ES2600616T3

ES2600616T3 - Antagonistas del receptor de la interleucina-1

Info

Publication number: ES2600616T3
Application number: ES12710122.8T
Authority: ES
Inventors: Vladimir Berezin; Elisabeth Bock
Original assignee: Phlogo ApS
Current assignee: Serodus ApS
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2017-02-10
Anticipated expiration: 2032-03-14
Also published as: JP2014510082A; RU2013145283A; CN103476933B; AU2012228769B2; US9359405B2; ZA201306744B; EP2686431A1; JP6120782B2; NZ615710A; CA2828504A1; AU2012228769A1; WO2012122985A1; MX2013010171A; EP2686431B1; BR112013023309A2; CN103476933A; US20140073556A1; KR20140012127A

Abstract

Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (SGRKSSKMQA); o una variante de SEQ ID NO: 1 que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicha variante una sustitución de aminoácido conservativa, siendo dicho péptido capaz de unirse al receptor de IL-1 de tipo 1 (IL1Rl), y capaz de interferir en la unión de IL-1 beta a IL1RI.

Description

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Tanto los fragmentos y como las variantes de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la divulgación pretenden ser los equivalentes funcionales de dichas secuencias, es decir, conservan su capacidad para unirse a IL1R1.

5 Además, los péptidos cortos de la presente divulgación derivados de IL1RA comprenden o consisten en RIWDVNQKT (SEQ ID NO: 29), TAMEADQPVS (SEQ ID NO: 35) o GPNAKLEEKA (SEQ ID NO: 36) o variantes, fragmentos, o fragmentos variantes de las mismas; como se indica por SEQ ID NO: 1 en el presente documento.

En una realización preferida, los péptidos son específicos, en tanto en cuanto la secuencia del péptido no tiene o reduce esencialmente el efecto cuando la secuencia de aminoácidos es mezcla o se invierte. Además, los péptidos son preferentemente específicos del antagonismo del efecto de la IL-1, y no de otras proteínas ni interleucinas.

Un fragmento funcional o una variante de, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 es un fragmento o una variante (o una variante de un fragmento) que conserva su capacidad para unirse a IL-1R1 e interferir con la unión de IL-1beta a

15 dicho receptor, y/o mantiene la capacidad de afectar a los efectos aguas abajo a un nivel comparable con SEQ ID NO: 1 con respecto a la inhibición de la IL-1 inducida por la activación de NF-κB, la reducción de la liberación de TNF-alfa inducida por la IL-1 a partir de macrófagos, la inducción de la excrecencia de las neuritas y/o la potenciación de la supervivencia de las células neuronales. Lo mismo se aplica a SEQ ID NO: 29, 35 y 36.

En el presente contexto, se aplica el código convencional de una letra para los restos de aminoácidos, así como el código convencional de tres letras. Las abreviaturas para los aminoácidos están en conformidad con las recomendaciones de la Comisión Conjunta de la IUPAC-IUB sobre la Nomenclatura Bioquímica, Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pág. 9-37. A lo largo de la solicitud, se usa bien el código de tres letras o el código de una letra para los aminoácidos naturales. Cuando no se especifica la forma L o D (isómeros ópticos), se ha de entender que el

25 aminoácido en cuestión tiene la forma L natural, cf. Pure & Appl. Chem. Vol. (56(5) pág. 595-624 (1984) o la forma D, de modo que los péptidos formados pueden consistir en los aminoácidos de la forma L, la forma D o una secuencia de formas L y formas D mixta.

Cuando no se especifica nada, se ha de entender que el aminoácido C-terminal de un péptido existe como ácido carboxílico libre, pudiéndose también especificar como "-OH". Sin embargo, el aminoácido C-terminal de un péptido, en otra realización, puede ser el derivado amidado, que se indica como “NH2”. Cuando no se establece nada más, el aminoácido N-terminal del péptido comprende un grupo amino libre, pudiéndose también especificar como “H-“. Sin embargo, el aminoácido N-terminal de un péptido puede, en otra realización, ser el derivado acetilado, que se indica como "-acetilo" o "COCH3".

35 En una realización, un péptido comprende al menos 5 de los veintidós aminoácidos incorporados de manera natural en los polipéptidos, denominados aminoácidos proteinogénicos o naturales. Entre ellos, 20 están codificados por el código genético universal. Los 2 restantes; la selenocisteína y la pirrolisina, se incorporan en las proteínas mediante mecanismos sintéticos exclusivos. Un péptido también puede comprender uno o más aminoácidos no proteinogénicos o no convencionales, no naturales.

En una realización preferida, el péptido consiste en o comprende SGRKSSKMQA (SEQ ID NO: 1), o un fragmento o una variante, o un fragmento variante de la misma.

45 En otra realización de la presente divulgación, el péptido consiste en o comprende las SEQ ID NO: 29, 35 o 36, o un fragmento o una variante, o un fragmento variante de las mismas.

En una realización, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos contigua de, cómo máximo, 14 aminoácidos, tal como, como máximo, 13 aminoácidos, por ejemplo, como máximo, 12 aminoácidos, por ejemplo, como máximo, 11 aminoácidos, tal como, como máximo, 10 aminoácidos, derivada de IL1RA que comprende SEQ ID NO: 1, o un fragmento o una variante, o un fragmento variante de la misma.

En una realización, el péptido consiste en 10 restos de aminoácidos contiguos de IL1RA que consisten en SEQ ID NO: 1. En otra realización, el péptido tiene una longitud total inferior o igual a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13 o 14 restos

55 de aminoácidos contiguos, derivada de IL1RA y comprende la SEQ ID NO: 1 o una variante o un fragmento, o un fragmento variante de la misma.

Un péptido puede consistir en 5-10 aminoácidos contiguos, tales como 6-10 aminoácidos contiguos, por ejemplo, 810 aminoácidos contiguos. En una realización, el péptido consiste en 5-6, tal como 6-7, por ejemplo, 7-8, tal como 89, por ejemplo, 9-10, tal como 10-11, por ejemplo, 11-12, tal como 12-13, por ejemplo, 13-14 aminoácidos contiguos que comprenden cualquiera de SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36, o una variante, un fragmento o un fragmento variante de las mismas.

En una realización, el péptido consiste en 5-6, tal como 6-7, por ejemplo, 7-8, tal como 8-9, por ejemplo, 9-10, tal

65 como 10-11, por ejemplo, 11-12, tal como 12-13, por ejemplo, 13-14, tal como 14-15, por ejemplo, 15-16, tal como 16-17, por ejemplo, 17-18, tal como 18-19, por ejemplo, 19-20 aminoácidos contiguos que comprenden cualquiera

de SEQ ID NO: 29, 35 o 36, o una variante, un fragmento o un fragmento variante de las mismas.

