se usa en relación con secuencias de aminoácidos cuando las secuencias de aminoácidos no son idénticas pero producen una proteína que tiene la misma funcionalidad y actividad. Se entenderá que estas observaciones acerca de la alta homología pueden relacionarse también con la estructura 3D de la proteína.

35 Se entenderá que pueden usarse la proteína de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno mínima, o un fragmento las mismas completas. El uso de proteínas truncadas o fragmentos de las mismas es ventajoso por facilidad de fabricación y para superar otros problemas tales como la escisión no deseada de la proteína. Se ampliará este concepto más adelante.

40 Dichos fragmentos deben comprender idealmente al menos parte de la región de unión a fibrinógeno de la proteína. Las ventajas de usar una proteína truncada o un fragmento de la misma, que comprende por ejemplo sólo uno o más subdominios de la región de unión a ligando-fibrinógeno, están relacionadas con la capacidad de purificar la proteína con alto rendimiento sin degradación. La región de unión a fibrinógeno de proteína ClfA, referida además como Región A, comprende 3 subregiones, N1, N2 y N3. Así, el fragmento inmunógeno puede comprender

45 subregiones N1, N2 y/o N3 de la Región A de ClfA o un fragmento de la misma. Así, por ejemplo, en relación con ClfA, el fragmento puede comprender uno o más subdominios de la Región A, N1, N2 o N3. Idealmente, pueden usarse N2 y N3 ya que este truncamiento es menos probable que sufra proteólisis (se ha indicado la existencia un sitio de escisión de proteasa entre N1 y N2 en ClfA y ClfB) y puede expresarse en niveles más elevados en E. coli. N2 y N3 son la región de unión a fibrinógeno mínima de las proteínas Clf.

50 Los autores de la invención han encontrado inesperadamente que esta proteína de unión a fibrinógeno alterada, truncamiento o fragmento de la misma, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno estimula una mayor respuesta inmunitaria tras inmunización que la proteína natural que se une a fibrinógeno de la forma normal. Ventajosamente, esta proteína de unión a fibrinógeno alterada no provoca inflamación sistémica cuando es expresada por S. aureus,

55 y así se reduce la virulencia microbiana. En consecuencia, esta proteína alterada que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno puede usarse ventajosamente en el tratamiento de infecciones microbianas. Los autores de la invención han encontrado también al contrario de lo esperado que el efecto de protección de la proteína de unión a fibrinógeno alterada es mayor que la proteína natural. Los autores de la invención han encontrado que una composición farmacéutica o vacuna que comprende dicha proteína recombinante alterada es más efectiva que una

composición farmacéutica o vacuna que comprende la misma proteína recombinante en una forma no alterada (natural), tal como ClfA, ClfB, SdrG, etc.

Así, estos hallazgos presentan una terapéutica de vacuna/inmunización nueva y valiosa contra infecciones 5 bacterianas que proporciona mejores resultados que la proteína natural cuando se usa también como terapéutica de vacuna/inmunización.

Se entenderá que la proteína alterada puede usarse en la generación de anticuerpos, incluyendo anticuerpos humanizados monoclonales, policlonales o quiméricos o fragmentos de los mismos, para su uso en el tratamiento de

10 dichas infecciones microbianas. A continuación pueden proporcionarse composiciones que incluyen dichos anticuerpos, tales como suero hiperinmune, y estas composiciones pueden usarse en el tratamiento de pacientes infectados con infecciones por Staphylococcus.

Así, las proteínas o fragmentos activos de las mismas pueden usarse para inhibir la unión de estafilococos a la 15 matriz extracelular (MEC) y para prevenir/tratar infecciones estafilocócicas en un paciente.

Además, las proteínas o fragmentos activos de las mismas, y los anticuerpos de las proteínas son útiles en el tratamiento de infecciones por infecciones estafilocócicas, para el desarrollo de vacunas para vacunación activa o pasiva, y cuando se administran como una composición farmacéutica en una herida o un dispositivo médico, tanto

20 las proteínas como los anticuerpos son útiles como agentes de bloqueo para prevenir la infección microbiana. Por ejemplo, estas proteínas o fragmentos de las mismas pueden usarse en vacunas activas, y los anticuerpos para estas proteínas en vacunas pasivas.

Estas vacunas y productos descritos en la presente memoria descriptiva presentan una mejora importante con

25 respecto a la técnica anterior, que enseña el uso general de MSCRAMM para impartir inmunización, pero no enseña las vacunas o productos inesperados o mejorados descritos en la presente memoria descriptiva.

La preparación de proteínas, ADN y anticuerpos son bien conocidos en la técnica y no se describirán en detalle en la presente memoria descriptiva. Las técnicas convencionales se usan idealmente en la generación de estas

30 moléculas. Se entenderá también que la invención cubre la construcción de ácidos nucleicos que contienen la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de interés, las células hospedadoras recombinantes que contienen dicha construcción de ácidos nucleicos para expresar la proteína de interés y las composiciones inmunógenas.

Para la administración, la composición de proteínas puede dispersarse en una solución salina isotónica estéril u otro 35 adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Se entenderá que la vacuna puede ser una vacuna de ADN o de proteína.

La inmunización puede tener lugar mediante la inyección de ADN, proteína o anticuerpos. Alternativamente, puede 40 administrarse un organismo vivo atenuado que incluye y expresa el ADN.

La cantidad de ADN, proteína o anticuerpos que puede administrarse dependerá de varios factores mitigantes, que incluyen dependencia de la fuerza del promotor, la expresión de proteína y la inmunogenicidad del gen expresado. Estos factores pueden verse alterados para cada nueva aplicación con el fin de obtener la cantidad

45 inmunológicamente efectiva deseada requerida.

En la presente memoria descriptiva se divulga también un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo y/o para tratar a un paciente que tiene una infección microbiana, que comprende la administración al individuo de un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención que comprende al menos

50 la región de unión a fibrinógeno, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, se proporciona una vacuna que comprende un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención que comprende al menos parte de la región de unión a fibrinógeno, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno.

55 En la presente memoria descriptiva se divulga también un anticuerpo preparado contra un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención que comprende al menos parte de la región de unión a fibrinógeno, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno, preferentemente en la forma de un suero hiperinmune.

De acuerdo con una realización preferida adicional más de la invención, se proporciona una composición farmacéutica inmunógena que comprende un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de la invención que comprende al menos parte de la región de unión a fibrinógeno, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

5 Idealmente, la proteína de unión a fibrinógeno estafilocócica recombinante o un fragmento de la misma se obtiene de

S. aureus, S. epidermidis y/o S. lugdunensis.

Se entenderá que las sustituciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos en la región de unión a fibrinógeno de 10 dicha proteína de unión a fibrinógenos producen una proteína recombinante sin la capacidad de unirse a fibrinógeno.

Se ha determinado que la unión a ClfA-fibrinógeno tiene lugar mediante un mecanismo de anclaje-llave-cerradura (DLL) similar al de SdrG. El modelo DLL se explicó en extenso anteriormente. La Región A de ClfA es responsable de la interacción proteína-ligando. Tal como se muestra en la Figura 11, la estructura modular de varias MSCRAMM

15 de unión a fibrinógeno es similar y todas ellas contienen una Región A similar a ClfA.

El sitio de unión a péptido de cadena γ de fibrinógeno está situado en un surco hidrófobo en la unión entre N2 y N3 de ClfA. Así, las sustituciones o deleciones mencionadas anteriormente se designan de manera que modifiquen la interacción proteína-ligando de MSCRAMM e impidan la unión no covalente de ClfA a fibrinógeno.

20 De acuerdo con una realización específica de la presente invención, la proteína de unión a fibrinógeno estafilocócica recombinante es un mutante deficiente de unión a fibrinógeno de ClfA. En esta realización, la Región de unión a fibrinógeno A de ClfA es modificada por cualquier medio (tal como mutaciones de sustitución o deleción) de manera que deje de estar unida a fibrinógeno.

25 Idealmente, la proteína de unión a fibrinógeno es ClfA, sin embargo, ClfA contiene una semejanza estructural 3D con muchas otras proteínas de unión a fibrinógeno.

ClfA es una proteína de 993 aminoácidos, que comprende un dominio de unión a fibrinógeno de 520 aminoácidos

30 (de los aminoácidos 40 a 559). Este dominio de unión a fibrinógeno es el dominio A en el extremo N que comprende las subregiones N1, N2 y N3. En la invención puede usarse la región de fibrinógeno completa que cubre de N1 a N3 desde el aminoácido 40 al aminoácido 559. Alternativamente, puede usarse un truncamiento de la región N1 a N3, por ejemplo de 221 a 559 (la región de unión a fibrinógeno mínima), de 221 a 531 (la región de fibrinógeno mínima sin el péptido de cerradura y los residuos posteriores), etc. Idealmente, pueden usarse las subregiones N2 y N3, la

35 región de unión a fibrinógeno mínima, que corresponden a los residuos de aminoácidos 221 a 559. Alternativamente, puede usarse un fragmento de estas subregiones.

