ES2601889T3

ES2601889T3 - Método y aparato para purificación cromatográfica

Info

Publication number: ES2601889T3
Application number: ES12759658.3T
Authority: ES
Inventors: Romas SKUDAS
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2011-10-04
Filing date: 2012-09-15
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2032-09-15
Also published as: EP2763771A1; SG2014015226A; EP2763771B1; CA2850872A1; US11590434B2; WO2013050104A1; KR20140072162A; CN103842045A; US20140251911A1; EP2578286A1; KR101974676B1; JP2014534055A; JP6105598B2; US20200101399A1; CN103842045B; IN2014KN00946A; CA2850872C

Abstract

Aparato que comprende - dos unidades de separación A1 y A2 que tienen ambas la misma matriz de cromatografía y una unidad de separación B que tiene una matriz de cromatografía que difiere de la matriz de cromatografía de las unidades de separación A1 y A2, teniendo todas las unidades de separación una entrada de fluido y una salida de fluido, para lo que hay al menos conexión de fluido entre la salida de fluido de la unidad de separación A1 y la entrada de fluido de la unidad de separación B y conexión de fluido entre la salida de fluido de la unidad de separación A2 y la entrada de fluido de la unidad de separación B - al menos una válvula en la conexión de fluido entre las unidades de separación A1 y A2 y la unidad de separación B que permite cambiar entre comunicación de fluido entre la salida de la unidad de separación A1 y la entrada de fluido de la unidad de separación B y comunicación de fluido entre la salida de la unidad de separación A2 y la entrada de fluido de la unidad de separación B - al menos dos depósitos de tampón y al menos dos bombas para lo que los depósitos de tampón están al menos en conexión de fluido con las entradas de las unidades de separación A1 y A2 y las bombas se usan para transportar el líquido desde los depósitos hacia las unidades de separación conteniendo un depósito una disolución de muestra que está en conexión de fluido con las entradas de las unidades de separación A1 y A2.

Description

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DESCRIPCION

Metodo y aparato para purificacion cromatografica

La presente invencion se refiere a un metodo y a un aparato adecuados para un procedimiento de cromatografla continuo que solo necesita tres columnas de separacion. El procedimiento es un procedimiento de dos etapas que comprende dos etapas cromatograficas. La primera etapa cromatografica (captura) se realiza de manera alternante y secuencial preferiblemente en dos columnas de separacion, la segunda etapa cromatografica (pulido) se realiza, tambien secuencialmente, en la tercera columna.

Antecedentes de la invencion

La purificacion de protelnas a gran escala, economica, es cada vez mas un problema importante para la industria biotecnologica y farmaceutica. Normalmente, las protelnas se producen mediante cultivo celular, usando llneas celulares o bien de mamlfero o bien bacterianas modificadas por ingenierla genetica para producir la protelna de interes mediante la insercion de un plasmido recombinante que contiene el gen para esa protelna. Puesto que las llneas celulares usadas son organismos vivos, deben alimentarse con un medio de crecimiento complejo, que contiene azucares, aminoacidos y factores de crecimiento, suministrado habitualmente a partir de preparaciones de suero animal. La separacion de la protelna deseada de la mezcla de compuestos alimentados a las celulas y de los subproductos de las propias celulas hasta una pureza suficiente para su uso como agente terapeutico humano plantea un reto formidable.

Los procedimientos para la purificacion de protelnas de desechos celulares dependen inicialmente del sitio de expresion de la protelna. Algunas protelnas se hace que se secreten directamente de la celula al interior de los medios de crecimiento circundantes; otras se obtienen intracelularmente. Para estas ultimas protelnas, la primera etapa de un procedimiento de purificacion implica la lisis de la celula, que puede realizarse mediante una variedad de metodos, incluyendo cizalladura mecanica, choque osmotico o tratamientos enzimaticos. Una alteracion de este tipo libera todo el contenido de la celula al interior del homogeneizado y, ademas, produce fragmentos subcelulares que son diflciles de retirar debido a su pequeno tamano. Estos se retiran generalmente mediante centrifugacion o mediante filtracion. El mismo problema surge, aunque a menor escala, con las protelnas secretadas directamente debido a la muerte natural de las celulas y a la liberacion de protelnas intracelulares de celulas huesped en el transcurso de la serie de production de protelnas.

Como consecuencia, los procedimientos de purificacion tlpicos que se usan actualmente incluyen las siguientes etapas:

- lisis celular para recuperar una protelna intracelular o para la recuperation de una protelna de los medios en el caso de una protelna secretada

- retirada de desechos celulares usando, por ejemplo, filtracion o centrifugacion diferencial para obtener una muestra clarificada que contiene la protelna de interes

- uso de una variedad de medios de cromatografla en un procedimiento de multiples etapas para separar la protelna de interes de otras protelnas y las otras impurezas diversas en la muestra.

Las tecnicas cromatograficas normalmente separan mezclas de protelnas basandose en su cambio, grado de hidrofobicidad o tamano. Se dispone de varias resinas de cromatografla diferentes para cada una de estas tecnicas, permitiendo la adaptation precisa del esquema de purificacion a la protelna particular implicada. La esencia de cada uno de estos metodos de separacion es que pueden producirse protelnas que o bien se descienden a diferentes velocidades a lo largo de una columna, logrando una separacion flsica que aumenta a medida que bajan adicionalmente por la columna, o bien se adhieren selectivamente al medio de separacion, eluyendose entonces de manera diferencial mediante disolventes diferentes. En algunos casos, la protelna deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren especlficamente a la columna y la protelna de interes no, es decir, la protelna de interes esta presente en la “fraction de flujo continuo”.

La cromatografla de intercambio ionico, denominada as! por el contraion intercambiable, es un procedimiento aplicable para la purificacion de moleculas ionizables. Las moleculas ionizadas se separan basandose en la interaction electrostatica no especlfica de sus grupos cargados con moleculas con carga opuesta unidas a la matriz de soporte de fase solida, retardando de ese modo aquellas moleculas ionizadas que interaccionan mas fuertemente con la fase solida. La carga neta de cada tipo de molecula ionizada, y su afinidad por la matriz, varla segun el numero de grupos cargados, la carga de cada grupo y la naturaleza de las moleculas que compiten por la interaccion con la matriz de fase solida cargada. Estas diferencias dan como resultado la resolution de diversos tipos de molecula mediante cromatografla de intercambio ionico. En la purificacion de protelnas tlpica usando cromatografla de intercambio ionico, se aplica una mezcla de muchas protelnas derivadas de una celula huesped,

tal como en cultivo de celulas de mamlfero, a una columna de intercambio ionico. Una vez eliminadas las moleculas que no se unen, se ajustan las condiciones, tal como cambiando el pH, la concentracion del contraion y similares en un modo por etapas o en gradiente, para liberar de la fase solida una protelna ionizada no retenida especlficamente o retardada de interes y para separarla de protelnas que tienen diferentes caracterlsticas de carga. La cromatografla 5 de intercambio anionico implica la competicion de una molecula anionica de interes con el contraion negativo para su interaction con una molecula cargada positivamente unida a la matriz de fase solida al pH y en las condiciones de un procedimiento de separation particular. En cambio, la cromatografla de intercambio cationico implica la competicion de una molecula cationica de interes con el contraion positivo para una molecula cargada negativamente unida a la matriz de fase solida al pH y en las condiciones de un procedimiento se separacion 10 particular. La cromatografla de intercambio ionico en modo mixto implica el uso de una combination de medios cromatograficos de intercambio cationico o anionico en la misma etapa. En particular, “modo mixto” se refiere a una matriz de soporte de fase solida a la que se une covalentemente una mezcla de restos de interaccion hidrofobos y de intercambio cationico y/o intercambio anionico.

La cromatografla de afinidad, que se aprovecha de una interaccion especlfica estructuralmente dependiente (es 15 decir, espacialmente complementaria) entre la protelna que va a purificarse y un agente de captura inmovilizado, es una option de purification convencional para algunas protelnas, tales como anticuerpos. La protelna A, por ejemplo, es un adsorbente util para la cromatografla de afinidad de protelnas, tales como anticuerpos, que contienen una region Fc. La protelna A es una protelna de la pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se une con alta afinidad (aproximadamente 10-8 M a la IgG humana) a la region Fc de anticuerpos. Pese a su uso comun, la 20 cromatografla de afinidad es costosa, particularmente a la escala industrial necesaria para purificar protelnas terapeuticas.

Metodos cromatograficos adicionales son la cromatografla con hidroxiapatita o la cromatografla de interaccion hidrofoba (CIH).

Por consiguiente, los procedimientos de purificacion tlpicos incluyen diferentes etapas de centrifugation y filtration, 25 as! como al menos 3 tecnicas de separacion cromatografica tales como cromatografla de afinidad (CA), cromatografla de permeation en gel (CPG), cromatografla de intercambio ionico (CII), cromatografla de interaccion hidrofoba (CIH), cromatografla de fase inversa (CFI) y cromatografla de fase normal (CFN). Habitualmente, cada una de las tecnicas nombradas requiere condiciones de funcionamiento diferentes (tampon, pH, conductividad) que conducen a la preparation de la muestra antes de la implementation de la separacion cromatografica. Podrla 30 lograrse un procedimiento de purificacion mas eficaz y economico eliminando las etapas de plegamiento/preparacion de la muestra entremedias de las etapas de purificacion mediante la combinacion directa de diversos modos cromatograficos en un tren de purificacion.

La tecnica de cromatografla discontinua simple esta bien aceptada en las aplicaciones industriales, sin embargo, esta tecnologla es cara debido a los tiempos largos de procesamiento y altos costes de funcionamiento (por ejemplo, 35 grandes cantidades de disolvente, resinas y hardware caros). Esta tecnica tambien es sensible a las condiciones de funcionamiento (por ejemplo, tltulo del producto, tiempo de residencia y velocidad de alimentation (comenzando las perdidas de producto a partir de valores de capacidad de union dinamica del 80%).

Tambien se desarrollaron algunas tecnologlas semicontinuas alternativas, lo que significa que conectan dos o tres modos de cromatografla diferentes, pero no permiten que uno tenga una alimentacion continua.

40 El documento WO 2011/037522 da a conocer un sistema de separacion que comprende al menos dos unidades de separacion que estan conectadas salida con entrada. Todas las columnas estan conectadas en llnea.

El documento WO 2011/017514 da a conocer la combinacion de una etapa de cromatografla de afinidad y dos etapas de cromatografla de intercambio ionico sin necesidad de mantener tanques ni etapas de intercambio de tampon.

45 El documento WO 2009/045897 da a conocer sistemas y metodos para purificar protelnas para lo que varias columnas de cromatografla diferentes estan en serie con etapas intermedias.

Isabelle Francois et al., Journal of Chromatography A, 1178 (2008), 33-42 dan a conocer un metodo de cromatografla bidimensional con dos columnas paralelas en la segunda dimension.

Sin embargo, todavla existe la necesidad de una solution mas eficaz y economica.

50 Breve description de la invention

Sorprendentemente, se ha encontrado un sistema que no solo permite la conexion de unidades de separacion (columnas) sino que tambien permite una alimentacion continua. Esto se logra proporcionando al menos dos

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columnas de captura.

La presente invention se refiere, por tanto, a un aparato que comprende

- dos unidades de separation A1 y A2 que tienen ambas la misma matriz de cromatografia y una unidad de separation B que tiene una matriz de cromatografia que difiere de la matriz de cromatografia de las unidades de separacion A1 y A2, teniendo todas las unidades de separacion una entrada de fluido y una salida de fluido, para lo que hay al menos conexion de fluido entre la salida de fluido de la unidad de separacion A1 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B y conexion de fluido entre la salida de fluido de la unidad de separacion A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B (linea de conexion C-P en las figuras 2, 3 y 4)

- al menos una valvula en la conexion de fluido entre las columnas de separacion A1 y A2 y la columna de separacion B que permite cambiar entre comunicacion de fluido entre la salida de fluido de la columna de separacion A1 y la entrada de fluido de la columna de separacion B y comunicacion de fluido entre la salida de fluido de la columna de separacion A2 y la entrada de fluido de la columna de separacion B.

- al menos dos depositos de tampon y al menos dos bombas para lo que los depositos de tampon estan al menos en conexion de fluido con las entradas de las unidades de separacion A1 y A2 y las bombas se usan para transportar el hquido desde los depositos hacia las unidades de separacion

- un deposito que contiene disolucion de muestra (alimentation de muestra), que esta en conexion de fluido con la entrada de las unidades de separacion A1 y A2

En una realization, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografia de afinidad, una de intercambio cationico, una de cromatografia de intercambio anionico o una matriz de intercambio cationico en modo mixto.

En otra realizacion, la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografia de intercambio cationico, una de intercambio anionico en modo mixto o una de intercambio anionico.

En otra realizacion, la unidad de separacion B tiene una mezcla de matrices que incluyen una matriz de cromatografia de intercambio cationico y una de intercambio anionico o una matriz de intercambio anionico en modo mixto o una matriz de intercambio cationico en modo mixto y una matriz de intercambio anionico.

En una realizacion preferida, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografia de afinidad y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografia de intercambio cationico.

En otra realizacion preferida, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografia de afinidad y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografia de intercambio anionico o una de intercambio anionico en modo mixto.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografia de afinidad y la unidad de separacion B tiene una mezcla de una matriz de cromatografia de intercambio anionico y una de intercambio cationico.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografia de afinidad y la unidad de separacion B tiene una mezcla de una matriz de cromatografia de intercambio anionico y una de intercambio cationico en modo mixto o una mezcla de una matriz de cromatografia de intercambio cationico y una de intercambio anionico en modo mixto o una mezcla de una matriz de cromatografia de intercambio cationico en modo mixto y una de intercambio anionico en modo mixto.

En otra realizacion preferida, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografia de intercambio cationico o una de intercambio cationico en modo mixto y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografia de intercambio anionico o una de intercambio anionico en modo mixto.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografia de intercambio anionico o una de intercambio anionico en modo mixto y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografia de intercambio cationico o una de intercambio cationico en modo mixto.

En otra realizacion preferida, dos unidades de separacion A1 y A2 tienen ambas al menos una valvula de selection de fluido en la salida de la unidad de separacion, para lo que al menos un canal de las valvulas de seleccion de fluido en las salidas de las unidades de separacion A1 y A2 esta conectado con la entrada de la unidad de separacion B (a traves de una linea de conexion), que permite el control (inicio y detention) de una comunicacion de

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fluido entre la unidad de separacion A1 y la unidad de separacion B y entre la unidad de separacion A2 y la unidad de separacion B.

En otra realizacion preferida, la unidad de separacion B tiene una valvula de seleccion de fluido en la salida de la unidad de separacion.

En otra realizacion preferida, las unidades de separacion A1 y A2 tienen ambas al menos una valvula de seleccion de fluido en la entrada de la unidad de separacion.

En una realizacion preferida, el aparato comprende ademas una llnea de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A1 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A2 y una llnea de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A1 (llneas de conexion F-F en las figuras 2, 3 y 4), permitiendo, por tanto, una comunicacion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A1 y la entrada de la unidad de separacion A2 as! como una comunicacion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A2 y la entrada de la unidad de separacion A1. En una realizacion muy preferida, al menos una valvula esta ubicada en la llnea de conexion entre la salida de la unidad de separacion A1 y la entrada de la unidad de separacion A2 y al menos una valvula esta ubicada en la llnea de conexion entre la salida de la unidad de separacion A2 y la entrada de la unidad de separacion A1. Normalmente, las valvulas estan ubicadas cerca de las salidas de las unidades de separacion A1 y A2 y/o cerca de las entradas de las unidades de separacion A1 y A2.

En otra realizacion preferida, el aparato comprende dos llneas de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A1 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A2 y dos llneas de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A1 (llneas de conexion F-F y W-F en la figura 4), permitiendo, por tanto, una comunicacion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A1 y la entrada de la unidad de separacion A2, as! como una comunicacion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A2 y la entrada de la unidad de separacion A1. En una realizacion muy preferida, las valvulas estan ubicadas cerca de la entrada y la salida de las unidades de separacion A1 y A2 y las llneas de conexion parten de estas valvulas.

En otra realizacion preferida, al menos dos depositos de tampon estan en conexion de fluido con las entradas de las unidades de separacion A1 y A2. Una o mas valvulas y/o entradas de fluido adicionales podrlan estar ubicadas en la llnea de conexion entre los depositos de tampon y las entradas de las unidades de separacion A1 y A2.

En otra realizacion preferida, el aparato comprende ademas una o mas entradas de fluido adicionales antes de las entradas de fluido de las unidades de separacion A2 y A1, preferiblemente de una llnea de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A1 y de una llnea de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A1 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A2.

En otra realizacion preferida, el aparato comprende una entrada de fluido adicional antes de la entrada de fluido de la columna B lo que significa que preferiblemente una llnea de conexion con uno o mas depositos esta ubicada antes de la entrada de fluido de la columna B en la llnea de conexion entre las salidas de columnas A1 y A2 y la entrada de columna B.

En otra realizacion preferida, el aparato comprende un deposito adicional con tampon de inactivacion de virus que esta al menos en conexion de fluido con la entrada de una de las tres unidades de separacion.

