ES2600481T3

ES2600481T3 - Preparación para tratar una infección intestinal que comprende oligosacáridos y material celular insoluble

Info

Publication number: ES2600481T3
Application number: ES08806589.1T
Authority: ES
Inventors: Leslie Priest; Vernon Fowler; Kevin Hillman
Original assignee: Promovita Ingredients Ltd
Current assignee: Promovita Ingredients Ltd
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2008-10-13
Publication date: 2017-02-09
Anticipated expiration: 2028-10-13
Also published as: CN101951922A; US20130071368A1; CA2704009C; GB0818805D0; CN101951922B; EP2222310B1; US20100330054A1; CA2704009A1; GB2453671A; EP2222310A1; GB2453671B; WO2009047537A1

Abstract

El uso de un galactooligosacárido y pulpa de un material hemi-celular de arándano en la creación de una preparación para uso en el tratamiento de infección por uno de Clostridium difficile y Salmonella.

Description

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DESCRIPCION

Preparacion para tratar una infeccion intestinal que comprende oligosacaridos y material celular insoluble Antecedentes de la invencion

1. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al tratamiento de patogenos intestinales. Tres de los patogenos mejor conocidos que son perjudiciales para los seres humanos incluyen Salmonella, Clostridium difficile (C. difficile”) y ciertas cepas de Escherichia coli (“E. coli”). La infeccion por C. difficile esta aumentando actualmente en los hospitales, dando como resultado un aumento considerable de casos de pacientes con smtomas graves y, en algunos casos, peligra su vida. Los protocolos de tratamiento presentes implican el tratamiento basado principalmente en el uso de antibioticos, tales como metronidazol, vancomicina y linezolid. Sin embargo, C. difficile, es resistente a muchos antibioticos. Ademas es una bacteria comensal (por ejemplo una bacteria que vive dentro del intestino de su huesped sin perjudicarle) en una parte de la poblacion. Los pacientes que son portadores asintomaticos de C. difficile pueden, por lo tanto, si se tratan con antibioticos “de amplio espectro” conjuntamente con otras enfermedades, mostrar, desarrollo repentino de muchos smtomas graves de una infeccion por C. difficile, tales como colitis pseudomembranosa. Esto ocurre porque los antibioticos de amplio espectro reducen los niveles normales de la flora intestinal mientras que crece la que no tiene efecto sobre C difficile, lo que significa que C. difficile tiene una competencia reducida.

La infeccion por Salmonella se aprecia muy frecuentemente como una enfermedad transmitida por los alimentos. El tratamiento de la Salmonella ha sido mediante antibiotico. Tal tratamiento puede, sin embargo, dar lugar a los problemas referidos anteriormente en relacion a la infeccion de C. difficile, mientras que el uso de antibioticos a largo plazo en industrias avmolas y de ganado puede haber creado una cepa de Salmonella que es potencialmente resistente a antibioticos.

Las vfas de infeccion por cepas patogenas de E. coli son variadas. Este organismo se dispersa normalmente por contaminacion fecal y se puede transmitir a traves de la comida, del agua, o del ambiente. Un tratamiento que suprime la actividad del grupo de bacteria coliforme en el intestino aumentana la resistencia del huesped a la infeccion por estos patogenos.

2. Descripcion de la tecnica relacionada

Es conocido que el intestino humano, y en particular el colon, contiene mucha microflora que se piensa que tiene una relacion simbiotica con el hospedador humano ayudando a la digestion y previniendo el crecimiento de especies perjudiciales. Un grupo particular de tales organismos utiles, que se piensa que tienen un efecto beneficioso en la ayuda en la lucha de un huesped humano de muchas formas de infeccion, es el grupo de bacterias del acido lactico, aqrn en lo sucesivo referido por sus miembros primarios, Lactobacillus spp.. Se piensa que Lactobacillus ayuda en la lucha de bacterias infecciosas, tales como C. difficile, de diversas maneras. En primer lugar, Lactobacillus, cuando actua sobre determinados sustratos fermentables, causa un descenso del pH de los contenidos intestinales que inhibe el crecimiento del patogeno. En cambio C. difficile crece en un ambiente con un pH mas neutro, lo que significa que la presencia de Lactobacillus dara como resultado un ambiente que es perjudicial para C. difficile. En segundo lugar, Lactobacillus puede tener un efecto antibacteriano que actua contra la bacteria competente tal como C. difficile. Un aumento de Lactobacillus en el intestino de un huesped que esta infectado con C. difficile puede, por lo tanto, dar como resultado una disminucion de los smtomas asociados con la infeccion por C. difficile. Una solucion atractiva superficialmente al problema de la lucha de la infeccion intestinal es, por lo tanto, introducir Lactobacillus adicional. Sin embargo, se ha encontrado que esto es raramente eficaz por la razon de que tales cantidades adicionales de bacteria no son sostenibles, y que las especies anadidas podnan no adaptarse para sobrevivir en el intestino del huesped. Una poblacion de Lactobacillus del huesped depende principalmente de las condiciones que son adecuadas para crecer. Los tratamientos descritos aqrn actuan para mejorar la propia poblacion de Lactobacillus spp. del huesped, que esta ya adaptada para sobrevivir en el intestino y aumentara por lo tanto rapidamente en numero y actividad si se le proporciona nutrientes adecuados.

Los Lactobacillus se conocen por crecer en medios que son ricos en azucares espedficos. Los azucares simples, sin embargo, son diffciles de trasportar a las ultimas partes del intestino porque se absorben en gran parte y se consumen muy pronto en el proceso digestivo. Por tanto, para cuando un bolo de comida ha alcanzado el colon -la localizacion donde la infeccion diana esta mayormente localizada- es improbable contener azucares en grandes cantidades. La alimentacion de azucar a un huesped no proporcionara, por lo tanto, las condiciones requeridas para Lactobacillus en el intestino grueso. Ciertos oligosacaridos, que son poffmeros que contienen normalmente entre tres y diez azucares simples, sin embargo son mas diffciles para la descomposicion temprana en la digestion. La administracion de oligosacaridos particulares se presenta para proporcionar un incremento en la cantidad de bacterias 'amigables' y la reduccion simultanea en la poblacion de bacterias perjudiciales.

Compendio de la invencion

Un aspecto de la presente invencion proporciona un ambiente apropiado para el cultivo de Lactobacillus en el intestino grueso mediante el uso de oligosacaridos. Segun un primer aspecto de la presente invencion se proporciona el uso de oligosacarido y pulpa de material hemi-celular a partir de arandano en la creacion de una 5 preparacion para uso en el tratamiento de Clostridium difficile y Salmonella.

La preparacion se puede crear como una preparacion alimentaria de duracion relativamente larga que permite el facil transporte y consumo, tal como fruta envasada, seca o en barritas de fruta (si esta contenida dentro de un envase hermetico o de otra manera), por ejemplo. Alternativamente, la preparacion puede ser fresca y en forma de una bebida (tal como, por ejemplo, los tipos de bebida que estan actualmente de moda bajo el eptteto 'smoothie') o 10 una bebida de yogurt. La preparacion puede usarse, en una realizacion, en el tratamiento (bien para la profilaxis o como remedio de la infeccion) de la infeccion intestinal por C. difficile o Salmonella. Cuando se usa como un profilactico, mejora la capacidad de la microflora intestinal para rechazar infecciones posteriores.

Cuando la preparacion incluye una pulpa, segun una realizacion, la pulpa se hace de arandanos enteros, molidos. La pulpa de la fruta, esta en gran medida compuesta de componentes estructurales complejos qmmicamente de 15 celulas vegetales que son por tanto mas diffciles de descomponer en la digestion temprana, ayudando en el reparto de grandes cantidades de oligosacarido al intestino grueso.

Un aspecto preferido de la presente invencion proporciona el uso de material hemi-celular a partir de arandanos en la creacion de una preparacion para el tratamiento de la enterotoxina liberada por Clostridium difficile en el canal alimentario humano.