En otra realización, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos contigua que tiene una longitud total inferior o igual a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 restos de aminoácidos contiguos, derivada de 5 IL1RA que comprende las SEQ ID NO: 29, 35 o 36, o un fragmento o una variante, o un fragmento variante de las mismas.

En otra realización más, el péptido comprende o consiste en un fragmento de las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36 que comprende al menos 5 aminoácidos contiguos de dicha/s secuencia/s de péptido; tal como 5 aminoácidos contiguos, por ejemplo, 6 aminoácidos contiguos, tal como 7 aminoácidos contiguos, por ejemplo, 8 aminoácidos contiguos, tal como 9 aminoácidos contiguos de dicha/s secuencia/s de péptido.

En una realización, un fragmento de un péptido es un péptido que comprende al menos 5 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36; tal como 5 aminoácidos contiguos, por ejemplo, 6 aminoácidos contiguos, tal como 7

15 aminoácidos contiguos, por ejemplo, 8 aminoácidos contiguos, tal como 9 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36. Un fragmento de las SEQ ID NO: 1, 35 o 36 puede comprender, por tanto, entre 5 y 9 aminoácidos de dichas secuencias, y un fragmento de SEQ ID NO: 29 puede comprender, por tanto, entre 5 y 8 aminoácidos de dicha secuencia.

Una variante de un péptido, o una variante de un fragmento de dichos péptidos, puede ser una secuencia de aminoácidos que tenga al menos el 40 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36, o un fragmento de la misma, tal como al menos un 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36, o un fragmento de las mismas, o un aminoácido que tenga del 40 al 50 % de identidad, por ejemplo, del 50 al 60 % de identidad, tal como del 60 al 70 % de identidad, por ejemplo, del 70 al 80 %

25 de identidad, tal como del 80 al 90 %, por ejemplo, del 95 al 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36, o un fragmento de las mismas, definiéndose la identidad como un porcentaje de aminoácidos idénticos de dicha secuencia variante cuando se coteja con las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36, o una fragmento de las mismas.

La identidad entre secuencias de aminoácidos se puede calcular usando algoritmos bien conocidos tales como BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 o BLOSUM 90, o simplemente comparando los aminoácidos específicos presentes en las posiciones correspondientes de dos secuencias peptídicas que se van a comparar.

El término “homología” se puede usar como sinónimo de identidad/identidad de secuencia.

35 Una variante de un péptido también puede ser una secuencia de aminoácidos que tenga aproximadamente el 10 % de coincidencias positivas de aminoácidos con las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36, o un fragmento de las mismas, tal como aproximadamente el 30 % de coincidencias positivas de aminoácidos, tal como aproximadamente el 40 % de coincidencias positivas de aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente el 50 % de coincidencias positivas de aminoácidos, tal como aproximadamente el 60 % de coincidencias positivas de aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente el 70 % de coincidencias positivas de aminoácidos, tal como aproximadamente el 80 % de coincidencias positivas de aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente el 90 % de coincidencias positivas de aminoácidos, definiéndose una coincidencia de aminoácidos positiva como la presencia en la misma posición de dos secuencias comparadas de restos de aminoácidos que tienen propiedades físicas y/o químicas similares. Las

45 coincidencias positivas particulares de aminoácidos son K con R, E con D, L con M, Q con E, I con V, I con L, A con S, Y con W, K con Q, S con T, N con S y Q con R.

Las variantes incluyen secuencias en las que un aminoácido alquilo está sustituido con un aminoácido alquilo, en las que un aminoácido aromático está sustituido con un aminoácido aromático, en las que un aminoácido que contiene azufre está sustituido con un aminoácido que contiene azufre, en las que un aminoácido que contiene hidroxi está sustituido con un aminoácido que contiene hidroxi, en las que un aminoácido ácido está sustituido con un aminoácido ácido, en las que un aminoácido básico está sustituido con un aminoácido básico, o en las que un aminoácido mono-carboxílico dibásico está sustituido con un aminoácido mono-carboxílico dibásico.

55 En otra realización, una variante de las secuencias de péptidos, o una variante de un fragmento de la secuencia peptídica, puede comprender al menos una sustitución, tal como una pluralidad de sustituciones introducidas independientemente entre sí. En una realización, la variante de péptido comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36 o un fragmento de las mismas.

Las variantes de las SEQ ID NO: 1, 29, 35 o 36, o de fragmentos de las mismas, pueden comprender una o más sustituciones conservativas independientes entre sí, es decir, la sustitución de aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen propiedades bioquímicas similares y, por lo tanto, no afectan a la función del péptido.

65 Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" también se puede ilustrar mediante una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina,

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Una variante de un péptido también puede significar que la secuencia del péptido puede estar modificada. Una modificación puede ser cualquier modificación conocida por el experto, tal como las que se denominan

5 modificaciones posteriores a la traducción. Estas incluyen acetilación, fosforilación, metilación, glucosilación, glicación, amidación, hidroxilación, desiminación, desamidación, carbamilación y sulfatación de uno o más restos de aminoácidos.

En una realización, el péptido no comprende ni consiste en la secuencia de aminoácidos RPSGRKSSKMQAFRI 10 (SEQ ID NO: 37) ni/o no comprende ni consiste en la secuencia de aminoácidos LVAGY (SEQ ID NO: 38).

En una realización, el péptido es un péptido aislado.

En una realización, el péptido es un péptido de origen no natural; que se deriva de una proteína de origen natural 15 (IL1RA). En una realización, se fabrica sintéticamente.

En una realización particular, los péptidos tienen un peso molecular en el intervalo de 100 Da a 5.000 Da, tal como de 100 Da a 250 Da, por ejemplo, de 250 Da a 500 Da, tal como de 500 Da a 750 Da, por ejemplo, de 750 a

1.000 Da, tal como de 1.000 Da a 1.500 Da, por ejemplo, de 1.500 Da a 2.000 Da, tal como de 2.000 Da a 3.000 Da, 20 por ejemplo, de 3.000 Da a 4.000 Da, tal como de 4.000 Da a 5000 Da.

Es un aspecto proporcionar un péptido para uso como un medicamento.

Preparación sintética

25 Los métodos para la producción sintética de péptidos son bien conocidos en la materia. En “Synthetic Peptides: A User's Guide” (Advances in Molecular Biology), Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002, o en: “Pharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins”, Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor y Francis, 1999, se pueden encontrar descripciones detalladas, así como consejos prácticos para producir péptidos sintéticos.