La presente invencion se refiere ademas a un metodo continuo de purificacion de una molecula objetivo de una o mas impurezas en una muestra, comprendiendo el metodo las etapas de

- cargar alternativamente la muestra en las unidades de separacion A1 y A2 de modo que mientras que la muestra se carga en la unidad de separacion A1, en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion A1, la unidad de separacion A2 esta al menos en parte en comunicacion de fluido con la unidad de separacion B de modo que la molecula objetivo cargada en la unidad de separacion A2 se eluye sobre la unidad de separacion B y la unidad de separacion a2 se reequilibra, y mientras que la muestra se carga en la unidad de separacion A2 en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion A2, la unidad de separacion A1 esta al menos en parte en comunicacion de fluido con la unidad de separacion B de modo que la molecula objetivo se eluye sobre la unidad de separacion B y la unidad de separacion A1 se reequilibra

- recuperar la molecula objetivo de la salida de fluido de la unidad de separacion B.

En una realizacion preferida, la molecula objetivo es un anticuerpo.

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En una realizacion preferida, la muestra se carga de manera continua alternativamente a o bien la unidad de separacion A1 o bien la unidad de separation A2.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 estan dispuestas en el modo de union y elusion y la unidad de separacion B esta dispuesta en el modo de flujo continuo.

En otra realizacion preferida, mientras se carga la muestra sobre la unidad de separacion A1, la salida de fluido de la unidad de separacion A1 esta al menos en parte en comunicacion de fluido con la entrada de fluido de la unidad de separacion A2 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A1 para que se una a la unidad de separacion A2. Y mientras se carga la muestra sobre la unidad de separacion A2, la salida de fluido de la unidad de separacion A2 esta preferiblemente al menos en parte en comunicacion de fluido con la entrada de fluido de la unidad de separacion A1 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A2 para que se una a la unidad de separacion A1.

En otra realizacion preferida, mientras se lava la muestra no unida de la unidad de separacion A1, la unidad de separacion A2 esta al menos en parte en comunicacion de fluido con el deposito que contiene disolucion de muestra y con la unidad de separacion A1. Esto significa que la unidad de separacion A2 se carga simultaneamente con muestra no unida que se eluye de la unidad A1 y con disolucion de muestra que procede del deposito. Y mientras se lava la muestra no unida de la unidad de separacion A2, la unidad de separacion A1 esta en comunicacion de fluido con el deposito que contiene disolucion de muestra y con la unidad de separacion A2.

En otra realizacion preferida, mientras la unidad de separacion B esta en comunicacion de fluido con la unidad de separacion A1, tambien esta en comunicacion de fluido con un deposito de tampon. Y mientras la unidad de separacion B esta en comunicacion de fluido con la unidad de separacion A2, tambien esta en comunicacion de fluido con un deposito de tampon.

En una realizacion preferida, se bombea un tampon de inactivation de virus a traves de las unidades de separacion A1 y A2 tras cargar las unidades con la molecula objetivo.

En otra realizacion, si la unidad de separacion B esta dispuesta en el modo de union/elucion, se bombea un tampon de inactivacion de virus a traves de la unidad de separacion B tras cargar la unidad con la molecula objetivo.

En una realizacion preferida, la muestra sometida al metodo de la presente invention es una muestra clarificada. Esto significa que antes de cargar la muestra en la unidad de separacion A1 o A2 se clarifica sometiendola a uno o mas de los siguientes: centrifugation, filtration y/o sedimentation. En una realizacion muy preferida, la muestra se trata con un agente precipitante antes de la clarification mediante centrifugacion, filtracion y/o sedimentacion.

Figuras

La figura 1 muestra una vista esquematica de una realizacion preferida del aparato segun la presente invencion. Muestra las dos unidades de separacion por captura (CIEX), una unidad de separacion por pulido (AIEX), los depositos (CIP, VI, E.A, E.B, Dil., alimentation, CIP, E.A, E. B) as! como las llneas de conexion, valvulas, bombas y detectores.

Las figuras 2, 3 y 4 muestran esquematicamente diferentes realizaciones del aparato segun la invencion. La figura 2 muestra una configuration que se limita principalmente a las caracterlsticas esenciales pero, por ejemplo, tiene una entrada de fluido adicional antes de unidad de separacion B (entrada C). La figura 3 muestra una configuracion que comprende adicionalmente conexion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A1 y la entrada de la unidad de separacion A2 as! como conexion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A2 y la entrada de la unidad de separacion A2 (llnea de conexion F-F). La figura 4 muestra una configuracion con dos llneas de conexion que permiten la conexion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A1 y la entrada de la unidad de separacion A2 as! como dos llneas de conexion que permiten la conexion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A2 y la entrada de la unidad de separacion A2 (llnea de conexion F-F, llnea de conexion W-F).

La figura 5 muestra una realizacion del aparato segun la invencion con tres unidades de separacion por captura A1, A2 y A3 y dos unidades de separacion por pulido B1 y B2.

Definiciones

Antes de describir la presente invencion en detalle, ha de entenderse que esta invencion no se limita a composiciones o etapas de procedimiento especlficas, ya que estas pueden variar. Debe observarse que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, la forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un ligando” incluye una pluralidad de ligandos y la referencia a “un anticuerpo” incluye una pluralidad de anticuerpos y

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similares.

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica al que se refiere esta invencion. Los siguientes terminos se definen para los fines de la invencion tal como se describe en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento el termino “molecula objetivo” se refiere a cualquier molecula, sustancia o compuesto o mezclas de los mismos que deben aislarse, separarse o purificarse de una o mas impurezas en una muestra. En una realizacion preferida, la molecula objetivo es una protelna o una mezcla de dos o mas protelnas. En una realizacion muy preferida, la molecula objetivo es un anticuerpo.

El termino “anticuerpo” se refiere a una protelna que tiene la capacidad para unirse especlficamente a un antlgeno. Normalmente, los anticuerpos tienen una estructura basica de cuatro cadenas polipeptldicas que consisten en dos cadenas pesadas y dos ligeras, estabilizandose dichas cadenas, por ejemplo, mediante enlaces de sulfuro entre cadenas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomerica o polimerica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamerica y/o anticuerpos IgA que existen en forma monomerica, dimerica o multimerica. Los anticuerpos tambien pueden incluir anticuerpos multiespeclficos (por ejemplo, anticuerpos biespeclficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que conserven, o se modifiquen para comprender, un dominio de union especlfico de ligando. El termino “fragmento” se refiere a una parte o porcion de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoacido que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse a traves de tratamiento qulmico o enzimatico de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos tambien pueden obtenerse mediante medios recombinantes. Cuando se producen de manera recombinante, los fragmentos pueden expresarse solos o como parte de una protelna mas grande denominada protelna de fusion. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv. Las protelnas de fusion a modo de ejemplo incluyen protelnas de fusion de Fc. Segun la presente invencion, las protelnas de fusion estan englobadas por el termino “anticuerpo”.

Tal como se comento anteriormente, en algunas realizaciones, un anticuerpo es una protelna que contiene una region Fc, por ejemplo, una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una protelna que contiene una region Fc es una protelna recombinante que incluye la region Fc de una inmunoglobulina fusionada a otro polipeptido o a un fragmento del mismo. Los polipeptidos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, renina; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoprotelnas; a-1-antitripsina; cadena a de insulina; cadena b de insulina; proinsulina; hormona estimulante del follculo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulacion tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes tales como protelna C; factor natriuretico auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminogeno, tal como urocinasa o activador de plasminogeno humano de tipo tisular o de orina (t- PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyetico; factor de necrosis tumoral a y b; encefalinasa; RANTES (quimiocina regulada por activacion, expresada y secretada normalmente por celulas T); protelna inflamatoria de macrofagos humana (MIP-1-a); una albumina serica tal como albumina serica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena a de relaxina; cadena b de relaxina; pro-relaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una protelna microbiana, tal como b-lactamasa; ADNasa; IgE; un antlgeno asociado a linfocito T citotoxico (CTLA) (por ejemplo, CTLA-4); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; protelna A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como factor neurotrofico derivado de huesos (BdNf), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT- 6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-b; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-b, incluyendo TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-b4 o TGF-b5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I y IGF-II); des(I-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), protelnas de union a factor de crecimiento similar a la insulina (IGfBp); protelnas CD tales como Cd3, CD4, CD8, cD 19, CD20, CD34 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una protelna morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon- a, b y g factor estimulante de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-I a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de celulas T; protelnas de la superficie de membranas; factor acelerador de la degradacion; antlgeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envuelta del virus del sida; protelnas transportadoras; receptores de migration; adresinas; protelnas reguladoras; integrinas tales como CDI Ia, CDI Ib, CDI Ic, CD 18, una ICaM, VLA-4 y VCAM; un antlgeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipeptidos enumerados anteriormente. Ademas, un anticuerpo segun la presente invencion es cualquier protelna o polipeptido, fragmento o variante del mismo, que se une especlficamente a cualquiera de los polipeptidos enumerados anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, y a menos que se indique otra cosa, el termino “muestra” se refiere a cualquier composition o mezcla que contiene una molecula objetivo. Las muestras pueden derivarse de fuentes biologicas o de otras. Las fuentes biologicas incluyen fuentes eucariotas y procariotas, tales como celulas, tejidos y

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organos de plantas y animales. La muestra tambien puede incluir diluyentes, tampones, detergentes y especies contaminantes, desechos y similares que se encuentran mezclados con la molecula objetivo. La muestra puede estar “parcialmente purificada” (es decir, haberse sometido a una o mas etapas de purification, tales como etapas de filtration) o puede obtenerse directamente de una celula u organismo huesped que produce la molecula objetivo (por ejemplo, la muestra puede comprender fluido recogido de cultivo celular).

El termino “impureza” o “contaminante” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula extrana u objetable, incluyendo una macromolecula biologica tal como ADN, ARN, una o mas protelnas de celulas huesped, endotoxinas, llpidos y uno o mas aditivos que pueden estar presentes en una muestra que contiene una molecula objetivo que esta separandose de una o mas de las moleculas extranas u objetables usando un procedimiento de la presente invention. Adicionalmente, una impureza de este tipo puede incluir cualquier reactivo que se use en una etapa que puede producirse antes del metodo de la invencion.

Los terminos “purificar”, “separar” o “aislar”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a aumentar el grado de pureza de una molecula objetivo de una composition o muestra que comprende la molecula objetivo y una o mas impurezas. Normalmente, el grado de pureza de la molecula objetivo aumenta retirando (completa o parcialmente) al menos una impureza de la composicion.

Los terminos “procedimiento de flujo continuo” “modo de flujo continuo” y “cromatografla de flujo continuo”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a una tecnica de separation de productos en la que se desea que al menos un producto (por ejemplo, una protelna que contiene una region Fc) contenido en una muestra junto con uno o mas contaminantes fluya de manera continua a traves de una resina o medio cromatografico, mientras que al menos un contaminante o impureza potencial se une a la resina o medio cromatografico. El “modo de flujo continuo” es generalmente una operation isocratica (es decir, un procedimiento de cromatografla durante el cual no cambia la composicion de la fase movil).

En algunas realizaciones segun los metodos reivindicados y tal como se describe en los ejemplos expuestos en el presente documento, los metodos, por ejemplo, emplean una etapa de cromatografla de intercambio anionico y/o cationico que se realiza en un modo de flujo continuo.

Los terminos “modo de union y elucion” y “procedimiento de union y elucion”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a una tecnica de separacion de productos en la que al menos un producto (molecula objetivo) contenido en una muestra (por ejemplo, una protelna que contiene una region Fc) se une a una resina o medio cromatografico y posteriormente se eluye.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “deposito” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier recipiente, tanque o bolsa, que puede usarse para almacenar cualquier tampon que va a usarse cuando se realiza el metodo de la invencion o la muestra o cualquier otro llquido que se use en el metodo de la invencion. Adicionalmente un “deposito” es un recipiente, tanque o bolsa que se usa para recoger la salida de una etapa de procedimiento (por ejemplo, un eluato de una columna).

Tal como se usa en el presente documento, el termino “dilution en llnea” se refiere a una etapa de intercambio de tampon o a un ajuste del estado de disolucion en llnea, que normalmente es una alternativa en muchos procedimientos convencionales al uso de un tanque de contention. En una dilucion en llnea tlpica, pueden mezclarse o titularse dos disoluciones durante la transferencia usando una combination de disoluciones en una tuberla o recipiente de mezclado, dispositivo o aparato de filtracion. Por ejemplo, puede requerirse diluir una disolucion con el fin de reducir la conductividad combinando la disolucion con otra disolucion de conductividad menor. El intercambio de tampon puede llevarse a cabo con la ayuda de dispositivos de filtracion, tales como diafiltracion, ultrafiltracion y similares. En algunas realizaciones segun la invencion reivindicada, los metodos proporcionan un procedimiento mejorado para purificar protelnas, que elimina la necesidad de una etapa de intercambio de tampon.

El termino “cromatografla” se refiere a cualquier tipo de tecnica que separa un analito de interes (por ejemplo, una molecula objetivo) de otras moleculas presentes en una mezcla. Habitualmente, la molecula objetivo se separa de otras moleculas como resultado de diferencias en las velocidades a las que migran las moleculas individuales de la mezcla a traves de un medio estacionario bajo la influencia de una fase movil, o en procedimientos de union y elucion.

Los terminos “matriz” o “matriz de cromatografla” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a cualquier tipo de sorbente, resina o fase solida que en un procedimiento de separacion separa una molecula objetivo (por ejemplo, una protelna que contiene una region Fc tal como un inmunoglobulina) de otras moleculas presentes en una mezcla. Habitualmente, la molecula objetivo se separa de otras moleculas como resultado de diferencias en las velocidades a las que migran las moleculas individuales de la mezcla a traves de la matriz bajo la influencia de una fase movil, o en procedimientos de union y elucion. Los ejemplos no limitativos

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incluyen resinas particuladas, monollticas o fibrosas as! como membranas que pueden colocarse en columnas o cartuchos. Los ejemplos de materiales para formar la matriz incluyen polisacaridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecanicamente estables tales como sllice (por ejemplo, vidrio de poro controlado), poli(estirendivinil) benceno, poliacrilamida, partlculas de ceramica y derivados de cualquiera de los anteriores. Ejemplos para tipos de matriz tlpicos adecuados para el metodo de la presente invencion son resinas de intercambio cationico, resinas de afinidad, resinas de intercambio anionico o resinas en modo mixto.

Un “ligando” es un grupo funcional que se une a la matriz de cromatografla y que determina las propiedades de union de la matriz. Los ejemplos de “ligandos” incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio ionico, grupos de interaccion hidrofoba, grupos de interaction hidrofila, grupos de interacciones tiofilas, grupos de afinidad con metal, grupos de afinidad, grupos de bioafinidad y grupos en modo mixto (combinaciones de los mencionados anteriormente). Algunos ligandos preferidos que pueden usarse en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio cationico fuerte, tales como sulfopropilo, acido sulfonico; grupos de intercambio anionico fuerte, tales como cloruro de trimetilamonio; grupos de intercambio cationico debil, tales como acido carboxllico; grupos de intercambio anionico debil, tales como N5N dietilamino o DEAE; grupos de interaccion hidrofoba, tales como fenilo, butilo, propilo, hexilo; y grupos de afinidad, tales como protelna A, protelna G y protelna L.

El termino “cromatografla de afinidad” se refiere a una tecnica de separation de protelnas en la que una protelna objetivo (por ejemplo, una protelna que contiene una region Fc de interes o anticuerpo) se une especlficamente a un ligando que es especlfico para la protelna objetivo. Un ligando de este tipo generalmente se denomina un ligando bioespeclfico. En algunas realizaciones, el ligando bioespeclfico (por ejemplo, protelna A o una variante funcional de la misma) se une covalentemente a un material de matriz de cromatografla y es accesible para la protelna objetivo en disolucion cuando la disolucion entra en contacto con la matriz de cromatografla. La protelna objetivo generalmente conserva su afinidad de union especlfica para el ligando bioespeclfico durante las etapas cromatograficas, mientras que otros solutos y/o protelnas en la mezcla no se unen de manera apreciable o especlfica al ligando. La union de la protelna objetivo al ligando inmovilizado permite que las protelnas contaminantes o impurezas proteicas se hagan pasar a traves de la matriz de cromatografla mientras que la protelna objetivo permanece unida especlficamente al ligando inmovilizado en la fase solida material. Entonces se retira la protelna objetivo unida especlficamente en forma activa del ligando inmovilizado en condiciones adecuadas (por ejemplo, pH bajo, pH alto, alta concentration de sal, ligando de competition, etc.), y se hace pasar a traves de la columna cromatografica con el tampon de elucion, libre de las protelnas contaminantes o impurezas proteicas que se hablan permitido pasar anteriormente a traves de la columna. Puede usarse cualquier componente como ligando para purificar sus protelnas de union especlficas respectivas, por ejemplo, un anticuerpo. Sin embargo, en diversos metodos segun la presente invencion, se usa protelna A como ligando para una protelna objetivo que contiene una region Fc. Las condiciones para la elucion del ligando bioespeclfico (por ejemplo, protelna A) de la protelna objetivo (por ejemplo, una protelna que contiene una region Fc) pueden determinarse facilmente por un experto habitual en la tecnica. En algunas realizaciones, puede usarse protelna G o protelna L o una variante funcional de la misma como ligando bioespeclfico. En algunas realizaciones, se usa un ligando bioespeclfico tal como protelna A a un intervalo de pH de 5-9 para unirse a una protelna que contiene una region Fc, lavando o re-equilibrando el conjugado de ligando bioespeclfico / protelna objetivo, seguido por elucion con un tampon que tiene un pH de aproximadamente o inferior a 4 que contiene al menos una sal.

