ES2375931T3

ES2375931T3 - Humanización de anticuerpo murino.

Info

Publication number: ES2375931T3
Application number: ES98960758T
Authority: ES
Inventors: Carlos F. Barbas, Iii; Christoph Rader
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2018-12-04
Also published as: CY1112365T1; EP1034298A4; IL136544A; US20030166871A1; IL136544A0; ATE531812T1; AU1628099A; AU760562B2; JP2001526044A; DK1034298T3; BR9813365A; PT1034298E; JP4460155B2; EP1034298B1; CA2312208C; EP1034298A1; US7087409B2; WO1999029888A1; CA2312208A1

Abstract

Método para producir un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado, que comprende las etapas siguientes: (a) construir una primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas tiene una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad (CDR3) de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable de origen humano; (b) combinar la primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas construida de la etapa (a) con una cadena complementaria de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, de forma que la cadena complementaria, junto con una cadena humanizada presente en la librería construida, forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados, en el que la cadena complementaria es una cadena quimérica de ratón/humana; (c) seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (b) un par particular de cadenas pesada y ligera humanizadas usando dicha cadena complementaria, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera humanizadas se selecciona para la unión a dicho antígeno preseleccionado; (d) construir una segunda librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada cadena tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable; en el que las cadenas de dicha segunda librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado son la cadena pesada o ligera complementaria de dichas cadenas de la primera librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado de la etapa (a), de manera que una librería es una librería de cadenas ligeras y la otra librería es una librería de cadenas pesadas; (e) aislar una cadena pesada o ligera del par de cadenas pesada y ligera humanizadas de unión al antígeno de la etapa (c), y combinar dicha cadena de unión al antígeno con cadenas de dicha segunda librería de la etapa (d), de manera que la cadena de unión al antígeno, junto con las cadenas presentes en la librería construida de la etapa (d), forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados; y (f) seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (e) un par de cadenas y ligera humanizadas que se une a dicho antígeno preseleccionado.

Description

Humanización de anticuerpo murino.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la humanización de anticuerpos murinos.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos comprenden típicamente dos cadenas pesadas enlazadas juntas mediante enlaces de disulfuro, y dos cadenas ligeras enlazadas a una cadena pesada respectiva mediante un enlace de disulfuro. Al comienzo de un extremo de cada cadena pesada existe un dominio variable, seguido de varios dominios constantes. De forma similar, cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo, pero solamente un solo dominio constante en su otro extremo. Hay dos tipos de cadena ligera, que se denominan cadenas lambda (A) y kappa (K). No se ha encontrado ninguna diferencia funcional entre anticuerpos que tienen cadenas ligeras A o K. Sin embargo, la relación de los dos tipos de cadena ligera varía de una especie a otra. En ratones, la relación K:A es 20:1, mientras que en seres humanos es 2:1.

Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada están alineados, como lo está el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes en las cadenas ligera y pesada no están involucrados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno.

Son los dominios variables los que forman el sitio de unión de los anticuerpos al antígeno. La estructura general de cada dominio de las cadenas ligera y pesada comprende un armazón de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas por tres regiones que determinan la complementariedad (CDR). Las cuatro regiones de armazón emplean una conformación de lámina beta, y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las CDR se mantienen en estrecha proximidad mediante las regiones de armazón, y, con las CDR del otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno.

Aunque los antígenos de la superficie celular de células tumorales son las dianas tradicionales para la terapia contra el cáncer guiada por anticuerpos, una de las limitaciones principales para la terapia de tumores sólidos es la baja accesibilidad de los antígenos tumorales a los anticuerpos que circulan en el torrente sanguíneo. El empaquetamiento denso de las células tumorales y la elevada presión intersticial en el núcleo tumoral presentan barreras físicas formidables.

Una solución al problema de la mala penetración de los anticuerpos en tumores sólidos sería atacar a las células endoteliales que forran los vasos sanguíneos del tumor, en vez de a las propias células tumorales. Aunque puede ser difícil dirigirse específicamente a la vasculatura tumoral madura, es decir, sin destruir el tejido sano, estrategias prometedoras apuntan a la inhibición de la neovascularización.

La neovascularización, también denominada angiogénesis, es inducida por citocinas que son segregadas a partir de células tumorales, y depende de la migración e invasión de células vasculares, procesos regulados por moléculas de adhesión celular (CAM) y por proteasas. Estas moléculas se consideran actualmente como dianas potenciales para los inhibidores angiogénicos. A este respecto, la integrina vascular av�3 se ha identificado recientemente como un marcador de vasos sanguíneos angiogénicos. Véase Brooks, P.C., et al. (1994), REQUIREMENT OF INTEGRIN av�3 FOR ANGIOGENESIS, Science 264, 569-571. Además, se demostró que el anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón LM609 dirigido contra integrina av�3 fue capaz de suprimir la angiogénesis, indicando que la integrina av�3 tiene un papel crítico en la angiogénesis.

Se ha demostrado además que LM609 promueve selectivamente la apoptosis de células vasculares que han sido estimuladas a sufrir angiogénesis. Véase Brooks, P.C., et al. (1994), INTEGRIN av�3 ANTAGONISTS PROMOTE TUMOR REGRESSION BY INDUCING APOPTOSIS OF ANGIOGENIC BLOOD VESSELS, Cell 79, 1157-1164. Estos hallazgos sugieren que la integrina av�3 puede ser una diana, y LM609 una herramienta para el diagnóstico y terapia del cáncer.

De hecho, LM609 no sólo evitó el crecimiento de tumores humanos histológicamente bien definidos implantados en membranas corioalantoicas de embriones de pollo, sino también indujo su regresión. Véase Cell 79, 1157-1164. Usando un modelo clínicamente más pertinente de crecimiento tumoral, se encontró que LM609 bloqueó el crecimiento de cáncer de mama humano en un modelo quimérico de ratón SCID/humano. De forma importante, LM609 no sólo bloqueó el crecimiento tumoral, sino también inhibió la metástasis de los carcinomas de mama examinados. Véase Brooks, et al. (1995) ANTI-INTEGRIN av�3 BLOCKS HUMAN BREAST CANCER GROWTH AND ANGIOGENESIS IN HUMAN SKIN, J. Clin. Invest. 96, 1815-1822.

Los resultados de Brooks et al. son consistentes con estudios previos que han sugerido que la angiogénesis contribuye a la diseminación metastásica de células de tumor de mama. Véase Weidner, N., et al. (1991) TUMOR ANGIOGENESIS AND METASTASIS: CORRELATION IN INVASIVE BREAST CARCINOMA, N. Engl. J. Med. 324, 1-8; y Weidner, N., et al. (1992) TUMOR ANGIOGENESIS: A NEW SIGNIFICANT AND INDEPENDENT PROGNOSTIC INDICATOR IN EARLY-STAGE BREAST CARCINOMA, J. Natl. Cancer Inst. 84, 1875-1887.

En los últimos años, se han presentado pruebas de que existen dos rutas de angiogénesis dependientes de citocinas, y que están definidas por su dependencia de integrinas vasculares bien claras. Véase Friedlander, M., et al. (1995) DEFINITION OF TWO ANGIOGENIC PATHWAYS BY DISTINCT AV INTEGRINS, Science 270, 15001502. Los resultados de los estudios de Friedlander et al. muestran que el anticuerpo LM609 anti-av 3 bloqueó la angiogénesis en respuesta a bFGF y TNFa, aunque tiene poco efecto sobre la angiogénesis inducida por VEGF, TGFa, o éster de forbol PMA. Por el contrario, el anticuerpo P1F6 anti-av 5 bloquea la angiogénesis inducida por VEGF, TGFa, y el éster de forbol PMA, aunque tiene efectos mínimos sobre la inducida por bFGF o TNFa.

De este modo, es concebible que los tumores que muestran menos susceptibilidad a anticuerpos anti-av 3 pueden segregar citocinas que promueven la angiogénesis de una manera dependiente de av 5. Tomados en conjunto, tanto los anticuerpos anti-av 3 como anti-av 5 son herramientas prometedoras para el diagnóstico y la terapia del cáncer.

Sin embargo, los anticuerpos monoclonales de ratón, tales como LM609, son muy inmunógenos en seres humanos, limitando así su uso potencial para la terapia contra el cáncer, especialmente cuando es necesaria una administración repetida. Para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales de ratón, se generaron anticuerpos monoclonales quiméricos, fusionándose los dominios de Ig variables de un anticuerpo monoclonal de ratón a los dominios de Ig constantes de ser humano. Véanse Morrison, S.L., et al. (1984) CHIMERIC HUMAN ANTIBODY MOLECULES; MOUSE ANTIGEN-BINDING DOMAINS WITH HUMAN CONSTANT REGION DOMAINS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; y Boulianne, G.L., et al. (1984) PRODUCTION OF A FUNCTIONAL CHIMAERIC MOUSE/HUMAN ANTIBODY, Nature 312, 643-646. Este proceso se denomina habitualmente como “humanización” de un anticuerpo.

En general, los anticuerpos monoclonales quiméricos retienen la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal de ratón, y muestran interacciones mejoradas con células efectoras humanas. Esto da como resultado una citotoxicidad celular mejorada dependiente de anticuerpos que se supone que es una de las vías para eliminar células tumorales usando anticuerpos monoclonales. Véase Morrison, S.L. (1992) IN VITRO ANTIBODIES: STRATEGIES FOR PRODUCTION AND APPLICATION, Ann. Rev. Immunol. 10, 239-265. Aunque algunos anticuerpos monoclonales quiméricos han demostrado ser menos inmunógenos en seres humanos, los dominios de Ig variables de ratón todavía pueden conducir a una respuesta anti-ratón significativa del ser humano. Véase Bruggemann, M., et al. (1989) THE IMMUNOGENICITY OF CHIMERIC ANTIBODIES. J. Exp. Med. 170, 2153-2157. Por lo tanto, para los fines terapéuticos, puede ser necesario humanizar completamente un anticuerpo monoclonal murino alterando tanto los dominios de Ig variables como constantes.

La patente US nº 5.565.332 describe métodos para la producción de anticuerpos con mayores características humanas con respecto a un anticuerpo progenitor usando cadenas ligeras humanas sin tratamiento previo.

