ES2600154T3

ES2600154T3 - Anticuerpos antiteofilina y métodos de uso

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Publication number: ES2600154T3
Application number: ES13737564.8T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Brinkmann; Guy Georges; Eike Hoffmann
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2017-02-07
Anticipated expiration: 2033-07-04
Also published as: MX353951B; EP3138578A1; BR112014030843A2; CN104394886B; HK1203354A1; HUE029435T2; EP3138578B1; JP2018138561A; CN107082810A; CN107082810B; EP2869837A1; RU2630664C2; EP2869837B1; US20150238628A1; RU2015102068A; KR20150023938A; US9925272B2; WO2014006118A1; PL2869837T3; RU2017128512A

Abstract

Un anticuerpo anti-teofilina en el que el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07; en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende, en la posición 71 del dominio variable de cadena pesada numerado de acuerdo con Kabat, el resto de aminoácido arginina, y comprende, en la posición 46 del dominio variable de cadena ligera numerado de acuerdo con Kabat, el resto de aminoácido leucina.

Description

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HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03.

En el presente documento se presenta un anticuerpo anti-teofilina que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07. El anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; y

(c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.

En el presente documento se presenta un anticuerpo anti-teofilina que comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de VH HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres VL HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-teofilina que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.

En una realización, el anticuerpo anti-teofilina es humanizado.

Se presenta en el presente documento un anticuerpo anti-teofilina humanizado que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

Se presenta en el presente documento un anticuerpo anti-teofilina humanizado que comprende al menos una, al menos dos, o las tres VH HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En una realización adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

Se presenta en el presente documento un anticuerpo anti-teofilina humanizado que comprende al menos una, al menos dos, o las tres VL HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

Se presenta en el presente documento un anticuerpo que comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de VH HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y

(c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

Se presenta en el presente documento un anticuerpo anti-teofilina humanizado que comprende a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia

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de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15.

En otro aspecto, al invención proporciona un anticuerpo anti-teofilina humanizado que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07, en el que el resto de aminoácido en la posición 60 en la HVR-H2 es A y el resto de aminoácido de la posición 61 en la HVR-H2 es Q.

El anticuerpo anti-teofilina humanizado comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además un marco conservado humano aceptor, por ejemplo, un marco conservado de inmunoglobulina humana o un marco conservado consenso humano. El anticuerpo anti-teofilina humanizado comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende, además

-R en la posición 71.

La posición 71 de Kabat corresponde al número de resto 72 de SEQ ID NO: 04, 12 y 20.

Este cambio (retromutación) se introdujo para aumentar la afinidad de unión del anticuerpo anti-teofilina humanizado.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-teofilina comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 04. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o supresiones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-teofilina que comprende esa secuencia conserva la capacidad para unirse con teofilina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o suprimido en SEQ ID NO: 04. En ciertas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones o supresiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-teofilina comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 04, incluyendo modificaciones posttraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-teofilina, en el que el anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o supresiones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-teofilina que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse con teofilina. En ciertas realizaciones, se han sustituido, insertado y/o suprimido un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 08. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o supresiones aparecen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-teofilina comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 08, incluyendo modificaciones posttraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-teofilina, en el que el anticuerpo comprende un VH, como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 04 y SEQ ID NO: 08, respectivamente, incluyendo modificaciones posttraduccionales de esas secuencias.

El anticuerpo anti-teofilina humanizado comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además un marco conservado humano aceptor, por ejemplo, un marco conservado de inmunoglobulina humana o un marco conservado consenso humano. En una realización, un anticuerpo anti-teofilina humanizado comprende un VL que comprende HVR-L como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende, además

-L en la posición 46.

La posición 46 de Kabat corresponde al número de resto 51 de SEQ ID NO: 08, 16 y 24.

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en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen las concentraciones de cada Fab que proporciona menos de o igual a 20 % de unión máxima para uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otra realización, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con microplacas CM5 con antígeno inmovilizado a aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activan microplacas biosensoras de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye antígeno con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, hasta 5 μg/ml (~0,2 μM) antes de la inyección a un caudal de 5 μl/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear grupos que no han reaccionado. Para mediciones de cinética, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo de polisorbato 20 (TWEEN-20™) 0,05 % (PBST) a 25°C a un caudal de aproximadamente 25 ml/min. Se calculan las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (software de evaluación BIACORE versión 3.2) mediante ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881. Si la velocidad de asociación supera 106M-1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de detención de fluorescencia que mide el aumento o la reducción de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se miden en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO ™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Fragmentos de anticuerpo

En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos posteriormente. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., en; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, Nueva York (1994), pág. 269-315; véase también documento WO 93/16185; y patentes de Estados Unidos N.º 5.571.894 y 5.587.458. Para análisis de fragmentos de Fab F(ab’)2 que comprenden restos epitópicos de unión a receptor de recuperación y que tienen semivida in vivo aumentada, véase patente de Estados Unidos N.º 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con los sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, documentos EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; y Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. También se describen diacuerpos y tetracuerpos en Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).

