ES2602459T3

ES2602459T3 - Anticuerpo anti-CD4

Info

Publication number: ES2602459T3
Application number: ES09835062.2T
Authority: ES
Inventors: Tomoaki Nakagawa; Sayaka Hori; Rinpei Niwa; Tsuguo Kubota; Kazuhiro Masuda; Kazuyasu Nakamura
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2008-12-26
Filing date: 2009-12-25
Publication date: 2017-02-21
Anticipated expiration: 2029-12-25
Also published as: PT2374883T; JPWO2010074266A1; US20100310573A1; EP2374883A1; PL2374883T3; HUE029946T2; EP2374883A4; US8877913B2; JP5511686B2; US8399621B2; WO2010074266A1; EP2374883B1; DK2374883T3; US20130177944A1

Abstract

Anticuerpo monoclonal frente a CD4 humano, presentando dicho anticuerpo una constante de disociación (KD) inferior a 1 x 10-9 M, se une a una región extracelular de CD4 humano, y es: (i) un anticuerpo híbrido humano recombinante en el que la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 12 pero que excluye la secuencia señal secretora de aminoácidos 1 a 19 en SEC ID nº: 12, y la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 22 pero que excluye la secuencia señal secretora de aminoácidos 1 a 20 en 10 SEC ID nº: 22; o (ii) un anticuerpo humanizado recombinante en el que: (a) la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 96 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 78; (b) la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 98 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 78; (c) la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 77 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 78; (d) la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 100 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 78; o (e) la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 100 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 102.

Description

Anticuerpo anti-C04.

Campo tecníco

La presente invención se refiere a un anticuerpo monodonal, que se une a la región extracelular de C04 humana con una afinidad elevada y también muestra una elevada citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (en adelante denominada ~actividad AOCC") o una elevada citotoxicidad celular dependiente del complemento (en adelante denominada "actividad COCO); a un AON que codifica el anticuerpo; a un vector que contiene el AON; a un transformante obtenible introduciendo el vector; a un procedimiento para producir un anticuerpo utilizando el transformante; ya la utilización del anticuerpo para la preparación de un agente terapéutico o un agente diagnóstico.

Tecnica anterior

El cumulo de diferenciación 4 (en adelante denominado ' C04") es una glicoproteina que presenta un peso molecular de aproximadamente 55 kOa, que se expresa en la superficie celular de la mayoria de las células tímicas, alrededor de 2/3 de las células T de la sangre periférica, monocitos, y macrófagos. El C04 es una proteína transmembránica de tipo I en la que cuatro dominios de la superiamilia de las inmunoglobulinas (denominados por orden 01 a 04 desde el término N hacia el lado de la membrana celular) están presentes en el exterior de las células, y en total dos cadenas de azúcar enlazadas mediante N están unidas a los dominios 03 a 04. El C04 se une a la molécula de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) a través de los dominios 01 y 02, Y entonces activa a las células T. Además, es conocido asimismo que C04 se polimeriza a través de los dominios 03 y 04. Es conocido que el dominio 01 de C04 actúa como receptor para un virus de la inmunodeficiencia humana (en adelante denomínado "HIV") (bibliografía 1 no de patente).

El C04 también es conocido como T4, y el gen se ha clonado en 1985 (bibliografía 2 no de patente), y la secuencia de ADN, la secuencia de aminoácidos y la estructura tridimensional de C04 están públicamente disponibles a partir de una base de datos conocida. Por ejemplo, se pueden obtener mediante referencia a los números de acceso P01730 (SWISSPROT), M12807 (EMBL), Y similares.

El anticuerpo monoclonal anti-C04 OKT4 se confirmó por primera vez como un anticuerpo monoclonal (en adelante denomínado "mAb") que se une a C04 (bibliografia 3 no de patente). Desde entonces, se ha dado a conocer un gran número de anticuerpos monoclonales frente a C04 (en adelante denominados "mAbs anti-C04"). Es conocido que la mayoría de los mAbs anti-C04 dados a conocer hasta ahora reconocen el dominio 01 (bibliografía 1 no de patente). Algunos mAbs anti-C04 están en desarrollo clínico con el fin de tratar cánceres, enfermedades inmunitarias, e infecciones. Por ejemplo, basándose en que la unión entre C04 y HIV es esencial para la infección de HIV, un anticuerpo que reconozca el dominio 01 de C04 puede inhibir la infección de HIV, bajo el desarrollo como un agente terapéutiCO contra el HIV.

Los ejemplos del mAb anti-C04 desarrollados como un agente terapéutico para cánceres y enfermedades inmunitarias incluyen zanolimumab (6G5) (bibliografia 4 no de patente). keliximab (CE9.1) (bibliografia 5 no de patente), y similares. Estos anticuerpos son anticuerpos que ejercen su eficacia médica atacando específicamente células que expresan C04, que son las células diana, y se considera que el mecanismo de la eficacia médica es debido principalmente a la actividad AOCC (bibliografías 6 y 7 no de patente). Mientras tanto, se muestra que estos anticuerpos están desprovistos de una actividad COC, que se sabe generalmente que es uno de los mecanismos principales de la eficacia médica de anticuerpos terapéuticos, como AOCC (bibliografias 6 y 7 no de patente).

La potencia de la actividad COC es diferente dependiendo de la subclase de anticuerpos, y las subclases IgG1 e IgG3 humanas tienen una actividad CDC elevada. Es conocido que la intensidad de la actividad COC entre las subclases está generalmente en el orden de IgG3 ~ IgG1 »lgG2 :.;. IgG4. Además, existe un caso en el que la actividad COC de un anticuerpo se ejerce o no se ejerce dependiendo del antígeno al que se una el anticuerpo (bibliografía 11 no de patente). En consecuencia, cada anticuerpo no siempre puede mostrar la actividad COCo

Entre los mAbs anti-C04 confirmados hasta el momento, se sabe poco de los anticuerpos que tienen actividad COCo Exclusivamente, incluso aunque se sabe que OKT4 muestra actividad COC frente a una estirpe celular humana positiva para C04 solamente cuando se usa suero de conejo que es rico en número de complementos (bibliografía 8 no de patente), no se han dado a conocer ejemplos de un anticuerpo que muestre actividad COC frente a una estirpe celular humana positiva para CD4 cuando se usa un complemento humano.

Se ha dado a conocer una constante de disociación Ka de un anticuerpo para varios mAbs anti-C04 conocidos. Por ejemplo, se ha dado a conocer que los anticuerpos mostrados en la sigu iente tabla tienen una constante de disociación Ka de alrededor de 7 a 0,01 nM (Tabla 1). AJ calcular las constantes de disociación, existe la posibilidad de que varíen los valores de medida dependiendo de los equipos de ensayo, métodos de ensayo y métodos de análisis. Por lo tanto, cuando se comparan constantes de disociación, se requieren los valores que se midieron y se analizaron en las mismas condiciones.

!Tabla 11

Nombre del clon Constante de disociación M

6G5*

7 1 x 10 CE9.1·

3,2 x 10· l eu-3a"

1,Ox10· 1388.2'"

5.0 x 10 : documento W097/13852, ..: bibli rafia 9 no de atente, ..*: bibli rafia 10 no de atente

5 La bibliografia 12 no de patente describe el anticuerpo anti-C04 13B8.2, que muestra proliferación de células de linfoma C04+ y muestra COC y AOCC. Listado de citas 10 Biblioorafia no de patente Bibliografia 1 no de patente: Leucocyte Typing VI , 49 (1997) Bibliografia 2 node patente: Cell, 42,93 (1985)

Bibliografía 3 node patente: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4061 (1979) Bibliografía 4 no de patente: Blood, 109,4655 (2007)

20 Bibliografia 5 no de patente: Lance!, 352, 1109 (1998) Bibliografía 6 no de patente: Clin Immunollmmunopat hol, 84, 73 (1997) Bibliografía 7 no de patente: Cancer Res, 67, 9945 (2007)

Bibliografía 8 no de patente: J Immunol, 164, 1925 (2000) Bibliografia 9 no de patente: J Immunol, 145, 2839 (1990)

30 Bibliografía 10 No de patente: Clinicallmmunology, 119, 38 (2006) Bibliografia 11 no de patente: J. Immunol., 174, 5706(2005) Bibliografía 12 no de patente: Journal of Immunotherapy, 30, 190 (2007)

Sumario de la invención

Problema técnico

40 Un objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que se une a una región extracelular de CD4 con afinidad elevada, y que también muestra una actividad AOCC o actividad COC elevada; un ADN que codifica el anticuerpo; un vector que contiene el AON; un transformante obtenible introduciendo el vector; un procedimiento para producir un anticuerpo utilizando el transformante; y la utilización del anticuerpo para la fabricación de un agente terapéutico o un agente diagnóstico.