Se ha establecido que los residuos de aminoácidos 221 a 559, que cubren las regiones N2 y N3, de ClfA desempeñan una parte importante en la unión a fibrinógeno y son la región de unión a fibrinógeno mínima. Los

40 autores de la invención han encontrado también inesperadamente que la mutación de residuos de aminoácidos en esta región produce una proteína expresada que puede ser reconocida por las defensas inmunitarias del hospedador pero carece de unión a fibrinógeno y, con ello, reduce la virulencia asociada. Esta región (el dominio de unión a fibrinógeno de 339 aminoácidos) de ClfA tiene una estructura 3D específica, denominada plegamiento IgG variante DE, y es el truncamiento de unión a Fg mínimo que si se altera (por medio de sustitución o deleción, etc.) puede

45 proporcionar una terapia mejorada.

La alteración para producir la pérdida de actividad de unión a fibrinógeno puede tener lugar por sustitución, adición o inserción o deleción en el nivel de nucleótidos o de aminoácidos. Idealmente, la sustitución influye negativamente en la estructura 3D (por ejemplo del denominado plegamiento IgG variante DE) de la proteína o fragmento con lo que ya

50 no puede unirse a fibrinógeno.

Idealmente, la sustitución de nucleótidos o aminoácidos reduce la interacción no covalente con fibrinógeno, preferentemente impidiendo la unión a ligando a la bolsa hidrófoba que separa N2 y N3 de la Región A de la proteína de unión a fibrinógeno. Alternativamente, la región del péptido de cerradura que corresponde a los aminoácidos 532

55 a 538 puede modificarse por sustitución o deleción para impedir la unión a ligando. Además, puede usarse un truncamiento/fragmento que carece de la región del péptido de cerradura y opcionalmente el resto de los residuos de proteínas en el extremo C, es decir, que carece de los residuos de aminoácidos 532 a 559.

De acuerdo con una realización específica de este aspecto de la invención, el mutante de ClfA deficiente en unión a

fibrinógeno puede construirse intercambiando los aminoácidos P338 por serina y/o Y338 por aspartato, respectivamente. La elección de los residuos se basó en la estructura cristalina en rayos X de ClfA y en la observación de que los cambios individuales en la prolina o la tirosina redujeron la afinidad de unión. Sorprendentemente, los autores de la invención encontraron que esta proteína ClfA mutante (rClfAP338S Y338A) 5 estimulaba una respuesta inmunitaria y puede usarse en la generación de una terapia mucho más efectiva de vacunas o anticuerpos. Esta sustitución puede tener lugar en la proteína de longitud completa de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno mínima o un fragmento de las mismas.

De acuerdo con otra realización específica de este aspecto de la invención, el mutante deficiente en unión a

10 fibrinógeno de ClfA puede construirse intercambiando aminoácidos P336 por aspartato y/o Y338 por serina, respectivamente. Como en la realización anterior, esta proteína ClfA mutante (rClfAP336A Y338S) puede usarse también en la generación de una terapia mucho más efectiva de vacunas o anticuerpos.

Alternativamente, la alteración puede estar en la forma de a deleción, que comprende la región de unión a

15 fibrinógeno sin la secuencia de péptidos de cerradura (aminoácidos 532 a 538), para producir una proteína de unión a fibrinógeno recombinante sin la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno. En esta realización, se usan residuos de aminoácidos 221 a 531 de Región A de ClfA, que carecen del péptido de cerradura y de los residuos siguientes del extremo C. Alternativamente, puede contemplarse una sustitución de aminoácidos en los aminoácidos de péptidos de cerradura 532 a 538 que impide el DLL del fibrinógeno.

20 Debe entenderse que todas las proteínas en la familia Clf-Sdr se unen a ligandos mediante el modelo DLL. Al modelizar la estructura 3D, es posible predecir el péptido de cerradura y preparar un truncamiento que carezca de él, ya sea en la longitud completa (N1 a N3) o en el truncamiento de unión a ligando mínimo N2-N3, o un fragmento de los mismos.

25 Los autores de la invención encontraron que estas proteínas rClfA de sustitución (ya sean mutantes de deleción, sustituciones o truncamientos) redujeron la virulencia y el resultado de la enfermedad, y sorprendentemente indujeron menos inflamación sistémica que la proteína natural.

30 Así, se espera que la inmunización con estas proteínas mutantes, basándose en las proteínas sometidas a ensayo, potencie el nivel de anticuerpos que reconocieron tanto la proteína mutante como la natural y proporcione una mayor respuesta inmunitaria que la proteína natural.

Así, la ClfA que ha sido alterada de manera que deje de unirse a fibrinógeno es un candidato terapéutico útil para

35 inmunización activa o pasiva. De esta forma, la proteína ClfA alterada en sí puede usarse como una vacuna o pueden usarse anticuerpos preparados para esta proteína ClfA alterada. Como antes la vacuna puede ser una vacuna de ADN o de proteína.

Pueden usarse las siguientes secuencias incluidas en la tabla mostrada a continuación de acuerdo con la invención. 40

SEQ ID NO

Descripción Longitud Región A

1

rClfA natural -secuencia aa longitud completa (Ejemplo 1) 933 aa -

2

Región A rClfA natural -secuencia ADN longitud completa (Ejemplo 1) 1560 nucleótidos N1 a N3

3

Región A rClfA natural -secuencia aa longitud completa (Ejemplo 1) 520 aa N1 a N3

4

Región A rClfAPYI (Ejemplo 1) 520 aa N1 a N3

5

Región A rClfAPYII (Ejemplo 1) 520aa N1 a N3

6

Región A rClfA natural -secuencia aa longitud completa con residuos en terminales N y C adicionales1 (Ejemplo 2) 530aa N1 a N3

7

Región A rClfAPYI con residuos en terminales N y C adicionales1 (Ejemplo 1) 530aa N1 a N3

8

Región A rClfAPYII con residuos en terminales N y C adicionales 530aa N1 a N3

9

rClfA 221-559 (Ejemplo 2) 339 aa N2 y N3

10

rClfA 221-559 con residuos en terminales N y C adicionales1 (Ejemplo 2) 349 aa N2 y N3

11

PY rClfA 221-559 (Ejemplo 2) 339aa N2 y N3

12

PY rClfA 221-559 con residuos en terminales N y C adicionales1 (Ejemplo 2) 349aa N2 y N3

13

rClfA 221-531 (truncamiento cerradura delta) con residuos en terminales 321aa N2 y N33

N y C adicionales2 (Ejemplo 2)

14

rClfAPY 221-531 (truncamiento cerradura delta) 311 aa N2 y N33

1 Los residuos adicionales en el extremo N (extensión en extremo N (6 x His tag y residuos adicionales) comprenden 6 residuos His, seguido por Gly y Ser. Los residuos adicionales en el extremo C comprenden Lys seguido por Leu (pueden usarse otros residuos en terminales N y C adicionales, dependiendo del cebador usado o de las etiquetas requeridas en los extremos N/C)2 Los residuos adicionales en el extremo N (6 x His tag y residuos adicionales) comprenden 6 residuos His, seguido por Gly y Ser. Los residuos adicionales en el extremo C comprenden Arg seguido por Ser (pueden usarse otros residuos en terminales N y C adicionales, dependiendo del cebador usado o de las etiquetas requeridas en los extremos N/C))3 sin el péptido de cerradura correspondiente a los residuos aa 532 a 538 y los residuos restantes en el extremo C de la Región A, es decir, que carece de residuos de aminoácidos 532 a 559.

Idealmente, la proteína de unión a fibrinógeno estafilocócica recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 3 donde los residuos P336 y/o Y338 están sustituidos por serina y/o alanina, o un fragmento de las mismas.

5 Alternativamente, el fragmento de la proteína de unión a fibrinógeno estafilocócica recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO. 4 a SEQ ID NO. 14. SEQ ID NO. 4 y 5 corresponden al dominio A de ClfA N1, N2, N3 sólo, rClfA P336S Y338A y rClfA P336A Y338S respectivamente tal como se indica en la tabla anterior.

10 Se postula también, basándose en las sustituciones en la cerradura que se prepararon en SdrG, que las sustituciones en la cerradura que son defectuosas en el cambio conformacional o la complementación de la cadena beta también serán defectuosas en unión a ligando. Así, idealmente, las sustituciones están en los residuos de aminoácidos 532 a 538 que corresponden al péptido de cerradura y afectan a la capacidad del péptido de

15 experimentar un cambio conformacional, o se unen al ligando o ambos. Alternativamente, la alteración puede comprender la eliminación de los residuos de aminoácidos 532 a 538 (péptido de cerradura delta) al mismo tiempo, para proporcionar resultados similares. Además, un mutante de truncamiento en el extremo C que carece de residuos de aminoácidos 532 a 559 (incluidos residuos de péptido de cerradura) realizará también la unión al ligando.