Los anticuerpos de único dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o una parte del dominio variable de cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de un único dominio es un anticuerpo de un único dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos N.º 6.248.516 B1).

Pueden prepararse fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitación, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

3. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.º 4.816.567; y Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo con “clase cambiada” en el que la clase o subclase se ha cambiado de la del anticuerpo parental. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, conservando al mismo tiempo la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que HVR, por ejemplo, CDR, (o partes de las mismas) derivan de un anticuerpo no humano, y FR (o partes de las mismas) derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos restos FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con restos correspondientes de un

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anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los restos de HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y métodos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; patentes de Estados Unidos N.º 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describe injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que describe “cambio de superficie"); Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describe “redistribución de FR"); y Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 y Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describe el enfoque de “selección guiada” para la redistribución de FR).

Las regiones marco conservadas humanas que pueden usarse para humanización incluyen, pero sin limitación: regiones marco conservadas seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiones marco conservadas derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones marco conservadas maduras humanas (mutadas de forma somática) o regiones marco conservadas de línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); y regiones marco conservadas derivadas de exploración de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 y Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).

4. Anticuerpos multiespecíficos

En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Son anticuerpos multiespecíficos anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En ciertas realizaciones, una de las especificidades de unión es para teofilina y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse con dos epítopos diferentes de teofilina. Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para localizar agentes citotóxicos para células que expresan teofilina. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase, Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, documento WO 93/08829, y Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), e ingeniería de “botón en ojal” (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.º 5.731.168). También pueden prepararse anticuerpos multiespecíficos modificando técnicamente efectos de dirección electroestática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos N.º 4.676.980, y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; usando tecnología de “diacuerpos” para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y usando dímeros de Fv monocatenario (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

También se incluyen en el presente documento anticuerpos modificados técnicamente con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo “anticuerpos Octopus” (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).

El anticuerpo o fragmento del presente documento también incluye un “Fab de acción doble” o “DAF” que comprende un sitio de unión a antígeno que se une con teofilina, así como otro antígeno diferente (véase, el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

El anticuerpo o fragmento del presente documento también incluye anticuerpos multiespecíficos descritos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793.

5. Variantes de anticuerpo

En ciertas realizaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede preparase cualquier combinación de supresión, inserción y

sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y supresión

5 En ciertas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y FR. Se muestran sustituciones conservativas en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de “sustituciones preferidas”. Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de “sustituciones ejemplares”, y como se describe

10 adicionalmente posteriormente en referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y los productos explorarse con respecto a una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad reducida o ADCC o CDC mejorada.

Tabla 1

Resto original: Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas

Ala (A): Val; Leu; Ile Val

Arg (R): Lys; Gln; Asn Lys

Asn(N): Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln

Asp (D): Glu; Asn Glu

Cys (C): Ser; Ala Ser

Gln (Q): Asn; Glu Asn

Glu (E): Asp; Gln Asp

Gly (G): Ala Ala

His (H): Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I): Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu

Leu (L): Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile

Lys (K): Arg; Gln; Asn Arg

Met (M): Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F): Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P): Ala Ala

Ser (S): Thr Thr

Thr (T): Val; Ser Ser

Trp (W): Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y): Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V): Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

15 Pueden agruparse aminoácidos de acuerdo con propiedades de cadenas laterales comunes:

(1) Hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;20 (3) Ácidos: Asp, Glu;

(4): Básicos: His, Lys, Arg;

(5): restos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro;

(6): Aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

25 Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o las variantes resultantes seleccionadas para estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) de ciertas propiedades

30 biológicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo parental y/o

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como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede preparase una inmunotoxina ricina como se describe en Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. El ácido 1-isotiocianatobencil-3metildietilen triamino pentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase documento WO 94/11026. El enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Puede usarse, por ejemplo, un enlazador lábil por ácidos, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; patente de Estados Unidos N.º 5.208.020).

Los inmunoconjugados o ADC en el presente documento contemplan expresamente, pero sin limitación, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación incluyendo, pero sin limitación, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están disponibles en el mercado (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., Estados Unidos).

E. Métodos y composiciones para diagnóstico y detección

El término “detectar” como se usa en el presente documento abarca detección cuantitativa o cualitativa.

En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-teofilina para uso en un método de diagnóstico o detección. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo.

