ES2600854T3

ES2600854T3 - Proteínas de unión a antígeno de TNF-alfa con unión a FcRn incrementada para su uso en terapia

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Publication number: ES2600854T3
Application number: ES12738101.0T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Henry Ellis; Michael J MOLLOY; Tejash SHAH; Ian M Tomlinson; Ahmed YASIN
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2017-02-13
Anticipated expiration: 2032-07-19
Also published as: EP3009450A1; AU2012285786A1; PH12014500167A1; WO2013011076A2; JP2014524748A; CO6862106A2; DOP2014000007A; CR20140029A; PE20141660A1; NZ618897A; MX2014000739A; CL2014000134A1; BR112014000341A2; SG10201601154QA; ZA201400062B; CN103748110A; GB201112429D0; EP2734548A2; US20130243764A1; AU2012285786B2

Abstract

Una proteína de unión a antígeno que se une específicamente a TNF-alfa que comprende: (i) CDRH1 (SEQ ID NO: 27), CDRH2 (SEQ ID NO: 28), CDRH3 (SEQ ID No: 29), CDRL1 (SEQ ID NO: 30), CDRL2 (SEQ ID NO: 31) y CDRL3 (SEQ ID NO: 32); y (ii) una porción de unión al receptor Fc neonatal (FcRn) de un dominio constante de IgG1 de ser humano que comprende sustituciones de aminoácido con relación al dominio constante de IgG1 de ser humano en los residuos de aminoácidos 252, 254 y 256 numerados de conformidad con el Índice UE de Kabat y en la que la sustitución en el residuo 252 es una sustitución de met con tyr; la sustitución en el residuo 254 es una sustitución de ser con thr y la sustitución en el residuo 256 es una sustitución de thr con glu; en la que la proteína de unión a antígeno tiene una afinidad de unión a FcRn incrementada a pH 6 y semivida incrementada en comparación con una IgG que comprende la secuencia de la cadena ligera de SEQ ID No. 2 y la secuencia de la cadena pesada de SEQ ID No.12 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en la que la proteína de unión a antígeno se administra a pacientes en una dosis única entre 35 a 45 mg a un intervalo de entre cuatro y ocho semanas.

Description

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farmacocinéticos de conformidad con el método descrito por Kim et al. (Eur. J. of Immuno. 24: 542, 1994). De conformidad con este método, la proteína radiomarcada se inyecta por vía intravenosa en los ratones y su concentración en plasma se mide periódicamente como una función del tiempo, por ejemplo, aproximadamente a 3 minutos hasta aproximadamente 72 horas después de la inyección.Otros métodos para análisis farmacocinético y determinación de la semivida de una molécula serán familiares para el experto en la técnica. Los detalles se pueden encontrar en Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Rev. ex edición (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como semivida t alfa y t beta y el área bajo la curva (ABC) y “Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications”, Rowland y Tozer, tercera edición (1995).

“Clarificación (CL)” se refiere al volumen del plasma clarificado irreversiblemente de una proteína por unidad de tiempo. La clarificación se calcula como la Dosis/ABC (ABC: es el área bajo la curva o el área bajo la curva de concentración-tiempo de fármaco en plasma). La clarificación también se puede calcular mediante la velocidad de eliminación de fármaco dividida entre la concentración en plasma del fármaco (velocidad de eliminación = CL*concentración).

“Tiempo medio de residencia (MRT)” es el tiempo promedio que los polipéptidos de unión a antígeno residen en el cuerpo antes de ser eliminados de manera irreversible. Calculado como MRT= AUMC/ABC.

“Concentración en estado constante” (Css) es la concentración alcanzada cuando la velocidad de eliminación del fármaco se vuelve igual a la velocidad de administración del fármaco como resultado de la administración continua del fármaco. La Css fluctúa entre niveles máximos y mínimos y se mide en microgramos/ml. “Concentración media mínima en estado constante” se refiere a la media del nivel mínimo a través de la población de pacientes a un tiempo dado.

“Concentración media mínima en estado constante comparable” se refiere a la concentración media mínima en estado constante que es la misma o está dentro de aproximadamente 10% a 30 % del valor declarado. La concentración media mínima en estado constante comparable para los polipéptidos de unión a antígeno de la invención puede considerarse que son aquellas concentraciones medias mínimas en estado constante que son 0,8 a 1,25 veces la concentración media mínima en estado constante lograda con una IgG que comprende la secuencia de la cadena ligera de SEQ ID No. 2 y la secuencia de la cadena pesada de SEQ ID No. 12.

La semivida y las ABC se pueden determinar a partir de una curva de concentración en suero del fármaco (por ejemplo el polipéptido de unión a antígeno de la presente invención) contra el tiempo. La semivida se puede determinar a través de análisis compartimental o no compartimental. Se puede utilizar el paquete de análisis WINNONLIN™ (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EE.UU.), por ejemplo,para modelar la curva. En una modalidad, “semivida” se refiere a la semivida terminal.

Se une específicamente: El término “se une específicamente” tal como se utiliza a través de toda la presente descripción con relación a las proteínas de unión a antígeno significa que la proteína de unión a antígeno se une a TNF-alfa sin unión o unión insignificante a otras proteínas no relacionadas. El término sin embargo no excluye el hecho de que las proteínas de unión a antígeno también pueden presentar reactividad cruzada con moléculas cercanamente relacionadas. Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento se pueden unir a TNF-alfa con una afinidad por lo menos 2, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 50, por lo menos 100, o por lo menos 1000 veces mayor que con las que estas se unen a moléculas cercanamente relacionadas.

CDR: Las “CDR” se definen como las secuencias de aminoácido de la región determinante de complementariedad de una proteína de unión a antígeno. Estas son las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. Existen tres CDR de la cadena pesada y tres CDR de la cadena ligera (o regiones CDR) en la porción variable de una inmunoglobulina. Por lo tanto, "CDR" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a todas las tres CDR de la cadena pesada, todas las tres CDR de la cadena ligera, todas las CDR de la cadena pesada y ligera, o por lo menos dos CDR.

A través de toda esta descripción, los residuos de aminoácido en las secuencias del dominio variable y en las secuencias de anticuerpo de longitud completa se enumeran de conformidad con la convención de numeración de Kabat. De manera similar, los términos “CDR”, “CDRL1”, “CDRL2”, “CDRL3”, “CDRH1”, “CDRH2”, “CDRH3” utilizados en los Ejemplos siguen la convención de numeración de Kabat. Para mayor información, véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).