Solución al problema La presente invención se refiere a los siguientes (1) a (11): 50 (1) Un anticuerpo monoclonal frente a CD4 humana, anticuerpo el cual tiene una constante de disociación (en adelante denominada "Ka") menor que 1 x 10-9 M, se une a una región extracelular de C04 humana, yes:

(i) un anticuerpo híbrido humano recombinante en el que la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC 10 NO: 12 pero excluyendo la secuencia

55 señal secretora de aminoácidos 1 a 19 en SEC ID NO: 12, y la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 22 pero excluyendo la secuencia señal secretora de aminoácidos 1 a 20 en SEC 10 NO: 22; o

(ii) un anticuerpo humanizado recombinante en el que:

(a): la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 96, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 78;

(b): la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 98, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 78;

(c): la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 77, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 78;

(d): la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 100, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 78; o

15 (e) la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 100, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 102.

(2): El anticuerpo monoclonal según (1), en el que la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 96, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 78.

(3): El anticuerpo monodonal según (1) o (2), que se une a C04 con una Ko menor que 7 x 10-10 M.

(4): El anticuerpo monodonal según (1) o (2), que se une a C04 con una Ko menor que 2 x 10. 10 M.

(5): El anticuerpo monocional según uno cualquiera de (1) a (4), en el que el anticuerpo tiene una actividad COC sobre una estirpe celular de cáncer humano que expresa C04 humana.

(6): Un AON que codifica el anticuerpo según uno cualquiera de (1) a (5).

(7): Un vector recombinante que comprende el AON según (6).

(8): Un transformante obtenible al introducir el vector recombinante según (7) en una célula hospedante.

35 (9) Un procedimiento para producir el anticuerpo monodonal según uno cualquiera de (1) a (5), que comprende cu ltivar el transformante definido en (8) en un medio para producir y acumular el anticuerpo según uno cualquiera de (1) a (5) en el cultivo, y recoger el anticuerpo del mismo desde el cultivo.

(10): Utilización del anticuerpo según uno cualquiera de (1) a (5) para la fabricación de un agente de diagnóstico

o agente terapéutico para un cáncer positivo para C04 humana.

(11): Un anticuerpo según uno cualquiera de (1) a (5) para la utilización para tratar cáncer positivo para C04: detectar o medir inmunitariamente C04 in vivo; o diagnosticar cáncer positivo para C04 in vivo.

45 Efectos ventajosos de la invención

La presente invención puede proporcionar un anticuerpo monodonal que reconoce especificamente una región extracelular de C04 humana y se une a la región extracelular con una afinidad elevada, y también muestra una actividad AOCC elevada o una actividad COC elevada; un ADN que codifica el anticuerpo; un vector que comprende el AON; un transformante obtenible al introducir el vector; un procedimiento para producir un anticuerpo usando el transformante; y la utilización del anticuerpo para la fabricación de un agente terapéutico o un agente de diagnóstico.

Breve descripción de los dibujos

55 La figura 1 representa un procedimiento de construcción de un vector de expresión de C04.

La figura 2 representa un procedimiento de construcción de un vector de expresión de C04-Fc.

La figura 3 representa la reactividad de un anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 y un anticuerpo de ratón antiC04 OKT4 para la estirpe celular de linfoma de células T humano HPB-ALl en el análisis de FCM. la gráfica se divide en (A) a (O) según la subdase de los anticuerpos. la abscisa representa una concentración de cada uno de los anticuerpos, y la ordenada representa el valor de la intensidad de fluorescencia media, MFI. (A) • representa un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4065, y X representa un anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4069. (8) X representa un anticuerpo monodonal de rata anti-C04 KM4068. (C) • representa un anticuerpo

65 monoclonal de rata anti-C04 KM4066, y o representa un anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4067. (O) • representa un anticuerpo monodonal de ratón anti-C04 OKT4.

La figura 4 representa citotoxicidad celular dependiente del complemento (actividad CDC) de un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 y un anticuerpo mOllOaonal de ratón anti-CD4 DKT4 sobre un transfectante Que expresa CD4. La ordenada representa una tasa de citotoxicidad celular (%), y la abscisa representa una concentración de anticuerpo de un anticuerpo monoaonal anti-CD4.• representa un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4066, • representa un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4067, -representa un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4068, y + representa un anticuerpo monoaonal de ratón anti-CD4 DKT4.

La figura 5 representa un procedimiento de clonación de un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4.

La figura 6 representa un procedimiento de construcción de un vector de expresión de anticuerpo hibrido anti-CD4.

La figura 7 representa un procedimiento de construcción de vectores de expresión de anticuerpos humanos anti-CD4 6GS-1 y 6GS-113F.

La figura 8 representa la reactividad de diversos anticuerpos anti-CD4 en el ELlSA de unión. La abscisa representa una concentración de cada uno de los anticuerpos, y la ordenada representa una actividad de unión de cada uno de los anticuerpos. Se muestra la reactividad de cada anticuerpo frente a CD4 humana recombinante. l::.. en la linea discontinua representa un anticuerpo monoaonal 6GS-1 , l::.. en la linea continua representa un anticuerpo humano anti-CD46G5-P, ... representa un anticuerpo humano anti-CD4 6G5-113F, • representa un anticuerpo hibrido antiCD4 KM4045, • representa un anticuerpo hibrido anti-CD4 KM4046, o representa un anticuerpo hibrido anti-CD4 KM4047, X en la linea discontinua representa un anticuerpo hibrido anti-CD4 KM4048, y X en la linea continua representa un anticuerpo hibrido anti-CD4 KM4049.

La figura 9 representa citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) de diversos anticuerpos anti-CD4 sobre diversas estirpes de células T humanas. La ordenada representa una tasa de citotoxicidad celular (%), y la abscisa representa una concentración de anticuerpo de cada anticuerpo. l::.. en la linea discontinua representa un anticuerpo monoclonaI6G5-1, t::. en la linea continua representa un anticuerpo monoclonal 6GS-P, ... representa un anticuerpo hibrido 6GS-1 13F, . representa un anticuerpo hibrido KM4045, • representa un anticuerpo hibrido KM4046, o representa un anticuerpo hibrido KM4047, X en la linea discontinua representa un anticuerpo hibrido KM4048, y X en la linea continua representa un anticuerpo hibrido KM4049. (A) muestra una actividad ADCC cuando se usó HPB-ALL como célula diana. (B) muestra una actividad ADCC cuando HUT78 se usó como célula diana. (C) muestra una actividad ADCC cuando se usó SUP-T1 como célula diana. (O) muestra una actividad ADCC cuando se usó HPB-ALL como célula diana.

La figura 10 representa citotoxicidad celular dependiente del complemento (actividad COe¡ de diversos anticuerpos anti-CD4 Sobre un transfectante Que expresa C04 o una estirpe celular de linfoma humano. La ordenada representa una tasa de citotoxicidad celular (%), y la abscisa representa una concentración de anticuerpo de cada anticuerpo.

(A) muestra una actividad CDC sobre un transfectante que expresa CD4. (B) muestra una actividad CDC sobre la estirpe celular de linfoma humano HPB-ALL. + en la linea discontinua representa un anticuerpo humano anti-CD4 6GS-1, + en la linea continua representa un anticuerpo humano anti-CD4 6GS-113F, ... representa un anticuerpo híbrido antí-CD4 KM4045, • representa un anticuerpo híbrido antí-CD4 KM4046, • representa un antícuerpo híbrido anti-CD4 KM4047, -representa un anticuerpo hibrido anti-CD4 KM4048,. representa un anticuerpo hibrido anti-C04 KM4049, y . en la linea discontinua representa un anticuerpo de ratón anti-CD4 DKT4.

La figura 11 representa la reactividad de diversos anticuerpos anti-CD4 para una estirpe celular de linfoma de células T HPB-ALL positiva para CD4 en el uso de un citómetro de flujo. La abscisa representa una ooncentración de anticuerpo (Jlg/ml), y la ordenada representa un valor de intensidad de fluorescencia media, MFI. • representa un anticuerpo hibrido KM4045, o representa un anticuerpo humanizado HVDLVO, o representa un anticuerpo humanizado HV2LVO, Orepresenta un anticuerpo humanizado HV3LVO, -representa un anticuerpo humanizado HV4LVO, X representa un anticuerpo humanizado HV4LV6, l::.. en la linea discontinua representa un anticuerpo humano 6GS-1 , y t::. en la linea continua representa un anticuerpo humano 6G5-P.