La humanización completa es factible introduciendo las seis CDR de los dominios de Ig variables de las cadenas pesada y ligera de ratón en las regiones de armazón apropiadas de los dominios de Ig variables de ser humano. Esta técnica de injerto de CDR (Riechmann, L., et al. (1988) RESHAPING HUMAN ANTIBODIES FOR THERAPY, Nature 332, 323) aprovecha la estructura conservada de los dominios de Ig variables, sirviendo las cuatro regiones de armazón (FR1-FR4) como un andamiaje para soportar los bucles de CDR que son los contactos principales con el antígeno. La patente US nº 5.502.167, de Waldmann, et al., describe un “anticuerpo humanizado” que tiene los bucles de CDR LCDR1 a LCDR3 y HCDR1 a HCDR3 de YTH 655(5)6, un anticuerpo monoclonal de IgG2b de rata, injertados en un anticuerpo de célula T humana.

Sin embargo, un inconveniente de la técnica de injerto de las CDR es el hecho de que los aminoácidos de las regiones de armazón pueden contribuir a la unión al antígeno, así como los aminoácidos de los bucles de las CDR pueden influir en la asociación de los dos dominios de Ig variables. Para mantener la afinidad del anticuerpo monoclonal humanizado, la técnica de injerto de CDR se basa en la elección apropiada de las regiones de armazón humanas y en mutagénesis dirigida al sitio de aminoácidos individuales, auxiliadas por formación de modelos mediante ordenador del sitio de unión al antígeno (por ejemplo, Co, M.S., et al. (1994) A HUMANIZED ANTIBODY SPECIFIC FOR THE PLATELET INTEGRIN gpIIb/IIa, J. Immunol. 152, 2968-2976). Se ha dado a conocer un número de humanizaciones exitosas de anticuerpos monoclonales de ratón mediante diseño racional. Entre ellos están varios anticuerpos monoclonales que se dirigen a integrinas humanas y tienen aplicación clínica potencial. Véanse J. Immunol. 152, 2968-2976; Hsiao, K.C., et al. (1994) HUMANIZATION OF 60.3, AN ANTI-CD18 ANTIBODY; IMPORTANCE OF THE L2 LOOP, Protein Eng. 7, 815-822; y Poul, M.A., et al. (1995) INHIBITION OF T CELL ACTIVATION WITH A HUMANIZED ANTI-BETA 1 INTEGRIN CHAIN mAb, Mol. Immunol. 32, 101-116.

Los ratones transgénicos de inmunoglobulina humana proporcionan una alternativa prometedora a la humanización de anticuerpos monoclonales de ratón. Véase, por ejemplo, Fishwild, D.M., et al. (1996) HiGH-AVIDITY HUMAN IgGK MONOCLONAL ANTIBODIES FROM A NOVEL STRAIN OF MINILOCUS TRANSGENIC MICE, Nature Biotechnology 14, 845-851. En respuesta a la inmunización, estos ratones expresan anticuerpos monoclonales humanos, a los que se puede acceder mediante tecnología de hibridoma convencional.

Las estrategias de diseño racional en la manipulación de proteínas mediante ingeniería se ha puesto a prueba mediante estrategias de selección in vitro que se basan principalmente en librerías de presentación de fagos. Véase Clackson, T., y Wells, J.A. (1994) IN VITRO SELECTION FROM PROTEIN AND PEPTIDE LIBRARIES, TIBTECH 12, 173-184. En particular, la selección in vitro y la evolución de anticuerpos derivados de librerías de presentación de fagos se han convertido en una herramienta poderosa. Véanse Burton, D.R., y Barbas III, C.F. (1994) HUMAN ANTIBODIES FROM COMBINATORIAL LIBRARIES, Adv. Immunol. 57, 191-280; y Winter, G., et al. (1994) MAKING ANTIBODIES BY PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455.

El desarrollo de tecnologías para obtener repertorios de genes de anticuerpos humanos, y la presentación de los fragmentos de anticuerpos codificados en la superficie de bacteriófagos filamentosos, han proporcionado un medio para obtener directamente anticuerpos humanos. Los anticuerpos producidos mediante tecnología de fagos se producen como fragmentos de unión a antígeno -habitualmente fragmentos Fv o Fab -en bacterias, y de este modo carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras pueden ser introducidas mediante una de dos estrategias: los fragmentos se pueden manipular mediante ingeniería en anticuerpos completos para la expresión en células de mamíferos, o en fragmentos de anticuerpos biespecíficos con un segundo sitio de unión capaz de disparar una función efectora.

Típicamente, el fragmento Fd (VH-CH1) y la cadena ligera (VL-CL) de los anticuerpos se clonan por separado mediante PCR y se recombinan aleatoriamente en librerías de presentación de fagos combinatorias, que entonces se pueden seleccionar para la unión a un antígeno particular. Los fragmentos Fab se expresan sobre la superficie del fago, es decir, se enlazan físicamente a los genes que los codifican. De este modo, la selección de Fab mediante unión al antígeno coselecciona las secuencias que codifican Fab, que se pueden amplificar subsiguientemente. Mediante varias rondas de unión a antígeno y reamplificación, un procedimiento denominado cribado mediante inmunoadsorción, los Fab específicos para el antígeno se enriquecen y se aíslan finalmente.

En 1994 se describió un enfoque para la humanización de anticuerpos, denominado “selección guiada”. La selección guiada utiliza el poder de la técnica de presentación de fagos para la humanización de un anticuerpo monoclonal de ratón. Véase Jespers, L.S., et al. (1994) GUIDING THE SELECTION OF HUMAN ANTIBODIES FROM PHAGE DISPLAY REPERTOIRES TO A SINGLE EPITOPE OF AN ANTIGEN, Bio/Technology 12, 899-903. Para esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón se puede presentar en combinación con una librería de cadenas ligeras humanas, y la librería de Fab híbrida resultante se puede seleccionar entonces con el antígeno. El fragmento Fd de ratón proporciona de ese modo un molde para guiar la selección.

Subsiguientemente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una librería de fragmentos Fd humanos. La selección de la librería resultante produce Fab completamente humano.

Para la humanización completa de anticuerpos monoclonales murinos, la presente invención usa una combinación única de injerto de CDR y selección guiada. El anticuerpo anti-integrina generado es útil para el diagnóstico y la terapia del cáncer.

Sumario de la invención

La humanización de un anticuerpo monoclonal humano se logra mediante una combinación de selección guiada e injerto de CDR. El término “humanizada”, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, significa que por lo menos una cadena de un anticuerpo monoclonal de ratón incluye una región de un anticuerpo monoclonal humano.

Un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado se produce construyendo una librería de cadenas pesadas o cadenas ligeras de anticuerpos humanos, en la que cada una de tales cadenas incluye un dominio variable y tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) que es la de una cadena pesada o ligera de anticuerpo de ratón correspondiente, y combinando después la librería así construida con una cadena complementaria a partir de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado. De esta manera, la cadena complementaria, junto con una cadena humana presente en la librería construida, forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería resultante de pares de cadenas humanizadas. Después, un par de cadenas pesada y ligera humanizadas particular se selecciona de la librería de pares humanizados usando la cadena complementaria mencionada anteriormente.

Un anticuerpo monoclonal de ratón también se puede humanizar construyendo una librería de cadenas ligeras humanas en la que cada cadena ligera incluye por lo menos el dominio variable de la misma y por lo menos una secuencia de aminoácidos de CDR de una cadena ligera de ratón, y una librería de cadenas pesadas humanas en la que cada una de tal cadena pesada incluye por lo menos el dominio variable de la misma y por lo menos una secuencia de aminoácidos de CDR de una cadena pesada de ratón. La cadena pesada habitualmente no tiene más de alrededor de 200 restos de aminoácidos en tamaño.

Una cadena ligera humana que tiene una CDR de ratón se selecciona de la librería de cadenas ligeras humanas construida usando una cadena pesada de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado. La librería de cadenas pesadas construida se combina con la cadena ligera humana seleccionada, que tiene una CDR de ratón, para producir una librería humanizada de pares de cadenas pesada y ligera, conteniendo cada uno por lo menos una CDR de ratón. Después, un par de cadenas pesada y ligera con CDR de ratón se selecciona de la librería humanizada mencionada anteriormente usando la cadena ligera humana seleccionada con CDR de ratón. La secuencia de la construcción de librería mencionada anteriormente no es crítica.

Preferentemente, sólo el bucle de la región tres determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR3) del anticuerpo monoclonal se injerta en la cadena ligera humana. De forma similar, es preferible que sólo se injerte el bucle de HCDR3 en el fragmento de cadena pesada (HC) humana. La selección de la cadena ligera humana o de la cadena pesada humana que tiene la CDR de ratón injertada se hace preferentemente usando como molde una cadena complementaria quimérica de ratón/humana.

Al injertar CDR en una cadena ligera humana, la cadena ligera humana se clona, y después los clones se recombinan aleatoriamente para formar una librería, tal como una librería de presentación de fagos combinatoria. Se puede seguir el mismo método para el injerto en la cadena pesada humana.

En consecuencia, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado, que comprende las etapas siguientes:

(a): construir una primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas tiene una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad (CDR3) de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable de origen humano;

(b): combinar la primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas construida de la etapa (a) con una cadena complementaria de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, de forma que la cadena complementaria, junto con una cadena humanizada presente en la librería construida, forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados, en el que la cadena complementaria es una cadena quimérica de ratón/humana;

(c): seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (b) un par particular de cadenas pesada y ligera humanizadas usando dicha cadena complementaria, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera humanizadas se selecciona para la unión a dicho antígeno preseleccionado;

(d): construir una segunda librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada cadena tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable; en el que las cadenas de dicha segunda librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado son la cadena pesada o ligera complementaria de dichas cadenas de la primera librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado de la etapa (a), de manera que una librería es una librería de cadenas ligeras y la otra librería es una librería de cadenas pesadas;

(e): aislar una cadena pesada o ligera del par de cadenas pesada y ligera humanizadas de unión al antígeno de la etapa (c), y combinar dicha cadena de unión al antígeno con cadenas de dicha segunda librería de la etapa (d), de manera que la cadena de unión al antígeno, junto con las cadenas presentes en la librería construida de la etapa (d), forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados; y

(f): seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (e) un par de cadenas y ligera humanizadas que se une a dicho antígeno preseleccionado.