El termino “intercambio ionico” y “cromatografla de intercambio ionico” se refiere al procedimiento cromatografico en el que un soluto o analito de interes (por ejemplo, una protelna objetivo que contiene una region Fc) en una mezcla interacciona con un compuesto cargado unido (tal como mediante union covalente) a un material de intercambio ionico de fase solida de manera que el soluto o analito de interes interacciona de manera no especlfica con el compuesto cargado mas o menos que las impurezas o contaminantes del soluto en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla eluyen de una columna del material de intercambio ionico mas rapido o mas lento que el soluto de interes o se unen a o se excluyen de la resina en relation con el soluto de interes. “Cromatografla de intercambio ionico” incluye especlficamente cromatografla de intercambio cationico, de intercambio anionico y de intercambio ionico en modo mixto. Por ejemplo, la cromatografla de intercambio cationico puede unir la molecula objetivo (por ejemplo, una protelna objetivo que contiene una region Fc) seguido por elucion (cromatografla de intercambio cationico de union y elucion o “ClEx”) o puede unir predominantemente las impurezas mientras que la molecula objetivo “fluye de manera continua a traves de” la columna (cromatografla de intercambio cationico de flujo continuo FT-CIEX). La cromatografla de intercambio anionico puede unir la molecula objetivo (por ejemplo, una protelna objetivo que contiene una region Fc) seguido por elucion o puede unir predominantemente las impurezas mientras que la molecula objetivo “fluye de manera continua a traves de” la columna. En algunas realizaciones y tal como se demuestra en los ejemplos expuestos en el presente documento, la etapa de cromatografla de intercambio anionico se realiza en un modo de flujo continuo.

La expresion “matriz de intercambio ionico” se refiere a una matriz de cromatografla que esta cargada negativamente (es decir, una resina de intercambio cationico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio anionico). La carga puede proporcionarse uniendo uno o mas ligando cargados a la matriz, por ejemplo, mediante union covalente. Alternativamente, o ademas, la carga puede ser una propiedad inherente de la matriz (por

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ejemplo, como es el caso para la sllice, que tiene una carga negativa global).

Una “matriz de intercambio cationico” se refiere a una matriz de cromatografla que esta cargada negativamente y que, por tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una disolucion acuosa que se hace pasar sobre o a traves de la fase solida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase solida para formar la resina de intercambio cationico puede ser, por ejemplo, un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio cationico disponibles comercialmente incluyen carboximetilcelulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado en agarosa (por ejemplo, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™ de Pharmacia) y sulfonilo inmovilizado en agarosa (por ejemplo, S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de Pharmacia). Se prefiere Fractogel® EMD SO3, Fractogel® EMD SE Highcap, Eshmuno ® S y Fractogel ® EMD COO (Merck).

Una matriz en “modo mixto” es una matriz de cromatografla que porta al menos dos tipos de funcionalidades que pueden interaccionar con la molecula objetivo y/o las impurezas. Tales funcionalidades pueden ser grupos de intercambio ionico, grupos de interaction hidrofoba, grupos de interaction hidrofila, grupos de interacciones tiofilas, grupos de afinidad con metal, grupos de afinidad y grupos de bioafinidad. Matrices en modo mixto preferidas que van a usarse en la presente invention son matrices que portan al menos grupos de intercambio anionico y de intercambio cationico o matrices de intercambio ionico en modo mixto. “Portar al menos dos tipos de funcionalidades” significa en una realization que se proporciona un tipo de matriz que esta modificada covalentemente con al menos dos tipos de funcionalidades diferentes. Tambien es posible que la matriz en modo mixto este compuesta por una combination de dos o mas matrices diferentes que tiene cada una al menos una funcionalidad, para lo que la combinacion se realiza combinando las matrices en una unidad de separacion. En este caso, la matriz en modo mixto puede ser una mezcla de dos matrices diferentes, portando cada matriz al menos una funcionalidad, por ejemplo, puede ser una mezcla de una matriz de intercambio cationico y una matriz de intercambio anionico, ambas presentes, por ejemplo, en forma de partlculas sorbentes que pueden mezclarse facilmente en la unidad de separation. Tambien es posible acoplar una columna rellena con una primera matriz con otra columna rellena con una segunda matriz a una unidad de separacion de modo que el llquido de muestra este fluyendo a traves de ambas matrices.

Una “matriz de intercambio ionico en modo mixto” se refiere a una matriz de cromatografla que esta modificada covalentemente con restos cationicos y/o anionicos e hidrofobos. Una resina de intercambio ionico en modo mixto disponible comercialmente es BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) que contiene grupos de intercambio cationico debil, una baja concentration de grupos de intercambio anionico y ligandos hidrofobos unidos a una matriz de soporte de fase solida de gel de sllice. Las matrices de intercambio cationico en modo mixto normalmente tienen grupos de intercambio cationico y matrices hidrofobas. Matrices de intercambio cationico en modo mixto adecuadas son Capto® MMC (GE Healthcare) y Eshmuno® HCX (Merck).

Matrices de intercambio anionico en modo mixto normalmente tienen grupos de intercambio anionico y restos hidrofobos. Matrices de intercambio anionico en modo mixto adecuadas son Capto ® Adhere (GE Healthcare).

El termino “matriz de intercambio anionico” se usa en el presente documento para referirse a una matriz de cromatografla que esta cargada positivamente, por ejemplo, que tiene uno o mas ligandos cargados positivamente, tales como amino grupos cuaternarios, unidos a la misma. Las resinas de intercambio anionico disponibles comercialmente incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia). Materiales preferidos son Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE highcap, Eshmuno ® Q y Fractogel® EMD DEAE.

Los terminos “protelna A” y “Prot A” se usan de manera intercambiable en el presente documento y engloban protelna A recubierta de una fuente nativa de la misma, protelna A producida de manera sintetica (por ejemplo, mediante slntesis de peptidos o mediante tecnicas recombinantes) y variantes de la misma que conservan la capacidad para unirse a protelnas que tienen una region CH2/CH3, tal como una region Fc. La protelna A puede adquirirse comercialmente de Repligen, Pharmacia y Fermatech. La protelna A se inmoviliza generalmente en una matriz de cromatografla. El termino “ProA” tambien se refiere a una matriz o columna de cromatografla de afinidad que contiene una matriz de soporte solida cromatografica a la que se une covalentemente la protelna A.

Un derivado, fragmento o variante funcional de la protelna A usado en los metodos segun la presente invencion puede caracterizarse por una constante de union de al menos K=10-8 M, y preferiblemente K=10-9 M, para la region Fc de IgG2a de raton o IgG1 humana. Una interaccion que se amolda a tal valor para la constante de union se denomina “union de alta afinidad” en el presente contexto. Preferiblemente, un derivado o variante funcional de protelna A de este tipo comprende al menos parte de un dominio de union a IgG funcional de protelna A de tipo natural, seleccionado de los dominios naturales E, D, A, B, C o mutantes obtenidos por ingenierla genetica de los mismos que tienen funcionalidad de union a IgG conservada.

Ademas, tambien pueden usarse derivados o variantes de protelna A obtenidos por ingenierla genetica que permiten una union en un unico punto en la etapa de cromatografla de afinidad en los metodos reivindicados.

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Union en un unico punto generalmente significa que el resto de protelna se une a traves de una unica union covalente a un material de soporte cromatografico de la cromatografla de afinidad con protelna A. Una union en un unico punto de este tipo tambien puede producirse mediante el uso de residuos reactivos adecuados que esta colocados en una posicion de aminoacido expuesto, concretamente en un bucle, cerca del extremo N o C-terminal o en otro sitio en la circunferencia externa del plegamiento de protelna. Tales grupos reactivos son por ejemplo funciones sulfhidrilo o amino.

El termino “matriz de cromatografla de afinidad” se usa en el presente documento para referirse a una matriz de cromatografla que porta ligandos adecuados para cromatografla de afinidad. Normalmente, los ligandos (por ejemplo, protelna A o una variante funcional de la misma) se unen covalentemente a un material de matriz de cromatografla y son accesibles a la molecula objetivo en disolucion cuando la disolucion entra en contacto con la matriz de cromatografla. Un ejemplo de una matriz de cromatografla de afinidad es una matriz de protelna A.

El termino “union” tal como se usa en el presente documento para describir interacciones entre una molecula objetivo (por ejemplo, una protelna que contiene una region Fc) y un ligando unido a una matriz (por ejemplo, protelna A unida a una resina o matriz de fase solida o), se refiere a la union generalmente reversible de la molecula objetivo a un ligando a traves de los efectos combinados de complementariedad espacial de, por ejemplo, las estructuras de la protelna y el ligando en un sitio de union acoplado con fuerzas electrostaticas, enlaces de hidrogeno, fuerzas hidrofobas y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de union. Generalmente, cuanto mayor es la complementariedad especial y cuanto mas fuerte sean las otras fuerzas en el sitio de union, mayor sera la especificidad de union de una protelna para su ligando respectivo. Los ejemplos no limitativos de union especlfica incluyen union de anticuerpo-antlgeno, union de enzima-sustrato, union de enzima-cofactor, quelacion de iones metalicos, union de protelna de union a ADN-ADN, interacciones reguladoras protelna-protelna, y similares. De manera ideal, en la cromatografla de afinidad se produce union especlfica con una afinidad de aproximadamente 10"4 a 10"8 M en disolucion libre.

El termino “detergente” se refiere a tensioactivos ionicos y no ionicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxameros (por ejemplo, poloxamero 188); Triton; dodecilsulfato de sodio (SDS); laurilsulfato de sodio; octilglicosido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetalna; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, o cetil-betalna; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betalna (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metilcocoil-taurato de sodio o metiloleil- taurato de disodio; y la serie MONAQU AT™ series (Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.). Detergentes utiles son un polisorbato, tal como polisorbato 20 (TWEEN 20®.) o polisorbato 80 (TWEEN 80®.) o diversos acidos, tales como acido octanoico.

Un “tampon” es una disolucion que resiste cambios en el pH mediante la accion de sus componentes de conjugado acido-base. Diversos tampones que pueden emplearse dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampon se describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). Los ejemplos no limitativos de tampones incluyen tampones MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, fosfato, acetato, citrato, succinato y amonio, as! como combinaciones de estos.

Segun la presente invencion, el termino “tampon” o “disolvente” se usa para cualquier composicion llquida que se use para cargar, lavar, eluir y reequilibrar las unidades de separacion.

Cuando “se carga” una columna de separation se usa un tampon para cargar la muestra o composicion que comprende la molecula objetivo (por ejemplo, una protelna objetivo que contiene una region Fc) y una o mas impurezas sobre una columna de cromatografla (por ejemplo, una columna de afinidad o una columna de intercambio ionico). El tampon tiene una conductividad y/o pH de manera que la molecula objetivo se une a la matriz de cromatografla mientras que de manera ideal las impurezas no se unen y fluyen de manera continua a traves de la columna.

Cuando “se carga” una columna de separacion para “hacer fluir de manera continua” una molecula objetivo, se usa un tampon para cargar la muestra o composicion que comprende la molecula objetivo (por ejemplo, una protelna objetivo que contiene una region Fc) y una o mas impurezas sobre una columna de cromatografla (por ejemplo, una columna de afinidad o una columna de intercambio ionico). El tampon tiene una conductividad y/o pH de manera que la molecula objetivo no se une a la matriz de cromatografla y fluye de manera continua a traves de la columna mientras que de manera ideal todas las impurezas se unen a la columna.

El termino “reequilibrar” se refiere al uso de un tampon para reequilibrar la matriz de cromatografla antes de cargar la molecula objetivo. Normalmente, para reequilibrar se usa el tampon de carga.

Mediante “lavado” de una matriz de cromatografla quiere decirse hacer pasar un tampon apropiado a traves o sobre la matriz. Normalmente, se usa lavado para retirar contaminantes debilmente unidos de la matriz antes de eluir la

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molecula objetivo.

En este caso, normalmente, el tampon de lavado y el tampon de carga son el mismo. En caso de que se use un tampon de inactivacion de virus, se usa para inactivar determinados virus presentes antes de eluir la molecula objetivo. En este caso, normalmente, el tampon de inactivacion de virus difiere del tampon de carga puesto que puede contener detergente/detergentes o tener propiedades diferentes (pH/conductividad/sales y sus cantidades).

“Eluir” una molecula (por ejemplo, un polipeptido de interes o una impureza) de una matriz de cromatografla quiere decir retirar la molecula de la misma alterando las condiciones de disolucion de manera que el tampon compite con la molecula de interes por los sitios de ligando en la resina de cromatografla. Un ejemplo no limitativo es eluir una molecula de una resina de intercambio ionico alterando la fuerza ionica del tampon que rodea el material de intercambio ionico de manera que el tampon compite con la molecula por los sitios cargados en el material de intercambio ionico.

El termino “inactivacion de virus”, o “VI” tal como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a cualquier procedimiento que pueda hacer que un virus no pueda infectar una celula o que pueda inhibir una funcion viral a traves de medios fisicoqulmicos. Los metodos tlpicos de inactivacion de virus incluyen, pero no se limitan a, tratamiento a pH bajo (por ejemplo, por debajo de pH 4,5, por debajo de 4,0 o por debajo de 3,8), tratamiento termico, tratamiento con tensioactivos y radiacion (por ejemplo, exposicion a luz ultravioleta). En algunas realizaciones, los metodos de inactivacion de virus se dirigen contra retrovirus.

En una realizacion particular, se usan condiciones de pH bajo para la inactivacion de virus ya que tales condiciones normalmente alteran la envuelta lipldica del virus, inactivando de ese modo el virus.

En una realizacion particular, se usan determinados tensioactivos para la inactivacion de virus ya que normalmente alteran el virus, inactivando de ese modo el virus (como Tween, Triton X-100, SDS).

Segun la presente invencion, una “unidad de separacion” es un equipo sobre el que puede realizarse una etapa de separacion cromatografica. Una unidad de separacion normalmente es una columna de cromatografla o cartucho de cromatografla que se llena con una matriz sorbente. Un experto en la tecnica conoce columnas de cromatografla. Normalmente comprenden un tubo de columna con accesorios de extremo para la entrada de fluido y la salida de fluido. El tubo de columna se llena con una matriz de cromatografla adecuada.

Segun la presente invencion, un procedimiento “continuo” es un procedimiento que no se ejecuta en modo discontinuo. En un procedimiento continuo segun la invencion, se carga una nueva muestra sobre las unidades de separacion A1 o A2 no solo una vez sino secuencialmente de manera alternante o bien en la unidad de separacion A1 o bien en la unidad de separacion A2 con solo pausas cortas o preferiblemente sin pausas entremedias.

Segun la invencion “secuencial” es dos veces o mas de dos veces.

Segun la presente invencion, una “llnea de conexion” es cualquier tubo, manguito, tuberla o canal que es adecuado para hacer fluir llquidos a su traves. Una llnea de conexion puede estar interrumpida por una o mas valvulas. Una llnea de conexion podrla ser recta o ramificada. Segun la presente invencion si dos partes de un aparato estan “en conexion de fluido” significa que hay una llnea de conexion entre las dos partes del aparato de modo que puede fluir llquido desde una parte hacia la otra. Esta llnea de conexion puede ser directa o puede estar interrumpida por una o mas valvulas, por una unidad de separacion u otras partes del aparato. El termino “en conexion de fluido” engloba una conexion de fluido que es permanente pero tambien engloba una conexion de fluido que no es permanente y esta compuesta por una llnea de conexion que esta interrumpida, por ejemplo, por una o mas valvulas de modo que el flujo de llquido a traves de la llnea de conexion puede iniciarse y detenerse cuando sea necesario. Normalmente, la mayorla de las partes del aparato que estan en conexion de fluido tienen una conexion de fluido que no es permanente. Por ejemplo, si un deposito de tampon esta en conexion de fluido con una unidad de separacion, esto significa que puede producirse un flujo del tampon hacia la columna si es necesario, pero normalmente hay al menos una valvula ubicada en la llnea de conexion entre el deposito y la unidad de separacion de modo que el flujo de llquido puede detenerse cuando sea necesario e iniciarse cuando sea necesario. Si se produce realmente un flujo de llquido entre dos partes del aparato que estan en conexion de llquido y, por tanto, se hace fluir llquido a traves de la llnea de conexion entre las dos partes, estas dos partes estan en “comunicacion de fluido”. Por consiguiente, “comunicacion de fluido” segun la presente invencion describe el estado en que se usa realmente una “conexion de fluido” haciendo fluir llquido a traves de la llnea de conexion. Si dos partes del sistema estan parcialmente en comunicacion de fluido, significa que la comunicacion de fluido no es permanente y que el llquido no esta fluyendo permanentemente desde una parte hacia la otra sino solo parte del tiempo. Normalmente, el flujo del llquido entre dos partes del sistema se inicia y/o se detiene con la ayuda de valvulas que dirigen el flujo de llquido.