20 La presente invencion preferiblemente proporciona ademas una preparacion para el tratamiento de la bacteria intestinal perjudicial que comprende uno o mas del Lactobacillus salivarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchner, cada uno de los cuales se ha encontrado que crecen provechosamente en presencia de galacto- oligosacarido. En una realizacion preferida, la preparacion es para el tratamiento de Salmonella.

Breve descripcion de los dibujos

25 Las realizaciones de la presente invencion seran a continuacion descritas, por medio de ejemplos, y con referencia a los dibujos que se acompanan en los que:

Fig. 1 es una representacion esquematica de la fermentacion en un vaso del intestino de un cerdo usado para ensayar los efectos de varias sustancias para el reparto de oligosacaridos; y

Fig. 2 es un diagrama de flujo de los ensayos realizados con el vaso de la Fig. 1.

30 Descripcion de realizaciones preferidas

El tratamiento (y dentro de esta memoria, el termino 'tratamiento' se entiende por incluir dentro de su alcance, el tratamiento profilactico asf como tratamiento curativo, a menos que se requiera un contexto espedfico) de la infeccion intestinal puede variar dependiendo de la naturaleza del patogeno. En cada caso, sin embargo, un paciente es probable que se beneficie de un incremento de la poblacion de Lactobacillus spp..

35 Segun una realizacion de la presente invencion, un oligosacarido se digiere como parte de una mezcla que incluye un material celular comestible, insoluble. En el contexto de esta memoria, el termino 'insoluble' se refiere al contexto de transmision a traves del canal alimentario hasta el colon. Por tanto, si un material es insoluble en las condiciones presentes en el canal alimentario anterior al colon durante un penodo de tiempo en el que ocurrina la transmision comun a traves del canal alimentario hasta el colon, (por tanto, normalmente, aunque no se limita a entre uno y diez 40 dfas), entonces este es un material insoluble para los objetivos de esta memoria. El material comestible, en el presente ejemplo, es una pulpa fibrosa de material comestible de origen vegetal. El oligosacarido es galacto- oligosacarido (GOS). El GOS puede estar bien infusionado en la pulpa o ser administrado simplemente en conjunto. La pulpa puede incluir preferiblemente, aunque no esencialmente, un residuo de fruta, tal como el que se puede obtener a partir de hacer jugo o una operacion de prensado. Por tanto la pulpa puede ser las pieles, semillas y otros 45 materiales que contienen celulosa que permanece en el prensado o al hacer jugo de los arandanos. Ademas, la pulpa vegetal, se puede usar, bien si se obtiene como un residuo al hacer jugo o una operacion de prensado, tal como puede ser el caso con, por ejemplo, zanahorias, o bien generarse por maceracion o licuacion. Ejemplos de vegetales que pueden servir para crear una pulpa practica incluyen, pero no se limitan a, patatas (por ejemplo, las pieles de una patata horneada), zanahorias, remolachas, apio, puerros, pimientos, brasicas tales como brocoli, 50 brotes, coliflor y col.

La infusion del oligosacarido se puede realizar en una variedad de maneras. Por ejemplo mediante el mezclado del oligosacarido GOS, en forma de polvo o sirope, con una pulpa de arandano comestible para crear una mezcla a razones apropiadas. Preferiblemente, la razon estara en la region de 50:50 (por peso seco) de pulpa fibrosa de oligosacarido. La razon puede variar dependiendo de la naturaleza de la infeccion que se este tratando, entre 10:90

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y 90:10 ya que en experimentos in vitro, que se describen con mas detalle posteriormente, se han encontrado que proporcionan efectos diferentes dependiendo de la naturaleza del patogeno que se este tratando.

Los oligosacaridos, son poKmeros, que tienen una mayor capacidad para endurecerse en una forma que puede ser beneficiosa para los Lactobacillus residentes en el intestino grueso que los azucares simples tales como glucosa, fructosa, galactosa y sacarosa, siendo estos mas susceptibles inmediatamente para la absorcion por el huesped y para la digestion bacteriana que tiene lugar en el intestino delgado. Se formula la hipotesis de que las realizaciones de la invencion proporcionan para una mejora del reparto de oligosacaridos al intestino grueso y, relacionada, una reduccion en su asimilacion mas adelante en el canal alimentario, en el estomago, duodeno o fleon. Se cree que tal mejora del reparto ocurre porque el material celular 'insoluble', dentro del cual se localizan los oligosacaridos cuando se mezclan juntos, mientras que es diffcil de descomponer en el canal superior alimentario, es facil de descomponer en el colon y mas soluble para la bacteria. La descomposicion del material celular libera el oligosacarido que hasta ese momento se ha atrapado en su estructura celular durante su paso a traves del canal, y la posterior liberacion de oligosacarido por los Lactobacillus para que se desarrolle. Por tanto, se pueden repartir mayores niveles de oligosacarido al colon que sena el caso si los oligosacaridos fuesen introducidos por sf solos y dara como resultado un aumento correspondiente de Lactobacillus. Un incremento en la poblacion de otras bacterias que producen acido lactico tales como, por ejemplo, Streptococcus y Bacteroides pueden ser tambien beneficiosas para el tratamiento de la infeccion intestinal perjudicial, y tales grupos de bacterias pueden proporcionar tambien un resultado de dicho tratamiento.

Salmonella

Una infeccion patogena simulada en la fermentacion in vitro en un vaso del intestino de un cerdo con Salmonella poona se trato con una mezcla de GOS y pure de arandano. El resultado que se encontro fue que, despues de dos dfas, se obtuvo una reduccion de mil veces en la poblacion de Salmonella. Se formula la hipotesis de que, en el caso de Salmonella una combinacion de al menos dos mecanismos proporcionan un resultado beneficioso. En primer lugar, la presencia de GOS (cuyo material vegetal se piensa, que proporcionara in vivo, para el reparto al intestino grueso mayores cantidades que en el caso donde se administra GOS oralmente por sf solo) proporciona un ambiente favorable para la poblacion de Lactobacillus, dando como resultado un menor pH y, posiblemente tambien un efecto antibacteriano contra la Salmonella. En segundo lugar, se piensa que Salmonella ataca mecanicamente a la pulpa. Esto tiene el efecto de que la eliminacion de la pulpa durante el curso del flujo peristaltico normal en el intestino eliminara asimismo la Salmonella unida, con el resultado del descenso de la poblacion de Salmonella. Cuando este tratamiento se aplico como un profilactico in vitro, con posterior infeccion, los niveles de Salmonella disminuyeron a niveles indetectables dentro de los tres dfas, mientras que se mantuvieron dentro de la poblacion del vaso sin tratar.

Clostridium difficile

Una infeccion simulada por C. difficile en la fermentacion in vitro en un vaso del intestino de cerdo, cuando se trato con una mezcla de GOS y pure de arandano, dio como resultado una reduccion significantiva estadfsticamente en el numero de unidades formadoras de colonias (ufc) de C. difficile en 48 horas. Esta es la hipotesis que es atribuible a un aumento en las cantidades de Lactobacillus, que disminuyen el pH y, posiblemente, tienen tambien un efecto anti-bacteriano sobre el C. difficile, que podna ser el caso con GOS en solitario. El papel hipotetico de GOS es que proporciona un ambiente favorable para Lactobacillus mientras que el pure de arandano proporciona que se pueda pensar como un mecanismo de reparto para transportar mayores niveles de GOS -y por lo tanto azucares sin digerir- al area al que un incremento en la poblacion de Lactobacillus podna ser beneficiosa para el tratamiento de C. difficile. Aunque la poblacion de C. difficile no se erradico por completo, se piensa que la reduccion podna ser de un nivel suficientemente significativo como para permitir metodos dirigidos de tratamiento usando antibioticos espedficos que surten efecto en proporcionar una cura, posiblemente en conjunto con otras terapias de reemplazo de la microflora. Esta hipotesis se soporta por la evidencia anecdotica, discutida posteriormente.

