ES2960604T3 - Tratamiento de infecciones microbianas - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida a vacunas antigénicas microbianas, composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas y anticuerpos mejorados y su uso en el tratamiento de infecciones microbianas, particularmente aquellas de origen bacteriano, incluido el origen estafilocócico. Idealmente, la presente invención está dirigida a un MSCRAMM estafilocócico recombinante o proteínas similares a MSCRAMM, o fragmentos de las mismas, con unión reducida a su ligando huésped, para uso en terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de infecciones microbianas

Introducción

La presente divulgación se refiere a vacunas antigénicas microbianas mejoradas, composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas y anticuerpos y su uso en el tratamiento de infecciones microbianas, particularmente aquellas de origen bacteriano, incluyendo origen estafilocócico.

La resistencia a múltiples fármacos (MDR) es un problema creciente entre bacterias gram positivas, particularmente en hospitales. El uso generalizado de antibióticos y otros agentes para tratar infecciones bacterianas ha conducido al rápido desarrollo de bacterias resistentes a los agentes y muchas bacterias tienen resistencia a múltiples fármacos. Por lo tanto, existe ahora la necesidad de proporcionar terapias mejoradas para tratar estas infecciones resistentes a fármacos.

Los estafilococos son bacterias Gram-positivas de forma esférica, normalmente dispuestas en grupos irregulares parecidos a uvas. Algunos son miembros de la flora normal de la piel y las membranas mucosas de los seres humanos, otros causan supuración, formación de abscesos, una diversidad de infecciones piógenas e incluso septicemia mortal. Los estafilococos patogénicos suelen hemolizar la sangre, coagular el plasma y producir una diversidad de enzimas extracelulares y toxinas.

El géneroStaphylococcustiene al menos 30 especies. Las tres principales especies de importancia clínica sonStaphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,yStaphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureuses positivo a coagulasa, lo que lo diferencia de las demás especies. S.aureuses un patógeno importante para los seres humanos. Casi todas las personas tienen algún tipo de infección por S.aureusa lo largo de su vida, que varía en gravedad a partir de la intoxicación alimentaria o infecciones cutáneas menores a infecciones graves que amenazan la vida. Los estafilococos negativos a coagulasa son la flora humana normal que a veces causan infección, a menudo asociada con dispositivos implantados, especialmente en pacientes muy jóvenes, ancianos e inmunocomprometidos. Aproximadamente el 75 % de las infecciones causadas por estafilococos negativos a coagulasa se deben a S.epidermidis.Las infecciones debidas aStaphylococcus warneri, Staphylococcus hominis,y otras especies son menos comunes. S.saprophyticuses una causa relativamente común de infecciones del tracto urinario en mujeres jóvenes. Los estafilococos producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos. S.lugdunensistambién es relevante en un entorno clínico y está presente en aproximadamente el 5 al 10 % de los casos de endocarditis infecciosa.

La colonización por S.aureusdel cartílago articular, del cual el colágeno es un componente principal, dentro del espacio articular, parece ser un factor importante que contribuye al desarrollo de la artritis séptica. La artritis bacteriana adquirida de forma hematógena sigue siendo un problema médico grave. Esta enfermedad de las articulaciones rápidamente progresiva y altamente destructiva es difícil de erradicar. Típicamente, menos del 50 % de los pacientes infectados se recuperan sin daños graves en las articulaciones. S.aureuses el patógeno predominante aislado de pacientes adultos con osteomielitis hematógena y secundaria.

En los pacientes hospitalizados, las bacteriasStaphylococcus,tal como S.aureus,son una causa principal de infección. Las infecciones localizadas iniciales de heridas o dispositivos médicos permanentes pueden conducir a infecciones invasivas más graves tales como septicemia, osteomielitis, mastitis y endocarditis. En las infecciones asociadas con dispositivos médicos, las superficies de plástico y metal se recubren con proteínas de plasma y matriz del huésped tales como fibrinógeno y fibronectina, poco después de la implantación. Esta capacidad de S.aureusy otras bacterias estafilocócicas para adherirse a estas proteínas es esencial para el inicio de la infección. Los injertos vasculares, los catéteres intravenosos, las válvulas cardiacas artificiales y los dispositivos de asistencia cardiaca son trombogénicos y propensos a la colonización bacteriana. De las bacterias estafilocócicas, S.aureuses generalmente el patógeno más dañino de tales infecciones.

Se ha observado un aumento significativo en aislados de S.aureusque presentan resistencia a la mayoría de los antibióticos actualmente disponibles para tratar infecciones en hospitales en todo el mundo. El desarrollo de la penicilina para combatir S.aureusfue un gran avance en el control y tratamiento de infecciones. Desafortunadamente, surgieron rápidamente organismos resistentes a la penicilina y fue primordial la necesidad de nuevos antibióticos. Con la introducción de cada nuevo antibiótico, S.aureusha podido contrarrestar con plactamasas, proteínas de unión a la penicilina alteradas y proteínas de la membrana celular mutadas que permiten que la bacteria persista. Por consiguiente, han surgido S.aureusresistentes a la meticilina (MRSA) y organismos resistentes a múltiples fármacos y han establecido puntos de apoyo importantes en hospitales y hogares de ancianos de todo el mundo (Chambers, H.F., Clin Microbiol Rev, 1:173, 1988; y Mulligan, M.E., et al., Am J Med, 94:313, 1993). Hoy en día, casi la mitad de las cepas estafilocócicas que causan infecciones nosocomiales son resistentes a todos los antibióticos, excepto a la vancomicina, y parece ser sólo cuestión de tiempo antes de que la vancomicina también se vuelva ineficaz.

Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad muy fuerte y rápidamente creciente de agentes terapéuticos para tratar infecciones de estafilococos tales como S.aureus,que sean efectivos contra cepas resistentes a antibióticos de las bacterias.

En patógenos gram positivos, tales como estafilococos, estreptococos y enterococos, las proteínas, denominadas adhesinas, median estas infecciones, por ejemplo, promoviendo la colonización, la unión a coágulos sanguíneos y tejido traumatizado. Estas adhesinas superficiales microbianas específicas se denominan MSCRAMM (componentes de superficie microbiana que reconocen moléculas de matriz adhesiva) (Patti, J., et al., Ann Rev Microbiol, 48:585-617, 1994; Patti, J. y Hook, M., Cur Opin Cell Biol., 6:752-758, 1994). Las MSCRAMM reconocen y se unen específicamente a componentes de la matriz extracelular (ECM), tales como fibronectina, fibrinógeno, colágeno y elastina. Estas MSCRAMM se encuentran en muchos patógenos gram positivos y sus secuencias de aminoácidos están relacionadas, tienen un diseño modular similar y organización del dominio de unión común.

Las MSCRAMM sobre la superficie de la célula bacteriana y los ligandos dentro del tejido huésped interaccionan de una forma cerrada y clave dando como resultado la adherencia de bacterias al huésped. La adhesión es a menudo necesaria para la supervivencia bacteriana y ayuda a las bacterias a evadir los mecanismos de defensa del huésped y los desafíos de los antibióticos. Una vez que las bacterias se han adherido y han colonizado con éxito tejidos del huésped, su fisiología se altera drásticamente y los componentes perjudiciales tales como toxinas y enzimas, se secretan. Además, las bacterias adherentes a menudo producen una biopelícula y rápidamente se vuelven resistentes al efecto de muerte de la mayoría de los antibióticos.

Una bacteria puede expresar MSCRAMM que reconocen una diversidad de proteínas de la matriz. Los sitios de unión a ligandos en MSCRAMM parecen estar definidos por tramos contiguos relativamente cortos de secuencias de aminoácidos (restos). Debido a que un resto similar se puede encontrar en varias especies diferentes de bacterias, parece que estos restos funcionales se someten a la transferencia entre especies (Patti y Hook, Cur Opin Cell Biol, 6:752-758, 1994). Además, una única MSCRAMM a veces puede unirse a varios ligandos de la ECM.

Las MSCRAMM pueden mediar la infección por la unión a proteínas, incluyendo fibrinógeno (Fg) y/o fibronectina (Fn), etc. El fibrinógeno y la fibronectina son proteínas que se encuentran en el plasma sanguíneo y desempeñan un papel clave en la hemostasia y la coagulación.

El fibrinógeno está compuesto por seis cadenas polipeptídicas, dos cadenas Aa, dos Bp y dos<y>. La parte C-terminal de la cadena<y>es biológicamente importante e interacciona con la integrina plaquetaria durante la adherencia y agregación plaquetaria. Es esta región la que también es diana deStaphylococcus aureus,dando como resultado la aglutinación celular dependiente del fibrinógeno y la adherencia tisular.

Staphylococcus aureustiene varias proteínas expresadas en superficie que estimulan la activación y la agregación de plaquetas. Las proteínas MSCRAMM deStaphylococcus aureusincluyen, pero no se limitan a, las siguientes:

- Factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno;

- Factor B de aglutinación (ClfB) de la proteína de unión al fibrinógeno;

- Proteína A de unión a fibronectina-fibrinógeno (FnBPA);

- Proteína B de unión a fibronectina-fibrinógeno (FnBPB); y

- Proteínas de superficie de S. aureus SasA, SasG, SasK, etc.

La Tabla 1 a continuación describe una selección de diversas proteínas de superficie ancladas a la pared celular deStaphylococcus aureus.

Tabla 1

Otras bacterias estafilocócicas expresan proteínas expresadas en la superficie (MSCRAMM) que son similares a los factores de aglutinación o proteínas de unión enumerados anteriormente. Estos incluyen, pero no se limitan a: - SdrF, SdrG y SdrH de S.epidermidisen donde se ha demostrado que SdrG/F se une a fibrinógeno y colágeno.

- Fbl deStaphylococcus lugdunensises una proteína de unión a fibrinógeno. Fbl es un miembro de la familia Sdr, un grupo de proteínas de la superficie celular de estafilococos que contienen una región de repetición serina-aspartato característica. El dominio de unión a fibrinógeno de Fbl se ha mapeado a 313 aminoácidos, y muestra un 62 % de identidad con la región correspondiente en el factor de aglutinación A (ClfA) deStaphylococcus aureus.

Otras proteínas/adhesinas de unión a ligando incluyen proteínas Isd (determinantes de superficie regulados por hierro), que, aunque todas ellas no son MSCRAMMper se(p. ej., IsdB e IsdH) promueven la adhesión de bacterias a componentes de la matriz extracelular y se denominan en la presente memoria "proteínas similares a MSCRAMM". Se sabe que IsdA promueve la adhesión a células escamosas, y tiene una afinidad débil por el fibrinógeno y la fibronectina, por lo que técnicamente puede definirse como una MSCRAMM.

El factor A de aglutinación (ClfA) fue la primera adhesina de S.aureusde unión a la cadena<y>de fibrinógeno identificada. La proteína A de unión a fibronectina-fibrinógeno (FnBPA) y la proteína B de unión a fibronectinafibrinógeno (FnBPB) se reconocieron posteriormente como proteínas bifuncionales que se encontró que se unen al mismo segmento peptídico C-terminal en la cadena y de Fg. ClfA y FnBP tienen características estructurales que son comunes a todas las proteínas ancladas a la pared celular expresadas en bacterias Gram-positivas, incluyendo ClfB.

El factor A de aglutinación (ClfA), por ejemplo, es una proteína localizada en la superficie deStaphylococcus aureus.ClfA es un importante factor de virulencia de S.aureus.Contribuye a la patogénesis de la artritis séptica y la endocarditis. ClfA es el arquetipo de una familia de proteínas asociadas a la superficie con una organización estructural/modular similar, que incluye, pero no se limita a, ClfB, SdrD, SdrE, etc.

ClfA contiene un dominio A N-terminal de 520 aminoácidos (la región de unión a fibrinógeno), que comprende tres subdominios plegados por separado N1, N2 y N3. El dominio A va seguido de una región de repetición de dipéptido de serina-aspartato y una región que abarca la pared y la membrana celular, que contiene el resto LPDTG para el anclaje promovido por sortasa a la pared celular. ClfA está presente en prácticamente todas las cepas de S.aureus(Peacock SJ, Moore CE, Justice A, Kantzanou M, Story L, Mackie K, O'Neill G, Day NPJ (2002) Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations ofStaphylococcus aureus.Infect Immun 70:4987-4996). Se une al extremo C de la cadena y de fibrinógeno, y es así capaz de inducir la aglutinación de bacterias en la solución de fibrinógeno (McDevitt D, Nanavaty T, House-Pompeo K, Bell E, Turner N, McEntire L, Foster T, Hook M (1997) Characterization of the interaction between theStaphylococcus aureusclumping factor (ClfA) and fibrinogen. Eur J Biochem 247:416-424 y McDevitt D, Francois P, Vaudaux P, Foster TJ (1994) Molecular characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) ofStaphylococcus aureus.Mol Microbiol 11:237-248).