20 Sin embargo, se contemplará también que podrían sustituirse residuos de aminoácidos distintos de los antes enumerados específicamente. Por ejemplo, pueden sustituirse Glu 526, Val 527, Tyr 256 y Lys 389 para alterar las propiedades de unión a fibrinógeno de la proteína o de un fragmento de la misma. Así, puede contemplarse cualquier sustitución que reduzca la capacidad de unión. Idealmente, dichas sustituciones o deleciones realizan la

25 bolsa hidrófoba y el mecanismo asociado para unión al ligando en la distancia hidrófoba tales como los homólogos Val527 en ClfA y N526 en ClfB. En ClfB, se han estudiado Q235 y N526 para mostrar que reducen la unión. Se realizó un estudio similar con FnBPA donde N304 y F306 mostraron que eran importantes para la unión a Fg. Así, las mutaciones en estos residuos de aminoácidos afectarán a la unión a ligando.

30 El tratamiento (vacuna, anticuerpo o composición farmacéutica, etc.) puede comprender la región de unión a fibrinógeno completa o un fragmento de la misma.

En la memoria descriptiva, los términos "comprender, comprende, comprendido y que comprende" o cualquier variación de los mismos y los términos "incluir, incluye, incluido y que incluye" o cualquier variación de los mismos se 35 consideran totalmente intercambiables y deben entenderse con la interpretación más extensa posible.

La invención no se limita a la realización descrita anteriormente, sino que puede modificarse en su construcción y en sus detalles dentro del alcance de las reivindicaciones.

40 A continuación se describirá la presente invención con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

Las Figuras 1 a 15 muestran los resultados del Ejemplo 1.

La Figura 1 muestra la gravedad de la artritis (A), medida como índice artrítico, y la pérdida de peso (B) en ratones a

45 los que se ha inoculado la cepa Newman de S. aureus, y se inocularon de clfAPYI, clfAPYII y clfA nula mutante. Se inoculó 3,2 x 106 -6,0 x 106 UFC de cepas de S. aureus. Los datos se presentan como medianas (cuadrados o líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). Se agrupan los datos de

tres experimentos. NNewman = 27 -30, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10 y NclfA = 16 -20.

La Figura 2 muestra el crecimiento bacteriano en los riñones de ratones 7-8 días después de la inoculación con 3,2 x 106 -6,0 x 106 UFC de cepa Newman de S. aureus, y clfAPYI, clfAPYII y clfA nula mutante. Los datos se presentan 5 como UFC por par de riñones. Cuando no se detectó crecimiento, se asignó el máximo recuento posible de acuerdo con la dilución usada. Se agrupan los datos de tres experimentos.

NNewman = 26, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10 y NclfA = 15.

10 La Figura 3 muestra la supervivencia de ratones después de la inoculación con 5,2, 5,1 ó 3,3 x 107 UFC de cepa Newman de S. aureus, clfAPYI mutante o clfA nula mutante, respectivamente. N = 10 por grupo desde el inicio.

La Figura 4 muestra la supervivencia de ratones después de la inoculación con 9,4, 7,9, 10,7 ó 9,8 x 106 UFC de cepa LS-1 de S .aureus yclfAPYI, clfAPYII o clfA nula mutante, respectivamente. N = 15 por grupo desde el inicio.

15 La Figura 5 muestra la supervivencia de ratones inmunizados con BSA, ClfA recombinante o ClfAPY recombinante (es decir, dominio A de proteína ClfAPYI recombinante) y se les inoculó 2,3 x 107 UFC de Newman de S. aureus. N = 15 por grupo desde el inicio.

20 La Figura 6 muestra la frecuencia de ratones artríticos a los que se inoculó 3,2 x 106 -6,0 x 106 UFC de cepa Newman de S. aureus natural, y clfAPYI, clfAPYII y clfA nula mutante. Se agrupan los datos de tres experimentos. NNewman = 27 -30, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10 y NclfA = 16 -20.

La Figura 7 muestra la gravedad de artritis medida como índice artrítico en ratones a los que se inoculó 5,2, 5,1 ó 3,3

25 x 107 UFC de cepa Newman de S. aureus natural, clfAPYI mutante o clfA nula mutante, respectivamente. Los datos se presentan como medianas (cuadrados), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NNewman = 0-10, NclfAPYI = 9-10 y NclfA = 0-10.

La Figura 8 muestra la pérdida de peso en ratones a los que se inoculó 5,2, 5,1 ó 3,3 x 107 UFC de cepa Newman

30 de S. aureus natural, clfAPYI mutante o clfA nula mutante, respectivamente. Los datos se presentan como medianas (línea central), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NNewman = 0-10, NclfAPYI = 910 y NclfA = 0-10.

La Figura 9 muestra la gravedad de artritis medida como índice artrítico en ratones inmunizados con BSA, ClfA

35 recombinante o ClfAPY recombinante (es decir, dominio A de proteína ClfAPYI recombinante) y se les inoculó 4,0 x 108 UFC de Newman de S. aureus. Los datos se presentan como medianas (cuadrados), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NBSA = 14, NclfAPY = 14 y NclfA = 15 por grupo desde el inicio.

La Figura 10 proporciona la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de proteína de dominio A de ClfA natural

40 (rClfA), sólo los dominios N123, con los residuos resaltados que están modificados en los ejemplos siguientes (P338 y Y338) para dar lugar a rClfAPYI/II (SEQ ID NO: 3). Este dominio A de proteína recombinante se usó en la vacunación en los ejemplos siguientes.

La Figura 11 muestra una representación ilustrativa de la estructura de las proteínas FnBPA, ClfB, ClfA y SdrG. La

45 Región A es la región de unión a fibrinógeno, S es la secuencia de señal, W es el dominio que cubre pared celular, M es el anclaje de membrana que incluye el motivo LPXTG, + representa residuos con carga positiva y R es la región de repetición. En ClfA la Región A comprende N123 (no mostrado). La región BCD de FnBPA (y la región CD más corta de FnBPB -no mostrada) se une a fibronectina.

50 La Figura 12 muestra las respuestas de anticuerpos específicos a ClfAPY recombinante 40-559 en muestras séricas de ratones inmunizados con albúmina de suero bovino (BSA), ClfA recombinante 40-559 (rClfA) o ClfAPY recombinante 40-559 (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 2,3 x 107 UFC/ratón de cepa Newman de S. aureus natural para inducción de sepsis. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80%

55 (bigotes). NBSA = 13-15, NrClfA = 15 y NrClfAPY = 15.

La Figura 13 muestra las respuestas de anticuerpos específicos a ClfA recombinante 40-559 en muestras séricas de ratones inmunizados con albúmina de suero bovino (BSA), ClfA recombinante 40-559 (rClfA) o ClfAPY recombinante 40-559 (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con

2,3 x 107 UFC/ratón de cepa Newman de S. aureus natural para inducción de sepsis. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NBSA = 13-15, NrClfA = 15 y NrClfAPY = 15.

5 La Figura 14 muestra las respuestas de anticuerpos específicos a ClfAPY recombinante 40-559 en muestras séricas de ratones inmunizados con albúmina de suero bovino (BSA), ClfA recombinante 40-559 (rClfA) o ClfAPY recombinante 40-559 (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 4,0 x 106 UFC/ratón de cepa Newman de S. aureus natural para inducción de artritis séptica. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80%

10 (bigotes). NBSA = 14-15, NrClfA = 15 y NrClfAPY = 15.

La Figura 15 muestra las respuestas de anticuerpos específicos a ClfA recombinante 40-559 en muestras séricas de ratones inmunizados con albúmina de suero bovino (BSA), ClfA recombinante 40-559 (rClfA) o ClfAPY recombinante 40-559 (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con

15 4,0 x 108 UFC/ratón de cepa Newman de S. aureus natural para inducción de artritis séptica. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NBSA = 14-15, NrClfA = 15 y NrClfAPY = 15.

La Figura 16 del Ejemplo 2 muestra las respuestas de anticuerpos específicos a ClfAPY recombinante 221-559 en

20 muestras séricas de ratones inmunizados con albúmina de suero bovino (BSA), ClfA recombinante 221-559 (rClfA221-559) o ClfAPY recombinante 221-559 (rClfAPY221-559), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NBSA = 15, NrClfA221-559 = 14-15 y NrClfAPY221-559 = 14-15.

25 La Figura 17 del Ejemplo 2 muestra las respuestas de anticuerpos específicos a ClfA recombinante 221-559 en muestras séricas de ratones inmunizados con albúmina de suero bovino (BSA), ClfA recombinante 221-559 (rClfA221-559) o ClfAPY recombinante 221-559 (rClfAPY221-559), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NBSA = 15, NrClfA221-559 = 14-15 y NrClfAPY221-559 = 14-15.

30 La Figura 18 del Ejemplo 3 muestra las respuestas de anticuerpos específicos a ClfA recombinante 221-531 en muestras séricas de ratones inmunizados con ClfAPY recombinante 221-531 (rClfAPY221-531), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartílicos (cajas) e intervalos centrales del 80% (bigotes). NrClfA221-531 = 14-15.

Ejemplos

Ejemplo 1

40 Truncamientos de la región A de rClfA que comprenden N1, N2 y N3 (aminoácidos 40-559) MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS

Al final de esta sección de proporcionan detalles completos de las referencias numéricas entre paréntesis incluidas 45 en los Ejemplos.

