ES2601201T3 - Cubeta desechable para recogida de sangre con composición de sonda para recuento y análisis de células - Google Patents

Abstract

Una cubeta desechable para recogida de sangre para análisis óptico de células no rojas de la sangre, comprendiendo la cubeta: una cámara de mezclado que tiene una entrada para aceptar una muestra de sangre entera, comprendiendo además la cámara de mezclado un reactivo seco capaz de disolverse al contacto con la muestra de sangre entera y que contiene una composición de sonda que comprende una pluralidad de sondas específicas para cada analito, capaz cada una de ellas de unirse específicamente a un analito celular diferente de una célula no roja de la sangre, en la cual cada sonda está caracterizada por (a) un compuesto de unión específico para un analito celular bajo condiciones de unión, y (b) una etiqueta óptica fijada al compuesto de unión, donde la etiqueta óptica de cada diferente sonda tiene una banda de excitación diferente excitable por una fuente de luz diferente y las etiquetas ópticas de todas las sondas emiten señales ópticas dentro del mismo rango de longitudes de onda detectables por un único detector; y una cámara para muestras conectada fluidamente a la cámara de mezclado de modo que una muestra en la cámara de mezclado se transfiere a la cámara para muestras por acción capilar, teniendo la cámara para muestras una pared ópticamente transmisiva y una dimensión perpendicular a ella, donde las dimensiones de la cámara para muestras perpendiculares a dicha pared ópticamente transmisiva están dentro del rango de 10 a 120 μm.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

DESCRIPCION

Cubeta desechable para recogida de sangre con composicion de sonda para recuento y analisis de celulas Antecedentes

La realizacion de ensayos en el punto de atencion y la busqueda de biomarcadores efectivos son temas importantes en la investigacion biomedica, por ejemplo, Holland et al, Curr. Opin. Microbiol., 8: 504-509 (2005); Yager et al, Nature, 442: 412-418 (2006); Frank et al. Nature Reviews Drug Discovery, 2: 566-580 (2003); Sidransky, Nature Reviews Drug Discovery, 2: 210-218 (2002). El objetivo de ambos esfuerzos es mejorar el acceso y la efectividad de la asistencia sanitaria al mismo tiempo que se reducen sus costes. Un ensayo en el punto de atencion es un ensayo analftico realizado fuera de un laboratorio central utilizando un dispositivo que se puede transportar facilmente hasta las cercamas del paciente y que se puede operar en condiciones de campo sin personal altamente especializado. En muchas aplicaciones de monitorizacion medica y de biodefensa en cuidados para enfermedades agudas, tambien son necesarios un procesamiento rapido de muestras y lecturas de los ensayos, por ejemplo, Raja et al, Clinical Chemistry, 48: 1329-1337 (2002).

Un biomarcador es una caractenstica que se mide y se evalua objetivamente como un indicador de procesos biologicos normales, de procesos patogenicos, o de respuestas farmacologicas a una intervencion terapeutica. Atkinson et al, Clin. Pharmacol. Ther. 69: 89-95 (2001). Los biomarcadores vanan mucho en su naturaleza, en la facilidad de medida, y en su correlacion con estados fisiologicos de interes, por ejemplo, Frank et al (citado anteriormente). La mayona de los dispositivos para uso en el punto de atencion estan disenados para medir biomarcadores moleculares que han sido extrafdos de una muestra o especimen o que se encuentran directamente en un fluido biologico, por ejemplo en la sangre, Holland et al (citado anteriormente). Existe interes significativo en medir de marcadores celulares en dispositivos para uso en el punto de atencion, pero los marcadores celulares requieren tfpicamente alguna forma de obtencion de imagenes o un sistema flrndico para hacer medidas espedficas para cada celula, anadiendo de este modo un desaffo tecnico significativo al que ya supone la medida de marcadores moleculares, por ejemplo, Shapiro, Cytometry A, 60A: 115-124 (2004); Shapiro et al, Cytometry A, 69A: 620-630 (2006); Rodriguez et al, pLOS Medicine, 2(7): e182 (2005); Janossy et al, Clinical Cytometry, 50: 78-85 (2002); Toner et al, Annu. Rev. Biomed. Eng., 7: 77-103 (2005); y similares.

Los ensayos en el punto de atencion se podnan llevar a cabo sobre un amplio rango de tipos de muestras, incluyendo no solo muestras procedentes de organismos individuales, tales como muestras medicas, veterinarias, o de plantas, sino tambien muestras procedentes de diversos entornos, tales como suelos, sistemas de agua, sistemas de aire acondicionado, superficies de lugares publicos, tales como sistemas de transporte, y similares. Entre las muestras medicas, los fluidos biologicos, tales como sangre, saliva, fluido del conducto lacrimal, orina, y similares, son especialmente aptos para ser utilizados con ensayos en el punto de atencion, ya que estos suelen ser mucho mas accesibles que los tejidos solidos. Entre tales fluidos biologicos a partir de los cuales se pueden obtener marcadores celulares o moleculares, la sangre es la muestra preferida, siempre que sea biologicamente relevante, porque es sistemica, es facilmente accesible, y contiene una suspension rica y dinamica de celulas y moleculas cuya composicion refleja estados de salud y enfermedad. En concreto, existe gran interes en ser capaz de contar ciertos subconjuntos de celulas no rojas de la sangre que estan correlacionados con susceptibilidades a enfermedades, avance de la enfermedad, respuesta a medicamentos, y similares, por ejemplo Guisset et al, Intensive Care Med, Epub (8 de Noviembre de 2006): Shaked et al, Curr. Cancer Drug Targets, 5: 551-559 (2005): Madjid et al, J Am. Coll. Cardiol., 44: 1945-1956 (2004): Janossy et al (citado anteriormente); Rodriguez et al (citado anteriormente). Desgraciadamente, los analizadores actualmente disponibles para estos marcadores sufren de uno o mas inconvenientes que limitan su uso generalizado, incluyendo pasos de preparacion complejos que implican separacion y/o lisis de celulas, participacion de personal especializado, falta de portabilidad, coste elevado, falta de sensibilidad, y similares.

En vista de lo anterior, varios campos medicos y biotecnologicos tendnan un avance significativo con la disponibilidad de tecnicas, capaces de operar en el punto de atencion, que permitieran medidas faciles y flexibles de marcadores celulares, en particular en fluidos biologicos, tales como la sangre.

La patente EP 1 701 150 A1 describe una cubeta que comprende un cuerpo principal y una camara para muestras. La camara para muestras se puede rellenar con una muestra a traves de la entrada por la accion capilar. En la camara para muestras se coloca un reactivo seco que sera disuelto por la muestra. Ademas, la camara para muestras comprende una pared opticamente transmisiva a traves de la cual se puede analizar la muestra.

En el documento WO 00/28297 se describe una cubeta desechable que comprende una camara de mezclado y, conectada fluidamente a ella, una camara para muestras. Ademas, la cubeta desechable comprende un componente en el cual esta contenido un reactivo. La muestra se transfiere mediante una bomba desde la entrada hasta la camara de mezclado para que se mezcle con el reactivo. Desde allf la muestra se transfiere a la camara para muestras para ser analizada.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

SUMARIO DE LA INVENCION La invencion esta dirigida a una cubeta desechable para recogida de sangre para analisis optico de celulas no rojas de la sangre, comprendiendo la cubeta (a) una camara de mezclado que tiene una entrada para aceptar una muestra de sangre entera, comprendiendo ademas la camara de mezclado un reactivo seco capaz de disolverse al contacto con la muestra de sangre entera y que contiene una composicion de sonda que comprende una pluralidad de sondas espedficas para cada analito, capaz cada una de ellas de unirse espedficamente a un analito celular diferente de una celula no roja de la sangre, donde cada sonda esta caracterizada por (i) un compuesto de union espedfico para un analito celular bajo condiciones de union, y (ii) una etiqueta optica fijada al compuesto de union, donde la etiqueta optica de cada sonda diferente tiene una banda de excitacion diferente y las etiquetas opticas de todas las sondas emiten senales opticas en el mismo rango de longitudes de onda; y (b) una camara para muestras conectada fluidamente a la camara de mezclado de manera que una muestra situada dentro de la camara de mezclado se transfiere por accion capilar a la camara para muestras, teniendo la camara para muestras una pared opticamente transmisiva y una dimension perpendicular a ella substancialmente equivalente al diametro de una celula no roja de la sangre, de modo que las senales opticas generadas por sondas fijadas a analitos celulares de la misma no sean obstruidas por celulas rojas de la sangre de la muestra. Preferiblemente, dicha dimension se selecciona de manera que substancialmente impide la formacion de una capa que obstruye la luz de celulas rojas de la sangre enucleadas entre una celula de interes y dicha pared opticamente transmisiva.