En una forma de realización preferida del método según el primer aspecto, la librería humanizada de la etapa (a) contiene cadenas ligeras, y la cadena complementaria de la etapa (b) es una cadena pesada.

En una forma de realización preferida adicional del método según el primer aspecto de la invención, la librería humanizada de la etapa (a) contiene cadenas pesadas, y la cadena complementaria de la etapa (b) es una cadena ligera.

También se prefiere el método según el primer aspecto, en el que la cadena pesada es un fragmento Fd.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para humanizar un anticuerpo monoclonal de ratón, que comprende las etapas siguientes:

(a): construir una librería de cadenas ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas ligeras comprende por lo menos el dominio variable de la misma, y tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de una cadena

ligera de ratón;

(b): seleccionar de la librería de cadenas ligeras humanizadas construida una cadena ligera humana que tiene una CDR3 de ratón, en el que la selección comprende usar una cadena pesada de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, en el que la cadena pesada es una cadena quimérica de ratón/humana, y en el que dicha cadena ligera humana que tiene una CDR3 de ratón se selecciona para la unión a un antígeno preseleccionado;

(c): construir una librería de cadenas pesadas humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas pesadas comprende por lo menos el dominio variable de la misma, y tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de una cadena pesada de ratón;

(d): combinar la librería de cadenas pesadas humanizadas construida con la cadena ligera humanizada seleccionada, para producir una librería humanizada de pares de cadenas pesada y ligera que contienen cada uno una CDR3 de ratón; y

(e): seleccionar de la librería humanizada de la etapa (d) un par de cadenas pesada y ligera usando la cadena ligera humana seleccionada, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera se selecciona para la unión al antígeno preseleccionado.

También se proporciona una forma de realización preferida del segundo aspecto, en la que el método comprende además convertir el par de cadenas pesada y ligera seleccionado en anticuerpo completo.

Otra forma de realización preferida del segundo aspecto se refiere al método según el segundo aspecto de la invención, en el que sólo está presente en la cadena ligera humana una región tres determinante de la complementariedad de la cadena ligera del anticuerpo LM609.

También se prefiere un método según el segundo aspecto de la invención, en el que sólo está presente en la cadena pesada humana una región tres determinante de la complementariedad de la cadena pesada del anticuerpo LM609.

Además, la invención se refiere a una forma de realización preferida del método según el segundo aspecto de la invención, en la que la cadena pesada es Fd.

En la forma de realización mencionada anteriormente, se prefiere que la Fd sea:

un miembro del grupo que consiste en un fragmento de cadena pesada quimérica de ratón/humana y un fragmento de cadena pesada de ratón molde;

una cadena pesada quimérica de ratón/humana; o

un fragmento de cadena pesada de ratón molde.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una ilustración esquemática que muestra la secuencia de las etapas en la técnica de injerto de CDR y la técnica de selección guiada combinadas, para formar el fragmento Fab humanizado.

Las figuras 2a y 2b muestran las secuencias de aminoácidos de VA y VK, respectivamente, del anticuerpo monoclonal de ratón LM609. Los dos aminoácidos N-terminales (Leu)(Glu) de VA y (Glu)(Leu) de VK, codificados por los sitios de clonación del vector CTCGAG (XhoI) y GAGCTC (SacI), respectivamente, son artificiales. Los bucles de CDR están subrayados.

La figura 3a a figura 3e muestran el alineamiento de secuencias de aminoácidos de VK de LM609 de ratón (línea completa superior de cada agrupamiento de secuencias) y seis VK humanas seleccionadas (#1-6). Las regiones de armazón (FR1-3) y los bucles de CDR (CDR1-2) están separados. Las líneas (-) indican aminoácidos idénticos. Obsérvese que, debido a las partes de FR3 que se injertan en LCDR3, toda la CDR3 y todo la FR4 son idénticas en VK de LM609 de ratón y las VK humanas seleccionadas. Por lo tanto, estas dos secuencias no se muestran.

La figura 4 muestra una comparación de tres secuencias de fragmentos humanos seleccionadas y cuatro secuencias de fragmentos humanos sin seleccionar con las secuencias originales de los bucles de LCDR1 y LCDR2 de ratón.

La figura 5a a la figura 5f son gráficas de líneas que muestran la unión de integrina av 3 humana en la superficie celular por los clones 2, 4, 7, 11, 24 de LM609 humanizados, y el anticuerpo de control, respectivamente. La línea A indica células de hámster CS-1 sin transfectar; la línea B indica células de hámster CS-1 transfectadas con ADNc que codifica 5 humana (esencialmente la misma línea que la línea A en la figura 5f); y la línea C indica células de hámster CS-1 transfectadas con ADNc que codifica 3 humana.

La figura 6 es una gráfica de barras que muestra la reactividad cruzada del anticuerpo LM609, y los clones 2, 4, 7, 11, 24, y el anticuerpo de control, respectivamente. Las columnas representan la media de triplicados, indicando las columnas de la izquierda la unión a integrina av 3 humana, indicando las columnas centrales la unión a integrina aIIb 3 humana, e indicando las columnas de la derecha la unión de fondo. Las barras de error indican desviaciones estándar.

La figura 7 es una ilustración esquemática de un tramo de cuatro aminoácidos en una región tres determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR3) y una región tres determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3) que se optimiza.

Las figuras 8a y 8b son ilustraciones fragmentadas de las secuencias de aminoácidos de VL de un anticuerpo de ratón comparadas con las secuencias de aminoácidos de cinco versiones de clones humanizados representados por grupos de letras A (clones 10, 11, y 37), B (clones 7, 8, y 22), C (clones 4, 31, y 36), D (clones 24, 34, 35, y 40), y E (clon 2), que se combinan.

Las figuras 8c a 8e son ilustraciones fragmentadas de las secuencias de aminoácidos de VH de un anticuerpo de ratón comparadas con las secuencias de aminoácidos de cinco versiones de clones humanizados representados por grupos de letras A (clones 10, 11, y 37), B (clones 7, 8, y 22), C (clones 4, 31, y 36), D (clones 24, 34, 35, y 40), y E (clon 2).

Descripción de una forma de realización preferida

La presente invención es susceptible de diferentes formas de realización; a continuación se describe una forma de realización preferida de la invención.

Comenzando con una estirpe celular de hibridoma que segrega LM609 (denominación ATCC HB 9537), se preparó ARN total a partir de 108 células de hibridoma que segregan LM609 usando un kit de aislamiento de ARN (Stratagene, La Jolla, CA). La transcripción inversa y la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las secuencias que codifican fragmento Fd y la cadena K se llevaron a cabo esencialmente como se describe en “Combinatorial immunoglobulin libraries in phage 1”, (Methods 2, 119 (1991)) por A.S. Kang, et al.

Los productos de PCR que codifican el fragmento Fd y la cadena K se cortaron con XhoI/SpeI y SacI/XbaI, respectivamente, y se ligaron secuencialmente en el vector fagómido apropiadamente digerido pComb3H. Los productos de la ligación se introdujeron en la cepa XL1-Blue de E. coli mediante electrotransformación, y las etapas subsiguientes fueron como se describe en “Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site”, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982) por C.F. Barbas III, et al., para producir fagos que presentan Fab sobre su superficie. Los fagos se seleccionaron cribando por inmunoadsorción frente a integrina av 3 inmovilizada. Después de dos rondas de cribado por inmunoadsorción, los clones individuales se analizaron en busca de la expresión de Fab de LM609. El sobrenadante de cultivos inducidos por IPTG se analizó, mediante ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), en busca de la unión a integrina av 3 inmovilizada, usando como anticuerpo secundario anti-F(ab’)2 de ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. La secuencia de cada secuencia que codifica el fragmento Fd y cada secuencia que codifica la cadena K de clones positivos se determinó mediante secuenciación de ADN.

Amplificación de secuencias de cadena ligera humana y del fragmento Fd

Se preparó ARN total a partir de médula ósea de cinco donantes (Poietic Technologies; Germantown, MD) usando el reactivo TRI (Molecular Research Center; Cincinnati, OH), y se purificó posteriormente mediante precipitación con cloruro de litio. Véase Sambrook, J., et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Se sintetizó ADNc de primera hebra usando el kit “SUPERSCRIPT Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis” con cebado de oligo (dT) (Life Technologies; Gaithersburg, MD). Los cinco ADNc de primera hebra generados se sometieron a amplificaciones mediante PCR separadas.

Las secuencias de VK de cada uno de los ADNc de primera hebra se amplificaron en ocho reacciones separadas combinando cuatro cebadores sentido y dos cebadores antisentido (véase la lista más abajo). Las secuencias de VA se amplificaron en nueve reacciones separadas, usando nueve cebadores sentido y un cebador antisentido (véase la lista más abajo). Las secuencias de aminoácidos de VA y VK, incluyendo el subrayado de los bucles de CDR, se muestran en las figuras 2a y 2b, respectivamente (véanse también SEC ID nº: 44 y SEC ID nº: 45, respectivamente). Las secuencias de VH (véase SEC ID nº: 56) se amplificaron en cuatro reacciones usando cuatro cebadores sentido y un cebador antisentido (véase la lista más abajo). Todas las amplificaciones se llevaron a cabo en condiciones de PCR estándar usando Taq polimerasa (Pharmacia; Uppsala, Suecia). Mientras que los cebadores sentido se hibridan a secuencias que codifican los aminoácidos N-terminales de las diversas familias de VK, VA, y VH, los cebadores antisentido se hibridan a una secuencia que codifica los aminoácidos C-terminales de FR3 de VK, VA, o VH, respectivamente, que están muy conservados.