Ratones

Se obtuvieron ratones NMRI de Scanbur BK (Sollentuna, Suecia) y se mantuvieron en las instalaciones para

50 animales del Departamento de Reumatología, Universidad de Gotemburgo, Suecia. Los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de experimentos con animales de Gotemburgo. Se alojó a hasta 10 animales por jaula con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, y se les alimentó con pienso estándar de laboratorio y agua a voluntad. Al inicio de los experimentos los animales tenían de 6 a 16 semanas de vida.

55 Cepas bacterianas

Para la infección de los animales se usaron cepas Newman de S. aureus naturales (14) y LS-1 (11) y se construyeron derivados de las mismas. Se construyeron derivados de ClfA P336SY338A (clfAPYI) y clfA P336AY338S (clfAPYII) en cepa Newman y se realizó transducción a cepa LS-1 (véase más adelante). Se usaron también los

mutantes de deleción Newman clfA2::Tn917 mutante DU5876 (3) y LS-1 clfA2: Tn917 mutante (J.R. Fitzgerald y col., inédito). Las bacterias se cultivaron en placas de agar en sangre durante 48 h, se recogieron y se mantuvieron congeladas a -20°C en PBS que contenía el 5% (p/v) de BSA (Sigma Chemicals) y el 10% (v/v) de sulfóxido de dimetilo. Antes de la inyección en los animales, se descongelaron las suspensiones bacterianas, se lavaron en PBS

5 y se ajustaron a concentraciones celulares apropiadas. Se midió el número de bacterias viables en conjunción con cada prueba de provocación por cultivo en placas de agar en sangre y recuento de colonias.

Construcción de mutaciones de clfAPYI y clfAPYII en Newman y LS-1 de S. aureus

10 En este experimento, se usó un truncamiento de la región A de ClfA de longitud completa, que comprende N1, N2 y N3, correspondientes a los aminoácidos 40 a 559. En la descripción y las figuras siguientes:

-

ClfA puede referirse también como rClfA 40-559 (SEQ ID NO 3); -ClfA P336SY338A puede referirse también como clfAPYI, rclfAPY o rclfAPYI (es decir, clfAPYI 40-559) (SEQ ID NO 15 4);y -ClfA P336AY338S puede referirse también como clfAPYII, rclfAPYII (es decir, clfAPYII 40-559) (SEQ ID NO 5).

Se clonaron 1,02 kb de fragmento PstI-BamHI de pCF77 PY (Loughman y col., 2005) que contenía las mutaciones P336S y Y338A en clfA en pBluescriptII SK-(Stratagene). Se linealizó este plásmido con HindIII y se ligó a HindIII-cut 20 pTSermC (J. Higgins, inédito) para generar plásmido pARM, que es un vector transportador de E. coli-S. aureus sensible a la temperatura que contiene las sustituciones P336S y Y338A.

Con el fin de reducir el riesgo de generar sin saberlo un epítopo funcional o inmunorreactivo por sustitución de P336 e Y338, los autores de la invención generaron un segundo mutante, en el que se invirtió el orden de las sustituciones,

25 para producir P336A y Y338S. Para generarlo se generó un plásmido pJH2, análogo a pARM pero que contenía las sustituciones P336A y Y338S. Se usó PCR de cebador de superposición con los mismos cebadores de flanqueo usados para preparar pCF77 PY (6), y un par diferente de cebadores mutágenos de superposición:

F3: GCAACTTTGACCATGGCCGCTTCTATTGACCCTGAAAATG y 30 R3: CATTTTCAGGGTCAATAGAAGCGGCCATGGTCAAAGTTGC

(mutaciones en negrita y subrayadas) para generar pCF77 PYII. El fragmento de 1,02 kb de PstI-HindIII de este plásmido se usó tal como se describe anteriormente para generar pJH2, un vector transportador de E. coli-S. aureus 35 sensible a la temperatura que contiene las sustituciones P336A y Y338S.

Se transfirió pARM y pJH2 a RN4220 (15) por electroporación y posteriormente se procedió a la transducción usando el fago 85 (16) en S. aureus Newman (14) y LS-1 (11). En estas cepas se indujo a los plásmidos a insertarse en el cromosoma y después escindirse, para dejar mutaciones en el cromosoma de una proporción de 40 transformantes, que generan Newman clfAPYI, Newman clfAPYII, LS-1 clfAPYI y LS-1 clfAPYII. Se cribaron los transformantes en relación con la pérdida del plásmido y una pérdida de actividad de unión a fibrinógeno. La integridad del gen ClfA se verificó por inmunotransferencia Southern usando una sonda de clfA (datos no mostrados). La expresión de una proteína inmunorreactiva (ClfAPY) se verificó por Western blotting usando antisuero de conejos policlonal de la región A anti-ClfA (datos no mostrados). Las mutaciones se verificaron por PCR

45 en los fragmentos de KpnI-BamHI de ADN genómico y la secuenciación comercial de los productos. Las 700 bases aproximadamente del gen ClfA de la cepa LS-1 que se secuenciaron eran idénticas a las bases correspondientes en el gen clfA Newman de la cepa Newman.

Producción de ClfA recombinante y ClfAPY

50 Se produjo una región A de ClfA recombinante marcada con His, dominios N123 (aminoácidos 40-559), a partir de pCF40 tal como se describe anteriormente (17), con una etapa de pulido adicional a través de una columna de intercambio iónico. Se usó el plásmido pCF77 PY (6) como plantilla para clonar los dominios N123 de clfAPYI en pQE30 para generar pCF40PY. Usando este plásmido, se produjo también ClfAPY por cromatografía de afinidad por

55 níquel y cromatografía de intercambio aniónico, tal como se describió para rClfA. Se dializaron los eluatos frente a dos cambios de PBS antes de la concentración y la liofilización.

Experimentos de artritis séptica y sepsis

En los experimentos 1-3 se infectó a todos los ratones (n = 10 por grupo) con cepa Newman para provocar artritis. En los experimentos 4 y 5, se infectó a los ratones con cepa Newman y LS-1, respectivamente, para inducir sepsis (n = 10 por grupo).

5 Experimento 1 Se infectó a los ratones con inyección intravenosa con 3,5 x 106 UFC/ratón de cepa Newman de S. aureus o con 4,3 x 106 UFC/ratón de Newman clfAPYI mutante, ambas en 200 µl de PBS. Se realizó un seguimiento clínico de artritis y de cambio de peso hasta el día 7. Se sacrificó a los ratones en el día 8, se evaluó el crecimiento renal de bacterias y se midieron las concentraciones de IL-6 sérico e IgG total. Se estudió histológicamente la sinovitis y la destrucción ósea en las articulaciones de las patas delanteras y traseras.

10 Experimento 2 Se infectó a los ratones con 5,0 x 106 UFC, 6,0 x 106 UFC o 4,3 x 106 UFC de cepa Newman de S. aureus, clfAPYI mutante o Newman clfA::ErmR (clfA nula mutante), respectivamente. Se llevó un seguimiento de la artritis clínica y del cambio de peso hasta el día 7. Se sacrificó a los ratones en el día 7, se evaluó el crecimiento renal de bacterias y se midieron las concentraciones de IL-6 sérico e IgG total. Se estudió histológicamente la

15 sinovitis y la destrucción ósea en las articulaciones de las patas delanteras y traseras.

Experimento 3 Se infectó a los ratones con 4,7 x 106 UFC, 3,2 x 106 UFC, 3,9 x 106 UFC o 4,8 x 106 UFC de cepa Newman de S. aureus, clfAPYI mutante, Newman clfAPYII mutante o Newman clfA nula mutante, respectivamente. Se llevó un seguimiento de la artritis clínica y del cambio de peso hasta el día 7. Se sacrificó a los ratones en el día 8

20 y se evaluó el crecimiento renal de bacterias.

Los resultados de los experimentos 1-3 fueron muy similares, con lo que se agruparon los datos y se presentaron en conjunto.

25 En el Experimento 4 se inyectó a los ratones por vía intravenosa 5,2 x 107 UFC, 5,1 x 107 UFC o 3,3 x 107 UFC de cepa Newman de S. aureus, clfAPYI mutante o clfA nula mutante, respectivamente. Se llevó un seguimiento de la mortalidad, el cambio de peso y la artritis clínica hasta el día 10.

En el Experimento 5 se infectó a los ratones con 9,4 x 106 UFC, 7,9 x 106 UFC, 10,7 x 106 UFC o 9,8 x 106 UFC de

30 S. aureus cepa LS-1, LS-1 clfAPYI mutante, LS-1 clfAPYII mutante o LS-1 clfA nula mutante, respectivamente. Mortalidad, se llevó un seguimiento de la artritis clínica y del cambio de peso hasta el día 16.