La invencion supera muchos inconvenientes de coste y eficiencia de los enfoques de la tecnica anterior para los sistemas para uso en el punto de atencion para el analisis rapido de muestras de sangre. La invencion es muy adecuada para deteccion y recuento baratos y eficientes de celulas no rojas de la sangre.

Breve Descripcion de los dibujos

La Figura 1 ilustra esquematicamente un sistema optico para ser utilizado con la invencion.

La Figura 2 ilustra esquematicamente un sistema de componentes opticos que no es parte de la presente invencion para ser utilizado con LEDs para acondicionar haces de excitacion.

La Figura 3 ilustra el principio para seleccionar etiquetas opticas para composiciones de sonda utilizadas en la invencion.

La Figura 4A muestra curvas de absorcion para dos etiquetas fluorescentes utilizadas en el ejemplo que tienen distintas bandas de excitacion pero que son capaces de emitir fluorescencia substancial dentro del mismo rango de longitudes de onda.

La Figura 4B muestra curvas de absorcion y emision de tres etiquetas fluorescentes que pueden ser excitadas secuencialmente por tres haces de excitacion diferentes y que emiten senales de fluorescencia en el rango de longitudes de onda por encima de 650 nm.

Las Figuras 5A-5C ilustran esquematicamente una realizacion de una cubeta para muestras para detectar y analizar celulas no rojas de la sangre y/u otras celulas o microorganismos en sangre entera.

La Figura 6A es una imagen de microesferas etiquetadas con ficoeritrina disponibles en el mercado situadas sobre un portaobjetos.

La Figura 6B muestra datos que demuestran la relacion lineal entre la concentracion de microesferas etiquetadas y los recuentos de microesferas.

La Figura 7A es una imagen de celulas procedentes de sangre entera etiquetadas de manera dual con anticuerpo anti-CD3 etiquetado con APC y anticuerpo anti-CD4 etiquetado con PECy5.

La Figura 7B muestra datos de la Figura 7A en un grafico en dos dimensiones de intensidad de senal APC frente a intensidad de senal PE, el cual muestra distintos agrupamientos de tres tipos de celulas, monocitos, celulas CD4+T, y celulas CD4"T.

Las Figuras 8A-8B muestran datos que comparan recuentos de celulas de sangre entera obtenidos con el aparato del Ejemplo 1 con recuentos obtenidos utilizando un citometro de flujo, ambos para diferentes profundidades de cubeta para muestras (Figura 6A) y para diferentes etiquetas con una cubeta para muestras (Figura 6B) de 50 [mu]m (de profundidad).

La Figura 9 muestra datos de un ensayo basado en microesferas para determinar la concentracion de interleucina-2.

La Figura 10 ilustra de forma esquematica un sistema optico para ser utilizado con la invencion. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La puesta en practica de la presente invencion puede emplear, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologfa molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), biologfa celular, tecnologfa de inmunoensayo, microscopfa, analisis de imagen, y qrnmica analftica, las cuales estan dentro del estado del arte de la tecnica. Dichas tecnicas convencionales incluyen, pero no estan limitadas a, componentes de deteccion de senales fluorescentes, de analisis de imagen, de seleccion de fuentes de iluminacion y de deteccion de senales opticas, de etiquetado de celulas biologicas, y similares. Dichas tecnicas convencionales y sus descripciones se pueden encontrar en manuales estandar de laboratorio tales como Genome Analysis; A Laboratory Manual Series (Vols. I- IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, y Molecular Cloning. A Laboratory Manual (todos ellos de la editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press); Murphy, Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Cuarta Edicion (Wiley-Liss, 2003): Herman et al, Fluorescence Microscopy, 2a Edicion (Springer, 1998); todos los cuales se incorporan en este documento en su totalidad por referencia a todos los efectos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La invencion proporciona una cubeta desechable para medir y contar celulas no rojas de la sangre en una muestra de sangre entera por iluminacion secuencial de la muestra con haces de iluminacion que tienen diferentes rangos de longitudes de onda que corresponden a las bandas de excitacion de etiquetas unidas o fijadas de forma directa o indirecta a las celulas de la muestra. Despues de cada iluminacion en dicha secuencia, se recogen senales opticas para formar una imagen, de manera que se forma un conjunto de imagenes, cada una de las cuales contiene datos de imagen, que se analiza para proporcionar recuentos y/o medidas de la poblacion de celulas. Se emplea una pluralidad de haces de iluminacion que tienen rangos de longitudes de onda que substancialmente no se solapan. Dicha pluralidad de haces de iluminacion puede estar dentro del rango de desde 2 hasta 6, o dentro del rango de desde 2 hasta 4, o dentro del rango de desde 2 hasta 3. Se puede generar una pluralidad de haces de iluminacion mediante una variedad de metodos y aparatos disponibles para las personas con experiencia ordinaria en la tecnica, incluyendo mediante laseres, lamparas de filamento y de arco, y similares. En un ejemplo, se generan haces de iluminacion utilizando diodos emisores de luz (LEDs), o dispositivos de estado solido similares. Ejemplos de fuentes de luz LED incluyen LEDs Luxeon TM que tienen picos de longitud de onda en verde (530 nm), en cian (505 nm), en azul (470 nm), y en azul real (455 nm), comercializados por la empresa Lumileds Lighting LLC (San Jose, CA). Orientaciones para la seleccion de LEDs concretos para ser utilizados con la invencion estan disponibles para todo el publico en la literatura tecnica, tal como la Technical Data Sheet DS23 Luxeon Star (Lumileds Lighting, EE.UU., LLC, San Jose, 2006); la Technical Data Sheet DS30 Luxeon V Star (Lumileds Lighting, Ee.UU., LLC, San Jose, CA, 20 de Septiembre de 2004); y similares. Normalmente, las fuentes de luz se utilizan con filtros convencionales y con otros componentes opticos para generar haces de iluminacion de rangos de longitudes de onda y distribuciones de intensidad deseados.

I. Sistemas Opticos

Con la invencion se pueden emplear una amplia variedad de sistemas opticos. Por lo general, dichos sistemas proporcionan uno o mas haces de iluminacion para iluminar secuencialmente una muestra en distintos rangos de longitud de onda, un dispositivo de recogida de imagenes para registrar datos de imagen de la muestra iluminada, y un controlador que controla el funcionamiento de los haces de iluminacion y del dispositivo de recogida de imagenes de manera que se recogen secuencialmente conjuntos de datos de imagen.