La lista de cebadores usados para la amplificación de secuencias de anticuerpos humanos incluye:

Cebadores sentido de VK: HSCK1 -F SEC ID nº: 3 HSCLam6 SEC ID nº: 14 HSCK24 -F SEC ID nº: 4 HSCLam270 SEC ID nº: 15 HSCK3 -F SEC ID nº: 5 HSCLam78 SEC ID nº: 16 HSCK5 -5 SEC ID nº: 6 HSCLam9 SEC ID nº: 17 Cebadores antisentido de VK: Cebadores antisentido de VA: BKFR3UN SEC ID nº: 7 BLFR3UN SEC ID nº: 18 BK2FR3UN SEC ID nº: 8 Cebadores sentido de VH Cebadores sentido de VA HFVH1-F SEC ID nº: 19 HSCLam1a SEC ID nº: 9 HSCLam1b SEC ID nº: 10 HSCLam2 SEC ID nº: 11 HSCLam3 SEC ID nº: 12 HSCLam4 SEC ID nº: 13 HFVH2-F SEC ID nº: 20 HFVH35-F SEC ID nº: 21 HFVH4-F SEC ID nº: 22 Cebadores antisentido de VH BFR3UN SEC ID nº: 23

5 Construcción de un fragmento Fd quimérico de ratón/humano fusionando VH de LM609 a CH1 humana

El vector fagómido pComb3H que contiene las secuencias de Fab

de LM609 se usó como un molde para la amplificación de la secuencia que codifica el fragmento FR1 a FR3 N

10 terminal de VH de LM609 mediante el par de cebadores de PCR PELSEQ (SEC ID nº: 24)/BFR3UN (SEC ID nº: 25). El cebador sentido PELSEQ se hibrida a la secuencia líder pe1B en dirección 5’ de la secuencia codificante del fragmento Fd en pComb3H. El cebador antisentido BFR3UN se hibrida a una secuencia que codifica ocho aminoácidos C-terminales de FR3 de VH, que están muy conservados (SEC ID nº: 26), y difieren en un aminoácido de la secuencia de aminoácidos correspondiente de VH de LM609 (SEC ID nº: 27).

15 Mediante PCR de extensión por solapamiento (véase McArn Horton, R., y Readington Pease, L. (1991) RECOMBINATION AND MUTAGENESIS OF DNA SEQUENCES USING PCR IN DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, ed. M.J. McPherson, IRL Press, Oxford, UK, p. 217-247), el producto PELSEQ/BFR3UN se fusionó a un fragmento de PCR que codifica la HCDR3 (SEC ID nº: 1) de LM609 acoplado a FR4 de VH y el

20 dominio CH1 completo del anticuerpo b8 humano anti-gp120. Este fragmento se ha amplificado mediante el par de cebadores de PCR CR501 (SEC ID nº: 28)/CR301 (SEC ID nº: 29). El cebador sentido CR501 codifica un enlace sintético de los nueve aminoácidos C-terminales de FR3, los ocho aminoácidos que forman la HCDR3 (SEC ID nº:1) de LM609, y los seis aminoácidos N-terminales de FR4 de b8. La FR4 de b8 es una elección preferida en este caso debido a que es idéntica a FR4 de VH de LM609, con la excepción del aminoácido C-terminal, que, para LM609, es

25 A, y para b8 es S. El solapamiento de 24 pb de CR501 y BFR3UN permitió fusionar los productos de la PCR correspondientes mediante PCR de extensión por solapamiento.

El cebador sentido CR301 se hibrida a una secuencia que codifica el término C de CH1 e introduce un sitio SpeI que permite que el producto de la PCR se enlace al ORF del gen III en pComb3H. El producto de la PCR de extensión 30 por solapamiento se cortó con XhoI/SpeI, se ligó en el vector fagómido apropiadamente digerido pComb3H, y la secuencia correcta se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Sustitución de la cadena ligera de LM609 por una cadena ligera humana que contiene la LCDR3 de LM609

35 Usando la PCR de extensión por solapamiento, las secuencias humanas amplificadas, que codifican el fragmento Nterminal de FR1 a FR3 de VK y VA, se fusionaron en los fragmentos de PCR que codifican la LCDR3 (SEC ID nº: 2) de LM609 acoplados a FR4 de VKo VA humano y el dominio CK o CA humano. Se generaron dos fragmentos K mediante los pares de cebadores de PCR CR503 (SEC ID nº: 30)/T7B (SEC ID nº: 31) y CR508 (SEC ID nº: 32)/T7B, usando como molde la secuencia del anticuerpo b11 anti-gp120 en pComb3.

40 Los cebadores sentido CR503 y CR508 codifican un enlace sintético de ocho aminoácidos C-terminales de FR3 de VK humano (SEC ID nº: 33 o SEC ID nº: 34), los nueve aminoácidos que forman la LCDR3 (SEC ID nº: 2) de LM609, y los siete aminoácidos N-terminales de FR4 de b11. FR4 de b11 es la elección preferida debido a que es idéntica a FR4 de VK de LM609, con la excepción del tercer aminoácido N-terminal y C-terminal, que son G y T en LM609

45 frente a Q y A en b11. El solapamiento de 23 pb de CR503 con BFR3UN y CR508 con BK2FR3UN permitió fusionar los productos de la PCR correspondientes mediante PCR de extensión por solapamiento.

El cebador inverso T7B se hibrida a una secuencia de pComb3 en dirección 3’ de la secuencia codificante de la cadena ligera. Se generó un fragmento A mediante el par de cebadores de PCR CR510 (SEC ID nº: 35)/CLext (SEC ID nº: 36), usando como molde ADNc de primera hebra de médula ósea humana cebado con CLext.

El cebador sentido CR510 codifica un enlace sintético de siete aminoácidos C-terminales de FR3 de VA humano (SEC ID nº: 37), los nueve aminoácidos que forman la LCDR3 de LM609, y los siete aminoácidos N-terminales de FR4 de VA humano (SEC ID nº: 38). El solapamiento de 21 pb de CR510 con BLFR3UN permitió fusionar los productos de PCR correspondientes mediante PCR de extensión por solapamiento. El cebador inverso CLext se hibrida al extremo 3’ de la secuencia codificante de CA humano, e introduce un sitio XbaI.

Las secuencias generadas que codifican la cadena ligera se cortaron con SacI/XbaI y se ligaron en el vector fagómido apropiadamente digerido pComb3H que contenía el fragmento Fd quimérico de ratón/humano. La electrotransformación de los productos de ligación en la cepa ER 2537 de E. coli (New England Biolabs; Beverly, MA) dio como resultado una librería de cadenas ligeras que consiste en 1,5 x 108 transformantes independientes. La secuenciación del ADN reveló el ensamblaje correcto de los fragmentos fusionados. Se llevaron a cabo cuatro rondas de cribado por inmunoadsorción frente a integrina av 3 humana inmovilizada, esencialmente como se describe en “High-affinity self-reactive human antibodies by design and selection: targeting the integrin ligand binding site”, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10003-10007 (1993)) por C.F. Barbas, III, et al. usando 200 ng de proteína en 25 1l de tampón de metal (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 137 mM de NaCl; 1 mM de KCl; 1 mM de MgCl2; 1 mM de CaCl2; 1 mM de MnCl2) para revestimiento, 0,05 por ciento de Tween 20 en TBS para lavado, y 10 mg/ml de tripsina en TBS para la elución. Las etapas de lavado se incrementaron desde 5 en la primera ronda hasta 10 en la segunda ronda, y 15 en la tercera y cuarta rondas. El conjunto de fagos producido de cada ronda se monitorizó mediante ELISA de fagos.

Después de la cuarta ronda, los fagos se produjeron a partir de clones individuales, y se ensayaron para determinar la unión a integrina av 3 inmovilizada mediante ELISA de fagos. Las secuencias codificantes de cadena ligera de los clones positivos se analizaron mediante secuenciación de ADN usando el cebador OMPSEQ (SEC ID nº: 39) que se hibrida a la secuencia líder ompA en dirección 5’ de la secuencia codificante de cadena ligera en pComb3H.

Sustitución del fragmento Fd de LM609 por un fragmento Fd humano que contiene la región tres determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3) de LM609

Se fusionaron tres fragmentos de PCR en una etapa mediante PCR de extensión por solapamiento. Usando como molde los fagómidos seleccionados del cribado por inmunoadsorción de las cadenas ligeras, el Fragmento 1 se amplificó con el par de cebadores de PCR RSC-F (SEC ID nº: 40)/lead-B (SEC ID nº: 41). Mientras que el cebador sentido RSC-F se hibrida a una secuencia en dirección 5’ de la secuencia codificante de la cadena ligera, el cebador antisentido lead-B se hibrida a una secuencia en dirección 5’ de la secuencia codificante del fragmento Fd. Como fragmento 2, se usaron las secuencias humanas amplificadas que codifican el fragmento de FR1 a FR3 de VH (véase más arriba).

El Fragmento 3 se amplificó con el par de cebadores de PCR CR501/HIgG1-B (SEC ID 42), usando como molde el fragmento Fd híbrido de ratón/humano (véase anteriormente). El cebador antisentido HIgG1-B se hibrida al extremo 3’ de la secuencia codificante de CH1. Usando el solapamiento de 21 pb de lead-B con los cebadores HFVH-F y el solapamiento de 24 pb de BFR3UN con CR501, se fusionaron los tres fragmentos y se amplificaron con el par de cebadores de PCR RSC-F/RSC-B (SEC ID nº: 43). El cebador antisentido RSC-B se solapa con HIgG1-B. RSC-F y RSC-B introducen dos sitios SfiI asimétricos.

Para mantener la elevada complejidad, se llevaron a cabo reacciones separadas de PCR para cada fagómido seleccionado del cribado por inmunoadsorción de las cadenas ligeras (Fragmento 1) y para cada uno de los cinco conjuntos de fragmentos de VH derivados de las cinco fuentes de ADNc de primera hebra (Fragmento 2). Los fragmentos generados, que codifican las cadenas ligeras humanas seleccionadas, enlazadas a fragmentos Fd humanos, se cortaron con SfiI y se ligaron en el vector fagómido apropiadamente digerido pComb3H, generando una librería de 3 x 107 transformantes independientes.

La secuenciación de ADN reveló el ensamblaje correcto de los fragmentos de ADN fusionados. Se llevaron a cabo cuatro rondas de cribado por inmunoadsorción frente a integrina av 3 humana inmovilizada, exactamente como se describe para el cribado por inmunoadsorción de las cadenas ligeras. El conjunto de fagos producido de cada ronda se monitorizó mediante ELISA de fagos. Después de la cuarta ronda, las secuencias codificantes de las cadenas ligeras y del fragmento Fd se aislaron de los fagómidos seleccionados mediante digestión con SfiI y se subclonaron en el vector de expresión compatible pPhoA-H6HA.