El análisis estructural en 3D de ClfA y las proteínas de unión a fibrinógeno relacionadas SdrG y ClfB ha revelado que el dominio A de unión a ligando en todas estas proteínas relacionadas está compuesto por tres subdominios N1, N2 y N3, siendo los residuos 221-559 correspondientes a las regiones N2-N3 el truncamiento más pequeño que conserva la capacidad de unirse al fibrinógeno. Se ha encontrado que los residuos de aminoácidos 532 a 538 corresponden a la región peptídica de retención de ClfA. Cada subdominio comprende nueve cadenas p que forman un nuevo pliegue de tipo IgG. El sitio de unión al péptido de la cadena y del fibrinógeno en estas proteínas está localizado en un surco hidrófobo en la unión entre N2 y N3. Se ha encontrado que existe una similitud estructural significativa entre la estructura 3D de estas proteínas, esto se debe a una o más de la secuencia de aminoácidos relacionada, un diseño modular similar y una organización de dominio de unión común.

Deivanayagam et al. ("A novel variant of the immunoglobulin fold in surface adhesins of Staphylococcus aureus: Crystal structure of the fibrinogen-binding MSCRAMM, clumping factor A"; EMBO JOURNAL, vol. 21, no. 24, diciembre 2002) divulgan la estructura de cristal del segmento de unión a ligando mínimo de la MSCRAMM de Staphylococcus aureus, factor A de aglutinación. La sustitución mutagénica de los residuos Tyr256, Pro336, Tyr338 y Lys389 en el factor de aglutinación, que se proponen que contactan con los residuos terminales 408AGDV411 de la cadena y, dio lugar a proteínas con una afinidad ausente o reducida de forma importante para el fibrinógeno.

SdrC, SdrD, SdrE, FnBPA-A (las siete isoformas) y FnBPB-B (las siete isoformas) tienen una organización modular similar, por lo que usando el modelado molecular PHYRE, se esperaría que estas proteínas tuvieran la misma estructura 3D.

IsdA e IsdB no tienen el mismo tipo de estructura que las proteínas Clf o Sdr. Tienen un resto novedoso llamado NEAT que está involucrado en la unión de ligando. Sin embargo, el resto NEAT es similar a la estructura 3D de Clf o Sdr, en que está compuesto por un sándwich de cadenas beta (pliegue de sándwich beta que consiste en dos hojas beta antiparalelas de cinco cadenas) y es un miembro de la superfamilia Ig (Pilpa et al "Solution Structure of the NEAT (NEAr Transported) Domain from IsdH/HarA: the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus" J. Mol. Biol. (2006) 360:435-447) La estructura 3D del resto NEAT de IsdH se ha resuelto y se han predicho los residuos en el bucle 1b-2.

La expresión de ClfA en S.aureusdificulta la fagocitosis tanto por los macrófagos como por los neutrófilos (Palmqvist N, Patti JM, Tarkowski A, Josefsson E (2004) Expression of staphylococcal dumping factor A impedes macrophage phagocytosis. Microb Infect 6:188-195 and Higgins J, Loughman A, van Kessel KPM, van Strijp JAG, Foster TJ (2006) Clumping factor A ofStaphylococcus aureusinhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes. FEMS Microbiol Lett 258:290-296). En los neutrófilos esto se debe tanto a un mecanismo dependiente del fibrinógeno como a un mecanismo independiente del fibrinógeno. Por el contrario, las plaquetas se activan por bacterias que expresan ClfA a través de su interacción con GPIIb/IIIa dando lugar a la agregación. Esto se ejecuta más eficientemente cuando el fibrinógeno está presente, pero también hay una ruta independiente del fibrinógeno para la activación plaquetaria (Loughman A, Fitzgerald JR, Brennan MP, Higgins J, Downer R, Cox D, Foster TJ (2005) Roles of fibrinogen, immunoglobulin and complement in platelet activation promoted byStaphylococcus aureusclumping factor A. Mol Microbiol 57:804-818 y O'Brien L, Kerrigan SW, Kaw G., Hogan M., Penadés J., Litt D., Fitzgerald D.J., Foster T.J. y Cox D. (2002) Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation byStaphylococcus aureus:roles for the clumping factors ClfA and ClfB, the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A. Mol Microbiol44, 1033-1044). LOUGHMAN et al. utilizaron plaquetas que se purificaron a partir de plasma para demostrar el requisito tanto para el fibrinógeno unido como para la inmunoglobulina, en donde una IgG debe contener anticuerpos específicos para el dominio ClfA. Además, el análisis de un mutante de ClfA que carecía totalmente de la capacidad de unirse al fibrinógeno reveló un segundo mecanismo, aunque menos eficiente, de activación plaquetaria, que requería IgG y deposición de complemento para desencadenar la agregación plaquetaria.

ClfA es un factor de virulencia para la inducción de artritis séptica en ratones (Josefsson E., Hartford O., O'Brien L, Patti JM, Foster T (2001) Protection against experimentalStaphylococcus aureusarthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J Infect Dis 184:1572-1580). Además, la eliminación de ClfA junto con otra proteína de unión al fibrinógeno ClfB protegió contra la inflamación sistémica en las primeras etapas de la infección (Palmqvist N, Foster T, Fitzgerald R, Josefsson E, Tarkowski A (2005) Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation. J Inf Dis 191 :791-798).

La proteína de unión al fibrinógeno deStaphylococcus aureusClfA se ha aislado y caracterizado y es el objeto de, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. No. 6.008.341 y 6.177.084.

ClfA y ClfB tienen una organización estructural (3D) idéntica y aproximadamente un 27 % de identidad de aminoácidos. FnBPA tiene aproximadamente un 25 % de identidad de aminoácidos con respecto a ClfA.

En la actualidad, no hay vacunas basadas en MSCRAMM aprobadas ni en el mercado. Veronate®, una inmunoglobulina intravenosa humana estafilocócica seleccionada por donante (IGIV), dirigida contra ClfA y SdrG, tuvo un mal rendimiento en ensayos clínicos de fase III y se retiró de los ensayos. Actualmente, se está reevaluando para determinar si es un tratamiento viable para las infecciones estafilocócicas.

WO 2005/116064 se refiere a FnBPA, que es una proteína de unión multifuncional de S.aureus.El dominio A N-terminal de FnBPA se asemeja a ClfA y se ha encontrado que se une a fibrinógeno. Sin embargo, los dominios BCD C-terminales de FnBPA se unen a fibronectina, por lo tanto, FnBPA es una MSCRAMM bifuncional.

WO 2005/116064 se basa en el hallazgo de que, en presencia de transglutaminasa, se forman enlaces covalentes entre la adhesina bacteriana FnBPA y la proteína huésped fibronectina, haciendo la asociación mucho más fuerte y esencialmente irreversible. El fibrinógeno es un componente principal (~3 mg/ml) en la sangre, donde sirve como diana final de la cascada de coagulación. La fibronectina es menos abundante, ~0.3 mg/ml o una molécula de Fn por cada 10-15 de fibrinógeno. No se cree que el fibrinógeno y la fibronectina estén asociados en la sangre donde circulan independientemente.

Es importante destacar que WO 2005/116064 se refiere específicamente a la reticulación covalente catalizada por el Factor XIIIa. WO 2005/116064 aísla múltiples mutantes en un FnBPA recombinante en el que se alteraron residuos con cadenas laterales cargadas positivamente (es decir, sustratos de transglutaminasa). Además, WO 2005/116064 está dirigido a mutantes que tienen propiedades de unión covalente a fibronectina alteradas, no solo de unión a fibrinógeno. Adicionalmente, este documento no demuestra experimentalmente si la unión de la proteína mutante al ligando se reduce y no proporciona ningún dato de inmunogenicidad de soporte.

Por lo tanto, a la vista de la prevalencia de la resistencia a múltiples fármacos en bacterias gram positivas y la falta de terapias y vacunas con éxito para estas bacterias resistentes a múltiples fármacos, cualquier terapia alternativa que pueda tratar dichas infecciones bacterianas sin el uso de antibióticos tendrá un valor significativo.

Además, cualesquiera mejoras en la eficacia sobre cualesquiera tratamientos o vacunas conocidos será de particular importancia, especialmente en un entorno clínico.

Por lo tanto, la presente invención está dirigida a proporcionar una terapia alternativa y mejorada para tratar dichas infecciones bacterianas.

Declaración de la invención

Según un primer aspecto general de la invención, se proporciona una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante seleccionada del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno, para su uso en terapia.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona también se divulga la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante o fragmento de la misma para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene una infección microbiana, comprendiendo el uso administrar al individuo la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, o vacuna que comprende la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, que carece de la capacidad de unirse a su ligando huésped.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona el uso de una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante y un adyuvante farmacéuticamente aceptable, en donde la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante se selecciona del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno en la generación de una vacuna.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona el uso de una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante y un adyuvante farmacéuticamente aceptable, en donde la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante se selecciona del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno en la generación de una composición farmacéutica inmunogénica.

Descripción detallada

En esta memoria descriptiva, se entenderá que los términos "adhesina", "MSCRAMM" y "proteínas ancladas a la pared celular" son intercambiables y abarcan todas las proteínas de unión al ligando derivadas de microbios. Idealmente, estas proteínas se unen a fibrinógeno, hemo o hemoglobina, haptoglobina-hemoglobina, hemina, colágeno y otros de dichos ligandos. La expresión proteínas "similares a MSCRAMM" pretende abarcar proteínas o adhesinas que tienen secuencias de aminoácidos relacionadas, un diseño modular similar y/o una organización del dominio de unión común/similar a dichas proteínas MSCRAMM, tales como proteínas Isd. Idealmente, las proteínas similares a MSCRAMM tienen una organización de dominio de unión/diseño modular similar. Adicionalmente, las proteínas similares a MSCRAMM pueden tener al menos un 50 %, preferiblemente un 60 %, preferiblemente un 75 %, más preferiblemente un 85 %, aún más preferiblemente un 95 %, aún más preferiblemente un 99 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con las proteínas MSCRAMM.

También se entenderá que cualquiera de los porcentajes de identidades u homologías a los que se hace referencia en la memoria descriptiva se determinan usando los métodos convencionales disponibles en la longitud total/completa de la secuencia.

El término "microorganismo", "microbio", "microbiano" o similar, incluye, pero no está limitado a, organismos que incluyen bacterias, hongos, virus, levaduras y/o mohos.

La expresión "cantidad inmunológicamente efectiva" abarca las cantidades que son capaces de estimular una respuesta de células B y/o células T.

Según un primer aspecto general de la invención, se proporciona una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante seleccionada del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno, para su uso en terapia. Dicha proteína recombinante puede usarse en el tratamiento de infecciones microbianas, tales como el tratamiento de sepsis, artritis séptica y/o endocarditis u otras afecciones o estados patológicos similares. Dichas infecciones microbianas pueden estar causadas idealmente por estafilococos u otros microorganismos similares.

Según una realización particular de este aspecto de la invención, la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a su ligando huésped.

Por lo tanto, se entenderá que la unión con el ligando huésped puede evitarse.

Se postula que, según la invención, la unión no covalente que tiene lugar durante la unión, a través de unión, fijación y bloqueo (DLL), de la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo a su ligando puede prevenirse. Se establece que la primera etapa en la unión de una MSCRAMM a su ligando implica una interacción no covalente a través del modelo DLL. Estas son las principales interacciones no covalentes de MSCRAMM con el ligando. Las fases finales en la unión al ligando de MSCRAMM implican interacciones covalentes. En esta realización particular, la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, carece de la capacidad de unirse de forma no covalente a su ligando huésped debido a la alteración de la unión, fijación y bloqueo. Una o más de las etapas de unión, fijación o bloqueo pueden alterarse.