En un ejemplo, un sistema optico de este tipo incluye un sistema que comprende un dispositivo de recogida de imagenes utilizado en conjunto con conjuntos de tintes diferencialmente excitables fijados a sondas espedficas para celulas, partfculas, o analitos de interes de una muestra. Dicho de otra manera, un sistema de este tipo comprende un aparato de los siguientes componentes para obtener imagenes de muestras o espedmenes etiquetados con una pluralidad de etiquetas diferencialmente excitables: (a) multiples fuentes de luz, capaz cada una de ellas de iluminar el especimen con un haz de iluminacion con una banda de longitudes de onda distinta; (b) un controlador acoplado a las multiples fuentes de luz para dirigir sucesivamente el haz de iluminacion de cada fuente de luz sobre el especimen, de manera que se hace que cada una de la pluralidad de etiquetas diferencialmente excitables emita sucesivamente una senal optica dentro de la misma banda de longitudes de onda; y (c) un sistema optico capaz de recoger dichas senales opticas emitidas y de formar sucesivas imagenes correspondientes a ellas sobre una superficie sensible a la luz para formar sucesivos conjuntos de datos de imagen. Un ejemplo del aparato anterior se ilustra en la Figura 1. El sistema (100) comprende varios componentes, incluidas una pluralidad de fuentes de luz, mostradas como LED 1 (102) y LED 2 (104), para iluminar secuencialmente un area de observacion (107) de muestra (114) situada sobre o en una plataforma (116) para muestras, optica de obtencion de imagenes (106) para recoger senales (109) opticas generadas por sondas situadas en, y/o sobre, la muestra en respuesta a haces (103) y (105) de iluminacion y para dirigir (111) las senales recogidas hacia un detector (108), el cual comprende una superficie sensible a la luz, tal como un elemento CCD o CMOS, sobre la cual las senales (109) opticas forman una imagen y a partir de la cual se registran sucesivos conjuntos de datos de imagen. Preferiblemente, el funcionamiento del sistema (100) esta bajo el control del ordenador (110) que (a) controla la temporizacion y la duracion de los haces (103) y (105) de iluminacion, (b) controla al detector (108) para recoger y transferir datos de imagen a una o mas bases de datos, (c) analiza datos de imagen para producir una lectura para un componente (112) de lectura, y funcionamiento similar. La plataforma (116) para muestras puede variar ampliamente en su diseno y capacidades funcionales, pero por lo general requiere que se coloque una muestra en una geometna substancialmente plana que es consistente con la recogida de una pluralidad de senales opticas en paralelo y con la formacion de una imagen sobre un detector. Preferiblemente, una muestra situada sobre la plataforma (116) para muestras esta estatica y no fluye ni se mueve; o, si existe movimiento, este es suficientemente lento para que se puedan recoger imagenes sucesivas que se puedan alinear durante el analisis de imagen. La plataforma (116) para muestras puede comprender portaobjetos para microscopio convencionales, camaras o cubetas para muestras utilizadas en microscopfa, placas de cultivo, dispositivos microflmdicos, o similares. Como se describe con mayor detalle mas adelante, la plataforma (116) para muestras comprende una cubeta desechable que esta disenada para la deteccion de componentes celulares no-rojos en sangre entera. En un ejemplo, la plataforma (116) para muestras comprende una cubeta que tiene una camara para muestras con una geometna que permite estudiar un volumen conocido siempre que dicha cubeta se utilice con el sistema (100). En una realizacion, dicha camara para muestras tiene una geometna substancialmente plana en la cual (a) un suelo (o pared inferior) y un techo (o pared superior) son paralelos entre sf y (preferiblemente) perpendiculares a la trayectoria minima de la luz hasta la optica (106) de obtencion de imagenes y (b) la distancia perpendicular entre las paredes superior e inferior es substancialmente equivalente al diametro de las celulas o partfculas que se estan detectando. Siempre que dicha camara para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

muestras este situada dentro del area (107) de observacion, el cual es conocido o determinable, las celulas o pardculas estaran dentro de un volumen conocido (o determinable), permitiendo de ese modo medir las concentraciones de las celulas o partfculas. El termino “substancialmente equivalente” en referencia a la distancia, o dimension, perpendicular, entre las paredes superior e inferior de una camara para muestras significa que, en una muestra de sangre entera, las senales opticas procedentes de celulas o partfculas no rojas en el area (107) de observacion son detectables. En otras palabras, una capa de celulas rojas de la sangre (o de otros desechos) que pueda existir entre una celula o partfcula etiquetada y la pared superior de la camara no obstruye completamente la transmision de senales opticas. En un aspecto, cuando son etiquetadas y detectadas celulas blancas de la sangre, tales como celulas CD4+, la distancia perpendicular entre una pared superior y una pared inferior esta dentro del rango de desde 40 a 120 |im, o dentro del rango de desde 50 a 100 |im. La naturaleza del componente (112) de lectura puede variar ampliamente desde una simple pantalla numerica hasta una interfaz grafica de usuario rica en informacion. En un ejemplo, una simple lectura numerica es proporcionada por el componente (112) de lectura que proporciona recuentos de uno o mas tipos de celula o partfcula predeterminados. En otro ejemplo, las lecturas comprenden concentraciones de uno o mas tipos de celula o partfcula predeterminados. Y en otro ejemplo adicional, las lecturas comprenden simples indicadores “sf o no” en cuanto a si se han superado o no niveles (por ejemplo, recuentos o concentraciones) umbral de celulas, partfculas, u otros analitos.

Los LEDs generan haces de iluminacion, las emisiones procedentes de los LED seleccionados se pueden acondicionar utilizando componentes opticos, como se ilustra en la Figura 2 para un sistema de dos LEDs. El primer LED (202) y el segundo LED (206) tienen opticas de acondicionamiento (200) y (204), respectivamente, cada una de las cuales comprende difusor (208), lente (210), filtro paso-banda (212), y lente (216). Un objetivo de las lentes de acondicionamiento (200) y (204) es proporcionar iluminacion espacialmente uniforme de la muestra (220).

La Figura 10 ilustra un sistema optico de epi-iluminacion para ser utilizado con la invencion. El LED (1000) genera un haz de iluminacion (1002) que es colimado por una lente (1004) y dirigido hacia un espejo dicroico (1006) y a continuacion hacia un objetivo (1008). La luz procedente del haz de iluminacion (1002) es enfocada sobre la muestra (1010) en la cual etiquetas fluorescentes se excitan para emitir senales fluorescentes. Las senales fluorescentes recogidas por el objetivo (1008) son dirigidas a traves del espejo dicroico (1006), opcionalmente a traves de un filtro (1012) de emision, y a continuacion sobre una superficie (1014) sensible a la luz, en esta ilustracion, una camara de un asistente personal digital disponible en el mercado, Zire 72 Palm Pilot, el cual tambien contiene una pantalla para observar una muestra. Se pueden anadir haces de iluminacion adicionales anadiendo espejos dicroicos adicionales a lo largo del camino optico entre el objetivo (1008) y el filtro (1012) de emision.

II. Sondas Diferencialmente Excitables

La invencion utiliza composiciones de sondas diferencialmente excitables para ser utilizadas en el etiquetado de uno o mas analitos de una pluralidad de diferentes analitos en una muestra. Por lo general, las composiciones de sonda utilizadas en la invencion comprenden una mezcla de sondas espedficas para cada analito, capaz cada una de ellas de unirse espedficamente a un analito diferente, estando cada sonda caracterizada por (a) un compuesto de union espedfico para un analito, tal como por ejemplo un analito celular, bajo condiciones de union, y (b) una etiqueta optica fijada al compuesto de union, donde la etiqueta optica de cada sonda diferente tiene una banda de excitacion diferente y las etiquetas opticas de todas las sondas emiten senales opticas dentro del mismo rango de longitudes de onda. Normalmente, el ultimo rango de longitudes de onda no se solapa con ninguna de las bandas de excitacion. Preferiblemente, las etiquetas opticas son etiquetas fluorescentes, por ejemplo tintes fluorescentes, capaces de generar senales fluorescentes. Sin embargo, con la invencion se pueden utilizar otras etiquetas opticas, tales como partfculas de resonancia de plasmones, cuando se utilizan bajo condiciones de iluminacion de campo oscuro. Composiciones de sondas utilizadas en la invencion incluyen al menos una sonda espedfica para cada analito de una pluralidad de diferentes analitos. Dicha pluralidad esta dentro del rango de desde 2 hasta 8; o dentro del rango de desde 2 hasta 4; o dentro del rango de desde 2 hasta 3; o dicha pluralidad es de al menos 3; o esta dentro del rango de desde 3 hasta 4. Un rasgo importante de una composicion de sonda utilizada en la invencion es que analitos en una muestra etiquetados con diferentes sondas de la composicion se pueden detectar secuencialmente mediante la excitacion sucesiva de las etiquetas opticas de cada sonda utilizando el haz de iluminacion espedfico para dicha etiqueta optica. Normalmente, dicha excitacion sucesiva es temporalmente sin solapamiento ya que cada haz de iluminacion es dirigido a la muestra en un intervalo de tiempo diferente. Dicho de otra manera, los haces de iluminacion son dirigidos sucesivamente a una muestra, de uno en uno. Preferiblemente, durante el funcionamiento, sobre una superficie sensible a la luz de un detector se obtiene la imagen de senales opticas de cada excitacion, a partir de la cual se generan datos de imagen, almacenandose estos datos para su analisis. Cuando las senales opticas de las sondas estan restringidas a un rango de longitudes de onda estrecho, se reduce o se elimina la degradacion de la imagen debida a aberraciones cromaticas de la lente en el camino optico.