30 Los péptidos se pueden sintetizar como monómeros, dímeros o tetrámeros (> 80 % de pureza, Schafer-N,

Copenhague, Dinamarca). Los dímeros y los tetrámeros consisten en dos y cuatro cadenas, respectivamente, en una realización, junto con una cadena principal de lisina.

En una realización, las secuencias de péptidos se producen sintéticamente, en particular, mediante el método de 5 síntesis de péptidos asistida por secuencia (SAPS) o síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) de secuencia. Estos son bien conocidos por el experto.

Los péptidos se pueden sintetizar por lotes en un sintetizador de péptidos completamente automatizado usando 9fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o terc-butiloxicarbonilo (Boc) como grupo protector de N-a-amino y grupos de protección comunes adecuados para las funcionalidades de la cadena lateral.

Tras la purificación por HPLC de fase inversa, los péptidos se pueden procesar adicionalmente para obtenerse, por ejemplo, isoformas modificadas C-o N-terminales cíclicas. Los métodos para la ciclación y la modificación terminal son bien conocidos en la técnica.

15 Compuesto

Es un aspecto proporcionar un compuesto que comprenda o que consista en un péptido. En una realización, dicho péptido se formula como un monómero (es decir, que comprende 1 copia del péptido), mientras que, en otra realización, dicho péptido se formula como un multímero.

Es un aspecto proporcionar un compuesto para su uso como un medicamento.

Compuesto multimérico

25 Una secuencia de péptido se puede conectar a otra secuencia de péptido (idéntico o no idéntico) a través de un enlace químico o a través de un grupo enlazador. En algunas realizaciones, un péptido se puede formular como un oligómero o un multímero de monómeros, en el que cada monómero es como una secuencia de péptido según lo definido anteriormente en el presente documento.

Por lo tanto, un compuesto multimérico puede ser un polímero que comprenda dos o más secuencias de péptidos, siendo las secuencias de péptidos idénticas o no idénticas, en las que al menos una de las dos o más secuencias de péptidos es un péptido de acuerdo con la presente divulgación. Preferentemente, las dos secuencias de péptidos son un péptido de acuerdo con la presente divulgación.

35 En una realización, el compuesto multimérico es un dímero que comprende dos péptidos de acuerdo con la presente divulgación, siendo dichos dos péptidos idénticos o no idénticos entre sí.

En otra realización, el compuesto multimérico es un trímero o un tetrámero que comprende tres o cuatro péptidos de acuerdo con la presente divulgación, respectivamente, siendo dichos péptidos idénticos o no idénticos entre sí.

En una realización, el compuesto multimérico es un dendrímero tal como un dendrímero tetramérico. Los dendrímeros son moléculas grandes más o menos esféricas, ramificadas repetidamente, normalmente simétricas alrededor del núcleo y que, a menudo, adoptan una morfología tridimensional esférica. Los dendrímeros pueden

45 comprender 4 péptidos, 8 péptidos, 16 péptidos o 32 péptidos; preferentemente cuatro péptidos (es decir, dendrímero tetramérico).

En algunas realizaciones particulares, el compuesto multimérico puede comprender dos secuencias de aminoácidos idénticas (dímero) o el compuesto puede comprender cuatro copias idénticas de una secuencia de aminoácidos (dendrímero tetramérico).

Los multímeros se pueden fabricar mediante la unión de dos o más monómeros de péptido mediante un enlace peptídico o un grupo enlazador. Pueden estar unidos a una cadena principal de lisina, tal como un resto de lisina (un solo resto de lisina), o acoplados a un vehículo polimérico, por ejemplo, un vehículo de proteína. Dicho grupo

55 enlazador, en una realización, comprende una pluralidad de restos de lisina, tal como una fracción de núcleo que tiene una pluralidad de restos de lisina. Sin embargo, se puede prever cualquier otro enlace de monómeros peptídicos conocido por el experto en la materia.

En una realización, la unión puede producirse en el extremo N-terminal o C-terminal de los monómeros peptídicos.

Métodos

También es un aspecto proporcionar un método de estimulación de la excrecencia de las neuritas y/o de fomento de la supervivencia de las neuronas, comprendiendo dicho método administrar una cantidad eficaz de un péptido, de un

65 compuesto o de una composición de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que la necesita.

También se desvela un método para interferir con la unión de IL1RI a IL-1, comprendiendo dicho método administrar una cantidad eficaz de un péptido, de un compuesto o de una composición de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que la necesita.

5 En una realización preferida, dicho individuo es un ser humano tal como un ser humano que tiene una enfermedad neurodegenerativa.

La divulgación también se refiere a un método de identificación de parejas de unión para los péptidos descritos en el presente documento, comprendiendo dicho método las etapas de extraer el polipéptido y aislar dichas parejas de unión.

Formulación farmacéutica

Si bien es posible que los péptidos o los compuestos de la presente divulgación se administren como producto

15 químico (o péptido) en bruto, a veces se prefiere presentarlos en forma de una formulación farmacéutica. Dicha formulación farmacéutica se puede denominar composición farmacéutica, o composición farmacéuticamente aceptable o segura.

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona además una formulación farmacéutica que comprende un péptido o un compuesto de la presente divulgación, o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable/s. Las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 2005, Lippincott, Williams & Wilkins.

25 Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser bien sólidos o líquidos. Los preparados en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios y gránulos dispersables. Un vehículo sólido puede ser uno o más excipientes que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes humectantes, agentes disgregantes de comprimidos o un material encapsulante.

Los ejemplos de vehículos sólidos son lactosa, terra alba, sacarosa, ciclodextrina, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico o éteres de alquilo inferior de celulosa. Los ejemplos de vehículos líquidos son jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, fosfolípidos, ácidos grasos, aminas de ácidos grasos, polioxietileno, agua, solución salina o una solución de glucosa. De manera similar, el vehículo o diluyente

35 puede incluir cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol, solo o mezclado con una cera.

También se incluyen preparados en forma sólida que están destinados a convertirse, poco antes de su uso, en preparados en forma líquida. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estos preparados pueden contener, además del componente activo, colorantes, aromatizantes, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

Los compuestos se pueden formular para la administración parenteral, y se pueden presentar en forma de dosis unitarias en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en recipientes multidosis,

45 opcionalmente, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, por ejemplo, soluciones en polietilenglicol acuoso.

Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos oleosos o no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y pueden contener agentes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes o de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo, obtenido mediante el aislamiento aséptico del sólido estéril o mediante la liofilización de la solución para la constitución antes de su uso con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena, estéril.