La figura 12 representa una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) de diversos anticuerpos anti-CD4 sobre diversas estirpes de linfoma de células T humano. La ordenada representa una tasa de citotoxicidad celular (%), y la abscisa representa una concentración de anticuerpo (ng/ml) . • representa un anticuerpo hibrido KM4045, o representa un anticuerpo humanizado KMB045, ... en la linea discontinua representa un anticuerpo humano 6G5-1, y ... en la linea continua representa un anticuerpo humano 6GS-P. (A) muestra una actividad AOCC cuando se usó HPB-ALL como célula diana. (B) muestra una actividad ADCC cuando se usó HUT7a como célula diana. (C) muestra una actividad AOCC cuando se usó CCRF-CEM como célula diana.

La figura 13 representa el efecto antitumoral (modelo de cáncer de etapa temprana) de cada anticuerpo de la estirpe celular de linfoma de células T humano HH Que se trasplantó en un ratón SCIO. La abscisa representa el número de dias después del trasplante del tumor, y la ordenada representa un volumen tumoral. X representa un grupo de control negativo, ... representa un grupo al Que se le administró KM8045, y • representa un grupo al Que se le

administró 6G5-P. La barra representa una desviación estándar.

La figura 14 representa efectos antitumorales (modelo de metástasis) de anticuerpos individuales sobre células C04/EL4 que se trasplantaron a un ratón C57BU6. En (Al, la ordenada representa una relación de peso del hígado.

(B) la ordenada representa una relación de peso de riñón. La barra representa una desviación estándar.

La figura 15 representa efectos antítumorales (modelo de cáncer progresivo) de cada anticuerpo sobre una estirpe celular HH que se trasplantó en un ratón SCIO. La abscisa representa el número de días después del trasplante del tumor, y la ordenada representa un volumen tumoral. X representa un grupo de control negativo, .. representa un grupo al que se administró 20 Ilgtcabeza de KM8045, • representa un grupo al que se administró 100 Ilgtcabeza de KM8045, y o representa un grupo al que se administró 200 Ilgtcabeza de KM8045. La barra representa una desviación estándar.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une con afinidad elevada a una región extracelular de C04 y en consecuencia tiene citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos elevada (en adelante denominada "actividad AOCC").

El C04 incluye un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807; un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos están suprimidos, sustituidos o añadidos a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807, Y que tiene la actividad de C04; un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de homología, preferentemente al menos 80% de homología, más preferentemente al menos 90% de homología, y muy preferentemente al menos 95% de homología, con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807, Y que tiene la actividad de C04; y similares.

El polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos están suprimidos, sustituidos yto añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807 se puede obtener, por ejemplo, introduciendo una mutación específica del sitio en AoN que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 mediante mutagénesís específica del sitio ¡Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nudeic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), o Proc. Natl. Acad. $ei. USA, 82, 488 (1985)] o similar. El número de restos de aminoácidos que se suprimen, sustituyen o añaden no está particularmente limitado, y el número es preferentemente 1 a docenas, tal como 1 a 20, y más preferentemente 1 a varios, tal como 1 a 5.

Como gen que codifica C04, se puede ejemplificar la secuencia nucleotidica representada por SEC ID NO: 2 o el N° de Acceso de EMBL M12807. El gen que codifica C04 también incluye un gen que contiene un AON que comprende una secuencia nucleotidica que tiene una supresión o supresiones, una sustitución O sustituciones o una adición o adiciones de uno o más nucle6tidos en la secuencia nucleotidica representada por SEC ID NO: 2 o el N° de Acceso de EMBL M12807, Y que codifica también un polipéptido que tiene la función de C04; un gen que contiene un AON que consiste en una secuencia nucleotídica que tiene al menos 60% o más de homología, preferentemente 80% o más de homologia, y más preferentemente 95% o más de homologia, con la secuencia nucleotidica representada por SEC ID NO: 2 o el N° de Acceso de EMBL M12807, Y que también codifica un polipéptido que tiene la función de C04; un gen que consiste en un AON que se hibrida con un AON que tiene la secuencia nucleotídica representada por SEC ID NO: 2 o el N° de Acceso de EMBL M12807 en condiciones restrictivas y que también contiene un AoN que codifica un polipéptido que tiene la función de C04; y similares.

El AoN que se hibrida en condiciones restrictivas se refiere a un AoN que se obtiene mediante hibridación en colonias, hibridación en placa, hibridación de transferencia Southern, miCfomatriz de AoN, o similar, usando como sonda un AON que tiene la secuencia nucleotídica representada por SEC ID NO: 2 o el N° de Acceso de EMBL M12807. Un ejemplo específico de tal AON es un AON derivado de la hibridación en colonias o en placa que se puede identificar llevando a cabo la hibridación [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbar Lab. Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997); ONA Cloning 1: Core Technique, A Practical Approach, Segunda Edición, Oxford University (1995)] a 65°C en presencia de 0,7 a 1,0 moles/l de cloruro de sodio usando un filtro o portaobjetos de vidrio con el producto de la PCR u oligo AON que lo tiene inmovilizado sobre él, y lavando entonces el filtro o portaobjetos de vidrio a 65°C con una disolución de SSC de concentración 0,1 a 2 veces (disolución de SSC de concentración 1 vez: 150 mmolesll de cloruro de sodio y 15 mmoles/I de citrato de sodio). Específicamente, el ADN capaz de hibridarse incluye AoN que tiene al menos 60% o más de homologia, preferentemente 80% o más de homología, más preferentemente 90% o más de homologia, y lo más preferible 95% o más de homología con la secuencia nucleotídica representada por SEC ID NO: 2 o el N" de Acceso de EMBL M12807.

En la secuencia nucleotídica del gen que codifica una proteína de un eucariota, a menudo se reconoce el polimorfismo genético. El gen de C04también incluye un gen en el que se genera una pequeña modificación en la

secuencia nudeotídica mediante tal polimorfismo.

El numero de la homología puede ser un numero calculado usando un programa de busqueda de homología conocido por la experto en la materia, excepto que se índique de otro modo. Con respecto a la secuencia nucleotídica, el numero se puede calcular usando BLAST [J . Mol. Biol., 215, 403 (1990)] con un parámetro por defecto o similar, y con respecto a la secuencia de aminoácidos, el número se puede calcular usando BLAST2 (Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997); Genome Res., 7, 649 (1997), con un parámetro por defecto; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/EducationlBLASTinfofinformation3.html] o similar.

Como parámetro por defecto, G (Coste por espacio vacío abierto) es 5 para la secuencia nucleotídica y 11 para la secuencia de aminoácidos; -E (Coste de espacio vacío extendido) es 2 para la secuencia nucleotídica y 1 para la secuencia de aminoácidos; -q (Penalización para error de apareamiento de nucle6tidos) es -3; -r (recompensa para apareamiento de nucle6tidos) es 1; -3 (valor esperado) es 10; -W (tamaño de palabra) es 11 restos para la secuencia nucleotídica y 3 restos para la secuencia de aminoácidos; -y ]caída (X) para extensiones de blast en bits] es 20 para blastn y 7 para un programa distinto de blastn; -X (valor de caída X para el alineamiento con espacios vacíos en bits) es 15; y -Z (valor de caida X final para el alineamiento con espacios vacios en bits) es 50 para blastn y 25 para un programa distinto de blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blasVhtmllblastcgihelp.html).

El polípéptido que comprende una secuencia parcial de la secuencia de amínoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807 se puede preparar según un método conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede preparar suprimiendo una parte del AON que codifica la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 2 y cultivando un transformante en el que se íntroduce un vector de expresión que contiene el AON. También, en base al polipéptido o AON preparado usando el método anterior, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, sustituidos o añadidos en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807 se puede preparar de la misma manera como se describe anteriormente. Además, el polipéptido que comprende una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, sustituidos o añadidos en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807, se puede producir mediante un método de síntesis quimica tal como el método de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o el método de t-butiloxicarbonilo (tBoe).

En la presente invención, la región extracelular de CD4 incluye, por ejemplo, regiones predichas a partir de la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por SEC ID NO: 1 usando un programa de deducción de la región transmembránica generalmente conocida SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/SOSUI/SOSUI_submit.), TMHMM ver. 2 (http://WINW.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.orgl), o similar. Los ejemplos de la región extracelular de C04 en la presente invención incluyen regiones que corresponden al término N hasta la posición 394 en el dominio extracelular predicho por SOSUI. La región extracelular comprende dominios de la superfam ilia de inmunoglobulinas (01 a 04), y cada dominio está comprendido en el dominio extracelular predicho.