% de identidad de las variantes: El término “e idéntico" o “identidad de secuencia” indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de aminoácido cuando se alinean de manera óptima y se comparan con las inserciones o deleciones apropiadas. Las variantes descritas en el presente

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documento pueden tener 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % de identidad con la CDR nativa o con las secuencias de dominio variable a nivel de aminoácido.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se utiliza en conjunto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la descripción puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "por lo menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para decir "y/o" a menos que se indique explícitamente que es para referirse a las alternativas solamente o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación soporta una definición que se refiera a solamente a alternativas y "y/o". A través de toda esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que está siendo utilizado para determinar el valor, con la variación que existe entre los individuos sometidos a estudio.

Tal como se utilizan en esta descripción y reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contiene" y "contienen") son incluyentes o de extremo abierto y no excluyen elementos o eatapas del método adicionales, no recitados. En un aspecto dichos términos de extremo abierto también comprenden dentro de su alcance una definición restringida o cerrada, por ejemplo tal como "que consiste esencialmente en", o "que consiste en".

El término "o combinaciones de los mismos" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los ítems listados que preceden al término. Por ejemplo, "A, B, C, o combinaciones de los mismos pretende incluir por lo menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABCy si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, o CAB. Continuando con este ejemplo, están expresamente incluidas combinaciones que contienen repeticiones de uno o más ítems o términos, tales como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB y así sucesivamente. El experto en la técnica entenderá típicamente no hay límite en el número de ítems o términos en cualquier combinación, a menos que de lo contrario sea evidente a partir del contexto.

Todas las composiciones y/o métodos divulgados y reclamados en el presente documento se pueden hacer y ejecutar sin experimentación indebida en vista de la presente divulgación. Aunque las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en el presente documento sin alejarse del concepto, alcance y campo de la invención. Todos de dichos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están considerados dentro del alcance, campo y concepto de la invención como queda definido por las reivindicaciones anexas.

La presente invención se describe también con referencia a los siguientes ejemplos, no limitativos sobre la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: clonación de vectores de expresión de anticuerpo

Las construcciones de expresión de ADN que codifican para los dominios pesado variable (VH) y ligero variable (VL) de un anticuerpo anti-TNFα se prepararon previamente de novo e incluyen los sitios de restricción para clonación en vectores de expresión mamíferos. Ambas secuencias de dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera se optimizaron en cuanto a secuencia para expresión en células de mamífero (para la metodología véase los documentos WO2009024567 y Kotsopoulou et al, J Biotechnol (2010) 146: 186-193). La información que describe las secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera se puede encontrar en la patente de E.U.A. US6090382. Para generar las construcciones utilizadas en este estudio, las secuencias del dominio pesado variable (VH) se amplificaron utilizando PCR. Los iniciadores de PCR contienen sitios de restricción HindIII y SpeI para encuadrar el dominio de VH que contiene la secuencia de señal para clonación en vectores de expresión mamíferos pTT que contienen la región constante γ1 de humano. De manera similar la secuencia del dominio VL se amplificó mediante PCR utilizando iniciadores que contienen los sitios de restricción HindIII y BsiWI para facilitar la clonación en un vector de expresión mamífero pTT que contiene la región constante kappa de humano. Al plásmido de expresión de la cadena pesada se le asignó el código SJC322 y el plásmido de expresión de la cadena ligera se le asignó el código de plásmido SJC321.

Se prepararon de novo construcciones de expresión de ADN que codifican para regiones de la cadena pesada y la cadena ligera alternativas de anticuerpos anti-TNFα con modificaciones en las regiones CDR (como se describe en Rajpal et al. PNAS (2005) 102(24): páginas 8466-8471) mediante acumulación de oligonucleótidos traslapantes y técnicas de biología molecular similares a aquellas descritas anteriormente. Los plásmidos resultantes que codifican para las cadenas pesada y ligera de las variantes cb1-3, cb2-6 y cb244 se describen en la Tabla 1.

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Ejemplo 2: diseño de la región Fc

Se utilizaron iniciadores para cebado sentido y antisentido para introducir modificaciones (M252Y/S254T/T256E y T250Q/M428L) en la región constante γ1 de ser humano del plásmido que codifica para la cadena pesada de pascolizumab (anticuerpo anti-IL-4) utilizando el protocolo Quikchange (Promega).

5 Como se describió en el Ejemplo 1 anterior, se generó un fragmento de PCR que codifica para el dominio VH de un anticuerpo anti-TNFα utilizando como plantilla un vector optimizado en cuanto a codón, previamente construido. El fragmento resultante se clonó utilizando HindIII y SpeI en un vector de expresión pTT que contiene la región constante γ1 de ser humano modificada descrita en el párrafo precedente. El plásmido que codifica para la cadena pesada del anticuerpo anti-TNFα con la modificación M252Y/S254T/T256E se designa

10 SJC324. El plásmido que codifica para la cadena pesada con la modificación T250Q/M428L se designó SJC323.

Se utilizaron iniciadores para cebado sentido y antisentido para introducir modificaciones en la región constante γ1 de ser humano de plásmidos de expresión de la cadena pesada anti-TNFα SJC322 utilizando el protocolo Quikchange (Promega). El plásmido SJC326 codifica para la cadena pesada anti-TNFα que

15 contiene la modificación M428L/N434S en la región constante γ1 de humano. El plásmido SJC328 codifica para la cadena pesada anti-TNFα que contiene la modificación V308F en la región constante γ1 de humano.

Ejemplo 3: expresión de anticuerpos en células HEK2936E utilizando vectores episómicos pTT5

Los plásmidos de expresión que codifican para las cadenas pesada y ligera descritos anteriormente se cotransfectaron en forma transitoria en células HEK 2936E. El anticuerpo expresado se purificó a partir del

20 sobrenadante mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de Proteína A HiTrap de 1ml (GE Healthcare). La siguiente Tabla 1 muestra la lista de anticuerpos producidos.

Algunos anticuerpos también se expresaron en células CHO utilizando un conjunto diferente de vectores de expresión. Véanse Ejemplos 13, 14 y 15 para una descripción de la biología molecular, expresión y purificación.