Una “entrada de fluido” o “entrada” es cualquier medio que permite la introduccion de llquido. Una entrada de la unidad de separacion es, por ejemplo, el accesorio de extremo de una columna de cromatografla al que puede

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conectarse una ilnea de conexion. Una entrada tambien puede ser una valvula que proporciona la introduction de llquido en una llnea de conexion. Una entrada tambien puede ser el extremo de una llnea de conexion.

Una “salida” o “salida de fluido” es cualquier medio que permite la retirada de un llquido. Una salida de la unidad de separation es, por ejemplo, el accesorio de extremo de una columna de cromatografla al que puede conectarse una llnea de conexion. Una salida tambien puede ser una valvula que proporciona la introduccion de llquido en una llnea de conexion. Una salida tambien puede ser el extremo de una llnea de conexion.

Una “valvula de selection de fluido” es cualquier medio que permite una comunicacion de fluido selectivamente entre cualquier fluido conectado y la parte del sistema. Una valvula de seleccion de fluido es, por ejemplo, la valvula antes de la entrada de la unidad de separacion, a la que pueden conectarse las llneas de conexion y elegirse selectivamente lo que puede permitir la comunicacion de fluido entre la llnea seleccionada y la entrada de la unidad de separacion. Una valvula de seleccion de fluido es, por ejemplo, la valvula tras la salida de la unidad de separacion a la que pueden conectarse las llneas de conexion y elegirse selectivamente lo que puede permitir la comunicacion de fluido entre la llnea seleccionada y la salida de la unidad de separacion. Una valvula de seleccion de fluido tambien puede ser una valvula que proporciona la introduccion de llquido en una llnea de conexion. Una valvula de seleccion de fluido tambien puede ser el extremo de una llnea de conexion.

Una “valvula de seleccion de disolvente” es una valvula de seleccion de fluido que permite una comunicacion de fluido selectivamente entre cualquier deposito de disolvente conectado y la parte del sistema. Una valvula de seleccion de disolvente es, por ejemplo, la valvula antes de la bomba de disolvente a la que pueden conectarse las llneas de conexion desde los depositos de disolvente y elegirse selectivamente lo que puede permitir la comunicacion de fluido entre el disolvente seleccionado y la bomba.

Una “valvula de seleccion de fluido” y una “valvula de seleccion de disolvente” pueden ser de tipo identico o de tipo diferente.

Un sistema de suministro de disolvente es un sistema que permite el suministro de llquido. Normalmente, el sistema de suministro de disolvente de un aparato comprende al menos un deposito y al menos una bomba para transportar el llquido desde el deposito hacia otra parte del aparato que esta en conexion de llquido con el deposito. Un experto en la tecnica conoce que cada vez que se transfiere llquido desde un deposito hacia una unidad de separacion, esto se realiza con la ayuda de una bomba. Las bombas tambien pueden usarse para mezclar dos o mas corrientes de llquido que proceden de dos o mas depositos.

Description detallada de la invention

La presente invencion proporciona por primera vez un metodo y un aparato adecuados para un procedimiento de cromatografla continuo que solo necesita tres columnas de separacion. El procedimiento es un procedimiento de dos etapas que comprende dos etapas cromatograficas. Si el aparato tiene tres unidades de separacion, la primera etapa cromatografica (captura) se realiza de manera alternante y secuencial en dos unidades de separacion, la segunda etapa cromatografica (pulido) se realiza, tambien secuencialmente, en la tercera unidad de separacion. Las dos primeras unidades de separacion que tienen la misma matriz de cromatografla se cargan alternativamente con la muestra. Esto significa que mientras que una de las unidades se carga con la muestra, al mismo tiempo, la otra unidad puede someterse a otras etapas de procedimiento como equilibration, lavado, elution de la molecula objetivo, etc. La tercera unidad de separacion que tiene una matriz de cromatografla que es diferente de la matriz de las dos primera unidades se alimenta con la molecula objetivo que se eluye de las dos primera unidades. Puesto que las dos primera unidades se cargan secuencialmente, tambien se eluyen secuencialmente. Esto significa que mientras que una unidad se carga, la otra unidad (ya cargada) se lava opcionalmente y entonces se eluye la molecula objetivo de esta unidad con un tampon de elucion que permite preferiblemente la alimentation directa a la tercera unidad. Una vez realizada la segunda separacion cromatografica en la tercera unidad, entonces puede recuperarse la molecula objetivo purificada de la salida de fluido de la tercera unidad.

El metodo y el aparato segun la presente invencion permiten alta carga de las unidades de separacion de primera dimension dando como resultado altas capacidades de union dinamica y rendimiento mas rapido para acortar los tiempos de residencia.

Ademas, el metodo y el aparato segun la presente invencion permiten conectar la primera dimension de separacion (captura) con la segunda dimension de separacion (pulido) normalmente sin acondicionamiento adicional, puesto que el producto capturado se eluye preferiblemente de la primera dimension en las condiciones, que se ajusta a la segunda dimension (pulido).

El metodo segun la presente invencion pude aplicarse a diferentes modos cromatograficos, por ejemplo, captura con CIEX combinada con pulido con AIEX, captura con Prot A combinada con pulido con CIEX y captura con AIEX combinada con pulido con CIEX, sin cargas en el concepto y la solution tecnologica. Por tanto, no solo es

economico, sino tambien una tecnologla de purificacion robusta adecuada para la purification de una amplia variedad de moleculas objetivo (por ejemplo, moleculas biofarmaceuticas que tienen un pI de desde 2-14).

En una realization preferida, las unidades de separation A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de afinidad y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla de intercambio cationico.

5 En otra realizacion preferida, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de afinidad y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla de intercambio anionico.

En otra realizacion preferida, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de intercambio cationico y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla de intercambio anionico.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de intercambio anionico 10 y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla de intercambio cationico.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de afinidad y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla en modo mixto.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de afinidad y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla de intercambio anionico y cationico en modo mixto y una matriz 15 de cromatografla de intercambio cationico o una matriz de cromatografla de intercambio cationico en modo mixto y de intercambio anionico en modo mixto.

En otra realizacion, las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de intercambio cationico y una unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla en modo mixto.

En la figura 2 se muestra una vista esquematica del aparato segun la invention. En la figura 2, la llnea de conexion 20 entre las salidas de las unidades de separacion A1 y A2 y la entrada de la unidad de separacion B se denomina llnea de conexion C-P. El aparato segun la invencion comprende tres unidades de separacion, dos unidades de separacion por captura A1 y A2 que tienen la misma matriz de cromatografla y una unidad de separacion por pulido B. Ademas de las unidades de separacion, normalmente comprende al menos dos bombas, una o mas valvulas, conexiones de llquido y depositos. Adicionalmente, puede comprender unidades de filtro, unidades de detection u 25 otro equipo que puede ser necesario o adecuado en un procedimiento de separacion cromatografica. El aparato segun la presente invencion puede ser un sistema de cromatografla convencional o un sistema de un solo uso. Comprende columnas, valvulas, depositos y otro equipo que se usa normalmente en los sistemas de cromatografla. Las unidades de separacion podrlan ser, por ejemplo, columnas de acero inoxidable, columnas de plastico o columnas de vidrio que se llenan con las matrices de cromatografla respectivas y tienen accesorios de extremo 30 adecuados para la entrada y salida de disolvente.

En alguna realizacion, el aparato segun la presente invencion puede comprender mas de tres unidades de separacion, por ejemplo, podrla tener 3 o 4 unidades de separacion por captura que tiene la misma matriz de cromatografla y 2 o 3 unidades de separacion por pulido que tienen la misma matriz de cromatografla pero una matriz de cromatografla que difiere de la matriz de las unidades de separacion por captura. En realizaciones a modo 35 de ejemplo puede tener

- dos unidades de separacion por captura A1 y A2 en combination con 2 unidades de separacion por pulido B1 y B2

- tres unidades de separacion por captura A1, A2 y A3 en combinacion con 1 unidad de separacion por pulido B

- tres unidades de separacion por captura A1, A2 y A3 en combinacion con 2 unidades de separacion por pulido B1 y B2

40 En una realizacion preferida, el aparato segun la presente invencion tiene cinco unidades de separacion, tres unidades de separacion por captura A1, A2 y A3 que tienen la misma matriz de cromatografla y dos unidades de separacion por pulido B1 y B2.

Para garantizar que o bien la salida de fluido de la unidad de separacion A1 o bien la salida de fluido de la unidad de separacion A2 o bien la salida de fluido de la unidad de separacion A3 puedan estar en comunicacion de fluido con 45 la entrada de la unidad de separacion B1 o con la entrada de la unidad de separacion B2, al menos una valvula esta ubicada entre las salidas de fluido de las unidades de separacion A1, A2 y a3 y la entrada de fluido de las unidades de separacion B1 y B2. Preferiblemente, hay una valvula ubicada tras la salida de cada unidad de separacion A1 y A2 y A3, lo que permite una comunicacion de fluido con la entrada de la unidad de separacion B1 o con la entrada de la unidad de separacion B2. El aparato tambien comprende al menos dos depositos de tampon y al menos dos 50 bombas, tambien denominado sistema de suministro de disolvente, que proporcionan el almacenamiento y la

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provision de los tampones necesarios, por ejemplo, para la carga, el lavado y la elucion de las moleculas objetivo. Normalmente, las unidades de separation a1, A2 y A3 tienen al menos una entrada de fluido que esta conectada a al menos un deposito de tampon y las unidades de separacion B1 y B2 tienen al menos una entrada de fluido que esta conectada a al menos un deposito de tampon. Normalmente, las unidades de separacion B1 y B2 tienen al menos una salida de fluido.

En una realization muy preferida, el aparato segun la presente invention tiene tres unidades de separacion, dos unidades de separacion por captura A1 y A2 que tienen la misma matriz de cromatografla y una unidad de separacion por pulido B.

A continuation, la description del aparato y el metodo se centran en un aparato con dos unidades de separacion por captura A1 y A2 que tienen la misma matriz de cromatografla y una unidad de separacion por pulido B. Esto no pretende ser restrictivo sino hacer que la descripcion sea mas completa. Un experto en la tecnica puede transferir la descripcion tambien a sistemas con mas de tres unidades, tal como se describio anteriormente.

Para garantizar que o bien la salida de fluido de la unidad de separacion A1 o bien la salida de fluido de la unidad de separacion A2 puedan estar en comunicacion de fluido con la entrada de la unidad de separacion B, al menos una valvula esta ubicada entre las salidas de fluido de las unidades de separacion A1 y A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B.

El aparato tambien comprende al menos dos depositos de tampon y al menos dos bombas, tambien denominado sistema de suministro de disolvente, que proporcionan el almacenamiento y la provision de los tampones necesarios, por ejemplo, para la carga, el lavado y la elucion de las moleculas objetivo. Normalmente, para cada etapa cromatografica, se necesita un tampon de carga y un tampon de elucion.

En una realizacion de la presente invencion, el aparato solo comprende dos depositos de tampon para los tampones de union y elucion, un deposito para el tampon A y un deposito para el tampon B. El tampon A es un tampon de carga y, por tanto, de union para la primera dimension que proporciona condiciones bajo las que se captura la molecula objetivo en las unidades de separacion A1/A2. Ademas, el tampon A es un tampon de elucion para la segunda dimension que proporciona condiciones bajo las que se eluye la molecula objetivo de la unidad de separacion B. El tampon B, es un tampon de elucion para la primera dimension (unidad de separacion A1/A2), pero un tampon de union para la segunda dimension (unidad de separacion B).

En otras realizaciones, el aparato puede comprender depositos adicionales para otros tampones, limpieza in situ, inactivation de virus etc. Normalmente, los depositos y las unidades de separacion estan conectados a traves de llneas de conexion, valvulas y bombas. Las valvulas de selection de disolvente preferidas para la election del disolvente antes de la bomba son valvulas que tienen 6 entradas de disolvente y 1 salida de disolvente que puede conectarse directamente a la bomba. Puede usarse cualquier bomba que garantice el flujo de disolvente incluyendo bombas peristalticas, bombas isocraticas, bombas de gradiente, bombas de alta presion y similares, bombas de baja presion y similares. Las valvulas de seleccion de fluido preferidas para la eleccion de la introduction de fluido antes de una entrada de parte de sistema son valvulas que tienen 6 entradas de fluido y 1 salida que puede conectarse a la entrada de la parte del sistema. Las valvulas de seleccion de fluido preferidas para la eleccion de la retirada de fluido tras la salida de la parte del sistema son valvulas que tienen 6 salidas de fluido y 1 entrada que puede conectarse a la salida de la parte del sistema.

En una realizacion preferida, el aparato comprende adicionalmente llneas de conexion entre las dos unidades de separacion por captura A1 y A2 que permiten la conexion de llquido entre la salida de la columna A1 y la entrada de la columna A2 y viceversa. En la figura 3 se muestra una vista esquematica de esta realizacion, en donde las llneas de conexion adicionales se nombran llnea de conexion F-F. Esta configuration permite una captura del producto lixiviado a partir de la primera unidad de separacion por captura (al final de la carga) sobre la segunda unidad de separacion (recien equilibrada y lista para la captura). Esto permite usar capacidades de union y rendimientos superiores sin la perdida de molecula objetivo.

En una realizacion preferida, se conecta un sistema de suministro de disolvente a las llneas de conexion entre las dos unidades de separacion por captura A1 y A2, preferiblemente el sistema de suministro de disolvente de muestra con el fin de garantizar una alimentation de muestra continua a cualquier unidad de separacion por captura seleccionada.

En otra realizacion preferida, el aparato comprende ademas uno o mas detectores. Los detectores pueden usarse para controlar la transferencia de muestra entre las columnas, para el analisis de la calidad de la muestra, la monitorizacion, etc. Los detectores pueden ubicarse en cualquier sitio que sea adecuado, normalmente se ubican antes de la entrada de fluido y/o despues de la salida de fluido de las columnas de separacion.

Ejemplos de detectores adecuados son detectores de pH, detectores de UV, detectores de infrarrojos o detectores

que miden la conductividad.

Preferiblemente, los detectores se ubican antes de la entrada de fluido y despues de la salida de fluido de todas las columnas de separacion. Esta configuration garantiza el control de la transferencia de muestra entre las unidades de separacion.

5 En otra realization preferida el aparato comprende ademas un sistema informatico. Los detectores as! como las bombas y valvulas estan conectados al sistema informatico. Este sistema informatico permite el control de las bombas y valvulas y detectores. Preferiblemente, el sistema informatico comprende un software y algoritmos que permiten que el aparato se use de un modo parcial o totalmente automatizado.

En otra realizacion preferida, se ubica una entrada de fluido adicional, que significa preferiblemente una llnea de 10 conexion a uno o mas depositos, antes de la entrada de fluido de la unidad de separacion B. En las figuras 2, 3 y 4 esta entrada adicional se nombra entrada C. Normalmente la entrada de fluido adicional se ubica despues de la salida de la unidad de separacion A1 y A2 y antes de la entrada de fluido de la unidad de separacion B. Preferiblemente, se ubica despues de la valvula que esta ubicada en la llnea de conexion entre las salidas de las unidades de separacion A1 y A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B y antes de la entrada de fluido 15 de la unidad de separacion B. Esto garantiza que la columna B no pueda alimentarse solo con los eluatos de las unidades de separacion A1 y A2 sino tambien con tampones o reactivos adicionales, por ejemplo para la dilution en llnea, elucion, equilibration, limpieza in situ, inactivation de virus, etc.

En otra realizacion preferida, el aparato comprende ademas un deposito adicional para limpieza in situ. La limpieza in situ (CIP) es una tecnologla conocida por el experto en la tecnica. La limpieza in situ es la elimination de 20 sustancias muy fuertemente unidas, precipitadas o desnaturalizadas de la matriz de cromatografla. Si tales contaminantes no se eliminan de la matriz de cromatografla, podrlan afectar a las propiedades cromatograficas de la columna, disminuyendo la capacidad de union y desprendiendose en rondas posteriores lo que da como resultado que se transporten contaminantes o productos entre ciclos. Un protocolo de CIP convencional incluye normalmente de uno a cinco lavados con de uno a tres volumenes de columna de tampones acuosos que comprenden 25 componentes como

- clorhidrato de guanidina 6 M

- NaOH de 10 mM a 500 mM

- NaOH de 10 mM a 500 mM y NaCl 1 M,

- NaOH 50 mM y Na2SO4 1 M,

30 - disolucion de acido fosforico 150 mM,

- urea 6 M,

- etanol al 20%,

- etanol al 20% y acido acetico 0,5 M,

- etanol al 20% y acido acetico 2 M,

35 - Tween al 1 % o tensioactivo T riton® X-100 o similar.

Concentration de los componentes como NaOH, el tiempo de contacto del tampon de CIP sobre la columna as! como la frecuencia de realizacion de la CIP puede ajustarse y determinarse por el experto en la tecnica.