El principio de funcionamiento de una realizacion de composiciones de sondas utilizada en la invencion se ilustra en la Figura 3, la cual muestra los espectros de excitacion y de emision de etiquetas opticas de una composicion de la invencion que consiste en dos sondas. Una primera sonda tiene una etiqueta optica que emplea transferencia de energfa por resonancia por fluorescencia (FRET), donde una molecula donadora tiene espectro de absorcion o excitacion (300) (curva de trazos discontinuos) y espectro de emision (302) (curva de trazo continuo) y una molecula aceptora tiene espectro de absorcion (304) (curva de trazos discontinuos), que se solapa con (302), y espectro de emision (306) (curva de trazo continuo). Una segunda sonda tiene como una etiqueta optica una molecula

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

fluorescente con espectro de absorcion (310) (curva de trazos discontinuos) y espectro de emision (312) (curva de trazo continuo). La lmea (320) de trazos discontinuos indicaba el Kmite mas alto de longitud de onda del rango en el cual se recogen senales opticas. De esta manera, siempre que una muestra etiquetada con las sondas primera y segunda es iluminada con un primer haz (330) de iluminacion que tenga rango de longitudes de onda como el indicado, se recoge una primera senal optica que consiste en emisiones (306) de moleculas aceptoras, y siempre que dicha muestra se ilumina con un segundo haz (340) de iluminacion que tenga rango de longitudes de onda como el indicado, se recoge una segunda senal optica dentro del mismo rango de longitudes de onda, pero consistente en emisiones (312). Un par donador-aceptor de ejemplo para la primera sonda es cianina 3- aloficocianina (Cy3-APC), y una etiqueta optica de ejemplo de la segunda sonda es cianina 5 (Cy5). Etiquetas opticas de ejemplo para una composicion de tres sondas incluyen cianina 7 (Cy7) (como donador y aceptor para una primera sonda), APC-Cy7 (APC como donador y Cy7 como aceptor para una segunda sonda), y PE-Cy7 (Pe como donador y Cy7 como aceptor para una tercera sonda).

Composiciones de sonda de ejemplo adicionales para sondas de dos etiquetas y de tres etiquetas se ilustran en las Figuras 4A (descrita mas adelante) y 4B, respectivamente. La Figura 4B ilustra perfiles de longitudes de onda de excitacion y de emision para tres tintes fluorescentes y bandas de longitudes de onda de haces de iluminacion asociados de una composicion de sonda de la invencion. Los tintes son protema clorofflica peridinina (PerCP) que tiene perfil de excitacion (422) y perfil de emision (428), ficoeritrina-Cy5 (PECy5) conjugada con perfil de excitacion (424) y perfil de emision (430), y aloficocianina (APC) con perfil de excitacion (426) y perfil de emision (432). Estos tintes se pueden excitar secuencialmente aplicando haces de iluminacion que tengan longitudes de onda en los rangos de aproximadamente 420-470 nm para PerCP (434), aproximadamente 515-550 nm para PECy5 (436), y aproximadamente 590-640 nm para APC (438). Dichos haces de iluminacion se pueden generar mediante LEDs, por ejemplo, LEDs Luxeon Star de colores Azul Real, Verde, y Rojo-Naranja, respectivamente. Las senales fluorescentes generadas por las sondas se separan convenientemente de la luz dispersada utilizando un filtro (440) paso-banda que deja pasar la luz solo por encima de aproximadamente 650 nm. Los tintes anteriores se conjugan facilmente a compuestos de union, tales como anticuerpos, utilizando tecnicas convencionales, por ejemplo, Hemanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, New York, 1996).

Las composiciones de sonda pueden comprender compuestos de union etiquetados con partfculas de resonancia de plasmones (PRPs). Dichas composiciones de sonda son particularmente utiles cuando se emplean con un sistema de iluminacion de campo oscuro de manera que solo se recoge luz dispersada procedente de PRPs. Las PRPs apropiadas para ser usadas con composiciones de sonda se describen en las siguientes referencias que se incorporan por referencia: Schultz et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 996-1001 (2000); Schultz et al, Patente de EE.UU. 6.180.415; Prober et al, Patente de EE.UU. 7.122.384; y similares. En esta realizacion, los PRPs se seleccionan de manera que cada uno dispersa al maximo la luz procedente de un haz de iluminacion distinto.

III. Cubeta para Medidas de Sangre Entera

En un aspecto de la invencion, se proporciona una cubeta desechable para ser utilizada con el sistema descrito anteriormente para hacer medidas en sangre entera. En un ejemplo, se utiliza una cubeta de este tipo para contar celulas no rojas de la sangre predeterminadas, dentro de un volumen determinable; de esta forma, los recuentos de celulas o las concentraciones de dichos tipos de celulas predeterminadas se pueden proporcionar como una lectura. Por lo general, una cubeta desechable para recogida de sangre para analisis optico de celulas no rojas de la sangre de la invencion comprende (a) una camara de mezclado que tiene una entrada para aceptar una muestra de sangre entera, comprendiendo ademas la camara de mezclado un reactivo seco capaz de disolverse al contacto con la muestra de sangre entera y que contiene una composicion de sonda que comprende una pluralidad de sondas espedficas para cada analito, capaz cada una de ellas de unirse espedficamente a un analito celular diferente de una celula no roja de la sangre, donde cada sonda esta caracterizada por (i) un compuesto de union espedfico para un analito celular bajo condiciones de union, y (ii) una etiqueta optica fijada al compuesto de union, donde la etiqueta optica de cada sonda diferente tiene una banda de excitacion diferente y las etiquetas opticas de todas las sondas emiten senales opticas dentro del mismo rango de longitudes de onda; y (b) una camara para muestras conectada fluidamente a la camara de mezclado de manera que una muestra situada en la camara de mezclado se transfiere a la camara para muestras por accion capilar, teniendo la camara para muestras una pared opticamente transmisiva y una dimension perpendicular a ella substancialmente equivalente al diametro de una celula no roja de la sangre de modo que las senales opticas generadas por sondas fijadas a analitos celulares de la misma no sean obstruidas por celulas rojas de la sangre de la muestra. Preferiblemente, una cubeta desechable de este tipo se utiliza con un sistema optico como el que se ha descrito anteriormente, el cual incluye una plataforma para alojar a la cubeta de manera que tenga una posicion fija con respecto a los haces de iluminacion y a la optica de obtencion de imagenes. Dicha posicion fija alineara la optica de obtencion de imagenes de modo que se puedan recoger senales opticas de la camara para muestras de la cubeta. El diseno y la fabricacion de portamuestras desechables para observar o medir propiedades de fluidos biologicos, tal como parametros de la sangre, se describen en las siguientes referencias: patentes de EE.UU. 6.723.290; 6.869.570; 5.674.457; 5.200.152; 6.638.769; 4.088.448; y similares.

En las Figuras 5A-5C se ilustra de forma esquematica un ejemplo de una cubeta. En una forma, la cubeta (500) comprende un cuerpo (501), que puede ser de vidrio, de plastico, o de materiales similares, o de combinaciones de los mismos; y al menos una camara (502) para muestras que esta conectada a un orificio (504) de entrada por un canal (506). Para ser utilizada en medidas de sangre entera, la camara (502) para muestras puede contener un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

volumen de fluido de muestra en el rango de desde 5 hasta 100 uL, o de desde 5 hasta 50 uL. La cubeta (500) tambien puede incluir un orificio de salida (no mostrado) conectado a la camara (502) para muestras para permitir que la muestra entre en la camara sin la formacion de contrapresion. Para cargar la muestra en la camara (502) para muestras tambien se pueden emplear tecnicas alternativas, tales como accion capilar, succion, fuerza centnfuga, y similares. Un rasgo importante de la cubeta (500) es la recogida de senales opticas procedentes de un volumen (512) definido o determinable de manera que se puedan hacer determinaciones de concentracion a partir de datos de imagen, por ejemplo, de tipos de celulas seleccionados. El volumen (512) esta definido por la distancia (por ejemplo, 528 en la Figura 5C) entre la pared (514) superior y la pared (516) inferior de la cubeta (500) y el area, o campo de vision, de la optica de obtencion de imagenes, indicado por un cono (508) y una direccion (510) en la cual se recogen las senales opticas. Un rasgo importante del sistema optico de la invencion en esta realizacion es que la profundidad de campo del objetivo sea mayor o igual que la distancia (528 o 518) entre la pared (514) superior y la pared (516) inferior, de manera que se recojan las senales opticas procedentes de todos los objetos situados dentro del volumen (512). Preferiblemente, la pared (514) superior es apropiada para dejar que pasen las senales opticas para su recogida y es substancialmente paralela a la pared (516) inferior. La cubeta de la invencion incluye una camara de mezclado que comprende un reactivo seco que contiene una composicion de sonda. Reactivos secos adicionales, por ejemplo, sales, tampones, agentes de lisis si fueran necesarios, y similares, tambien pueden estar situados directamente en la camara (502) para muestras, o pueden estar contenidos en la camara de mezclado para activacion y mezclado con una muestra antes de ser transferidos a la camara (502) para muestras.

