BRPI0807971B1

BRPI0807971B1 - Sistema e cubeta descartável de coleta de sangue para análise óptica de células não vermelhas de sangue

Info

Publication number: BRPI0807971B1
Application number: BRPI0807971-4A
Authority: BR
Inventors: Edward Goldberg; Jeff Brooker
Original assignee: Becton, Dickinson And Company
Priority date: 2007-01-26
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2019-10-08
Also published as: EP2109765A2; US20130045529A1; US20100261197A1; JP2015038513A; AU2008207835B2; ES2601201T3; EP2439515A2; US8248597B2; US9097640B2; WO2008092075A3; EP2439515B1; WO2008092075A2; BRPI0807971A2; AU2008207835A1; CA2676077C; JP2010517046A; CA2676077A1; US7738094B2; US20080212069A1; EP2439515A3

Abstract

sistema e cubeta descartável de coleta de sangue para análise óptica de células não vermelhas de sangue a presente invenção proporciona um sistema de baixo custo à base e imagem para detectar, medir e/ou contar características marcadas de amostras biológicas, particularmente espécimes de sangue. em um aspecto, a invenção inclui um sistema para a imagiologia de múltiplas características de um espécime que inclui uma ou mais fontes luminosas capazes de sucessivamente gerar feixes de iluminação possuindo cada uma, uma distinta faixa de comprimento de onda e uma pluralidade de marcas diferencialmente excitáveis capaz de marcar um espécime compreendendo múltiplas características, tal que cada diferentes característica é marcada com uma diferente marca diferentemente excitável. o sistema da invenção pode adicionalmente incluir um controlador operacionalmente associado com uma ou mais fontes luminosas para direcionar sucessivamente feixes de iluminação por sobre o espécime tal que cada uma das diferentes marcas diferencialmente excitáveis sejam sucessivamente induzidas a emitir um sinal óptico dentro da mesma faixa de comprimento de onda, um sistema óptico capaz de coletar tais sinais ópticos emitidos e formando sucessivas imagens correspondentes às características marcadas do espécime sobre uma superfície responsiva à luz para formar sucessivos conjuntos de dados de imagem provenientes, e uma cubeta descartável para a coleta e análise óptica de células não vermelhas do sangue.

Description

SISTEMA E CUBETA DESCARTÁVEL DE COLETA DE SANGUE PARA ANÁLISE ÓPTICA DE CÉLULAS NÃO VERMELHAS DE SANGUE”

Fundamentos [001]A realização de testes em testes laboratoriais remotos junto ao paciente e a pesquisa quanto a biomarcadores eficazes são temas importantes na pesquisa biomédica, por exemplo, Holland et al, Curr. Opin. Microbiol., 8: 504-509 (2005); Yager et al, Nature, 442: 412-418 (2006); Frank et al, Nature Reviews Drug Discovery, 2: 566-580 (2003); Sidransky, Nature Reviews Drug Discovery, 2: 210-218 (2002). Ambos os esforços são objetivados para melhorar o acesso e a eficácia dos cuidados de saúde ao mesmo tempo em que reduzindo seus custos. A realização de testes em testes laboratoriais remotos junto ao paciente é a realização de testes analíticos realizados fora de um laboratório central, utilizando um dispositivo que pode ser facilmente transportado até as proximidades do paciente e que possa ser operado sob as condições de campo sem pessoal altamente especializado. Em muitas aplicações de monitoramento de cuidados médicos agudos e de bio-defesa, o rápido processamento da amostra e a obtenção das leituras são também requeridas, por exemplo, Raja et al, Clinical Chemistry, 48: 1329-1337 (2002).

[002]Um biomarcador é uma característica que é objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos usuais, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas a uma intervenção farmacêutica, Atkinson et al, Clin. Pharmacol. Ther., 69: 89-95 (2001). Biomarcadores variam amplamente em natureza, facilidade de medição, e correlação com os estados fisiológicos de interesse, por exemplo, Frank et al (cited acima de). A maioria dos dispositivos de testes laboratoriais remotos junto ao paciente são projetados para medir biomarcadores moleculares que tenham sido extraídos de uma amostra ou espécime ou que são encontrados diretamente em um fluido biológico, tal como sangue, Holland et al (mencionado acima). Existe um significativo interesse na medição de marcadores celulares em dispositivos de testes laboratoriais remotos junto ao paciente, porém marcadores celulares requerem tipicamente alguma forma de imagiologia ou um sistema fluido a fim de produzir medições célula-específicas, acrescentando desse modo um significativo desafio técnico sobre aquele imposto pela medição de marcadores moleculares, por exemplo, Shapiro, Cytometry A, 60A: 115-124 (2004); Shapiro et al, Cytometry A, 69A: 620-630 (2006); Rodriquez et al, PLOS Medicine, 2(7): e182 (2005); Janossy et al, Clinical Cytometry, 50: 78-85 (2002); Toner et al, Annu. Rev. Biomed. Eng., 7: 77-103 (2005); e semelhantes.

[003]Testes em testes laboratoriais remotos junto ao paciente podem ser realizados em uma ampla faixa de tipos de amostras, incluindo não somente amostras provenientes de organismos individuais, tal como amostras clínicas, veterinárias, ou de vegetais, mas também amostras provenientes de diversos ambientes, tais como de terrenos, sistemas

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2/24 aquosos, sistemas de condicionamento de ar, superfícies em lugares públicos, tal como sistemas de transporte, e semelhantes. Em meio às amostras clínicas, fluidos biológicos, tal como sangue, saliva, fluido do canal lacrimal, urina, e semelhantes, são especialmente propensos para uso com ensaios de testes laboratoriais remotos junto ao paciente, na medida em que eles são usualmente muito mais acessíveis que tecidos sólidos. Em meio a tais fluidos biológicos a partir dos quais os marcadores celulares ou moleculares podem ser obtidos, o sangue é uma amostra de escolha, a qualquer momento biologicamente relevante, porque ela é sistêmica, ela é facilmente acessível, e ela contém uma suspensão rica e dinâmica de células e moléculas cuja composição reflete os estados de saúde e de doença. Em particular, existe um grande interesse em ser capaz de contar certos subconjuntos de células não vermelhas do sangue que estejam correlacionadas com suscetibilidades quanto à doenças, progressão da doença, responsividade ao fármaco, e semelhantes, por exemplo, Guisset et al, Intensive Care Med., Epub (November 8, 2006); Shaked et al, Curr. Cancer Drug Targets, 5: 551-559 (2005); Madjid et al, J. Am. Coll. Cardiol., 44: 1945-1956 (2004); Janossy et al (cited acima de); Rodriquez et al (cited acima de). Infelizmente, os analisadores atualmente disponíveis para tais marcadores sofrem de uma ou mais desvantagens que limitam seu uso mais amplo, incluindo etapas complexas de preparação envolvendo separação e/ou lise celular, envolvimento de pessoal especializado, falta de portabilidade, alto custo, falta de sensibilidade, e semelhantes.

[004]Em vista do acima, diversos campos médicos e de biotecnologia poderiam avançar significativamente com a disponibilidade de técnicas, capazes de operação de testes laboratoriais remotos junto ao paciente, que permitissem medições fáceis e flexíveis dos marcadores celulares, particularmente em fluidos biológicos, tal como sangue.

Sumário da Invenção [005]A presente invenção proporciona um sistema de base por imagiologia de baixo custo para detectar, medir e/ou contar características marcadas de amostras biológicas, particularmente espécimes de sangue.

[006]Em um aspecto, a invenção inclui um sistema para a imagiologia de múltiplas características de um espécime compreendendo os elementos apresentados a seguir: (a) uma ou mais fontes luminosas capazes de gerar sucessivamente feixes de iluminação cada possuindo um, uma distinta faixa de comprimento de onda; (b) uma pluralidade de marcas diferencialmente excitáveis capazes de marcar um espécime compreendendo múltiplas características, tal que cada característica diferente seja marcada com uma diferente marca diferencialmente excitável; (c) um controlador operacionalmente associado com a uma ou mais fontes luminosas para direcionar sucessivamente feixes de iluminação por sobre a amostra tal que cada uma das diferentes marcas diferencialmente excitáveis sejam sucessivamente induzidas a emitir um sinal óptico dentro da mesma faixa de comprimento

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3/24 de onda; e (d) um sistema óptico capaz de coletar tais sinais ópticos emitidos e formar sucessivas imagens correspondentes às características marcadas de uma amostra sobre uma superfície responsiva à luz para formar sucessivos conjuntos de dados de imagem deles provenientes.

[007]Em um outro aspecto, a invenção inclui um equipamento para analisar em uma amostra de sangue células não vermelhas marcadas com uma pluralidade marcas diferencialmente excitáveis, tal equipamento compreendendo: (a) uma câmara de amostra capaz de conter uma amostra de sangue e possuindo uma dimensão ao longo de um eixo de coleta de luz que impede a formação de uma camada obstrutiva à luz das células vermelhas do sangue; (b) múltiplas fontes luminosas cada uma capaz de iluminar uma amostra de sangue com um feixe de iluminação possuindo uma distinta faixa de comprimento de onda; (c) um controlador acoplado a múltiplas fontes luminosas para direcionar sucessivamente o feixe de iluminação de cada fonte luminosa por sobre a amostra tal que cada um da pluralidade de marcas diferencialmente excitáveis sejam sucessivamente induzidas a emitir um sinal óptico dentro da mesma faixa de comprimento de onda; (d) um sistema óptico capaz de coletar tais sinais ópticos emitidos e formando sucessivas imagens correspondentes a estas em uma superfície responsiva à luz para formar sucessivos conjuntos de dados de imagem, em que as células não vermelhas no espécime de sangue são contadas mediante análise dos sucessivos conjuntos de tais dados de imagem.