El aparato segun la presente invention tiene preferiblemente al menos un deposito que contiene un tampon de CIP. El tampon de CIP puede usarse para la CIP de todas unidades de separacion si es adecuado. Entonces el deposito 40 de tampon esta en conexion de llquido con todas las unidades de separacion de un modo que el flujo del tampon de CIP puede dirigirse a cada una de las columnas independientemente. En otra realizacion, el aparato comprende dos depositos con dos tampones de CIP diferentes. Un deposito esta en conexion de fluido con las unidades de separacion A1 y A2, para lo que el flujo de la unidad de separacion A1 y la unidad de separacion A2 puede realizarse independientemente, el otro deposito esta en conexion de fluido con la unidad de separacion B. Pueden 45 realizarse lavados de limpieza in situ tras cada ciclo de separacion. Normalmente se realiza CIP tras cada segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, septimo, octavo, noveno o decimo ciclo de separacion dependiendo de la muestra y por tanto la cantidad y tipo de contaminantes que podrlan contaminar la unidad de separacion. Un experto en la tecnica

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es consciente del hecho de que la CIP puede omitirse o puede simplificarse drasticamente para sistemas de uso unico.

En otra realizacion preferida, el aparato comprende un deposito adicional para la inactivacion de virus (VI). La purificacion de impurezas, especialmente la desactivacion y eliminacion de virus desempenan el papel principal en la produccion de compuestos biofarmaceuticos ya que los niveles de virus en compuestos biofarmaceuticos estan regulados por la FDA. Es posible realizar la inactivacion de virus en una etapa de purificacion adicional, en donde, dependiendo de compuesto biofarmaceutico, la inactivacion de virus puede realizarse por ejemplo mediante inactivacion con disolvente/detergente, pasteurizacion, inactivacion a pH acido o inactivacion con UV.

Se ha encontrado que cuando se usa el aparato segun la presente invencion y el procedimiento segun la presente invencion, es posible incluir tambien la inactivacion de virus en el procedimiento de purificacion. Para esto, o bien las unidades de separacion A1 y A2 o bien la unidad de separacion B o bien todas las unidades de separacion estan en conexion de fluido con un deposito adicional que contiene un tampon de inactivacion de virus. El tampon de inactivacion de virus fluye entonces a traves de la unidad de separacion sobre la que la inactivacion de virus tendra lugar mientras la molecula objetivo se une sobre la matriz de dicha unidad de separacion. Preferiblemente las unidades de separacion estan conectadas con el deposito para la inactivacion de virus o bien a bajo pH o bien con detergente o ambas, preferiblemente la etapa de inactivacion de virus se realiza sobre matrices de intercambio cationico. Si la inactivacion de virus se realiza sobre las unidades de captura A1 y A2, el deposito que contiene el tampon de inactivacion de virus esta en conexion de fluido con las unidades de separacion A1 y A2 de un modo que el flujo a la unidad de separacion A1 y la unidad de separacion A2 puede realizarse independientemente. Si la inactivacion de virus se realiza sobre una unidad de pulido B, el deposito que contiene el tampon de inactivacion de virus esta en conexion de fluido con la unidad de separacion B. Tampones adecuados para la inactivacion de virus a pH bajo integrada son tampones con un pH acido, preferiblemente tampones con un pH de entre 3 y 4. Ejemplos de tampones adecuados son acetato, glicina y otros. Tampones adecuados para la inactivacion de virus con tensioactivos integrada son tampones con al menos un tensioactivo o detergente. Ejemplos de detergentes adecuados son acido octanoico, Tween o tensioactivo Triton X-100. Realizar la etapa de inactivacion de virus mientras la molecula objetivo esta “sobre la columna”, esto significa mientras esta unida sobre la matriz de una unidad de separacion, conduce a una reduccion del numero de etapas de purificacion globales ya que se evita la inactivacion de virus en la acumulacion que se realiza normalmente ademas de las etapas de cromatografla.

En una realizacion preferida, el aparato no contiene ningun deposito para la acumulacion. En procedimientos de separacion cromatografica conocidos, a menudo todas las fracciones que se eluyen de una primera columna y que contienen la molecula objetivo se acumulan en primer lugar antes de que se carguen sobre una segunda columna de cromatografla. Se ha encontrado que el metodo y aparato de la presente invencion proporcionan una configuracion en la que tal acumulacion no es necesaria. Preferiblemente, cuando, tras cargar y lavar, la molecula objetivo se eluye de las unidades de separacion A1 o A2, todo el eluyente que contiene la molecula objetivo se dirige directamente, sin acumulacion, a la entrada de la unidad de separacion B y se carga sobre la unidad de separacion B. Esto acelera adicionalmente el procedimiento de purificacion. Para esto, las unidades de separacion A1 y A2 estan en conexion de fluido con la unidad de separacion B sin ningun deposito que interrumpa esta conexion. Esto se prefiere especialmente si el aparato comprende solo dos depositos de tampon para la union y elucion tal como se describio anteriormente. Si el modo de separacion necesita el uso de mas de dos tampones, tambien puede evitarse la acumulacion introduciendo una entrada de fluido adicional antes de la entrada de fluido de la unidad de separacion B (tal como se describio anteriormente) que puede usarse para la dilucion en llnea y el intercambio de tampon.

En una realizacion, el aparato comprende dos unidades de separacion con una matriz de cromatografla de afinidad y una unidad de separacion con una matriz de intercambio anionico, preferiblemente de intercambio cationico. Matrices de afinidad adecuadas son matrices que tienen grupos funcionales de protelna A, protelna G, protelna L o protelna r (por ejemplo Prosep® Highcap (Merck Millipore), Prosep® Ultra Plus (Merck Millipore), Poros® Prot A(Life Technologies), A650f (Tosoh), Mab-Select® Sure (GE). Matrices de intercambio cationico adecuadas son matrices que tienen pero no se limitan a grupos de intercambio cationico fuerte, tales como sulfopropilo, acido sulfonico (Fractogel EmD ®SO3, Fractogel EMD ® SE highcap (Merck) Eshmuno® S (Merck) SP-SePHAROSE FAST FLOW™ o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, de Pharmacia, o pero sin limitarse a grupos de intercambio cationico debil, tales como acido carboxllico como Fractogel ® EMD Carboxy (Merck).

En otra realizacion, el aparato comprende dos unidades de separacion con una matriz de intercambio cationico y una unidad de separacion con una matriz de intercambio anionico. Matrices de intercambio cationico adecuadas son matrices que tienen pero sin limitarse a grupos de intercambio cationico fuerte, tales como sulfopropilo, acido sulfonico o que tienen pero sin limitarse a grupos de intercambio cationico debil, tales como acido carboxllico tales como los mencionados anteriormente. Matrices de intercambio anionico adecuadas son matrices que tienen pero sin limitarse a uno o mas ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino cuaternarios. Las resinas de intercambio anionico disponibles comercialmente incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia), Fractogel® TMAE (M), Fractogel® TMAE HC (M) o Eshmuno® Q (Merck).

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En otra realizacion, el aparato comprende dos unidades de separacion con una matriz de intercambio anionico y una unidad de separacion con una matriz de intercambio cationico. Se han enumerado anteriormente matrices de intercambio cationico y matrices de intercambio anionico adecuadas.

En todas realizaciones, tambien pueden usarse matrices de modo mixto en lugar de matrices de intercambio ionico as! como combinaciones de las mismas. Un ejemplo es una combinacion de intercambio anionico y una funcionalidad hidrofoba (Capto Adhere (GE Healthcare) o una combinacion de intercambio cationico y una funcionalidad hidrofoba tal como (Capto ™ MMC (GE Healthcare), Eshmuno® HCX (Merck KGaA), POROS®XS (Applied Biosystems).

La figura 1 muestra una realizacion preferida del aparato segun la presente invencion. Las columnas A1 y A2 se denominan “CIEX”, mostrando que estas dos columnas tienen la misma matriz de cromatografla, por ejemplo una resina de intercambio cationico. La columna B se denomina AIEX, sugiriendo que esta columna podrla tener una matriz de cromatografla de intercambio anionico. Se ubican detectores de conductividad (“Cond.”) antes de la entrada de fluido de las tres columnas. Se ubican detectores de UV y pH (“UV, pH”) en la salida de fluidos de las tres columnas. Las columnas A1 y A2 estan conectadas con 6 depositos para limpieza in situ (“CIP”), inactivacion de virus (“VI”), tampon de carga (“E.A”), tampon de elucion (“E.B”), un tampon de dilucion (“Dil.”) y la alimentacion de muestra (“Alimentacion”). La columna B esta conectada a tres depositos para limpieza in situ (“CIP”), tampon de carga (“E.A”), tampon de elucion (“E.B”). Preferiblemente el tampon de elucion usado para las columnas A1/A2 es el mismo que el tampon de carga usado para la columna B y viceversa. Los depositos y las columnas estan conectados por medio de llneas de conexion. Preferiblemente las llneas de conexion estan interrumpidas al menos una vez por una valvula para poder controlar el flujo de llquido. El transporte de llquido se realiza con la ayuda de bombas.

La invencion proporciona ademas un metodo para la purificacion continua de una molecula objetivo a partir de una muestra que comprende la molecula objetivo y una o mas impurezas. El metodo de la invencion se realiza en el respectivo aparato de la invencion. En las figuras 2, 3 y 4 se muestra una vista esquematica de un aparato adecuado. El metodo comprende repetir secuencialmente las etapas. Las unidades de separacion A1 y A2 para la primera dimension cromatografica se cargan de manera continua, secuencial con la muestra de modo que mientras que la muestra se carga sobre la unidad de separacion A1, la unidad de separacion A2 esta al menos en parte en comunicacion de fluido con la unidad de separacion B de modo que la molecula objetivo se eluye sobre la unidad de separacion B y la unidad de separacion A2 reequilibra y mientras que la muestra se carga en la unidad de separacion A2, la unidad de separacion A1 esta al menos en parte en comunicacion de fluido con la unidad de separacion B de modo que la molecula objetivo se eluye sobre la unidad de separacion B y la unidad de separacion A1 se reequilibra.

Ademas, tiene lugar una segunda etapa de cromatografla sobre la unidad de separacion B que conduce a la recuperacion de la molecula objetivo purificada de la salida de fluido de la unidad de separacion B.

Para garantizar que el metodo de la presente invencion funciona en modo continuo, es necesario ajustar la velocidad de las dos etapas de separacion cromatografica. Normalmente, la carga, separacion cromatografica y reequilibracion sobre la unidad de separacion B en la segunda etapa cromatografica son mas rapidas que la carga, separacion cromatografica y reequilibracion sobre las unidades de separacion A1 y A2 de modo que la unidad de separacion B esta lista para una nueva carga vez que la molecula objetivo se eluye o bien de la unidad de separacion A1 o bien de la unidad de separacion A2. De lo contrario la elucion de las moleculas objetivo de las unidades de separacion A1 o A2 se retrasa hasta que la unidad de separacion B esta lista para la carga o podrla integrarse en el sistema una segunda unidad de separacion B2.

Cuando se realiza el metodo segun la presente invencion la elucion de la molecula objetivo de las unidades de separacion A1/A2 a la unidad de separacion B significa que la fraccion completa que contiene la molecula objetivo puede cargarse sobre la unidad de separacion B o solo partes de la fraccion. Para reducir la cantidad de impurezas puede ser aconsejable cargar solo las partes de la fraccion que contienen la molecula objetivo sobre la unidad de separacion B que contienen muy pocas impurezas. Tambien es posible sacar una parte de la fraccion de molecula objetivo para el control en procedimiento para analizar la pureza y otras propiedades de la molecula objetivo tras la primera etapa de separacion.

A continuacion se describen adicionalmente las siguientes realizaciones a modo de ejemplo. El marcaje de los componentes del aparato se refiere al marcaje usado en la figura 2.

A) Realizaciones en las que en ambas etapas de cromatografla (captura y pulido) la molecula objetivo se une a la matriz de la unidad de separacion respectiva (modo de union-union):

En una realizacion, el metodo segun la invencion se realiza

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a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion a2 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, seguido por el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida BW y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

Para el modo continuo preferiblemente, las etapas a) y b) se repiten al menos dos veces.

En una realizacion preferida mientras se alimenta la muestra sobre la unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2, para alcanzar cantidades especialmente altas de molecula objetivo unida sin perdidas razonables, al final de la carga, esto significa que cuando la carga casi ha acabado, la salida de la unidad de separacion A2 se conecta con la entrada de la unidad de separacion A1 a traves de una llnea de conexion F-F para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A2 para que se una a la unidad de separacion A1. Tan pronto como se detecte demasiada lixiviacion de la molecula objetivo de la unidad de separacion A2, la alimentacion de la muestra se cambia de la unidad de separacion A2 a unidad de separacion A1. Mientras tanto la molecula objetivo en A1 se lava y se eluye sobre la unidad de separacion B. Tras la reequilibracion de la unidad de separacion A1 se conecta su entrada a la salida de la columna de separacion A2 para garantizar que la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A1 se una a la unidad de separacion a2.

Esta conexion intermedia especlfica de las dos unidades de separacion A1 y A2 proporciona la posibilidad unica de ahorrar tiempo cargando las unidades de separacion A1 y A2 con cantidades muy altas de molecula objetivo. En sistemas de cromatografla conocidos, normalmente, las columnas se cargan hasta aproximadamente del 60 al 80% de la capacidad de union dinamica. El aparato y metodo segun la presente invencion con la conexion intermedia especlfica de las dos unidades de separacion A1 y A2 ofrecen la posibilidad de cargar las unidades de separacion A1 y A2 hasta mas del 80% de la capacidad de union dinamica, preferiblemente hasta del 80 al 95% de la capacidad de union dinamica sin perdida de molecula objetivo. La capacidad de union dinamica de un medio de cromatografla es la cantidad de molecula objetivo a la que se unira el medio en condiciones de flujo reales antes de que se produzca una penetracion significativa de protelna no unida.

Si la muestra se carga sobre la unidad de separacion A1 y especialmente cuando la carga casi ha acabado y la molecula objetivo comienza a lixiviarse de la unidad de separacion, la salida de la unidad de separacion A1 puede conectarse con la entrada de la unidad de separacion a2 de modo que la molecula objetivo que de lo contrario

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tendrla que recogerse y ponerse en la alimentacion de muestra de nuevo se alimenta directamente sobre la unidad de separacion A2. Un experto en la tecnica puede determinar cuando es el mejor momento para detener la alimentacion de muestra a la unidad de separacion A1 y cambiar la alimentacion de la muestra a la unidad de separacion A2. Al mismo tiempo tambien se interrumpe la conexion de la salida de la unidad de separacion A1 con la entrada de la unidad de separacion A2 y mientras la unidad de separacion A2 se carga adicionalmente con la alimentacion de muestra, la unidad de separacion A1 se lava y luego se pone en contacto con la entrada de la unidad de separacion B para eluir la molecula objetivo sobre la unidad de separacion B. Tras la reequilibracion de la unidad de separacion A1 se conecta de nuevo con la salida de la unidad de separacion A2 para capturar la molecula objetivo que podrla lixiviarse de la columna A2 al final de la carga de la muestra.

En la figura 3 se muestra una vista esquematica de un aparato adecuado para esta realizacion. Usando un aparato segun la vista esquematica mostrada en la figura 3, el metodo de la invention puede realizarse por ejemplo tal como sigue:

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion CP directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, seguido por el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A1, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A2 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta a la entrada C para la reequilibracion.

c) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composition esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

d) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A2, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A1 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta a la entrada C para la reequilibracion.

Para el modo continuo preferiblemente, las etapas a) to d) se repiten al menos dos veces.

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Se ha encontrado que las perdidas de molecula objetivo que resultan a menudo de la elucion de molecula objetivo no unida durante el lavado pueden reducirse por el siguiente modo de realization del metodo segun la invention:

En una realizacion preferida tras haberse cargado la unidad de separation A2 (o A1 respectivamente) hasta altas cantidades de molecula objetivo unida a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente), durante el lavado la molecula objetivo no unida se lava en la unidad de separacion A1 para transferir la molecula objetivo no unida sin perdidas razonables. Esto significa que cuando se acaba la carga, la salida de la unidad de separacion A2 se conecta con la entrada de la unidad de separacion A1, por ejemplo a traves de una llnea de conexion W-F, para permitir la captura de la molecula objetivo lavada de la unidad de separacion A2 para que se una a la unidad de separacion A1 (vease la figura 4). Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A2, se interrumpe la comunicacion de fluido y la salida de la columna A2 se cambia a la position de salida A2-W para extraer las moleculas no unidas. Mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A1, a medida que la molecula objetivo sobre la unidad de separacion A2 se lava adicionalmente y se eluye sobre la unidad de separacion B. Tras la reequilibracion de la unidad de separacion A2 se conecta su entrada a la salida de la columna de separacion A1 para garantizar que la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A1 se una a la unidad de separacion A2.

Esta conexion intermedia especlfica de las dos unidades de separacion A1 y A2 proporciona la posibilidad unica de ahorrar tiempo y evitar perdidas de molecula objetivo lavandolas. En sistemas de cromatografla conocidos, normalmente, la fraction de lavado de columna se extrae para desecharla o se recoge de nuevo en el deposito de alimentation. El aparato y metodo segun la presente invencion ofrecen la posibilidad de lavar las unidades de separacion A1 y A2 con bajas perdidas de molecula objetivo, preferiblemente hasta del 2 al 3% de perdidas de molecula objetivo totales usando este procedimiento de purificacion preferido.