Como se ha mencionado anteriormente, la distancia entre la pared (514) superior y la pared (516) inferior es importante para el analisis de muestras de sangre entera. Si la distancia es demasiado grande, por ejemplo (518) de la Figura 5B, entonces celulas (520) rojas enucleadas de la sangre pueden obstruir (526) el paso de senales opticas generadas por los tipos de celulas de interes (522), en cuyo caso puede que no se cuenten dichas celulas, provocando una subestimacion de los numeros de celulas o de su concentracion. Como se ilustra en la Figura 5C, la distancia (518) entre la pared (514) superior y la pared (516) inferior de la camara (502) para muestras es substancialmente equivalente al diametro, o al diametro efectivo, de los tipos de celulas de interes (522), de modo que entre una celula de interes (522) y la pared (514) superior no se pueden formar capas que obstruyen de celulas rojas de la sangre enucleadas, y senales opticas procedentes de ellas (524) todas desde la camara (502) para muestras a la optica de obtencion de imagenes. En un ejemplo, la camara (502) para muestras tiene una distancia (518) substancialmente equivalente a la profundidad de campo de la optica de obtencion de imagenes. En un aspecto, la camara (502) para muestras tiene una distancia (518) en el rango de desde 10 a 100 |im, o de desde 10 a 50 |im, o de desde 20 a 50 |im.

EJEMPLO

En este ejemplo, se construyo un sistema de obtencion de imagenes para ser utilizado con la invencion y se probo dicho sistema contando celulas o partfculas en diferentes muestras. El sistema tema un diseno que segrna el que se ilustra en la Figura 1. Como detectores se emplearon dos camaras de escala de grises diferentes. La primera fue una camara Sensovation Samba EZ140 TC-cooled (20 °C por debajo de la temperatura ambiente) con 1392 x 1024 pfxeles con pixel cuadrado de 6,45 |im. La segunda camara fue una camara de vision industrial Point Grey Research Dragonfly2 con 1024 x 768 pfxeles cuadrados (4,65 |im). Se utilizaron dos disenos de lentes de obtencion de imagenes. Un diseno fue un par de lentes esfericas doblete con el filtro de excitacion situado entre ellas. Este sistema posefa un NA relativamente alto (-0,33) y funcionaba bien para campos de vision de hasta aproximadamente 2 mm. Mas alla de esta distancia, la distorsion astigmatica es apreciable y aumenta rapidamente a medida que aumenta el campo de imagen. Para tratar esta condicion, se empleo una segunda configuracion de lente. Esta fue una lente para camara comercial (Nikon 18-55mm f/3.5-5,60 LED AF-S DX Zoom) con un elemento esferico hnbrido y un elemento de dispersion extra-baja. Esta lente tiene una distorsion baja excelente, mejor profundidad de campo, y permitio la obtencion de imagenes sobre un campo de vision de 4 mm sin ningun astigmatismo detectable, aunque tiene una menor N.A. de -0,1. Esta reduccion de la eficiencia de recogida de la luz no fue suficiente para provocar ninguna disminucion detectable de la precision para la enumeracion de celulas. El diseno con la camara DragonFly2 y con la lente Nikon DX zoom es la configuracion preferida por coste y calidad de imagen.

Las fuentes, o iluminadores, de luz LED, estaban provistas cada una de su propio filtro de excitacion dentro de las carcasas de las lamparas. En el caso de iluminacion tandem de loduro de Propidio (PI) o ficoeritrina/ficoeritrina (PE/PE), la lampara es un LED Luxeon V Star de color Cian con un patron de radiacion Lambertiano, pico nominal de longitud de onda de 505 nm (semianchura espectral de +30 nm), y un flujo nominal de 570 mW a una intensidad de 700 mA. El filtro de excitacion es un filtro HQ510/50 de la empresa Chroma. Para excitacion de SYTO 17 o APC, la lampara es un LED Luxeon Ill Star de color Rojo-Naranja (patron de radiacion Lambertiano) con un pico nominal de longitud de onda de 617 nm (semianchura espectral de +18 nm) y un flujo nominal de 600 mW a una intensidad de 1400 mA. Para la luz Roja-Naranja se utilizo un filtro de emision HQ610/30 de la empresa Chroma. Se utilizaron LEDs a intensidades menores que las nominales maximas. Espedficamente, Cian a 500 mA (con ~75% del flujo maximo) y Rojo-Naranja a 700 mA (con ~55% del flujo maximo), a menos que se indique otra cosa diferente. Como se ilustra en la Figura 2, para suavizar el patron del elemento LED procedente de la luz de excitacion, delante de los LEDs se colocaron difusores holograficos (angulo de 15°, de la empresa Edmunds Scientific). Se enfoco la luz sobre el area de obtencion de imagen de la muestra mediante parejas de lentes de 25 mm de longitud focal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

A lo largo de toda esta investigacion, fue necesario utilizar algoritmos de software para procesar y analizar las imagenes para identificar microesferas, celulas u otras partfculas y para parametrizarlas en terminos de intensidad de fluorescencia y tamano de partfcula. El procesamiento de imagen se mantuvo a un mnnimo relativo para mantener la integridad de los datos en bruto originales, y solo consistio en escalar la imagen para compensar la variacion en intensidad de iluminacion en la imagen. Espedficamente, esto consistio en un algoritmo que escalaba cada pixel utilizando el fondo local comparado con el fondo promedio de la imagen completa. El tamano del fondo local se modifico de la forma apropiada para tener en cuenta el rango de tamanos esperados de las partfculas de interes y la distancia representada por cada pixel (despues de la ampliacion de la imagen). Por ejemplo, en los casos mas comunes en esta investigacion, de microesferas con diametros de 3 a 8 |im y para celulas de diametros de 7 a 15 |im, representando cada pixel 4 |im de la muestra, se descubrio que una ventana de 60 |im (anchura transversal de 15 pfxeles) funcionaba bastante bien en este sistema de ejemplo, al mismo tiempo que no consuirna excesivo tiempo de CPU para su procesamiento. Despues de que se hubo compensado la variacion de iluminacion de las imagenes, otro algoritmo busco partfculas de interes identificando maximos de intensidad locales que cumplieran reglas estadfsticas disenadas para evitar falsos positivos producidos por ruido aleatorio, partfculas extranas (polvo, etc.) y patrones estructurales de la camara para muestras (por ejemplo, lmeas de escala del hemocitometro). Principalmente, el algoritmo busca un maximo local (un pixel brillante) que este al menos 3 desviaciones estandar por encima del ruido de fondo, rodeado por un anillo de pfxeles que esten todos al menos 15 desviaciones estandar por encima del ruido de fondo, y que tiene anillos posteriores de intensidad decreciente (que permiten variacion de ruido estadfstico). Se incluyen comprobaciones adicionales para descartar identificaciones de partfculas duplicadas y la comprobacion de que los valores de desviacion estandar son razonables. Cuando se identifica una partfcula, otro algoritmo encuentra la curva Gaussiana simple (circular, no elfptica) de mejor ajuste para el perfil de intensidad de la partfcula, utilizando un algoritmo de ajuste de maxima pendiente sobre una forma de la expresion Gaussiana optimizada para este algoritmo de ajuste. Para cada partfcula identificada se informa de los parametros estandar de altura, radio, desfase y posicion X-Y, y se registran estadfsticas de ajuste (suma de cuadrados de los residuos y prueba de chi-cuadrado). A continuacion las partfculas se categorizan (o se separan por poblaciones - “gating”) basandose en su radio, altura e intensidad integrada (volumen bajo la curva Gaussiana), para separarlas en diferentes poblaciones citometricas.