[008]Em um outro aspecto, a invenção inclui uma composição de sonda para uso em marcar um ou mais de uma pluralidade de diferentes analitos celulares em uma amostra, compreendendo uma mistura de sondas analito-específicas, cada uma capaz de se ligar especificamente a um diferente analito, em que cada sonda é caracterizada por (a) um composto ligante específico para um analito celular sob condições de ligação, e (b) anexado ao composto ligante uma marca óptica, a marca óptica de cada diferente sonda possuindo uma diferente faixa de excitação e as marcas ópticas de todas as sondas emitindo sinais ópticos dentro da mesma faixa de comprimento de onda. Preferivelmente, tal mesma faixa de comprimento de onda é separada das faixas de excitação as marcas ópticas da composição da sonda.

[009]Em um outro aspecto, a invenção inclui uma cubeta descartável para coleta de sangue para análise óptica de células não vermelhas do sangue, a cubeta que compreende (a) uma câmara de mistura possuindo uma entrada para receber uma amostra de sangue integral, uma câmara de mistura adicionalmente compreendendo um reagente seco capaz de se dissolver ao contato com a amostra de sangue integral e contendo uma composição de sonda que compreende uma pluralidade de sondas analito-específicas, cada uma capaz de se ligar especificamente a um diferente analito celular de uma célula sanguínea não

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4/24 vermelha, em que cada sonda é caracterizada por (i) um composto ligante específico para um analito celular sob condições de ligação, e (ii) anexado ao composto ligante uma marca óptica, em que a marca óptica de cada diferente sonda possui uma diferente faixa de excitação e as marcas ópticas de todas as sondas emitem sinais ópticos dentro da mesma faixa de comprimento de onda; e (b) uma câmara de amostra conectada de modo fluido a uma câmara de mistura tal que uma amostra na câmara de mistura é transferida para uma câmara de amostra pela ação de capilares, uma câmara de amostra possuindo uma parede oticamente transmissiva e uma dimensão perpendicular a esta substancialmente equivalente ao diâmetro de uma célula sanguínea não vermelha tal que sinais ópticos gerados pelas sondas anexados aos seus analitos celulares não são obstruídos pelas células vermelhas de sangue da amostra. Preferivelmente, a referida dimensão é selecionada tal que ela substancialmente impede a formação de uma camada obstrutiva à luz de células vermelhas sanguíneas enucleadas entre uma célula de interesse e a referida parede oticamente transmissiva.

[0010]Em ainda um outro aspecto, a invenção inclui uma cubeta descartável para coleta de sangue for análise óptica de células não vermelhas do sangue, em que a cubeta compreende (a) uma câmara de amostra capaz de receber uma amostra de sangue integral, uma câmara de amostra estando disposta em um corpo e possuindo pelo menos uma parede oticamente transmissiva e uma dimensão perpendicular a esta substancialmente equivalente ao diâmetro de uma célula sanguínea não vermelha tal que sinais ópticos gerados pelas sondas anexadas aos seus analitos celulares não sejam obstruídas pelas células vermelhas de sangue da amostra; e (b) um reagente seco na câmara de amostra que quando da combinação com a amostra se dissolve para formar uma composição de sonda que compreende uma pluralidade de sondas analito-específicas, cada uma capaz de se ligar especificamente a um diferente analito celular de uma célula sanguínea não vermelha, em que cada sonda é caracterizada por (i) um composto ligante específico para um analito celular sob condições de ligação, e (ii) anexado ao composto ligante uma marca óptica, em que a marca óptica de cada diferente sonda possui uma diferente faixa de excitação e as marcas ópticas de todas as sondas emitem sinais ópticos dentro da mesma faixa de comprimento de onda.

[0011]Em um outro aspecto, a invenção inclui um equipamento para imagiologia de espécimes marcadas com uma pluralidade de marcas fluorescentes, o equipamento compreendendo os elementos seguintes: (a) um ou mais diodos emissores de luz capaz de iluminar uma amostra, cada diodo emissor de luz gerando um feixe de iluminação com uma distinta faixa de comprimento de onda; (b) um controlador acoplado a diodos emissores de luz para direcionar seus feixes de iluminação por sobre a amostra tal que cada um da pluralidade de marcas fluorescentes seja induzida a emitir em seguida a um sinal óptico; e

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5/24 (c) um sistema óptico capaz de coletar os sinais ópticos emitidos e formando uma imagem correspondente a estes sobre uma superfície responsiva à luz para produzir dados de imagem, em que o sistema óptico inclui uma câmera a cores capaz de capturar múltiplos sinais ópticos possuindo diferente comprimentos de onda. Preferivelmente, o referido um ou mais diodos emissores de luz é uma pluralidade de diodos emissores de luz, e o referido sistema óptico produz uma pluralidade de conjuntos de dados de imagem, cada tal conjunto correspondendo aos sinais ópticos gerados em resposta à iluminação por um diferente dos referidos diodos emissores de luz.

[0012]A invenção supera muitas das desvantagens de custos e de eficiência das abordagens da arte existente de abordagem para os sistemas de testes laboratoriais remotos junto ao paciente para rápida análise das amostras médicas e ambientais, incluindo sangue, saliva, urina, e semelhantes. Modalidades particulares da invenção são bem adequadas para a detecção e contagem eficiente e de baixo custo de uma variedade de componentes celulares/ou patógenos que possam estar presentes no sangue integral, incluindo, mas não limitado a, células não vermelhas do sangue, linfócitos, tal como Células CD3+, Células CD4+, Células CD8+, parasitas do sangue, tal como malária, e semelhantes.

Breve Descrição dos Desenhos [0013]Fig. 1 ilustra em diagrama um sistema óptico para uso com a invenção.

[0014]Fig. 2 ilustra em diagrama um sistema de componentes ópticos para uso com LEDs para condicionar feixes de excitação.

[0015]Fig. 3 ilustra o princípio par selecionar marca ópticas para composições de sonda da invenção.

[0016]Fig. 4A mostra curvas de absorção para duas marcas fluorescentes usadas no exemplo que possuem distintas faixas de excitação, mas que são capazes de emitir substancial fluorescência dentro da mesma faixa de comprimento de onda.

[0017]Fig. 4B mostra curvas de absorção e emissão de três marcas fluorescentes que podem ser seqüencialmente excitadas por três diferentes feixes de excitação e que emitem sinais de fluorescência na faixa de comprimento de onda acima de 650 nm.

[0018]Fig. 5A-5C ilustra em diagrama uma modalidade de uma cubeta de amostra para uso com a invenção para detectar e analisar células não vermelhas do sangue e/ou outras células ou microorganismos no sangue integral.

[0019]Fig. 6A é uma imagem gotas marcadas com ficoeritrina comercialmente disponíveis, dispostas em uma lâmina.

[0020]Fig. 6B mostra dados de demonstram o relacionamento linear entre a concentração das gotas marcadas e a contagem das gotas.

[0021]Fig. 7A é uma imagem de células provenientes de sangue integral duplamente marcadas com anticorpo anti-CD3 APC-marcadas e anticorpo anti-CD4 PECy5

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6/24 marcadas.

[0022]Fig. 7B mostra dados da Figura 5A em um gráfico bidimensional da intensidade do sinal APC versus intensidade do sinal PE, que mostra distintos agrupamentos de três tipos de células, monócitos, células CD4+ T, e células CD4- T.

[0023]As Figuras 8A-8B mostram dados comparando as contagens de células de sangue integral provenientes do equipamento do Exemplo 1 para contagens obtidas utilizando um citometro de fluxo, tanto para diferentes profundidades da cubeta de amostra (Fig. 6A) e para diferentes marcas com uma cubeta de amostra de 50 μm (profundidade) (Fig. 6B).

[0024]Fig. 9 mostra dados de um ensaio baseado em gotas para a concentração de interleucina-2.

[0025]Fig. 10 ilustra em diagrama um sistema óptico para uso com a invenção.

Descrição Detalhada da Invenção [0026]A prática da presente invenção pode empregar, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais da biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), biologia celular, tecnologia de imunoensaios, microscopia, análises por imagem, e química analítica, as quais estão dentro do conhecimento da arte. Tais técnicas convencionais incluem, mas não estão limitadas a, detecção de sinais fluorescentes, análise por imagem, seleção das fontes de iluminação e componentes de detecção do sinal óptico, marcação das células biológicas, e semelhantes. Tais técnicas convencionais e descrições podem ser encontradas em manuais padrões de laboratório tal como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Utilizando Anticorpos: A Laboratory Manual, Células: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, e Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Murphy, Fundamentals of Light Microscopy e Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Fourth Edition (Wiley-Liss, 2003); Herman et al, Fluorescência Microscopy, 2nd Edition (Springer, 1998); todos os quais são aqui incorporados em suas totalidades por referência, para todos os propósitos.