En la figura 4 se muestra una vista esquematica de un aparato adecuado para esta realizacion. Usando un aparato segun la vista esquematica mostrada en la figura 4, el metodo de la invencion puede realizarse por ejemplo tal como sigue:

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion a2 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibration de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion CP directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, seguido por el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A1, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y la molecula objetivo no unida se transfiera a columna A2 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W. Al mismo tiempo columna B se conecta con la entrada C para la reequilibracion.

c) Cuando la carga de la unidad de separacion A1 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A1 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A1 con una llnea de conexion W-F con la unidad de separacion A2, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A1, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A1 se cambia a la posicion de salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A2 y se extraen las moleculas no unidas a traves de la salida A2-W.

d) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composition esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un

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primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

e) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A2, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A1 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta con la entrada C para la reequilibracion.

f) cuando la carga de la unidad de separacion A2 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A2 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A2 con una llnea de conexion W-F con la unidad de separacion A1, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A2, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A2 se cambia a la posicion de salida A2-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraen a traves de la salida A1-W.

Para el modo continuo preferiblemente, las etapas a) a f) se repiten al menos dos veces.

B) Realizaciones en las que en la primera etapa de cromatografla (captura) la molecula objetivo se une a la matriz de la unidad de separacion respectiva y en la segunda etapa cromatografica (pulido) la molecula objetivo se une debilmente o no se une a la matriz mientras se unen las impurezas (modo de union-flujo continuo):

En una realizacion, las columnas de separacion A1 y A2 para la primera dimension cromatografica se cargan de manera continua, secuencial con la muestra de modo que mientras que la muestra se carga sobre la columna de separacion A1, la columna de separacion A2 esta al menos en parte en conexion de fluido con la columna B de modo que la molecula objetivo se eluye sobre la columna de separacion B y la columna A2 se reequilibra y mientras que la muestra se carga sobre la columna de separacion A2, la columna de separacion A1 esta al menos en parte en conexion de fluido con la columna B de modo que la molecula objetivo se eluye sobre la columna de separacion B y la columna A1 se reequilibra.

Ademas, tiene lugar una segunda etapa de cromatografla en el modo de flujo continuo sobre la columna de separacion B que conduce a la recuperacion de la molecula objetivo purificada de la salida de fluido de la columna de separacion B.

Para garantizar que el metodo de la presente invention funciona en el modo continuo, es necesario que las condiciones de elucion de la etapa de separacion cromatografica de union y elucion se ajusten a las condiciones de carga para la etapa de flujo continuo realizada sobre la columna B. Si no es posible eluir la molecula objetivo de las unidades de separacion A1 y A2 en condiciones que sean adecuadas para la carga sobre la unidad de separacion B, normalmente, para ajustar condiciones de union debil o condiciones de no union de la molecula objetivo sobre la columna B, podrla usarse una entrada C. Con el fin de obtener un rendimiento de union debil o no union optimo y constante, son necesarias propiedades de disolucion constantes, tales como pH y conductividad. Esto se realiza mientras se acondiciona la molecula objetivo que eluye de las unidades de separacion A1 o A2 por medio de la entrada C por ejemplo mediante dilution en llnea o intercambio de tampon. Algunas veces la purification de productos biofarmaceuticos implica la separacion de la molecula objetivo de impurezas muy similares y se requieren metodos de separacion sensibles, tales como cromatografla de intercambio ionico debil. Con el metodo de la presente invencion, puede hacerse separacion por afinidad en el modo de union y elucion, y cromatografla de intercambio anionico en condiciones de union debil o no union (flujo continuo) para la protelna objetivo. Se mostro que esto era una herramienta muy poderosa. Especialmente la combination de varias matrices para este pulido de flujo continuo permite alcanzar la pureza de productos requerida por medio de la absorcion de impurezas mediante varias funcionalidades diferentes, tales como intercambio cationico o intercambio anionico o funcionalidades hidrofobas y mezclas de los mismos. Para la etapa de cromatografla de flujo continuo, tambien es posible usar matrices de intercambio ionico muy debil o matrices de modo mixto debiles como carbono activado. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre materiales carbonosos, carbono activado y su uso en procedimiento de purificacion de flujo continuo en la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/575349, que se incorpora en el presente documento como referencia. A continuation se describen adicionalmente realizaciones a modo de

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ejemplo. El marcaje de los componentes del aparato se refiere a al marcaje usado en la figura 2.

En una realizacion, el metodo segun la invencion se realiza

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras que la columna de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico o un medio de modo mixto) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras que la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B seguido por reequilibracion de la unidad de separacion B con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y las etapas de alimentacion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composition esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico o material de afinidad) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico o medio de modo mixto) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B, seguido por la reequilibracion de la unidad de separacion B con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y las etapas de alimentacion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

En una realizacion preferida mientras se alimenta la composicion sobre la unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2, para alcanzar cantidades especialmente altas de molecula objetivo unida sin perdidas razonables, al final de la carga, esto significa que cuando la carga casi ha acabado, la salida de la unidad de separacion A2 se conecta con la entrada de la unidad de separacion A1 a traves de una llnea de conexion F-F para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A2 para que se una a la unidad de separacion A1 (vease la figura 3). Tan pronto como se detecte demasiada lixiviacion de la molecula objetivo de la unidad de separacion A2, se cambia la alimentacion de muestra desde la unidad de separacion A2 hasta la unidad de separacion A1. Mientras tanto la molecula objetivo en A1 se lava y se eluye sobre la unidad de separacion B. Tras la reequilibracion de la unidad de separacion A1, se conecta su entrada a la salida de la columna de separacion A2 para garantizar que la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A1 se una a la unidad de separacion a2.

Esta conexion intermedia especlfica de las dos unidades de separacion A1 y A2 proporciona la posibilidad unica de ahorrar tiempo cargando las unidades de separacion A1 y A2 con una cantidad muy alta de molecula objetivo. En sistemas de cromatografla conocidos, normalmente, las columnas se cargan hasta aproximadamente del 60 al 80% de la capacidad de union dinamica. El aparato y metodo segun la presente invencion ofrecen la posibilidad de cargar las unidades de separacion A1 y A2 hasta mas del 80% la capacidad de union dinamica, preferiblemente hasta del 80 al 95% de la capacidad de union dinamica.

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a) alimentando la muestra sobre una columna de separation A1 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibration de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico o medio de modo mixto) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentation de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B, seguido por la reequilibracion de la unidad de separacion B con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y las etapas de alimentacion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A1, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A2 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta con la entrada C para la reequilibracion.

c) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composition esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico o material de afinidad) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico o medio de modo mixto) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B, seguido por la reequilibracion de la unidad de separacion B con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapas de alimentacion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

d) cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A2, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A1 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta con la entrada C para la reequilibracion.

Para el modo continuo preferiblemente, las etapas a) a d) se repiten al menos dos veces.

En una realizacion preferida cuando la unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) se carga con las cantidades especialmente altas de molecula objetivo unida sin perdidas razonables a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion estaba a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2, la molecula objetivo no unida se lava en la unidad de separacion A1 para transferir la molecula objetivo no unida sin perdidas razonables. Esto significa que cuando se acaba la carga, la salida de la unidad de separacion A2 se conecta con la entrada de la unidad de separacion A1 a traves de una llnea de conexion W-F para permitir la captura de la molecula objetivo lavada de la unidad de separacion A2 para que se una a la unidad de separacion A1 (vease la figura 4). Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A2, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A2 se cambia a la position de salida A2-W para

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extraer las moleculas no unidas. Mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A1, a medida que la molecula objetivo sobre la unidad de separacion A2 se lava adicionalmente y se eluye sobre la unidad de separacion B. Tras la reequilibracion de la unidad de separacion A2 se conecta su entrada a la salida de la columna de separacion A1 para garantizar que la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A1 se una a la unidad de separacion A2.

Esta conexion intermedia especlfica de las dos unidades de separacion A1 y A2 proporciona la posibilidad unica de ahorrar tiempo y evitar perdidas de molecula objetivo lavandolas. En sistemas de cromatografla conocidos, normalmente, la fraccion de lavado de columna se extrae para desecharla o se recoge de nuevo en el deposito de alimentacion. El aparato y metodo segun la presente invencion ofrecen la posibilidad de lavar las unidades de separacion A1 y A2 con bajas perdidas de molecula objetivo, preferiblemente hasta del 2 al 3% de perdidas de molecula objetivo totales en el procedimiento de purificacion preferido.

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico o material de afinidad) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 a las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B, la reequilibracion de la unidad de separacion B con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y las etapas de alimentacion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

c) Cuando ha acabado la carga de la unidad de separacion A1, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A1 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A1 con una llnea de conexion W-F con la unidad de separacion A2, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A1, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A1 se cambia a la posicion de salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A2 y las moleculas no unidas se extraen a traves de la salida A2-W.

d) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composition esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B, seguido por la reequilibracion de la unidad de separacion B con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y las etapas de alimentacion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

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e) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A2, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna Al directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta con la entrada C para la reequilibracion.

Para el modo continuo preferiblemente, las etapas a) to f) se repiten al menos dos veces.

Se ha encontrado que en el metodo de la presente invencion, preferiblemente se usan tampones que proporcionan union y elucion dependientes del pH. Se ha encontrado que especialmente la elucion de las moleculas objetivo de las unidades de separacion A1 y A2 es mas eficaz y mas rapida cuando se usa un tampon de elucion con un pH que difiere del pH del tampon de carga. En otras palabras, el perfil de elucion es mas favorable cuando se usa un tampon de elucion con un pH que difiere del pH del tampon de carga. La elucion mediante un gradiente de pH se prefiere especialmente. Un experto en la tecnica conoce tampones para la union y elucion dependientes del pH. Ejemplos de combinaciones de tampones adecuadas son PBS-glicina, acetato-TRIS y etc.

En una realizacion preferida el metodo de la invencion comprende el uso de solo dos tampones de carga y elucion, el tampon A y el tampon B, de modo que el tampon A es un tampon de carga para la primera dimension que proporciona condiciones en las que la molecula objetivo se captura sobre la columna de separacion A1/A2. Ademas, el tampon A es un tampon de elucion para la segunda dimension que proporciona condiciones en las que la molecula objetivo se eluye de la columna de separacion B. El tampon B es un tampon de elucion para la primera dimension (columna A1/A2), pero un tampon de captura para la segunda dimension (columna B).

Si las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de afinidad como una matriz de Prot A, el tampon de union (tampon A)) tiene normalmente un pH de entre 6 y 8 y una concentracion de sal (sales tlpicas son fosfato, acetato, cloruro, etc.) de entre 10 mM y 2 M. Se prefieren tampones de union con un pH de entre 6,8 y 7,3 y una concentracion de sal de entre 50 mM y 1 M. El tampon de elucion tiene normalmente un pH de entre 2 y 5 y una concentracion de sal (sales tlpicas son glicina, acetato, etc.) de entre 20 mM y 200 mM. Se prefieren tampones de elucion con un pH de entre 2,5 y 4,5 y una concentracion de sal de entre 20 mM y 50 mM. Si por ejemplo el tampon de elucion tiene un pH de 4 este tampon que es adecuado para eluir la molecula objetivo de la matriz de Prot A de la

unidad de separacion A1 y A2 tambien es adecuado para cargar las moleculas objetivo sobre una unidad de

separacion B con una matriz de intercambio cationico.

Si las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de intercambio cationico, la union del tampon de union tiene normalmente un pH de entre 4 y 7 y una concentracion de sal (sales tlpicas son fosfato, acetato, NaCl, etc.) de entre 10 mM y 300 mM. Se prefieren tampones de union con un pH de entre 4,5 y 6 y una concentracion de sal de entre 20 mM y 100 mM. El tampon de elucion tiene normalmente un pH de entre 7 y 10 y una concentracion de sal (sales tlpicas son TRIS, PBS, NaCl) de entre 10 mM y 300 mM. Se prefieren tampones de elucion con un pH de entre 8 y 9 y una concentracion de sal de entre 10 mM y 150 mM. Si por ejemplo el tampon de elucion tiene un pH de 8,5 este tampon que es adecuado para eluir la molecula objetivo de la matriz de intercambio cationico de la

separacion B con una matriz de intercambio anionico.

Si las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de intercambio anionico, el tampon de union tiene normalmente un pH de entre 7 y 10 y una concentracion de sal (sales tlpicas son TRIS, PBS, NaCl) de entre 10 mM y 300 mM. Se prefieren tampones de union con un pH de entre 7,5 y 9,5 y una concentracion de sal de entre 10 mM y 300 mM. El tampon de elucion tiene normalmente un pH de entre 4 y 7 y una concentracion de sal (sales tlpicas son PBS, acetato, NaCl, etc.) de entre 10 mM y 100 mM. Se prefieren tampones de elucion con un pH de entre 4,5 y 6,5 y una concentracion de sal de entre 10 mM y 100 mM. Si por ejemplo el tampon de elucion tiene un pH de 5,5 este tampon que es adecuado para eluir la molecula objetivo de la matriz de intercambio anionico de la unidad de separacion A1 y A2 tambien es adecuado para cargar las moleculas objetivo sobre una unidad de separacion B con una matriz de intercambio cationico.

En una realizacion preferida, la muestra que se somete al metodo de la presente invencion es una muestra clarificada. Esto significa que la muestra se somete a una etapa de clarificacion antes de cargarla sobre las unidades de separacion A1 o A2.

La etapa de clarificacion pretende separar una o mas impurezas solubles y/o insolubles de la molecula objetivo. Por ejemplo se eliminan impurezas insolubles como celulas y desechos celulares de la muestra dando como resultado un fluido clarificado que contiene la molecula objetivo en disolucion as! como otras impurezas solubles. Una etapa de clarificacion puede implicar una o mas de las siguientes, o bien solas o bien en cualquier combinacion, 5 centrifugacion, sedimentacion y/o filtracion, preferiblemente filtracion de flujo tangencial o filtracion de profundidad. Preferiblemente la etapa de clarificacion no implica centrifugacion sino solo filtracion y/o sedimentacion. En una realizacion preferida, la filtracion es filtracion de profundidad.

En algunas realizaciones, se usan filtros de profundidad para eliminar una o mas impurezas insolubles. Los filtros de profundidad son filtros que usan un medio de filtracion poroso para retener partlculas por todo el medio, en vez de 10 solo en la superficie del medio. Una clase comun de tales filtros de profundidad son los que comprenden una mezcla al azar de fibras unidas (o fijadas de otra forma), para formar un laberinto complejo, tortuoso de canales de flujo. La separacion de partlculas en estos filtros resulta generalmente resulta del atrapamiento mediante o la adsorcion a, la matriz de fibras. El medio de filtro de profundidad mas frecuentemente usado para el bioprocesamiento de caldos de cultivo celular y otras materias primas consiste habitualmente en fibras de celulosa, un adyuvante de filtracion tal 15 como DE (tierra de diatomeas), y un aglutinante de resina cargado positivamente.

Se ha encontrado que pueden lograres resultados especialmente buenos en la eliminacion primaria de impurezas particuladas si el filtro de profundidad poroso es anisotropico. En algunas realizaciones, los poros tienen un tamano de poro nominal que se clasifica > aproximadamente 25 pm. En algunas realizaciones, el filtro de profundidad comprende al menos 2 capas graduadas de fibras no tejidas, en el que las capas graduadas tienen un grosor total 20 de aproximadamente 0,3 cm a aproximadamente 3 cm.

En algunas realizaciones, los filtros de profundidad comprenden un material compuesto de capas graduadas de fibras no tejidas, celulosa y tierra de diatomeas. Las fibras no tejidas comprenden polipropileno, polietileno, poliester, nailon o mezclas de los mismos.

Pueden encontrarse filtros de profundidad a modo de ejemplo en la solicitud de patente provisional estadounidense 25 n.° 61/571994, incorporada como referencia en el presente documento.

En algunas realizaciones, puede realizarse una etapa de centrifugacion y/o filtracion de flujo tangencial antes de una etapa de filtracion de profundidad. Alternativamente, puede realizarse una etapa de filtracion de profundidad sin necesidad de una etapa de centrifugacion y/o filtracion de flujo tangencial.

En una realizacion, antes de la clarificacion mediante centrifugacion y/o filtracion y/o sedimentacion, la muestra se 30 trata previamente con una composicion de precipitacion para precipitar y eliminar contaminantes no deseados de la muestra. La composicion de precipitacion comprende al menos un agente precipitante que puede precipitar contaminantes como HCP, ADN, hormonas, etc. de la muestra. Los agentes precipitantes provocan la precipitacion de un compuesto de un estado acuoso y/o soluble a un estado no acuoso y/o insoluble o agregan y aglutinan partlculas finas a partir de una disolucion, dando como resultado su sedimentacion a partir de la fase llquida y una 35 reduccion en la turbidez de la disolucion.