La sensibilidad se demostro utilizando diversas microesferas preparadas espedficamente con bajas cantidades de moleculas de ficoeritrina (PE) unidas por cada microesfera. Estas partfculas se prepararon incubando Microesferas de Compensacion BD a-Mouse-Igk (p/n 552843 de la empresa Becton Dickinson) incubadas con mezclas de anticuerpo espedfico para antfgeno CD3 etiquetado con PE (CD3-PE) y anticuerpo espedfico para antfgeno CD3 etiquetado con biotina (CD3-biotina) en proporciones que generaron microesferas estables con muy bajos niveles de moleculas PE unidas por cada microesfera. Se obtuvieron imagenes de las microesferas con la camara DragonFly2 CCD (Point Grey Research, Vancouver, BC) para diferentes tiempos de exposicion y diferentes ajustes de ganancia interna. El numero de moleculas de PE por partfcula para las microesferas resultantes se determino escalando contra microesferas Quantibrite PE (p/n 30495 de la empresa Becton Dickinson). En este estudio, la preparacion de microesfera menos brillante (mostrada en la Figura 6A) proporciono 826 moleculas de PE por partfculas, y fue detectable frente al ruido de fondo a ganancia elevada (24 dB) y tiempo de exposicion intermedio (1 s). La microesfera de 825 moleculas de PE fue la partfcula menos brillante ensayada y representa un nivel de sensibilidad mas que adecuado para satisfacer cualquier ensayo de recuento de celulas basado en ADN (cientos de miles de fluoroforos por celula), los marcadores superficiales celulares mas relevantes tales como los antfgenos CD3 y CD4 sobre celulas T (tincion a -150.000 y -50.000 moleculas de PE por celula respectivamente), y muchas otras aplicaciones incluidos la deteccion de parasitos y los ensayos clfnicos basados en microesferas, por ejemplo, la matriz citometrica de microesferas descrita en Morgan et al, Clinical Immunol., 110: 252-266 (2004).

El rango dinamico para detectores electronicos (incluido este) se establece principalmente mediante el rango dinamico del convertidor A-D, y a continuacion se reduce por el ruido de la senal. El convertidor A-D de 12 bits de la camara Dragonfly2 establece un rango dinamico maximo teorico de 1-4096 dentro de una imagen individual. Se investigaron las caractensticas de ruido para la camara Dragonfly2, siendo el ruido de lectura y la corriente oscura los dos principales contribuyentes. Estos se midieron analizando imagenes tomadas con ganancias de 0 a 24 dB y tiempos de exposicion de entre 0 y 10 segundos. El ajuste de la intensidad de ruido calculada en las imagenes proporciono valores de ruido de lectura y de corriente oscura para cada ajuste de ganancia. El ruido aumento linealmente con la ganancia y, para un rango practico de condiciones de medida, consumio desde 1,62 bits para exposicion de 0,1 s a 0 dB de ganancia, hasta 6,24 bits para exposicion de 10 s a 24 dB de ganancia. Esto reduce el rango dinamico de una imagen individual a 1-1334 para el mejor caso o a 1-54 para el peor caso. Se observa que para este sistema, en el cual la muestra permanece estacionaria delante de la camara, el rango dinamico efectivo del instrumento se puede mejorar considerablemente tomando multiples imagenes mientras se van cambiando sobre la marcha el ajuste de ganancia del CCD y los tiempos de exposicion. Dado que la intensidad es directamente proporcional al tiempo de exposicion y a la amplificacion del CCD, en condiciones practicas esto incrementa el rango dinamico disponible en de dos a tres ordenes de magnitud.

Para ensayar esto se utilizaron microesferas Quantibrite PE, las cuales abarcan un cambio de intensidad de -100 veces. Las microesferas Quantibrite PE consisten en una mezcla de cuatro poblaciones de microesferas, cada una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de ellas con un numero medio espedfico de moleculas de PE por microesfera. De esta manera, los detectores se pueden calibrar para valores de intensidad absoluta en terminos de moleculas de PE. Asf, la poblacion mas brillante contiene (de media) 66408 moleculas de PE por microesfera, la siguiente poblacion contiene 31779 moleculas de PE por microesfera, seguida por 8612 y 863 moleculas de PE por microesfera. Se obtuvieron imagenes de las microesferas Quantibrite PE para una serie de tiempos de exposicion crecientes de 0,1 a 20 segundos y en un intervalo de ajustes de ganancia (1-15X de amplificacion). A medida que se fueron incrementando el tiempo y la ganancia, se movio la ventana del rango dinamico para detectar cada microesfera de una en una, a niveles de intensidad crecientes, hasta que se midieron todas las microesferas (Figura 9). En este metodo, la pendiente de las lmeas de mejor ajuste es proporcional al numero de moleculas de PE por microesfera y proporciona un valor mas preciso que utilizando solo imagenes individuales.

La primera aplicacion investigada en el dispositivo fue el recuento absoluto de celulas cultivadas en una camara volumetrica. Se diseno un ensayo vivo/muerto de acuerdo con los aspectos de excitacion bicolor y de rango de emision comun del instrumento, con el tinte de loduro de Propidio (PI) impermeante tinendo celulas muertas y el tinte SYTO-17 permeante tinendo todas las celulas. El PI se excito con el LED de 505 nm (Cian) detras de un filtro paso- banda 510/50 y el SYTO-17 se excito con el LED de 617 nm (Rojo-Naranja) detras de un filtro paso-banda 610/30. El filtro de emision utilizado fue un filtro paso-banda 720/150, el cual abarca aproximadamente un tercio del espectro de emision del PI y la mitad del espectro de emision del SYTO-17 (vease la Figura 4A, en la cual se ilustran los siguientes: espectro de absorcion del PI (400), espectro de emision del PI (402), espectro de absorcion del SYTO-17 (404), espectro de emision del SYTO-17 (406), primer rango de longitudes de onda de excitacion (408), segundo rango de longitudes de onda de excitacion (410), y rango de longitudes de onda (412) en el cual se recogen senales opticas).

En la investigacion se utilizaron tres lmeas celulares (A549, HeLa y U205), asf como partmulas ADN QC (p/n 349523 de Becton Dickinson, incluidos nucleos de eritrocito de pollo y nucleos de timo de ternera). Dado que la tincion de ADN es extremadamente brillante con respecto a los marcadores superficiales celulares o a las microesferas Quantibrite PE, la sensibilidad del instrumento se redujo reduciendo el tiempo de exposicion, la ganancia o la intensidad del LED de excitacion (proporcionando todos estos metodos resultados satisfactorios). La calidad y la fidelidad de imagen fue excelente para tincion de PI y de SYTO-17 (Figura 6A). El SYTO-17 puede pasar a traves de membranas celulares vivas mientras que el PI solo puede pasar a traves de membranas que hayan perdido parte de su integridad estructural. A medida que la permeabilidad de la membrana de celulas moribundas aumenta, la tincion de PI del nucleo aumenta. De esta forma, el equilibrio de la tincion de PI frente a la tincion de SYTO-17 en estas celulas puede variar desde aproximadamente 1:1 hasta intensidades de PI varias veces mayores a medidas que el PI desplaza del ADN al SYTO-17.

En la imagen resultante se diferenciaron celulas vivas y muertas para determinar de forma independiente los recuentos de celulas vivas y muertas, asf como los recuentos de celulas totales. En un estudio, celulas A549, recien tripsinizadas y separadas de un matraz de cultivo, fueron inyectadas en el interior de un medio celular DMEM a concentraciones de desde 50 hasta 500 celulas/uL. Cada muestra fue incubada con 10 |iM de SYTO-17 + 10 |iM de PI durante 10 minutos y a continuacion se transfirieron almuotas de cada muestra a una camara hemocitometrica. Se obtuvieron imagenes de la muestra en la camara hemocitometrica como se ha descrito anteriormente, y se analizaron las imagenes para conseguir recuentos de celulas vivas, muertas y totales. Los resultados de linealidad fueron excelentes (vease la Figura 6B), teniendo los tres recuentos valores de R2 de 0,99 o mejores. No se realizo ninguna optimizacion de los algoritmos de analisis de imagenes o de los procesos de separacion por poblaciones, y se observo un recuento de fondo de ~254 celulas/uL producido por falsos positivos, aunque esto se puede resolver mediante mejoras en los algoritmos de analisis y de separacion por poblaciones (“gating”).

El sistema anterior se utilizo para detectar y contar celulas CD4+ en muestras de sangre. Con muestras de sangre lisada los resultados son mejores que con citometna de flujo para la enumeracion de celulas positivas CD3-, CD4-, y CD45-. se han utilizado marcadores superficiales celulares CD3 y CD4 para identificar celulas en sangre entera, anadiendo anticuerpos etiquetados por fluorescencia anti-CD3 y anti-CD4 respectivamente con excelente calidad de imagen, como ilustran los datos mostrados en las Figuras 7A-7B y 8A-8B.