Inyección intraauricular de bacterias

35 Se inyectó en una articulación rotuliana por ratón 2,4 x 104 UFC, 2,4 x 104 UFC, o 3,4 x 104 UFC de cepa Newman natural, clfAPYI mutante o clfA manipulada genéticamente mutante, respectivamente, en 20 µl de PBS. N = 10 por grupo. Se sacrificó a los ratones 3 días más tarde, y se recogieron las articulaciones rotulianas para estudio histopatológico.

40 Vacunación con ClfA recombinante natural y mutante

Se disolvió rClfA40-559 purificada, rClfAPY 40-559 (es decir, rClfAPYI) o BSA en suero fisiológico salino y se emulsionó a 1:1 en adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories). Se inyectaron 200 µl de la emulsión que contenían 30 µg (= 0,53 nmol) de proteína por vía subcutánea (s.c.) en el día 0. Se realizó una primera inmunización

45 de refuerzo con 30 µg de proteína en suero fisiológico salino en adyuvante de Freund incompleto en el día 11. Se llevó a cabo una segunda inmunización de refuerzo en el día 21. En el día 30 se sangró a los ratones y se congeló el suero para un análisis posterior de las respuestas de anticuerpos.

En el día 31, se infectó a 14-15 ratones por grupo por inyección i.v. de 4,0 x 106 UFC/ratón para inducción de artritis

50 séptica, o por 2,3 x 107 UFC/ratón para inducción de sepsis. Se llevó un seguimiento de artritis clínica, cambio de peso y mortalidad durante 11 y 15 días, respectivamente. Se evaluó el crecimiento bacteriano en los riñones en el experimento de artritis séptica.

Evaluación clínica de ratones infectados

55 La evaluación clínica se realizó en modo ciego. Se inspeccionó visualmente cada extremidad. La inspección produjo una puntuación de 0 a 3 (0, sin tumefacción ni eritema; 1, tumefacción y/o eritema leve; 2, tumefacción y/o eritema moderado; 3 tumefacción y/o eritema intenso). El índice artrítico se elaboró sumando las puntuaciones de las cuatro extremidades de un animal. También se examinó el estado global de cada ratón evaluando los signos de inflamación

sistémica, es decir, disminución de peso, reducción de la alerta y pelaje deslucido. En casos de infección sistémica grave, cuando se consideró que un ratón estaba demasiado enfermo para sobrevivir otras 24 h, se le sacrificó por dislocación cervical y se le consideró muerto a causa de sepsis.

5 Estudio histológico

El estudio histológico de las articulaciones se realizó usando una modificación (8) de un procedimiento descrito anteriormente (18).

10 Estudio bacteriológico de riñones infectados

Se diseccionaron asépticamente los riñones, se mantuvieron en hielo, se homogeneizaron, se diluyeron en serie en PBS y se extendieron en placas de agar en sangre. Después de 24 h de incubación a 37°C se determinó el número de UFC por par de riñones.

Medida de IgG en suero

Se midieron las concentraciones en suero de IgG total mediante la técnica de inmunodifusión radial (19). Se adquirió un patrón de IgG de cabra antirratón e IgG de ratón en Southern Biotech, Birmingham, AL.

20 Anticuerpos específicos -ELISA

Se obtuvieron muestras séricas de ratones inmunizados 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Se midió la respuesta sérica de anticuerpos específica contra rClfA y rClfAPY mediante ELISA. Se cubrieron

25 microplacas (96 pocillos; Nunc) con 5 µg/ml de proteína recombinante en PBS. Se diluyó agente de bloqueo, muestras séricas, anticuerpos biotinilados y ExtrAvidinproxidasa en PBS. El ensayo se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Se diluyeron todas las muestras séricas a 1:20.000, y se monitorizó la respuesta de anticuerpos en forma de absorbancia a 405 nm.

30 En una segunda ejecución, para obtener una medida más precisa de las respuestas de anticuerpos específicos en los diferentes grupos de inmunización, se determinaron las respuestas para varias diluciones en suero. Así, se diluyeron todas las muestras séricas a 1:5.000, 1:20.000, 1:80.000 y 1:320.000, y se monitorizó la respuesta de anticuerpos en forma de absorbancia a 405 nm.

35 Análisis de IL-6

El valor sérico de IL-6 se detectó por un procedimiento descrito anteriormente (20).

Análisis estadístico

40 La evaluación estadística se realizó usando la prueba U de Mann-Whitney. Se consideró el valor P < 0,05 como significativo. Los datos se refieren en forma de medianas, intervalos intercuartílicos e intervalos centrales del 80%, salvo que se mencione lo contrario.

45 RESULTADOS El intercambio de dos aminoácidos necesarios para unión de ClfA a fibrinógeno obstaculiza el desarrollo de artritis séptica y sepsis

50 Se modificaron dos aminoácidos (P336 y Y338) de los que se sabe que son necesarios para la unión a fibrinógeno por ClfA mediante intercambio alélico para crear mutantes de cepas Newman y LS1 que expresaban una proteína ClfA de no unión a fibrinógeno en la superficie celular. Se midió el nivel de expresión y la integridad de la proteína por Western blotting que estableció que existía una buena expresión de las proteínas mutantes en la superficie bacteriana y que la proteína expresada tenía el tamaño correcto.

55 Se investigó la capacidad de Newman natural y Newman clfA P336S Y338A (clfAPYI) para provocar artritis séptica. La artritis séptica se indujo mediante inoculación intravenosa de 3,5 x 106 a 5,0 x 106 unidades de formación de colonias (UFC) y 3,2 x 106 a 6,0 x 108 UFC de Newman natural y clfAPYI mutante, respectivamente. Se estudió el desarrollo de artritis clínicamente durante 7 días. La clfAPYI mutante provocó una artritis significativamente menos grave que la

cepa natural en todo el periodo del experimento (P > 0,001, Fig. 1 A). La frecuencia de artritis era inferior para clfAPYI Newman en la mayor parte de los puntos de tiempo (Fig. 6).

Inesperadamente, parece que la nueva composición de aminoácidos en la molécula ClfAPYI se ajusta a la

5 interacción con la defensa antibacteriana del hospedador. Para verificar esta posibilidad, se preparó una nueva construcción donde diferentes aminoácidos se sustituyeron por P336 y Y338 (clfA P336A Y338S: clfAPYII). Los ratones a los que se inocularon 3,9 x 106 UFC de clfAPYII Newman desarrollaron artritis en la misma medida que la clfAPYI mutante (Fig. 1A), y con una frecuencia similar (Fig. 6). Este resultado sugiere intensamente que la pérdida de unión a fibrinógeno es responsable del nivel reducido de artritis.

10 Es posible que la ClfA intervenga en el desarrollo de artritis por mecanismos que no implican unión a fibrinógeno. Para comprobarlo se comparó un mutante de deleción de ClfA que carece de proteína ClfA con mutantes que expresan la proteína modificada de ClfA de no unión a fibrinógeno. Sin embargo, los ratones que fueron infectados con de 4,3 x 106 a 4,8 x 106 UFC de clfA nula mutante desarrollaron artritis de una forma no diferente a los ratones

15 infectados con clfAPYI y clfAPYII mutante (Fig. 1A). La frecuencia de artritis fue asimismo indistinguible (Fig. 6).

Se investigaron también histológicamente las articulaciones infectadas. La sinovitis en ratones de clfAPYI Newman infectados fue significativamente más leve que en ratones no manipulados genéticamente infectados en los experimentos 1 y 2 (P = 0,02 y 0,001, respectivamente). La destrucción ósea, una causa principal de secuelas en la

20 artritis séptica humana, estuvo casi ausente en las muestras infectadas con clfAPYI Newman (Experimento 2, P = 0,001). La sinovitis y la destrucción ósea inducidas por la clfA nula mutante Newman fueron también menos pronunciadas que en ratones no manipulados genéticamente infectados con cepa Newman (P = 0,003 y 0,006, respectivamente), si bien algo más grave que en el grupo clfAPYI Newman, aunque no demasiado.

25 A continuación se analizaron las consecuencias metabólicas de las mutaciones de ClfA para el proceso infeccioso. Los ratones infectados con la cepa Newman natural perdieron aproximadamente el 30% de su peso corporal durante el periodo del experimento. Los ratones que fueron infectados con los mutantes deficientes en unión a fibrinógeno clfAPYI Newman y clfAPYII Newman apenas perdieron peso (P > 0,0001 frente al tipo natural). En cambio, la clfA nula mutante Newman tuvo un efecto intermedio en la pérdida de peso, provocando un valor significativamente

30 menor que la cepa natural, pero significativamente mayor que las cepas mutantes de cltAPYI y clfAPYII (P ≤ 0,02 en la mayoría de los casos, Fig. 1B).

Las concentraciones séricas de IL-6, una medida de la respuesta inflamatoria sistémica, fueron analizadas en el día 7-8 de infección. El patrón de expresión de IL-6 fue similar a los cambios de peso. La cepa Newman natural evocó

35 altas concentraciones séricas de IL-6 (4,8 (2,8, 5,7) ng/ml), clfAPYI mutante Newman evocó valores de IL-6 considerablemente menores (0,2 (0,07, 2,4) ng/ml, P< 0,0001) mientras que la clfA nula mutante Newman produjo una respuesta intermedia (2,5 (1,3, 3,2) ng/ml) con diferencias significativas para el grupo natural y clfAPYI (P = 0,009 y P = 0,008, respectivamente) (mediana, intervalo intercuartílico).