Los experimentos realizados hasta el momento podnan parecer indicar que, en relacion al tratamiento por infeccion de Salmonella, la mezcla del componente de arandano fue la mas eficaz. En cambio, en relacion al tratamiento de C. difficile, GOS parece ser el agente mas activo y que tiene un mejor efecto en la reduccion de los niveles de poblacion de C. difficile.

Sin embargo, fuera del alcance de la presente invencion reivindicada, una combinacion de arandano -u otro material comestible que incluye un material celular insoluble, tal como una pulpa fibrosa de diferente tipo- y GOS produce una preparacion que probablemente abarque un amplio rango de bacterias patogenicas, ya que las dos que se discuten aqrn son de grupos taxonomicos ampliamente diferentes. Se hallo que la mezcla arandano/GOS no solo mejora la razon de Lactobacillus para bacterias coliformes a un mayor grado sino que tambien en el sustrato en solitario. La posterior observacion indica que, para uso profilactico general una mezcla de pulpa comestible de oligosacarido, tal como arandano y GOS, es mejor que los componentes individuales.

Los experimentos y sus resultados, en los que se basa la hipotesis descrita anteriormente, seran descritos a continuacion. Refiriendonos ahora a la Fig. 1, una simulacion in vitro de la fermentacion del intestino de cerdo, provista de un vaso de fermentacion 10 de intestino de cerdo se lleno, en su base, con perlas 12 de vidrio, aqrn

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ilustradas esquematicamente mediante un nivel en el vaso 10 por debajo del cual se asientan. Las perlas 12 simulan frondas dentro del intestino grueso, conocidas como vellosidades, y dentro de las cuales se acumulan bacterias coliformes y otras bacterias evitando de ese modo ser facilmente eliminadas en el intestino durante la digestion y el peristaltismo. El vaso tiene dos entradas, 14, 16. La entrada 14 lleva los medios designados a simular las condiciones digestivas normales, dentro del intestino grueso. Los vasos se inocularon con heces porcinas para proporcionar la microflora base para los experimentos. De esta forma la entrada de medios 14 lleva almidones, pectinas, xilano y similares. La entrada 16 que es conocida como el sustrato de ensayo, lleva por ejemplo la mezcla o preparacion cuya eficacia en el tratamiento de la bacteria patogena se desea ensayar.

El vaso 10 tiene tambien dos salidas, 18, 20. La salida 18 proporciona el residuo eliminado de una combinacion del medio y el sustrato, de ese modo simula la accion normal del tracto del intestino grueso, donde los contenidos pasan continuamente a traves del peristaltismo. La eliminacion de este residuo se anade como medio fresco que mantiene el volumen constante del vaso durante todo el experimento. La salida 20 es la via de salida de las muestras del medio de ensayo que se recogen en varios momentos durante el curso del experimento. Ademas para simular la accion intestinal, un agitador 22, en forma de un eje 24 de rotacion, propulsado por un motor (no mostrado) y que rota a una tasa de aproximadamente 60 rpm, junto con una pala 26 que se encuentra en el final distal del eje 24, mejora la accion simulada del intestino grueso.

Refiriendonos a continuacion a la Fig. 2, la simulacion del vaso se opero para proporcionar la simulacion de una infeccion patogena del intestino grueso porcino de la manera siguiente.

Para examinar los efectos del tratamiento en una infeccion existente, los vasos se cebaron con un inoculo fecal para proporcionar la microflora, el medio fresco y los patogenos que se examinaran en la etapa 200. Los patogenos se anadieron en esta etapa para permitirles incorporarse en la microflora, incrementando de ese modo la exposicion a los sustratos de ensayo. A los contenidos se les permitio a continuacion multiplicarse y estabilizarse en la etapa 202 (tres dfas) antes de anadir otra dosis de patogenos, seguido del sustrato o sustratos de ensayo, que en los ejemplos presentes comprenden residuo de arandano y GOS, en la etapa 204.

Cuando se examina un efecto profilactico, los sustratos se anadieron en la etapa 200 y despues diariamente. Los patogenos se introdujeron a continuacion en la etapa 204.

Se ha publicado una descripcion detallada de un sistema similar en las referencias siguientes, que proporcionan mas detalle en relacion a la operacion del sistema.

Hillman, K., Murdoch, T.A., Spencer, R.J. y Stewart, C.S. (1994) Inhibicion de Escherichia coli enterotoxigenica por la microflora del fleon porcino, en un sistema de cultivo semicontinuo in vitro. Journal of Applied Bacteriology 76: 294300.

Hillman, K., Spencer, R.J.., Murdoch T.A, y Stewart, C.S. (1995) El efecto de mezclas de Lactobacillus spp. en la supervivencia de Escherichia coli enterotoxigenica en un cultivo continuo in vitro de bacteria intestinal porcina. Letters in Applied Microbiology, 20: 130-133.

Khaddour, R., Reid, C-A. y Hillman, K. (1998) Mantenimiento in vitro de la microflora y modelos de fermentacion del intestino porcino. Pig News and Information 19: 111N-114N.

Blake, D.P., Hillman, K. y Fenlon, D.R. (2003). Uso de un modelo de fleon para investigar los efectos de antimicrobianos nuevos y existentes en la microflora gastrointestinal porcina indfgena: usando vancominicina como un ejemplo. Animal Feed Science and Tecnology 103: 123-139.

El inoculo inicial podna contener patogenos en un nivel bajo (las muestras se toman de individuos sanos) pero cualquier patogeno existente se sobresaturara por los altos niveles anadidos como parte del experimento y, en cualquier caso, sera sujeto a los efectos de los sustratos de ensayo.

El efecto del flujo a traves del intestino se simula a continuacion mediante reposicion de los contenidos del vaso con medio esteril fresco (etapa 206). Esto se realiza durante tres dfas anadiendo el 80% de los contenidos del vaso a intervalos de ocho horas, mientras las bombas de residuo mantienen constante el volumen total del vaso. Despues de permitir al vaso repoblarse durante un tiempo corto en la etapa 208, se retiran las muestras en la etapa 210 y se determina las cantidades de grupos bacterianos espedficos.

El experimento continua en este ciclo hasta que se obtienen datos suficientes, despues se retira una muestra final en la etapa 212 y termina el experimento.

Actualmente, se operan cuatro vasos simultaneamente permitiendo tres combinaciones de sustratos de ensayo y uno de control. Todos los vasos se suministraron con medio a partir de una unica fuente para garantizar que no haya diferencias debido a la fuente de alimentacion, y los sustratos de ensayo se introdujeron manualmente a traves del puerto 16 (figura 1).

EXPERIMENTO 1-Tratamiento profilactico de Salmonella con GOS y pure de arandano

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Materiales y metodos Residuo de arandano y GOS

El arandano se trituro mediante un molinillo manual antes de su uso, para reducir la posibilidad de obstruir la tubena durante la operacion del fermentador. No se incluyo arandano en el medio ya que el sustrato podna no mezclarse eficazmente, pero se anadio diariamente a traves de un puerto separado en la tapa del vaso. Por coherencia, se anadieron GOS y una mezcla de arandano/GOS 70:30 a los respectivos vasos de la misma manera, todo en una concentracion final del 1% de los contenidos en el fermentador. Ni el arandano ni el GOS se esterilizaron o trataron qmmicamente de ninguna manera antes de la adicion.

Simulacion In Vitro

Se emplearon cuatro vasos de fermentacion. El volumen de trabajo de cada vaso era de 300 ml y la tasa de dilucion era de 2,4 d-1 (720 ml d-1). Se calentaron todos los vasos al bano maria para proporcionar 37 (±1)°C en los contenidos del vaso. Se extrajeron las muestras mediante un tubo de salida de desague, que se extiende hasta aproximadamente dos-tercios de la profundidad del fluido.

El medio comprendfa (g l-1):

xilano, 0,6; pectina, 0,6; almidon de patata, 5,0; casema, 3,0; peptona, 3,0; K2HPO4, 2,0; NaHCO3, 1,0; NaCl, 4,5; MgSO4.7H2O, 0,5; CaCl2.2H2O, 0,45; Haemin, 0,01; Sales biliares (Oxoid), 0,05; Antifoam A (0,5 ml l-1) y Tween 80 (2 ml l-1). Todos los componentes se obtuvieron a partir del grupo Sigma excepto donde se indica.