Las prestaciones del sistema anterior se ensayaron ademas contando y cuantificando senales opticas obtenidas a partir de inmunoensayos convencionales basados en microesferas. Los microesferas de un ensayo de microesferas citometrico (CBA) de la empresa BD Bioscience (San Jose, CA) para medir interleucina-2 (IL-2) se combinaron con varias concentraciones de IL-2 y se tineron con un anticuerpo etiquetado anti-IL-2 utilizando el protocolo del fabricante, por ejemplo, Morgan et al, Clinical Immunology, 110: 252-266 (2004). En lugar de analizar senales procedentes de la microesfera con un citometro de flujo, en el sistema anterior se obtuvieron imagenes de las microesferas etiquetadas, despues de lo cual se contaron y se clasificaron de acuerdo con la intensidad de senal. Los resultados se ilustran en la Figura 9.

DEFINICIONES

Por lo general, los terminos utilizados en este documento no definidos espedficamente de otra manera tienen significados que corresponden a su uso convencional en los campos relacionados con la invencion, incluidos qmmica analftica, bioqmmica, biologfa molecular, biologfa celular, microscopfa, analisis de imagen, y similares, tal

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

como se representa en los siguientes tratados: Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Cuarta Edicion (Garland, 2002); Nelson and Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, Cuarta Edicion (W.H. Freeman, 2004); Murphy, Fundamentals of Ligh Microscopy and Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Cuarta Edicion (Wiley-Liss, 2003); y similares.

El termino “analito” hace referencia a una substancia, compuesto, o componente de una muestra cuya presencia o ausencia se quiere detectar o cuya cantidad se quiere medir. Los analitos incluyen, pero no estan limitados a, peptidos, protemas, polinucleotidos, polipeptidos, oligonucleotidos, moleculas organicas, haptenos, epftopos, partes de celulas biologicas, modificaciones post-translacionales de protemas, receptores, azucares complejos, vitaminas, hormonas, y similares. Puede haber mas de un analito asociado con una unica entidad molecular, por ejemplo, diferentes puntos de fosforilacion sobre la misma protema.

El termino “Anticuerpo” o “inmunoglobulina” hace referencia a una protema, ya sea natural o producida sinteticamente por medios recombinantes o qmmicos, que es capaz de unirse espedficamente a un antfgeno o determinante antigenico concreto. Los anticuerpos suelen ser glicoprotemas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 Daltons, compuestos por dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta conectada a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el numero de conexiones de disulfuro vana entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes de disulfuro dentro de la cadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antfgeno. Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas se pueden seguir dividiendo en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, e IgA2. El termino “fragmento de anticuerpo”, y todas las variantes gramaticales del mismo, se utilizan en este documento como una parte de un anticuerpo intacto que comprende el punto de union del antfgeno o region variable del anticuerpo intacto, donde la parte esta libre de los dominios de cadena pesadas constantes (es decir, CH2, CH3, y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la region Fc del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, y Fv; diacuerpos, cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipeptido que tenga una estructura primaria que consista en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoacidos contiguos (denominado en este documento “fragmento de anticuerpo de cadena unica” o “polipeptido de cadena unica”), incluidas sin limitacion (1) moleculas Fv de cadena unica (scFv) (2) polipeptidos de cadena unica que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento de los mismos que contiene las tres CDRs del dominio variable de cadena ligera, sin una parte de cadena pesada asociada; y (3) polipeptidos de cadena unica que contienen solo una region variable de cadena pesada, o un fragmento de los mismos que contiene las tres CDRs del dominio variable de cadena pesada, sin una parte de cadena ligera asociada; y estructuras multiespedficas o multivalentes conformadas a partir de fragmentos de anticuerpo. El termino “anticuerpo monoclonal” (mAb) tal como se usa en este documento hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos substancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones que se producen de forma natural que pueden estar presentes en cantidades pequenas. Los anticuerpos monoclonales son muy espedficos, estando dirigidos contra un unico punto antigenico. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales), las cuales tfpicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epftopos), cada mAb esta dirigido contra un unico determinante en el antfgeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se pueden sintetizar mediante cultivo de hibridomas, sin contaminacion por otras inmunoglobulinas. Se pueden encontrar orientaciones para la produccion y seleccion de anticuerpos para ser utilizados en inmunoensayos en textos faciles de obtener, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988); Howard and Bethell, Basic Methods in Antibody Production and Characterization (CRC Press, 2001); Wild, editor, The Immunoassay Handbook (Stockton Press, New York, 1994), y similares.

El termino “determinante antigenico”, o “epftopo” hace referencia a un punto de la superficie de una molecula, normalmente una protema, en el cual se une una unica molecula de anticuerpo; por lo general una protema tiene varios o muchos diferentes determinantes antigenicos y reacciona con anticuerpos de muchas especificidades diferentes. Un determinante antigenico preferido es un punto de fosforilacion de una protema.

El termino “compuesto de union” hace referencia a un compuesto que es capaz de unirse espedficamente a una molecula diana concreta. Ejemplos de compuestos de union incluyen anticuerpos, lectinas, acidos nucleicos, aptameros, y similares, por ejemplo Sharon and Lis, Lectins, 2a edicion (Springer, 2006); Klussmann, The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications (John Wiley & Sons, New York, 2006).

El termino “complejo” (complex) tal como se utiliza en este documento hace referencia a un ensamblaje o agregado de moleculas en contacto directo o indirecto unas con otras. En un aspecto, el termino “contacto” o, mas en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

concreto, el termino “contacto directo” en referencia a un complejo de moleculas, o en referencia a union de especificidad o espedfica, significa que dos o mas moleculas son suficientemente cercanas para que la interaccion de dichas moleculas este dominada por interacciones de atraccion no covalentes, tales como fuerzas de Van der Waals, union por puentes de hidrogeno, interacciones ionicas e hidrofobicas, y similares. En este aspecto, un complejo de moleculas es estable ya que bajo condiciones de ensayo el complejo es termodinamicamente mas favorable que un estado no-agregado, o no-complejo, de sus moleculas componentes. Tal como se usa en este documento, el termino “complejo” suele hacer referencia a un agregado estable de dos o mas protemas. En un aspecto, un “complejo” hace referencia a un agregado estable de dos protemas, como por ejemplo un anticuerpo unido espedficamente a un determinante antigenico de una protema diana.

El termino “reactivos secos” hace referencia a reactivos de ensayo, tales como tampones, sales, compuestos activos, tales como enzimas, co-factores, y similares, o compuesto de union, tales como anticuerpos, aptameros, o similares, que se proporcionan en una formulacion deshidratada con el objetivo de mejorar la vida util en almacenamiento, la facilidad de transporte y de manipulacion, conseguir un mejor almacenamiento, y similares. La naturaleza, la composicion, y el metodo de produccion de reactivos secos vanan ampliamente y la formulacion y produccion de dichos materiales es bien conocida por las personas con experiencia ordinaria en la tecnica como evidencian las siguientes referencias: Franks et al, Patente de EE.UU. n° 5.098.893; Cole, Patente de EE.UU. n° 5.102.788; Shen et al, Patente de EE.UU. n° 5.556.771; Treml et al, Patente de EE.UU. n° 5.763.157; De Rosier et al, Patente de EE.UU. n° 6.294.365; Buhl et al, Patente de EE.UU. n° 5.413.732; McMillan, publicacion de Patente de EE.UU. 2006/0068398; McMillan et al, publicacion de Patente de EE.UU. 2006/0068399; Schwegman et al (2005), Pharm. Dev. Technol., 10: 151-173; Nail et al (2002), Pharm. Biotechnol., 14: 281-360; y similares. Los reactivos secos incluyen, pero no estan limitados a, materiales en forma de partmulas solidos y/o semi-solidos, polvos, comprimidos, cristales, capsulas y similares, que se fabrican de formas variadas. En un aspecto, los reactivos secos son materiales en forma de partmulas liofilizados. Los materiales en forma de partmulas liofilizados pueden tener composiciones uniformes, donde cada material en forma de partmulas tiene la misma composicion, o puede tener composiciones diferentes, de tal manera que dos o mas tipos diferentes de materiales en forma de partmulas liofilizados con composiciones diferentes esten mezclados entre sf Los materiales en forma de partmulas liofilizados pueden contener reactivos para todos o parte de una amplia variedad de ensayos y de reacciones bioqmmicas, incluidos inmunoensayos, ensayos basados en enzimas, ensayos de substrato de enzima, reacciones de secuenciacion de ADN, y similares. En un aspecto, un material en forma de partmulas liofilizado de la invencion comprende un excipiente y al menos un reactivo de un ensayo. Los materiales en forma de partmulas liofilizados se pueden fabricar en tamanos y formas predeterminados, los cuales pueden estar determinados por el tipo de ensayo que se este realizando, el volumen de reaccion deseado, la velocidad de disolucion deseada, y similares. Los reactivos secos pueden incluir excipientes, los cuales suelen ser substancias inertes anadidas a un material para conferir a dicho material una consistencia o forma apropiada. Un gran numero de excipientes son conocidos por las personas con experiencia en la tecnica y pueden comprender varias estructuras qmmicas diferentes. Ejemplos de excipientes, que se pueden utilizar en la presente invencion, incluyen carbohidratos, tales como la sacarosa, la glucosa, la trehalosa, la melezitosa, el dextrano, y el manitol; protemas tales como BSA, gelatina, y colageno; y polfmeros tales como PEG y pirrolidona polivimlica (PVP). La cantidad total de excipiente en el material en forma de partmulas liofilizado puede comprender compuestos individuales o multiples. En algunas realizaciones, el tipo de excipiente es un factor en el control de la cantidad de higroscopia de un reactivo seco. Una disminucion de la higroscopia puede mejorar la integridad del reactivo seco y sus capacidades crioprotectoras. Sin embargo, eliminar toda el agua de una composicion como esta tendna efectos perjudiciales en aquellos componentes de reaccion, por ejemplo protemas, que requieran ciertas cantidades de agua unida para mantener conformaciones correctas.