25 TABLA 1: lista anticuerpos expresados

Código BPC: Variante de CDR Modificaciones de Fc Vector de expresión de la cadena pesada SEQ ID de la cadena pesada Vector de expresión de la cadena ligera SEQ ID de la cadena ligera

BPC1492: Ninguna Tipo silvestre SJC322 12 SJC321 2

BPC1494: Ninguna M252Y/S254T/ T256E SJC324 5 SJC321 2

BPC1496: Ninguna M428L/N434S SJC326 9 SJC321 2

BPC1493: Ninguna T250Q/M428L SJC323 15 SJC321 2

BPC1498: Ninguna V30F SJC328 18 SJC321 2

BPC1499: cb1-3 Tipo silvestre SJC336 150 SJC339 147

BPC1500: cb2-44 Tipo silvestre SJC337 151 SJC340 148

BPC1501: cb2-6 Tipo silvestre SJC336 150 SJC338 149

Ejemplo 4: unión de los anticuerpos al factor de necrosis tumoral alfa en un ELISA de unión directa

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Se efectúa un ELISA de unión para evaluar la unión de los anticuerpos expresados purificados utilizando proteína A al factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) recombinante. Las placas de ELISA se recubrieron con TNFα recombinante de ser humano a 0,1 µg/ml y se bloquean con solución para bloqueo (4 % de BSA). Se agregaron diversas diluciones del anticuerpo purificado (diluido en BSA al 4 % de en solución salina amortiguada con T Tris a pH 8,0 que contiene 0,05 % de Tween 20) y la placa se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en agua desionizada. La unión se detectó mediante la adición de un anticuerpo anti-cadena ligera kappa de ser humano marcado con peroxidasa (Sigma A7164) en solución para bloqueo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en agua desionizada. La unión se detectó por la adición de una peroxidasa marcada y de anticuerpo de cadena ligera kappa humana (Sigma A7164). La placa se reveló mediante adición del substrato OPD (Sigma P9187) y el desarrollo de color se detuvo mediante adición de HCl 2M. La absorbancia se midió a 490 nm con una lectora de placas y la media de la absorbancia se trazó frente a la la concentración. Los resultados se muestran en la Figura 1 y confirman que todos los anticuerpos tienen un perfil similar.

Ejemplo 5: análisis de anticuerpos en una prueba de neutralización L929 in vitro

Esta prueba se utilizó para analizar la capacidad de neutralización de los anticuerpos para neutralizar a TNF-α e inhibir la muerte celular. Brevemente, las células L929 se sembraron en una placa de fondo plano de 96 cavidades a 10,000/cavidad en 100 µl de RPMI 1640 (sin rojo de fenol) y se incubaron toda la noche a 37 ºC, 5 % de CO2. Las células se sensibilizaron con 1,25 µg/ml de actinomicina D durante 1 hora. Para el estudio de neutralización, 0,001-60 µg/ml (0,0067-400 nM) del anticuerpo monoclonal anti-TNF-α se pre-incubaron con aproximadamente 2 ng/ml (aproximadamente 0,05 nM) de TNF-α en una relación 1:1 durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el grupo de control, se utilizó RPMI en lugar del anticuerpo. Después de 1 hora de pre-incubación con actinomicina D, se agregaron 20 µl de complejo anticuerpo-antígeno por cavidad. Se agregaron 10 µl de medio solo a las cavidades como un control negativo. Las placas se incubaron 18 horas a 37 ºC, 5 % de CO2. Después de este periodo de tratamiento, la viabilidad celular se determinó mediante un kit para prueba luminiscente de célula Titer-Glo de conformidad con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison USA). Para la prueba L929, el porcentaje de viabilidad celular de los incógnitos se expresó como un porcentaje del grupo no tratado (tomado como 100 %) y los valores de CI50 se determinaron mediante Graphpad prism. Las diferencias en los valores de CI50 de los anticuerpos se evaluaron mediante ANOVA de una vía (prueba post hoc de Newman-Keuls) y se consideran significativas a valores P de menos de 0,05. Los datos se representan como la media ± SEM, de n=4 experimentos medidos por duplicado. Se determinaron los valores de CI50 para cada anticuerpo y se listan en la siguiente Tabla 2. Los resultados muestran que la potencia de todos los anticuerpos analizados es comparable.

TABLA 2: valores de CI50 para diversos anticuerpos anti-TNFα en una prueba de neutralización L929

Anticuerpo: Valor de CI50 (μg/ml)

BPC1492: 1,19 ± 0,10

BPC1494: 1,20 ± 0,13

BPC1496: 1,18 ± 0,10

Adalimumab: 1,09 ± 0,07

La Tabla 3 muestra los valores de CI50 obtenidos a partir del experimento. Los resultados indican que los anticuerpos anti-TNFα mejorados (BPC1499, BPC1500, BPC1501) muestran potencia incrementada en esta prueba en comparación con BPC1492 y adalimumab.

TABLA 3: valores de CI50 para anticuerposanti-TNFα mejorados en una prueba de neutralización L929

Anticuerpo: Valor de CI50 (μg/ml)

BPC1492: 1,19 ± 0,1

BPC1499: 0,21 ± 0,04

BPC1500: 0,13 ± 0,02

BPC1501: 0,21 ± 0,03

Adalimumab: 1,09 ± 0,07

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1 mg/ml a pH 7,4 y se retiró una alícuota de esta muestra para proveer un nivel de agregación de línea basal (según se monitorea mediante cromatografía por exclusión de tamaño). Las muestras se incubaron después a 37 ºC durante dos semanas en una incubadora, después de lo que las muestras se volvieron a cuantificar en un espectrofotómetro a DO280nm y se evaluaron (mediante cromatografía por exclusión de tamaño) respecto a agregación. Las muestras se analizaron para unión a TNFα de ser humano en una ELISA de unión directa. Los resultados se muestran en la Figura 2 y confirman que la actividad de unión de todos los anticuerpos analizados es comparable después del estudio de tensionante (estresor) acelerado.

Ejemplo 8: estudio de estabilidad en 25% de suero de humano

Antes del estudio, los anticuerpos que se van a analizar se cuantificaron en un espectrofotómetro a DO280nm y se diluyeron hasta 1,25 mg/ml en PBS (pH 7,4). Se retiró una alícuota y se agregó 25 % v/v de suero de ser humano para dar una concentración final de 1 mg/ml. A la muestra remanente en PBS se le agregó 25 % de PBS v/v hasta una concentración final de 1 mg/ml y se retiró una alícuota de esta muestra para proveer un nivel de línea basal. Las muestras se incubaron después a 37 ºC durante dos semanas en una incubadora, después de lo que las muestras se analizaron respecto a unión a TNFα de ser humano en un ELISA de unión directa. Los resultados se muestran en la Figura 3 y confirman que la actividad de unión de todos los anticuerpos analizados es comparable después de la incubación en 25 % de suero de ser humano durante dos semanas.

Ejemplo 9: análisis de unión a TNFα de ser humano después de congelar-descongelar

Las muestras de anticuerpo se diluyeron hasta 1 mg/ml en solución amortiguadora que contiene acetato 50 mM y NaCl 150 mM (pH 6,0), se congeló instantáneamente en hielo seco y después se descongeló a 4 ºC durante toda la noche. La unión de los anticuerpos a TNFα de ser humano se analizó mediante comparación con un anticuerpo que no ha sido congelado instantáneamente. Para evaluar la actividad de unión después de congelar-descongelar, las placas ELISA se recubrieron con TNFα recombinante de ser humano a 1 µg/ml y se bloquearon con solución para bloqueo (4 % de BSA en solución salina tamponada). Se agregaron diversas concentraciones a las placas recubiertas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en agua desionizada. La unión se detectó mediante la adición de un anticuerpo anti-cadena ligera kappa de ser humano marcado con peroxidasa (Sigma A7164) en solución para bloqueo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en agua desionizada. La placa se revela mediante adición del substrato OPD (Sigma P9187) y el desarrollo de color se detiene mediante adición de HCl 2M. La absorbancia se midió a 490 nm con una lectora de placas y la media de la absorbancia se representó frente a la concentración. Los resultados se muestran en la Figura 4 y confirman que la actividad de unión de todos los cuerpos analizados es comparable después de congelar-descongelar.