El medio se preparo en un deposito de 5 l que contiene aproximadamente 2 l de agua destilada con agitacion constante (magnetica) para reducir la formacion de agregados. El medio completo estaba compuesto hasta 5 l con agua destilada, se instalaron los tubos de reparto y se tapo el deposito con algodon hidrofilo antes de la esterilizacion por autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Despues del autoclave, los depositos se volvieron a colocar en los agitadores magneticos en estado caliente (75- 80°C), y se dejaron enfriar con agitacion constante. Esto previene la formacion de un gel de carbohidrato en la base del deposito, y rompe los agregados formados durante el autoclave.

Cuando el medio se ha colado, se anaden una solucion de oligoelementos (2 ml l-1) y una solucion de vitamina (1 ml l-1). Se proporciono agitacion continuamente en los depositos durante todo el experimento.

La solucion de oligoelementos comprendfa (mg l-1):

EDTA, 500; FeSO4.7H2O, 200; ZnSO4.7H2O, 10; MnCM^O, 3; H3BO3, 30; CoCl2.6H2O, 20; CuCh.2H2O, 1; NO2.6H2O, 2; Na2MoO4.2H2O, 3.

La solucion de vitamina comprendfa (mg l-1):

menadiona, 1; biotina, 2; pantotenato sodico, 10; nicotinamida, 5; vitamina B12, 0,5; tiamina, 4; acido para- aminobenzoico, 5.

La naturaleza particular del medio requiere el uso de un tubo de calibre ancho, y la operacion de bombeo discontinuo resultana en la instalacion de un medio dentro de tubos, conduciendo a una dispensacion inexacta y posible obstruccion. El medio se bombeo por lo tanto continuamente en un circuito recirculante, y se desvio (mediante valvulas solenoides) a los vasos durante 15 minutos cada 8 horas para proporcionar la reposicion y la tasa de dilucion requeridas diariamente.

Los vasos se accionaron durante tres dfas antes del comienzo del experimento para garantizar la estabilidad del sistema. Los sustratos de ensayo se incorporaron a los vasos durante el periodo de estabilizacion, excepto para el control (sin adicion), junto con un inoculo de heces porcinas frescas, se diluyeron 1:1 con diluyente de maxima recuperacion (Oxoid) precalentado para proporcionar la microflora de origen de un colon saludable. La disposicion de los ensayos en los vasos se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1:Protocolo de operacion del fermentador.

N° de vaso

Dfas: 1 2 3 4

1-3 (sin muestra): Arandano GOS Arandano/GOS Control

4-6 (serie de muestras 1): Arandano GOS Arandano/GOS Control

7-9 (sin muestra): Control Arandano GOS Arandano/GOS

N° de vaso

Dfas: 1 2 3 4

10-12 (serie de muestras 2): Control Arandano GOS Arandano/GOS

13-15 (Sin muestra): Arandano/GOS Control Arandano GOS

16-18 (serie de muestras 3): Arandano/GOS Control Arandano GOS

Todos los vasos se dosificaron durante la noche con un cultivo de Salmonella poona al comienzo de cada una de las series de muestras.

Analisis bacteriologico.

Se tomaron muestras (5 ml) diariamente durante tres dfas de las series de muestras. Las muestras se retiraron 5 inmediatamente antes de introducir el medio fresco para que no se maximizara ninguna diferencia en la fermentacion. Despues de la retirada de la muestra y de la dosificacion con medio fresco, se realizo la inoculacion diaria del sustrato de ensayo. Al inicio de cada serie de datos, se retiro una muestra para evaluar la concentracion inicial de Salmonella poona y el pH de los vasos inmediatamente despues de la adicion del medio fresco.

Despues de la medicion del pH, se anadio 1 ml de cada muestra a 9 ml del diluyente de maxima recuperacion (MRD: 10 Oxoid) y se diluyeron en serie hasta 10-6. Estas diluciones se recubrieron despues e incubaron como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2: Condiciones del medio e incubacion para la enumeracion de poblaciones bacterianas.

Grupo bacteriano: Medio Incubacion

Total de bacterias aerobicas: Columbia agar sangre. 24 h aerobico

Total de bacterias anaerobicas: Columbia agar sangre. 48 h anaerobico

Coliformes: Agar MacConkey N° 3. 24 h aerobico

Total de Lactobacillus: Agar MRS 48 h anaerobico

Lactobacillus aerotolerante: Agar MRS 24 h aerobico

Salmonella: Agar XLD 24 h aerobico

Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 37°C. Las condiciones anaerobicas se obtuvieron usando un frasco anaerobico y sobres de Oxoid Anaerogeno.

15 Resultados

Las muestras se retiraron inmediatamente despues de la alimentacion y dosificacion con Salmonella, al inicio de cada serie, se analizaron solo para el pH y enumeracion de Salmonella. Estas se representaron en los resultados como datos ‘Dfa 0'.

La muestra se recogio al inicio de la segunda serie de datos y se analizo por completo. Esto se hizo para examinar 20 el efecto de la introduccion de la alimentacion en la poblacion, y no con intenciones de un analisis estadfstico. Los resultados de este singlete se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Una muestra unica de la poblacion tomada al inicio de la serie de datos 2 (log 10 ufc/ml).

: Total de aerobios Coliformes Lactobacillus aerotolerenates Total de Lactobacillus Total de anaerobios Lac:coli

Arandano: 8,78 8,60 7,16 7,85 8,74 0,91

GOS: 8,48 8,30 8,06 8,32 8,88 1,00

Arandano/GOS: 8,65 8,18 7,65 8,08 8,65 0,99

Control: 8,88 8,40 7,54 7,48 8,88 0,89

Parece que existe una pequena diferencia entre los vasos inmediatamente despues de la alimentacion, por tanto se puede asumir que los efectos mostrados despues se debieron a los sustratos anadidos.

Se determinaron los valores iniciales de pH para el crecimiento del medio y para el 10% de las suspensiones/disoluciones de arandano, GOS y la mezcla 70:30 en agua destilada. Estos se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Medicion del pH del medio de crecimiento fresco y de los sustratos.

Componente: Condicion del ensayo pH

Medio del fermentador: Sin diluir 6,91

Arandano: 10% (p/v) suspension en H2O.d 3,00

GOS: 10% (p/v) disolucion en H2O.d 4,05

70:30 Arandano:GOS: 10% (p/v) suspension/disolucion en H2O.d 3,34

Agua destilada: N/A 6,55

5 El pH de los contenidos del fermentador a cada tiempo de la muestra se muestra en la Tabla 5. Estos son los medios de los datos triplicados, y muestran una cafda inmediata en el pH despues de la adicion de los sustratos de ensayo, los cuales aumentaron a lo largo del tiempo. El control de la fermentacion no muestra un cambio significativo en el pH a lo largo del penodo de incubacion, indicando que para una simulacion normal, la mayor amortiguacion es insuficiente.

10 Tabla 5. pH de las muestras retiradas de los vasos de fermentacion.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

0: 5,39aa 5,05ab 5,70ac 6,51d 0,086 0,05

1: 4,63ba 3,61bb 4,81ba 6,21c 0,093 0,05

2: 4,51ba 3,47bcb 4,45ca O) cn o 0,175 0,05

3: 4,54ba 3,31cb 4,38ca 6,41c 0,137 0,05

SEM: 0,143 0,089 0,134 0,170

P: 0,001 0,05 0,05 ns

Los valores en la columna que marcan las mismas letras en supenndice no difieren significativamente (P>0,05). Los valores en la fila que marcan las mismas letras en supenndice no difieren significativamente. ns- diferencias no significativas.

Las enumeraciones bacterianas se muestran en las Tablas 6 a 11, y las razones de Lactobacillus.coliformes derivados de los recuentos coliformes y de los recuentos totales de Lactobacillus se muestran en la Tabla 12. Todos los recuentos bacterianos se presentan como log10 ufc/ml, y en todos los datos los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos de estas tablas se consideran en la seccion de Discusion.