En ciertas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-teofilina marcados. Los marcadores incluyen, pero sin limitación, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrón densos, quimioluminiscentes y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero sin limitación, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelados de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de Estados Unidos N.º 4.737.456), luciferina, 2,3dihidroftalazinedionas, peroxidasa de rábano rusticano (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, Iisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, teofilina/avidina, marcadores de espín, marcadores bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

F. Formulaciones farmacéuticas

Se preparan formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-teofilina como se describe en el presente documento mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. (ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son en general no tóxicos para receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetilbencilamonio; cloruro de hexamentonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menores de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas de hialuronidasa activas neutras solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertas sHASEGP ejemplares y métodos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en la publicación de patente de Estados Unidos N.º 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas ejemplares en la patente de Estados Unidos N.º 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en la patente de Estados Unidos N.º 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato.

La formulación del presente documento también puede contener más de un principio activo según sea necesario para la indicación particular que se trate, preferentemente, los que tienen actividades complementarias que no se

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de un Qiashredder (Qiagen) y después se sometieron al procedimiento de purificación mediado por matriz (ETOH, columnas RNeasy) como se describe en el manual del fabricante. Después de la última etapa de lavado, se recuperó ARN de las columnas en 50 μl de agua sin RNAsa. La concentración del ARN recuperado se determinó mediante cuantificación A260 y A280 de muestras diluidas 1:20. La integridad (calidad, grado de degradación) de las muestras de ARN aisladas se realizó mediante electroforesis en gel de ARN desnaturalizante en geles de formamida-agarosa (véase, manuales de Maniatis). Se obtuvieron bandas discretas que representan los ARN ribosómicos 18s y 28s intactos y la integridad (y aproximadamente relaciones de intensidad 2:1) de estas bandas indicó una buena calidad de las preparaciones de ARN. Los ARN aislados de hibridoma se congelaron y se almacenaron a -80 ºC en alícuotas.

Generación de fragmentos de ADN que codifican VH y VH por PCR RACE, clonación de estos fragmentos de ADN en plásmidos y determinación de sus secuencias de aminoácidos y ADN.

El ADNc para reacciones de PCR (RACE) posteriores se preparó a partir de preparaciones de ARN aplicando las tecnologías como se ha descrito en la solicitud de patente internacional PCT/EP2011/074273. Posteriormente, los fragmentos de PCR que codificaban VH y VL se aislaron mediante extracción en gel de agarosa y posterior purificación mediante técnicas de biología molecular convencionales. Se insertaron fragmentos de PCR purificados generados por PWO en el vector PCR bluntII topo aplicando el kit de pCR bluntII topo (Invitrogen) siguiendo con exactitud las instrucciones del fabricante. Las relaciones de topoligación se transformaron en células competentes E: coli Topo10-one-shot. A continuación, se identificaron clones E. coli que contenían vectores con insertos que contenían VL o VH como colonias en placas de agar de LB-Kanamicina. Se prepararon plásmidos a partir de estas colonias y se confirmó la presencia del inserto deseado en el vector mediante digestión de restricción con EcoRI. Debido a que la cadena principal del vector contiene sitios de reconocimiento de restricción de EcoRI que flanquean cada lado del inserto, se definieron plásmidos que albergaban insertos por tener insertos liberables por EcoRI de aproximadamente 800 pb (para VL) o 600 pb (para VH). La secuencia de ADN y la secuencia de proteína deducida del VH y VL se definieron mediante secuenciación de ADN automática en clones múltiples para VH y VL.

La secuencia de VL murina del anticuerpo anti-teofilina se representa en SEQ IDNO: 08. La secuencia de VH murina del anticuerpo anti-teofilina se representa en SEQ ID NO: 04.

Ejemplo 2

Humanización de los dominios VH y VL de anticuerpo anti-teofilina murino

El anticuerpo de unión a teofilina murino se humanizó de la siguiente manera: se generó un anticuerpo anti-teofilina humanizado basado en la combinación del marco conservado de línea germinal humana IGHV4-31-02 y IGKV2-30

01. El VH humanizado se basa en la línea germinal IGHV4-31-02 humana y el elemento J humano de la línea germinal IGHJ4-01-3. Se introdujo una retromutación en la región marco conservada en la posición 71 (V71R). El VL humanizado se basa en la línea germinal IGHV2-30-01 humana y el elemento J humano de la línea germinal IGKJ2

01. Se introdujo una retromutación en la región marco conservada 2 en la posición 46 (R46L). La secuencia de aminoácidos del VH humanizado se representa en SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos del VL humanizado se muestra en SEQ ID NO: 16.