Ejemplo 10: análisis de unión de anticuerpos anti-TNFα a FcγRIIIa

Las placas ELISA se recubrieron con FcγRIIIa recombinante de ser humano (variantes V158 y F158) a 1 µg/ml y se bloquearon con solución para bloqueo (4 % de BSA en solución salina amortiguada con Tris). Se agregaron diversas concentraciones a las placas recubiertas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en agua desionizada. La unión se detectó mediante la adición de un anticuerpo anticadena ligera kappa de ser humano marcado con peroxidasa (Sigma A7164) en solución para bloqueo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente antes de lavar en agua desionizada. La placa se reveló mediante adición del substrato OPD (Sigma P9187) y el desarrollo de color se detuvo mediante adición de HCl 2M. La absorbancia se midió a 490 nm con una lectora de placas y la media de la absorbancia se representó frente a la concentración. Los resultados se muestran en la Figuras 5a y 5b y confirman que BPC1494 tiene capacidad reducida para ligar a FcγRIIIa (variantes V158 y F158) en comparación con BPC1492 y BPC1496.

Ejemplo 11: análisis ProteOn: unión a FcRn

Los anticuerpos para análisis se inmovilizaron a niveles similares en un chip biosensor GLC (BioRad 1765011) mediante acoplamiento de amina primaria. Se utilizaron FcRn recombinante de ser humano y de macaco de Java como analitos a 2048 nM, 512 nM, 128 nM, 32 nM y 8 nM, se utilizó una inyección de solución amortiguadora sola (es decir 0 nM) para doble referencia de las curvas de unión. La regeneración de la superficie del anticuerpo después de la inyección de FcRn utilizó HBS-N a pH 9,0, la prueba se corrió en el sistema de arreglo de interacción de proteína ProteOn XPR36 a 25 ºC y se corrió en HBS-N pH 7,4 y HBS-N pH 6,0 con el FcRn diluido en la solución amortiguadora apropiada. Las afinidades se calcularon utilizando el modelo de equilibrio, inherente al software de análisis ProteOn, utilizando una“R-máx global” para unión a pH 6,0 y la R-máx de la unión a pH 6,0 para el cálculo de afinidad a pH 7,4. Debido a que las curvas de unión no alcanzaron la saturación a pH 7,4, es poco probable que los valores obtenidos sean afinidades verdaderas, sin embargo estos se pueden utilizar para clasificar las construcciones. Los resultados se muestran en la Tabla 6 y confirman que BPC1494 y BPC1496 tienen una afinidad mejorada para FcRn de ser humano y de macaco de Java a pH 6,0 cuando se comparan con BPC1492.

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TABLA 6: afinidades de las construcciones anti-TNF alfa que se unen a FcRn de ser humano y de macaco de Java

Número BPC: Humano pH 6,0 KD (nM) Humano pH 7,4 KD (nM) Macaco de Java pH 6,0 KD (nM) Macaco de Java pH 6,0 KD (nM)

BPC1492: 554 21200 579 29700

BPC1494: 204 2320 239 2640

BPC1496: 144 1910 154 2100

BPC1497: 428 15500 464 20800

BPC1498: 357 5910 402 6280

BPC1493: 264 4390 295 4690

Ejemplo 12: estudios farmacocinéticos en ratones transgénicos FcRn de humano

En un estudio farmacocinético de dosis individual, BPC1494 y BPC1492 se administraron por vía intravenosa

5 (IV) a 1 mg/kg a dos cepas diferentes de ratones humanizados con FcRn y una cepa deficiente en FcRn (Petkova et al. Int. Immunol (2010) 18(12): 1759-1769). Las muestras de plasma se analizaron respecto a BPC1494 o BPC1492, según sea apropiado, utilizando una prueba inmunológica fluorescente Gyrolab validada.

Los métodos utilizaron TNF alfa de ser humano conjugado con biotina como el antígeno de captura y un

10 anticuerpo anti-IgG de ser humano (específico de Fc) marcado con Alexa como el anticuerpo de detección. Utilizando una alícuota de plasma de ratón diluido 1:10 con solución amortiguadora para prueba, el límite inferior de cuantificación (LLQ) es 100 ng/ml y el límite superior de cuantificación (HLQ) es 100,000 ng/ml.Las concentraciones de plasma por debajo de los patrones de referencia más bajos se consideran como no cuantificables. Las muestras de control de calidad preparadas a tres concentraciones diferentes y

15 almacenadas con las muestras de estudio, se analizaron con cada lote de muestras contra patrones de referencia para calibración preparados por separado. Para que el análisis sea aceptable, por lo menos una muestra de control de calidad en cada concentración no se debe desviar de la concentración nominal en más de 20 %. Los resultados de control de calidad de este estudio cumplen estos criterios de aceptación.

El análisis farmacocinético se efectuó mediante análisis farmacocinético no compartimental utilizando

20 WinNonLin, versión 6.1. Todos los cálculos utilizan los tiempos de muestreo de sangre nominales. La exposición sistémica a BPC1494 y BPC1492 se determina calculando el área bajo la curva (ABC) de concentración en plasma-tiempo desde el inicio de la dosificación hasta el último punto de tiempo cuantificable (ABC0-t) utilizando el método de cálculo trapezoidal logarítmico lineal. No se pudieron obtener parámetros farmacocinéticos adicionales a partir de los datos debido a discrepancias en el marcado de las muestras.