[0027]A invenção proporciona sistemas, métodos e composições para medir e contar células, micelas, partículas, e/ou analitos em uma amostra mediante iluminar sequencialmente a amostra com feixes de iluminação possuindo diferentes faixas de comprimentos de ondas que correspondam às faixas de excitação das marcas diretamente ou indiretamente unidas ou anexadas aos analitos, células, ou partículas na amostra. Após cada iluminação em uma tal sequência, sinais ópticos são coletados para formar uma imagem, tal que um conjunto de imagens são formados cada um contendo dados de imagem que são analisados para proporcionar contagens e/ou medições da população de células, partículas, e/ou analitos. Em um aspecto, uma pluralidade de feixes de iluminação é

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7/24 empregado que possui faixas de comprimento de onda que substancialmente não se sobrepõem. Tal pluralidade de feixes de iluminação pode estar na faixa de 2 a 6, ou na faixa de 2 a 4, ou na faixa de 2 a 3. Uma pluralidade de feixes de iluminação pode ser gerada por uma variedade de métodos e equipamento disponíveis por aqueles usualmente versados na técnica, incluindo lâmpadas por lasers, filamento e arco, e semelhantes. Em uma modalidade, feixes de iluminação são gerados utilizando diodos emissores de luz (LEDs), ou dispositivos semelhantes em estado sólido. Fontes luminosas LED representativas incluem LuxeonTM LEDs que possui picos de comprimentos de onda em verde (530 nm), ciano (505 nm), azul (470 nm), e azul Royal (455 nm), comercialmente disponíveis da Lumileds Lighting LLC (San Jose, CA). A orientação na seleção de LEDs particulares para uso com a invenção está amplamente disponível na literatura técnica, tal como Luxeon Star Technical Data Sheet DS23 (Philips Lumileds Lighting Company, San Jose, 2006); Luxeon Star V Technical Dados Sheet DS30 (Lumileds Lighting, U.S., LLC, San Jose, CA, September 20, 2004); e semelhantes. Usualmente, fontes luminosas são usadas com filtros convencionais e outros componentes ópticos para gerar feixes de iluminação de desejadas faixas de comprimento de ondas e de distribuição de intensidade.

[0028]I. Sistema ópticos [0029]Uma ampla variedade de sistema ópticos pode ser empregada com a invenção. No geral, tais sistemas proporcionam um ou mais feixes de iluminação para seqüencialmente iluminar uma amostra em distintas faixas de comprimentos de ondas, um dispositivo de coleta de imagem para registrar dados de imagem provenientes da amostra iluminada, e um controlador que controla a operação dos feixes de iluminação e dispositivo de coleta de imagem tal que conjuntos de dados de imagem sejam coletados seqüencialmente.

[0030]Em um aspecto, a invenção inclui um sistema compreendendo um dispositivo de coleta de imagem usado de acordo com os conjuntos de corantes diferencialmente excitáveis anexados a sondas específicas para células, partículas, ou analitos de interesse em uma amostra. Em outras palavras, um tal sistema compreende um equipamento dos seguintes componentes para a imagiologia de amostras ou de espécimes marcadas com uma pluralidade marcas diferencialmente excitáveis: (a) múltiplas fontes luminosas cada uma capaz de iluminar uma amostra com um feixe de iluminação possuindo uma distinta faixa de comprimento de onda; (b) um controlador acoplado a múltiplas fontes luminosas para direcionar sucessivamente o feixe de iluminação de cada fonte luminosa por sobre a amostra tal que cada um da pluralidade de marcas diferencialmente excitáveis sejam sucessivamente induzidas a emitir um sinal óptico dentro da mesma faixa de comprimento de onda; e (c) um sistema óptico capaz de coletar tais sinais ópticos emitidos e formando sucessivas imagens correspondente a estes sobre uma superfície responsiva à luz para

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8/24 formar sucessivos conjuntos de dados de imagem. Uma modalidade do equipamento acima é ilustrada na Figura 1. O sistema (100) compreende diversos componentes, incluindo uma pluralidade de fontes luminosas, apresentadas como LED 1 (102) e LED 2 (104), para sequencialmente iluminar a área de observação (107) da amostra (114) disposta sobre ou na plataforma de amostra (116), ópticas de imagiologia (106) para coletar sinais ópticos (109) gerados a partir das sondas na e/ou sobre uma amostra em resposta aos feixes de iluminação (103) e (105) e para direcionar (111) os sinais coletados ao detector (108), o qual compreende a superfície responsiva à luz, tal como um elemento CCD ou CMOS, sobre os quais os sinais ópticos (109) formam uma imagem e a partir do que sucessivos conjuntos de dados de imagem são registrados. Preferivelmente, operação do sistema (100) está sob o controle de computador (110) que (a) controla a temporização e a duração dos feixes de iluminação (103) e (105), (b) controla o detector (108) para coletar e transferir dados de imagem para uma ou mais bases de dados, (c) analisa dados de imagem para produzir uma obtenção de leitura para o componente de obtenção de leitura (112), e operações semelhantes. A plataforma de amostra (116) pode variar amplamente em projeto e capacidades funcionais, mas requer geralmente que uma amostra seja disposta numa geometria substancialmente plana que seja consistente com a coleta de uma pluralidade de sinais ópticos em paralelo e que forme uma imagem sobre um detector. Preferivelmente, uma amostra disposta sobre a plataforma de amostra (116) fica estática e não flui ou se movimenta; ou se movimento estiver presente, ele é suficientemente lento tal que sucessivas imagens podem ser coletadas que são capazes de alinhamento durante a análise da imagem. A plataforma de amostra (116) pode compreender lâminas convencionais de microscópio, câmaras ou cubetas de amostras usadas em microscopia, placas de cultura, dispositivos microfluídicos, ou semelhantes. Em um aspecto, descrito mais amplamente adiante, a plataforma de amostra (116) compreende uma cubeta descartável que é designada para a detecção de componentes de células não vermelhas no sangue integral. Em um outro aspecto, plataforma de amostra (116) compreende uma cubeta possuindo uma câmara de amostra com uma geometria que permite a um volume conhecido ser pesquisado sempre que tal cubeta seja usada com o sistema (100). Em uma modalidade, uma tal câmara de amostra tem uma geometria substancialmente planar em que (a) um piso (ou parede de fundo) e um teto (ou parede de topo) são paralelas uma relativamente à outra e (preferivelmente) perpendicular à trajetória luminosa mínima até as ópticas de imagiologia (106) e (b) a distância perpendicular entre as paredes de topo e de fundo é substancialmente equivalente ao diâmetro das células ou partículas que estão sendo testadas. Todas as vezes que tal câmara de amostra está disposta na área de observação (107), que é conhecida ou determinável, as células ou partículas estarão em um volume conhecido (ou determinável), permitindo desse modo que as concentrações das

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9/24 partículas ou das células sejam medidas. “Substancialmente equivalente” em referência à distância, ou dimensão perpendicular, entre as paredes de topo e de fundo de uma câmara de amostra significa que, na amostra de sangue integral, sinais ópticos provenientes de células não vermelhas ou partículas na área de observação (107) são detectáveis. Em outras palavras, uma camada de células vermelhas do sangue (ou outros fragmentos) que possam estar entre a célula ou partícula marcada e a parede de topo da câmara não obstrui completamente a transmissão dos sinais ópticos. Em um aspecto, onde células brancas do sangue são marcadas e detectadas, tal como Células CD4+, a distância perpendicular entre a parede de topo e a parede de fundo está na faixa de 40 a 120 μm, ou na faixa de 50 a 100 μm. A natureza do componente de obtenção da leitura (112) pode variar amplamente desde um simples painel numérico até uma interface gráfica usuário rica em informações. Em uma modalidade, uma simples obtenção de leitura numérica é provida pelo componente de obtenção da leitura (112) que fornece contagens de uma ou mais tipos predeterminados de células ou de partículas. Em uma outra modalidade, as obtenções de leituras compreendem concentrações da ou de uma ou mais dos predeterminados tipos de células ou de partículas. E em ainda uma outra modalidade, a obtenção de leituras compreendem simples indicadores “sim ou não” de modo a indicar se as células, partículas ou outros analitos ultrapassaram ou não os níveis limiares de referência (por exemplo, contagens ou concentrações).

[0031]Em modalidades que empregam LEDs para gerar feixes de iluminação, as emissões provenientes do LED selecionado podem ser condicionadas utilizando componentes ópticos, como ilustrado na Figura 2 para um sistema de dois-LED. O primeiro LED (202) e o segundo LED (206) possuem ópticas de condicionamento (200) e (204), respectivamente, que compreendem cada uma um difusor (208), lentes (210), filtro de faixa passante (212), e lentes (216). Um propósito das ópticas de condicionamento (200) e (204) é para proporcionar iluminação espacialmente uniforme da amostra (220).

[0032]A Figura 10 ilustra um sistema óptico de epi-iluminação para uso com a invenção. LED (1000) gera um feixe de iluminação (1002) que é colimado pelas lentes (1004) e direcionado ao espelho dicróico (1006) e em seguida para o objetivo (1008). A luz proveniente do feixe de iluminação (1002) é focalizada por sobre a amostra (1010) onde marcas fluorescentes são excitadas para emitir sinais fluorescentes. Os sinais fluorescentes coletados pela objetiva (1008) are direcionados através do espelho dicróico (1006), opcionalmente através do filtro de emissão (1012), em seguida por sobre a superfície responsiva à luz (1014), nessa ilustração, uma câmera de um auxiliar digital pessoal comercialmente disponível, Zire 72 Palm Pilot, que também contém uma tela para a observação de uma amostra. Adicionais feixes de iluminação podem ser acrescentados mediante adição de espelhos dicróicos ao longo do trajeto óptico entre a objetiva (1008) e o

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10/24 filtro de emissão (1012).