Ejemplo 3

Composición, expresión y purificación de anticuerpos anti-teofilina recombinantes

Se combinaron regiones variables de anticuerpo anti-teofilina murinas y humanizadas con regiones constantes de origen humano para formar anticuerpos quiméricos o humanizados mono o biespecíficos.

La generación de anticuerpos anti-teofilina humanizados monoespecíficos y anticuerpos anti-teofilina humanizados biespecíficos que se unen específicamente con teofilina así como con una diana distinta de teofilina diferente (por ejemplo, tirosina quinasas receptoras o IGF-1R) requirió (i) el diseño y la definición de secuencias de aminoácidos y nucleótidos para dichas moléculas, (ii) expresión de estas moléculas en células de mamífero cultivadas transfectadas y (iii) purificaciones de estas moléculas de los sobrenadantes de células transfectadas. Estas etapas se realizaron como se ha descrito previamente en el documento PCT/EP2011/074273.

En general, para generar un anticuerpo humanizado de la clase IgG que tiene la especificidad de unión del anticuerpo anti-teofilina murino (original), se fusionó la secuencia de VH humanizada en fase con el extremo N terminal de CH1-bisagra-CH2-CH3 de una región Fc humana de la subclase IgG1. De forma similar, la secuencia de VL humanizada se fusionó en fase con el extremo N terminal de la región constante CLkappa humana.

Para generar derivados de anticuerpo biespecíficos que contienen la especificidad de unión a teofilina, así como especifidades con otras dianas, se fusionó el anticuerpo anti-teofilina, un fragmento scFv o Fab en fase con el extremo C terminal de la cadena pesada de anticuerpos previamente descritos. En muchos casos, el scFv

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antihapteno aplicado se estabilizó adicionalmente mediante introducción de un enlace disulfuro VH44-VL 100 que se ha descrito previamente (por ejemplo, Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245).

Plásmidos de expresión

Los plásmidos de expresión comprenden casetes de expresión para la expresión de las cadenas pesada y ligera se ensamblaron por separado en vectores de expresión de células de mamífero.

Por lo tanto, los segmentos génicos que codifican los elementos individuales se unieron como se ha indicado anteriormente.

Se proporciona información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas humanas de la que puede deducirse el uso codónico en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Publicación NIH N.º 913242.

La unidad de transcripción de la cadena ligera κ está compuesta de los siguientes elementos:

-el potenciador temprano inmediato y promotor del citomegalovirus humano (hCMV), -un 5’-UT sintético que incluye una secuencia Kozak, -una secuencia señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia señal, -el ADNc de cadena ligera variable clonado dispuesto con un sitio de restricción BsmI único en el extremo 5’ y un

sitio donante de corte y empalme y un sitio de restricción de Notl único en el extremo 3’, -la región constante de gen κ humana genómica, que incluye el potenciador de Ig-κ de ratón de intrón 2 (Picard,

D. y Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), y -la secuencia señal de κ-poliadenilación de inmunoglobulina humana ("poli A").

La unidad de transcripción de la cadena pesada de κl está compuesta de los siguientes elementos:

-el potenciador temprano inmediato y promotor del citomegalovirus humano (hCMV), -un 5’-UT sintético que incluye una secuencia Kozak, -una secuencia señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina modificada que incluye el intrón de secuencia

señal,

-el ADNc de cadena pesada variable monoespecífico clonado o el ADN de cadena pesada variable-scFv de fusión biespecífico clonado dispuestos con un sitio de restricción BsmI único en el extremo 5’ y un sitio donante de corte y empalme y un sitio de restricción de Notl único en el extremo 3’,

-la región constante de γI-pesado humano genómica, incluyendo el potenciador μ de Ig de ratón (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), y -la secuencia señal de poliadenilación de γI inmunoglobulina humana ("poliA").

Además del casete de expresión de cadena ligera κ o cadena pesada γI estos plásmidos contienen

-un gen de resistencia a higromicina, -un origen de replicación, oriP, de virus de Epstein-Barr (VEB), -un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y -un gen de β-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli.

Técnicas de ADN recombinante

Se realizó clonación usando técnicas de clonación convencionales como se describe en Sambrook et al., 1999 (mencionado anteriormente). Todos los activos biológicos moleculares estaban disponibles en el mercado (si no se indica de otro modo) y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El ADN que contiene secuencias codificantes, mutaciones o elementos genéticos adicionales se sintetizó por Geneart AG, Regensburg.

Se determinaron secuencias de ADN mediante secuenciación bicatenaria realizada en SequiServe (SequiServe GmbH, Alemania).

Análisis de secuencia de ADN y proteína y control de datos de secuencia

Se usó el conjunto de programas Vector NTI Advance versión 9.0 para creación de secuencias, mapeo, análisis, anotación e ilustración.

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Claims

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