25 TABLA 7: sumario de los parámetros farmacocinéticos para BPC1494 y BPC1492 después de una administración intravenosa individual (bolo) a una dosis objetivo de 1 mg/kg a ratones transgénicos

Compuesto: Cepa Cmáx (µg/ml) ABC (hr*µg/ml)

BPC1494: 1 13,8 2240

BPC1492: 14,8 1730

BPC1494: 2 12,0 1320

BPC1492: 13,2 1060

BPC1494: 3 13,6 214

BPC1492: 12,2 250

Cepa 1 = mFcRn-/-hFcRn (32) Tg/Tg

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mediante centrifugación y el sobrenadante se utilizó para purificación de proteína. 1 litro de los sobrenadantes del cultivo celular se purificó utilizando un proceso automatizado de 2 pasos en un sistema AKTA Xpress. El anticuerpo se captura en una columna MabSelectSure de 5 ml y después se lavó antes de la elución. El anticuerpo eluido se cargó después en una columna para filtración en gel Superdex 200 de 440 ml y se recolectaron fracciones de 2 ml en un bloque de 96 cavidades. Las fracciones de anticuerpo purificado se combinaron y se filtraron a 0,2 µm y después se concentraron hasta aproximadamente 5 mg/ml utilizando concentradores centrífugos Amicon. El material final se filtró de nuevo a 0,2 µm y después se dispensó en tubos estériles para suministro. El material final se sometió a SEC analítica para determinar la agregación, una prueba con endotoxina, LC-MS para determinación exacta de la masa (incluidos PNGasaF y material no tratado para determinar la glucosilación), electroforesis SDS PAGE, PMF para confirmación de secuencia y A280 para determinación de la concentración.

Ejemplo 15: método alternativo para expresión de anticuerpos en células CHO utilizando los vectores de expresión pEF

Las células CHO DG44 DHFR-nulas se obuvieron del Dr. Chasin de la Universidad de Columbia. Estas células posteriormente se adaptaron a un medio químicamente definido. Estas células hospederas adaptadas se designaron DG44-c y se cultivaron en medio químicamente definido patentado suplementado con Glutamax y suplemento HT.

Generación de la mezcla policlonal: para mayores detalles sobre los protocolos véase documentos WO2009024567 y Kotsopoulou et al, J. Biotechnol (2010) 164(4): 186-193. Brevemente, las células DG44-c se transfectaron con los plásmidos que codifican para las cadenas pesada y ligera y DHFR y neoR respectivamente mediante electroporación (utilizando el sistema Amaxa nucleofector). A las 48 horas después de la transfección, la selección se inició mediante adición de G418 (a una concentración final de 400 µg/ml) y remoción de HT. Cuando la viabilidad y los conteos celulares se incrementaron lo suficiente (en este caso 2 meses después de la transfección) se agregó metotrexato (MTX) a una concentración final de 5 nM. Las células se escalan y las curvas de producción se inician 9-16 días después de la adición de MTX. Para estas curvas de producción las células se sembraron a 0,6-0,8 x 106 células/ml en medio químicamente definido y se alimentaron en los días 6, 9 o 10, 12 o 13 y/o 16. El sobrenadante se recolectó cuando la viabilidad cae hasta aproximadamente 50 % y las células se retiraron mediante centrifugación a 4000 g durante 30 minutos seguido por filtración a través de una cápsula sartobran.

Los anticuerpos se purifican a temperatura ambiente utilizando un procedimiento cromatográfico de dos pasos: la captura inicial se efectuó utilizando una columna MabSelect SuRe de 50 ml (GE Healthcare) seguida por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) con un SEC de 1,5 litros Superdex de 200 pg (GE Healthcare). El medio condicionado se cargó en una columna MabSelect SuRe previamente equilibrada a una velocidad de flujo de 9 m3/h. Después del lavado hasta línea basal con solución amortiguadora para equilibrio (Tris 50mm pH 8,0, NaCl 2M) la columna se lavó con una solución amortiguadora con bajo contenido de sal (50 mM NaCl Tris pH 8,0, NaCl 150 mM) hasta que la conductividad es estable. La columna después se eluyó con solución amortiguadora para elución (Citrato 25 mM pH 2,5). Las fracciones correspondientes a la elución máxima de proteína se neutralizaron inmediatamente con 1/10 del volumen de 1,0 M Tris pH 8,0 que después se combinaron y filtran a través de un filtro con botella superior de 0,2 µm. La muestra recuperada se cargó a 21 m3/h en una columna SEC previamente equilibrada con solución amortiguadora para SEC (Acetato de sodio 50 mM, NaCl 150mM). Las fracciones que contenían el pico de proteína principal (monomérico) se combinaron y se esterilizaron por filtración.

Los anticuerpos preparados mediante este método se utilizan para estudios de comparabilidad analítica presentados en forma resumida en el siguiente ejemplo.

Ejemplo 16: comparabilidad analítica en muestras de control y muestras estresadas

Se efectuó cromatografía por exclusión de tamaño para determinar los niveles de agregación de la proteína. El método optimizado implicó inyección de la muestra en una columna TOSOH TSK G3000SWXL que se ha equilibrado en fosfato de sodio 100 mM, NaCl 400 mM, pH 6,8. La absorbancia se midió tanto a 280 nm como a 214 nm. La HPLC de fase inversa separó las proteínas y sus isoformas basándose en el carácter hidrofóbico. PLRP-S 1000 °A 8 µm y se eluye utilizando un gradiente producido por 50 % de ácido fórmico y 95 % de acetonitrilo. La absorbancia se midió a 280 nm. La pureza de la molécula se reportó como un porcentaje del área de pico principal con relación al área de pico total. Las diferentes isoformas del anticuerpo monoclonal se separaron con base a sus valores pI utilizando enfoque isoeléctrico capilar (cIEF). La separación con IEF se efectuó en un capilar de cartucho transparente a UV 280 de 10 cm. El método optimizado incluyó una solución que contiene 5 % de anfolitos a pH 3-10, NaOH 10mM, la proteína de interés y los marcadores de pI internos (7,05 y 9,5) que se cargó en el capilar mediante inyección a presión.

La actividad específica de los anticuerpos (adalimumab, BPC1494, BPC1496) se determinó utilizando MSD. En breve, placas de 96 cavidades se recubrieron con 50 µl por cavidad de TNFα diluido a 1 µg/ml en PBS. La placa se incubó en la parte superior del banco a temperatura ambiente sin agitación durante 2 horas. Se retiró

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reducida a la superficie de Proteína A y a la superficie de anti-IgG de ser humano haciendo estas superficies inadecuadas para generar cinética para dichas moléculas.