[0033]II. Sondas Diferencialmente Excitáveis [0034]Em um outro aspecto, a invenção proporciona composições de sondas diferencialmente excitáveis para uso em marcar um ou mais de uma pluralidade de diferente analitos em uma amostra. Geralmente, as composições de sonda da invenção compreendem uma mistura de sondas analito-específicas, cada uma capaz de se ligar especificamente a um diferente analito, em que cada sonda é caracterizada por (a) um composto ligante específico para um analito, tal como um analito celular, sob condições de ligação, e (b) anexado ao composto ligante uma marca óptica, em que a marca óptica de cada diferente sonda possui uma diferente faixa de excitação e as marcas ópticas de todas as sondas emitem sinais ópticos dentro da mesma faixa de comprimento de onda. Usualmente, a última faixa de comprimento de onda não se sobrepõe com qualquer das faixas de excitação. Preferivelmente, marca ópticas são marcas fluorescentes, tal como corantes fluorescentes, capazes de gerar sinais fluorescentes. Todavia, outras marcas ópticas podem ser usadas com a invenção, tal como partícula de ressonância plasmon quando usada sob condições de iluminação de campo escuro. Em um aspecto, composições de sonda da invenção incluem pelo menos uma sonda específica para cada uma, de uma pluralidade de diferentes analitos. Em um outro aspecto, tal pluralidade está na faixa de 2 a 8; ou em um outro aspecto, na faixa de 2 a 4; ou em um outro aspecto, na faixa de 2 a 3; e em um outro aspecto, tal pluralidade é de pelo menos 3; ou está na faixa de 3 a 4. Uma característica importante de uma composição de sonda da invenção é que analitos em uma amostra marcadas com diferentes sondas da composição podem ser detectadas sequencialmente através da sucessiva excitação das marcas ópticas de cada sonda utilizando o feixe de iluminação específico para uma tal marca óptica. Usualmente, tal excitação sucessiva é temporalmente não sobreponível pelo fato de que cada feixe de iluminação é direcionado para a amostra em um intervalo de tempo em separado. Em outras palavras, os feixes de iluminação são sucessivamente direcionados a uma amostra um por vez. Preferivelmente, em operação, de sinais ópticos provenientes de cada excitação são formadas imagens sobre uma superfície responsiva à luz de um detector a partir do qual os dados de imagem são gerados e armazenados para análise. Quando sinais ópticos das sondas são restringidos a uma faixa estreita de comprimento de onda, a degradação da imagem devido a aberrações cromáticas das lentes no trajeto óptico é reduzida ou eliminada.

[0035]O princípio de operação de uma modalidade de composições de sonda da invenção está ilustrado na Figura 3, que mostra o espectro de excitação e de emissão das marcas ópticas de uma composição da invenção que consiste de duas sondas. Uma primeira sonda possui uma marca óptica que emprega transferência de energia de

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11/24 ressonância por fluorescência (FRET), em que uma molécula doadora possui espectro de absorção ou de excitação (300) (curva pontilhada) e espectro de emissão (302) (curva sólida) e uma molécula receptora possui espectro de absorção (304)(curva pontilhada), que se sobrepõe (302), e espectro de emissão (306)(curva sólida). Uma segunda sonda possui como uma marca óptica uma molécula fluorescência com espectro de absorção (310)(curva pontilhada) e espectro de emissão (312) (curva sólida). A linha pontilhada (320) indicou o limite do maior comprimento de onda da faixa acima da qual sinais ópticos são coletados. Desse modo, sempre que uma amostra marcada com a primeira e segunda sondas são iluminadas com um primeiro feixe de iluminação (330) possuindo faixa de comprimento de onda como indicado um primeiro sinal óptico é coletado consistindo de emissões de moléculas receptoras (306), e sempre que tal amostra é iluminada com um segundo feixe de iluminação (340) possuindo faixa de comprimento de onda como indicado um segundo sinal óptico é coletado dentro da mesma faixa de comprimento de onda, mas consistindo de emissões (312). Um par doador-receptor representativo para a primeira sonda é cianina 3aloficocianina (Cy3-APC), e uma marca óptica representativa da segunda sonda é cianina 5 (Cy5). Marcas ópticas representativas para uma composição de três sondas inclui cianina 7 (Cy7) (como doador e receptor para uma primeira sonda), APC-Cy7 (APC como doador e Cy7 como receptor for uma segunda sonda), e PE-Cy7 (PE as a doador e Cy7 como receptor for uma terceira sonda).

[0036]Adicionais composições de sonda representativas para sondas de dupla marcação e tripla marcação estão ilustradas nas Figuras 4A (descrita adiante) e 4B, respectivamente. A Figura 4B ilustra perfis de comprimentos de onda de excitação e de emissão para três corantes fluorescentes e faixas de comprimento de ondas de feixes de iluminação associados de uma composição de sonda da invenção. Os corantes são proteína peridinina clorofilada (PerCP) possuindo perfil de excitação (422) e perfil de emissão (428), conjugado ficoeritrin-Cy5 (PECy5) possuindo perfil de excitação (424) e perfil de emissão (430), e aloficocianina (APC) possuindo perfil de excitação (426) e perfil de emissão (432). Tais corantes podem ser sequencialmente excitados mediante aplicar feixes de iluminação possuindo comprimentos de onda nas faixas de cerca de 420-470 nm para PerCP (434), cerca de 515-550 nm para PECy5 (436), e cerca de 590-640 nm for APC (438). Tais feixes de iluminação podem ser gerados por LEDs, for exemplo, Luxeon Star Royal Blue, Green, e Vermelho-Laranja LEDs, respectivamente. Os sinais fluorescentes gerados pelas sondas são convenientemente separados da luz dispersa utilizando filtro de faixa passante (440) que transmite luz somente acima de cerca de 650 nm. Os corantes acima são facilmente conjugados a compostos ligantes, tais como anticorpos, utilizando técnicas convencionais, por exemplo, Hemanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, New York, 1996).

[0037]Em um outro aspecto, composições de sonda compreendem compostos

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12/24 ligantes are marcadas com partículas de ressonância plasmon (PRPs). Tais composições de sonda são particularmente úteis quando empregadas com um sistema de iluminação de campo escuro tal que somente a luz dispersada proveniente das PRPs é coletada. PRPs adequadas para uso com composições de sonda da invenção são reveladas nas referências adiante que são aqui incorporadas por referência: Schultz et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 996-1001 (2000); Schultz et al, Patente U.S. No. 6.180.415; Prober et al, Patente U.S. No. 7.122.384; e semelhantes. Nessa modalidade, as PRPs são selecionadas tal que cada uma difunde maximalmente a luz proveniente de um distinto feixe de iluminação.

[0038]III. Cubeta para medições do sangue integral.

[0039]Em um aspecto da invenção, uma cubeta descartável é provida para uso com o sistema da invenção para produzir medições no sangue integral. Em uma modalidade, uma tal cubeta é usada para contar predeterminados tipos de células sanguíneas, por exemplo, células não vermelhas, em um determinado volume; desse modo, tanto contagens ou concentrações de células de tais predeterminados tipos de células podem ser dadas como obtidas por leitura. No geral, uma cubeta descartável da invenção compreende (a) uma câmara de amostra capaz de receber uma amostra de sangue integral, uma câmara de amostra estando disposta em um corpo e possuindo pelo menos uma parede oticamente transmissiva e uma dimensão perpendicular a esta substancialmente equivalente ao diâmetro de uma célula sanguínea não vermelha a ser analisada tal que sinais ópticos gerados pelas sondas anexadas aos seus analitos celulares não são obstruídas pelas células vermelhas de sangue da amostra; e (b) um reagente seco na câmara de amostra que quando da combinação com a amostra se dissolve para formar uma composição de sonda que compreende uma pluralidade de sondas analito-específicas, cada uma capaz de se ligar especificamente a um diferente analito celular de uma célula sanguínea não vermelha, em que cada sonda é caracterizada por (i) um composto ligante específico para um analito celular sob condições de ligação, e (ii) anexado ao composto ligante uma marca óptica, em que a marca óptica de cada diferente sonda possui uma diferente faixa de excitação e as marcas ópticas de todas as sondas emitem sinais ópticos dentro da mesma faixa de comprimento de onda. Preferivelmente, uma tal cubeta descartável é usada com um sistema óptico como descrito acima, que inclui uma plataforma para receber a cubeta tal que ela tenha uma posição fixa com respeito aos feixes de iluminação e ópticas de imagiologia. Uma tal posição fixa irá alinhar as ópticas de imagiologia tal que sinais ópticos possam ser coletados a partir de uma câmara de amostra da cubeta. O projeto e a fabricação de seguradores descartáveis de amostras para observar ou medir as propriedades de fluidos biológicos, tal como parâmetros do sangue, são revelados nas referências adiante, as quais são aqui incorporadas por referência: Patentes U.S. Nos. 6.723.290; 6.869.570; 5.674.457; 5.200.152; 6.638.769; 4.088.448; e semelhantes.