La región extracelular de C04 en la presente invención puede tener cualquier estructura. en tanto que tenga una estructura equivalente a una estructura que se pueda tomar en un estado nativo por la región extracelular de C04 que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1 o el N° de Acceso de EMBL M12807. La expresión "estructura que se puede tomar en el estado nativo por la región extracelular de C04" se refiere a una estructura (conformacional) tridimensional nativa de C04 que se expresa en una membrana celular.

La función de C04 en la presente invención significa que C04 induce la activación o diferenciación de células T al actuar como un cofactor de un receptor de células T cuando C04 se une a un complejo de MHC clase II-antígeno que se expresa en una célula presentadora de antigenos, a través del receptor de células T que se expresa en las células T. Además, los ejemplos de la función de C04 incluyen su participación en la infección de células T con HIV de una forma tal que C04 expresada sobre una membrana celular de células T se une a gp120, que es una de las proteínas de cubierta de un virus de inmunodeficiencia humana (HIV).

La unión del anticuerpo de la presente invención a la región extracelular de C04 se puede confirmar mediante un método en el que se puede examinar la capacidad de unión de una célula que expresa un antigeno específico y un anticuerpo para el antígeno específico, por ejemplo mediante un radioinmunoensayo usando un método de sándwich en fase sólida o similar, o un método de detección inmunológica convencionalmente conocido para una célula que expresa C04 usando un método de inmunoensayo enzimático (ELlSA), preferentemente un método de tinción celular fluorescente o similar. Los ejemplos induyen un método de tinción de anticuerpos fluorescente usando el sistema FMAT810QHTS (fabricado por Applied Biosystem), (Cancer Immunol. Immunol her., 36, 373 (1993)], un método de tinción celular fluorescente que usa citometria de flujo, una resonancia de plasmones superficiales que usa el sistema de Biacore (fabricado por GE Healthcare), y similar. Además, también se puede confirmar mediante una combinación de métodos de detección inmunológica convencionalmente conocidos (Monoclonal Antibodies-Principies and Practice, Tercera edición, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)], y similares.

Como célula que expresa C04, se incluyen cualesquiera células en tanto expresen CD4. los ejemplos incluyen una célula Que existe en el cuerpo humano, una estirpe celular que se establece a partir de una célula que existe de forma natural en el cuerpo humano, y una estirpe celular que se produce usando técnicas recombinantes de genes.

la célula que está presente de forma natural en el cuerpo humano incluye una célula que expresa C04 en el cuerpo de un paciente que sufre enfermedad autoinmunitaria, un paciente alérgico y un paciente con cáncer. Los ejemplos incluyen una célula que expresa C04 entre células tumorales obtenidas mediante biopsia, o similares.

la estirpe celular establecida a partir de la célula que está presente de forma natural en el cuerpo humano incluye una estirpe celular que expresa CD4 entre las estirpes celulares obtenidas estableciendo las células descritas anteriormente que expresan CD4 obtenidas a partir de un paciente con cáncer, tal como una estirpe celular de linfoma de células T humano (OSMZ NO: ACC483) o HUT78 (ATCC No: TIB16).

los ejemplos especificos de la célula obtenida usando técnica de recombinación génica incluyen una célula que expresa CD4, que se prepara introduciendo un vector de expresión que comprende ADNc que codifica C04 en una célula de insecto o en una célula de animal, etc., y similar.

Ejemplos del anticuerpo de la presente invención incluyen un anticuerpo monoclonal frente a CD4 humana que tiene una constante de disociación (en adelante denominada ~Ko") menor que 1 x 10. 9 M del anticuerpo a CD4, se une a una región extracelular de CD4 humana con afinidad elevada, y tiene actividad AOCC elevada.

Además, los ejemplos del anticuerpo de la presente invención incluyen un anticuerpo monoclonal frente a C04 humana que tiene una constante de disociación "Ko" del anticuerpo de 1 x 10. 9 M o menos para el antigeno, y tiene una actividad ADCC elevada y una citotoxicidad celular dependiente del complemento (actividad CDC) elevada. Los ejemplos del anticuerpo de la presente invención también incluyen un anticuerpo que tiene actividad CDC sobre una estirpe celular de cáncer humano que expresa CD4 humana.

El anticuerpo monoclonal de la presente invención incluye un anticuerpo recombinante producido mediante un transformante transformado con un vector de expresión que contiene un gen que codifica el anticuerpo.

El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo segregado por una célula produclora de anticuerpo de un solo clon, y reconoce solamente un epitopo (también denominado determinante antigénico) y tiene secuencia de aminoácidos uniforme (estructura primaria).

En la presente invención, el anticuerpo monoclonal presenta una estructura que comprende un heterotetrámero que consiste en dos cadenas H y dos cadenas l. Una cadena H comprende una región variable de la cadena H (en adelante denominada "VH") y una región constante de cadena H (en adelante denominada OCHO); y una cadena l comprende una región variable de cadena L (en adelante denominada "VL") y una región constante de cadena L (en adelante denominada "Cl"). Además, CH comprende cuatro dominios: dominio CH1, dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3. Además, un dominio que consiste en el dominio CH2 y en el dominio CH3 juntos se define como "región Fc". "dominio Fc" o simplemente "Fc" de un anticuerpo.

Los ejemplos del epitopo incluyen una secuencia de un solo aminoácido, una estructura tridimensional fonnada por una secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos que tiene una cadena de azúcar unida a ella, una estructura tridimensional fonnada por una secuencia de aminoácidos que tiene una cadena de azúcar unida a ella, y similar, que un anticuerpo monoclonal reconoce y al que se une. El anticuerpo monoclonal de la presente invención reconoce un epitopo que comprende 03 o 04 de la región extracelular de C04.

En la presente invención, un anticuerpo Que se une a C04 con afinidad elevada es un anticuerpo que tiene suficiente afinidad para un anticuerpo terapéutico, es decir, un anticuerpo que se une a CD4 con un valor de la constante de disociación Ko menor que 1 x 10-9 M, preferentemente menor que 7 x 10. 10 M, más preferentemente menor que 2 x

10. 10 M, en ténninos de afinidad. Zanolimumab (6G5), con el cual ya se ha comenzado un ensayo clinico, tiene afinidad con un valor de la constante de disociación Ko de 7,1 x 10.9 M, Y exhibe efectos terapéuticos elevados. Por lo tanto, el anticuerpo de la presente invención puede exhibir efectos terapéuticos elevados.

La afinidad se mide mediante análisis cinético, y se puede medir, por ejemplo, usando un Biacore T100 (fabricado por GE Healthcare Sio-$ciences), o similar.

En la presente invención, la expresión "disociaciones lentas· Significa que un valor de una constante de velocidad de disociación kd de un anticuerpo, calculado mediante Siacore T100, tiene un valor más pequeño. La menor constante de velocidad de disociación representa que un anticuerpo no se disocia fácilmente de una célula que expresa antigenos. Al incrementar la cantidad de un anticuerpo que se une a la superficie celular para prolongar de ese modo el tiempo de eficacia del anticuerpo, entonces se puede esperar una eficacia médica elevada. Una constante de velocidad de disociación kd se mide, por ejemplo, usando un Siacore T100 (fabricado por GE Healthcare SioSciences), y se puede calcular mediante un software instalado en el aparato, software de evaluación de Siacore

T100 (fabricado por Biaoore).

Como se usa en la presente memoria, la expresión ~anticuerpo que tiene una actividad ADCC elevada" se refiere a un anticuerpo que tiene una actividad AOCC mayor que los anticuerpos anti-C04 6G5 y CE9.1 , los cuales se ha informado que tienen una actividad AOCC, cuando las actividades AoCC de varios anticuerpos se midieron simultáneamente para células que expresan C04, usando un método de ensayo conocido [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)].

La expresión "actividad AOCC" significa una actividad que conduce a la citotoxicidad a una célula diana de una manera tal que un anticuerpo unido a un antígeno en la célula diana se une a un receptor Fc de una célula inmune a través de una región Fc del anticuerpo, dando en consecuencia como resultado la activación del sistema inmunitario (célula asesina natural, etc.).