TABLA 9: análisis cinético de unión de TNF alfade ser humano y de macaco de Java a los anticuerpos anti-TNF alfa capturados

Construcción: Analito Superficie de captura ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)

BPC1492: TNF de humano Proteína A 2,12E+06 1,10E-04 0,05196

BPC1494: TNF de humano Proteína A Datos No Analizables

BPC1496: TNF de humano Proteína A Datos No Analizables

BPC1500: TNF de humano Proteína A 2,68E+06 4,19E-05 0,01561

BPC1492: TNF de humano Anti-IgG de humano 6.78E+06 1,73E-04 0,02554

BPC1494: TNF de humano Anti-IgG de humano Datos No Analizables

BPC1496: TNF de humano Anti-IgG de humano Datos No Analizables

BPC1500: TNF de humano Anti-IgG de humano 4,51E+06 7,07E-05 0,01568

BPC1492: TNF de macaco de Java Proteína A 1,10E+06 1,11E-04 0,101

BPC1494: TNF de macaco de Java Proteína A Datos No Analizables

BPC1496: TNF de macaco de Java Proteína A Datos No Analizables

BPC1500: TNF de macaco de Java Proteína A 2,34E+06 3,51E-05 0,01503

BPC1492: TNF de macaco de Java Anti-IgG de humano 1,96E+06 3,75E-04 0,1911

BPC1494: TNF de macaco de Java Anti-IgG de humano Datos No Analizables

BPC1496: TNF de macaco de Java Anti-IgG de humano Datos No analizables

BPC1500: TNF de macaco de Java Anti-IgG de humano 4,48E+06 2,09E-04 0,04667

Ejemplo 19: análisis de unión con la prueba inversaProteOn

TNF alfa conjugado con biotina se mezcló con BSA conjugada con biotina a una relación 1:49, a una concentración final de proteína total de 20 µg/ml (es decir 0,4 µg de TNF alfa conjugado con biotina y 19,6 µg de BSA conjugada con biotina). Esta mezcla se capturó en un chip biosensor NLC (una sola celda de flujo)

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Ejemplo 24: estudios farmacocinéticos con Pasco contra Pasco-YTE

La Figura 6 muestra las concentraciones promedio en plasma normalizadas por dosis de pascolizumab-YTE (BPC2604)) en macacos de Java hembra y pascolizumab en macacos de java macho después de una administración intravenosa individual (1 hora de infusión) a una dosis objetivo de 1 mg/kg. Los datos para BPC2604 y pascolizumab se generaron en estudios separados. Las concentraciones de anticuerpo en plasma para pascolizumab y BPC2604 se evaluaron mediante ELISA con quimio-luminiscencia utilizando IL-4 como el reactivo de captura y el conjugado de anti-IgG de ser humano (específico de Fc)-HRP como el reactivo de detección. El intervalo validado para la prueba es de 50-5000 ng/ml. Los resultados se muestran en la Figura

6. Ambos compuestos tienen Cmáx similares pero BPC2604 tiene una clarificación en plasma 3 veces más baja lo que da como resultado un incremento de 3 veces en el ABC y un incremento de 2 veces en la semivida (T½).

Ejemplo 25: estudios de formulación a 5 mg/ml

Se comparó la estabilidad de adalimumab y de la variante BPC1494 de TNF-alfa en dos formulaciones. La Formulación “A” (solución amortiguadora de citrato-fosfato) es la formulación de adalimumab comercializada constituida por 6,16 mg/ml de cloruro de sodio + 0,30 mg/ml de citrato de sodio monobásico + 1,30 mg/ml de ácido cítrico monohidratado + 12 mg/ml de manitol + 0,86 mg/ml de fosfato de sodio monobásico dihidratado + 1,53 mg/ml de fosfato de sodio dibásico dihidratado + 1,0 mg/ml de PS80 a pH 5,2.

La Formulación “B” (solución amortiguadora de acetato) está constituida por 6,81 mg/ml (50 mM) de acetato de sodio trihidratado + 10 mg/ml (1 % p/v) de arginina + 0,0186 mg/ml (0,05mM) de EDTA + 2,98 mg/ml (51 mM) de cloruro de sodio + 0,2 mg/ml (0,02 % p/v) de Polisorbato 80, ajustada a pH 5,5 utilizando HCl o NaOH.

El material de la variante BPC1494 de TNF-alfa utilizado en este estudio se elaboró en una línea celular de ovario de hámster chino (CHO DG44) y se purificó utilizando un procedimiento de dos pasos que implica mAb Select Sure seguido por columna Superdex 200pg. Se utiliza adalimumab (código de producto NDC 00743799-02, número de lote 91073LX40) fabricado por Abbott Laboratories.

El adalimumab se volvió a reformular en la Formulación “B” mediante diálisis nocturna a 5 ºC utilizando un cassette Slide-A-Lyzer de 10 KDa (Número de producto 66830, número de lote LJ150514); producido por Thermo Scientific (Rockford, IL; EE.UU.). Este experimento se efectuó en un punto de tiempo diferente al de las otras tres formulaciones. Ambos adalimumab en las Formulaciones “A” y “B” se diluyeron hasta 5 mg/ml utilizando sus respectivas soluciones amortiguadoras para formulación. La molécula de la variante BPC1494 de TNF-alfa también se formularon en las Formulaciones A y B aproximadamente a 5 mg/ml. Un total de 4 muestras se filtraron a través de un filtro MillexGV de 0,22 µm en una condición de flujo laminar limpio antes de transfrirse a viales de vidrio pre-esterilizados etiquetados e incubadas a 5 ºC, 25 ºC y 40 ºC hasta por 14 semanas. Las muestras se tomaron en los puntos de tiempo seleccionados y se analizaron utilizando SEC-HPLC (Tabla 12), cIEF (Tabla 13). También se efectuaron otras pruebas como las descritas más adelante para evaluar la estabilidad de los anticuerpos.

Apariencia mediante observación visual

Las muestras se inspeccionaron respecto a claridad en condiciones de luz diurna. Ambos anticuerpos en cada formulación permanecen sin cambio (solución incolora transparente) después de 14 semanas de almacenamiento a 5 ºC, 25 ºC y 40 ºC.

Medición de la concentración de proteína (A280nm)

La concentración de proteína se midió utilizando un espectrómetro de nanogota, lo que es indicativo de la estabilidad de la proteína. El coeficiente de extinción para adalimumab es 1,46 y para la variante BPC1494 de TNF-alfa es 1,48. No hay diferencia significativa en los resultados después de 14 semanas de almacenamiento a 5 ºC, 25 ºC y 40 ºC.

pH

El pH se midió para todas las muestras almacenadas en condiciones de almacenamiento diferentes para determinar si es que han ocurrido o no cualesquiera derivas significativas en el pH. Todos los resultados permanecieron dentro de la variabilidad de la prueba después de 14 semanas de almacenamiento a 5 ºC, 25 ºCy 40 ºC.

Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)

Este método separa las moléculas de proteínas solubles en la solución basándose en el tamaño y no en el peso molecular. En teoría, las moléculas pequeñas penetran cada poro pequeño de la fase estacionaria y por lo tanto eluirán más tarde. El cromatograma obtenido permite la determinación del porcentaje de área de los

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NT= No analizado; pI R: Intervalo de Pi; pMI: pI de la isoforma principal; % de AMI: % de área de la isoforma principal; No P: Número de picos.

Ejemplo 26: estudios de formulación a 50 mg/ml

Como se muestra en el Ejemplo 25 previo, el adalimumab y la variante BPC1494 de TNF-alfa a 5mg/ml en la formulación “B” pueden servir como una alternativa para la formulación “A”. Este ejemplo está enfocado en comparar la estabilidad de adalimumab en su formulación “A” comercializada en comparación con la formulación “B” y otras variantes de TNF-alfa a 50 mg/ml.