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13/24 [0040]Uma modalidade da cubeta da invenção é ilustrada no diagrama nas Figuras 5A-5C. Em uma forma, a cubeta (500) compreende o corpo (501), que pode ser de vidro, plástico, ou de materiais semelhantes, ou combinações desses; e pelo menos uma câmara de amostra (502) que está conectada à porta de entrada (504) pela passagem (506). Em um aspecto, para uso nas medições do sangue integral, a câmara de amostra (502) pode suportar um volume de fluido de amostra na faixa de 5 a 100 μL, ou de 5 a 50 μL. A cubeta (500) pode também incluir uma porta de exaustão (não mostrada) conectada à câmara de amostra (502) para permitir a amostra entrar na câmara sem a formação de contrapressão. Abordagens alternativas para o carregamento da amostra para dentro da câmara de amostra (502) podem ser também empregadas, tal como ação capilar, sucção, forca centrifuga, e semelhantes. Uma característica importante da cubeta (500) é a coleta de sinais ópticos provenientes de um volume definido ou determinável (512) tal que as determinações das concentrações possam ser feitas a partir dos dados de imagem, por exemplo, de selecionados tipos de células. O volume (512) é definido por uma distância (por exemplo, 528 na Figura 5C) entre parede de topo (514) e parede de fundo (516) da cubeta (500) e a área, ou campo de visão (507) das ópticas de imagiologia, indicado pelo cone (508) e direção (510) na qual os sinais ópticos são coletados. Uma característica importante do sistema óptico da invenção nessa modalidade é que a profundidade do campo da objetiva é maior que ou igual à distância (528 ou 518) entre a parede de topo (514) e parede de fundo (516), tal que os sinais ópticos provenientes de todos os objetos em volume (512) são coletados. Preferivelmente, a parede de topo (514) é adequada para a passagem de sinais ópticos para coleta e é substancialmente paralela com a parede de fundo (516). Em outras modalidades, as cubetas da invenção podem incluir câmaras de adição, por exemplo, para sustentar reagentes e/ou para misturar a amostra com um tal reagente antes da visualização. Em um aspecto, as cubetas da invenção adicionalmente contêm reagentes secos, por exemplo, incluindo composições de sonda, sais, tampões, agentes de lise se necessário, e semelhantes, seja diretamente dispostos na câmara de amostra (502), ou em outras modalidades, contidos em uma câmara de mistura separada para ativação e mistura com uma amostra antes da transferência para a câmara de amostra (502).

[0041]Como mencionado acima, a distância entre a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) da câmara de amostra (502) é importante para a análise das amostras de sangue integrais. Se a distância é muito grande, por exemplo, (518) da Figura 5B, então as células vermelhas enucleadas do sangue (520) podem obstruir (526) a passagem dos sinais ópticos gerados pelos tipos de células de interesse (522), caso no qual tais células não podem ser contadas, levando a uma sub-estimativa dos números ou das concentrações das células. De acordo com a invenção, e como ilustrado na Figura 5C, a distância (518) entre a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) da câmara de

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14/24 amostra (502) é substancialmente equivalente ao diâmetro, ou ao diâmetro efetivo, dos tipos de células de interesse (522), tal que as camadas das células vermelhas enucleadas do sangue não podem se formar entre uma célula de interesse (522) e parede de topo (514), e sinais ópticos daí provenientes (524) todos a partir da câmara de amostra (502) para as ópticas de imagiologia. Em um aspecto, câmara de amostra (502) possui uma distância (518) substancialmente equivalente à profundidade do campo das ópticas de imagiologia. Em um outro aspecto, câmara de amostra (502) possui uma distância (518) na faixa de 10 a 100 μm, ou de 10 a 50 μm, ou de 20 a 50 μm.

[0042]EXEMPLO [0043]Nesse exemplo, um sistema de imagiologia para uso com a invenção foi construído e testado mediante contagem de células ou de partículas em diversas amostras. O sistema tinha um esboço que seguiu aquele ilustrado na Figura 1. Duas diferentes câmeras em escala de cinza foram empregadas como detectores. A primeira era uma câmera Sensovation Samba EZ140 TC-resfriada a (20°C abaixo da temperatura ambiente) com 1392 x 1024 pixels com 6.45 um pixel quadrados. A segunda câmera era uma câmera Point Grey Research Dragonfly2 de visão industrial com 1024 x 768 (4.65 um) pixels quadrados. Um ou outro dos dois esboços de lentes de imagiologia foi usado. Um esboço foi um par de lentes esféricas em dubleto com o filtro de excitação posicionado entre elas. Esse sistema possuía uma N.A. relativamente alta (~0.33) e trabalhou bem para campos de visão até cerca de 2 mm. Além dessa distância, a distorção astigmática é notável e aumenta rapidamente à medida que o campo de imagem é aumentado. Para lidar com essa condição, um segundo conjunto de lentes foi empregado. Esta foi uma lente de câmera comercial (Nikon 18-55mm f/3.5-5.6G ED AF-S DX Zoom) com um elemento esférico híbrido e um elemento de dispersão extra-baixa. Essa lente possui distorção excelentemente baixa, melhor profundidade de campo, e capacidade de formação de imagem sobre um campo de 4 mm de vista com astigmatismo não detectável, embora ela possua uma N.A. mais baixa de ~0,1. Essa redução na eficiência de coleta da luz não foi suficiente para provocar qualquer declínio detectável na precisão para a contagem das células. O esboço com a câmera DragonFly2 e lentes zoom Nikon DX é a configuração preferida para o custo e a qualidade da imagem.

[0044]Fontes luminosas LED, ou iluminadores, foram cada um instalados com seus próprios filtros de excitação dentro de alojamentos de lâmpadas. No caso de tandem de iluminação de iodeto de propídio (PI) ou ficoeritrina/ficoeritrina (PE/PE), a lâmpada é uma Luxeon V Star Cyan LED com um padrão de radiação Lambertiano, comprimento de onda de pico nominal de 505 nm (largura de meia-vida espectral de ± 30 nm), e um fluxo nominal de 570 mW uma corrente de 700 mA. O filtro de excitação é um filtro HQ510/50 da Chroma. Para SYTO 17 ou excitação APC, a lâmpada de um LED Vermelho-Laranja Luxeon III Star

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15/24 (padrão de radiação Lambertiano) com um comprimento de onda de pico nominal de 617 nm (meia-vida espectral de ± 18 nm) e fluxo nominal 600 mW na corrente de 1400 mA. Um filtro de emissão Chroma HQ610/30 foi usado para a luz Vermelho-Laranja. Os LEDs foram usados mais baixo que os máximos de corrente avaliados. Especificamente, Ciano a 500 mA (com fluxo máximo ~75% ) e Vermelho-Laranja a 700 mA (com ~55% fluxo máximo), a menos que de outro modo estabelecido. Como ilustrado na Figura 2, para aplainar o padrão do elemento LED da luz de excitação, difusores halográficos (ângulo 15°, da Edmunds Scientific) foram colocados diante dos LEDs. A luz foi focada por sobre a área de formação de imagem da amostra em pares de lentes de comprimento foral de 25 mm.

[0045]No transcurso dessa investigação, foi necessário utilizar algoritmos de software para processar e analisar as imagens para identificar gotas, células ou outras partículas e para a parametrização delas em termos da intensidade da fluorescência e tamanho de partícula. O processamento da imagem foi mantido a um relativo mínimo a fim de manter a integridade dos dados iniciais originais, e apenas consistiu do escalonamento da imagem para compensar quanto a variação na intensidade da iluminação sobre a imagem. Especificamente, isso consistiu de um algoritmo que escalonou cada pixel utilizando a base de referência local comparada com a base de referência média da imagem integral. O tamanho da base de referência local foi modificado como apropriado para levar em conta a faixa de tamanho esperada das partículas de interesse e a distância representada por pixel (após ampliação da imagem). Por exemplo, nos casos mais comuns nessa investigação, de gotas com diâmetros de 3 a 8 um e para células de diâmetros de 7 a 15 um, com cada pixel representando 4 um da amostra, uma janela de 60 um (15 pixels transversal) foi descoberto funcionar bastante bem nesse sistema representativo, ao mesmo tempo em que não consome excessivo tempo de CPU no processamento. Após as imagens terem sido compensadas quanto a variação da iluminação, um outro algoritmo pesquisou quanto a partículas de interesse mediante identificar a máxima intensidade local que satisfizesse as regras estatísticas designadas para evitar falsos positivos a partir de ruídos aleatórios, partículas estranhas (poeira, etc.) e padrões estruturais de uma câmara de amostra (por exemplo, linhas copiadoras hemacitometro). Primariamente, o algoritmo procura por um máximo local (pixel brilhante) que seja pelo menos 3 desvios padrões acima do ruído de fundo, circundado por um anel de pixels que sejam todos pelo menos 1,5 desvio padrão acima do ruído de fundo, e possuem subsequentes anéis de intensidade decrescente (permitindo quanto a variação estatística do ruído). Verificações adicionais para a escolha de identificação e verificação de partícula duplicada para valores razoáveis de desvio padrão são incluídas. Quando uma partícula é identificada, um outro algoritmo encontra a amostra de melhor ajuste (circular, não elíptico) curva Gaussiana para o perfil de intensidade da partícula, utilizando um algoritmo de ajuste de descida escalonada em uma

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16/24 forma de expressão Gaussiana otimizada para esse algoritmo de ajuste. Os parâmetros padrões de altura, raio, deslocamento e posição X-Y são reportados, juntamente com as estatísticas de ajuste (soma dos resíduos quadráticos e qui-quadrado) são registrados para cada partícula identificada. As partículas são então categorizadas (ou “classificadas”) com base nos seus raios, altura e intensidade integrada (volume sob a curva Gaussiana), para separá-las em diferentes populações citométricas.