Un receptor Fc (en adelante denominado "FcR") es un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo y conduce a diversas actividades efectoras mediante la unión al anticuerpo. Un FcR corresponde a una subclase de un anticuerpo, e IgG, IgE, IgA e IgM se unen específicamente a FcyR, FlOR, FwR Y Fq.lR, respectivamente. Además, un FcyR tiene subtipos de FcyRl (C064), FcyRlI (C032) y FcyRlIl (CD16), Y éstos tienen isoformas de FcyRIA, FcyRIB, FcyRIC, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, FcyRlIlA Y FcyRIIIB, respectivamente. Los diferentes FcyRs diferentes anteriores existen en diferentes células (Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (199 1» . En el ser humano, FcyRlIlB se expresa específicamente sobre un neutrófilo, y FcyRlIlA se expresa sobre un monocito, una célula asesina natural (célula NK) y cierta parte de la célula T. La unión de un anticuerpo a través de FcyRlI lA conduce a una actividad AoCC dependiente de las células NK.

En la presente invención, la expresión "anticuerpo que tiene una actividad COC elevada" se refiere a un anticuerpo que tiene una actividad COC mayor que los anticuerpos anli-C04 convencionales, cuando las actividades CDC de varios anticuerpos se miden simultáneamente para células que expresan C04, usando un complemento humano y un método de ensayo de CDC conocido [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)]. Es más preferido un anticuerpo que tiene una actividad CDC mayor que anticuerpos anti-C04 convencionales, cuando una actividad CDC del anticuerpo se mide de la misma manera que antes para una célula que expresa CD4 que está presente de forma natural en el cuerpo humano o una estirpe celular de cáncer positiva para CD4. Más especifica mente, tal anticuerpo es aquel que exhibe una actividad CDC mayor que un anticuerpo anti-CD4 convencional 6G5 u OKT4, en el mismo sistema experimental.

La expresión ~actividad CDC" se refiere a una actividad que conduce a la citotoxicidad a una célula diana de una manera tal que un anticuerpo unido a un antigeno en la célula diana activa una serie de cascadas (rutas de activación del complemento) que contienen en la sangre grupos proteicos relacionados con el complemento. Además, fragmentos proteicos generados mediante la activación de un complemento pueden inducir la migración y activación de células inmunitarias.

Los anticuerpos de la presente invención reconocen el dominio D3 o D4, y tienen una VH que comprende las secuencias de aminoácidos de CDRs 1 a 3 representadas por SEC ID NOs: 27 a 29, respectivamente, y una VL que comprende las secuencias de aminoácidos de CoRs 1 a 3 representadas por SEC ID NOs: 30 a 32, respectivamente.

Además, ejemplos específicos del anticuerpo monoclonal de la presente invención son un anticuerpo monoclonal en el que la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 12 pero excluyendo la secuencia señal secretora de aminoácidos 1 a 19 en SEC ID NO: 12, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 22 pero excluyendo la secuencia señal secretora de aminoácidos 1 a 20 en SEC ID NO: 22.

Además, un anticuerpo que se une a CD4 tiene actividad inductora de apoptosis.

Los hibridomas se pueden preparar, por ejemplo, preparando la célula anterior que expresa C04 como antígeno, induciendo una célula productora de anticuerpos que tiene especificidad por el antigeno procedente de un animal inmunizado con el antígeno, y fusionando la célula productora del antigeno con una célula de mieloma. El anticuerpo monoclonal anti-C04 se puede obtener cultivando el hibridoma o administrando la célula de hibridoma a un animal para producir tumor ascítico en el animal, y separando y purificando el cultivo o la ascitis.

El animal inmunizado con un antígeno puede ser cualquier animal, en tanto que se pueda preparar un hibridoma, y se usa de forma adecuada un ratón, rata, hámster, pollo, conejo o similar.

En la presente invención, el anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo producido mediante recombinación génica, y es un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo humanizado (anticuerpo con región determinante de la complementariedad (en adelante denominada CDR) injertada). Entre los anticuerpos recombinantes, como agente terapéutico es preferido aquel que presente caracteres de un anticuerpo monoclonal, baja inmunogenicidad y

semivida prolongada en la sangre. los ejemplos del anticuerpo recombinante incluyen un anticuerpo en el que el anticuerpo monoclonal anterior de la presente invención se modifica mediante tecnologia de recombinación génica.

la CH del anticuerpo recombinante de la presente invención es preferentemente de origen humano, e incluye el dominio CH1 , el dominio CH2 y el dominio CH3.

la región Fc del anticuerpo recombinante de la presente invención puede incluir una o más modificaciones de aminoácidos, en tanto que tenga actividad de unión a FcyR.

El anticuerpo hibrido humano es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada VH y una región variable de cadena ligera Vl de un anticuerpo de un animal no humano, y CH y Cl de un anticuerpo humano. Especificamente, el anticuerpo hibrido humano de la presente invención se puede producir obteniendo los ADNc que codifican VH y Vl de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reconoce especificamente CD4 y se une a la región eld:racelular, insertando cada uno de ellos en un vector de expresión para una célula de animal que comprende los ADN que cod ifican CH y Cl del anticuerpo humano para construir de ese modo un vector de expresión de anticuerpo hibrido humano, e introduciendo después el vector en una célula de animal para expresar el anticuerpo.

Como la CH del anticuerpo hibrido humano, se puede usar cualquier CH, en tanto que pertenezca a inmunoglobulina humana (en adelante denominada "hlg"), y se prefieren aquellas que pertenezcan a la clase hlgG, y se puede usar una cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase hlgG, tales como hlgG1 , hlgG2, hlgG3 Y hlgG4. Como la Cl del anticuerpo hibrido humano, se puede usar cualqu ier Cl, en tanto que pertenezca a la clase hlg, y se pueden usar aquellas que pertenezcan a la clase K" o a la clase A.

El anticuerpo hibrido humano de la presente invención es un anticuerpo hibrido humano en el que VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 12 pero excluyendo la secuencia señal secretora de los aminoácidos 1 a 19 en SEC ID NO: 12, y Vl del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 22 pero excluyendo la secuencia señal secretora de los aminoácidos 1 a 20 en SEC ID NO: 22.

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de CDRs de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano se injertan en posiciones apropiadas de VH y Vl de un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado de la presente invención se puede producir construyendo ADNc que codifican una región V en la que las secuencias de aminoácidos de CDRs de VH y Vl de un anticuerpo derivado de un animal no humano producido mediante un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reconoce especificamente CD4 y se une a la región eld:racelular se injertan en la región de estructura (en adelante denominada ~FR~) de VH y Vl de cualquier anticuerpo humano, insertando cada uno de ellos en un vector de expresión de una célula de animal que comprende genes que codifican CH y Cl de un anticuerpo humano para construir de ese modo un vector para la expresión de anticuerpo humanizado, e introduciéndolo en una célula de animal para expresar y producir de ese modo el anticuerpo humanizado.

Como la CH del anticuerpo humanizado, se puede usar cualquier CH, en tanto que pertenezca a la clase hlg, y se prefieren aquellas de la clase hlgG, y se puede usar una cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase hlgG, tales como hlgG1, hlgG2, hlgG3 Y hlgG4. Como la Cl del anticuerpo humanizado, se puede usar cualquier Cl, en tanto que pertenezca a la clase hlg, y se pueden usar aquellas que pertenezcan a la clase K o a la dase A.

En el anticuerpo humanizado de la presente invención, las CDRs 1 a 3 de VH del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 27 a 29, respectivamente, y las CDRs 1 a 3 de Vl del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 30 a 32, respectivamente.

Además, ejemplos específicos del anticuerpo humanizado de la presente invención incluyen los siguientes anticuerpos humanizados:

con respecto a la secuencia de aminoácidos de VH del anticuerpo, un anticuerpo humanizado en el que VH del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos en la que leu en la posición 18, Val en la posición 93, Ala en la posición 97 y Thr en la posición 114 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77 están sustituidos por otros restos de aminoácidos,

preferentemente, un anticuerpo humanizado en el que VH del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos en la que Val en la posición 93, Ala en la posición 97 y Thr en la posición 114 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77 están sustituidos por otros restos de aminoácidos,

preferentemente, un anticuerpo humanizado en el que VH del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos en la que leu en la posición 18, Ala en la posición 97 y Thr en la posición 114 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77 están sustituidos por otros restos de aminoácidos,

preferentemente, un anticuerpo humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos en la que Ala en la posición 97 y Thr en la posición 114 están sustituidos por otros restos de aminoácidos.

Un ejemplo especifico de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen cuatro modificaciones es una

5 secuencia de aminoácidos en la que en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77 se introducen sustituciones de Leu en la posición 18 por Met, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 114 por lIe.

Un ejemplo específico de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen tres modificaciones es una 10 secuencia de aminoácidos en la que en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77 se introducen sustituciones de Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 114 por lIe.