Se analizaron dos muestras de la variante BPC1494 de TNF-alfa, una expresada en células CHO DG44 y la otra expresada en células CHOK1. Se elaboró una segunda variante BPC1496 de TNF-alfa en una línea de células CHO-DG44. Todas las tres muestras se expresaron y purificaron utilizando mAb Select Sure. En contraste con el Ejemplo 25, no se efectuó el paso en columna Superdex. Adalimumab (Código de producto N 00515-01, Número de lote 02136XH12) fabricado por Abbott Laboratories, como en el Ejemplo 25. El adalimumab se formuló en las formulaciones “A” (tal como se compró) y “B” (mediante intercambio con solución amortiguadora) como se describió anteriormente en el Ejemplo 25 y las variantes de TNF-alfa (BPC1494 y 1496) se formulan en “B”, todas aproximadamente a 50 mg/ml (total de 5 muestras). Las muestras se filtraron con filtro MillexGV de 0,22 µm en condiciones de flujo laminar limpio antes de transferirse a viales de vidrio pre-esterilizados etiquetados e incubarse a 5 ºC y 40 ºC hasta por 9 semanas. En los puntos de tiempo seleccionados, las muestras se tomaron y se analizaron utilizando SEC-HPLC (Tabla 14), cIEF (Tabla 15). También se pueden efectuar otras pruebas como se describe más adelante.

Apariencia mediante observación visual

Las muestras se observaron respecto a claridad en condiciones de luz diurna. Ambos anticuerpos en ambas formulaciones permanecen sin cambio (solución incolora transparente) después de 9 semanas de almacenamiento a 5 ºC y 40 ºC.

Medición de la concentración de proteína (A280nm)

La concentración de proteína se midió utilizando un espectrómetro de nanogota, lo que es indicativo de la estabilidad de la proteína. No hubo diferencia significativa en los resultados después de 9 semanas de almacenamiento a 5 ºC y 40 ºC.

Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)

Los datos de SEC-HPLC (Tabla 13) mostraron que el adalimumab a 50 mg/ml es relativamente más estable en la formulación “B” en comparación con la formulación “A” después de almacenamiento a 40 ºC durante 9 semanas. Además, las variantes de TNF-alfa (BPC1494 y 1496) fueron relativamente tan estables o más estables en “B” como el adalimumab en “B”. No se llevó a cabo comparación entre las variantes en “A” y “B”.

Nótese que los niveles de TA Iniciales para las variantes de TNF-alfa eran relativamente más altos que para el adalimumab. Por lo tanto, los resultados incluyen una columna de % de cambio en el lado derecho para comparar los cambios desde Inicial hasta Semana 9 a 40 ºC. Por ejemplo, la Tabla 13 muestra que después de 9 semanas de almacenamiento, el porcentaje de cambio en el fragmento de peso molecular bajo total (TLMWF) en la formulación “B” estaba entre 3,82-4,96 % en comparación con 6,08 % en la formulación “A”. De manera similar, el porcentaje de cambio en monómero en la formulación “A” era mayor para adalimumab que para “B” (7,54 y 4,52 % respectivamente). Las variantes de TNF-alfa en “B” eran todas relativamente por lo menos tan estables o más estables que el adalimumab en la formulación “A” (% de cambio en la semana 9). Los resultados en la semana 4 para todas las muestras están dentro de la tolerancia de 5 % de TA y/o TLMWF para un producto comercial. Por lo tanto, “B” tiene ventajas sobre “A” tanto para las variantes de TNFalfa como para el adalimumab a 50 mg/ml.

En particular, la variante BCP1496 de TNF-alfa mostró a un valor bajo de TLMWF de 3,86 en la semana 9 a 40 ºC.

Enfoque isoeléctrico capilar (c-IEF)

Los datos de C-IEF (Tabla 15) soportan los hallazgos en la Tabla 14.

La Formulación B muestra un % de cambio reducido de % de AMI en la semana 9 para adalimumab en comparación con la Formulación A (23,53 y 27,57 respectivamente).

Las variantes de TNF-alfa en “B” son más estables en términos de heterogeneidad de carga (es decir incremento en el número de picos) que adalimumab (tanto en “A” como en “B”). Por ejemplo, en la semana 9 hubo 5 y 6 hijos para cada una de las variantes; y 6 y 9 picos para adalimumab, a 5 ºC y 40 ºC respectivamente.

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En particular, la variante BCP1496 de TNF-alfa y adalimumab, ambos en “B”, muestran un % de cambio bajo en % en AMI en la semana 9 de 25,83 y 23,53 respectivamente. El % de cambio relativamente más alto en % de AMI en la semana 9 para la variante BCP1496 de TNF-alfa (CHO DG44) de 38,13 se puede deber al % de AMI inicial relativamente alto de 75,03.

5 Pruebas de unión funcional (ELISA)

La actividad biológica de adalimumab y de las variantes de TNF-alfa en las dos formulaciones se evauó mediante Biacore. A lo largo del periodo de 9 semanas de almacenamiento a 5 ºC y 40 ºC, las muestras presentaban el mismo % de unión dentro de la variabilidad de la prueba.

Por lo tanto, se puede concluir que la formulación “B” puede servir como una alternativa para la formulación

10 “A” en un escenario clínico sin comprometer la estabilidad del anticuerpo a una concentración de dosis de 50 mg/ml.

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Ejemplo 28: análisis de unión con SPR de FcRn a anticuerpos monoclonales anti-TNFα capturados con Proteína L

El estudio se efectuó utilizando la máquina biosensora ProteOnTM XPR36 (BioRadTM), una máquina basada en plasmón de superficie diseñada para mediciones de cinética/afinidad libres de marca. La Proteína L se inmovilizó en un chip GLM (BioRad, N.º de cat.: 176-5012) mediante acoplamiento de amina primaria. Esta superficie se utilizó después para capturar los anticuerpos humanizados, después se utilizó FcRn de ser humano y de macaco de Java (ambos materiales propios) como analitos a 2048 nM, 512 nM, 128 nM, 32 nM y 8 nM, una inyección de solución amortiguadora sola (es decir 0 nM) utilizada para doble referencia de las curvas de unión. La regeneración de la superficie de la proteína L se efectuó utilizando Glicina-HCl pH 1,5. La prueba se corrió a 25 ºC y se corióe en HBS-EP pH 7,4 y HBS-EP pH 6,0 con FcRn de ser humano o de macaco de Java diluido en la solución reguladora apropiada. Las afinidades se calcularon utilizando el modelo de equilibrio, inherente al software de análisis ProteOn, utilizando una “R-máx global” para unión a pH 6,0 y la R-máx proveniente de la unión a pH 6,0 para el cálculo de la afinidad a pH 7,4. Debido a que las curvas de unión no alcanzaron la saturación a pH 7,4, los valores obtenidos probablemente no sean afinidades verdaderas sin embargo se utilizaron para clasificar la unión de los anticuerpos analizados.