[0046]A sensibilidade foi demonstrada utilizando diversas gotas especificamente preparadas com baixas quantidades e moléculas de ficoeritrina (PE) ligadas por gota. Essas partículas foram preparadas mediante incubar BD α-Mouse-IgK Compensation Beads (Becton Dickinson p/n 552843) incubadas com misturas de anticorpo específico para antígeno CD3 marcados com PE (CD3-PE) e anticorpo específico para antígeno CD3 marcados com biotina (CD3-biotina) em relações que geraram gotas estáveis com níveis muito baixos de moléculas PE ligadas por gota. As gotas tiveram imagens formadas com a câmera DragonFly2 CCD (Point Grey Research, Vancouver, BC) em diversas durações de exposição e ajustes de ganho interno. O número de moléculas PE por partícula para as gotas resultantes foram determinados por escalonamento contra PE Quantibrite beads (Becton Dickinson p/n 30495). Nesse estudo, a preparação da gota mais turva (mostrado na Figura 6A) produziu 825 moléculas PE por partícula, e foi detectável a partir do ruído de fundo em alto ganho (24 dB) e duração intermediária de exposição (1 s). A gota de 825 PEmolécula foi a partícula mais turva testada e representa um nível mais que adequado da sensibilidade para satisfazer qualquer ensaio de contagem de célula com base em DNA (centenas de milhares de fluoróforos por célula), os mais relevantes marcadores de células tal como antígenos CD3 e CD4 em células-T (manchamento a ~150,000 e ~50,000 moléculas PE por célula respectivamente), e muitas outras aplicações incluindo detecção parasita e ensaios clínicos de base em gota, por exemplo, a disposição da gota citométrica revelada em Morgan et al, Clinical Immunol., 110: 252-266 (2004), que é aqui incorporada por referência.

[0047]A faixa dinâmica para detectores eletrônicos (incluindo este) está primeiramente ajustada pela faixa dinâmica do conversor A-D, e em seguida reduzida pelos ruídos de sinal. O conversor A-D 12-bit da câmera Dragonfly2 ajusta uma faixa dinâmica teórica máxima a 1-4096 dentro de uma imagem única. As características de ruído foram investigadas para a câmera Dragonfly2, com os dois principais contribuintes sendo o ruído lido e a corrente escura. Estas foram medidas mediante analisar as imagens tomadas com ganhos de 0 a 24 dB e tempos de exposição variando de 0 a 10 segundos. O ajuste da intensidade de ruído calculada nas imagens produziu valores de ruído lido e corrente escura para cada ajuste de ganho. O ruído cresceu linearmente com o ganho e, para uma faixa prática de condições de medição, consumiu de 1,62 bits para exposição de 0,1 s em ganho

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17/24 de 0 dB, a 6,24 bits em exposição de 10 s em ganho de 24 dB. Isso reduz a faixa dinâmica de uma imagem única a 1-1334 para o melhor caso ou 1-54 para o pior caso. É notado que para esse sistema, em que a amostra permanece estacionária diante da câmera, a faixa dinâmica efetiva do instrumento pode ser consideravelmente melhorada mediante tomar múltiplas imagens ao mesmo tempo em que alterando o ajuste do ganho CCD e durações da exposição do vôo. Uma vez que a intensidade é diretamente proporcional à duração da exposição e amplificação de CCD, sob condições práticas isso aumenta a faixa dinâmica disponível por duas ou três ordens de magnitude.

[0048]Gotas PE Quantibrite, que ampliam ~100 vezes a alteração de intensidade, foram usadas para esse teste. As gotas PE Quantibrite consistem de uma mistura de quatro populações de gotas, cada uma com um específico número médio de moléculas PE por gota. Desse modo, os detectores podem ser calibrados para valores absolutos de intensidade em termos de moléculas de PE. Desse modo, a população mais brilhante contém (em média) 66408 moléculas de PE por gota, a próxima população contém 31779 moléculas de PE por gota, seguido por 8612 e 863 moléculas de PE por gota. Gotas PE Quantibrite tiveram imagens formadas em uma série de durações de exposição crescente de 0,1 a 20 segundos e numa amplitude de ajustes de ganho (1-15 X amplificação). Como a duração e o ganho foram aumentados a janela da faixa dinâmica se moveu para detectar cada gota por vez, em níveis crescentes de intensidade, até que todas as gotas fossem medidas (Fig 9). Nesse método, a inclinação das linhas de melhor ajuste é proporcional ao número de moléculas de PE por gota e produz um valor mais preciso utilizando somente imagens simples.

[0049]A primeira aplicação investigada no dispositivo foi a contagem absoluta das células cultivadas em uma câmara volumétrica. Um ensaio de vida/morte foi projetado de acordo com a excitação em duas cores e aspectos comuns da faixa de emissão do instrumento, com o impermeável corante Iodeto de Propídio (PI) de manchamento corante em células mortas e o permeável SYTO-17 de manchamento corante de todas as células. PI foi excitado com o LED 505 nm (Cyan) atrás de um filtro de faixa passante 510/50 e SYTO17 foi excitado com o LED 617 nm (Vermelho-Laranja) LED atrás de um filtro de faixa passante 610/30. O filtro de emissão usado foi um filtro de faixa passante 720/150, que abrange a grosso modo um terço do espectro de emissão PI e a metade do espectro de emissão SYTO-17 (ver Fig 4A, onde o seguinte é ilustrado: espectro de absorção PI (400), espectro de emissão PI (402), SYTO-17 espectro de absorção (404), SYTO-17 espectro de emissão (406), faixa de comprimento de onda da primeira excitação (408), faixa de comprimento de onda da segunda excitação (410), e faixa de comprimento de onda (412) sobre a qual os sinais ópticos são coletados).

[0050]Três linhagens de células (A549, HeLa e U20S) bem como partículas DNA

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QC (Becton Dickinson p/n 349523, incluindo núcleo eritrócito de pintos e núcleo de timo de novilho) foram usados na investigação. Uma vez que o manchamento DNA é extremamente brilhante relativamente aos marcadores da superfície de célula ou gotas de PE Quantibrite, a sensibilidade do instrumento foi reduzida ou pela redução do tempo de exposição, ganho ou corrente do LED de excitação (todos os quais produziram resultados satisfatórios). A qualidade e a fidelidade da imagem foram excelentes para ambos os manchamentos PI e SYTO-17 (Fig. 6A). SYTO-17 pode passar através de membranas de células vivas enquanto que PI pode apenas passar através de membranas que tenham perdido alguma integridade estrutural. À medida que a permeabilidade de membrana de células manchadas aumenta, o manchamento PI do núcleo aumenta. Desse modo, o equilíbrio do manchamento PI versus manchamento SYTO-17 nessas células pode variar desde grosseiramente 1:1 até intensidades PI de várias vezes maior à medida que PI desloca o SYTO-17 do DNA.

[0051]Células vivas e mortas foram diferenciadas na imagem resultante para determinar separadamente contagens de células vivas e mortas, bem como as contagens de células totais. Em um estudo, células A549, recém tripsinizadas e separadas de um frasco de cultura, foram picadas em um meio de células DMEM em concentrações variando de 50 a 500 células/uL. Cada amostra foi incubada com 10 uM SYTO-17 + 10 uM PI por 10 minutos e em seguida alíquotas de cada amostra foram transferidas para dentro de uma câmara de hemacitômetro. A amostra teve imagem formada na câmara do hemacitometro como descrito acima, e as imagens foram analisadas para as contagens de células vivas, mortas e totais. A linearidade dos resultados foi excelente (ver Figura 6B), com todas as três contagens possuindo valores R2 de 0,99 ou melhores. Não foram conduzidas otimização nos algoritmos de análises da imagem ou processos de acesso, e uma contagem de base de referência de ~25 células/uL proveniente de falso positivo foi aparente, embora isso possa ser solucionado pelas melhorias nas análises e algoritmos de acesso.

[0052]O sistema acima foi usado para detectar e contar amostras de células CD4+ no sangue. Com amostras da lise sanguínea, os resultados se comparam muito favoravelmente com a citometria de fluxo para a contagem de células CD3-, CD4- e CD45positivas. Ambos os marcadores de superfície de células CD3 e CD4 são usados para identificar células no sangue integral, mediante adição de anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 anticorpos marcados de modo fluorescente, respectivamente, com excelente qualidade de imagem, como ilustrado pelos dados mostrados nas Figuras 7A-7B e 8A-8B.

[0053]A performance do sistema acima foi também testada mediante contagem e quantificação dos sinais ópticos provenientes de imunoensaios de base-gota. Gotas de um ensaio citométrico de gota da BD Bioscience (San Jose, CA) (CBA) para medir interleucina2 (IL-2) foram combinados com diversas concentrações de IL-2 e manchada com um anticorpo anti-IL-2 marcado utilizando o protocolo do fabricante, por exemplo, Morgan et al,

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Clinicai Immunology, 110: 252-266 (2004). Em lugar de analisar sinais provenientes da gota com um citometro de fluxo, as gotas marcadas tiveram imagens formadas no sistema acima, após o que elas foram contadas e classificadas de acordo com a intensidade do sinal. Os resultados são ilustrados na Figura 9.

Definições [0054]Geralmente, os termos usados aqui não de outro modo especificamente definidos possuem significados correspondentes aos de sua utilização conversão nos campos correlacionados com a invenção, incluindo química analítica, bioquímica, biologia molecular, biologia celular, microscopia, análises de imagem, e semelhantes, tal como representados pelas seguintes pesquisas: Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition (Garland, 2002); Nelson e Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition (W.H. Freeman, 2004); Murphy, Fundamentals of Light Microscopy e Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Fourth Edition (Wiley-Liss, 2003); e semelhantes.