55 Los compuestos también se pueden formular para la administración tópica. Las regiones para la administración tópica incluyen la superficie de la piel y también los tejidos de las membranas mucosas de la vagina, del recto, de la nariz, de la boca y de la garganta. La formulación tópica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable adaptado a la administración tópica. Por lo tanto, la composición puede adoptar la forma de suspensión, solución, pomada, loción, lubricante sexual, crema, espuma, aerosol, pulverizado, supositorio, implante, inhalante, comprimido, cápsula, polvo seco, jarabe, bálsamo o gragea, por ejemplo.

La formulación farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar por vía transdérmica. La administración transdérmica normalmente implica la administración de un compuesto para el paso percutáneo del fármaco a la circulación sistémica del paciente. Las zonas de la piel incluyen regiones anatómicas para la

65 administración transdérmica del fármaco, e incluyen el antebrazo, el abdomen, el pecho, la espalda, las nalgas, el área mastoidea, y similares.

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adicional puede ser fármacos para el tratamiento de una afección inflamatoria, diabetes mellitus, una enfermedad neurodegenerativa etc.

Trastornos inflamatorios

5 Las anomalías asociadas con la inflamación comprenden un grupo grande, no relacionado, de trastornos que subyacen a una variedad de enfermedades humanas. El sistema inmune suele participar en los trastornos inflamatorios, lo que se demuestra tanto en las reacciones alérgicas como en algunas miopatías, generando muchos trastornos del sistema inmune una inflamación anómala. Se cree que las enfermedades no inmunes con orígenes etiológicos en los procesos inflamatorios incluyen el cáncer, la aterosclerosis y la enfermedad cardíaca isquémica. Hay una gran variedad de proteínas implicadas en la inflamación, y cualquiera de ellas está abierta a una mutación genética que anule o desregula de otro modo la función normal y la expresión de esa proteína.

Poco después del inicio de una infección en el organismo, la IL-1 activa un conjunto de procesos de respuesta del

15 sistema inmune. En particular, la IL-1 estimula la proliferación de los fibroblastos; induce la síntesis de proteasas, la posterior proteólisis muscular, la liberación de todos los tipos de aminoácidos en la sangre y estimula la síntesis de proteínas en fase aguda; cambia el contenido de iones metálicos del plasma sanguíneo mediante el aumento del cobre, y la reducción de la concentración de cinc y de hierro en sangre; aumenta los neutrófilos sanguíneos y activa la proliferación de los linfocitos, e induce fiebre.

Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios, especialmente trastornos inflamatorios en los que la IL-1 desempeña un papel destacado.

También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un

25 medicamento para el tratamiento de trastornos inflamatorios, especialmente trastornos inflamatorios en los que la IL1 desempeña un papel destacado.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para el tratamiento de un trastorno inflamatorio, tal como un trastorno inflamatorio en el que la IL-1 desempeña un papel destacado, que comprende la administración de un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

En una realización, una enfermedad inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en acné vulgar, asma, aterosclerosis, enfermedades inmunitarias, enfermedad de Behçet, inflamación crónica, prostatitis crónica, dermatitis, gota, glomerulonefritis, hipersensibilidades (incluyendo el tipo 1 (inmediata o atópica, o anafiláctica) que 35 comprenden asma alérgica, conjuntivitis alérgica, rinitis alérgica (fiebre del heno), anafilaxia, angioedema, urticaria (ronchas), eosinofilia y la respuesta a la penicilina y la cefalosporina; de tipo 2 (dependiente de anticuerpos), que comprenden anemia hemolítica autoinmune, síndrome de Goodpasture, hepatitis, SII (síndrome del intestino irritable), artritis idiopática juvenil (AIJ), pénfigo, anemia perniciosa (si es autoinmune), soriasis, artritis soriásica, trombocitopenia inmune, reacciones de transfusión, tiroiditis de Hashimoto, cistitis intersticial, enfermedad de Graves, miastenia gravis, fiebre reumática, enfermedad hemolítica del recién nacido y rechazo agudo de trasplante; de tipo 3 (complejos inmunes) que comprenden artritis reumatoide, glomerulonefritis compleja inmune, enfermedad del suero, endocarditis bacteriana, subaguda, síntomas de la malaria, lupus eritematoso sistémico (LES), reacción de Arthus, pulmón de granjero y poliarteritis nodosa; de tipo 4 (hipersensibilidad mediada por células o de tipo retardado DTH) que comprenden dermatitis de contacto, dermatitis atópica (eczema), arteritis temporal, sarcoidosis,

45 síntomas de la lepra, síntomas de la tuberculosis, esclerosis sistémica, test de Mantoux, enfermedad celíaca y rechazo crónico de trasplante), enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis colágena, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis de desviación, síndrome de Behçet, colitis infecciosa y colitis indeterminada), miopatías (incluyendo dermatomiositis, polimiositis y miositis por cuerpos de inclusión), enfermedad inflamatoria pélvica, Podagra, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes y vasculitis, pueden ser objeto de uso o tratamiento de acuerdo con la presente divulgación.

En una realización, las enfermedades inmunitarias seleccionadas del grupo que consiste en aclorhidria, hepatitis crónica activa autoinmune, encefalomielitis aguda diseminada (EAD), leucoencefalitis hemorrágica aguda, enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, alergias, alopecia universal, esclerosis lateral amiotrófica, anafilaxia, 55 espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, anemia aplásica, asma, ataxia-telangiectasia, enfermedades inmunitarias, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis autoinmune, enfermedad de Behçet, celiaquía/enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, síndrome de fatiga crónica, enfermedad granulomatosa crónica, inmunodeficiencia variable común, diabetes mellitus de tipo 1, síndrome de DiGeorge, disautonomía, electrosensibilidad, endometriosis, fiebre mediterránea familiar, penfigoide gestacional, síndrome de Goodpasture, enfermedad del injerto contra el huésped, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (SGB), enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurativa, infecciones por VIH, síndrome de hiper-IgM, hipersensibilidad, deficiencia de IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, deficiencia de subclase IgG, enfermedades complejas inmunitarias, enfermedades del sistema inmunitario, síndromes de inmunodeficiencia, cistitis intestinal, enfermedad de Kawasaki, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad de Lyme, trastornos 65 linfoproliferativos, enfermedad mixta del tejido conectivo, morfea, sensibilidad química múltiple, esclerosis múltiple (EM), miastenia gravis, narcolepsia, neuromiotonía, síndrome opsoclonus-mioclonus (SOM), neuritis óptica, tiroiditis

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medicamento para el tratamiento de la AIJ.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la AIJ que comprende la administración de un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

5 La artritis idiopática juvenil (AIJ) es la forma más común de artritis persistente en niños. En el presente contexto, el término “juvenil” se refiere a un inicio previo a los 16 años, “idiopática” se refiere a una afección sin causa definida, y “artritis” es la inflamación de la membrana sinovial de una articulación. La JIA es un subconjunto de la artritis que se observa en la infancia, que puede ser transitoria y autolimitada, o crónica. Se diferencia significativamente de la artritis que se observa comúnmente en los adultos (artrosis, artritis reumatoide), y de otros de tipos de artritis que se pueden presentar en la infancia, que son afecciones crónicas (por ejemplo, la artritis soriásica y la espondilitis anquilosante). La AIJ es una enfermedad inmunitaria.