Los lisados de clones individuales que se hicieron crecer en medio sin fosfato se analizaron para determinar la unión a integrina av 3 inmovilizada mediante ELISA, usando como anticuerpo secundario anticuerpo anti-F(ab’)2 humano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce). Las secuencias codificantes de cadenas ligeras y del fragmento Fd de los clones positivos se analizaron mediante secuenciación de ADN usando los cebadores OMPSEQ y PELSEQ, respectivamente.

Resultados

Clonación de ADNc de LM609

Partiendo de células de hibridoma que expresan LM609, se clonaron mediante PCR los ADNc que codifican fragmentos Fd de la cadena A y las cadenas K completas. Los productos de la PCR se clonaron en el fagómido pComb3H, que deriva de pComb3, y se manipularon mediante ingeniería para facilitar la expresión de Fab sobre la superficie del fago filamentoso M13. Los fagos que presentan Fab de LM609 se seleccionaron mediante cribado por inmunoadsorción frente a integrina av 3, y se determinaron las secuencias de ADNc correspondientes. Se analizó Fab de LM609 soluble, purificado de E. coli, y se encontró que se une específicamente a integrina av 3 mediante ELISA.

En la figura 1 se ilustra el enfoque para la humanización secuencial de LM609 mediante una combinación de selección guiada e injerto de CDR. Para la selección de la cadena ligera humana, el fragmento Fd de ratón se sustituye por un fragmento Fd quimérico compuesto de VH de ratón enlazado a CH1 humano, para estabilizar el Fab híbrido de la primera etapa de selección mediante la interacción de dos dominios constantes humanos coincidentes, CK y CH1. Una estabilización del Fab híbrido también estabiliza el sitio de unión al antígeno.

La selección guiada se inicia sustituyendo la cadena ligera K de LM609 por una librería de cadenas ligeras K y A humanas que contienen el bucle injertado LCDR3 de LM609. Las librerías fágicas correspondientes que presentan el Fab híbrido se seleccionan entonces mediante cuatro rondas de cribado por inmunoadsorción frente a integrina av3 inmovilizada. Aunque la producción no aumenta de ronda a ronda, el análisis del conjunto de fagos producido de cada ronda para la unión a integrina av 3 mediante ELISA de fagos revela una señal creciente. Después de la cuarta ronda, los fagos se producen a partir de clones, se ensayan para determinar la unión a integrina av 3 mediante ELISA de fagos.

Aunque la mayoría de estos clones dan señales que revelan cierta unión por encima del fondo, en el presente caso seis clones dieron señales muy fuertes (véanse las figuras 3a a 3e). El análisis de la secuencia de ADN de estos clones reveló tres secuencias de cadenas ligeras diferentes. Dos secuencias de cadenas ligeras encontradas en cinco de seis clones positivos difieren sólo en cuatro aminoácidos, es decir, son 96 por ciento idénticas. La tercera secuencia de las cadenas ligeras comparte alrededor de 80 por ciento de identidad con las otras dos. Sin embargo, esta secuencia tuvo dos partes, cada una de las cuales se pudo alinear a líneas germinales de diferentes familias de VK, y de este modo se considera probable que han surgido de cruzamiento por PCR, un artefacto que se ha informado que se produce frecuentemente en las secuencias de anticuerpos de amplificación.

Haciendo referencia a las figuras 3a a 3e, el análisis de los seis VK humanos reveló dos grupos de secuencias de cadenas K muy relacionadas. Además, los bucles de CDR1 de los seis VK humanos seleccionados, que se cree que desempeña un papel en el ensamblaje de VK y VA, se asemejan a la región correspondiente de VK de LM609. Esto indica que el VA molde de LM609, junto con el antígeno de LM609, la integrina av 3 humana, seleccionó cadenas K humanas que están relacionadas con la cadena K de LM609. El hecho de que no se encontraron secuencias repetidas puede indicar que el bucle injertado de LCDR3 de LM609, que es idéntico en todas las cadenas K humanas seleccionadas, es principalmente responsable de la contribución de la cadena K de LM609 a la unión al antígeno.

Esta suposición está apoyada por dos observaciones adicionales. En primer lugar, el enfoque de humanización inicial se basó en las librerías de cadenas K humanas originales. Cuatro rondas de cribado por inmunoadsorción seleccionaron una cadena K humana repetida con una secuencia relacionada con la cadena K de LM609. Sin embargo, parece que el Fab híbrido correspondiente se une sólo débilmente a integrina av 3 humana. Por lo tanto, el bucle de LCDR3 de LM609 se injertó en las librerías de las cadenas K humanas, y, aunque sólo se estimó aproximadamente a partir de ELISA, la unión del Fab híbrido seleccionado correspondiente a integrina av 3 humana mejoró.

En segundo lugar, se seleccionaron los fagos seleccionados mediante otras dos rondas de cribado por inmunoadsorción frente a integrina av 3 humana inmovilizada. Nuevamente, los solubles derivados de fagómidos seleccionaron se analizaron mediante ELISA para determinar la unión a av 3 humana inmovilizada. Esta vez, se encontró que los 20 clones analizados se unen específicamente. Sin embargo, la secuenciación de 16 clones no reveló secuencias repetidas. De este modo, parece que un número de secuencias de cadena K humana que contienen el bucle de LCDR3 de LM609 pueden sustituir a la cadena K de LM609 sin mucha diferencia en la unión a integrina av 3 humana. Se cree que este hallazgo es de importancia para la aplicación terapéutica de LM609 humanizado.

Debido a la variabilidad de secuencia alotípica, los anticuerpos humanizados se pueden neutralizar por el sistema inmunitario del paciente después de inyecciones repetidas. Este problema se evita usando anticuerpos humanizados con propiedades de unión al antígeno idénticas pero diferentes secuencias de aminoácidos durante administraciones repetidas.

Al igual que con la cadena ligera de LM609 original, las cadenas ligeras seleccionadas son cada una cadenas ligeras K. Además, la identificación de bases de datos reveló que derivaban de la misma línea germinal, a saber, DPK-26, que pertenece a la familia VK6. Esto habla a favor de una fuerte selección hacia estas secuencias, debido a que la familia VK6 no se encuentra frecuentemente en anticuerpos humanos. Una razón obvia para esta fuerte selección es una similitud de secuencias relativamente elevada de las cadenas ligeras humanas seleccionadas con la cadena ligera de ratón original.

Haciendo referencia a la figura 4, para comparación, se escogieron aleatoriamente cuatro clones de la librería sin seleccionar, y se determinaron sus secuencias de cadenas ligeras. Tres cadenas ligeras humanas seleccionadas, usadas en la comparación, consistieron en once aminoácidos de LCDR1, la longitud de la LCDR1 de ratón original, mientras que sólo una de cuatro cadenas ligeras humanas sin seleccionar compartieron la misma longitud de LCDR1 con la secuencia de ratón original (véase la figura 4).

Además, tanto LCDR1 como LCDR2 de las cadenas ligeras humanas seleccionadas son muy similares a la secuencia de ratón correspondiente. El aminoácido C-terminal de la región 2 de armazón de la secuencia de cadena ligera de ratón original, una lisina (Lys) mostrada entre corchetes en la figura 4, es un aminoácido inusual en esta posición, y de este modo puede estar implicado en la formación del sitio de unión al antígeno. De forma interesante, todas las secuencias de cadenas ligeras humanas seleccionadas contienen una lisina en esta posición, mientras que todas las secuencias no seleccionadas contienen una tirosina (Tyr) en su lugar. De hecho, la familia VK6 es la única familia VK humana que contiene una lisina en esa posición.

Tomadas en conjunto, estas pruebas muestran que el molde de VH de ratón y el antígeno seleccionado para secuencias de VK humano no alteradas están relacionados con la secuencia de VK de ratón original. También se analizaron mediante secuenciación de ADN tres clones de la selección de cadenas ligeras, revelando una unión más débil a integrina av 3 que los seis clones expuestos anteriormente, pero teniendo todavía una unión significativa con respecto al fondo. Estos análisis revelaron tres secuencias de VA no relacionadas, y junto con las secuencias de VK seleccionadas -excepto la que se originó del artefacto de cruzamiento de PCR -se usaron como moldes en la humanización de la cadena pesada de LM609.

Basándose en la estrategia de humanización descrita anteriormente, se generaron cinco versiones humanizadas del anticuerpo monoclonal LM609 anti-integrina av 3 humana. Las cinco versiones se revelaron a través del análisis de secuencia de 14 clones que se unen a av 3. Haciendo referencia a las figuras 8a y 8b, las secuencias de aminoácidos de un VL de ratón (SEC ID nº: 45) se compararon con las secuencias de aminoácidos de la versión A, y las versiones (o grupos) combinadas B, C, D, y E.

De forma similar, las figuras 8c a 8e comparan las secuencias de aminoácidos de un VH de ratón (SEC ID nº: 56) con las secuencias de aminoácidos de las cinco versiones (o grupos) A-E. Cuatro de estas versiones, representadas por los clones 7, 8, y 22 (grupo B); 4, 31, y 36 (grupo C); 24, 34, y 40 (grupo D); y 2 (grupo E), están muy relacionadas en la secuencia de aminoácidos. El grupo BCDE de secuencias en las figuras 8a y 8b representa las cuatro versiones que comparten un dominio VL idéntico (SEC ID nº: 49). La identidad de secuencia de aminoácidos de sus dominios VH (SEC ID nº: 50-53), que derivan todos de la línea germinal DP-65 o la DP-78 muy relacionada, es por lo menos 90% para cada versión.

Por el contrario, la versión quinta incluye los clones 10, 11, y 37 (A), y representa una versión humanizada con un dominio VH (SEC ID nº: 54) que deriva de una familia de línea germinal diferente. Esta versión humanizada también contiene un dominio VL diferente (SEC ID nº: 55), que, sin embargo, es 95% idéntico, y deriva de la misma línea germinal. Las líneas germinales se determinaron mediante alineamiento de secuencias de ácidos nucleicos usando un software DNAPLOT proporcionado por VBASE Directory of Human V Gene Sequences del MRC Centre for Protein Engineering.