La afinidad de unión de diferentes lotes de BPC1492, BPC1494 y BPC1496 para FcRn de ser humano se comparó utilizando capturas de anticuerpos por la Proteína L. La Tabla 17 mostró resultados de una serie de experimentos utilizando este formato. Los datos confirman que los BPC1494 y BPC1496 tienen una afinidad mejorada para FcRn recombinante de ser humano en comparación con BPC1492 tanto a pH 6,0 como a pH 7,4. La mejora en número de veces en la afinidad de unión de BPC1494 para FcRn en comparación con BPC1492 difiere de experimento a experimento debido a cambios en la actividad de la Proteína L en la captura. Sin embargo, en los experimentos mostrados en la Tabla 17, la mejora en número de veces en la afinidad de unión a pH 6,0 varía entre 3,5 veces y 16,3 veces. No fue posible determinar la mejora en número de veces en la afinidad de unión a pH 7,4 debido a la actividad de unión débil de IgG de ser humano para FcRn a pH neutro.

También se comparó la afinidad de unión de los diferentes lotes de BPC1492, BPC1494 y BPC1496 para FcRn de macaco de Java utilizando anticuerpos capturados con Proteína L. La Tabla 18 muestra los resultados del experimento utilizando este formato. Los datos confirman que BPC1494 tiene una afinidad mejorada para FcRn recombinante de macaco de Java en comparación con BPC1492 tanto a pH 6,0 como a pH 7,4. La mejora en número de veces en la afinidad de unión de BPC1494 (intervalo 41,8-46,8 nM) para FcRn de macaco de Java en comparación con BPC1492 (intervalo 394-398 nM) es de aproximadamente 9 veces a pH 6. No es posible determinar la mejora en número de veces en la afinidad de unión a pH 7,4 debido a la actividad de unión débil de BPC1492 para FcRn.

TABLA 17: afinidades de unión a FcRn recombinante de ser humano utilizando el método de captura con proteína L

KD de afinidad (nM)

BPC1492: BPC1494 BPC1496

Lote
Lote
Lote

Expt.: pH HEK 1406 HEK 1348 CHO grado clínico HEK 1407 HEK 1350 GRITS 42954 HEK 1352 HEK 1408 GRITS 42955

5: 6 320,0 325,0 315,0 6,08** 24,9 26,2 14,3 16,9 15,4

7,4: NAB NAB NAB 2020** 12600 11700 8980 9830 9670

4: 6 50,9 54,8 55,5 1,33 4,05 4,50 2,35 3,60 2,33

7,4: NAB NAB NAB 303 5270 4740 6820 7550 7550

3: 6 16,0 16,8 17,3 0,701 1,960 2,430 2,200 4,140 1,810

7,4: NAB NAB NAB 1760 10500 10900 7830 8050 8460

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Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la modificación M428L/N434S: 8 9

Dominio constante de IgG1 más la modificación M428L/N434S: - 10

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF (IgG1 de tipo silvestre): 11 12

Dominio constante de IgG1 (tipo silvestre): - 13

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la modificación T250Q/M428L: 14 15

Dominio de constante de IgG1 más la modificación T250Q/M428L: - 16

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la modificación V308F: 17 18

Dominio constante de IgG1 más la modificación V308F: - 19

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la modificación V259I: 20 21

Dominio constante de IgG1 más la modificación V259I: - 22

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la variante P257L y N434Y: 23 24

Dominio constante de IgG1 más la modificación P257L y N434Y: - 25

Secuencia de péptido de señal: - 26

CDRH1 de anticuerpo anti-TNF: - 27

CDRH2 de anticuerpo anti-TNF: - 28

CDRH3 de anticuerpo anti-TNF: - 29

CDRL1 de anticuerpo anti-TNF: - 30

CDRL2 de anticuerpo anti-TNF: - 31

CDRL3 de anticuerpo anti-TNF: - 32

Variante de CDRH1 de anticuerpo anti-TNF: - 33-38

Cimzia (certolizumab) LC (VL + Ck): 39

Variante de CDRH3 de anticuerpo anti-TNF: - 40-49

Variante de CDRL1 de anticuerpo anti-TNF: - 50-61

Variante de CDRL2 de anticuerpo anti-TNF: - 62-72

Variante de CDRL3 de anticuerpo anti-TNF: - 73-76

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cb2-38-VH: 93 94

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cb1-45-VL: 101 102

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cb1-39-VL: 109 110

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cb1-23-VL: 121 122

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cb1-10-VL: 125 126

cb2-1-VL: 127 128

cb2-11-VL: 129 130

cb2-40-VL: 131 132

cb2-35-VL: 133 134

cb2-28-VL: 135 136

cb2-20-VL: 137 138

cb1-3-VL: 139 140

cb2-6-VL: 141 142

cb2-44-VL: 143 144

cb1-VH variante de la cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la modificación M252Y/S254T/T256E: - 145

cb2-44-VH variante de la cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la modificación M252Y/S254T/T256E: - 146

cb1-3-VL variante de la cadena ligera de anticuerpo anti-TNF: 147 148

39

cb2-6-VL variante de la cadena ligera de anticuerpo anti-TNF: 149 150

cb2-44-VL variante de la cadena ligera de anticuerpo anti-TNF: 151 152

cb1-3-VH variante de la cadena pesada de anticuerpo anti-TNF: 153 154

cb2-44-VH variante de la cadena pesada de anticuerpo anti-TNF: 155 156

Cadena pesada de Pascolizumab que contiene las modificaciones M252Y/S254T/T256E: 157 158

Cadena ligera de Pascolizumab: 159 160

Cadena pesada de Pascolizumab: - 161

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF alternativa más la modificación M428L/N434S: 162

Dominio constante de IgG1 alternativo más la modificación M428L/N434S: 163

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF más la modificación H433K/N434F: 164

Dominio constante de IgG1 más la modificación H433K/N434F: 165

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF alternativa más la modificación H433K/N434F: 166

Dominio constante de IgG1 alternativo más la modificación H433K/N434F: 167

Cadena pesada de anticuerpo anti-TNF alternativa más la modificación M428L/N434S: 168

Dominio constante de IgG1/2 más la modificación M428L/N434S: 169

Golimumab_VH: 170

Golimumab_VL: 171

Golimumab HC: 172

Golimumab LC: 173

Remicade VH: 174

Remicade VL: 175

Remicade HC: 176

Remicade LC: 177

Cimzia (certolizumab) VH: 178

40

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Claims

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