El modelo DLL fue elucidado a partir de la estructura 3D de SdrG en complejo con su ligando. Ahora se ha mostrado que ClfA actúa por una variación menor del mecanismo de DLL (Ganech et al (2008) "A structural model of theStaphylococcus aureusClfa-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics". PloS Pathog 4(11); e1000226). El modelo de DLL se refiere específicamente a las interacciones no covalentes implicadas en la unión de ligando. El modelo de DLL se infiere para todas las demás proteínas de tipo estructural similar (ya sea por similitud/homología de aminoácidos u homología de organización estructural), incluyendo, pero no limitado a, MSCRAMM o proteínas similares a MSCRAMM.

En relación con las MSCRAMM ClfA/ClfB en particular, se ha encontrado que el dominio de unión al ligando mínimo comprende las subregiones N1 a N3 de la Región A, específicamente las subregiones N2 y N3 que comprenden un pliegue de Ig de la variante Dev-IgG. El pliegue de Ig de la variante Dev-IgG es una nueva variante del resto de inmunoglobulina también denominada variante DE. Se postula que un bolsillo hidrófobo formado entre los dos dominios DEv-IgG de ClfA/B es el sitio de unión al ligando para la cadena<y>de fibrinógeno. Esencialmente, el ligando se une al surco hidrófobo que separa N2 y N3. Específicamente, durante la unión al ligando, el componente peptídico desplegado del ligando se inserta en el surco situado entre los subdominios N2 y N3. El péptido de bloqueo en el extremo C del subdominio N3 experimenta un cambio conformacional y se inserta entre dos cadenas beta en el subdominio N2, bloqueando así el ligando en su lugar. De hecho, la sustitución mutagénica de los residuos Tyr256, Pro336, Tyr338 y Lys389 en el factor de aglutinación, que se propone que contacta con los residuos terminales 408AGDV411 de la cadena y de fibrinógeno, dio como resultado proteínas sin ninguna afinidad o notablemente reducida para el fibrinógeno. Los detalles adicionales de esta realización específica se expanden más adelante.

Aunque estas enseñanzas se refieren a factores de aglutinamiento, ClfA en particular, son igualmente aplicables a otras MSCRAMM y/o proteínas similares a MSCRAMM, que tienen una organización de dominio de unión modular similar y se unen a ligandos de maneras similares.

Por lo tanto, con el fin de proporcionar MSCRAMM o proteínas similares a MSCRAMM de estafilococo recombinantes, o fragmento de las mismas, con unión reducida a su ligando huésped, la proteína de longitud completa, el dominio de unión a ligando, el dominio de unión a ligando mínimo o fragmento de los mismos se pueden alterar para reducir o prevenir la unión a su ligando huésped. Idealmente, para CIfA/CIfB y otras proteínas MSCRAMM o similares a MSCRAMM, las subregiones N2 y N3 de la Región A, que idealmente comprenden un pliegue de IgG de Dev-IgG variante, pueden alterarse para prevenir o reducir la unión a su ligando huésped. Dicha alteración está diseñada para evitar que el ligando se una al surco hidrófobo que separa los dominios mínimos de unión al ligando necesarios para DLL.

Dichas alteraciones en el dominio de unión al ligando pueden tener lugar a nivel de aminoácidos, mediante sustitución o deleción de aminoácidos, utilizando la proteína de longitud completa, el dominio de unión al ligando, el dominio de unión al ligando mínimo o fragmento de los mismos. Se entenderá que pueden usarse también proteínas o fragmentos de las mismas con homología suficientemente alta con la proteína de unión al ligando. La alta homología como se define en la presente memoria se produce cuando al menos el 50 %, preferiblemente el 60 %, preferiblemente el 70 %, preferiblemente el 80 %, más preferiblemente el 90 %, aún más preferiblemente el 95 %, aún más preferiblemente del 95 % al 99 % y aún más preferiblemente el 99 % o más de los nucleótidos coinciden en toda la longitud de la secuencia de ADN o cuando se usan en relación con las secuencias de aminoácidos cuando las secuencias de aminoácidos no son idénticas, pero producen una proteína que tiene la misma funcionalidad y actividad. Se entenderá que estos comentarios sobre la alta homología también pueden estar relacionados con la estructura 3D de la proteína, es decir, la organización del dominio de unión modular.

Se entenderá que se puede usar la proteína de unión al ligando completa, o un fragmento de la misma.

El uso de proteínas truncadas de la proteína de unión al ligando o el uso de fragmentos de las mismas es ventajoso para facilitar la fabricación y superación de otros problemas tales como escisión no deseada de la proteína. Por ejemplo, el péptido de retención, presente en el dominio de unión al ligando mínimo, puede alterarse. Por ejemplo, el péptido de retención en ClfA corresponde a los aminoácidos de la Región A 532 a 538 y en ClfB a los aminoácidos de la Región A 530-540 (Walsh et al (2004) JBC 279(49): 50691-50699). Estos residuos pueden alterarse, sustituirse con el fin de evitar que el ligando se una a la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo a través de DLL. De esta manera, se evita la "retención" de DLL de la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo a su ligando. Esta "retención" se produce por medio de una interacción no covalente. En una realización, el péptido de retención se elimina en su totalidad junto con los residuos de aminoácidos C-terminales de la Región A restantes. Según otra realización, la región peptídica de retención solamente se elimina. Según otra realización más, la región peptídica de retención experimenta una sustitución de aminoácidos para dar como resultado la prevención de la unión al ligando/retención. Estos comentarios son aplicables a todas las proteínas MSCRAMM o similares a MSCRAMM que se unen a ligandos por el modelo DLL o similares.

Mediante la alteración de la proteína de unión al fibrinógeno de estafilococo de esta manera, es posible proporcionar una proteína de unión al ligando sin la capacidad de unirse a su ligando, lo que estimula una mayor respuesta inmune tras la inmunización que la proteína de tipo salvaje. Ventajosamente, esto reduce la inflamación sistémica, disminuyendo así la virulencia microbiana. En consecuencia, esta proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo con unión al ligando alterada que carece de la capacidad de unirse a su ligando, se puede utilizar ventajosamente en el tratamiento de las infecciones microbianas. Por tanto, estos hallazgos presentan una nueva y valiosa vacuna/inmunización terapéutica frente a infecciones bacterianas que proporciona mejores resultados cuando se compara con una vacuna o inmunización terapéutica derivada de la proteína de tipo salvaje.

Según la invención, el ligando es fibrinógeno.

Según la invención, la proteína MSCRAMM recombinante es ClfA, que es una proteína de unión a fibrinógeno.

Las proteínas de unión a fibrinógeno se han expandido anteriormente, e incluyen, pero no se limitan a, ClfA, ClfB, FnBPA, FnBPB, Fbl, IsdA, etc. Se ha mostrado que SdrG/F se une al colágeno. Otras MSCRAMM incluyen SasA, SasG, SasK y SdrH.

Basándose en los hallazgos de la MSCRAMM ClfA de unión a fibrinógeno, se pueden generar mutantes sin unión a ligando similares en, por ejemplo, el resto NEAT (Transportador NEAr) de proteínas Isd que incluyen IsdH e IsdB. Como se ha expandido anteriormente, IsdA e IsdB no tienen el mismo tipo de estructura que las proteínas Clf o Sdr. Sin embargo, el resto NEAT en Isd está directamente implicado en la unión del ligando (haptoglobinahemoglobina, hemoglobina, hemina), por lo tanto, las alteraciones en el resto NEAT evitarán la interacción del huésped-ligando de la misma manera que la alteración de la interacción DLL o similar a DLL del huésped-ligando de Clf o Sdr. Muchas proteínas que contienen el dominio NEAT, incluyendo IsdA enStaphylococcus aureus,están implicadas en la unión al hemo. Se postula que la propiedad de unión al hemo de IsdA está contenida dentro del dominio NEAT. Las estructuras cristalinas del dominio NEAT apo-IsdA y en complejo con hemo han revelado un pliegue de sándwich p similar a adaptador de clatrina con un bolsillo de unión a hemo hidrófobo grande. IsdB tiene dos restos NEAT e IsdA tiene un resto NEAT. Los mutantes que no se unen al ligando de las proteínas Isd pueden aislarse alterando los residuos predichos para la unión al ligando, por ejemplo, alterando los residuos entre las cadenas beta y/o el bolsillo hidrófobo. Adicionalmente, el resto NEAT puede alterarse para efectuar interacciones huésped-ligando no covalentes.

También se divulga la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante o fragmento de la misma para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene una infección microbiana, comprendiendo el uso administrar al individuo la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, o vacuna que comprende la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, que carece de la capacidad de unirse a su ligando huésped.

Según otra realización de este aspecto de la invención, se proporciona el uso de la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, que carece de la capacidad de unirse a su ligando huésped en la generación de una vacuna.

Según otra realización particular de este aspecto de la invención, se proporciona el uso de la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, que carece de la capacidad de unirse a su ligando huésped en la generación de una composición farmacéutica inmunogénica.

Según la invención, se proporciona una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante seleccionada del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno, para su uso en terapia.

Se entenderá que la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, puede usarse en el tratamiento de infecciones microbianas, preferiblemente infecciones por estafilococo tales como en el tratamiento de sepsis, artritis séptica y/o endocarditis, u otras afecciones o estados patológicos similares.

La región de unión al fibrinógeno de la proteína se altera de manera que ya no se una al fibrinógeno. Como se ha indicado anteriormente, la alteración puede tener lugar a nivel de los nucleótidos o los aminoácidos. Se entenderá que pueden usarse también proteínas o fragmentos de las mismas con homología suficientemente alta con la proteína de unión al fibrinógeno. La alta homología como se define en la presente memoria se produce cuando al menos el 50 %, preferiblemente el 60 %, preferiblemente el 70 %, preferiblemente el 80 %, más preferiblemente el 90 %, aún más preferiblemente el 95 %, aún más preferiblemente del 95 % al 99 % y aún más preferiblemente el 99 % de los nucleótidos coinciden en toda la longitud de la secuencia de ADN o cuando se usan en relación con las secuencias de aminoácidos cuando las secuencias de aminoácidos no son idénticas, pero producen una proteína que tiene la misma funcionalidad y actividad. Se entenderá que estos comentarios sobre la alta homología también pueden estar relacionados con la estructura 3D de la proteína.

Se entenderá que se puede usar la proteína de unión a fibrinógeno completa, o el fragmento de la misma. El uso de proteínas truncadas o fragmentos de las mismas es ventajoso para facilitar la fabricación y superación de otros problemas tales como escisión no deseada de la proteína. Esto se expande a continuación.

Las ventajas de usar una proteína truncada o fragmento de la misma se refieren a la capacidad de purificar la proteína con altos rendimientos sin degradación. La región de unión al fibrinógeno de la proteína ClfA, denominada de otro modo como la Región A, comprende 3 subregiones, N1, N2 y N3. Por tanto, el fragmento inmunogénico comprende las subregiones N2 y<n>3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponden a los aminoácidos 220 a 559 de la Región A de ClfA o el fragmento de la misma. Por tanto, por ejemplo, en relación con ClfA, el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponden a los aminoácidos 220 a 559. Idealmente, se puede utilizar N2 y N3 ya que este truncamiento es menos probable que experimente proteólisis (se ha informado un sitio de escisión de proteasa entre N1 y N2 en ClfA y ClfB) y se puede expresar a niveles más altos en E. coli. N2 y N3 son la región mínima de unión al fibrinógeno de las proteínas Clf.

Se entenderá que, aunque la siguiente discusión se refiere a la proteína de unión a fibrinógeno ClfA, que estos comentarios son igualmente aplicables a otras MSCRAMM, proteínas similares a MSCRAMM y en particular otras proteínas de unión a fibrinógeno que son estructuralmente similares ya sea a nivel de aminoácido o estructura de proteína a ClfA, por ejemplo, como ClfB, Fbl y SdrF/G (que también se une a colágeno). Además, estas enseñanzas son aplicables a FnBPA y FnBPB. Por tanto, aunque los siguientes comentarios se refieren a proteínas de unión a fibrinógeno, son igualmente aplicables a otras proteínas MSCRAMM o similares a MSCRAMM que se unen a ligandos distintos del fibrinógeno.