15 Tabla 6. Total de bacterias aerobicas.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

1: 7,72a 7,85a 8,06ab 8,71a 0,288 0,05

2: 7,90a 7,58a 8,03a 8,84b 0,331 0,05

3: 7.93 7,68 7,89 8,62 0,457 ns

SEM: 0,230 0,599 0,080 0,341

P: ns ns ns ns

Tabla 7. Total de bacterias anaerobicas.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

1: 8,69aa 8,65a 8,60a 9,14b 0,133 0,05

2: 8,87abab 8,95b 8,63a 9,24c 0,107 0,05

3: 8,99bac 8,79ab 8,61b 9,22c 0,136 0,05

SEM: 0,113 0,128 0,148 0,110

P: 0,05 ns ns ns

Los valores en la columna que marcan las mismas letras en superindice no difieren significativamente (P>0,05). Los valores en la fila que marcan las mismas letras en supenndice no difieren significativamente. ns- diferencias no significativas.

Tabla 8. Total de Lactobacillus.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

1: 8,33a 8,39a 8,20ab 7,84b 0,189 0,05

2: 8,45 8,47 8,24 7,92 0,336 ns

3: 8,54a 8,44a 8,55a 7,75b 0,214 0,05

SEM: 0,245 0,155 0,175 0,380

P: ns ns ns ns

Los valores en la columna que marcan las mismas letras en supenndice no difieren significativamente (P>0,05). Los valores en la fila que marcan las mismas letras en superindice no difieren significativamente. ns- diferencias no significativas.

Tabla 9. Lactobacillus aerotolerantes.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

1: 7,65a 8,31b 8,33b 7,59a 0,249 0,05

2: 7,75ab 8,42a 8,22ab 7,67b 0,320 0,05

3: 7,92 8,27 8,20 7,82 0,337 ns

SEM: 0,229 0,075 0,117 0,547

P: ns ns ns ns

Los valores en la columna que marcan las mismas letras en superindice no difieren significativamente (P>0,05). Los valores en la fila que marcan las mismas letras en superindice no difieren significativamente. ns- diferencias no significativas.

Tabla 10. Bacterias coliformes.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

1: 7,52ac 5,96b 6,62aab 8,45c 0,417 0,05

2: 6,95ac 4,80b 5,39bab 8,78c 0,805 0,05

3: 7,09a 3,11b 3,97cb 8,23a 1,172 0,05

SEM: 0,837 1,390 0,482 0,260

P: ns ns 0,05 ns

5

10

15

20

25

30

Tabla 11. Salmonella poona.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

0: 7,23a 7,18a 7,26a 7,22a 0,047 ns

1: 5,97ba 4,79bb 5,68ba 6,93ac 0,279 0,05

2: NDca 3,79cb 3,55cb 6,77ac 0,335 0,001

3: NDca NDda NDda 5,95bb 0,062 0,001

SEM: 0,155 0,186 0,240 0,284

P: 0,001 0,001 0,001 0,05

Los valores en la columna que marcan las mismas letras en superindice no difieren significativamente (P>0,05). Los valores en la fila que marcan las mismas letras en superindice no difieren significativamente. ns- diferencias no significativas.


: Tabla 12. Razon Lactobacillus.coliforme.

Dfas: Arandano GOS Arandano/GOS Control SEM P

1: 1,11* 1,41b 1,25abc 0,93a 0,080 0,05

2: 1,26ac 1,83b 1,55abc 0,90a 0,242 0,05

3: 1,21a 1,81b 2,17bc 0,94a 0,125 0,05

SEM: 0,175 0,226 0,172 0,044

P: ns ns 0,05 ns

Discusion

Se mejoro la razon de bacterias totales de Lactobacillus para bacterias coliformes (Tabla 12) mediante la adicion de arandano, aunque esta no alcanzo significancia estadfstica. Se observaron mejoras significativas con GOS, que aparecio con un maximo despues del segundo d^a. Este resultado se afecto por un valor coliforme de ND (<500 ufc/ml) en el d^a 3 de la segunda serie de datos; la aparente eliminacion de bacterias coliformes mediante GOS en este punto no permitio el calculo de la razon lac:coli. Es probable que el valor de GOS en el dfa tres pudiera ser mayor que el que se indica aqm. La adicion de arandano, GOS o una combinacion de estos en los fermentadores dieron como resultado una cafda inmediata en el pH alrededor de 5,0-5,7, todos significativamente menores que el control, y con el mayor efecto inmediato mostrado por la adicion de GOS (Tabla 5). Esto parece inusual, ya que el pH del arandano es una unidad menos que la de GOS (Tabla 4) pero probablemente ocurre porque el GOS se fermenta rapidamente al entrar en el vaso, mientras que el arandano podna usarse mas lentamente. Esta rapida fermentacion puede explicar el aumento de la acidez vista en el vaso tratado con GOS.

Despues de la incubacion, tanto GOS como la combinacion de GOS/arandano mostraron un descenso en el pH a lo largo de tres dfas. Aun cuando el acto de carga de los vasos con medio fresco parecfa 'restablecer' las poblaciones (Tabla 3), la influencia de GOS y el sustrato combinado es acumulativo. Cuanto mas se alimentaban los sustratos, mayor era su efecto. El efecto maximo para GOS y GOS/arandano no se alcanzo en este experimento, aunque el efecto del arandano en solitario no difirio significativamente a lo largo del tiempo, y es probablemente maximo a los dos dfas. Es probable que la poblacion se adapte al sustrato, algo que es probable que ocurra en los intestinos del ser humano o animal. Para un estudio en seres humanos, podna ser ventajoso para el sujeto consumir las comidas preparadas durante una semana para permitir a sus poblaciones intestinales adaptarse antes de medir los efectos.

El total de bacterias aerobicas (Tabla 6) y el total de bacterias anaerobicas (Tabla 7) mostraron una pequena diferencia en los vasos a lo largo del tiempo, pero todos los tratamientos mostraron reducciones significativas en estas poblaciones totales en comparacion con el control. Es probable que el total recupere los niveles sin tratamiento, proporcionando el tiempo suficiente, pero senan dominados por diferentes especies que en la poblacion original. En los vasos tratados con arandano, el total de anaerobios se recupero a lo largo de tres dfas hasta el punto de que esta poblacion no difiere significativamente del control (Tabla 7) y todas las poblaciones de bacterias aerobicas alcanzaron una equivalencia estadfstica en el dfa 3 (Tabla 6). Es por lo tanto probable que estos tratamientos modifiquen y no que reduzcan el total de la poblacion del colon.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se incremento significativamente el total de Lactobacillus tanto con arandano como por GOS despues de un d^a de fermentacion (Tabla 8), pero no mostraron un incremento progresivo a lo largo del tiempo. Los efectos de estos aditivos fueron inmediatos. El tratamiento con arandano/GOS aumento tambien el total de Lactobacillus, alcanzando significancia despues de tres dfas. Los Lactobacillus aerotolerantes, un subgrupo del total de Lactobacillus, mostro incrementos significativos en poblaciones donde solo se incluyo GOS (Tabla 9). Es probable que las especies que utilizan primero GOS sea este subgrupo, mientras que aquellas especies estimuladas por la adicion de arandano sean del subgrupo de los Lactobacillus anaerobicos. GOS y arandano parecen mejorar el crecimiento de diferentes especies de Lactobacillus.

El arandano redujo la concentracion de bacterias coliformes pero no alcanzo significancia (Tabla 10). Cuando se incluyo GOS, las bacterias coliformes se redujeron significativamente, y la reduccion fue progresiva a lo largo de los tres dfas de muestreo. Esta reduccion progresiva era significativa estadfsticamente en el tratamiento de arandano/GOS, sugiriendo que la combinacion era mas eficaz que el tratamiento en solitario.