Un ejemplo especifico de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen dos modificaciones es una secuencia de aminoácidos en la que en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77 se introducen 15 sustituciones de Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 114 por lIe.

Con respecto a VL del anticuerpo, los ejemplos incluyen una secuencia de aminoácidos en la que Ala en la posición 13, Val en la posición 15, Val en la posición 19, Ala en la posición 47, Val en la posición 62, y Leu en la posición 82 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 78 están sustituidos por otros restos de aminoácidos.

20 Un ejemplo especifico de la secuencia de aminoácidos de VL en la que se introducen seis modificaciones es una secuencia de aminoácidos en la que en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 78 se introducen sustituciones de Ala en la posición 13 por Val, Val en la posición 15 por Leu, Val en la posición 19 por Ala, Ala en la posición 47 por Gln, Val en la posición 62 por lIe, y Leu en la posición 82 por Val.

Los anticuerpos humanizados de la presente invención son anticuerpos humanizados en los que VH comprende la secuencia de aminoácidos representada por aquella seleccionada de SEC ID NOs: 77, 96, 98 Y 100, Y VL comprende la secuencia de aminoácidos representada por aquella seleccionada de SEC ID NOs:78 y 102.

30 Además, los anticuerpos humanizados de la presente invención son: un anticuerpo humanizado en el que la cadena H de la región variable comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77 y la cadena L de la región variable comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No: 78; un anticuerpo humanizado en el que VH comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No: 96 y VL comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No: 78; un anticuerpo humanizado en el que VH

35 comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No: 98 y VL comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No: 78; un anticuerpo humanizado en el que VH comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No: 100 y VL comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No:78; un anticuerpo humanizado en el que VH comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No:l00 y VL comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID No:l02.

40 En la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monodonal, se pueden suprimir, sustituir, insertar o añadir uno o más aminoácidos. mientras se retiene actividad similar al anticuerpo.

El número de aminoácidos que se suprime, sustituye, inserta y/o añade es uno o más, y no está limitado

45 especificamente, pero está en el intervalo en el que sea posible la supresión, sustitución o adición por métodos conocidos tales como la mutagénesis dirigida al sitio [Molecular Cloning 21' Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucieic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Nall. Acad. Sei., USA, 79, 6409 (1982),Gene, 34, 315 (1985), Nudeic Acids Research, 13, 4431 (1985), Pro. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)] o similar. Por ejemplo, el número es 1 a docenas, preferentemente

50 1 a 20, más preferentemente 1 a 10, y lo más preferible 1 aS.

La expresión "se suprimen, sustituyen, insertan o añaden uno o más aminoácidos", en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anterior, significa lo siguiente. Es decir, significa que existe una supresión, sustitución, inserción o adición de uno o más aminoácidos en posiciones opcionales en la misma secuencia y una o más secuencias de

55 aminoácidos. También, la supresión, sustitución, inserción o adición puede ocurrir al mismo tiempo, y al aminoácido que se sustituye, inserta o añade puede ser de tipo natural o de tipo no natural. El aminoácido de tipo natu ral induye L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, Lleucina, L-lisina, L-melionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, Lcisteína y similares.

A continuación se muestran ejemplos preferidos de aminoácidos mutuamente sustituibles. Los aminoácidos en el mismo grupo son mutuamente sustituibles.

Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalína, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, 065 metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexilalanina

Grupo B: ácido aspártico, ácido glulámico, ácido ísoaspártico, ácido isoglulámico, ácido 2-aminoadipico, ácido 2-aminosubérico

Grupo C: asparagina, glutamina

Grupo O: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropiónico

Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina

Grupo F: serina, treonina, homoserina

Grupo G: fenilalanina, tirosina

El anticuerpo monoclonal de la presente invención que reconoce especificamente una estructura tridimensional de una región extracelular de CD4 y se une a la región extracelular puede estar unído quimica o genéticamente a un radioisótopo, un agente que tiene un peso molecular bajo, un agente que tiene un peso molecular elevado, una proteína, un anticuerpo terapéutico, o similar.

El conjugado del anticuerpo se puede producir conjugando químicamente un radioisótopo, un agente que tiene un peso molecular bajo, un agente que tiene un peso molecular elevado, una proteina, un anticuerpo terapéutico, o similar, al lado N-terminal o al lado C-terminal de una cadena H o una cadena L del anticuerpo monoclonal, un sustituyente o cadena lateral apropiado del anticuerpo, una cadena de azúcar en el anticuerpo, que reconoce especificamente una estructura tridimensional de una región extracelular de CD4 y se une a la región extracelular [Antibody Engineering Handbook, publicado por Chijin Shokan (1994)].

También, el conjugado del anticuerpo se puede producir genéticamente enlazando AON, que codifica el anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la estructura tridimensional de una región extracelular de CD4 y se une a la región extracelular en la presente invención, a otro AON que codifica una proteina o un anticuerpo terapéutico a conjugar, insertando el AON en un vector para la expresión, e introduciendo el vector de expresión en una célula hospedante apropiada.

Los radioisótopos incluyen 13\ 1251, 9Oy , &4Cu, ~c, 77 Lu, 211 At y similares. El radioisótopo se puede conjugar directamente con el anticuerpo mediante el método de Cloramina-T. También, una sustancia quelante del radioisótopo se puede conjugar con el anticuerpo. El agente quelante incluye ácido 1-isotiocianato bencil-3metildietilen-triaminopentaacético (MX-DTPA) y similar.

El agente que tiene un peso molecular bajo incluye un agente antitumoraltal como un agente alquilante, un agente de nitrosourea, un antagonista del metabolismo, una sustancia antibiótica, un alcaloide derivado de una planta, un inhibidor de topoisomerasa, un agente para hormonoterapia, un antagonista hormonal, un inhibidor de aromatasa, un inhibidor de glicoproteina P, un derivado de complejo de platino, un inhibidor de la fase M y un inhibidor de cinasas [Rinsho Syuyo-gaku (Clinical Oncology), Gan to Kagaguryoho-Sha (1996)]. un agente esteroide tal como hidrocortisona y prednisona, un agente no esteroideo tal como aspirina e indometacina, un agente inmunorregulador tal como aurotiomalato, penicilamina, un agente inmunosupresor tal como ciclofosfamida y azotioprina, un agente antiinflamatorio tal como un agente antihistaminico, por ejemplo maleato de dorieniramina y clemastina [Ensho to Koatensho-Ryoho (Inflammation and Anti-inflammation Therapy), Ishiyaku Shuppann (1982)] y similares. Ejemplos del agente antitumoral incluyen amifostina (Ethyol), cisplatino, dacarbazina (DTIC), dac1inomicina, mecloretamina (mostaza de nitrógeno), estreptozocina, ciclofosfamida, ifosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), epirrubicina, gemcilabina (Gemsal), daunorrubicina, procarbazina, milomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, daunomicina, peplomicina, estramustina, pacJitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotea), aldesleukina, asparaginasa, buSulfano, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, dadribina, camptotecina, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarrubicina, mesna, irinotecán (CPT-11), nogitecán, mitoxantrona, topotecán, leuprolida, megestrol, melfalano, mercaptopurina, hidroxicarbamida, plicamicina, mitotano, pegasparagasa, pentostatina, pipobromano, estreptozocina, tamoxifeno, goserelina, leuprorrelina, flutamida, tenipósido, testolactona, tioguanina, liolepa, mostaza de uracilo, vinorrelbina, clorambucilo, hidrocortisona, prednisolona, metilprednisolona, vindesina, nimustina, semustina, capecitabina, Tomudex, azacitidina, UFT, oxaliplatino, gefitinib (Iressa), imatinib (STI 571 ), elrotinib, inhibidor de tirosina cinasa 3 similar a FMS (Flt3), inhibidor del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) tal como Iressa y Tarceva, radicicol, 17-alilamino-17desmetoxigeldanamicina, rapamicina, amsaCrina, ácido todo-trans-retinoico, talidomida, anastrozol, fadrozol, letrozol, exemestano, tiomalato de oro, D-penicilamina, bucilamina, azatioprina, mizorribina, cidosporina, rapamicina, hidrocortisona, bexaroteno (Targretin), tamoxifeno, dexametasona, sustancias progestágenas, sustancias estrogénicas, anastrozol (Arimidex), Leuplin, aspirina, indometacina, celecoxib, azatioprina, penicilamina, tiomalato de oro, maleato de clorieniramina, dorieniramina, clemastina, tretinoína, bexaroteno, arsénico, voltezomib, alopurinol, caliqueamicina, ibritumomab tiuxetano, Targretin, ozogamina, claritromicina, leucovorina, ifosfamida, ketoconazol, aminoglutetimida, suramina, metotrexato, maitansinoide y sus derivados.