Hemos encontrado inesperadamente que esta proteína de unión al fibrinógeno alterada, truncamiento o fragmento de la misma, sin la capacidad de unirse al fibrinógeno estimula una mayor respuesta inmune tras la inmunización que la proteína de tipo salvaje que se une al fibrinógeno de la manera normal. Ventajosamente, esta proteína de unión al fibrinógeno alterada no provoca inflamación sistémica cuando se expresa por S.aureus,por tanto, disminuye la virulencia microbiana. En consecuencia, esta proteína alterada que carece de la capacidad para unirse a fibrinógeno se puede utilizar ventajosamente en el tratamiento de infecciones microbianas. También hemos encontrado, al contrario de las expectativas, que el efecto de protección de la proteína de unión al fibrinógeno alterada es mayor que el de la proteína de tipo salvaje. Hemos encontrado que una composición farmacéutica o vacuna que comprende dicha proteína recombinante alterada es más efectiva que una composición farmacéutica o vacuna que comprende la misma proteína recombinante en una forma inalterada (tipo salvaje), tal como ClfA, ClfB, SdrG, etc.

Por tanto, estos hallazgos presentan una nueva y valiosa vacuna/inmunización terapéutica frente a infecciones bacterianas que proporciona mejores resultados en comparación con la proteína de tipo salvaje cuando se usa también como una vacuna/inmunización terapéutica.

Se entenderá que la proteína alterada se puede utilizar en la generación de anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados o fragmentos de los mismos, para su uso en el tratamiento de dichas infecciones microbianas. Pueden proporcionarse entonces composiciones que incluyen dichos anticuerpos, tales como un suero hiperinmune, y estas composiciones pueden usarse en el tratamiento de pacientes infectados con infecciones porStaphylococcus.

Por tanto, las proteínas o fragmentos activos de las mismas pueden usarse para inhibir la unión de estafilococos a la matriz extracelular (ECM) y para prevenir/tratar infecciones por estafilococos en un paciente.

Además, las proteínas o fragmentos activos de las mismas, y anticuerpos frente a las proteínas son útiles en el tratamiento de infecciones de estafilococos, para el desarrollo de vacunas para la vacunación activa o pasiva, y cuando se administran como una composición farmacéutica a una herida o un dispositivo médico, tanto las proteínas como los anticuerpos son útiles como agentes bloqueantes para prevenir la infección microbiana. Por ejemplo, estas proteínas o fragmentos de las mismas, pueden usarse en vacunas activas, y los anticuerpos frente a estas proteínas en vacunas pasivas.

Estas vacunas y productos descritos en la presente memoria presentan una mejora significativa con respecto a la técnica anterior, que enseña el uso general de MSCRAMM para impartir inmunización, pero no enseña las vacunas o productos inesperados y mejorados descritos en la presente memoria.

La preparación de proteínas, ADN y anticuerpos se conoce bien en la técnica y no se describirán en detalle en la presente memoria. Las técnicas convencionales se utilizan idealmente en la generación de estas moléculas. También se entenderá que la invención abarca construcciones de ácido nucleico que contienen la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de interés, células huésped recombinantes que contienen dichas construcciones de ácido nucleico para expresar la proteína de interés, y composiciones inmunogénicas.

Para la administración, la composición proteica puede dispersarse en una solución salina isotónica estéril u otro adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Se entenderá que la vacuna puede ser una vacuna de ADN o proteína.

La inmunización puede tener lugar mediante la inyección de ADN, proteína o anticuerpos. Alternativamente, se puede administrar un organismo vivo atenuado que incluye y expresa el ADN.

La cantidad de ADN, proteína o anticuerpos que se pueden administrar dependerá de varios factores atenuantes, incluyendo la dependencia de la fuerza del promotor, la expresión de la proteína y la inmunogenicidad del gen expresado. Estos pueden alterarse para cada nueva aplicación para obtener la cantidad inmunológicamente efectiva deseada requerida.

También se divulga la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante o fragmento de la misma para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene una infección microbiana, comprendiendo el uso administrar al individuo la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno.

Según una realización preferida adicional de la invención, se proporciona el uso de la proteína de unión al fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno en la generación de una vacuna.

Según una realización aún más preferida de la invención, se proporciona el uso de la proteína de unión al fibrinógeno de estafilococo recombinante, o fragmento de la misma, sin la capacidad de unirse a fibrinógeno en la generación de una composición farmacéutica inmunogénica.

Idealmente, la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante o fragmento de la misma se obtiene a partir de S.aureus,S.epidermidisy/o S.lugdunensis.

La proteína de unión a fibrinógeno es el factor de aglutinación A de la proteína de unión a fibrinógeno (ClfA)lsdA que promueve la adhesión tiene una afinidad débil por fibrinógeno y fibronectina, por lo que técnicamente puede definirse como una MSCRAMM de unión a fibrinógeno.

Se entenderá que las sustituciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos dentro de la región de unión a fibrinógeno de dichas proteínas de unión a fibrinógeno dan como resultado una proteína recombinante sin la capacidad de unirse a fibrinógeno.

Se ha elucidado que la unión de CIfA-fibrinógeno se produce mediante un mecanismo de unión, fijación y retención (DLL) similar al de SdrG. El modelo de DLL se expandió anteriormente. La Región A de ClfA es responsable de la interacción proteína-ligando. Como se muestra en la Figura 11, la estructura modular de varias MSCRAMM de unión a fibrinógeno son similares y todas contienen una Región A similar a ClfA.

El sitio de unión al péptido de la cadena<y>del fibrinógeno está localizado en un surco hidrófobo en la unión entre N2 y N3 de ClfA. Por tanto, las sustituciones o deleciones mencionadas anteriormente están diseñadas para alterar la interacción proteína MSCRAMM-ligando y prevenir la unión no covalente de ClfA al fibrinógeno.

Según la presente invención, la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante es un mutante deficiente en la unión a fibrinógeno de ClfA. En esta realización, la Región A de Unión a Fibrinógeno de ClfA se altera por cualquier medio (tal como mutaciones de sustitución o deleción) de manera que ya no se une a fibrinógeno.

La proteína de unión a fibrinógeno es ClfA, sin embargo, ClfA tiene similitud estructural 3D con muchas otras proteínas de unión a fibrinógeno. Por tanto, se entenderá que estos comentarios relativos a ClfA son igualmente aplicables a otras proteínas de unión a fibrinógeno de MSCRAMM, incluyendo ClfB, FnBPA, FnBPB, Fbl, SdrG/F, IsdA, etc. Todas estas proteínas tienen estructuras 3D similares, por tanto, se pueden hacer alteraciones/mutaciones similares en la región de unión a fibrinógeno para lograr los mismos resultados.

ClfA es una proteína de 993 aminoácidos, que comprende un dominio de unión a fibrinógeno de 520 aminoácidos (desde los aminoácidos 40 a 559). Este dominio de unión al fibrinógeno es el dominio A del extremo N que comprende las subregiones N1, N2 y N3. Toda la región de fibrinógeno que abarca N1 a N3 desde el aminoácido 40 hasta el aminoácido 559, se puede usar en la invención. Alternativamente, se puede usar un truncamiento de la región N1 a N3, p. ej., 221 a 559 (la región mínima de unión al fibrinógeno). Idealmente, pueden usarse las subregiones N2 y N3, la región mínima de unión al fibrinógeno, que corresponden a los residuos de aminoácidos 221 a 559.

Se ha establecido que los residuos de aminoácidos 221 a 559, que abarcan las regiones N2 y N3, de ClfA desempeñan un papel importante en la unión al fibrinógeno y son la región de unión al fibrinógeno mínima. También hemos encontrado inesperadamente que la mutación de residuos de aminoácidos en esta región da como resultado una proteína expresada que puede ser reconocida por las defensas inmunes del huésped, pero que carece de unión al fibrinógeno y, por tanto, reduce la virulencia asociada. Esta región (el dominio de unión al fibrinógeno de 339 aminoácidos) de ClfA tiene una estructura 3D específica, un denominado pliegue de IgG de la variante DE, y es el truncamiento de unión a Fg mínimo que si se altera (a través de sustitución o deleción, etc.) puede proporcionar una terapia mejorada.

La alteración para dar como resultado la pérdida de la actividad de unión al fibrinógeno puede tener lugar por sustitución, adición o inserción o deleción a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Idealmente, la sustitución afecta negativamente a la estructura 3D (p. ej., del denominado pliegue de IgG de la variante DE) de la proteína o fragmento de modo que ya no puede unirse al fibrinógeno.

Idealmente, la sustitución de nucleótidos o aminoácidos reduce la interacción no covalente con fibrinógeno, preferiblemente impidiendo la unión del ligando al bolsillo hidrófobo que separa N2 y N3 de la Región A de la proteína de unión al fibrinógeno. Alternativamente, la región del péptido de retención correspondiente a los aminoácidos 532 a 538 puede alterarse por sustitución para evitar la unión al ligando.

Según una realización específica de este aspecto de la invención, el mutante deficiente en la unión a fibrinógeno de ClfA puede construirse intercambiando los aminoácidos P336 por serina y/o Y338 por alanina, respectivamente. La elección de residuos se basó en la estructura cristalina de rayos X de ClfA y la observación de que los cambios individuales en la prolina o la tirosina reducían la afinidad de unión. Sorprendentemente, encontramos que esta proteína ClfA mutante (rClfAP336 S Y338A) estimulaba una respuesta inmune y se puede utilizar en la generación de una vacuna o terapia de anticuerpos mucho más efectiva. Esta sustitución puede tener lugar en la proteína de unión al fibrinógeno de longitud completa, la región de unión al fibrinógeno, la región mínima de unión al fibrinógeno, o el fragmento de la misma.

Según otra realización específica de este aspecto de la invención, el mutante deficiente en la unión a fibrinógeno de ClfA puede construirse intercambiando los aminoácidos P336 por alanina y/o Y338 por serina, respectivamente. Como con la realización anterior, esta proteína ClfA mutante (rClfAP336 A Y338S) también se puede usar en la generación de una vacuna o terapia de anticuerpos mucho más efectiva.

Alternativamente, se puede contemplar una sustitución de aminoácidos en los aminoácidos de péptido de retención 532 a 538 que evita el DLL del fibrinógeno.

Se entiende que todas las proteínas de la familia Clf-Sdr se unen a ligandos por el modelo DLL. Mediante el modelado de la estructura 3D, es posible predecir el péptido de retención y hacer un truncamiento que carezca de éste, ya sea en longitud completa (N1 a N3) o el truncamiento de unión a ligando mínimo N2-N3.

Encontramos que estas proteínas rClfA de sustitución (ya sean mutantes de deleción, sustituciones o truncamientos) redujeron la virulencia y el resultado de la enfermedad, y sorprendentemente indujeron menos inflamación sistémica que la proteína de tipo salvaje.

Por tanto, se espera que la inmunización con estas proteínas mutantes, basada en las proteínas ensayadas, aumente el nivel de anticuerpos que reconocen tanto la proteína mutante como de tipo salvaje y que proporcionen una respuesta inmune mayor que la proteína de tipo salvaje.

Por tanto, ClfA que se ha alterado de manera que ya no se une al fibrinógeno es un candidato terapéutico útil para la inmunización activa o pasiva. De esta manera, la proteína ClfA alterada por sí misma puede usarse como una vacuna o pueden usarse anticuerpos producidos frente a esta proteína ClfA alterada. Como anteriormente, la vacuna puede ser una vacuna de ADN o proteína.

Las siguientes secuencias SED ID No: 1-12 indicadas en la siguiente tabla pueden usarse según la invención.

Idealmente, la proteína recombinante de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante comprende la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID No. 1 a 3, en donde el residuo P336 y/o Y338 están sustituidos con serina y/o alanina, o el fragmento de la misma.

Alternativamente, el fragmento de la proteína de unión al fibrinógeno de estafilococo recombinante comprende la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID No: 4 a SEQ ID No: 12. Las SEQ ID NO: 4 y 5 corresponden al dominio A de ClfA N1, N2 , N3 solamente, rCIfA P336S Y338A y rCIfA P336A Y338S respectivamente como se ha indicado en la tabla anterior.

También se postula, en base a las sustituciones en la retención que se realizaron en SdrG, que las sustituciones en la retención que son defectuosas en el cambio conformacional o en la complementación de la cadena beta también serán defectuosas en la unión al ligando. Por tanto, idealmente, las sustituciones están en los residuos de aminoácidos 532 a 538 que corresponden al péptido de retención y afectan a la capacidad del péptido de experimentar un cambio conformacional, o de unirse al ligando o ambos.