Diabetes mellitus

15 Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus.

También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la diabetes mellitus que comprende la administración de un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

25 En una realización, dicha diabetes mellitus es la diabetes mellitus de tipo I. En otra realización, dicha diabetes mellitus es la diabetes mellitus de tipo II.

La diabetes mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas en las que una persona tiene un nivel alto de azúcar en sangre, ya sea porque el organismo no produce suficiente insulina o porque las células no responden a la insulina que se produce. Este nivel alto de azúcar en sangre produce los síntomas clásicos de la poliuria (orinar con frecuencia), polidipsia (aumento de la sed) y polifagia (aumento del apetito).

 Diabetes de tipo 1: se produce por la incapacidad del organismo para producir insulina y, en la actualidad, es necesario que la persona se inyecte la insulina. (También se conoce como diabetes mellitus insulino

35 dependiente, DMID, para abreviar, y diabetes juvenil). La diabetes mellitus de tipo 1 se caracteriza por la pérdida de las células beta, productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, lo que conduce a la deficiencia de insulina. Este tipo de diabetes se puede clasificar además como de mediación inmunitaria o idiopática. La mayoría de las diabetes de tipo 1 está mediada inmunitariamente, donde la pérdida de células beta es un ataque autoinmune mediado por los linfocitos T.  Diabetes de tipo 2: se produce por la resistencia a la insulina, una afección en la que las células no pueden usar la insulina adecuadamente, a veces combinada con una deficiencia absoluta de insulina. (Anteriormente denominada diabetes mellitus no insulino-dependiente, DMNID, para abreviar, y diabetes del adulto). La diabetes mellitus de tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina, que se puede combinar con una reducción relativa de la secreción de insulina. Se cree que la capacidad defectuosa de la

45 respuesta de los tejidos corporales a la insulina implica al receptor de la insulina. La diabetes de tipo 2 se debe principalmente a factores del estilo de vida y a la genética.  Diabetes gestacional: se produce cuando las mujeres embarazadas, que nunca han tenido diabetes anteriormente, tienen un nivel alto de glucosa en sangre durante el embarazo. Puede preceder al desarrollo de la DM de tipo 2.

Otras formas de diabetes mellitus incluyen la diabetes congénita, que se debe a defectos genéticos de la secreción de insulina, diabetes relacionada con la fibrosis quística, diabetes esteroidea inducida por altas dosis de glucocorticoides y varias formas de diabetes monogénicas.

55 La diabetes sin tratamientos adecuados puede causar muchas complicaciones. Las complicaciones agudas incluyen hipoglucemia, cetoacidosis diabética o coma hiperosmolar no cetónico. Las complicaciones graves a largo plazo incluyen enfermedades cardiovasculares, insuficiencia renal crónica y daño en la retina. Por lo tanto, el tratamiento adecuado de la diabetes es importante, así como el control de la presión arterial y los factores de estilo de vida tales como dejar de fumar y mantener un peso corporal saludable.

Enfermedad de Behçet

Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Behcet.

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También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Behcet.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de Behçet que comprende 5 administrar un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

La enfermedad de Behçet es una forma rara, sistémica, de vasculitis (o inflamación de los vasos sanguíneos) que a menudo se presenta con ulceración de las mucosas y afectación ocular (implicación de los ojos). La afectación ocular puede ser en forma de uveítis posterior, uveítis anterior o vasculitis retinal. Como enfermedad sistémica, también afecta a los órganos viscerales tales como el tracto gastrointestinal, y a los sistemas pulmonar, musculoesquelético y neurológico. Este síndrome puede ser fatal; se puede producir la muerte por la ruptura de los aneurismas vasculares o complicaciones neurológicas graves, y por lo tanto, requiere el tratamiento médico inmediato.

15 Trastornos neurodegenerativos

Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.

También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, que comprende la administración de un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

25 En particular, dicho trastorno neurodegenerativo tiene un componente neuroinflamatorio y se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y esclerosis múltiple. Especialmente, dicho trastorno neurodegenerativo puede ser aquel en el que la IL-1 tenga un papel destacado.

El cerebro es una zona inmunológicamente privilegiada en condiciones normales. Los factores de supresión de la respuesta inmune incluyen neurotransmisores, neurohormonas, factores neurotróficos, factores antiinflamatorios y los contactos célula-célula a través de moléculas de adhesión o CD200. Sin embargo, ningún factor por sí solo puede explicar completamente el control inmune. El aumento de las respuestas inmunes cerebrales observado en 35 las enfermedades neurodegenerativas probablemente refleja señales estimuladoras que anulan las señales supresoras. Sin embargo, la supresión de las respuestas inmunes no siempre es beneficiosa para las neuronas en condiciones degenerativas (Chang et al., 2009). Por lo tanto, las intervenciones terapéuticas en enfermedades neurodegenerativas deberían ayudar a restablecer el control adecuado de las células inmunes/microglías en el SNC.

Las enfermedades neurodegenerativas son una causa creciente de discapacidad en los ancianos. La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común. La incidencia anual de la EA en todo el mundo se estima en 4,6 millones de casos, con un nuevo caso cada 7 segundos. Para el año 2040, se esperan 80 millones de casos en todo el mundo (Massoud y Gauthier, 2010). La neurodegeneración; la progresión lenta de la disfunción con una pérdida de neuronas y conexiones axonales en el sistema nervioso central (SNC), es la característica patológica 45 principal de trastornos neurológicos tales como la EA, enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Huntington (EH) (Heneka et al., 2010). En la EA, las principales características de la neuroinflamación incluyen la activación microglial en las regiones asociadas con la deposición de Αβ (beta amiloide) y la expresión de una variedad de citocinas proinflamatorias tales como la IL1β y el factor de necrosis tumoral α (TNFα). La proporción de la IL1β proinflamatoria con respecto a la IL10 antiinflamatoria aumenta notablemente en suero en pacientes con EA. La reacción inflamatoria local de la EA es mantenida por las microglías activadas y los astrocitos reactivos. La activación microglial puede ser bien neuroprotectora o perjudicial. En general, una respuesta neuroinflamatoria aguda es beneficiosa para el SNC, reduciendo al mínimo las lesiones adicionales y contribuyendo a la reparación del tejido dañado, mientras que la inflamación crónica es perjudicial y dañina para el sistema nervioso. Se sabe que el depósito progresivo de Αβ en la EA es quimioatrayente para las microglías y, por lo tanto, podría proporcionar un

55 estímulo crónico a las células microgliales. Recientemente, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, el ibuprofeno, ha demostrado tener un efecto protector en la EA (Heneka et al., 2010; Krause y MüIller, 2010).