40 El crecimiento de bacterias en los riñones fue significativamente mayor en ratones infectados con cepa Newman natural, en comparación con clfAPY mutantes Newman y clfA nula mutante Newman (P < 0,0001, P = 0,011, y P = 0,005, respectivamente; Figura 2). Los ratones infectados con clfA nula mutante Newman tuvieron significativamente más crecimiento bacteriano en los riñones que los ratones infectados con clfAPYI Newman (P = 0,0005, Fig. 2).

45 El valor total en suero de IgG en ratones se midió en el día 7-8 de infección. Se observó un aumento significativamente menor de las concentraciones de IgG en los grupos infectados con clfAPYI Newman y clfA nula mutante Newman en comparación con ratones infectados con la cepa natural (3,1 (1,2, 4,9); 2,3 (1,0, 2,6); y 6,4 (5,0, 11,0), respectivamente (mediana, intervalo intercuartílico); P ≤ 0,0003). No se apreciaron diferencias significativas entre los dos grupos mutantes.

50 La mortalidad fue del 17% en los ratones infectados con cepa Newman natural, del 0% en los grupos clfAPYI Newman y clfAPYII mutante y del 30% en el grupo de clfA nula mutante Newman. Se produjeron diferencias estadísticamente significativas en la mortalidad entre los grupos natural y clfAPYI, y entre los grupos clfAPYI y clfA nula mutante (P < 0,05 y P < 0,01, respectivamente).

55 Parece que los signos directos e indirectos de inflamación sistémica son menores en ratones infectados con S. aureus que expresa ClfA que es deficiente en unión a fibrinógeno. Inesperadamente, la cepa que carecía de expresión de ClfA indujo en total más inflamación sistémica que una cepa que expresa ClfAPY mutante.

La sepsis se indujo en ratones aumentando la dosis de inoculación de S. aureus. Se infectó a los ratones con 5,2 x 107 UFC de Newman natural, 5,1 x 107 UFC de clfAPYI mutante Newman y 3,3 x 107 UFC de clfA nula mutante Newman. En un plazo de 5 días se sacrificó a todos los ratones no manipulados genéticamente infectados, pero sólo un ratón clfAPYI mutante de diez había muerto después de 10 días de infección (P < 0,0001, Fig. 3). Los ratones 5 infectados con ClfA nula mutante también sobrevivieron un tiempo significativamente más breve que los ratones infectados con clfAPYI mutante (P < 0,0001, Fig. 3). En este experimento los ratones sometidos a prueba de provocación con ClfA nula mutante desarrollaron significativamente más artritis que los grupos de clfAPYI mutante, mientras que al mismo tiempo perdieron significativamente más peso (Fig. 7 y 8). Así, por analogía con las medidas de inflamación sistémica en el experimento de artritis sépticas, la supervivencia de los ratones se prolonga si se

10 expresa la molécula de ClfA, siempre que carezca de las propiedades de unión a fibrinógeno.

Inyección de bacterias en articulaciones

Para probar si la reacción inflamatoria en la articulación depende de la unión a fibrinógeno, se inyectó cepa Newman

15 natural, Newman clfAPYI o Newman clfA nula directamente en una articulación rotuliana de los ratones, sorteando así el compartimento sistémico. La sinovitis, incluida la infiltración polimorfonuclear de la cavidad articular, y la destrucción ósea se estudiaron mediante histología 3 días más tarde. Los ratones recibieron 2,4 x 104 UFC de cepa natural, 2,4 x 104 UFC de ClfA nulo mutante, o 3,4 x 104 UFC de clfAPYI mutante en una rodilla. El índice histológico de sinovitis e infiltración polimorfonuclear en la cavidad articular fue de 0,25 (0, 3,0) para rodillas infectadas con cepa

20 natural, 2,38 (0,25, 3,0) para ClfA nula mutante y 0,25 (0, 0,25) para clfAPYI mutante (mediana, intervalo intercuartílico). El índice histológico para destrucción de hueso fue de 0 (0, 1,0) para cepa natural, 1,0 (0, 1,0) para ClfA nula mutante y 0 (0, 0) para clfAPYI mutante (mediana, intervalo intercuartílico; P = 0,01 entre clfAPYI mutante y ClfA nula mutante). Dado que la clfAPYI mutante evocó muy poca sinovitis y destrucción, pese al hecho de que se suministró un 42% más de esa cepa a ratones que las otras cepas, se concluye que la unión a fibrinógeno

25 promovida por ClfA es necesaria para una respuesta inflamatoria máxima dentro de la articulación. De nuevo, la ausencia de expresión de ClfA promovió la inflamación en comparación con ClfA mutante deficiente en unión a fibrinógeno.

Mutación PY en cepa LS-1

30 Para determinar si la capacidad de ClfA de unión a fibrinógeno influye en la virulencia de otras cepas de S. aureus, se procedió a transducción de mutaciones de clfAPYI, clfAPYII y clfA nulas en TSST-1 que expresa la cepa de S. aureus LS-1. Se sometió a los ratones a prueba de provocación con 9,4 x 106 UFC de LS-1 natural, 7,9 x 106 UFC de LS-1 clfAPYI, 10,7 x 106 UFC de LS-1 clfAPYII o 9,4 x 106 UFC de la cepa LS-1 de clfA nula mutante. Se estudió

35 la sepsis con un seguimiento de la tasa de supervivencia. Después de 16 días sólo el 40% de ratones sometidos a prueba de provocación con la cepa natural estaban vivos mientras que el 90% de los ratones con prueba de provocación con los grupos de clfAPYI mutante y clfA nula mutante y el 80% de los ratones infectados con clfAPYII mutante estaban vivos (Fig. 4). clfAPYI mutante y ClfA nulo mutante de LS-1 fueron significativamente menos virulentos (P = 0,014, P = 0,05 y P = 0,03, respectivamente).

Inmunización con proteínas ClfA recombinantes

El efecto de la vacunación con proteína recombinante de dominio A de ClfA natural (rClfA) y proteína ClfAPYI mutante (rClfAPY) se estudió en el modelo de artritis séptica y en el modelo de sepsis. Los ratones fueron 45 sensibilizados y después se les reforzó dos veces con BSA de proteína de control, rClfA o rClfAPY, y posteriormente fueron infectados con 4,0 x 106 UFC de cepa Newman de S. aureus para inducir artritis séptica, o con 2,3 x 107 UFC de cepa Newman para inducir sepsis. La inmunización con rClfAPY (es decir, dominio A de proteína recombinante ClfAPYI) protegió significativamente contra la muerte por sepsis en comparación con los ratones de control (P = 0,01, Fig. 5) mientras que la inmunización con rClfA no obtuvo una protección significativa. Un día antes de la 50 infección bacteriana se produjo una respuesta de anticuerpos en suero específica muy superior para rClfAPY y rClfA en ratones inmunizados con rClfAPY (A405 = 0,39 (0,33, 0,56) y 0,71 (0,52, 0,81)) en comparación con ratones inmunizados con rClfA (A405 = 0,13 (0,07, 0,17) y 0,15 (0,10, 0,24), P < 0,0001 en las dos comparaciones (mediana, intervalo intercuartílico)). Los animales inmunizados de control tenían sólo niveles basales (A405 nm=0 y0,01(0, 0,01) (mediana, intervalo intercuartílico)). Los ratones inmunizados destinados a ser infectados con la dosis

55 bacteriana artrítica inferior mostraron respuestas a anticuerpos similares para rClfA y rClfAPY que los ratones en los que se indujo la sepsis (datos no mostrados). La inmunización con rClfA y con rClfAPY protegió contra el desarrollo de artritis, aunque la protección no era significativa (Fig. 9).

Durante el día 5 a 9 después de infección la pérdida de peso se redujo significativamente en los ratones

inmunizados con rClfAPY y rClfA, en comparación con los ratones de control (datos no mostrados).

Se observó una tendencia a reducción del crecimiento bacteriano en los riñones de los ratones inmunizados con rClfAPY o rClfA en el día 11 después de la infección (BSA: 38 (3, 436); rClfAPY: 7 (2, 17); rClfA: 10 (7, 54) x 107 5 UFC/par de riñones).

Para obtener una medida más precisa de las respuestas de anticuerpos específicos en los diferentes grupos de inmunización, las respuestas se determinaron para varias diluciones séricas (la segunda pasada). Los datos muestran que se produjeron valoraciones muy probablemente superiores de anticuerpos específicos en sueros de

10 ratones inmunizados con rClfAPY en antígenos rCtfAPY y rClfA naturales, tanto en los ratones que no serían infectados con la dosis bacteriana para sepsis y artritis, respectivamente, como en el suero de ratones inmunizados con rClfA natural, dado que se produjeron respuestas a anticuerpos significativamente superiores medidas en forma de absorbancia en ratones inmunizados con rClfAPY para cada dilución sérica en todas las comparaciones (P < 0,0001 a P = 0,008, Figura 12-15). La inmunización con BSA evocó sólo una respuesta de anticuerpos basal.