Se dosifico Salmonella poona en cada vaso al inicio de cada serie cada tres dfas, a una concentracion de 107ufc/ml (Tabla 11). En el control, este patogeno sobrevivio cerca de 106 por ml despues de tres dfas, pero era indetectable (<500 /ml) en los vasos dosificados con cualquiera de los tres sustratos de ensayo despues de este tiempo. El arandano probo mas eficacia para eliminar la Salmonella, con niveles que cafan por debajo de la detectabilidad despues de dos dfas. Es posible que haya una accion de union implicada: la capacidad del arandano para unirse a este patogeno no se ha investigado. Si este fuese el caso, la union del patogeno acelerana su eliminacion del intestino. Todos los sustratos de ensayo proporcionaron una eliminacion eficaz de Salmonella poona en tres dfas.

Con la combinacion de arandano/GOS, la razon lac:coli mostro un incremento progresivo a lo largo de tres dfas, culminando en un valor de 2,17, mayor que el observado con arandano o GOS usados individualmente. Es posible un efecto sinergico, aunque los puntos de datos que faltan en los resultados de GOS podnan afectar esta conclusion.

Parece que, entonces, mientras que tanto el arandano como GOS mejoran los Lactobacillus, mejoran diferentes grupos. Por lo tanto su uso en combinacion tiende a ser mas eficaz que su uso como sustratos individuales. El arandano parece particularmente eficaz en la eliminacion de Salmonella, mientras que GOS es mas eficaz en la supresion de la poblacion coliforme general. Juntos, presentan una razon de Lactobacillus.coliformes significativamente mayor que la que pudieran presentar en solitario. Ambos dieron como resultado la acidificacion de la fermentacion intestinal que desfavorecera al grupo coliforme mientras que mejorara la actividad de los Lactobacillus.

Los resultaron que se presentan aqrn sugieren que el uso del arandano y de GOS en combinacion es probable que se sea mas eficaz para mejorar la salud intestinal que el uso de cualquiera de los aditivos en solitario.

EXPERIMENTO 2. Tratamiento curativo de Clostridium difficile y Salmonella poona con GOS y Pure de Arandano

Metodos y Materiales

Se incorporo Galacto-oligosacarido (GOS) una vez al dfa en los vasos de fermentacion a una concentracion del 1% (del producto). Se preparo una disolucion de GOS al 50% (p/v) en agua esteril destilada para un facil manejo. El pH de esta disolucion de GOS era 3,94.

Se molieron parcialmente pieles de arandano (aproximadamente un 12% DM) antes de su uso, utilizando un molinillo manual. Se anadio diariamente al vaso el 1% (peso humedo) del tratamiento de arandano.

Una mezcla de GOS/arandano compuesta de una mezcla 70:30 de arandano y GOS, proporcionando una adicion diaria del 0,7% de las pieles de arandano y el 0,3% de GOS.

Patogenos.

La simulacion se sembro con Clostridium difficile fresco y con cultivos de Salmonella poona durante su fase de estabilizacion inicial, para permitir a estos patogenos la mejor oportunidad de estabilizacion en la poblacion. Ademas, las dosis de patogenos se anadieron en el primer dfa (dfa 0) de cada serie, mientras que los tratamientos no se aplicaron hasta el segundo dfa (dfa 1). El experimento se diseno para hacer lo mas diffcil posible que los tratamientos afectaran a la estabilizacion de los patogenos.

Simulacion In Vitro.

El protocolo de operacion para el proyecto actual se muestra en la Tabla 1 e incluye el uso de cuatro vasos de fermentacion. El promedio de pH del medio de crecimiento era 6,54 a lo largo del curso de trabajo.

Tabla 1: Protocolo de operacion del fermentador.

N° de vaso

Dfas: 1 2 3 4

1-3 (sin muestra): Control Arandano GOS GOS/arandano

4-7 (serie de muestras 1): Control Arandano GOS GOS/arandano

8-10 (sin muestra): Arandano GOS GOS/arandano Control

11-14 (serie de muestras 2): Arandano GOS GOS/arandano Control

15-17 (sin muestra): GOS GOS/arandano Control Arandano

18-21 (serie de muestras 3): GOS GOS/arandano Control Arandano

Analisis bacteriologico.

Se tomaron muestras (5 ml) diariamente durante tres dfas de las series de muestras. Las muestras se retiraron inmediatamente antes de introducir el medio fresco para que no se maximizara ninguna diferencia en la 5 fermentacion. Despues de la retirada y de la dosificacion con medio fresco, se realizo la inoculacion diaria del sustrato de ensayo. Al inicio de cada serie de datos, se retiro una muestra para evaluar las concentraciones iniciales de Salmonella poona y de Clostridium difficile y el pH de los vasos inmediatamente despues de la adicion del medio fresco.

Despues de la medicion del pH, se anadio 1 ml de cada muestra a 9 ml del diluyente de maxima recuperacion (MRD: 10 Oxoid) y se diluyeron en serie hasta 10-6 Estas diluciones se recubrieron despues e incubaron como se muestra en la Tabla 2.

Grupo bacteriano Medio Incubacion

Total de bacterias aerobicas: Columbia agar sangre. 24 h aerobico

Total de bacterias anaerobicas: Columbia agar sangre. 48 h anaerobico

Coliformes: Agar MacConkey N° 3. 24 h aerobico

Total de Lactobacillus: Agar MRS 48 h anaerobico

Lactobacillus aerotolerante: Agar MRS 24 h aerobico

Salmonella: Agar XLD 24 h aerobico

Clostridium difficile: Medio selectivo para C.difficile 48 h anaerobico

Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 37°C. Las condiciones anaerobicas se obtuvieron utilizando un frasco anaerobico y sobres de Oxoid Anaerogeno. La anaerobiosis se confirmo mediante tiras indicadoras Oxoid.

15 Cuando la identidad de C. difficile no pudo determinarse definitivamente a ojo despues de la incubacion, las colonias se evaluaron usando anticuerpos en base a un ensayo de confirmacion (Oxoid).

Resultados

El pH de todos los vasos tratados descendio a lo largo del curso del experimento hasta una mayor extension que la observada en el vaso control (Tabla 3). Los tratamientos con GOS y GOS/arandano mostraron un pH 20 significativamente reducido en comparacion con el control el dfa 2 (despues de un dfa de tratamiento) y el dfa 3, en los tres tratamientos se redujo significativamente el pH en comparacion con el control.

Tabla 3. pH de los contenidos del fermentador en cada tiempo de la muestra.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 6,63a 6,56a 6,68a 6,69a 0,107 ns

1: 6,33a 6,32a 6,36b 6,51ab 0,134 ns

2: 4,73ba 5,54bbc 5,23cb 6,14bc 0,258 0,05

3: 4,50ba 5,17bb 4,79dab 6,03bc 0,158 0,01

5

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

SEM: 0,169 0,189 0,099 0,216

P<: 0,001 0,01 0,01 0,05

No hubo diferencias significativas en los recuentos de bacterias aerobicas totales (Tabla 4) o en el total de bacterias aerobicas (Tabla 5) como resultado de cualquier tratamiento a lo largo del curso del experimento.

Tabla 4. Total de bacterias aerobicas.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 8,39 8,37 8,48 8,63 0,317 ns

1: 8,57 8,74 8,56 8,76 0,186 ns

2: 8,56 8,68 8,68 8,82 0,217 ns

3: 8,56 8,52 8,71 8,72 0,363 ns

SEM: 0,252 0,337 0,288 0,234

P<: ns ns ns ns

Tabla 5. Total de bacterias anaerobicas.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 8,45 8,04 8,15 8,63 0,603 ns

1: 8,38 8,40 8,35 8,46 0,388 ns

2: 8,45 8,56 8,42 8,68 0,208 ns

3: 8,49 8,20 8,45 8,56 0,345 ns

SEM: 0,278 0,501 0,495 0,322

P<: ns ns ns ns

El total de Lactobacillus (Tabla 6) se presento en mayores cantidades al inicio del experimento, que era probablemente debido a un mayor inoculo en el comienzo de la muestra. Sus cantidades disminuyeron en el vaso control a lo largo del tiempo, pero no hubo una reduccion significativa a lo largo del tiempo en ningun vaso. GOS mostro un recuento significativamente mayor del total de Lactobacillus el dfa 2; los otros dos tratamientos fueron mayores que el valor control, aunque los datos no alcanzaron significancia estadfstica.