Ejemplos de agentes precipitantes adecuados son acidos organicos (por ejemplo acido octanoico), acidos inorganicos (por ejemplo HCl), otros agentes acidos que disminuyen sustancialmente el pH hacia pH acido, sales (por ejemplo, benzoato de sodio, colato de sodio, desoxicoltato de sodio, etc. otras sales monovalentes o acidos organicos que precipitan en medio acido). Otro ejemplo de un agente precipitante es un acido graso de cadena corta 40 tal como acido caprllico. En condiciones ligeramente acidas, la adicion de acidos grasos de cadena corta tales como acido caprllico normalmente precipita protelnas distintas de IgG mientras IgG no precipita.

Otros agentes precipitantes adecuados son pollmeros de polielectrolitos (vease, por ejemplo, la solicitud de patente PCT internacional n.° WO2008/091740, incorporada como referencia en el presente documento).

En una realizacion preferida, se usan pollmeros sensibles a estlmulos para precipitar una o mas impurezas. Pueden 45 encontrarse ejemplos de tales pollmeros sensibles a estlmulos, por ejemplo, en las publicaciones estadounidenses n.os 20080255027, 20090036651, 20090232737 y 20110020327, incorporadas como referencia en el presente documento. Los pollmeros sensibles a estlmulos son generalmente solubles en un disolvente de base acuosa en un determinado conjunto de condiciones de procedimiento tales como pH, temperatura y/o concentracion de sal y se vuelven insolubles tras un cambio en one o mas de tales condiciones y posteriormente precipitan. Los pollmeros 50 sensibles a estlmulos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, polialilamina, polialilamina modificada con un grupo bencilo o polivinilamina y polivinilamina modificada con un grupo bencilo, en donde el estlmulo es fosfato o citrato.

La composicion de precipitacion puede comprender ademas un detergente (Triton X-100, triton X-114, NP-40, Tween-20, OTD, SDS, CHAPS y/o polietilenglicol (PEG) (PEG-1000, PEG 10000) y/o poli(alcohol vinllico) y/o

polielectrolitos.

Los contaminantes precipitados se eliminan entonces de la muestra mediante clarificacion antes de cargar la muestra sobre las unidades de separacion.

En una realizacion preferida, la precipitacion va seguida por filtracion de profundidad, sin una etapa de centrifugacion 5 para proporcionar la muestra clarificada.

En una realizacion preferida la clarificacion de la muestra se realiza simultaneamente con la purificacion cromatografica segun el metodo de la presente invencion durante al menos una parte de su duracion. En otras palabras, la muestra llquida que contiene la molecula objetivo no se almacena en un tanque de acumulacion tras la clarificacion para esperar a que el volumen de muestra completo se clarifique sino que tan pronto como la muestra 10 clarificada resulta del procedimiento de clarificacion se usa de manera continua como disolucion de muestra para el metodo de la presente invencion y se carga sobre la unidad de separacion A1 o A2.

Por consiguiente, el metodo de la presente invencion tambien cuando usa una disolucion de muestra clarificada no requiere el uso de tanques de acumulacion que puedan almacenar el volumen completo de la disolucion de muestra. Preferiblemente no se usa ningun tanque de acumulacion o solo tanques de acumulacion que pueden almacenar 15 menos del 25% preferiblemente menos del 10% del volumen total de la disolucion de muestra.

En algunas realizaciones, podrlan realizarse una o mas etapas de purificacion del flujo continuo adicionales tras realizar la segunda etapa cromatografica sobre la unidad de separacion B. Para esto, la salida de la unidad de separacion B esta en conexion de fluido con una o mas unidades de separacion adicionales. Una o mas valvulas podrlan estar ubicadas entre la salida de la unidad de separacion B y la entrada de la primera unidad de separacion 20 adicional y/o en las llneas de conexion entre las unidades de separacion adicionales opcionalmente siguientes (normalmente conectadas en serie) para garantizar la posibilidad de dilucion en llnea y/o intercambio de tampon. Las matrices de los dispositivos de flujo continuo adicionales se seleccionan normalmente de

- carbono activado

- intercambio cationico

25 - modo mixto

- exclusion molecular

- intercambio anionico

La molecula objetivo purificada que resulta del metodo segun la presente invencion puede someterse adicionalmente a etapas de procedimiento adicionales como etapas de formulacion/esterilizacion/concentracion, en donde la 30 disolucion que contiene molecula objetivo se esteriliza y se formula para que este en un tampon deseado a una concentracion deseada.

A continuacion se enumeran realizaciones adicionales del metodo segun la presente invencion:

En un procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con CIEX y pulido con AIEX, el metodo segun la invencion se realiza

35 a) alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B 40 (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y reequilibracion de la unidad de separacion A1 con tampon A, en donde las etapas de lavado, reequilibracion nombradas se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio 45 anionico) directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, lavado con tampon B, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B en donde las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan 50 mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida BW y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta

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la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 a altas cantidades de molecula objetivo unida sin perdidas razonables mientras se conecta directamente la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion A2 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A1 para que se una a la unidad de separacion A2 en donde la unidad de separacion A2 esta conectada con la salida A2-W para extraer las moleculas no unidas, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para por ejemplo la reequilibracion de la unidad de separacion B mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B=W.

c) Alimentando la composicion sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida B, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y reequilibracion de la unidad de separacion A1 con tampon A etapas, en donde las etapas de lavado, reequilibracion nombradas se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, lavado con tampon B, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B en donde las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

d) Alimentando la composicion sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 a altas cantidades de molecula objetivo unida sin perdidas razonables mientras se conecta directamente la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion A1 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A2 para que se una a la unidad de separacion A1 en donde la unidad de separacion A1 esta conectada con la salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para por ejemplo la reequilibracion de la unidad de separacion B etapa mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W.) Diluyendo en llnea la disolucion de anticuerpo que eluye con un tercer tampon con el fin de unir el anticuerpo que eluye sobre el material de intercambio anionico;

Preferiblemente, las etapas a) a d) se realizan secuencialmente, esto significa que se realizan en el mismo orden dos o mas veces.

En una realizacion, el metodo comprende captura con CIEX, alto rendimiento y pulido con AIEX.

En procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con CIEX, alto rendimiento, y pulido con AIEX, el metodo segun la invencion se realiza

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, seguido por el lavado

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con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A1, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y la molecula objetivo no unida se transfiera a columna A2 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta con la entrada C para la reequilibracion.

c) Cuando la carga de la unidad de separacion A1 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A1 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A1 con una llnea de conexion W-F con la unidad de separacion A2, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A1, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A1 se cambia a la posicion de salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A2 y las moleculas no unidas se extraen a traves de la salida A2-W.

d) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a

traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de

separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de

conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

f) Cuando la carga de la unidad de separacion A2 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de

separacion A2 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A2 con una llnea de

conexion W-F con la unidad de separacion A1, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A2, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A2 se cambia a la posicion de salida A2-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraen a traves de salida A1-W.

Preferiblemente, las etapas a) a f) se realizan secuencialmente, esto significa que se realizan en el mismo orden dos o mas veces.

En una realizacion, el metodo comprende captura con CIEX, inactivacion de virus y pulido con AIEX (union y elucion o flujo continuo). En un procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con CIEX, inactivacion de virus y pulido con AIEX, el metodo segun la invencion se realiza

a) alimentando la composicion sobre una unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la inactivacion de virus con un tampon C a un segundo pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un tercer pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A2 con tampon A, en

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donde las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion nombradas se realizan mientras se conecta la unidad de separation A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de alimentation de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, lavado con tampon B, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B en donde las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Alimentando la composition sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, inactivacion de virus con un tampon C a un segundo pH, elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un tercer pH y reequilibracion de la unidad de separacion A1 con tampon A, en donde las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion nombradas se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, lavado con tampon B, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B en donde las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

Preferiblemente, las etapas a) a b) se realizan secuencialmente, esto significa que se realizan en el mismo orden dos o mas veces.

En una realization, el metodo comprende captura con CIEX, alto rendimiento, inactivacion de virus y pulido con AIEX. En un procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con CIEX, alto rendimiento, inactivacion de virus y pulido con AIEX, el metodo segun la invention se realiza

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion a2 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la etapa de inactivacion de virus con un tampon de inactivacion de virus, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, seguido por lavado con tampon B, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

c) Cuando la carga de la unidad de separacion A1 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A1 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A1 con una llnea de conexion W-F con la unidad de separacion A2, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se

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detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A1, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A1 se cambia a la posicion de la salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A2 y las moleculas no unidas se extraen a traves de la salida A2-W.

d) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio cationico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composition esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo medio de intercambio cationico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio cationico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la etapa de inactivation de virus con un tampon de inactivation de virus, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibration de la columna de separacion A1 con tampon A. Las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio anionico) a traves de llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentation de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

e) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A2, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A1 directamente a traves de la llnea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta a la entrada C para la reequilibracion.

En una realization, el metodo comprende captura con ProtA, pulido con CIEX (union y elucion) e inactivacion de virus. En un procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con ProtA, pulido con CIEX (union y elucion) e inactivacion de virus, el metodo segun la invention se realiza realizando las siguienes etapas:

a) alimentacion de la composicion sobre una unidad de separacion A1 (por ejemplo matriz de afinidad de columna de ProtA) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la unidad de separacion A2 (por ejemplo material de ProtA) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y reequilibracion de la unidad de separacion A1 con tampon A, en donde las etapas de lavado, reequilibracion nombradas se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio cationico) directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, lavado con tampon B, inactivacion de virus con tampon C y elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B en donde las etapas de alimentacion, lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Alimentacion de la composicion sobre una unidad de separacion A1 a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la

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molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 a altas cantidades de molecula objetivo unida sin perdidas razonables mientras directamente se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion A2 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A1 para que se una a la unidad de separacion A2 en donde la unidad de separacion A2 esta conectada con la salida A2-W para extraer las moleculas no unidas, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para por ejemplo la reequilibracion de la unidad de separacion B mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W.

c) Alimentacion de la composicion sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de ProtA) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 (por ejemplo medio de ProtA) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de afinidad) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la unidad de separacion A1 con tampon A etapas, en donde las etapas de lavado y reequilibracion nombradas se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A y la etapa de elucion nombrada se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio cationico) directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para las etapas de alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, lavado con tampon B, inactivacion de virus con un tampon C a un tercer pH, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B en donde las etapas de alimentacion, lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

d) Alimentacion de la composicion sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de afinidad) a traves de la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 a altas cantidades de molecula objetivo unida sin perdidas razonables mientras directamente se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion A1 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la unidad de separacion A2 para que se una a la unidad de separacion A1 en donde la unidad de separacion A1 esta conectada con la salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para por ejemplo la reequilibracion de la unidad de separacion B mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W.

Preferiblemente, etapas a) a d) se realizan secuencialmente, esto significa que se realizan en el mismo orden dos o mas veces.

En una realizacion, el metodo comprende captura con ProtA, alto rendimiento y pulido con CIEX. En un procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con ProtA, alto rendimiento y pulido con CIEX, el metodo segun la invencion se realiza

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion a2 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la etapa de inactivacion de virus con un tampon de inactivacion de virus, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio cationico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, seguido por lavado con tampon B, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

b) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A1, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la

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molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A2 directamente a traves de la linea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta con entrada C para la reequilibracion.

c) Cuando la carga de la unidad de separacion A1 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A1 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A1 con una linea de conexion W-F con la unidad de separacion A2, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A1, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A1 se cambia a la posicion de salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A2 y las moleculas no unidas se extraen a traves de salida A2-W.

d) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la etapa de inactivacion de virus con un tampon de inactivacion de virus, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio cationico) a traves de linea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, el lavado con tampon B, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

e) Cuando la carga casi ha acabado sobre la columna A2, se carga ademas a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 y la molecula objetivo no unida se transfiera a la columna A1 directamente a traves de la linea de conexion F-F y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W. Al mismo tiempo la columna B se conecta a la entrada C para la reequilibracion.

f) Cuando la carga de unidad de separacion A2 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A2 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A2 con una linea de conexion W-F con la unidad de separacion A1, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A2, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A2 se cambia a la posicion de salida A2-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraen a traves de salida A1-W.

Preferiblemente, etapas a) a f) se realizan secuencialmente, esto significa que se realizan en el mismo orden dos o mas veces.

En una realizacion, el metodo comprende captura con ProtA en el modo de union elucion, alto rendimiento y pulido de modo mixto en el modo de flujo continuo. En un procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con ProtA, alto rendimiento y pulido de modo mixto, el metodo segun la invention se realiza

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion a2 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la etapa de inactivacion de virus con un tampon de inactivacion de virus, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de modo mixto) a traves de la linea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B, seguido por la reequilibracion con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad

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de separacion B con la salida B-W y la etapa de alimentacion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

c) Cuando la carga de la unidad de separacion A1 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A1 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A1 con una llnea de conexion W-F con la unidad de separacion A2, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A1, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A1 se cambia a la posicion de salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A2 y las moleculas no unidas se extraen a traves de salida A2-W.

d) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion a2 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo matriz de afinidad de ProtA) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la etapa de inactivacion de virus con un tampon de inactivacion de virus, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la salida A1-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A1 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio cationico) a traves de llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una debilmente o no se una a la unidad de separacion B, seguido por la reequilibracion con tampon B. Las etapas de reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de alimentacion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

f) Cuando la carga de la unidad de separacion A2 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A2 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A2 con una llnea de conexion W-F con la unidad de separacion A1, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A2, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A2 se cambia a la posicion de salida A2-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraen a traves de salida A1-W.

En una realizacion, el metodo comprende captura con AIEX, alto rendimiento, pulido con CIEX (union y elucion) y inactivacion de virus. En un procedimiento a modo de ejemplo que comprende captura con AIEX, alto rendimiento, pulido con CIEX (union y elucion) e inactivacion de virus, el metodo segun la invencion se realiza

a) alimentando la muestra sobre una columna de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio anionico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A1 y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A1-W, mientras la columna de separacion a2 (por ejemplo material de intercambio anionico) esta conectada con la entrada A (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la salida A2-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio cationico) a traves de la llnea de conexion C-P directamente para transferir la molecula

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objetivo a la unidad de separacion B, mientras la unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A2 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, seguido por lavado con tampon B, etapa de inactivacion de virus con un tampon de inactivacion de virus, elucion de la molecula objetivo con tampon A y reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-W y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida BP para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

c) Cuando la carga de la unidad de separacion A1 ha acabado, la molecula objetivo no unida de la unidad de separacion A1 se lava usando la entrada A mientras se conecta la unidad de separacion A1 con una llnea de conexion W-F con unidad de separacion A2, que esta cargandose a traves de la entrada B. Tan pronto como se detecte poca molecula objetivo de la unidad de separacion A1, se interrumpe la conexion y la salida de la columna A1 se cambia a la posicion de salida A1-W para extraer las moleculas no unidas, mientras tanto la molecula objetivo se carga ademas sobre la unidad de separacion A2 y las moleculas no unidas se extraen a traves de salida A2-W.

d) Alimentando la muestra sobre una unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio anionico) a traves de la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) en la que la composicion esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo (por ejemplo anticuerpo) se una a la unidad de separacion A2 (por ejemplo material de intercambio anionico) y las moleculas no unidas se extraigan a traves de la salida A2-W, mientras la unidad de separacion A1 (por ejemplo material de intercambio anionico) esta conectada con la entrada B (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para el lavado de la molecula objetivo unida con un tampon A a un primer pH, la elucion de la molecula objetivo unida con tampon B a un segundo pH y la reequilibracion de la columna de separacion A2 con tampon A. Las etapas de lavado y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion A2 con la unidad de separacion B (por ejemplo medio de intercambio cationico) a traves de llnea de conexion CP directamente para transferir la molecula objetivo a la unidad de separacion B, mientras una unidad de separacion B esta conectada con la entrada C (por ejemplo sistema de suministro de disolvente) para la alimentacion de la molecula objetivo desde la unidad de separacion A1 en las condiciones que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion B, el lavado con tampon B, la etapa de inactivacion de virus con un tampon de inactivacion de virus, la elucion de la molecula objetivo con tampon A y la reequilibracion con tampon B. Las etapas de alimentacion, lavado, inactivacion de virus y reequilibracion se realizan mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida BW y la etapa de elucion se realiza mientras se conecta la unidad de separacion B con la salida B-P para extraer la molecula objetivo purificada (por ejemplo anticuerpo).

El aparato y el metodo segun la presente invencion ofrecen por primera vez la posibilidad de un procedimiento cromatografico de dos etapas que ahorra tiempo para la purificacion de moleculas objetivo como anticuerpos. Si se necesita selectividad unica, el procedimiento se realiza usando por ejemplo captura por afinidad y pulido por intercambio cationico, y si se prefiere evitar un sorbente de afinidad, el procedimiento de purificacion se realiza por medio del intercambio de la etapa de cromatografla de afinidad (Prot A) por la cromatografla de intercambio ionico usando captura cationica y pulido anionico o captura anionica y pulido cationico. Esto tiene la ventaja de tiempos de uso de la resina mas prolongados, limpieza in situ, resinas baratas y puede aplicarse a multiples compuestos biofarmaceuticos.

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La optimizacion del procedimiento de purificacion actual por medio de la inactivacion de virus en columna permite acortar el tiempo de procesamiento. A menudo el tiempo de procesamiento se reduce hasta la mitad del tiempo o menos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos representan aplicaciones practicas de la invencion.