El método para conjugar el agente que tiene un peso molecular bajo con el anticuerpo incluye un método en el que el agente y un grupo amino del anticuerpo se conjugan a traves de glutaraldehldo, un método en el que un grupo amino del agente y un grupo carboxilo del anticuerpo se conjugan a traves de carbodiimida soluble en agua, y similar.

El agente que presenta un peso molecular elevado incluye polietilenglicol (en adelante denominado ·PEG"), albumina, dextrano, polioxietileno, copolimero de estireno-ácido maleico, polivinilpirrolidona, copolimero de pirano, hidroxipropilmelacrilamida, y similar. Al unir estos compuestos que tienen un peso molecular elevado a un anticuerpo, se esperan los siguientes efectos: (1) mejora de la estabilidad frente a diversos factores quimicos, fisioos

o biológicos, (2) prolongación notable de la semivida en sangre, (3) desaparición de la inmunogenicidad, supresión de la producción de anticuerpos, y similares [Bioconjugate Orug, Hirokawa Shoten (1993)]. Por ejemplo, el método para unir PEG a un anticuerpo inCluye un método en el que se permite que un anticuerpo reaccione con un reactivo modificador de PEG [Bioconjugate Orug, Hirokawa Shoten (1993)]. El reactivo modificador de PEG incluye un agente modificador del grupo €-amino de lisina (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar nO 178926f86), un agente modificador de un grupo carboxilo de ácido aspártico y ácido glutámico (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar nO 23587f81), un agente modificador de un grupo guanidino de arginina (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar nO 117920/90) y similar.

El inmunoestimulador puede ser cualquier producto natural conocido como inmunoadyuvantes. los ejemplos de un agente que potencia el inmunógeno incluyen ~(1-->3)glucano (Ientinano, esquizofilano), «-galactosilceramida, y similar.

la proteina incluye una citocina o un factor de crecimiento que activa una célula inmunocompetente, tal como célula NK, maCfófago o neutrófilO, y una proteina tóxica, y similar.

los ejemplos de la citocina o del factor de crecimiento incluyen interferón (en adelante denominado "INF"}-«, INF-~, INF-y, interleucina (en adelante denominada "ll")-2, Il-12, Il-15, Il-18, Il-21 , Il-23, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y maCfófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de maCfófagos (M-CSF), y similar. la proteína tóxica incluye ricina, toxina de la difteria, ONTAK, y similar, y también incluye una proteina tóxica en la que se introduce una mutación en una proteína a fin de controlar la toxicidad.

El anticuerpo terapéutico incluye un anticuerpo contra un antígeno en el que se induce apoptosis mediante la unión del anticuerpo, un anticuerpo contra un antigeno que participa en la información del estado patológico del tumor, un anticuerpo que regula la función inmunitaria, y un anticuerpo relacionado con la angiogénesis en la parte patológica.

El antigeno en el que se induce apoptosis mediante la unión del anticuerpo incluye el cumulo de diferenciación (en adelante en la presente memoria "CO") 19, C020, CD2l, CD22, CD23, C024, CD37, C053, CD72, C073, CD74, COw75, CDw76, C077, CDw78, C079a, Co79b, CD80 (B7.1), CD8l, CD82, C083, CDw84, C08S, C086 (B7.2), antigeno leucocitario humano (HLA)-Clase 11, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y similar.

El antigeno para el anticuerpo que regula la función inmunológica incluye C040, ligando de CD40 , molécula de la familia de B7 (CoBO, CoBS, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, 87-H4), ligando de la molécula de la familia de 87 (CD28, CTLA-4, ICOS, PO-l, BTLA), OX-40, ligando de OX-40, CD137, molécula de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (oR4, oR5, TNFR1, TNFR2), molécula de la familia de receptores del ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF TRAll fam ilia de receptores de la molécula de la familia de TRAll (TRAll-R1, TRAll-R2, TRAl l-R3, TRAll-R4), activador del receptor del ligando del factor nuclear kappa 8 (RANK), ligando de RANK, C025, receptor 4 de ácido fólico, citocina [Il-l«, Il-l~, Il-4, Il-5, Il-6, Il-l0, Il-13, factor de crecimiento transformante (TGF)~, TNF«, etc.], receptores de estas citocinas, quimiocina (SlC, ElC, 1-309, TARC, MoC, CTACK, etc.) y receptores de estas quimiocinas.

El antigeno para el anticuerpo que inhibe la angiogénesis en la parte patológica incluye factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), EGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF), eritropoyetina (EPO), TGF~, Il-B, efilina, SoF-1, sus receptores, y similares.

Un anticuerpo de fusión con una proteina o anticuerpo terapéutico se puede producir enlazando un ADNc que codifica un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo a un AoNc que codifica la proteína, construyendo el AON que codifica el anticuerpo de fusión, insertando el AON en un vector de expresión para procariota o eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el anticuerpo de fusión.

En el caso en el que se use el conjugado del anticuerpo anterior para un método de detección, un método para la determinación cuantitativa, un reactivo de detección, un reactivo para la determinación cuantitativa o un agente de diagnóstico en la presente invención, los ejemplos del agente al que está unido un anticuerpo monoclonal de la

presente invención que reconoce especificamente una región extracelular de CD4 y se une a la región extracelular incluye un marcador usado en un método habitual de detección o medida inmunitario. El marcador incluye enzimas tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa y luciferasa, materiales luminiscentes tales como éster de acridinio y lofina, materiales fluorescentes tales como isotiocianato de fluoresceina (FITC) e isotiocianato de tetramelilrodamina (RllC), Y similares.

Además, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal de la invención en la fabricación de un agente terapéutico para una enfermedad relacionada con una célula positiva para CD4, agente el cual comprende como principio activo un anticuerpo monoclonal que reconoce especificamente una región extracelular de CD4 y también se une a la región extracelular.

La enfermedad asociada a una célula positiva para CD4 puede ser cualquier enfermedad en tanto que sea un cáncer relacionado con una célula que expresa CD4.

Los ejemplos de una célula positiva para CD4 incluyen una célula T positiva para CD4 tal como una célula Th1, célula Th2, o célula Th17, una célula T reguladora (también denominada ~célula T reguladora"), una célula yoT, y similar. Además, un ejemplo de una célula positiva para CD4 que está relacionada con una enfermedad es un célula cancerosa que se basa en el hecho de que CD4 es expresada en una célula anormal responsable de tal enfermedad.

El cáncer incluye cáncer de la sangre, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de tiroide, cáncer de cuello uterino, cáncer de intestino delgado, cancer de próstata y cáncer pancreático. Los ejemplos preferidos del cáncer incluyen cáncer de la sangre, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer hepático y cáncer de próstata. Los ejemplos de cáncer de la sangre incluyen linfoma cutáneo de células T (CTCL), linfoma periférico de células T (PTCL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), otra leucemia linfoide, leucemia mieloide, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin.

El agente terapéutico en la presente invención es un agente terapéutico que comprende como principio activo el anticuerpo monoclonal anterior de la presente invención.

El agente terapéutico que comprende el anticuerpo de la presente invención, o un conjugado del mismo, puede comprender solamente el anticuerpo, o conjugado del mismo, como principio activo. Generalmente se prefiere que el agente terapéutico se prepare como una preparación farmacéutica producida mediante un método apropiado bien conocido en el campo técnico de la farmacia, y mezclándolo con uno o más vehiculos farmacéuticamente aceptables.

Se prefiere administrar el agente terapéutico mediante la via que sea más eficaz para el tratamiento. Los ejemplos incluyen la administración oral y administración parenteral, tal como la administración bucal, traqueal, rectal, subcutánea, intramuscular o intravenosa, y se prefiere la administración intravenosa.

El agente terapéutico puede estar en forma de pulverización, cápsulas, comprimidos, gránulos, polvo, jarabe, emulsión, supositorio, inyección, ungüento, cinta, y similar.

Aunque la dosis o la frecuencia de administración varia dependiendo del efecto terapéutico objetivo, del método de administración, del periodo de tratamiento, de la edad, del peso corporal y similar, habitualmente es 10 I1gfkg a 10 mgfkg por día y por adulto.

Además, la presente invención se refiere a un anticuerpo de la invención para uso en un método para detectar inmunológicamente o medir CD4 in vivo, O diagnosticar cáncer pOSitivo para CD4 in VNO .

Como método para la detección o determinación de la cantidad de CD4 en la presente invención, se puede incluir cualquier método conocido. Por ejemplo, se puede ejemplificar un método de detección o medida inmunitario.