La implicación del sistema de IL1 en la neurodegeneración se apoya en las siguientes líneas de evidencia. Su expresión se mejora espectacular y rápidamente tras cualquier tipo de lesión cerebral. Todas las enfermedades neurodegenerativas crónicas se ven acompañadas por un aumento de la expresión de IL1. Por otra parte, la neuroinflamación mediada por IL1β aumenta la susceptibilidad de las neuronas a la degeneración. Las células microgliales son la principal fuente de IL1β en la neuroinflamación, aunque también se induce su producción en los astrocitos. En los pacientes con EA, se ha encontrado la reducción de los niveles de IL1Ra. El bloqueo de la señalización de IL-1 mediante el aumento de las cantidades de IL1Ra tras las lesiones cerebrales da mejores 65 resultados en muchos modelos experimentales de neurodegeneración. El IL1Ra proporciona neuroprotección de manera constante. El IL1Ra ha mostrado penetrar en el cerebro humano a concentraciones experimentalmente

terapéuticas, y se han diseñado ensayos clínicos para la introducción de IL1Ra como terapia posterior a la apoplejía (Cawthorne et al., 2011; Clark et al., 2008; Koprich et al., 2008; Spulber et al., 2009; Tarkowski et al., 2001).

Enfermedad de Alzheimer

5 Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un 10 medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende administrar un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

15 La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia. Muy a menudo, se diagnostica en personas mayores de 65 años, aunque el Alzheimer menos frecuente de aparición temprana puede producirse mucho antes. En 2006, había 26,6 millones de pacientes en todo el mundo. Se prevé que la enfermedad de Alzheimer afectará a 1 de cada 85 personas en el mundo en 2050.

20 La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la pérdida de neuronas y la sinapsis en la corteza cerebral y ciertas regiones subcorticales. Esta pérdida produce una atrofia bruta de las regiones afectadas, incluyendo la degeneración del lóbulo temporal y del lóbulo parietal, y partes de la corteza frontal y el giro cingulado. Tanto las placas amiloides como los ovillos neurofibrilares se observan claramente mediante microscopía en los cerebros de las personas afectadas por EA. Las placas son depósitos densos, en su mayoría insolubles, del péptido beta

25 amiloide y material celular del exterior y alrededores de las neuronas. Los ovillos (ovillos neurofibrilares) son agregados de la proteína tau asociada a los microtúbulos que se ha hiperfosforilado y se ha acumulado dentro de las propias células.

Enfermedad de Parkinson

30 Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un 35 medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de Parkinson que comprende administrar un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

40 La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno degenerativo del sistema nervioso central. Es el resultado de la muerte por causas desconocidas de las células que contienen dopamina de la sustancia negra, que es una región del cerebro medio. Pronto, en el curso de la enfermedad, los síntomas más evidentes están relacionados con el movimiento, incluyendo temblores, rigidez, lentitud de movimiento y dificultad para caminar. Más tarde, pueden surgir problemas cognitivos y de comportamiento, produciéndose comúnmente demencia en las etapas avanzadas

45 de la enfermedad. La patología de la enfermedad se caracteriza por la acumulación de una proteína denominada alfa-sinucleína en inclusiones denominadas cuerpos de Lewy en las neuronas, y de la formación y actividad insuficentes de la dopamina producida en ciertas neuronas de las partes del cerebro medio.

Los tratamientos modernos son eficaces en el tratamiento de los síntomas motores iniciales de la enfermedad,

50 principalmente a través del uso de levodopa y agonistas de la dopamina. A medida que la enfermedad progresa y las neuronas de dopamina se siguen perdiendo, finalmente llega un momento en el que estos fármacos se vuelven ineficaces en el tratamiento de los síntomas, produciendo, al mismo tiempo, una complicación denominada discinesia, caracterizada por movimientos de retorcimiento. Hay medicamentos para tratar otros síntomas de la EP. La dieta y algunas formas de rehabilitación han demostrado cierta eficacia en el alivio de los síntomas. Se han usado

55 la cirugía y la estimulación cerebral profunda para reducir los síntomas motores como último recurso en los casos graves donde los fármacos no son eficaces.

Enfermedad de Huntington

60 Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

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En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de Huntington que comprende la administración de un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

La enfermedad de Huntington, corea o trastorno (EH) es un trastorno genético neurodegenerativo que afecta a la

5 coordinación muscular y conduce al deterioro cognitivo y a la demencia. La enfermedad está causada por una mutación autosómica dominante en cualquiera de las dos copias de un individuo de un gen denominado huntingtina. Los síntomas físicos de la enfermedad de Huntington pueden comenzar a cualquier edad desde la infancia hasta la vejez, pero, por lo general, comienzan entre los 35 y 44 años de edad. Aproximadamente el 6 % de los casos comienza antes de los 21 años con un síndrome acinético-rígido; avanzan más rápido y varían ligeramente. La variante se clasifica como variante de la EH juvenil, acinética-rígida o de Westphal.

Los síntomas de la enfermedad pueden variar entre los individuos e incluso los miembros de una misma familia, pero los síntomas progresan de manera predecible para la mayoría de los individuos. Los primeros síntomas son una falta general de coordinación y una marcha inestable. A medida que la enfermedad avanza, los movimientos

15 corporales espasmódicos, descoordinados, se hacen más evidentes, junto con una reducción de la capacidad mental, y problemas de conducta y psiquiátricos. Las habilidades físicas se ven obstaculizadas gradualmente hasta que el movimiento coordinado se hace muy difícil, y la capacidad mental suele degenerar en demencia. Las complicaciones tales como la neumonía, enfermedades del corazón y daños físicos por caídas reducen la esperanza de vida a aproximadamente veinte años desde el comienzo de los síntomas. No hay cura para la EH y, en las últimas etapas de la enfermedad, se requiere atención a tiempo completo, pero hay tratamientos emergentes para aliviar algunos de sus síntomas.

Esclerosis múltiple

25 Es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple.

También es un aspecto proporcionar un péptido de acuerdo con la presente divulgación para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la esclerosis múltiple que comprende la administración de un péptido de acuerdo con la presente divulgación a un individuo que lo necesita.