Sin embargo, también se contemplará que pueden sustituirse otros residuos de aminoácidos distintos de los específicamente citados anteriormente. Por ejemplo, Glu 526, Val 527, Tyr 256 y Lys 389 pueden sustituirse para alterar las propiedades de unión al fibrinógeno de la proteína o fragmento de la misma. Por tanto, puede contemplarse cualquier sustitución que reduzca la capacidad de unión. Idealmente, dichas sustituciones o deleciones afectan al bolsillo hidrófobo y el mecanismo asociado para unir el ligando en la zanja hidrófoba tal como los homólogos Val527 en ClfA y N526 en ClfB. En ClfB, se han estudiado Q235 y N526 para mostrar que reducen la unión. Un estudio similar se realizó con FnBPA, donde se mostró que N304 y F306 son importantes para la unión a Fg. Por tanto, las mutaciones en estos residuos de aminoácidos afectarán a la unión al ligando.

Se entenderá que estos comentarios son igualmente aplicables a otras proteínas de unión a fibrinógeno, tales como ClfB, SdrG, FnBPA, FnBPB. Por tanto, el tratamiento (vacuna, anticuerpo o composición farmacéutica, etc.) puede comprender la Región de Unión a Fibrinógeno completa o el fragmento de la misma.

En la memoria descriptiva, los términos "comprenden, comprende, comprendido y que comprende" o cualquier variación de los mismos y los términos "incluyen, incluye, incluido y que incluye", o cualquier variación de los mismos se consideran como totalmente intercambiables y que deben tener la interpretación más amplia posible.

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

Las Figuras 1 a 15 muestran los resultados del Ejemplo 1.

La Figura 1 muestra la gravedad de la artritis (A), medida como índice artrítico, y la pérdida de peso (B) en ratones inoculados con la cepa Newman de S.aureus,y los mutantes nulosclfAPYI, clfAPYII,yclfA.Se inocularon 3.2 x 106 - 6.0 x 106 cfu de cepas de S.aureus.Los datos se presentan como medianas (cuadrados o líneas centrales), intervalos intercuartiles (cuadrados), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Se agrupan los datos de tres experimentos. NNewman = 27 - 30,NclfAPYI= 30, N<cayii>= 10, yNcifA= 16 - 20.

La Figura 2 muestra el crecimiento bacteriano en los riñones en ratones 7-8 días después de la inoculación con 3.2 x 106 - 6.0 x 106 cfu de la cepa Newman de S.aureus,y los mutantes nulosclfAPYI, clfAPYII,yclfA.Los datos se presentan como cfu por par de riñones. Cuando no se detectó crecimiento, el recuento se puso en el recuento más alto posible según la dilución que se utilizó. Se agrupan los datos de tres experimentos. N<n>ewman = 26,NclfAPYI= 30,NclfAPYI= 10, yNclfA= 15.

La Figura 3 muestra la supervivencia de los ratones después de la inoculación con 5.2, 5.1 o 3.3 x 107 cfu de la cepa Newman de S.aureus,mutanteclfAPYIo mutante nuloclfA,respectivamente.N= 10 por grupo desde el inicio.

La Figura 4 muestra la supervivencia de los ratones después de la inoculación con 9.4, 7.9, 10,7 o 9.8 x 106 cfu de la cepa LS-1 de S.aureus,y mutantes nulosclfAPYI, clfAPYIIoclfA,respectivamente.N= 15 por grupo desde el inicio.

La Figura 5 muestra la supervivencia de los ratones inmunizados con BSA, ClfA recombinante o ClfAPY recombinante (es decir, el dominio A de la proteína recombinante ClfAPYI) e inoculados con 2.3 x 107 cfu de la cepa Newman de S.aureus. N =15 por grupo desde el inicio.

La Figura 6 muestra la frecuencia de los ratones artríticos inoculados con 3.2 x 106 - 6.0 x 106 cfu de la cepa Newman de tipo salvaje de S.aureus,y los mutantes nulosclfAPYI, clfAPYII,yclfA.Se agrupan los datos de tres experimentos. NNewman = 27 - 30,NcIfAPYI= 30, Ncayii = 10, yNcifA= 16 - 20.

La Figura 7 muestra la gravedad de la artritis medida como el índice artrítico en ratones inoculados con 5.2, 5.1 o 3.3 x 107 cfu de la cepa Newman de tipo salvaje deS.aureus,mutanteclfAPYIo mutante nuloclfA,respectivamente. Los datos se presentan como medianas (cuadrados), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NNewman = 0-10,NclfAPYI= 9-10, yNclfA= 0-10.

La Figura 8 muestra la pérdida de peso en ratones inoculados con 5.2, 5.1 o 3.3 x 107 cfu de la cepa Newman de tipo salvaje de S.aureus,mutanteclfAPYIo mutante nuloclfA,respectivamente. Los datos se presentan como medianas (línea central), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NNewman = 0-10,NclfAPYI= 9-10, yNclfA= 0-10.

La Figura 9 muestra la gravedad de la artritis medida como el índice artrítico en los ratones inmunizados con BSA, ClfA recombinante o ClfAPY recombinante (es decir, el dominio A de la proteína recombinante ClfAPYI) e inoculados con 4.0 x 106 cfu de la cepa Newman de S.aureus.Los datos se presentan como medianas (cuadrados), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Nbsa = 14, Nc a y = 14, yNclfA= 15 por grupo desde el inicio.

La Figura 10 proporciona la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la proteína del dominio A de ClfA de tipo salvaje (rClfA), dominios N123 solamente, con los residuos destacados que se alteran en los siguientes ejemplos (P336 e Y338) para dar lugar a rClfAPYI/II (SEQ ID No.3). Es este dominio de proteína A recombinante el que se usó en la vacunación en los siguientes ejemplos.

La Figura 11 muestra una representación ilustrativa de la estructura de las proteínas FnBPA, ClfB, ClfA y SdrG. La Región A es la región de unión al fibrinógeno, S es la secuencia señal, W es el dominio que abarca la pared celular, M es el anclaje de la membrana incluyendo el resto LPXTG, representa residuos cargados positivamente y R es la región de repetición. En ClfA, la Región A comprende N123 (no mostrado). La región BCD de FnBPA (y la región CD más corta de FnBPB - no mostrada) se une a fibronectina.

La Figura 12 muestra las respuestas de anticuerpo específicas para ClfAPY40-559 recombinante en muestras de suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 2.3 x 107 cfu/ratón de la cepa Newman de tipo salvaje de S.aureuspara la inducción de sepsis. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Nbsa = 13-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15.

La Figura 13 muestra las respuestas de anticuerpo específicas para CIfA40-559 recombinante en muestras de suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 2.3 x 107 cfu/ratón de la cepa Newman de tipo salvaje de S.aureuspara la inducción de sepsis. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). N<bsa>= 13-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15.

La Figura 14 muestra las respuestas de anticuerpo específicas para ClfAPY40-559 recombinante en muestras de suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 4.0 x 106 cfu/ratón de la cepa Newman de tipo salvaje de S.aureuspara la inducción de artritis séptica. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Nbsa = 14-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15.

La Figura 15 muestra las respuestas de anticuerpo específicas para CIfA40-559 recombinante en muestras de suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 4.0 x 106 cfu/ratón de la cepa Newman de tipo salvaje de S.aureuspara la inducción de artritis séptica. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Nbsa = 14-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15.

La Figura 16 del Ejemplo 2 muestra las respuestas de anticuerpos específicas para ClfAPY221-559 recombinante en muestras de suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA221-559 recombinante (rClfA221-559), o ClfAPY221-559 recombinante (rClfAPY221-559), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Nbsa = 15, NrClfA221-559 = 14-15, y NrClfAPY221-559 = 14-15.

La Figura 17 del Ejemplo 2 muestra las respuestas de anticuerpos específicas para ClfA221-559 recombinante en muestras de suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA221-559 recombinante (rClfA221-559), o ClfAPY221-559 recombinante (rClfAPY221-559), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Nbsa = 15, NrClfA221-559 = 14-15, y MrClfAPY221-559 = 14-15.

La Figura 18 del Ejemplo 3 muestra las respuestas de anticuerpos específicas para ClfA221-531 recombinante en muestras de suero de ratones inmunizados con ClfAPY221-531 recombinante (rClfAPY221-531), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NrClfA221-531 = 14-15.

Ejemplos

Ejemplo 1

Truncamientos de la región A de rCIfA que comprenden N1, N2 y N3 (aminoácidos 40-559)

Material y métodos

Los detalles completos de las referencias numéricas entre paréntesis dados en los Ejemplos se proporcionan al final de esta sección.

Ratones

Se obtuvieron ratones NMRI de Scanbur BK (Sollentuna, Suecia) y se mantuvieron en la instalación para animales del Departamento de Reumatología de la Universidad de Goteborg, Suecia. La junta de ética para experimentos con animales de Goteborg aprobó los experimentos. Se alojaron hasta 10 animales por jaula con un ciclo de luzoscuridad de 12 h, y se alimentaron con pienso estándar de laboratorio y agua ad libitum. Los animales tenían de 6 a 16 semanas de edad al comienzo de los experimentos.

Cepas bacterianas

Para la infección de los animales se usaron las cepas Newman (14) y LS-1 (11) de tipo salvaje de S.aureusy derivados construidos de las mismas. Los derivadosclfAP336SY338A(clfAPYI)yclfAP336AY338S(clfAPYII)se construyeron en la cepa Newman y se transdujeron a la cepa LS-1 (véase más adelante). También se usaron los mutantes de deleción NewmancIfA2::Tn917mutante DU5876 (3) y LS-1cIfA2::Tn917mutante (J.R. Fitzgerald et al., no publicado). Las bacterias se cultivaron en placas de agar sangre durante 48 h, se recogieron y se mantuvieron congeladas a -20 °C en PBS que contenía BSA al 5 % (p/vol) (Sigma Chemicals) y dimetilsulfóxido al 10 % (vol/vol). Antes de la inyección en animales, las suspensiones bacterianas se descongelaron, se lavaron en PBS y se ajustaron a las concentraciones celulares apropiadas. El número de bacterias viables se midió en combinación con cada pulso por cultivo en placas de agar sangre y recuento de colonias.

Construcción de mutaciones clfAPYI y clfAPYII en la cepa Newman y LS-1 de S. aureus

En este experimento, se utilizó un truncamiento de región A de ClfA de longitud completa, que comprendía N1, N2 y N3, correspondientes a los aminoácidos 40 a 559. En la siguiente descripción y figuras:

ClfA también puede denominarse como rClfA 40-559 (SEQ ID NO 3);

- ClfA P336SY338A también puede denominarse comoclfAPYI,rclfAPY o rclfAPYI (es decir, clfAPYI 40-559) (SEQ ID NO 4); y

- ClfA P336AY338S también puede denominarse comoclfAPYII,rclfAPYI I (es decir,clfAPYII40-559) (SEQ ID NO 5).

Un fragmentoPstI-BamHIde 1.02 kbdepCF77 PY (Loughmanet al.,2005) que contenía las mutaciones P336S e Y338A enclfAse clonó en pBluescriptII SK- (Stratagene). Este plásmido se linealizó conHindIIIy se ligó aHindIII-cutpTSermC(J. Higgins, no publicado) para generar el plásmido pARM, que es un vector lanzadera sensible a la temperaturaE. coli-S. aureusque contiene las sustituciones P336S e Y338A.

Con el fin de reducir el riesgo de generar inadvertidamente un epítopo funcional o inmunorreactivo sustituyendo P336 e Y338, generamos un segundo mutante, en el que se invirtió el orden de las sustituciones, produciendo P336A e Y338 S. Para generar esto se generó un plásmido pJH2, análogo a pARM pero que contenía las sustituciones P336A e Y338S. Se usó PCR de cebador de superposición con los mismos cebadores flanqueantes usados para producir pCF77 PY (6), y un par diferente de cebadores mutagénicos solapantes:

F3: GCAACTTTGACCATGGCCGCTTCTATTGACCCTGAAAATG y

R3: CATTTTCAGGGTCAATAGAAGCGGCCATGGTCAAAGTTGC

(mutaciones en negrita y subrayadas) para generar pCF77 PYII. El fragmento PstI-HindIII de 1.02 kb de este plásmido se usó como se ha descrito anteriormente para generar pJH2, un vector lanzadera sensible a la temperaturaE. coli-S. aureusque contenía las sustituciones P336A e Y338S.