Conservando las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad originales, tales como las secuencias de LCDR3 (SEC ID nº: 2) y HCDR3 (SEC ID nº: 1) de LM609, la estrategia de humanización descrita asegura la conservación epitópica. La conservación epitópica es una exigencia crítica en la humanización de anticuerpos, especialmente en el caso de LM609. El anticuerpo monoclonal de ratón LM609 anti-integrina av3 humana que bloquea la función se une a un epítopo no lineal aún sin identificar que implica tanto las cadenas polipeptídicas av como 3. De forma importante, mediante la unión a este epítopo, LM609 induce apoptosis en células vasculares que expresan av 3, un rasgo único entre un número de anticuerpos monoclonales de ratón antiintegrina av 3 humana. LM609 no reconoce la integrina aIIb 3 relacionada. Cualquier reactividad cruzada con aIIb 3 humana, que es expresada en plaquetas, excluye el uso de LM609 como herramienta en la terapia del cáncer.

Las cinco versiones humanizadas de LM609, clones 2, 4, 7, 11, y 24, que se han seleccionado mediante la unión a integrina av 3 humana inmovilizada, y de este modo potencialmente desnaturalizada, se ensayaron para determinar la unión a integrina av 3 humana nativa expresada sobre la superficie celular. Para esto, se analizó mediante citometría de flujo la unión de LM609 humanizado a células de hámster CS-1 sin transfectar y a células de hámster CS-1 transfectadas con ADNc de 3 o 5 humana. Al igual que LM609 de ratón, pero contrariamente a un anticuerpo de control, las cinco versiones humanizadas de LM609 revelaron unión específica a células de hámster CS-1 transfectadas con ADNc de 3 humana (véanse las figuras 5a-5f).

Se analizó mediante ELISA la reactividad cruzada potencial de LM609 humanizado con integrina aIIb 3 humana. Mientras que el anticuerpo Fab-9 con reactividad cruzada conocida se unió tanto a integrina av 3 como a aIIb 3 humana inmovilizada, no se detectó reactividad cruzada ni para LM609 de ratón ni para sus cinco versiones humanizadas (véase la figura 6).

De este modo, todas las pruebas hablan a favor de la conservación epitópica a lo largo del proceso de humanización de LM609.

La maduración de la afinidad es una etapa muy relevante a la hora de manipular mediante ingeniería anticuerpos para aplicaciones terapéuticas. Aumentando la afinidad de la diana, se reduce la concentración in vivo de un anticuerpo que se debe alcanzar para que sea efectiva para terapia. Además de reducir los costes de la terapia con anticuerpos, las bajas concentraciones in vivo efectivas ayudarán a reducir la posibilidad de respuesta inmunitaria.

La estrategia de desplazamiento o paseo sobre la CDR para la maduración de la afinidad de anticuerpos se ha descrito en otra parte, y es conocida en la técnica pertinente. Para la maduración de la afinidad de LM609 humanizado, se escogió una optimización secuencial de LCDR3 y HCDR3 (véase la figura 7). La región aleatorizada en ambas CDR se confinó a un tramo de cuatro aminoácidos que reveló la variabilidad más elevada en secuencias de anticuerpos humanos. Véase Kabat, E.A. et al. (1991) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Dept of Health and Human Services, Washington, D.C. Usando el dopaje NNK (Barbas, C.F. et al., (1994) IN VITRO EVOLUTION OF A NEUTRALIZING HUMAN ANTIBODY TO HIV-1 TO ENHANCE AFFINITY AND BROADEN STRAIN CROSS-REACTIVITY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3809-3813), la aleatorización de cuatro codones da como resultado 324 ó 1 x 106 secuencias nucleotídicas diferentes. Basándose en esto, y suponiendo una distribución de Poisson (Clackson, T., y Wells, J.A. (1994) IN VITRO SELECTION FROM PROTEIN AND PEPTIDE LIBRARIES, Trends in Biotechnol. 12, 173-184), se necesitan 5 x 106 transformantes independientes para una librería completa con 99 por ciento de confianza. Para cada una de las cinco versiones humanizadas de LM609, se generaron librerías aleatorizadas de LCDR3 independientes. El número de transformantes independientes en cada librería se sitúa muy por encima de 5 x 106 (véase Procedimientos Experimentales, más abajo). Se obtuvieron diez secuencias de LCDR3 completamente diferentes cuando se analizaron mediante secuenciación de ADN dos clones de cada una de las cinco librerías. Las tres librerías que se basaron en los clones 2, 4, y 24 de LM609 humanizado, que contienen cadenas ligeras idénticas y cadenas pesadas muy relacionadas derivadas de la línea germinal DP-65, se reunieron. Correspondiendo a sus secuencias de líneas germinales subyacentes, las tres librerías que quedan se denominaron DPK-26ranLCDR3/DP-10, DPK-26ranLCDR3/DP-65, y DPK-26ranLCDR3/DP-78. Estas tres librerías se seleccionaron en paralelo.

Para mejorar la selección de mutantes de LCDR3 de mayor afinidad, se usó una selección mediante constante de disociación en fase sólida (Yang, W.P. et al. (1995) CDR WALKING MUTAGENESIS FOR THE AFFINITY MATURATION OF A POTENT HUMAN ANTI-HIV-1 ANTIBODY INTO THE PICOMOLAR RANGE, J. Mol Biol. 254, 392-403). En cinco ciclos subsiguientes de selección, se añadieron 20 1g de IgG de LM609 al pocillo con 200 ó 50 ng de integrina av 3 humana inmovilizada, seguido de la incubación de los fagos y el lavado. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el pocillo se lavó nuevamente, y los fagos unidos se eluyeron con tripsina. Esta etapa de selección mediante constante de disociación se explica en el siguiente párrafo.

Las interacciones proteicas se caracterizan mediante parámetros termodinámicos y cinéticos. Aunque la constante de afinidad (Ka = kon/koff) es una constante de equilibrio, las constantes de velocidad de asociación (kon) y de disociación (koff) son más relevantes para procesos in vivo que están más allá del equilibrio. Véase Williams, A.F. (1991) OUT OF EQUILIBRIUM, Nature 352, 473-474. De hecho, para que se produzcan in vivo, las interacciones con afinidad elevada, es decir, valores elevados de Ka, todavía se basan en la asociación rápida, es decir, valores elevados de kon. Los anticuerpos se someten a selección cinética basándose en la unión a antígenos diana rápidamente, en paralelo con la selección termodinámica para la unión de alta afinidad a fin de permitir un tiempo suficiente para el aclaramiento antigénico. Véase Foote, J., y Milstein, C. (1991) KINETIC MATURATION OF AN IMMUNE-RESPONSE, Nature 352, 530-532. Una interacción típica anticuerpo/antígeno con un valor Ka en el

M-1 M-1

intervalo de 109 se asocia rápidamente con un valor kon en el intervalo de 105 a 106 s-1, y se disocia lentamente con un valor koff en el intervalo de 10-3 a 10-4 s-1. Una selección mediante la constante de disociación para la maduración de la afinidad, es decir, disminuyendo koff, requiere considerar la semivida de las interacciones anticuerpo/antígeno, que está dada por t½ = ln2/koff. Una interacción anticuerpo/antígeno con koff = 1 x 10-4 s-1 tiene una semivida de alrededor de 2 horas. Una constante de disociación más baja, de diez veces, es decir, koff = 1 x 10-5 s-1, da como resultado una mayor duración de la semivida, de diez veces, es decir, alrededor de 20 horas. Estas semividas prolongadas limitan la selección mediante la constante de disociación en nuestro protocolo de valoración de la afinidad. Usando un marco de tiempo razonable, los anticuerpos con constantes de disociación por debajo de 1 x 10-6 s-1 no se pueden enriquecer, incluso después de múltiples ciclos de selección. Sin embargo, usando un protocolo similar, se seleccionó un anticuerpo frente a gp120 con un valor koff en el intervalo de 10-6 s-1. La constante de afinidad correspondiente estaba en el intervalo de 101 M-1, una mejora de más de 400 veces del anticuerpo parental.

Se analizaron mediante secuenciación de ADN ocho clones de cada una de las tres librerías seleccionadas independientemente. Las secuencias de LCDR3 se muestran en la Tabla 1, más abajo. Tuvo lugar una fuerte selección con relación a una secuencia de consenso que está muy relacionada con la secuencia original. Los 24 5 clones analizados contienen una serina (Ser) en la Posición 91, y una glutamina (Gln) en la Posición 92 de la región aleatorizada. Los aminoácidos correspondientes en la LCDR3 parental son serina (Ser) y asparagina (Asn), respectivamente. De forma interesante, los tres codones de serina del código genético NNK (TCT, TCG, y ACT) se encuentran en la Posición 91. La Posición 94, un triptófano (Trp) en la LCDR3 parental, se volvió a seleccionar en 22 de los 24 clones. Dos clones contienen una histidina (His) en su lugar. Sólo la Posición 93 revela una mayor 10 diversidad. La serina (Ser) original se sustituye por un aminoácido aromático o hidrófobo, ya sea fenilalanina (Phe13/24), triptófano (Trp-6/24), valina (Val-3/24), tirosina (Tyr-1/24) o histidina (His-1/24). El análisis de las secuencias de cadenas pesadas reveló que no tuvo lugar contaminación cruzada entre las tres librerías seleccionadas independientemente. Los ocho clones seleccionados de la librería DPK-26ranLCDR3/DP-65, que contiene el conjunto de las tres secuencias codificantes de las cadenas pesadas muy relacionadas derivadas de la línea

15 germinal DP-65, fueron idénticos y derivaron del clon 24 de LM609 humanizado.

La secuencia de LCDR3 conservada habla a favor de un epítopo muy definido en integrina av 3 humana. Aunque todavía se ha de demostrar la unión a integrina av 3 humana nativa sobre la superficie celular, es improbable un desplazamiento epitópico hacia integrina av 3 humana desnaturalizada. Los conjuntos de fagos seleccionados se

20 analizaron para determinar la unión a integrina av 3 humana mediante ELISA de fagos y en competición con IgG de LM609. Estos análisis sugieren una constante de disociación significativamente menor de los clones seleccionados en comparación con LM609, así como con LM609 humanizado. La sustitución de la serina original en la Posición 3 por un resto aromático puede dar lugar a una nueva interacción hidrófoba con un fuerte impacto sobre la afinidad global.