La esclerosis múltiple (EM, también conocida como esclerosis diseminada o encefalomielitis diseminada) es una

35 enfermedad inflamatoria en la que se dañan las vainas de mielina de grasa que hay en torno a los axones del cerebro y la médula espinal, dando lugar a la desmielinización y la cicatrización, así como un amplio espectro de signos y síntomas. El inicio de la enfermedad suele ocurrir en adultos jóvenes y es más común en las mujeres. Tiene una frecuencia que varía entre 2 y 150 por cada 100.000 personas.

La EM afecta a la capacidad de las células nerviosas del cerebro y la médula espinal para comunicarse entre sí. Las células nerviosas se comunican enviando señales eléctricas denominadas potenciales de acción por las fibras largas denominadas axones, que están envueltas en una sustancia aislante denominada mielina. En la EM, el propio sistema inmune del organismo ataca y daña la mielina. Cuando se pierde mielina, los axones ya no pueden conducir con eficacia las señales. La expresión “esclerosis múltiple” se refiere a cicatrices (esclerosis -más conocidas como

45 placas o lesiones), particularmente en la sustancia blanca del cerebro y la médula espinal, que se compone principalmente de mielina.

Con la enfermedad, puede aparecer casi cualquier síntoma neurológico, y suele progresar en discapacidad física y cognitiva. La EM adopta varias formas, produciéndose nuevos síntomas bien en ataques diferenciados (formas recidivantes) o acumulándose lentamente a lo largo del tiempo (formas progresivas). Entre los ataques, los síntomas pueden desaparecer por completo, pero a menudo se producen problemas neurológicos permanentes, especialmente a medida que va avanzando la enfermedad.

No se conoce ninguna cura para la esclerosis múltiple. Los tratamientos intentan restablecer la función tras un

55 ataque, prevenir nuevos ataques y prevenir la discapacidad. Los medicamentos para la EM pueden tener efectos adversos o ser mal tolerados, y muchos pacientes buscan tratamientos alternativos a pesar de la falta de estudios científicos que los apoyen. La esperanza de vida de los pacientes es de 5 a 10 años inferior a la de la población no afectada.

Secuencias

Secuencia de aminoácidos de la proteína antagonista del receptor de la interleucina-1 (de longitud completa; SEQ ID NO: 28);

65 N.º de acceso de UniProt: P18510 (IL1RA_HUMANO) Nombres abreviados: IL-1RN, IL1RN, IL-1ra, IRAP, IL1F3, IL1RA. Nombre/s alternativo/s: ICIL-1RA, inhibidor de IL1,

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Ejemplo 6

El péptido llantafin (SEQ ID NO: 1) reduce la muerte celular de las neuronas (apoptosis), que se induce por la reducción de las concentraciones de cloruro de potasio. El efecto del péptido es comparable al efecto del factor de 5 supervivencia neuronal IGF-1 (Figura 15 y Figura 20).

Método: Ensayo de supervivencia: se sembraron cultivos primarios de CGN a una densidad de 100.000 células/cm2 en portaobjetos permanox de 8 pocillos recubiertos de poli-L-lisina en Neurobasal-A (Gibco BRL) complementado con B27 al 2 % (v/v), glutamax al 0,5 % (v/v), 100 unidades/ml de penicilina, 100 Ig/ml de estreptomicina y KCI, produciendo la concentración final de KCl en el medio de 40 mM. 24 horas después de la siembra, se añade citosina-b-D-arabinofuranósido (Ara-C; Sigma-Aldrich) a una concentración final de 10 μΜ para evitar la proliferación de las células gliales, tras lo que se dejó que se diferenciaran las neuronas durante 6 días a 37 ºC. Se indujo la muerte celular apoptótica lavando dos veces y cambiando el medio a medio basal de Eagle (BME; Gibco BRL) complementado con glutamina al 1 % (v/v), 100 U/ml de penicilina y 100 Ig/ml de estreptomicina, 3,5 g de D

15 glucosa/L y piruvato de sodio al 1 % (v/v) (Gibco BRL) junto con diversas concentraciones de péptido. De este modo, se redujo la concentración de potasio en los cultivos a KCI 5 mM (Ditlevsen et al., 2003). Dos días después de la inducción de la apoptosis, se fijaron las células con formaldehído al 4 % (v/v) y se tiñeron con Hoechst 33258 como se describe para el ensayo de supervivencia empleando neuronas del hipocampo.

Ejemplo 7

El péptido llantafin (SEQ ID NO: 1) suprime un aumento de las manifestaciones clínicas de la AIC en ratas (Figura 16).

25 Método: la artritis reumatoide es una enfermedad inmunitaria crónica, inflamatoria, sistémica que afecta aproximadamente al 1 % de la población general de los países occidentales. La artritis inducida por colágeno (AIC) en ratas es un modelo animal ampliamente empleado para la selección de compuestos antiinflamatorios. Colágeno bovino de tipo II (Cll, n.º de cat. 20021, Lote 090209, Chondrex, EE.UU.), Adyuvante Completo de Freund, que contiene Mycobacterium tuberculosis al 0,1 % (CFA, n.º de cat. F5581, Lote 049K8700, Sigma-Aldrich), adyuvante incompleto de Freund (IFA, n.º de cat. F5506, Lote 058K8702, Sigma). PBS (Instituto Panum, Universidad de Copenhague). Isoflurano (Baxter). Los animales se inmunizaron dos veces: el día 0 (CII + CFA) y el día 10 (CII + IFA, refuerzo). El día 15, la puntuación clínica media alcanzó un valor de 5,0, y todos los animales se dividieron en 3 grupos, de modo que la gravedad de la enfermedad (puntuación clínica media) en todos los grupos era casi la misma. Se administró el péptido (dos dosis, 3,3 y 10 mg/kg) por vía subcutánea diariamente comenzando el día 15.

35 La evaluación clínica de la gravedad de la artritis se evaluó mediante el siguiente sistema de clasificación: 0 -sin enrojecimiento o hinchazón en las patas ni en las palmas; 1 -ligero hinchazón o enrojecimiento en la articulación metatarsofalángica y el tobillo en las patas o las palmas; 2 -hinchazón/inflamación y enrojecimiento avanzados desde el tobillo a mitad de la pata o en toda la palma; 3 -hinchazón/inflamación de toda la pata a excepción de los dedos de las patas; 4 -hinchazón e inflamación de toda la pata, incluyendo los dedos.

Ejemplo 8

Detección de péptidos llantafin (tales como SEQ ID NO: 1) en plasma y líquido cefalorraquídeo.