Tanto pARM como pJH2 se transfirieron a RN4220 (15) por electroporación y posteriormente se transdujeron usando fago 85 (16) a la cepa Newman (14) y LS-1 (11) de S.aureus.En estas cepas se indujo a los plásmidos a insertarse en el cromosoma y después a escindirse, dejando las mutaciones en el cromosoma de una proporción de transformantes, generando NewmanclfAPYI,NewmanclfAPYII,LS-1clfAPYIy LS-1 clfAPYII. Se cribaron los transformantes para determinar la pérdida del plásmido y una pérdida de la actividad de unión al fibrinógeno. La integridad del genclfAse verificó por hibridación Southern usando una sondaclfA(datos no mostrados). La expresión de una proteína inmunorreactiva (ClfAPY) se verificó mediante inmunotransferencia Western utilizando un antisuero policlonal de conejo anti-región A de ClfA (datos no mostrados). Las mutaciones se verificaron por PCR a través de los fragmentosKpnI-BamHIdel ADN genómico y secuenciación comercial de los productos. Las aproximadamente 700 bases del genclfAde la cepa LS-1 que se secuenciaron eran idénticas a las bases correspondientes en el gen NewmanclfAde la cepa Newman.

Producción de ClfA y ClfAPY recombinantes

Se produjo a partir de pCF40, como se ha descrito anteriormente (17), la región A de ClfA recombinante etiquetada con His, dominios N123 (aminoácidos 40-559), con una etapa de pulido adicional a través de una columna de intercambio aniónico. El plásmido pCF77 PY (6 ) se usó como molde para clonar los dominios N123 declfAPYIen pQE30 para generar pCF40PY. Usando este plásmido, también se produjo ClfAPY recombinante por cromatografía de afinidad de níquel y cromatografía de intercambio aniónico, como se describió para rClfA. Los eluatos se dializaron frente a dos cambios de PBS antes de la concentración y la liofilización.

Experimentos de artritis séptica y sepsis

En los experimentos 1-3 todos los ratones (n = 10 por grupo) se infectaron con la cepa Newman para desencadenar artritis. En los experimentos 4 y 5, los ratones se infectaron con la cepa Newman y LS-1, respectivamente, para inducir sepsis (n = 10 por grupo).

Experimento 1 Los ratones se infectaron por inyección intravenosa con 3.5 x 106 cfu/ratón de la cepa Newman deS.aureuso con 4.3 x 106 cfu/ratón del mutante Newman clfAPYI, ambos en 200 pl de PBS. La artritis clínica y el cambio de peso se siguieron hasta el día 7. Los ratones se sacrificaron el día 8, se evaluó el crecimiento de bacterias en los riñones y se midieron los niveles séricos de IL-6 y de IgG total. La sinovitis y la destrucción ósea se estudiaron histológicamente en las articulaciones de las patas delanteras y traseras.

Experimento 2 Los ratones se infectaron con 5.0 x 106 cfu, 6.0 x 106 cfu o 4.3 x 106 cfu de la cepa Newman deS.aureus, mutanteclfAPYIo NewmanclfA::ErmR (clfAmutante nulo), respectivamente. La artritis clínica y el cambio de peso se siguieron hasta el día 7. Los ratones se sacrificaron el día 7, se evaluó el crecimiento de bacterias en los riñones y se midieron los niveles séricos de IL-6 y de IgG total. La sinovitis y la destrucción ósea se estudiaron histológicamente en las articulaciones de las patas delanteras y traseras.

Experimento 3 Los ratones se infectaron con 4.7 x 106 cfu, 3.2 x 106 cfu, 3.9 x 106 cfu o 4.8 x 106 cfu de la cepa Newman deS.aureus, mutante clfAPYI, mutante NewmanclfAPYIIo mutante nulo NewmanclfA,respectivamente. La artritis clínica y el cambio de peso se siguieron hasta el día 7. Los ratones se sacrificaron el día 8 y se evaluó el crecimiento de bacterias en los riñones.

Los resultados de los experimentos 1-3 fueron muy similares, por lo que los datos se combinaron y se presentaron juntos.

En el Experimento 4 a los ratones se les inyectaron por vía intravenosa 5.2 x 107 cfu, 5.1 x 107 cfu o 3.3 x 107 cfu de la cepa Newman deS.aureus, mutanteclfAPYIo mutante nuloclfA,respectivamente. La mortalidad, el cambio de peso y la artritis clínica se siguieron hasta el día 10.

En el Experimento 5 los ratones se infectaron con 9.4 x 106 cfu, 7.9 x 106 cfu, 10.7 x 106 cfu o 9.8 x 106 cfu de la cepa LS-1 deS.aureus, mutante LS-1 clfAPYI, mutante LS-1 clfAPYII, o mutante nulo LS-1clfA,respectivamente. La mortalidad, la artritis clínica y el cambio de peso se siguieron hasta el día 16.

Inyección intraarticular de bacterias

En una articulación de rodilla por ratón se inyectaron 2.4 x 104 cfu, 2.4 x 104 cfu, o 3.4 x 104 cfu de la cepa Newman de tipo salvaje, mutanteclfAPYIo mutante de inactivaciónclfA,respectivamente, en 20 pl de PBS. N = 10 por grupo. Los ratones se sacrificaron 3 días más tarde, y las articulaciones de la rodilla se recogieron para el examen histopatológico.

Vacunación con ClfA recombinante de tipo salvaje y mutante

Se disolvieron rClfA40-559 purificado, rClfAPY40-559 (es decir, rClfAPYI) o BSA en una solución salina fisiológica y se emulsionaron 1:1 en adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories). Doscientos pl de la emulsión que contenía 30 pg (= 0.53 nmoles) de proteína se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) el día 0. La primera inmunización de refuerzo con 30 pg de proteína en solución salina fisiológica en adyuvante de Freund incompleto se realizó el día 11. La segunda inmunización de refuerzo se hizo el día 21. El día 30 se extrajo la sangre a los ratones y se congelaron los sueros para un análisis posterior de las respuestas de anticuerpos.

El día 31, 14-15 ratones por grupo se infectaron por inyección i.v. de 4.0 x 106 cfu/ratón para la inducción de artritis séptica, o con 2.3 x 107 cfu/ratón para la inducción de sepsis. La artritis clínica, el cambio de peso y la mortalidad se siguieron durante 11 y 15 días, respectivamente. El crecimiento bacteriano en los riñones se evaluó en el experimento de artritis séptica.

Evaluación clínica de ratones infectados

La evaluación clínica se realizó de una manera ciega. Cada extremidad fue inspeccionada visualmente. La inspección produjo una puntuación de 0 a 3 (0, sin hinchazón ni eritema; 1, hinchazón y/o eritema leve; 2, hinchazón y/o eritema moderado; 3, hinchazón y/o eritema marcado). El índice artrítico se construyó añadiendo las puntuaciones de las cuatro extremidades de un animal. El estado general de cada ratón también se examinó evaluando los signos de inflamación sistémica, es decir, disminución de peso, disminución de la vigilancia y pelaje erizado. En los casos de infección sistémica grave, cuando se determinó que un ratón estaba demasiado enfermo para sobrevivir 24 h más, se sacrificó por dislocación cervical y se consideró muerto debido a la sepsis.

Examen histológico

El examen histológico de las articulaciones se realizó usando una modificación (8) de un método descrito previamente (18).

Examen bacteriológico de riñones infectados

Los riñones se diseccionaron asépticamente, se mantuvieron en hielo, se homogeneizaron, se diluyeron en serie en PBS y se extendieron en placas de agar de sangre. Después de 24 h de incubación a 37 °C, se determinó el número de cfu por par de riñones.

Medición de IgG en suero

Los niveles en suero de IgG total se midieron mediante la técnica de inmunodifusión radial (19). Se adquirieron estándar de IgG de cabra anti-ratón y de IgG de ratón en Southern Biotech, Birmingham, AL.

Anticuerpos específicos - ELISA

Se obtuvieron muestras de suero de ratones inmunizados 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. La respuesta de anticuerpos específica en suero frente a rClfA y rClfAPY se midió mediante ELISA. Las microplacas (96 pocillos, Nunc) se recubrieron con 5 pg/ml de proteína recombinante en PBS. El agente bloqueante, las muestras en suero, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina-proxidasa se diluyeron en PBS. El ensayo se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras de suero se diluyeron 1:20.000, y la respuesta de anticuerpos se monitorizó como absorbancia a 405 nm.

En una segunda operación, para obtener una medida más precisa de las respuestas de anticuerpos específicos en los diferentes grupos de inmunización, se determinaron las respuestas en varias diluciones de suero. Por tanto, todas las muestras de suero se diluyeron 1:5.000, 1:20.000, 1:80.000 y 1:320.000, y la respuesta de anticuerpos se monitorizó como absorbancia a 405 nm.

Análisis de IL-6

Se detectó IL-6 en suero mediante un método descrito previamente (20).

Análisis estadístico

La evaluación estadística se realizó utilizando la prueba U de Mann-Whitney. P<0.05 se consideró que era significativo. Los datos se informan como medianas, intervalos intercuartiles e intervalos centrales al 80 %, a no ser que se mencione otra cosa.

Resultados

El intercambio de dos aminoácidos necesarios para la unión de ClfA al fibrinógeno dificulta el desarrollo de artritis séptica y sepsis

Se alteraron dos aminoácidos (P336 y/o Y338) que se sabe que son necesarios para la unión al fibrinógeno por ClfA mediante intercambio alélico para crear mutantes de las cepas Newman y LS1 que expresen una proteína de ClfA que no se una al fibrinógeno en la superficie celular. El nivel de expresión e integridad de la proteína se midió mediante transferencia Western, que estableció que había una buena expresión de las proteínas mutantes en la superficie bacteriana y la proteína expresada tenía el tamaño correcto.

Se investigó la capacidad de Newman de tipo salvaje y NewmanclfAP336S Y338A(clfAPYI)para provocar artritis séptica. Se indujo artritis séptica mediante inoculación intravenosa de 3.5 x 106 a 5.0 x 106 unidades formadoras de colonias (cfu) y 3.2 x 106 a 6.0 x 106 cfu de Newman de tipo salvaje y el mutante clfAPYI, respectivamente. El desarrollo de la artritis se estudió clínicamente durante 7 días. El mutante clfAPYI provocó una artritis significativamente menos grave que la cepa de tipo salvaje durante todo el periodo experimental (P> 0.001, Fig. 1 A). La frecuencia de artritis fue inferior para NewmanclfAPYIen la mayor parte de los puntos de tiempo (Fig. 6).

De forma inesperada, parece que la nueva composición de aminoácidos en la molécula ClfAPYI se adapta a la interacción con una defensa anti-bacteriana del huésped. Para comprobar esta posibilidad, se hizo una nueva construcción donde se sustituyeron diferentes aminoácidos para P336 e Y338(clfAP336A Y338S; clfAPYII). A los ratones a los que se les inocularon 3.9 x 106 cfu de NewmanclfAPYIIdesarrollaron artritis en el mismo grado bajo que el mutante clfAPYI (Fig. 1 A), y con una frecuencia similar (Fig. 6). Este resultado sugiere fuertemente que la pérdida de unión al fibrinógeno es responsable del nivel reducido de artritis.

Es posible que ClfA esté implicado en el desarrollo de la artritis por mecanismos que no implican la unión al fibrinógeno. Para ensayar esto, un mutante de deleción deClfAque carecía de la proteína ClfA se comparó con los mutantes que expresaban la proteína ClfA modificada que no se unía al fibrinógeno. Sin embargo, los ratones que se infectaron con 4.3 x 106 a 4.8 x 106 cfu del mutante nuloclfAdesarrollaron artritis de una manera no diferente de los ratones infectados con los mutantes clfAPYI yclfAPYII(Fig. 1 A). La frecuencia de la artritis también era indistinguible (Fig. 6).