1.

La disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales, que tenia anticuerpo monoclonal 0,9 mg/ml que componla una fraccion del 17% de todos los componentes en la disolucion (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era de 600000 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico SP 2/0), se purifico sobre la resina Eshmuno™ S en el primer modo (que se parece a las columnas A1 y A2) y Capto™ Adhere en el segundo modo (que se parece a la columna B) en las siguientes condiciones. Condiciones de cromatografla: primer modo - se empaquetaron 33,5 ml de resina Eshmuno™ S en una columna de 16 x 150 mm; entonces se equilibro la columna con tampon fosfato 25 mM que contenla NaCl 20 mM, pH 4,5 a 30 ml/min (1000 cm/h). Segundo modo - se empaquetaron 33,5 ml de resina Capto™ Adhere en una columna de 16 x 150 mm; entonces se equilibro la columna con tampon TRIS 50 mM que contenla NaCl 20 mM, pH 9 a 15 ml/min (500 cm/h). Para preparar la muestra: se diluyo la disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales 1:2 con agua, se anadio acido caprllico al 0,5% mientras se agitaba durante 10 minutos. Se permitio que el precipitado formado se sedimentara durante otros 20 minutos. Se filtro la disolucion obtenida a traves de un filtro de 0,45 pm y titulo a pH 5,5, conductividad a aproximadamente 6 mS/cm. Se cargaron 3000 ml de muestra sobre la columna de Eshmuno ™ S y se lavo posteriormente la columna con acetato 25 mM, pH 4,6. Entonces se lavo la columna con fosfato 25 mM, pH 6,3. Entonces se redujo la velocidad de flujo hasta 300 cm/h (10 ml/min) y se eluyo el anticuerpo con 10 volumenes de columna en un gradiente lineal hasta TRIS 50 mM, NaCl 20 mM, pH ~7,5 (cond. aproximadamente 3,3 mS/cm) sobre la columna de Capto™ Adhere. Se uso dilucion en llnea con tampon TRIS 50 mM para aumentar el valor de pH de la disolucion que elula hasta 8,5. Entonces se lavo posteriormente la columna de Capto™ Adhere con un tampon TRIS 50 mM, pH 8,5, y se eluyo el anticuerpo con 10 volumenes de columna en un gradiente lineal hasta acido cltrico 10 mM, fosfato 10 mM y NaCl 20 mM, pH 3,5. La fraccion eluida contenla anticuerpo 3,2 mg/ml, que componia el 99,9% de todos los componentes (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era de 33 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico SP 2/0). Tras la elucion, se separaron ambas columnas con NaCl 1 M, luego NaOH 1 M.

2. Captura de cationes + flujo continuo de aniones

La disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales, que tenia anticuerpo monoclonal 0,9 mg/ml que componia una fraccion del 17% de todos los componentes en la disolucion (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era de 600000 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico SP 2/0), se purifico sobre la resina Eshmuno™ S en el primer modo (que se parece a las columnas A1 y A2) y Fractogel™ TMAE (M) en el segundo modo (que se parece a la columna B) en las siguientes condiciones. Condiciones de cromatografla: primer modo - se empaquetaron 33,5 ml de resina Eshmuno™ S en una columna de 16 x 150 mm; entonces se equilibro la columna con tampon fosfato 25 mM que contenia NaCl 20 mM, pH 4,5 a 30 ml/min (1000 cm/h). Segundo modo - se empaquetaron 33,5 ml de resina Fractogel™ TMAE (M) en una columna de 16 x 150 mm; entonces se equilibro la columna con tampon TRIS 50 mM que contenia NaCl 20 mM, pH 8,6 a 15 ml/min (500 cm/h). Para preparar la muestra: se diluyo la disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales 1:2 con agua, se anadio acido caprilico al 0,5% mientras se agitaba durante 10 minutos. Se permitio que el precipitado formado se sedimentara durante otros 20 minutos. Se filtro la disolucion obtenida a traves de un filtro de 0,45 pm y se titulo a pH 5,5, conductividad a aproximadamente 6 mS/cm. Se cargaron 3000 ml de muestra sobre la columna de Eshmuno™ S y se lavo posteriormente la columna con acetato 25 mM, pH 4,6. Entonces se lavo la columna con fosfato 25 mM, pH 6,3. Entonces se redujo la velocidad de flujo hasta 300 cm/h (10 ml/min) y se eluyo el anticuerpo con 10 volumenes de columna con TRIS 100 mM, NaCl 20 mM, pH ~8,5 (cond. aproximadamente 4,6 mS/cm) sobre la columna de Fractogel™ TMAE (M). Se uso dilucion en linea con tampon TRIS 100 mM para mantener el valor de pH de la disolucion que eluia a 8,6. Entonces se lavo posteriormente la columna de Fractogel™ TMAE (M) con un tampon TRIS 50 mM, pH 8,5, y se retiro por lavado el anticuerpo restante con 2 volumenes de columna. El flujo continuo contenia anticuerpo 2,8 mg/ml, que componia el 99,9% de todos los componentes (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era de 30 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico SP 2/0). Tras la elucion para la columna de Eshmuno ™ S y el lavado para la de Fractogel™ TMAE (M), se separaron ambas columnas con NaCl 1 M, luego NaOH 1 M.

3. Captura de ProtA + pulido de cationes

La disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales, que tenia anticuerpo monoclonal 0,9 mg/ml que componia una fraccion del 17% de todos los componentes en la disolucion (segun SEC analltica), en donde la

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cantidad de HCP era de 600000 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico SP 2/0), se purifico sobre la resina Prosep® Ultra Plus en el primer modo (que se parece a las columnas A1 y A2) y Eshmuno ™ S en el segundo modo (que se parece a la columna B) en las siguientes condiciones. Condiciones de cromatografla: primer modo - se empaquetaron 33,5 ml de resina Prosep Ultra® Plus en una columna de 16 x 150 mm; entonces se equilibro la columna con tampon fosfato 25 mM que contenla NaCl 20 mM, pH 7,2 a 30 ml/min (1000 cm/h). Segundo modo - se empaquetaron 33,5 ml de resina Eshmuno™ S en una columna de 16 x 150 mm; entonces se equilibro la columna con tampon glicina 10 mM que contenla NaCl 20 mM, pH 4,0 a 30 ml/min (1000 cm/h). Para preparar la muestra: se filtro la disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales a traves de un filtro de 0,45 pm y se titulo a pH 7,2, conductividad a aproximadamente 16 mS/cm. Se cargo una muestra de 1500 ml sobre la columna de Prosep® Ultra Plus y se lavo posteriormente la columna con tampon fosfato 25 mM que contenla NaCl 20 mM, pH 7,2. Entonces se redujo la velocidad de flujo hasta 300 cm/h (10 ml/min) y se eluyo el anticuerpo con 10 volumenes de columna con tampon glicina 10 mM que contenla NaCl 20 mM, pH ~5,0, (cond. aproximadamente 3,6 mS/cm) sobre la columna de Eshmuno ™ S. Se uso dilucion en llnea con tampon glicina 10 mM para mantener el valor de pH de la disolucion que elula a ~5,5. Entonces se lavo posteriormente la columna de Eshmuno™ S con un tampon glicina 10 mM, pH 4,0, y se eluyo el anticuerpo con 10 volumenes de columna en un gradiente lineal hasta tampon fosfato 25 mM que contenla NaCl 20 mM, pH 7,2. La fraccion de elucion contenla anticuerpo 4,5 mg/ml, que componla el 99,9% de todos los componentes (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era de 40 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico SP 2/0). Tras la elucion, se separo la columna de Prosep Ultra Plus con H3PO4 0,15 M, y la columna de Eshmuno™ S con NaCl 1 M y luego NaOH 1 M.

4. Captura de ProtA + flujo continuo de intercambio ionico mixto

La disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales, que tenia anticuerpo monoclonal 1,25 mg/ml que componla una fraccion del 10% de todos los componentes en la disolucion (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era de 250000 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico CHO), se purifico sobre la resina Prosep®-vA High Capacity en el primer modo (que se parece a las columnas A1 y A2) y Eshmuno™ S y Fractogel® TMAE Hicap en el segundo modo (que se parece a la columna B) en las siguientes condiciones. Condiciones de cromatografla: primer modo - se empaquetaron 17,3 ml de resina Prosep®-vA High Capacity en una columna de 16 x 8,6 mm; entonces se equilibro la columna con tampon TRIS 25 mM que contenla NaCl 20 mM, pH

7.0 a 30 ml/min (1000 cm/h). Segundo modo - se empaquetaron 16,75 ml de resina Eshmuno™ S en una columna de 16 x 75 mm y se empaquetaron 16,75 ml de resina Fractogel® TMAE Hicap en una columna de 16 x 75 mm, combinando ambas columnas en una unidad de separacion; entonces se equilibro esta unidad de separacion con tampon TRIS 25 mM que contenla NaCl 20 mM, pH 7,4 a 30 ml/min (1000 cm/h). Para preparar la muestra: se filtro la disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales a traves de un filtro de profundidad que tenia poros de 0,8 pm y 0,2 pm y se titulo a pH 7,2, conductividad a aproximadamente 18 mS/cm. Se cargaron 220 ml de muestra sobre la columna de Prosep®-vA High Capacity y se lavo posteriormente la columna con tampon TRIS 25 mM que contenla NaCl 500 mM, pH 7,2. Entonces se redujo la velocidad de flujo hasta 300 cm/h (10 ml/min) y se eluyo el anticuerpo con 10 volumenes de columna con tampon glicina 10 mM que contenla NaCl 20 mM, pH ~4,0, (cond. aproximadamente 3,6 mS/cm) sobre la columna de Eshmuno™ S/Fractogel® TMAE Hicap. Se uso dilucion en llnea con tampon TRIS 100 mM para mantener el valor de pH de la disolucion que elula a ~7,4. El flujo continuo contenla anticuerpo 5,67 mg/ml, que componla el 99,9% de todos los componentes (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era <50 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico CHO). Tras la elucion, se separo la columna de Prosep®-vA High Capacity con H3PO4 0,15M y la columna Eshmuno™ S/Fractogel® TMAE Hicap con NaCl 1 M y luego NaOH 1 M.

5. Captura de ProtA + flujo continuo en modo mixto

7.0 a 30 ml/min (1000 cm/h). Segundo modo - se empaquetaron 16,75 ml de resina Capto™ Adhere en una columna de 16 x 75 mm y se empaquetaron 16,75 ml de resina Capto™ MMC en una columna de 16 x 75 mm, combinando ambas columnas en una unidad de separacion; entonces se equilibro esta unidad de separacion con tampon TRIS 25 mM que contenla NaCl 50 mM, pH 7,4 a 30 ml/min (1000 cm/h). Para preparar la muestra: se filtro la disolucion de cultivo celular de anticuerpos monoclonales a traves de un filtro de profundidad que tenia poros de 0,8 pm y 0,2 pm y se titulo a pH 7,2, conductividad a aproximadamente 18 mS/cm. Se cargaron 220 ml de muestra sobre la columna de Prosep4-vA High Capacity y se lavo posteriormente la columna con tampon TRIS 25 mM que contenla NaCl 500 mM, pH 7,2. Entonces se redujo la velocidad de flujo hasta 300 cm/h (10 ml/min) y se eluyo el anticuerpo con 10 volumenes de columna con tampon glicina 50 mM que contenla NaCl 50 mM, pH ~4,0, (cond. aproximadamente 7,6 mS/cm) sobre la columna de Capto™ Adhere/Capto™ MMC. Se uso dilucion en llnea con

tampon TRIS 100 mM para mantener el valor de pH de la disolucion que elula a ~7,2. El flujo continuo contenla anticuerpo 6,15 mg/ml, que componla el 99,9% de todos los componentes (segun SEC analltica), en donde la cantidad de HCP era <30 ng/mg de anticuerpo (segun ensayo inmunoenzimatico CHO). Tras la elucion, se separo la columna de Prosep®-vA High Capacity con H3pO4 0,15 M y la columna de Capto™ Adhere/Capto™ MMC con NaCl 5 1 M y luego NaOH 1 M.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Aparato que comprende

- dos unidades de separacion A1 y A2 que tienen ambas la misma matriz de cromatografla y una unidad de separacion B que tiene una matriz de cromatografla que difiere de la matriz de cromatografla de las unidades de separacion A1 y A2, teniendo todas las unidades de separacion una entrada de fluido y una salida de fluido, para lo que hay al menos conexion de fluido entre la salida de fluido de la unidad de separacion A1 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B y conexion de fluido entre la salida de fluido de la unidad de separacion A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B

- al menos una valvula en la conexion de fluido entre las unidades de separacion A1 y A2 y la unidad de separacion B que permite cambiar entre comunicacion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A1 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B y comunicacion de fluido entre la salida de la unidad de separacion A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B

- al menos dos depositos de tampon y al menos dos bombas para lo que los depositos de tampon estan al menos en conexion de fluido con las entradas de las unidades de separacion A1 y A2 y las bombas se usan para transportar el llquido desde los depositos hacia las unidades de separacion conteniendo un deposito una disolucion de muestra que esta en conexion de fluido con las entradas de las unidades de separacion A1 y A2.
2. Aparato segun la reivindicacion 1, caracterizado porque las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de cromatografla de afinidad, una de intercambio cationico, una de intercambio cationico en modo mixto o una de intercambio anionico.
3. Aparato segun las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla de intercambio cationico, una de intercambio anionico en modo mixto o una de intercambio anionico.
4. Aparato segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de afinidad y la unidad de separacion B tiene una matriz de cromatografla de intercambio cationico, una de intercambio anionico en modo mixto o una de intercambio anionico.
5. Aparato segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las unidades de separacion A1 y A2 tienen una matriz de cromatografla de intercambio cationico o de intercambio cationico en modo mixto y la unidad de separacion B tiene una matriz de afinidad de intercambio anionico o una de intercambio anionico en modo mixto.
6. Aparato segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el aparato comprende ademas una llnea de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A1 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A2 y una llnea de conexion entre la salida de fluido de la unidad de separacion A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion A1.
7. Aparato segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el aparato comprende una entrada de fluido en la llnea de conexion entre las salidas de las unidades de separacion A1 y A2 y la entrada de fluido de la unidad de separacion B.
8. Aparato segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el aparato comprende un deposito adicional con tampon de inactivacion de virus que esta al menos en conexion de fluido con la entrada de una de las tres unidades de separacion.
9. Aparato segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el aparato comprende al menos un deposito adicional con tampon para limpieza in situ que esta al menos en conexion de fluido con la entrada de una de las tres unidades de separacion.
10. Metodo de purificacion continua de una molecula objetivo de una o mas impurezas en una muestra usando un aparato segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo el metodo las etapas de

- cargar alternativamente la muestra en las unidades de separacion A1 y A2 de modo que mientras que la muestra se carga en la unidad de separacion A1, en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion A1, la unidad de separacion A2 esta al menos parte de ese tiempo en comunicacion de fluido con la unidad de separacion B de modo que la molecula objetivo cargada en la unidad de separacion A2 se eluye sobre la unidad de separacion B y la unidad de separacion A2 se reequilibra, y mientras que la muestra se carga en la unidad de separacion A2 en la que la muestra esta a un primer pH y conductividad que permiten que la molecula objetivo se una a la unidad de separacion A2, la unidad de separacion A1 esta al menos parte de ese tiempo en comunicacion de fluido con la unidad de separacion B de modo que la

molecula objetivo cargada en la unidad de separacion A1 se eluye sobre la unidad de separation B y la unidad de separation A1 se reequilibra

- recuperar la molecula objetivo de la salida de fluido de la unidad de separacion B.
11. Metodo segun la revindication 10, caracterizado porque la molecula objetivo es un anticuerpo.

5 12. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 10 a 11, caracterizado porque mientras se carga la muestra

sobre la unidad de separacion A1, la salida de fluido de la unidad de separacion A1 esta al menos parte de ese tiempo en comunicacion de fluido con la entrada de fluido de la unidad de separacion A2 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la columna de separacion A1 para que se una a la columna de separacion A2 y mientras se carga la muestra sobre la unidad de separacion A2, la salida de fluido de la unidad de 10 separacion A2 esta al menos parte de ese tiempo en comunicacion de fluido con la entrada de fluido de la unidad de separacion A1 para permitir la captura de la molecula objetivo que empieza a lixiviarse de la columna de separacion A2 para que se una a la columna de separacion A1.
13. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque se bombea un tampon de inactivacion de virus a traves de la unidad de separacion A1 tras cargar la unidad de separacion A1 con la molecula

15 objetivo y a traves de la unidad de separacion A2 tras cargar la unidad de separacion A2 con la molecula objetivo.
14. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque, mientras se lava la muestra no unida de la unidad de separacion A1, la unidad de separacion A2 esta al menos parte de ese tiempo en comunicacion de fluido con el deposito que contiene disolucion de muestra y con la unidad de separacion A1 y mientras se lava la muestra no unida de la unidad de separacion A2, la unidad de separacion A1 esta al menos parte

20 de ese tiempo en comunicacion de fluido con el deposito que contiene disolucion de muestra y con la unidad de separacion A2.
15. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la muestra es una muestra clarificada.