25 TABLA 1

Mutantes de LCDR3 Seleccionados

Posición de Kabat1: 91 92 93 94

LM609: Ser Asn Ser Trp

Librería DPK-26ranLCDR3/DP-102: Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Trp Trp Trp Trp Val Phe Phe Phe Trp Trp Trp Trp Trp Trp His His

Librería DPK-26ranLCDR3/DP-653: Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp

Librería DPK-26ranLCDR3/DP-784: Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Trp Trp Val Val Phe Phe Tyr His Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp

1 véase Kabat, et al. (1991)2 basada en el clon 11 de LM609 humanizado 3 basada en los clones 2, 4, y 24 de LM609 humanizado 4 basada en el clon 7 de LM609 humanizado

Procedimientos experimentales

30 Materiales

IgG de LM609 purificada de cultivos de hibridoma se proporcionó por el Dr. David A. Cheresh. La integrina av3 humana y la integrina aIIb 3 humana procedieron de fuentes descritas en HIGH-AFFINITY SELF-REACTIVE HUMAN ANTIBODIES BY DESIGN AND SELECTION: TARGETING THE INTEGRIN LIGAND BINDING SITE, Barbas III, C.F., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10003-10007. Las células de hámster CS-1 sin transfectar y las células de hámster CS-1 transfectadas con ADNc de 3 o de 5 humana se obtuvieron del Dr. David A. Cheresh (Filardo, E.J., et al. (1995) REQUIREMENT OF THE NPXY MOTIF IN THE INTEGRIN 3 SUBUNIT CYTOPLASMIC TAIL FOR MELANOMA CELL MIGRATION IN VITRO AND IN VIVO, J. Cell Biol. 130, 441-450), y se mantuvieron en medio RPMI suplementado con 5% de suero fetal de ternera (FCS) a 37ºC en 7% de CO2.

Expresión en E. coli de Fab de LM609 humanizado soluble

Tras el cribado por inmunoadsorción de la librería de fagos, el inserto SfiI del conjunto fagómido de LM609 humanizado seleccionado se clonó en el vector de expresión de E. coli pPhoA-H6HA (véase Rader, C., y Barbas III,

C.F. (1997) PHAGE DISPLAY OF COMBINATORIAL ANTIBODY LIBRARIES, Curr. Opin. Biotechnol. 8, 503-508) para determinar la detección de ligantes de av 3. La determinación de las secuencias de 14 clones reveló cinco versiones de LM609 humanizado, representadas por los clones 2, 4, 7, 11, y 24. Los ADNc de estos clones se cortaron mediante digestión con SacI/SpeI, y se ligaron en pComb3H cortado con SacI/NheI, eliminando de ese modo el ADNc de pComb3H que codifica el fragmento del gen III, y permitiendo la producción de Fab soluble (véase Rader, C. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 503-508). Los productos de la ligación se electrotransformaron en la cepa XL1-Blue de E. coli. La producción de Fab se indujo por adición de isopropil -D-tiogalactopiranósido, como se describe (Barbas III, C.F., et al. (1991) ASSEMBLY OF COMBINATORIAL ANTIBODY LIBRARIES ON PHAGE SURFACES: THE GENE III SITE, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982).

ELISA

Las integrina av 3y aIIb 3 humanas se revistieron durante 90 minutos a 37ºC en una placa de 96 pocillos (Costar #3690), a una concentración de 60 ng/25 1l de tampón de metal (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 137 mM de NaCl; 1 mM de KCl; 1 mM de MgCl2; 1 mM de CaCl2; 1 mM de MnCl2 por pocillo. Tras el bloqueo con 150 1l de 3% de BSA/TBS durante 1 hora a 37ºC, se añadieron al pocillo 25 1l de sobrenadantes brutos procedentes de cultivos durante toda la noche de la cepa XL1-Blue de E. coli que expresa Fab de LM609 soluble o de LM609 humanizado soluble, y se incubó durante 2 horas a 37ºC. La unión de cada uno de los sobrenadantes a los pocillos revestidos con integrina av 3y aIIb 3 humana, así como a pocillos sin revestir pero bloqueados, se analizó por triplicado. Como control positivo, se usaron 25 1l de Fab-9 purificado 50 ng/1l, un anticuerpo que se une tanto a integrina av 3 como aIIb 3 humana (Barbas III, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10003-10007), y, como control negativo, 25 1l de medio de cultivo bacteriano completo. Después de un lavado amplio con agua del grifo, se añadió al pocillo 25 1l de una dilución 1:2.000 de anticuerpo anti-F(ab’)2 de ratón de cabra o anticuerpo anti-F(ab’)2 humano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce #31324 ó 31312, respectivamente) en 1% de BSA/TBS, y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Tras otro lavado amplio con agua del grifo, se añadieron al pocillo 50 1l de sustrato de fosfatasa alcalina (5 mg de p-nitrofenilfosfato de sodio hexahidratado (Sigma #104-105) disueltos en 5 ml de dietanolamina al 10%, 1 mM de MgCl2, 3 mM de NaN3, pH 9,8). La placa se analizó con un lector de ELISA (Molecular Devices) después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente.

Citometría de flujo

La citometría de flujo se llevó a cabo usando un instrumento Becton Dickinson FACScan. Para cada determinación, se analizaron 5 x 103 células de hámster CS-1 sin transfectar o células de hámster CS-1 que expresan 3 o 5, humana. La tinción de inmunofluorescencia indirecta se logró con lisados brutos de la cepa XL1-Blue de E. coli que expresa Fab de LM609 humanizado soluble o, como control negativo, un Fab humano no relacionado. Para la detección se usó una dilución 1:100 de anticuerpo anti-F(ab’)2 humano de cabra conjugado con FITC (Jackson #109096-097).

Construcción de librerías de LCDR3

Los clones 2, 4, 7, 11, y 24 de LM609 humanizado en pPhoA-H6HA se utilizaron separadamente como moldes para la mutagénesis por PCR mediante extensión por solapamiento como se describe (Barbas III, et al. (1994) IN VITRO EVOLUTION OF A NEUTRALIZING HUMAN ANTIBODY TO HIV-1 TO ENHANCE AFFINITY AND BROADEN STRAIN CROSS-REACTIVITY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3809-3813). Los dos fragmentos requeridos para este procedimiento se obtuvieron con los pares de cebadores de PCR OMPSEQ (SEC ID nº: 39)/CR320 (SEC ID nº: 46) y CR520 (SEC ID nº: 47)/DPSEQ (SEC ID nº: 48), respectivamente. Los cinco ADNc resultantes con LCDR3 aleatorizada se cortaron con SfiI, se ligaron en el vector fagómido pComb3H, y se electrotransformaron en la cepa ER 2537 de E. coli. Se analizaron dos clones de cada una de las cinco librerías mediante secuenciación de ADN, y esto reveló un ensamblaje correcto así como 10 secuencias de LCDR3 diferentes. Antes de la selección, las librerías basadas en los clones 2, 4, y 24 (línea germinal de VL DP-26; línea germinal de VH DP-65) se combinaron para dar una complejidad de 6 x 107 transformantes independientes. Las librerías basadas en el clon 11 (línea germinal de VL DP-26; línea germinal de VH DP-10) y 7 (línea germinal de VL DP-26; línea germinal de VH DP-78) se mantuvieron separadas con una complejidad de 3 x 107 y 4 x 107 transformantes independientes, respectivamente.

Selección de librerías de LCDR3

Las tres librerías de LCDR3 se seleccionaron separadamente mediante cribado por inmunoadsorción durante seis ciclos frente a integrina av 3 inmovilizada. El cribado por inmunoadsorción se llevó a cabo sustancialmente como se ha descrito anteriormente para la humanización de LM609. La concentración de integrina av 3 humana para el revestimiento fue 200 ng/25 1l en los ciclos primero a cuarto, y 50 ng/25 1l en los ciclos quinto y sexto. También, el número de entrada de fagos, en el intervalo de 1012 en los ciclos primero a cuarto según lo habitual, se disminuyó por un factor de 10 en el quinto ciclo, y por un factor de 100 en el sexto ciclo. En los ciclos segundo a sexto de selección, se añadieron al pocillo 20 1g de IgG de LM609 en 50 1l de tampón de metal (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 137 mM de NaCl; 1 mM de KCl; 1 mM de MgCl2; 1 mM de CaCl2; 1 mM de MnCl2) tras la eliminación de los fagos sin unir mediante cinco a diez etapas de lavado. La placa se incubó entonces durante 24 horas a temperatura ambiente (selección por constante de disociación) antes de cinco etapas de lavado adicionales y la elución con tripsina como se describe. Después del sexto ciclo, los fagos se produjeron a partir de clones individuales, y se ensayaron para determinar la unión a integrina av 3 humana inmovilizada mediante ELISA de fagos usando como anticuerpo secundario un anticuerpo anti-M13 de oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante (Pharmacia #27-9411-01). Las secuencias que codifican las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de los clones positivos se analizaron mediante secuenciación de ADN usando los cebadores OMPSEQ (SEC ID nº: 39) y PELSEQ (SEC ID nº: 24), respectivamente.

Optimización de LM609 mediante aleatorización de CDR

Además de la humanización, LM609 se puede optimizar en dos aspectos: en primer lugar, incrementando la afinidad por av 3, y, en segundo lugar, ampliando la reactividad cruzada de las especies. La afinidad incrementada de LM609 manipulado por ingeniería aumenta la potencia y disminuye el coste de una terapia potencial del cáncer.