45 Se recogen muestras de sangre del plexo orbital de ratas Wistar de 200 g anestesiadas a los 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 y 24 h de una sola administración subcutánea de llantafin (SEQ ID NO: 1) (10 mg/kg) como se describe en Secher et al. (2006). Se muestrea líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna a las 2 h, como se ha descrito previamente (Secher et al., 2006). Se midieron las concentraciones de llantafin de las muestras de plasma usando un ensayo de inmunoabsorción competitiva ligado a enzima. Se recubren placas de noventa y seis pocillos AminoTM (Nunc) con 30 mg/ml de albúmina biotinilada (Sigma-Aldrich) diluida en tampón de carbonato 100 mM (pH 9,6). Se incuban las placas durante 2 h y se lavan tres veces con Tween 20 al 0,05 % v/v en solución salina tamponada con fosfato (PBST). Se mezcla un volumen de muestra con tres volúmenes de estreptavidina marcada con peroxidasa diluida A

1:5.000 en PBST y se incuba durante 30 min. A continuación, se añade una cantidad de 100 ml/pocillo de la mezcla a las placas recubiertas de albúmina biotinilada. Se incuban las placas durante 1 h, se lavan tres veces con PBST y

55 se revelan con TMB plus (Kem-En-Tec, Taastrup, Dinamarca). La reacción enzimática se detiene con ácido sulfúrico 0,2 M. Se registra la densidad óptica a 450 nm usando un lector de absorbancia Sunrise (Tecan, Männedorf, Suiza). Todas las muestras se procesan preferentemente por duplicado.

Para investigar si SEQ ID NO: 1 penetra en la barrera hematoencefálica de las ratas, se detecta llantafin con biotina en el plasma y el LCR tras la administración subcutánea. Si el péptido está presente tanto en el plasma como en el LCR, esto sugiere que la llantafin administrada sistémicamente atraviesa la barrera cefalorraquídea.

Ejemplo 9

65 El efecto de los péptidos llantafin, tales como SEQ ID ΝΟ: 1, en la reversión de la citotoxicidad neuronal se puede evaluar mediante el siguiente método: "citotoxicidad inducida por el ácido kaínico"

Se siembran neuronas del hipocampo en placas a una densidad de 5 x 104 células por pocillo en portaobjetos Permanox LabTek de ocho pocillos recubiertos con poli-L-lisina (Nunc) como se ha descrito previamente (Soroka et al., 2002). Tras 7 días en cultivo, se tratan las neuronas con llantafin (0,001 a 3 mM) o IL1RA de longitud completa durante 1 h seguido de la adición de ácido kaínico 300 mM (Sigma, Brndby, Dinamarca) recién reconstituido. Las

5 células se cultivan además durante 24 h. Se fijan las células en formaldehído al 4 % v/v y se tiñen con 5 mg/ml de Hoechst 33258 (Invitrogen, Copenhague, Dinamarca) o 5 mg/ml de yoduro de propidio (Sigma). Se registran al menos 1.000 células/condición en una serie sistemática de campos de visión, con la posición del primer campo seleccionada al azar según lo descrito en Ronn et al., (2000). Se estima la viabilidad celular basándose en la morfología nuclear (las células muertas muestran cromatina condensada o núcleos fragmentados) en un modo semiautomático usando el software desarrollado en el laboratorio para reducir al mínimo el sesgo. Los resultados se presentan como la media de la proporción de células vivas [n células vivas/(n células vivas + células muertas) ± ETM].

Ejemplo 10

15 El efecto de los péptidos llantafin, tales como SEQ ID NO: 1, en la atenuación de las convulsiones, la reducción de la mortalidad y la reducción de la neurodegeneración se puede evaluar mediante el siguiente método: "Convulsiones inducidas por ácido kaínico".

Se administra a ratones C57BLJ6J macho, de 28 a 32 g, mediante inyección por vía subcutánea, llantafin (10 mg/kg), IL1RA de longitud completa o vehículo 48, 24 y 2 h antes del tratamiento con ácido kaínico. Basándose en experimentos preliminares de ajuste de la dosis, se seleccionan dos dosis de ácido kaínico (intraperitoneal) para realizar dos series de experimentos para inducir bien convulsiones de bajo grado (ácido kaínico a 20 mg/kg) o convulsiones de alto grado y mortalidad (ácido kaínico a 30 mg/kg). Los parámetros medidos incluían la latencia del

25 inicio de las convulsiones, la gravedad de las convulsiones y la mortalidad. Se registra la actividad convulsiva durante 2 horas tras la administración de ácido kaínico por un observador con ocultación del tratamiento, y se evalúa de acuerdo con una escala modificada de Racine (0 = inmovilidad; 1 = automatismo facial; 2 = cabeceo; 3 = clono de extremidades anteriores; 4 = levantamiento de extremidades anteriores; 5 = convulsiones generalizadas; 6 = muerte, Racine, 1972). Los grados de las convulsiones 1 a 3 se consideran convulsiones de bajo grado, y los grados de convulsiones 4 a 5 se consideran convulsiones de alto grado. La latencia de la inmovilidad se mide como el tiempo entre la inyección de ácido kaínico y la aparición de la inmovilidad. El grupo de control de animales recibió una inyección de vehículo.

Ejemplo 11

35 Se sintetizaron péptidos usando la estrategia de protección con Fmoc en resina TentaGel (Rapp Polymere, Tübingen, Alemania), usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Calbiochem-Novabiochem). Los dendrímeros se componían de cuatro monómeros acoplados a una cadena principal de lisina. Los dímeros se componían de dos monómeros acoplados a un resto de lisina. Los péptidos tenían una pureza de al menos el 95 % estimada mediante cromatografía de líquidos de alta resolución y espectroscopia de masas de desorción/ionización mediante láser asistida por matriz, acoplada a un analizador de tiempo de vuelo (VG TOF Spec E, Fisons Instruments, Beverly, MA).

Ejemplo 12

45 Solubilidad de los péptidos

Tras la recepción de los péptidos de la empresa de síntesis (en forma de polvo), se reconstituyeron en agua, en PBS

o en medio. Por lo tanto, es inmediatamente evidente si un péptido es soluble o no.

Ejemplo 13

Estabilidad de los péptidos

55 Un método de evaluación de la estabilidad de los péptidos es aquel en el que la cantidad de péptidos en solución se mide espectrofotométricamente o por MS (espectrometría de masas; que mide la proporción de la masa con respecto a la carga de las partículas cargadas) en función del tiempo (1, 2, 3 días, etc.) cuando se mantiene el péptido en solución a 4 ºC y a temperatura ambiente.

Ejemplo 14

Efecto de llantafin SEQ ID NO: 1 (SGRKSSKMQA) en un modelo de rata de artritis inducida por colágeno (AIC).

Método:

65 Artritis inducida por colágeno en ratas (AIC). Inducción de la AIC. El estudio de la AIC se realizó en un total de 40 ratas Wistar macho con un peso medio de

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Claims

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