Tabla 6. Total de Lactobacillus.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 8,21 8,12 8,65 8,48 0,552 ns

1: 8,32 8,43 8,36 8,37 0,320 ns

2: 8,44a 8,25ab 8,02b 8,02b 0,162 0,05

3: 8,47a 8,02ab 8,35ab 7,71b 0,340 0,05

5

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

SEM: 0,247 0,410 0,362 0,435

P<: ns ns ns ns

Aunque los Lactobacillus aerotolerantes (Tabla 7) muestran un modelo similar al del total de Lactobacillus (Tabla 6), hubo algunas diferencias significativas estadfsticamente, debido a la amplia variacion en esta poblacion entre series. Los mayores recuentos iniciales de esta poblacion tambien sirven para enmascarar cualquier incremento potencial debido a GOS o al arandano.

Tabla 7. Lactobacillus aerotolerantes.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 7,44 7,65 7,58 7,31 1,042 ns

1: 8,02 7,59 7,69 7,77 0,810 ns

2: 8,22a 7,85b 8,20ab 8,07ab 0,169 0,05

3: 8,30 8,09 8,37 7,87 0,380 ns

SEM: 0,684 0,581 0,721 0,771

P<: ns ns ns ns

Los valores en la columna que marcan las mismas letras en supenndice no difieren significativamente (P>0,05). Los valores en la fila que marcan las mismas letras en supenndice no difieren significativamente. ns- diferencias no significativas.

Se observaron disminuciones significativas en las bacterias coliformes (Tabla 8) en todos los tratamientos pero no en el control. El dfa 3, los tratamientos con GOS y arandano dieron como resultado una reduccion significativa de las cantidades de coliformes en comparacion con el control, mientras que la combinacion de GOS/arandano no la tuvo.


: Tabla 8. Bacterias coliformes.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 8,14a 8,24a 8,39a 8,12 0,232 ns

1: 8,11a 8,24a 8,00ab 8,10 0,235 ns

2: 8,06a 8,19a 7,78b 8,09 0,224 ns

3: 7,20ba 7,18ba 7,95abb 7,85b 0,282 0,05

SEM: 0,203 0,303 0,271 0,177

P<: 0,01 0,01 0,05 ns

10 Salmonella poona (Tabla 9) descendio en todos los vasos a lo largo del tiempo. Aunque el descenso fue mayor en los vasos tratados que en el control, las diferencias no alcanzaron significancia estadfstica debido a la mayor variabilidad entre series.

Tabla 9. Salmonella poona.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 7,86a 8,04a 8,14a 8,19a 0,339 ns

1: 7,05a 7,49a 7,21ab 7,24ab 0,891 ns

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

2: 5,03b 5,38b 5,53ab 6,83ab 0,860 ns

3: 4,63b 5,07b 4,90b 5,81b 1,042 ns

SEM: 0,917 0,883 0,789 0 -vl o cn

P<: 0,05 0,05 0,05 0, ,05

Clostridum difficile (Tabla 10) demostro una reduccion significativa en las cantidades de todos los vasos tratados, pero no en el control. Los tres tratamientos mostraron una reduccion significativa de este patogeno comparado con el control en el dfa 2, aunque el tratamiento con arandano no fue significativamente diferente del control en el dfa 3.

Tabla 10. Clostridium difficile.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 5,81a 5,70a 5,44a 5,58 0,356 ns

1: 5,65a 5,00ab 5,05ab 6,10 1,058 ns

2: 3,70ba 4,37aba 3,70aba 5,76b 0,504 0,05

3: 2,70ba 3,76bab 3,37ba 4,96b 0,674 0,05

SEM: 0,489 0,789 0,849 0,613

P<: 0,01 0,05 0,05 ns

5 La razon de Lactobacillus.coliformes alcanzo significancia estadfstica el dfa 3, mejor con los tres tratamientos que el control. GOS genero la mayor razon, seguido del arandano.

Tabla 11. Razon Lactobacillus:coliformes.

Dfas: GOS Arandano GOS/Arandano Control SEM P<

0: 1,01a 0,98a 1,03 1,05 0,052 ns

1: 1,03a 1,02a 1,04 1,03 0,030 ns

2: 1,05a 1,01a 1,04 0,99 0,040 ns

3: 1,18ba 1,12bb 1,05c 0,98d 0,026 0,05

SEM: 0,033 0,032 0,043 0,043

P<: 0,05 0,05 ns ns

Discusion

Esta claro que este experimento debena continuarse durante otro dfa en cada una de las series por triplicado. En un 10 trabajo futuro, el periodo de ensayo comenzara con la adicion de tratamientos, el dfa 1 que se llevo a cabo este experimento. Los datos del dfa 0 y del dfa 1 no muestran diferencias materiales, ya que las muestras del dfa 1 se extrajeron despues de exponer los vasos al tratamiento durante solo una hora.

No obstante, incluso con solo dos dfas eficaces del tratamiento, GOS, arandano y la mezcla combinada produjeron datos que mostraron diferencias significativas. Los tres tratamientos redujeron las cantidades de C. difficile, los tres 15 mejoraron la razon de Lactobacillus:coliformes, y todos redujeron el pH total de los contenidos del vaso.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Salmonella poona se redujo tambien, aunque no a niveles significativos. El trabajo previo mostro un efecto profilactico en el que los vasos pretratados con estos sustratos no soportaron el crecimiento de S. poona. La eliminacion de una infeccion existente llevara mas tiempo de los dos d^as que se aplico aqm, pero la tendencia es clara.

Los mayores recuentos iniciales de ambos grupos de Lactobacillus fueron consecuencia de las muestras fecales usadas: las muestras naturales variaran, por supuesto, entre cerdos asf como lo haran entre los seres humanos. Sin embargo, aun cuando las cantidades de Lactobacillus mostraron una pequena variacion, fue un cambio suficiente para permitir diferencias significativas en la razon de Lactobacillus:coliformes, y el rapido descenso en el pH sugiere que la actividad de estas poblaciones incremento incluso aunque sus cantidades estuvieran ya, o se aproximaran, a su maximo.

El experimento ha mostrado que una infeccion existente de C. difficile puede ser rapidamente y significativamente reducida mediante la aplicacion de estos tratamientos, particularmente cuando se incluye GOS, e indica que es probable que aparezca un efecto similar con una infeccion existente de Salmonella.

Evidencia Anecdotica que incluye el tratamiento

Un paciente, varon de aproximadamente 50 anos de edad, padeda de smtomas graves de infeccion por C. difficile, a pesar de haber estado en tratamiento con un antibiotico de reducido espectro, durante un periodo de aproximadamente tres meses. Entonces se modifico el protocolo de tratamiento para incluir, adicionalmente, la administracion oral de pure de arandano y GOS al menos una vez al dfa. El resultado, cinco dfas despues de la modificacion del tratamiento, fue que no era posible detectar la infeccion por C. difficile.

En otro paciente femenino, que presenta por segunda vez smtomas de C. difficile se trato inicialmente con metronidazol y despues, posteriormente, con vancomicina. Ningun tratamiento estaba teniendo efecto. En el momento de administracion de una mezcla de galacto-oligosacarido y pure de arandano, la paciente registraba 16 episodios de deposiciones en un periodo de 24 horas, padeda de deshidratacion grave y estaba causando una significante preocupacion que podna dar como resultado una muerte inminente. En 48 horas de la administracion oral tres veces al dfa de galacto-oligosacarido y pure de arandano, la paciente se estaba recuperando, con un numero de episodios de deposiciones que se habfa reducido a tres en un periodo de 24 horas.