Las articulaciones infectadas también se investigaron histológicamente. La sinovitis en los ratones infectados con NewmanclfAPYIera significativamente más moderada que en los ratones infectados con el tipo salvaje tanto en el experimento 1 como 2 (P = 0.02 y 0.001, respectivamente). La destrucción ósea, una causa principal de secuelas en la artritis séptica humana, estuvo casi ausente en las muestras infectadas con Newman clfAPYI (Experimento 2,P= 0.001). La sinovitis y la destrucción ósea inducidas por el mutante nulo NewmanclfAeran también menos pronunciadas en comparación con los ratones infectados con Newman de tipo salvaje (P = 0.003 y 0.006, respectivamente), pero de alguna manera más graves que en el grupo Newman clfAPYI, aunque no significativamente.

A continuación, se analizaron las consecuencias metabólicas de las mutaciones enclfApara el proceso infeccioso. Los ratones infectados con la cepa Newman de tipo salvaje perdieron hasta aproximadamente el 30 % de su peso corporal durante el período experimental. Los ratones que se infectaron con los mutantes deficientes en unión al fibrinógeno NewmanclfAPYIy NewmanclfAPYIIcasi no perdieron peso en absoluto (P > 0.0001 frente al tipo salvaje). Por el contrario, el mutante nulo NewmanclfAtuvo un efecto intermedio sobre la pérdida de peso, causando significativamente menos que la cepa de tipo salvaje, pero significativamente más que las cepas mutantes clfAPYI yclfAPYII (P< 0.02 en la mayor parte de los casos, Fig. 1 B).

Se analizaron los niveles séricos de IL-6, una medida de la respuesta inflamatoria sistémica, el día 7-8 de la infección. El patrón de la expresión de IL-6 fue similar a los cambios de peso. Newman de tipo salvaje provocó altos niveles de IL-6 en suero (4.8 (2.8, 5.7) ng/ml), el mutante NewmanclfAPYIprovocó una IL-6 considerablemente menor (0.2 (0.07, 2.4) ng/ml,P< 0.0001), mientras que el mutante nulo NewmanclfAdio lugar a una respuesta intermedia (2.5 (1.3, 3.2) ng/ml) con diferencias significativas tanto respecto al tipo salvaje como al grupo del mutanteclfAPYI (P= 0.009 y P= 0.008, respectivamente) (mediana, intervalo intercuartil).

El crecimiento de bacterias en los riñones fue significativamente mayor en los ratones infectados con Newman de tipo salvaje, en comparación tanto con los mutantes Newman clfAPY como con el mutante nulo NewmanclfA (P< 0.0001,P= 0.011, yP= 0.005, respectivamente; Figura 2). Los ratones infectados con el mutante nulo NewmanclfAtuvieron un crecimiento bacteriano significativamente mayor en los riñones que los ratones infectados con NewmanclfAPYI(P= 0.0005, Fig. 2).

La IgG total en suero se midió en los ratones el día 7-8 de la infección. Hubo un aumento significativamente menor de los niveles de IgG tanto en los grupos infectados con NewmanclfAPYIcomo mutante nulo NewmanclfAen comparación con los ratones infectados con la cepa de tipo salvaje (3.1 (1.2, 4.9); 2.3 (1.0, 2.6); y 6.4 (5.0, 11.0), respectivamente (mediana, intervalo intercuartil);P< 0.0003). No hubo diferencias significativas entre los dos grupos mutantes.

La mortalidad fue del 17 % en los ratones infectados con Newman de tipo salvaje, del 0 % en los grupos de mutantes NewmanclfAPYIyclfAPYIIy del 30 % en el grupo del mutante nulo NewmanclfA.Hubo diferencias significativas en la mortalidad entre los grupos de tipo salvaje y clfAPYI, y entre los grupos clfAPYI y mutante nuloclfA (P< 0.05 yP< 0.01, respectivamente).

Parece que los signos directos e indirectos de inflamación sistémica son más bajos en ratones infectados conS.aureusque expresa ClfA que es defectuoso en la unión al fibrinógeno. De forma inesperada, la cepa que carecía de expresión de ClfA indujo en total más inflamación sistémica que una cepa que expresa el mutante ClfAPY.

La sepsis se indujo en los ratones aumentando la dosis de inoculación de S.aureus.Los ratones se infectaron con 5.2 x 107 cfu de Newman de tipo salvaje, 5.1 x 107 cfu del mutante NewmanclfAPYIy 3.3 x 107 cfu del mutante nulo Newman clfA. En 5 días, todos los ratones infectados con el tipo salvaje murieron, pero solo un ratón del mutanteclfAPYIde diez murió después de 10 días de infección (P < 0.0001, Fig. 3). Los ratones infectados con el mutante nuloclfAtambién sobrevivieron un tiempo significativamente más corto que los ratones infectados con el mutante clfAPYI (P < 0.0001, Fig. 3). En este experimento, los ratones pulsados con el mutante nuloclfAdesarrollaron significativamente más artritis que el grupo de mutante clfAPYI, mientras al mismo tiempo perdieron significativamente más peso (Fig. 7 y 8). Por tanto, por analogía con las medidas de la inflamación sistémica en los experimentos de artritis séptica, la supervivencia de los ratones se prolonga si se expresa la molécula de ClfA, siempre que carezca de propiedades de unión al fibrinógeno.

Inyección de bacterias en las articulaciones

Para ensayar si la reacción inflamatoria en la articulación es dependiente de la unión al fibrinógeno, se inyectaron Newman de tipo salvaje, NewmanclfAPYIo NewmanclfAnulo directamente en la articulación de la rodilla de ratones, evitando de esta manera el compartimento sistémico. La sinovitis, incluyendo la infiltración polimorfonuclear de la cavidad articular, y la destrucción ósea se estudiaron por histología 3 días después. Los ratones recibieron 2.4 x 104 cfu de tipo salvaje, 2.4 x 104 cfu del mutante nuloclfA,o 3.4 x 104 cfu de mutanteclfAPYIen una rodilla. La sinovitis y el índice histológico de infiltración polimorfonuclear en la cavidad articular fue de 0.25 (0, 3.0) para las rodillas infectadas con tipo salvaje, 2.38 (0.25, 3.0) para el mutante nuloclfAy 0.25 (0, 0.25) para el mutanteclfAPYI(mediana, intervalo intercuartil). El índice histológico para la destrucción del hueso fue de 0 (0, 1,0) para el tipo salvaje, 1,0 (0, 1,0) para el mutante nuloclfA,y 0 (0, 0) para el mutanteclfAPYI(mediana, intervalo intercuartil;P= 0.01 entre el mutante clfAPYI y el mutante nuloclfA).Dado que el mutante clfAPYI provocó muy poca sinovitis y destrucción, a pesar de que se administró el 42 % más de esa cepa a los ratones que las otras cepas, se concluye que la unión al fibrinógeno promovida por ClfA es necesaria para la respuesta inflamatoria máxima dentro de la articulación. De nuevo, la ausencia de expresión de ClfA mejoró la inflamación en comparación con el mutante ClfA con unión defectuosa al fibrinógeno.

Mutación PY en la cepa LS-1

Para determinar si la capacidad de ClfA para unirse a fibrinógeno afecta a la virulencia de otras cepas deS.aureus,las mutacionesclfAPYI, clfAPYIIy nulaclfAse transdujeron en la cepa LS-1 de S.aureusque expresaba TSST-1. Los ratones se pulsaron con 9.4 x 106 cfu de LS-1 de tipo salvaje, 7.9 x 106 cfu de LS-1clfAPYI,10.7 x 106 cfu de LS-1clfAPYII,o 9.4 x 106 cfu del mutante nulo LS-1clfA.La sepsis se estudió siguiendo la tasa de supervivencia. Después de 16 días, sólo el 40 % de los ratones pulsados con la cepa de tipo salvaje estaban vivos, mientras que el 90 % de los ratones pulsados con los grupos de mutante clfAPYI y mutante nuloclfAy el 80 % de los ratones infectados con el mutanteclfAPYIIestaban vivos (Fig. 4). Los mutantes clfAPYI y el mutante nuloclfAde LS-1 eran significativamente menos virulentos (P = 0.014,P= 0.05 yP= 0.03, respectivamente).

Inmunización con proteínas ClfA recombinantes

Se estudió el efecto de la vacunación con la proteína del dominio A de ClfA de tipo salvaje recombinante (rClfA) y la proteína ClfAPYI mutante (rClfAPY) tanto en el modelo de artritis séptica como en el modelo de sepsis. Los ratones se sensibilizaron y luego se reforzaron dos veces con la proteína de control BSA, rClfA o rClfAPY, y posteriormente se infectaron con 4.0 x 106 cfu de la cepa Newman de S.aureuspara inducir artritis séptica, o con 2.3 x 107 cfu de la cepa Newman para inducir sepsis. La inmunización con rClfAPY (es decir, el dominio A de la proteína ClfAPYI recombinante) protegió significativamente contra la muerte séptica en comparación con los ratones control (P = 0.01, Fig. 5), mientras que la inmunización con rClfA no logró una protección significativa. Un día antes de la infección bacteriana, hubo una respuesta de anticuerpos en suero específica mucho más alta tanto para rClfAPY como rClfA en ratones inmunizados con rClfAPY (A405 = 0.39 (0.33, 0.56) y 0.71 (0.52, 0.81)) en comparación con ratones inmunizados con rClfA (A405 = 0.13 (0.07, 0.17) y 0.15 (0.10, 0.24),P< 0.0001 en ambas comparaciones (mediana, intervalo intercuartil)). Los animales inmunizados de control tenían sólo niveles de fondo (A405 nm = 0 y 0.01 (0, 0.01) (mediana, intervalo intercuartil)). Los ratones inmunizados que debían ser infectados con la dosis bacteriana artrítica inferior tenían respuestas de anticuerpos similares a rClfA y rClfAPY como los ratones en los que se indujo la sepsis (datos no mostrados). La inmunización tanto con rCIfA como con rCIfAPY protegió contra el desarrollo de la artritis, aunque la protección no fue significativa (Fig. 9).

Durante el día 5 a 9 después de la infección, la pérdida de peso se redujo significativamente en los ratones inmunizados con rClfAPY y rClfA, en comparación con los ratones control (datos no mostrados).

Se observó una tendencia a la disminución del crecimiento bacteriano en riñones de ratones inmunizados con rClfAPY o rClfA el día 11 después de la infección (BSA: 38 (3, 436); rClfAPY: 7 (2, 17); rCIfA: 10 (7, 54) x 107 cfu / par de riñones).

Para obtener una medida más precisa de las respuestas de anticuerpos específicas en los diferentes grupos de inmunización, se determinaron las respuestas en varias diluciones de suero (la segunda operación). Los datos muestran que eran muy probables títulos más altos de anticuerpos específicos en sueros de ratones inmunizados con rClfAPY con respecto a los antígenos de tipo salvaje rClfAPY y rClfA, tanto en los ratones que se iban a infectar con la dosis bacteriana séptica y artrítica, respectivamente, que en los sueros de ratones inmunizados con rClfA de tipo salvaje, puesto que hubo respuestas de anticuerpos significativamente más altas medidas como la absorbancia en ratones inmunizados con rClfAPY en cada dilución de suero en todas las comparaciones (P<0.0001 a P=0.008, Figura 12-15). La inmunización con BSA provocó sólo una respuesta de anticuerpos de fondo.

Conclusión

Los resultados sugieren fuertemente que la interacción ClfA-fibrinógeno es crucial para la virulencia bacteriana y el resultado de la enfermedad. La capacidad de ClfA de unirse al fibrinógeno se asoció a una mayor virulencia en términos de la capacidad de causar muerte séptica. En ambas cepas de estafilococos ensayadas, un mutanteclfAPYindujo menos muerte séptica que el tipo salvaje. Además, la gravedad de la artritis se redujo en gran medida en ratones infectados con el mutante clfAPY sin unión a fibrinógeno.

Un mecanismo probable para la promoción de la virulencia por la interacción fibrinógeno-superficie celular bacteriana es la inhibición de la fagocitosis de los neutrófilos (5). Los neutrófilos son cruciales para la defensa del huésped en la fase temprana de la infección por S.aureus(13). Sin neutrófilos, el crecimiento bacteriano aumenta fuertemente en la sangre y los riñones, y la frecuencia de la artritis y la mortalidad aumenta. La inhibición mediada por el fibrinógeno de la fagocitosis de neutrófilos por ClfA podría explicar, al menos en parte, la virulencia más pronunciada de S.aureusde tipo salvaje comparada con los mutantes clfAPY. La unión del fibrinógeno a ClfA podría disminuir la opsonofagocitosis por neutrófilos al reducir la deposición de opsonina o el acceso a las opsoninas por los receptores de neutrófilos. Alternativamente, el fibrinógeno unido podría bloquear la unión de un factor protector desconocido del huésped a S.aureus.Otra opción es que la interacción fibrinógeno-ClfA promueva el paso bacteriano de los vasos sanguíneos al tejido o promueva la colonización en los tejidos.