CONCLUSIÓN

Los resultados sugieren intensamente que la interacción ClfA-fibrinógeno es crucial para la virulencia bacteriana y el resultado patológico. La capacidad de ClfA para unirse a fibrinógeno se asoció con una mayor virulencia en términos

20 de capacidad de causar muerte por sepsis. En las dos cepas estafilocócicas sometidas a ensayo, una clfAPY mutante indujo menos muerte por sepsis que la cepa natural. Además, la gravedad de la artritis se redujo de modo acusado en ratones infectados con la clfAPY mutante de no unión a fibrinógeno.

Un mecanismo probable para la promoción de virulencia por la interacción de superficie celular fibrinógeno

25 bacteriana es la inhibición de la fagocitosis de neutrófilos (5). Los neutrófilos son cruciales para la defensa del hospedador en la primera fase de infección por S. aureus (13). Sin neutrófilos, el crecimiento bacteriano aumenta de modo acusado en la sangre y los riñones, y la frecuencia de artritis y de mortalidad aumenta. La inhibición mediada por fibrinógeno de la fagocitosis de neutrófilos por ClfA podría explicar al menos en parte la virulencia más pronunciada de natural S. aureus en comparación con clfAPY mutantes. La unión de fibrinógeno a ClfA podría

30 reducir la opsonofagocitosis por neutrófilos al reducir el depósito de opsonina o el acceso a opsoninas por receptores de neutrófilos. Alternativamente, el fibrinógeno ligado podría bloquear la unión de un factor de hospedador protector desconocido a S. aureus. Otra opción es que la interacción fibrinógeno-ClfA promueve el paso bacteriano desde el vaso sanguíneo en el tejido o promueve la colonización en los tejidos.

35 Inesperadamente, los datos de los autores de la invención muestran también que la ClfA nula mutante era más virulenta que las cepas de clfAPY mutante. Posiblemente la proteína ClfA tiene funciones in vivo distintas que la interacción con fibrinógeno. Esta interacción es claramente desventajosa para el hospedador tal como se muestra en este estudio. En la actualidad no se han establecido correspondencias adecuadas con otras funciones de ClfA pero la agregación de plaquetas no dependiente del fibrinógeno ejercida por ClfA podría producir el atrapamiento de

40 grandes cantidades de S. aureus en circulación con la ulterior eliminación de los complejos de bacterias-plaquetas a través del sistema reticuloendotelial. Dicha eliminación de estafilococos mediada por agregación de plaquetas tendría lugar fácilmente en las cepas naturales y clfAPY mutadas pero no en ClfA manipulada genéticamente. Mientras en la cepa natural la interacción con fibrinógeno podría oscurecer los otros acontecimientos, en las clfAPY mutantes dicha eliminación bacteriana podría ser altamente beneficiosa para el hospedador.

45 El ClfA mutante manipulado genéticamente protegía contra la muerte por sepsis en el mismo grado que la mutación de clfAPY en la cepa LS-1 de S. aureus, pero protegía menos, o nada, en la cepa Newman. El impacto global de expresión de ClfA en la virulencia bacteriana podría diferir entre distintas cepas de S. aureus dependiendo del nivel de expresión y de la presencia de otros factores de virulencia.

50 La cuestión sobre si la clfAPY mutante muestra una virulencia igual o inferior una vez que está en la cavidad articular adquiere cierta importancia teniendo presente que en el líquido sinovial inflamado el fibrinógeno y la fibrina son abundantes. Los datos de los autores de la invención sugieren que la clfAPY mutante es menos destructiva para el cartílago y el hueso.

55 El efecto protector del mutante P338Y338 de no unión a fibrinógeno del domino A de ClfA recombinante fue mayor que para la rClfA natural. La inmunización con ClfAPY indujo muy probablemente una mejor respuesta inmunitaria dado que se evocaron mayores respuestas de anticuerpos específicos contra la proteína ClfA inmunógena y natural. De forma más importante, indujo una respuesta inmunitaria protectora superior contra la muerte por sepsis que la ClfA

natural.

En conclusión, los resultados de los autores de la invención muestran que rClfAPY es un mejor candidato de vacuna que la ClfA recombinante natural. Los autores de la invención conjeturan que la unión de fibrinógeno por proteína 5 ClfA natural durante la fase de inmunización disminuye la presentación de antígenos debido a la ocultación de epítopos importantes en la molécula de ClfA y con ello degrada la producción de anticuerpos específicos.

Ejemplo 2

10 Truncamiento de región A de rClfA que comprende N2 y N3 (rClfA 221-559)

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

En este ejemplo se siguieron los protocolos indicados en el Ejemplo 1 y se usó:

15 -rClfA 221-559 (es decir, truncamiento de región A de ClfA que comprende N2 y N3 correspondiente a aminoácidos 220-559) -rClfAPY221-559; y -BSA.

20 Había también 15 ratones NMRI hembra por grupo que tenían 8 semanas de vida al inicio de los experimentos. En este Ejemplo, las construcciones usadas para inmunización fueron truncamiento N2N3 natural/salvaje de ClfA, truncamiento N2N3 de ClfA con mutación PY tal como se define en el Ejemplo 1. Se usó BSA como control.

25 Vacunación con ClfA recombinante natural y mutante

Los ratones fueron inmunizados con rClfA 221-559, rClfAPY 221-559 o BSA de acuerdo con el protocolo del Ejemplo

1.

30 Se disolvió rClfA221-559, rClfAPY221-559 (es decir, subdominios N2 y N3 de proteína recombinante A de ClfAPYI) o BSA purificados en PBS y se emulsionó 1:1 en adyuvante completo de Freund. Se inyectaron 200 µl de la emulsión que contenían 30 µg (= 0,79 nmol) de proteína s.c. en el día 0. La primera inmunización de refuerzo con 30 µg de proteína en suero fisiológico salino en adyuvante de Freund incompleto se realizó en el día 12. La segunda inmunización de refuerzo se realizó en el día 22. En el día 31 se sangró a los ratones y se congeló el suero para

35 análisis posterior de respuestas de anticuerpo.

Anticuerpos específicos -ELISA

Las muestras séricas de ratones inmunizados se obtuvieron 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo.

40 La respuesta sérica de anticuerpos específicos contra rClfA221-559 y rClfAPY221-559 se midió mediante ELISA. Se cubrieron las microplacas (96 pocillos; Nunc) con 5 µg/ml de proteína recombinante en PBS. Se diluyó el agente de bloqueo, las muestras séricas, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina-proxidasa en PBS. El ensayo se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras séricas se diluyeron 1:5.000, 1:20.000, 1:80.000 y 1:320.000, y la respuesta a anticuerpos se monitorizó en forma de absorbancia a 405 nm.

RESULTADOS:

RESPUESTA DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS:

50 La respuesta de anticuerpos se midió por absorbancia en un ensayo ELISA, como en el Ejemplo 1, con cuatro diluciones séricas diferentes. Los datos obtenidos fueron muy similares a los datos del Ejemplo 1.

Se encontró que la inmunización con rClfAPY221-559 produjo muy probablemente valoraciones superiores de anticuerpos específicos en rClfA221-559 natural y rClfAPY221-559, que la inmunización con rClfA221-599 natural,

55 dado que existían respuestas a anticuerpos significativamente más elevadas medidas en forma de absorbancia en ratones inmunizados con rClfAPY221-559 en cada dilución sérica para todas las comparaciones salvo una (P = 0,001 a 0,025, véanse Figuras 16 y 17). La inmunización con BSA evocó sólo niveles basales de respuesta de anticuerpos.

CONCLUSIÓN

Los autores de la invención encontraron que la inmunización con una proteína rClfAPY221-559 produjo respuestas a anticuerpos significativamente superiores al inmunógeno y a la proteína ClfA natural que la inmunización con la 5 proteína natural.

Basándose en estos hallazgos, los autores de la invención concluyen que la inmunización PY, con independencia de si la proteína PY comprende los aminoácidos 40 a 550 como en el Ejemplo 1 o los aminoácidos 221 a 559 como en el Ejemplo 2, induce una mejor respuesta inmunitaria que la inmunización con ClfA natural del tamaño

10 correspondiente.

Ejemplo 3

Truncamiento de región A de ClfA A (truncamiento cerradura δ/delta) MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

En este ejemplo se usaron los protocolos indicados en el Ejemplo 1 y se usó la siguiente construcción:

20 -rClfA 221-531 (es decir, truncamiento de la región A de rClfA que comprende N2 y N3 de los aminoácidos 220-559 pero sin el péptido de cerradura de aminoácidos 532-538 y los posteriores residuos ricos en prolina.

En el grupo había 15 ratones NMRI hembra que tenían 8 semanas de vida al inicio del experimento. En este Ejemplo, se usó la construcción anterior para inmunización. Los ratones fueron inmunizados con el truncamiento

25 anterior de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1.