El termino “lectura” hace referencia a un parametro, o parametros, que son medidos y/o detectados y que se pueden convertir en un numero o valor. En algunos contextos, el termino lectura se puede referir a una representacion numerica real de dichos datos recogidos o registrados. Por ejemplo, una lectura de senales de intensidad fluorescente obtenida de una micromatriz es la posicion e intensidad de fluorescencia de una senal que esta siendo generada en cada punto de hibridacion de la micromatriz; de esta manera, dicha lectura se puede registrar o almacenar de diferentes maneras, por ejemplo, como una imagen de la micromatriz, como una tabla de numeros, o de maneras similares.

El termino “muestra” hace referencia a una cantidad de material procedente de una fuente biologica, medioambiental, medica, o de un paciente en la cual se busca la deteccion o medida de celulas, partmulas, microesferas, y/o analitos diana. El termino “muestra” incluye muestras biologicas, por ejemplo, una cantidad de sangre, un cultivo microbiologico, o similares; muestras medioambientales, por ejemplo, una muestra de suelo o de agua; muestras o espedmenes medicos, por ejemplo, una cantidad de sangre o tejido; o similares. Una muestra puede incluir un especimen de origen sintetico. Las muestras biologicas pueden ser animales, incluyendo humanas, fluidas, solidas (por ejemplo, heces) o tejido, asf como productos alimenticios lfquidos y solidos para personas o para animales e ingredientes tales como productos lacteos, carne y derivados carnicos, y desperdicios. Las muestras biologicas pueden incluir materiales tomados de un paciente incluidos, pero no limitado a, cultivos, sangre, saliva, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido pleural, leche, linfa, esputos, semen, aspirados con agujas, y similares. Se pueden obtener muestras biologicas de todas las diferentes familias de animales domesticos, asf como de animales silvestres o salvajes, incluidos, pero no limitado a, animales tales como ungulados, osos, peces, roedores, etc. Las muestras medioambientales incluyen material medioambiental tal como materia superficial, suelo, agua y muestras

5

10

15

20

25

industriales, as^ como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipamiento, utensilios, artfculos desechables y no-desechables para el procesamiento de alimentos y de productos lacteos. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitativos de los tipos de muestra aplicables a la presente invencion. Los terminos “muestra” y “especimen” se utilizan de modo intercambiable.

El termino “espedfico” o “especificidad” en referencia a la union de una molecula con otra molecula hace referencia al reconocimiento, contacto, o formacion de un complejo estable entre las dos moleculas , junto con substancialmente menos reconocimiento, contacto, o formacion de complejo de esa molecula con otras moleculas. En un aspecto, el termino “espedfico” en referencia a la union de una primera molecula con una segunda molecula significa que en la medida en que la primera molecula reconoce a otras moleculas y forma un complejo con ellas en una reaccion o muestra, forma el mayor numero de los complejos con la segunda molecula. Preferiblemente, este mayor numero es al menos un treinta por ciento. Por lo general, las moleculas implicadas en un suceso de union espedfico tienen areas sobre sus superficies y/o, en el caso de protemas, en cavidades, que dan origen a reconocimiento espedfico entre las moleculas que se unen entre sf Ejemplos de union espedfica/os incluyen interacciones anticuerpo-antfgeno, interacciones enzima-substrato, formacion de duplexes o triplexes entre polinucleotidos y/u oligonucleotidos, interacciones receptor-ligando, y similares.

Tal como se usa en este documento, el termino “contacto” en referencia a medios de union de especificidad o espedficos significa que dos moleculas estan suficientemente cerca para que interacciones qmmicas no-covalentes debiles, tales como fuerzas de Van der Waals, enlaces por puentes de hidrogeno, interacciones de apilamiento de bases, interacciones ionicas e hidrofobicas, y similares, dominen la interaccion de las moleculas.

Las ensenanzas anteriores tienen el objetivo de ilustrar la invencion y de no limitar por sus detalles el alcance de las reivindicaciones de la invencion. Aunque se describen realizaciones ilustrativas preferidas de la presente invencion, para una persona con experiencia en la tecnica resultara evidente que se pueden hacer diversos cambios y modificaciones en ellas sin salirse del alcance de la invencion, como definen las reivindicaciones adjuntas.

Claims (6)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Una cubeta desechable para recogida de sangre para analisis optico de celulas no rojas de la sangre, comprendiendo la cubeta:

   una camara de mezclado que tiene una entrada para aceptar una muestra de sangre entera, comprendiendo ademas la camara de mezclado un reactivo seco capaz de disolverse al contacto con la muestra de sangre entera y que contiene una composicion de sonda que comprende una pluralidad de sondas espedficas para cada analito, capaz cada una de ellas de unirse espedficamente a un analito celular diferente de una celula no roja de la sangre, en la cual cada sonda esta caracterizada por (a) un compuesto de union espedfico para un analito celular bajo condiciones de union, y (b) una etiqueta optica fijada al compuesto de union, donde la etiqueta optica de cada diferente sonda tiene una banda de excitacion diferente excitable por una fuente de luz diferente y las etiquetas opticas de todas las sondas emiten senales opticas dentro del mismo rango de longitudes de onda detectables por un unico detector; y

   una camara para muestras conectada fluidamente a la camara de mezclado de modo que una muestra en la camara de mezclado se transfiere a la camara para muestras por accion capilar, teniendo la camara para muestras una pared opticamente transmisiva y una dimension perpendicular a ella, donde las dimensiones de la camara para muestras perpendiculares a dicha pared opticamente transmisiva estan dentro del rango de 10 a 120 |im.
2. 2. La cubeta desechable para recogida de sangre de la reivindicacion 1, en la cual dicha dimension impide substancialmente la formacion de una capa que obstruye la luz de celulas rojas de la sangre enucleadas entre una celula de interes y la citada pared opticamente transmisiva.
3. 3. La cubeta desechable para recogida de sangre de la reivindicacion 1, en la cual la dimension de la camara para muestras perpendicular a una pared opticamente transmisiva esta dentro del rango de 40 a 120 |im.
4. 4. La cubeta desechable para recogida de sangre de la reivindicacion 1, en la cual la dimension de la camara para muestras perpendicular a una pared opticamente transmisiva esta dentro del rango de 50 a 100 |im.
5. 5. La cubeta desechable para recogida de sangre de la reivindicacion 1, en la cual la dimension de la camara para muestras perpendicular a una pared opticamente transmisiva esta dentro del rango de 10 a 100 |im.
6. 6. La cubeta desechable para recogida de sangre de la reivindicacion 1, en la cual la dimension de la camara para muestras perpendicular a una pared opticamente transmisiva esta dentro del rango de 20 a 50 |im.