Inesperadamente, nuestros datos también muestran que el mutante nulo ClfA era más virulento que las cepas mutantes clfAPY. Posiblemente, la proteína ClfA tiene funciones in vivo además de la interacción con el fibrinógeno. Esta interacción es claramente desventajosa para el huésped como se muestra en este estudio. Otras funciones de ClfA no están actualmente bien mapeadas, pero la agregación plaquetaria no dependiente de fibrinógeno ejercida por ClfA podría dar como resultado la captura de grandes cantidades de S.aureusen circulación con la posterior eliminación de los complejos plaquetarios bacterianos a través del sistema reticuloendotelial. Dicha eliminación mediada por la agregación plaquetaria de estafilococos se produciría fácilmente en las cepas de tipo salvaje y mutadas clfAPY, pero no en la inactivación declfA.Mientras que en la cepa de tipo salvaje la interacción del fibrinógeno podría eclipsar los demás eventos, en los mutantes clfAPY dicha eliminación bacteriana podría ser altamente beneficiosa para el huésped.

El mutante con inactivaciónclfAprotegía contra la muerte séptica en el mismo grado que la mutación clfAPY en la cepa LS-1 de S.aureus,pero protegía menos, si es que lo hacía, en la cepa Newman. El impacto global de la expresión de ClfA sobre la virulencia bacteriana podría diferir entre diferentes cepas de S.aureusdependiendo del nivel de expresión y la presencia de otros factores de virulencia.

La cuestión de si el mutante clfAPY muestra igual o menor virulencia una vez en la cavidad articular tiene cierta importancia teniendo en cuenta que en el líquido sinovial inflamado el fibrinógeno y la fibrina son abundantes. Nuestros datos sugieren que el mutante clfAPY es menos destructivo para el cartílago y el hueso.

El efecto protector del mutante P336Y338 sin unión a fibrinógeno con dominio A de ClfA recombinante fue mayor que para rCIfA de tipo salvaje. La inmunización con ClfAPY indujo muy probablemente una mejor respuesta inmune ya que se provocaron respuestas de anticuerpos específicos más altas frente tanto al inmunógeno como a la proteína ClfA de tipo salvaje. Más importante aún, indujo una mayor respuesta inmune protectora frente a la muerte séptica que ClfA de tipo salvaje.

En conclusión, nuestros resultados muestran que rClfAPY es una mejor vacuna candidata que ClfA recombinante de tipo salvaje. Establecemos la hipótesis de que la unión de fibrinógeno por medio de la proteína ClfA de tipo salvaje durante la fase de inmunización disminuye la presentación de antígenos debido a la ocultación de importantes epítopos en la molécula de ClfA y, por lo tanto, altera la producción de anticuerpos específicos. Ejemplo 2

Truncamiento de la región A de rCIfA que comprende N2 y N3 (rCIfA 221-559)

Materiales y métodos:

Se siguieron los protocolos descritos en el Ejemplo 1 en este ejemplo, que utilizaron

- rClfA 221-559 (es decir, truncamiento de la región A de ClfA que comprende N2 y N3 correspondiente a los aminoácidos 220-559)

- rClfAPY221-559; y

- BSA.

Había 15 ratones NMRI hembra por grupo de 8 semanas de edad al inicio de los experimentos. En este Ejemplo, las construcciones utilizadas para la inmunización fueron truncamiento de N2N3 de ClfA de tipo salvaje/nativo, truncamiento de N2N3 de ClfA con la mutación PY como se define en el Ejemplo 1. BSA se usó como control. Vacunación con ClfA recombinante de tipo salvaje y mutante

Los ratones se inmunizaron con rCIfA 221-559, rClfAPY 221-559 o BSA de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1.

Si disolvieron rClfA221-559 purificado, rClfAPY221-559 (es decir, los subdominios N2 y N3 de la proteína A recombinante de ClfAPYI) o BSA en PBS y se emulsionaron 1:1 en adyuvante completo de Freund. Se inyectaron s.c. doscientos j l de la emulsión que contenía 30 |jg (= 0.79 nmoles) de proteína en el día 0. La primera inmunización de refuerzo con 30 jg de proteína en solución salina fisiológica en adyuvante incompleto de Freund se realizó el día 12. La segunda inmunización de refuerzo se hizo el día 22. El día 31 se extrajo la sangre a los ratones y se congelaron los sueros para un análisis posterior de las respuestas de anticuerpos.

Anticuerpos específicos - ELISA

Se obtuvieron muestras de suero de ratones inmunizados 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. La respuesta de anticuerpos específicos en suero contra rCIfA221-559 y rClfAPY221-559 se midió mediante ELISA. Las microplacas (96 pocillos, Nunc) se recubrieron con 5 pg/ml de proteína recombinante en PBS. El agente bloqueante, las muestras de suero, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina-proxidasa se diluyeron en PBS. El ensayo se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras de suero se diluyeron 1:5.000, 1:20.000, 1:80.000 y 1:320.000, y la respuesta de anticuerpos se monitorizó como absorbancia a 405 nm.

Resultados:

Respuesta de anticuerpos específicos:

La respuesta de anticuerpos se midió por la absorbancia en un ensayo ELISA, según el Ejemplo 1, con cuatro diluciones de suero diferentes. Los datos obtenidos fueron muy similares a los datos del Ejemplo 1.

Se encontró que la inmunización con rClfAPY221-559 muy probablemente dio lugar a títulos más altos de anticuerpos específicos tanto para rClfA221-559 nativo como rClfAPY221-559, en comparación con la inmunización con rCIfA221-599 nativo, ya que había respuestas de anticuerpos significativamente más altas medidas como la absorbancia en ratones inmunizados con rClfAPY221-559 en cada dilución de suero en todas las comparaciones, excepto una (P = 0.001 a 0.025, véanse las Figuras 16 y 17). La inmunización con BSA provocó sólo los niveles de fondo de la respuesta de anticuerpos.

Conclusión

Encontramos que la inmunización con una proteína rClfAPY221-559 daba lugar a respuestas de anticuerpos significativamente más altas tanto para el inmunógeno como para la proteína ClfA de tipo salvaje, que la inmunización con la proteína nativa.

En base a estos hallazgos, concluimos que la inmunización con PY, independientemente de si la proteína PY comprende los aminoácidos 40 a 550 como en el Ejemplo 1 o los aminoácidos 221 a 559 como en el Ejemplo 2, induce una mejor respuesta inmune que la inmunización con ClfA nativa del tamaño correspondiente.

Ejemplo 3

Truncamiento de la región A de ClfA (truncamiento de retención 5/delta)

Materiales y métodos:

Se siguieron los protocolos descritos en el Ejemplo 1 en este ejemplo, que utilizó la siguiente construcción: - rClfA 221-531 (es decir, truncamiento de la región A de rClfA que comprendía los aminoácidos N2 y N3 220-559 pero sin los aminoácidos peptídicos de retención 532-538 y los posteriores residuos ricos en prolina. Había 15 ratones NMRI hembra en el grupo de 8 semanas de edad al inicio del experimento. En este Ejemplo, se usó la construcción anterior para la inmunización. Los ratones se inmunizaron con el truncamiento anterior de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1.

Vacunación con ClfA recombinante de tipo salvaje y mutante

Se disolvió rCIfA221-531 purificado en PBS y se emulsionó 1:1 en adyuvante completo de Freund. Se inyectaron s.c. doscientos pl de la emulsión que contenía 0.79 nmoles de proteína en el día 0. La primera inmunización de refuerzo con 0.79 nmoles de proteína en solución salina fisiológica en adyuvante incompleto de Freund se realizó el día 12. La segunda inmunización de refuerzo se hizo el día 22. El día 31 se extrajo la sangre a los ratones y se congelaron los sueros para un análisis posterior de las respuestas de anticuerpos.

Anticuerpos específicos - ELISA

Se obtuvieron muestras de suero de ratones inmunizados 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los niveles en suero de los anticuerpos específicos se midieron por ELISA. Las microplacas (96 pocillos; Nunc) se recubrieron con 4.6 pg/ml de proteína rCIfA221-531 que es equimolar a 5 pg/ml de rClfA221-559 y rClfAPY221-559 de los Ejemplos 1 y 2. El agente bloqueante, las muestras de suero, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina-proxidasa se diluyeron en PBS. El ensayo se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras de suero se diluyeron 1:5.000, 1:20.000, 1:80.000 y 1:320.000, y la respuesta de anticuerpos se monitorizó como absorbancia a 405 nm.

Resultados:

La respuesta de anticuerpos se midió por absorbancia en un ensayo ELISA, según el Ejemplo 1. Se encontró que la inmunización con rCIfA221-531 daba lugar a una respuesta inmune, medida como una respuesta de anticuerpos específicos (Figura 18).

Conclusión:

Encontramos que rCIfA221-531 también funciona bien como un inmunógeno, ya que el antígeno provoca una respuesta de anticuerpos específicos.

REFERENCIAS

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante seleccionada del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno, para su uso en terapia.

2. La proteína de unión a fibrinógeno recombinante para su uso en terapia según la reivindicación 1 derivada de S.aureus, S. epidermidisy/o S.lugdunensis.

3. La proteína de unión a fibrinógeno recombinante para su uso en terapia según una cualquiera de las reivindicación 1 o 2, en la que el residuo P336 y/o Y338 de la región de unión a fibrinógeno (Región A) de ClfA se sustituye con bien serina o alanina para dar lugar a rClfAP336S Y338A o rClfAP336 A Y338S; opcionalmente, en donde la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 3 en donde el residuo P336 y/o Y338 se sustituyen bien con serina y/o alanina.

4. La proteína de unión a fibrinógeno recombinante para su uso en terapia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende la proteína de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno, y/o un fragmento de la misma, en donde el fragmento comprende las subregiones N123, que abarcan los residuos de aminoácidos 40 a 559 de la región de unión a fibrinógeno (Región A).

5. La proteína de unión a fibrinógeno recombinante para su uso en terapia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO 4 a 5.

6. La proteína de unión a fibrinógeno recombinante para su uso en terapia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha terapia es el tratamiento o profilaxis de infecciones microbianas, incluyendo sepsis, artritis séptica y/o endocarditis, preferiblemente causadas por estafilococos.

7. Uso de una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, que se selecciona del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno en una vacuna.

8. Uso de una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, que se selecciona del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno en una composición farmacéutica inmunogénica.

9. Uso de una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, que se selecciona del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno en la generación de una vacuna.

10. Uso de una proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante, que se selecciona del factor A de aglutinación (ClfA) o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el fragmento comprende las subregiones N2 y N3 de la región de unión a fibrinógeno de ClfA, que corresponde a los aminoácidos 220 a 559, y que comprende al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido Tyr256, Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527, en donde la al menos una sustitución de residuo de aminoácido en el residuo Pro336 y/o Tyr338 es sustitución con ya sea Ala y/o Ser, para dar como resultado una proteína de unión a fibrinógeno recombinante que carece de la capacidad de unirse a fibrinógeno en la generación de una composición farmacéutica inmunogénica.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la proteína de unión a fibrinógeno recombinante deriva de S.aureus, S. epidermidisy/o S.lugdunensis.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el residuo P336 y/o Y338 de la región de unión a fibrinógeno (Región A) de ClfA se sustituye con bien serina o alanina para dar lugar a rClfAP336S Y338A o rClfAP336 A Y338S; opcionalmente, en donde la proteína de unión a fibrinógeno de estafilococo recombinante tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO 1 a 3 en donde el residuo P336 y/o Y338 se sustituyen bien con serina y/o alanina.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde la proteína de unión a fibrinógeno recombinante comprende la proteína de unión a fibrinógeno, la región de unión a fibrinógeno, y/o un fragmento de la misma, en donde el fragmento comprende las subregiones N123, que abarcan los residuos de aminoácidos 40 a 559 de la región de unión a fibrinógeno (Región A).

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde la proteína de unión a fibrinógeno recombinante comprende la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO 4 y 5.