[0055]“Analito” significa uma substância, composto, ou componente em uma amostra cuja presença ou ausência é para ser detectada ou cuja quantidade é para ser medida. Analitos incluem, não estão limitadas a peptídeos, proteínas, polinucleotídeos, polipeptídios, oligonicleotídeos, moléculas orgânicas, haptenos, epítopos, partes de células biológicas, modificações pós-traducionais de proteínas, receptores, açúcares complexos, vitaminas, hormônios e semelhantes. Pode haver mais que um analito associado com uma única entidade molecular, por exemplo, diferentes sítios de fosforilação em alguma proteína.

[0056]“Anticorpo” ou “imunoglobulina” significa uma proteína, ou natural ou produzida sinteticamente através de meios recombinantes ou químicos, que seja capaz de especificamente se ligar a um antígeno particular ou determinante antigênico. Anticorpos são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150,000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está articulada a uma cadeia pesada por meio de uma ligação covalente dissulfeto, enquanto que o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve possui também pontes intracadeias espaçadas. Cada cadeia pesada possui numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno. Dependendo da sequência aminoácido de do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser consignadas a diferentes classes.

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Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversas dessas podem ser adicionalmente divididas na forma de subclasses (isotipos), por exemplo,, IgG,, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. “Fragmento anticorpo”, e todas as suas variantes gramaticais, como usado aqui se definem como uma parte de um anticorpo intacto compreendendo o sítio antígeno ligante ou região variável do anticorpo intacto, em que a parte é livre dos domínios, em que a parte é livre dos domínios constantes da cadeia pesada (isto é, CH2, CH3, e CH4, dependendo do isotipo do anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, e Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que seja um polipeptídio possuindo uma estrutura primária consistindo de uma sequência não interrompida de resíduos aminoácidos contíguos (referida aqui como um “fragmento anticorpo de cadeia simples” ou “polipeptídio de cadeia simples”), que inclui, sem limitação (1) moléculas Fv (ScFv) de cadeia simples, (2) polipeptídios de cadeia simples possuindo apenas um domínio variável de cadeia leve, ou um seu fragmento que contém três CDRs de domínio variável de cadeia leve, sem uma associada fração de cadeia pesada e (3) polipeptídio de cadeia única contendo somente uma região de domínio variável, ou um seu fragmento contendo os três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem uma associada fração cadeia leve; e estruturas multiespecíficas ou estruturas multivalentes formadas a partir de fragmentos anticorpos. O termo “anticorpo monoclonal” (mAB) como usado aqui se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substâncias homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações naturalmente ocorrentes que possam estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos estando direcionados contra um único sitio antigênico. Além disso, em contraste às preparações conversão de anticorpos (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada mAB é direcionado contra um único determinante no antígeno. Adicionalmente às suas especificidades, os anticorpos monoclonais são vantajosos pelo fato de que eles posem ser sintetizados através de cultura hibridoma, não contaminados por outra imunoglobulinas. A orientação da produção e seleção de anticorpos para uso em imunoensaios pode ser encontrada facilmente em textos e manuais, por exemplo, Harlow e Lane, Anticorpos: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988); Howard e Bethell, Basic Methods in Anticorpo Production e Characterization (CRC Press, 2001); Wild, editor, The Immunoassay Handbook (Stockton Press, New York, 1994), e semelhantes.

[0057]“Determinante antigênico”, ou “epitopo” significa um site sobre a superfície de uma molécula, usualmente uma proteína, para a qual uma única molécula anticorpo; geralmente uma proteína possui diversos ou muitos diferentes determinantes antigênicos e

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21/24 reage com anticorpos de muitas diferentes especificidades. Um preferido determinante antigênico é um sítio de fosforilação de uma proteína.

[0058]“Composto ligante” significa um composto que é capaz de se ligar especificamente a uma particular molécula alvo. Exemplos de compostos ligantes incluem anticorpos, lecitinas, ácidos nucléicos, aptâmeros, e semelhantes, por exemplo, Sharon e Lis, Lectins, 2nd Edition (Springer, 2006); Klussmann, The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides e Their Applications (John Wiley & Sons, New York, 2006).

[0059]“Complexos” como usado aqui significa uma montagem ou agregados de moléculas em contato direto ou indireto uma com as outras. Em um aspecto, “contato”, ou mais particularmente “contato direto” em referência a um complexo de moléculas ou mais particularmente “contato direto” em referência a um complexo de moléculas, ou em referência a um complexo de moléculas, ou em relação à especificidade ou ligação específica de duas ou mais moléculas, significa duas ou mais moléculas que são próximas o suficiente tal que as interações monovalentes, tal como forças de ligações hidrogênio de Van der Waal, interações hidrofóbicas iônicas, e semelhantes, dominam a interação das moléculas. Em um tal aspecto, um complexo de moléculas é estável pelo fato de que sob condições de ensaio, o complexo é mais favoravelmente que um não complexo de componente moléculas. Como usado aqui, “complexo” usualmente se refere a um agregado de dois ou mais proteínas. Em um aspecto, um “complexo” usualmente se refere a um agregado estável de duas proteínas, tal como um anticorpo ligado a um determinante antigênico de uma proteína alvo.

[0060]“Reagente secos” significa reagentes de ensaios, tal como tampões, tais como sais, compostos ativos, tais como enzimas, co-fatores, e semelhantes, ou compostos ligantes, tal como anticorpos, aptâmeros, ou semelhantes, que são providos em uma formulação desidratada para o propósito de aprimorada vida de prateleira, facilidade de transporte, aprimorado armazenamento, e semelhantes. A natureza, composição e método de produzir um reagente seco varia amplamente e o método de produzir reagentes secos varia amplamente e a formulação e produção de tais materiais é bem conhecida por aqueles usualmente versados na técnica como evidenciado pelas referências apresentadas adiante. Franks et al, Patente U.S. No. 5..098.893; Cole, Patente U.S. No. 5.102.788; Shen et al, Patente U.S. No. 5.556.771; Treml et al, Patente U.S. No. 5.763.157; De Rosier et al, Patente U.S. No. 6.294.365; Buhl et al, Patente U.S. No. 5.413.732; McMillan, Publicação de Patente U.S. No. 2006/0068398; McMillan et al, publicação 2006/0068399; Schwegman et la (2005), Pharm. Dev. Technol., 10: 151-173; Nail et al (2002), Pharm. Biotechnol., 14: 281360; e semelhantes. Os reagentes secos incluem, mas não estão limitados a, particulados sólidos ou semi-sólidos de pós, comprimidos, cristais, cápsulas e semelhantes, tal que são fabricados em uma variedade de modos, reagente secos são particulados liofilizados. Os

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22/24 particulados liofilizados podem ter composições uniformes, em que cada particulado possui a mesma composição, ou elas podem ter diferentes composições, tais como aqueles dois ou mais diferentes tios de particulados liofilizados podem ter composições uniformes, em que particulados liofilizados podem ter composições uniformes, em que cada particulado possui a mesma composição, ou eles podem ser composições diferentes tal que dois ou mais diferentes tipos de particulados liofilizados possuindo diferentes composições são misturados juntos. Os particulados liofilizados podem conter reagentes para a totalidade ou parte de uma ampla variedade de ensaios e reações bioquímicas, incluindo imunoensaios, ensaio baseados em enzimas, incluindo imuno-ensaios, ensaios baseados em enzimas, ensaios baseado em substratos enzimas, reações de sequenciamento DNA, e semelhantes. Em um aspecto, a um particulado liofilizado da invenção compreende um excipiente e pelo menos um reagente de um ensaio. Particulados liofilizados podem ser produzidos em tamanhos e formas predeterminadas, as quais podem ser determinadas pelos tipos de ensaios que estão sendo conduzidos, volumes reacionais desejados, velocidades desejadas de dissolução, e semelhantes. Reagentes secos podem incluir excipientes, os quais são usualmente substâncias inertes acrescentadas a um material a fim de conferir uma adequada consistência ou forma ao material. Um grande número de excipientes são conhecidos por aqueles usualmente versados na técnica e podem compreender um número de diferentes estruturas químicas. Exemplos de excipientes, que podem ser usados na presente invenção, incluem carboidratos, tal como sacarose, glicose, trealose, melezitose, dextrano, e manitol; proteínas tal com BSA, gelatinas, e colágenos; e polímeros tal como PEG e polivinil pirrolidona (PVP). A quantidade total de excipiente no particulado liofilizado pode compreender ou compostos simples ou múltiplos. Em algumas modalidades, o tipo de excipiente é um fator em controlar a quantidade de higroscopia de um reagente seco. O rebaixamento da higroscopia pode melhorar a integridade do reagente seco e as capacidades crioprotetoras. Todavia, a remoção de toda a água de uma tal composição pode ter efeitos prejudiciais naqueles componentes reacionais, proteínas, por exemplo, que requeiram certas quantidades de água ligada a fim de manter as apropriadas conformações.

[0061]“Obtenção de leitura” significa um parâmetro, ou parâmetros, os quais são medidos e/ou detectados os quais podem ser convertidos a um número ou valor. Em alguns contextos, a obtenção de leitura pode referir a uma representação numérica atual de tais dado coletados ou registrados. Por exemplo, a obtenção de leitura de sinais de intensidade fluorescência provenientes de um microarranjo é a posição da intensidade da fluorescência de um sinal que está sendo gerado em cada sítio de hibridização do microarranjo; desse modo, uma tal obtenção de leitura pode ser registrada ou armazenada em diversos modos, por exemplo, como uma imagem do microarranjo, como uma tabela de números, ou semelhantes.