Vacunación con ClfA recombinante natural y mutante

Se disolvió rClfA221-531 purificada en PBS y se emulsionó 1:1 en adyuvante completo de Freund. Se inyectaron 200

30 µl de la emulsión que contenían 0,79 nmol de proteína s.c. en el día 0. La primera inmunización de refuerzo con 0,79 nmol de proteína en suero fisiológico salino en adyuvante de Freund incompleto se realizó en el día 12. La segunda inmunización de refuerzo se realizó día 22. En el día 31 se sangró a los ratones y se congeló el suero para análisis posterior de respuestas a anticuerpos.

35 Anticuerpos específicos -ELISA

Las muestras séricas de ratones inmunizados se obtuvieron 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Las concentraciones séricas de anticuerpos específicos se midió por ELISA. Se cubrieron las microplacas (96 pocillos; Nunc) con 4,6 µg/ml de proteína rClfA221-531 que es equimolar a 5 µg/ml de rClfA221-559 y rClfAPY221

40 559 de los Ejemplos 1 y 2. Se diluyó el agente de bloqueo, las muestras séricas, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina-proxidasa en PBS. El ensayo se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras séricas se diluyeron 1:5.000, 1:20.000, 1:80.000 y 1:320.000, y la respuesta a anticuerpos se monitorizó en forma de absorbancia a 405 nm.

45 RESULTADOS:

La respuesta de anticuerpos se midió por absorbancia en un ensayo ELISA, como en el Ejemplo 1. Se encontró que la inmunización con rClfA221-531 produjo una respuesta inmunitaria, medida como una respuesta de anticuerpos específicos (Figura 18).

CONCLUSIÓN:

Los autores encuentran que rClfA221-531 actúa como un inmunógeno, dado que el antígeno evoca una respuesta de anticuerpos específicos. 55

REFERENCIAS

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17. O’Connell DP, Nanavaty T, McDevitt D, Gurusiddappa S, Höök M, Foster TJ (1998) The fibrinogen-binding MSCRAMM (clumping factor) of Staphylococcus aureus has a Ca2++-dependent inhibitory site. J Biol Chem 273:6821-6829.

40 18. Sakiniene E, Bremell T, Tarkowski A (1999) Complement depletion aggravates Staphylococcus aureus septicaemia and septic arthritis. Clin Exp Immunol 115:95-102.

19. Mancini G, Carbonara AO, Heremans JF (1965) Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry 2:235-254.

20. Bremell T, Abdelnour A, Tarkowski A (1992) Histopathological and serological progression of experimental 45 Staphylococcus aureus arthritis. Infect Immun 60:2976-2985.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> The Provost Fellows and Scholars of the College of the Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth Near 50 Dublin

<120> Tratamiento de infecciones microbianas

<130> 31546WO 55

<160> 14

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 933

<212> PRT

<213> Artificial 5

<220>

<223> Secuencia de proteínas de longitud completa (naturales) ClfA recombinantes

<400> 1 10

<210> 2

<211> 1560 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Regiones (naturales) de dominio A ClfA recombinantes N1 N2 N3 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1560)

15 <400> 2

<210> 3

<211> 520 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 3

<210> 4

<211> 520 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Regiones de dominio A ClfA N1 N2 N3 con alteraciones (ClfA P336S Y338A)

<400> 4

<210> 5

<211> 520 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Regiones de dominio A ClfA N1 N2 N3 con alteraciones (ClfA P336A Y338S) 10

<400> 5

<210> 6

<211> 530 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Región A rClfA natural con residuos en terminales N y C adicionales 10

<400> 6

<210> 7

<211> 530 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Región A rClfAPYI natural con residuos en terminales N y C adicionales 10

<400> 7

<210> 8

<211> 530 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Región A rClfAPYII natural con residuos en terminales N y C adicionales 10

<400> 8

<210> 9

<211> 339 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Residuos rClfA 221-559

<400> 9

<210> 10

<211> 349 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Residuos rClfA 221 a 559 con residuos en terminales N y C adicionales 10

<400> 10

<210> 11

<211> 339 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> PY rClfA 221 a 559 10

<400> 11

<210> 12

<211> 349 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> PY rClfA 221 a 559 con residuos en terminales N y C adicionales 10

<400> 12

<210> 13

<211> 321 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Residuos rClfA 221 a 531 con residuos en terminales N y C adicionales (truncamiento cerradura delta) 10

<400> 13

<210> 14

<211> 311 5 <212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Residuos rClfA 221 a 531 (truncamiento cerradura delta)

<400> 14

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o una secuencia con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de 5 SEQ ID NO. 1 o un fragmento de la misma que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión a fibrinógeno (Región A), caracterizado por al menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 para producir una proteína de unión a fibrinógeno recombinante con capacidad reducida o que carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno que estimula una mayor respuesta inmunitaria que la proteína ClfA

   10 natural, para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas.
2. 2. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante o un fragmento del mismo para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con la reivindicación 1 donde la infección es una infección por Staphylococcus aureus.
3. 3. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante o un fragmento del mismo para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con la reivindicación 1 donde la infección es una sepsis, artritis séptica y/o endocarditis.

   20 4. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante o un fragmento del mismo para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante o un fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO. 3, 6, 9, 10 y 13 o secuencias con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de SEQ ID NO: 3, 6, 9, 10 y

   25 13 con al menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en los residuos de aminoácidos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527.
4. 5. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante o un fragmento del mismo para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4

   30 donde el ClfA o un fragmento del mismo comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en los residuos de aminoácidos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527.
5. 6. El factor de aglutinación (ClfA) estafilocócico recombinante o un fragmento del mismo para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5

   35 donde el ClfA o un fragmento del mismo comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en los residuos de aminoácidos Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527.
6. 7. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante o un fragmento del mismo, para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6

   40 donde la unión no covalente que tiene lugar durante el proceso de anclaje-llave-cerradura de la proteína en el fibrinógeno se reduce o se evita.
7. 8. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la sustitución o

   45 deleción de aminoácidos reduce la interacción no covalente con fibrinógeno evitando o reduciendo la unión a ligando con la bolsa hidrófoba que separa las subregiones N2 y N3 de la Región A de la proteína de unión a fibrinógeno.
8. 9. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el ClfA o un

   50 fragmento del mismo comprende la región de unión a fibrinógeno sin los residuos de aminoácidos de péptidos de cerradura.
9. 10. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el ClfA o un

   55 fragmento del mismo comprende los residuos de aminoácidos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 que están sustituidos por Ala o Ser.
10. 11. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la proteína de

    unión a fibrinógeno estafilocócica recombinante tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO. 1 y 3 a 14 donde el residuo P336 y/o Y338 de SEQ ID NO: 1, 3, 6, 9, 10 y 13 están sustituidos por serina y/o alanina para producir rClfAP336S Y33aA o rClfAP336A Y338S.

    5 12. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el ClfA o un fragmento del mismo comprende la proteína de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno mínima y/o un fragmento de las mismas.

    10 13. El factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el ClfA o un fragmento del mismo comprende

    Subregiones N1 a N3, que cubren residuos de aminoácidos 40 a 559 de la región de unión a fibrinógeno (Región A);

    15 o Subregiones N2 y N3, que cubren residuos de aminoácidos 221 a 559 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA (Región A).

11. 14.

    El uso del factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o una secuencia con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia 20 de SEQ ID NO. 1 o un fragmento de la misma que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión a fibrinógeno (Región A), con al menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en los residuos de aminoácidos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 para producir una proteína de unión a fibrinógeno recombinante con capacidad reducida o que carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno que estimula una mayor respuesta inmunitaria que la proteína ClfA natural en la

    25 fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas.

12. 15.

    Una construcción de ácido nucleico, vector de expresión o célula hospedadora que expresa un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o una secuencia con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO. 1 o un 30 fragmento de la misma que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión a fibrinógeno (Región A), con al menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 para producir una proteína de unión a fibrinógeno recombinante con capacidad reducida o que carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno que estimula una mayor respuesta inmunitaria que la proteína ClfA natural, para su uso en el tratamiento

    35 o profilaxis de infecciones estafilocócicas.
13. 16. Una vacuna que comprende un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o una secuencia con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO. 1 o un fragmento de la misma que comprende al menos los residuos de

    40 aminoácidos 221 a 531 de la región de unión a fibrinógeno (Región A), con al menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 para producir una proteína de unión a fibrinógeno recombinante con capacidad reducida o que carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno que estimula una mayor respuesta inmunitaria que la proteína ClfA natural, para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas.
14. 17. Una composición farmacéutica inmunógena que comprende un factor de aglutinación A (ClfA) estafilocócico recombinante de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o una secuencia con al menos el 85%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO. 1 o un fragmento de la misma que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión a fibrinógeno (Región A), con al

    50 menos una sustitución o deleción de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 para producir una proteína de unión a fibrinógeno recombinante con capacidad reducida o que carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a fibrinógeno que estimula una mayor respuesta inmunitaria que la proteína ClfA natural, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones estafilocócicas.