Entre las cepas de Lactobacillus, algunas se afectan mas beneficiosamente por oligosacaridos tales como galacto- oligosacarido que otras. Por lo tanto, dada la cantidad de cepas diferentes de Lactobacillus, no hay razon para suponer que cualquier individuo dado, tenga necesariamente algunas de las poblaciones de estas cepas que se afectan mas beneficiosamente. Otro aspecto independiente de la presente divulgacion, fuera del alcance de la invencion tal como se reivindica, proporciona un metodo para generar una mezcla de probiotico y prebiotico que comprende las etapas de tratar una variedad de cepas Lactobacillus con un oligosacarido prebiotico, identificar una o mas cepas de Lactobacillus que se afectan beneficiosamente e incorporar una poblacion de una o mas de las cepas de Lactobacillus que se afectan mas beneficiosamente en un prebiotico. La mezcla resultante se puede administrar entonces a personas con el objetivo de mejorar su salud intestinal, garantizando asf que posean una poblacion de las bacterias que se afectan mas beneficiosamente, por ejemplo, por un prebiotico galacto- oligosacarido.

Durante los ensayos para examinar el efecto del galacto-oligosacarido, en una poblacion de Salmonella (realizado utilizando el aparato de simulacion de la fermentacion in vitro anteriormente ilustrada) se encontro que el efecto beneficioso de los Lactobacillus en la reduccion de la poblacion de Salmonella aumento con mayores periodos de tiempo sobre los que se trato el vaso con galacto-oligosacarido. Por tanto, despues de un periodo de tres semanas, la accion de Lactobacillus en la reduccion de la poblacion de Salmonella aumento significativamente. Ensayos posteriores revelaron que una mejora en la eficacia de la accion de la poblacion de Lactobacillus en la reduccion de los niveles de Salmonella continuo produciendose durante un periodo en el que la poblacion de Lactobacillus permanecio estable-eliminando asf la posibilidad de que este efecto resulte de un simple aumento en la cantidad de Lactobacillus presente a lo largo de este periodo de tiempo.

Esto ha llevado a la conclusion de que esta accion mejorada se debe a una mejora de la eficacia en cepas espedficas de la poblacion de Lactobacillus debido a su tratamiento con el prebiotico, afectando asf preferente y beneficiosamente a aquellas cepas que, a su vez, tienen una accion mejorada contra la Salmonella. De tales cepas de Lactobacillus, tres que se afectan preferentemente que, ademas, son tambien eficaces contra Salmonella son:

L. salivarius

L. brevis

L. buchneri

Por lo tanto, otro aspecto de la presente divulgacion proporciona el aislamiento de estas cepas de Lactobacillus que son por tanto eficaces probando su eficacia contra, por ejemplo, Salmonella y Clostridium difficile, y su recombinacion con galacto-oligosacarido como prebiotico, proporcionando asf un suplemento alimenticio eficaz que

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tiene el efecto beneficioso de reducir la poblacion de Salmonella y Clostridium difficile. Preferiblemente, esta mezcla se mezcla adicionalmente con una pulpa hemi-celular. Ejemplos de tal pulpa incluyen arandanos u otras frutas tales como: arandanos, fresas, frambuesas, moras, grosellas, grosellas negras, zarzamoras, manzanas, naranjas, fruta de kiwi, melocotones, nectarinas, ciruelas, albaricoques, uvas y similares, asf como tomates, por ejemplo. Alternativamente, o en adicion, se puede usar pulpa vegetal, bien obtenida como un residuo al hacer jugo o una operacion de presion, tal como puede ser el caso con, por ejemplo, zanahorias, o bien generado por maceracion o licuacion. Ejemplos de vegetales que pueden servir para crear una pulpa practica incluyen, pero no se limitan a, patatas (por ejemplo, las pieles de una patata horneada), zanahorias, remolachas, apio, puerros, pimientos, brasicas tales como brocoli, brotes, coliflor y col.

Por tanto, otro aspecto de la presente divulgacion proporciona un metodo en el que cepas de las bacterias probioticas que se afectan mas beneficiosamente, tales como las tres que se indicaron anteriormente, se pueden seleccionar por referencia a su crecimiento, y despues de seleccionarse con referencia a su efecto sobre bacterias intestinales perjudiciales se recombinan con prebiotico.

Otro aspecto mas de la presente divulgacion se refiere a los efectos de la infeccion por C. difficile. Clostridium difficile produce una variedad de toxinas. Una de estas, conocida como 'toxina A', es una enterotoxina y actua directamente en la mucosa del intestino causando inflamacion, haciendo que las celulas secreten fluido. La toxina B es una citotoxina y mata celulas. Aunque la toxina B es menos importante, sus efectos en presencia de la toxina A puede ser nociva debido a la susceptibilidad a sus efectos de las celulas mucosas inflamadas. La toxina A, sin embargo, es la mas peligrosa de las dos ya que sus efectos son mas idoneos para causar los smtomas que pueden, finalmente, dar como resultado una septicemia y la muerte.

En los ensayos de cultivos de C. difficile se encontro que, a lo largo de un periodo de 24 horas, la presencia de pulpa de arandano a una concentracion del 20% en su diluyente tema el efecto de reducir los niveles de toxina A detectables en un factor de al menos mas de 100 veces que las del control (por ejemplo, un cultivo identico sin arandano), proporcionando una clara evidencia de los efectos beneficiosos del arandano para reducir la toxina A producida por C. difficile. Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona, por lo tanto, el uso del arandano para producir una preparacion que se emplea en la reduccion de los niveles de toxina A producida por C. difficile. Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona un tratamiento para reducir los niveles de toxina A producidos por C. difficile que comprende la etapa de administrar oralmente el arandano en cuestion a un paciente.

La preparacion combinada de un material comestible que contiene hemicelulosa u otros componentes celulares insolubles proporciona una preparacion que tiene utilidad para tratar smtomas causados por un amplio rango de bacterias patogenas, ya que Salmonella y Clostridium son grupos taxonomicos ampliamente diferenciados. Cabe destacar que la mezcla de arandano/GOS mejoro la razon de Lactobacillus.coliformes en un mayor grado que el sustrato en solitario, que parecena indicar que, para el uso profilactico general, esta mezcla es mejor que los componentes individuales. El efecto reductor del arandano en la toxina, unido con los muchos efectos significativos de la reduccion de la poblacion de C. difficile en los vasos in vitro mediante la administracion de galacto- oligosacarido produce una preparacion combinada adaptada para enfrentarse a los smtomas de la infeccion por C. difficile mediante la reduccion de los niveles de toxina, y tambien la presencia de la bacteria C. difficile estimulan los niveles de Lactobacillus en el intestino. Ademas, hay una clara evidencia del beneficio del tratamiento profilactico de Salmonella a partir del uso del arandano en solitario. Sin embargo, el uso en solitario del arandano no forma parte de la invencion como se reivindica.

En una realizacion el arandano y el galacto-oligosacarido se pueden proporcionar ventajosamente a traves de un sustrato en forma de una bebida a base de leche tal como un batido. Alternativamente se puede proporcionar en un sustrato que comprende yogurt o una bebida de yogurt. Todas las forma del sustrato pueden incluir adicionalmente una o mas de las cepas de Lactobacillus especificados anteriormente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. El uso de un galactooligosacarido y pulpa de un material hemi-celular de arandano en la creacion de una preparacion para uso en el tratamiento de infeccion por uno de Clostridium difficile y Salmonella.
2. El uso segun la reivindicacion 1, en donde el tratamiento es para Salmonella y el uso incluye ademas el uso de 5 al menos una de las siguientes cepas de bacteria en la creacion de la preparacion: Lactobacillus brevis,

Lactobacillus salivarius, Lactobacillus buchneri.
3. El uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el tratamiento incluye el tratamiento de la enterotoxina producida por Clostridium difficile.
4. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tratamiento es un tratamiento 10 profilactico.
5. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el tratamiento es un tratamiento curativo.
6. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la preparacion tiene la forma de uno de: fruta desecada envasada o una barrita de fruta contenida en un envase hermetico, o una bebida.