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23/24 [0062]“Amostra” significa uma quantidade de material proveniente de uma fonte biológica, ambiental, médica ou de paciente em que a detecção ou a medição das células alo, partículas ou gotas, e/ou analitos é objetivada. O temo “amostra” abrange amostras biológicas, por exemplo, uma quantidade de sangue, uma cultura microbiana, ou semelhantes; amostras ambientais, por exemplo, uma amostra de solo ou de água; amostras médicas ou espécimes, por exemplo, uma quantidade de sangue ou de tecido; ou semelhantes. Uma amostra pode incluir um espécime de origem sintética. As amostras biológicas podem ser de animal, incluindo humano, fluido, sólido (por exemplo, fezes) ou tecido, bem como líquido e alimento sólido e produtos e ingredientes alimentícios tal como itens de laticínios, vegetais, carnes e subprodutos de carnes, rejeitos. Amostras biológicas podem incluir materiais tomados a partir de um paciente que incluem, mas não limitados a culturas, de sangue, saliva, fluido espinal cerebral, fluido pleural, leite, linfo, esputo, sêmen, aspirados de agulhas, e semelhantes. Amostras biológicas podem ser obtidas a partir da totalidade das famílias de animais domésticos ou selvagens, incluindo, mas não limitado a, animais tais como animais de casco, peixes, roedores, etc. Amostras ambientais incluem materiais ambientais tais como matérias de superfície, solo, água e amostras industriais, bem como amostras obtidas a partir de alimentos, instrumentos de processamento de laticínios, utensílios, equipamentos, itens descartáveis e não descartáveis. Esses exemplos não são para serem considerados como a limitar os tipos de amostras aplicáveis à presente invenção. Os termos “amostra” e “espécime” são usados aqui de modo intercambiável.

[0063]“Específico” ou “especificidade” em referência à ligação de uma molécula a uma outra molécula significa o reconhecimento, contato, e formação de um complexo estável entre as duas moléculas, juntamente com substancialmente menos reconhecimento, contato, ou formação complexa daquela molécula com outras moléculas. Em um aspecto, “específico” em referência à ligação de uma primeira molécula a uma segunda molécula significa que ao nível a primeira molécula reconhece e forma um complexo com outras moléculas em uma reação ou amostra, ela forma o maior número de complexos com a segunda molécula. Preferivelmente, esse maior número é pelo menos trinta por cento. Geralmente, as moléculas envolvidas em um específico evento ligante possuem áreas em suas superfícies, e/ou no caso de proteínas em cavidades, produzindo o específico reconhecimento entre as moléculas ligantes entre si. Exemplos de ligações específicas incluem interações anticorpos-antígenos, interações enzimas-substratos, formações de duplexos ou triplexos entre os polinucleotídeos e/ou olinucleotídeos, interações receptorligando, e semelhantes. Como usado aqui, “contato” em referência à especificidade ou ligação específica significa duas moléculas que estão próximas o suficiente que interações não covalentes fracas, tais como forças de Van der Waal, ligações hidrogênio, interações de empilhamento base, interações iônicas e hidrofóbicas, e semelhantes, dominam a interação

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24/24 das moléculas.

[0064]As orientações apresentadas acima são pretendidas a ilustrar a invenção e não a limitar o seu escopo ou as reivindicações da invenção. Embora modalidades representativas da presente invenção sejam descritas, será evidente por aqueles usualmente versados na técnica que diversas alterações e modificações podem ser feitas nela sem se afastar do escopo e espírito da invenção, sendo pretendido que as reivindicações apresentadas adiante abranjam todas as tais modificações e alterações que se insiram no verdadeiro espírito e escopo da invenção.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema (100) para analisar células não vermelhas em um espécime de sangue marcadas com uma pluralidade de marcas diferencialmente excitáveis, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

uma câmara de amostra (502) capaz de conter um espécime de sangue e possuindo uma dimensão ao longo de um eixo de coleta de luz (528) que impede a formação de uma camada de obstrução de luz de células vermelhas de sangue;

múltiplas fontes luminosas (102, 104), cada uma capaz de iluminar o espécime de sangue com um feixe de iluminação possuindo uma faixa de comprimento de onda distinta;

um controlador (110) acoplado às múltiplas fontes luminosas (102, 104) para direcionar sucessivamente o feixe de iluminação de cada fonte luminosa para o espécime de modo que cada uma da pluralidade de marcas diferencialmente excitáveis seja sucessivamente induzida a emitir um sinal óptico dentro da mesma faixa de comprimento de onda; e um sistema óptico (106, 108) capaz de coletar tais sinais ópticos emitidos e formar sucessivas imagens correspondentes a estes sobre uma superfície responsiva à luz para formar sucessivos conjuntos de dados de imagem e enumerar as células não vermelhas no espécime de sangue mediante análise dos sucessivos conjuntos de dados de imagem.
2. Cubeta descartável de coleta de sangue (500) para análise óptica de células não vermelhas de sangue, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:

uma câmara de mistura possuindo uma entrada (504) para o recebimento de uma amostra de sangue integral, a câmara de mistura adicionalmente compreendendo um reagente seco capaz de dissolver ao contato com a amostra de sangue integral e contendo uma composição de sonda que compreende uma pluralidade de sondas específicas de analito, cada uma capaz de se ligar especificamente a um diferente analito celular de uma célula de sangue não vermelha, em que cada sonda é definida por (a) um composto ligante específico para um analito celular sob condições de ligação, e (b) uma marca óptica anexada ao composto ligante, em que a marca óptica de cada diferente sonda possui uma diferente faixa de excitação excitável por uma fonte de luz diferente e as marcas ópticas de todas as sondas emitem sinais ópticos dentro da mesma faixa de comprimento de onda detectável por um único detector; e uma câmara de amostra (502) conectada de modo fluídico à câmara de mistura de modo que uma amostra na câmara de mistura seja transferida para a câmara de amostra (502) por meio de ação de capilaridade, a câmara de amostra (502) possuindo uma parede opticamente transmissiva e uma dimensão ao longo de um eixo de coleta de luz (528) que impede a formação de uma camada obstrutiva à luz de células vermelhas de sangue.
3. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de

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2/4 que a câmara de amostra (502) compreende uma parede de topo (514) e uma parede de fundo (516) tendo uma distância entre a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) da câmara de amostra (502) que é equivalente ao diâmetro de células não vermelhas de sangue em um espécime de sangue.
4. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a distância entre a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) varia de 10 pm a 50 pm.
5. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a distância entre a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) varia de 20 pm a 50 pm.
6. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a distância entre a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) da câmara de amostra (502) é equivalente ao diâmetro dos linfócitos.
7. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o sistema óptico (106, 108) está configurado para coletar sinais ópticos emitidos a uma distância que é igual ou maior que a distância entre a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) da câmara de amostra (502).
8. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a parede de topo (514) e a parede de fundo (516) são paralelas.
9. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma porção da parede de topo (514) da câmara de amostra (502) é opticamente transparente.
10. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a distância entre a porção da parede de topo (514) que é opticamente transparente e a parede de fundo (516) da câmara de amostra (502) é equivalente ao diâmetro de células não vermelhas de sangue em um espécime de sangue.
11. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a câmara de amostra (502) compreende uma composição reagente compreendendo sondas para marcação de analitos em um espécime de sangue.
12. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição reagente compreende sondas específicas para marcação de células ou patógenos em um espécime de sangue.
13. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição reagente compreende sondas específicas para marcar uma ou mais células CD3+, células CD4+, células CD8+ e CD45+.
14. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição reagente compreende uma marca fluorescente.

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15. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a marca fluorescente é cianina 3 (Cy3), cianina 3-aloficocianina (Cy3-APC), cianina 5 (Cy5), ficoeritrina, ficoeritrina-cianina 5 (PE-Cy5), aloficocianina, cianina 7 (Cy7), cianina 7aloficocianina (Cy7-APC) e ficoeritrina-cianina 7 (PE-Cy7).
16. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição reagente compreende uma composição de três sondas.
17. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de três sondas compreende ficoeritrina-Cy5 (PECy5), aloficocianina e ficoeritrina.
18. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de três sondas compreende uma primeira sonda, uma segunda sonda e uma terceira sonda, em que a primeira sonda interage com a segunda sonda por transferência de energia de ressonância por fluorescência.
19. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda sonda e a terceira sonda possuem a mesma faixa de comprimento de onda de emissão.
20. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda sonda e a terceira sonda possuem uma faixa de comprimento de onda de emissão que se sobrepõe a 25 nm ou mais.
21. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a faixa de comprimento de onda distinta compreende 25 nm ou menos.
22. Sistema (100), da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas fontes luminosas (102, 104) são capazes de iluminar de 2 a 4 faixas de comprimentos de onda distintos.
23. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas fontes luminosas (102, 104) iluminam em dois ou mais de 455 nm, 470 nm, 505 nm, 530 nm e 617 nm.
24. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas fontes luminosas (102, 104) iluminam a 505 nm e 617 nm.
25. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas fontes luminosas (102, 104) compreendem diodos emissores de luz.
26. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas fontes luminosas (102, 104) compreendem 2 a 4 diodos emissores de luz.
27. Sistema (100), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um espécime de sangue presente na câmara de amostra (502), em que a amostra de sangue é marcada com uma pluralidade de marcas diferencialmente

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4/4 excitáveis posicionados na câmara de amostra (502), de tal modo que cada componente diferente de célula não vermelha do espécime de sangue é marcado com uma marca diferencialmente excitável diferente que emite um sinal óptico com a mesma faixa de comprimento de onda detectável por um único detector (108).