El anticuerpo monoclonal de ratón LM609 original ya tiene una amplia reactividad cruzada de especies. Se une a av 3 humana, de perro, de gato, bovina, de conejo, y de pollo, pero no de ratón. El hecho de que LM609 no reconozca el hospedante av 3 en los modelos de ratón de cáncer humano es un asunto preocupante importante para la aplicabilidad terapéutica de LM609. LM609 manipulado mediante ingeniería, que se una a av 3 tanto humana como de ratón, sería una herramienta importante para ensayos clínicos. Los métodos in vitro para la mejora de la afinidad de anticuerpos monoclonales incluye intercambio de cadenas (véase Marks, J.D., et al. (1992) BY-PASSING IMMUNIZATION: BUILDING HIGH HUMAN ANTIBODIES BY CHAIN SHUFFLING, Bio/Technology 10, 779-783). La unión a av 3 se puede mejorar adicionalmente mediante aleatorización subsiguiente de CDR, un enfoque denominado desplazamiento o paseo sobre la CDR (véase Barbas III, C.F., et al. (1994) IN VITRO EVOLUTION OF A NEUTRALIZING HUMAN ANTIBODY TO HIV-1 TO ENHANCE AFFINITY AND BROADEN STRAIN CROSS-REACTIVITY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3809-3813). Es probable que las estrategias in vitro para la humanización y mejora de la afinidad de LM609 generen concurrentemente reactividad cruzada con av 3de ratón. La selección dirigida para el reconocimiento de av 3 de ratón es complicada por el hecho de que av 3 de ratón no se ha purificado todavía. Sin embargo, se sabe que varias estirpes celulares de ratón, por ejemplo NIH/3T3, expresan av 3, y de este modo se pueden incluir en el procedimiento de identificación.

La discusión anterior y los ejemplos que se acompañan se presentan como ilustrativos, y no se deben considerar como limitativos.

Listado de secuencias

<110> The Scripps Research Institute

<120> HUMANIZACIÓN DE ANTICUERPO MURINO

<130> TSRI 598.0

<140> No conocido aún

<141>

<150> 08/986,016

<151>

<160> 56

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1 <211>8

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 1

<210>2 <211>9

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400>: 2

<400>: 8

<210>3 <211> 37 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 3

gggcccaggc ggccgagctc cagatgaccc agtctcc: 37

<210>4 <211> 37 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 4

gggcccaggc ggccgagctc gtgatgacyc agtctcc: 37

<210>5 <211> 37 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 5

gggcccaggc ggccgagctc gtgwtgacrc agtctcc: 37

<210>6 <211> 37 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 6

gggcccaggc ggccgagctc acactcacgc agtctcc: 37

<210>7 <211> 23 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 7

cagtaataca ctgcaaaatc ttc: 23

<210>8 <211> 23 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

cagtaataaa ccccaacatc ctc: 23

<210>9 <211> 40 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 9

gggcccaggc ggccgagctc gtgbtgacgc agccgccctc: 40

<210> 10 <211> 40 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 10

gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agccaccctc: 40

<210> 11 <211> 43 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 11

gggcccaggc ggccgagctc gccctgactc agcctccctc cgt: 43

<210> 12 <211> 46 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 12

gggcccaggc ggccgagctc gagctgactc agccaccctc agtgtc: 46

<210> 13 <211> 40 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 13

gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc aatcgccctc: 40

<210> 14 <211> 40 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 14 gggcccaggc ggccgagctc atgctgactc agccccactc: 40

<210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 15

gggcccaggc ggccgagctc gggcagactc agcagctctc: 40

<210> 16 <211> 40 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 16

gggcccaggc ggccgagctc gtggtgacyc aggagccmtc: 40

<210> 17 <211> 40 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 17

gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agccaccttc: 40

<210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 18

gcagtaataa tcagcctcrt c: 21

<210> 19 <211> 44 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 19

gctgcccaac cagccatggc ccaggtgcag ctggtgcagt ctgg: 44

<210> 20 <211> 44 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 20

gctgcccaac cagccatggc ccagatcacc ttgaaggagt ctgg: 44

<210> 21 <211> 44 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 21

gctgcccaac cagccatggc cgaggtgcag ctggtgsagt ctgg: 44

<210> 22 <211> 44 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 22

gctgcccaac cagccatggc ccaggtgcag ctgcaggagt cggg: 44

<210> 23 <211> 24 <212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 23

cgcacagtaa tacacggccg tgtc: 24

<210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 24

acctattgcc tacggcagcc: 21

<210> 25 <211> 24 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 25

cgcacagtaa tacacggccg tgtc: 24

<210> 26 <211>8 <212> PRT <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 26

<210>: 27 <211>8

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 27

<210> 28

<211> 69

<212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 28

<210> 29

<211> 42

<212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 29

gaggaggagg aggagactag ttttgtcaca agatttgggc tc

<210> 30

<211> 73 <212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 30

<210> 31

<211> 21

<212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 31

aatacgactc actatagggc g 21

<210> 32

<211> 72

<212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 32

<210> 33 <211>8

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 33

<210> 34 <211>8

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 34

<210> 35

<211> 69

<212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 35

<210> 36

<211> 50

<212> ADN

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 36

agagagagag agagagagag cgccgtctag aattatgaac attctgtagg

<210> 37 <211>7

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 37

<210> 38 <211>7

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 38

<210> 39 <211> 22 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 39

aagacagcta tcgcgattgc ag: 22

<210> 40 <211> 41 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 40

gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c: 41

<210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 41

ggccatggct ggttgggcag c: 21

<210> 42 <211> 42 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 42

gcagagccca aatcttgtga cactagtggc caggccggcc ag: 42

<210> 43 <211> 41 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 43

gaggaggagg aggaggagcc tggccggcct ggccactagt g: 41

<210> 44

<211> 130

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 44

10 <210> 45

<211> 109

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

15 <400> 45 15 <210> 50

20: <210> 46 <211> 57 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

25: <400> 46 ggtcccctgg ccaaacgtgt gaggmnnmnn mnnmnnctgt tggcagtaat acactgc 57

30: <210> 47 <211> 23 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 47

35: cctcaccgtt tggccagggg ace 23

40: <210> 48 <211> 21 <212> ADN <213> LM609 de hibridoma murino

<400> 48

agaagcgtag tccggaacgt c: 21

5

<210> 49

<211> 109

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

10

<400> 49

<211> 118

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

20 <400> 50

<210>51 25 <211> 118

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 51 30

<210> 52

<211> 118

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 52

10 <210> 53

<211> 118

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

15 <400> 53

<210> 54 20 <211> 117

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 54 25

<210> 55

<211> 109

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

<400> 55

10 <210> 56

<211> 117

<212> PRT

<213> LM609 de hibridoma murino

15 <400> 56

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado, que comprende las etapas siguientes:

(a)

construir una primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas tiene una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad (CDR3) de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable de origen humano;

(b)

combinar la primera librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas construida de la etapa (a) con una cadena complementaria de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, de forma que la cadena complementaria, junto con una cadena humanizada presente en la librería construida, forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados, en el que la cadena complementaria es una cadena quimérica de ratón/humana;

(c)

seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (b) un par particular de cadenas pesada y ligera humanizadas usando dicha cadena complementaria, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera humanizadas se selecciona para la unión a dicho antígeno preseleccionado;

(d)

construir una segunda librería de cadenas pesadas o ligeras humanizadas, en la que cada cadena tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena pesada o ligera de ratón correspondiente, y en la que cada una de dichas cadenas incluye un dominio variable; en el que las cadenas de dicha segunda librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado son la cadena pesada o ligera complementaria de dichas cadenas de la primera librería de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo humanizado de la etapa (a), de manera que una librería es una librería de cadenas ligeras y la otra librería es una librería de cadenas pesadas;

(e)

aislar una cadena pesada o ligera del par de cadenas pesada y ligera humanizadas de unión al antígeno de la etapa (c), y combinar dicha cadena de unión al antígeno con cadenas de dicha segunda librería de la etapa (d), de manera que la cadena de unión al antígeno, junto con las cadenas presentes en la librería construida de la etapa (d), forma un par de cadenas pesada y ligera en una librería de pares humanizados; y

(f)

seleccionar de la librería de pares humanizados de la etapa (e) un par de cadenas y ligera humanizadas que se une a dicho antígeno preseleccionado.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que la librería humanizada de la etapa (a) contiene cadenas ligeras, y la cadena complementaria de la etapa (b) es una cadena pesada.
3.

Método según la reivindicación 1, en el que la librería humanizada de la etapa (a) contiene cadenas pesadas, y la cadena complementaria de la etapa (b) es una cadena ligera.
4.

Método según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada es un fragmento Fd.
5.

Método para humanizar un anticuerpo monoclonal de ratón, que comprende las etapas siguientes:

(a)

construir una librería de cadenas ligeras humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas ligeras comprende por lo menos un dominio variable de la misma y tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena ligera de ratón;

(b)

seleccionar de la librería de cadenas ligeras humanizadas construida una cadena ligera humana que tiene una CDR3 de ratón, en el que la selección comprende usar una cadena pesada de un anticuerpo que se une a un antígeno preseleccionado, en el que la cadena pesada es una cadena quimérica de ratón/humana, y en el que dicha cadena ligera humana que tiene una CDR3 de ratón se selecciona para la unión a un antígeno preseleccionado;

(c)

construir una librería de cadenas pesadas humanizadas, en la que cada una de dichas cadenas pesadas comprende por lo menos un dominio variable humano, y tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 de ratón de una cadena pesada de ratón;

(d)

combinar la librería de cadenas pesadas humanizadas construida con la cadena ligera humanizada seleccionada, para producir una librería humanizada de pares de cadenas pesada y ligera que contienen cada uno una CDR3 de ratón; y

(e)

seleccionar de la librería humanizada de la etapa (d) un par de cadenas pesada y ligera usando la cadena ligera humana seleccionada, en el que dicho par de cadenas pesada y ligera se selecciona para la unión al antígeno preseleccionado.
6. Método según la reivindicación 5, que comprende además convertir el par de cadenas pesada y ligera seleccionado en anticuerpo completo.
7.

Método según la reivindicación 5, en el que la cadena pesada es Fd. 5
8. Método según la reivindicación 7, en el que el Fd es un miembro del grupo que consiste en un fragmento de cadena pesada de ratón/humana quimérico y un fragmento molde de cadena pesada de ratón.
9.

Método según la reivindicación 5, en el que sólo está presente en la cadena ligera humana una región tres 10 determinante de la complementariedad de la cadena ligera procedente del anticuerpo LM609.
10. Método según la reivindicación 5, en el que sólo está presente en la cadena pesada humana una región tres determinante de la complementariedad de la cadena pesada procedente del anticuerpo LM609.

15 11. Método según la reivindicación 7, en el que el Fd es una cadena pesada quimérica de ratón/humana.
12. Método según la reivindicación 7, en el que el Fd es un fragmento molde de la cadena pesada de ratón.