Un método de detección o medida inmunitario es un método en el que se detecta o determina una cantidad de anticuerpo o una cantidad de antigeno usando un antígeno o anticuerpo marcado. Los ejemplos del método de detección o medida inmunitario son método de inmunoanticuerpo marcado con sustancia radiactiva (RIA), inmunoensayo enzimático (EIA o ELlSA), inmunoensayo fluorescente (F1A), inmunoensayo luminiscente, método de transferencia Western, medios físico-quimicos, y similares.

El cáncer anterior relacionado con CD4 se puede diagnosticar detectando o midiendo una célula que expresa CD4 usando el anticuerpo monoclonal de la presente invención.

Para la detección de la célula que expresa CD4, se pueden usar métodos de detección inmunológica conocidos, y se usa preferentemente un método de inmunoprecipitaci6n, un método de tinción celular fluorescente, un método de tinción tisular inmune, y similar. Además, se puede usar un método de tinción con anticuerpo fluorescente que usa el

sistema FMAT 8100 HTS (Applied Biosystem) y similar.

En la presente invención, la muestra de organismo vivo a usar para delectar o medir CD4 no está particularmente limitada, en tanto que tenga la posibilidad de contener el polipéptido, tal como células tisulares, sangre, plasma sanguineo, suero, fluido pancreático, orina, materia fecal, fluido tisular o fluido de cultivo.

El agente de diagnóstico que contiene el anticuerpo monoclonal o su conjugado puede contener además un reactivo para llevar a cabo una reacción de antigeno-anticuerpo, o un reactivo para la detección de la reacción , dependiendo del método de diagnóstico deseado. El reactivo para llevar a cabo la reacción de antígeno-anticuerpo incluye un amortiguador, una sal, y similar. La reacción para la detección incluye un reactivo usado generalmente para el método de detección o medida inmunológico, tal como anticuerpo secundario marcado que reconoce al anticuerpo monoclonal, o conjugado del mismo, y sustrato correspondiente al marcado.

Se describe a continuación especificamente un procedimiento para producir el anticuerpo de la presente invención, un método para tratar la enfermedad y un método para diagnosticar la enfermedad,

1. Método de preparación de anticuerpo monoclonal

(1) Preparación de antigeno

El C04 o una célula que expresa C04 como antigeno se puede obtener introduciendo un vector de expresión que comprende AONc que cod ifica una longitud completa de C04 o una longitud parcial de la misma en Escherichia coli, levadura, una célula de insecto, una célula de animal, o similar. Además, C04 se puede purificar de diversas estirpes celulares de tumor humano, tejido humano que expresa una gran cantidad de CD4. Se puede permitir el uso de la estirpe celular de tumor y el tejido como antigenos. Además, un péptido sintético que tiene una secuencia parcial de la CD4 se puede preparar mediante un métooo de sintesis quimica tal como método de Fmoc o métooo de tBoc, y se puede usar como un antígeno.

El C04 usado en la presente invención se puede producir, por ejemplo, expresando un AON que codifica C04 en una célula hospedante usando un método descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (19871997), o similares, según el siguiente método.

En primer lugar, un vector recombinante se prepara insertando un ADNc de longitud completa que comprende la región codificante de CD4 en dirección 3' de un promotor de un vector de expresión apropiado. En este momento, si es necesario, se puede usar un fragmento de ADN que tiene una longitud apropiada que contiene una región que codifica el polipéptido basado en el AONc de longitud completa , y se puede usar el fragmento de ADN en lugar del AONc de longitud completa anterior. A continuación, se puede obtener un transformante que produce CD4 introduciendo el vector recombinante en una célula hospedante adecuada para el vector de expresión.

El vector de expresión incluye vectores que se pueden replicar de forma autónoma en la célula hospedante a usar, o vectores que se pueden integrar en un cromosoma que comprende un promotor apropiado en una posición tal que se puede transcribir el AON que codifica el polipéplido.

La célula hospedante puede ser una cualquiera, en tanto que pueda expresar el gen objetivo. Los ejemplos incluyen un microorganismo que pertenece a los géneros Escherichia, tal como Escherichia coli, levadura, una célula de insecto, una célula de animal, y similar.

Cuando se usa un procariota tal como Escherichia coli como la célula hospedante, se prefiere que el vector recombinante usado en la presente invención sea replicable de forma autónoma en el procariota, y comprende un promotor, una secuencia de unión al ribosoma, el ADN que comprende la porción que codifica CD4, y una secuencia de terminación de la transcripción. No es necesario que el vector recombinante tenga una secuencia de terminación de la transcripción, pero preferentemente se coloca una secuencia de terminación de la transcripción justo debajo del gen estructural. El vector recombinante puede comprender además un gen que regula el promotor.

También, el vector recombinante anterior es preferentemente un plásmido en el que el espacio entre la secuencia de Shine-Dalgarno (también denominada como secuencia SO), que es la secuencia de unión al ribosoma, y el codón de iniciación se ajusta a una distancia apropiada (por ejemplo, 6 a 18 nucleótidos).

Además, la secuencia nueleotidica del AON que codifica CD4 se puede sustituir por otra base para que sea un codón adecuado para la expresión en una célula hospedante, mejorando de ese modo la productividad de la CD4 objetivo.

Se puede usar cualquier vector de expresión, en tanto que pueda funcionar en la célula hospedante que se va a utilizar. Los ejemplos del vector de expresión incluyen pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (todos fabricados por Rache Diagnostics), pKK233-2 (fabricado por Pharmacia), pSE280 (fabricado por Invitrogen), pGEMEX-1 (fabricado por

Promega), pQE-8 (fabricado por QIAGEN), pKYP10 (Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 110600f83), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)J, pLSAI [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)J, pGELJ [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript 11 SK(-) (fabricado por Stratagene), pTrs30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109fpTrS30 (FERM BP-5407)], pTrs32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109fpTrS32 (FERM BP-5408)], pGHA2 [preparado a partir de Escherichia col; IGHA2 (FERM BP-400), Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 221091f85], pGKA2 [preparado a partir de Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 221091/85], pTenn2 (documentos US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUBll0, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (fabricado por Pharmacia), el sistema pET (fabricado por Novagen), pME18SFL3, y similares.

Se puede usar cualquier promotor, en tanto que pueda funcionar en la célula hospedante que se va a utilizar. Los ejemplos incluyen promotores derivados de Escherichia coli, fago, y similar, tal como el promotor trp (Ptrp), promotor lac, promotor PL, promotor PR y promotor TI. También, se pueden usar promotores diseñados y modificados artificialmente, tales como un promotor en el que dos Prtp se enlazan en tándem, promotor tac, promotor lacT7 y promotor le1l .

Los ejemplos de la célula hospedante induyen Escherichia coli XL l-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1 , Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB10l, Escherichia coli nO 49, Escherichia coli W311 0, Escherichia coli NY49, Escherichia coli DH5a, y similares.

Se puede usar cualquier método de introducción del vector recombinante, en tanto que sea un método para introducir AON en la célula hospedante, y los ejemplos incluyen un método que usa un ion de calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), métodos descritos en Gene, 17, 107 (1982) Y Molecular & General Genetics, 168,

111(1979»)

Cuando se usa una célula de animal como la célula hospedante, se puede usar un vector de expresión, en tanto que pueda funcionar en la célula de animal. l os ejemplOS inCluyen pcDNAI, pcDM8 (fabricada por Funakoshi), pAGE107 [Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 22979/91; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar n° 227075190), pCDM8 [Nature, 329, 840,(1987)], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen), pcONA3.1 (fabricado por Invilrogen), pREP4 (fabricado por Invilrogen), pAGEl 03 [J . Biochemistry, 101 , 1307 (1987)], pAGE21Q, pME18SFL3, pKANTEX93 (documento WO 97/10354) y similares.

Se puede usar cualquier promotor, en tanto que pueda funcionar en una célula de animal. Los ejemplos incluyen un promotor del gen temprano inmediato (lE) de citomegalovirus (CMV), el promotor temprano de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de metalotioneina, un promotor de choque ténniCO, promotor de SRa, promotor o potenciador del virus de la leucemia murina de Molony, y similar. También, el potenciador del gen lE de CMV humano se puede usar junto con el promotor.

Los ejemplos de la célula hospedante incluyen la célula Namalwa de célula de leucemia humana, la célula COS de mono, la célula CHO de célula de ovario de hámster chino (Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Apéndice 1, 11 (p. 883-900)), CHO/DG44, CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUkXB11 (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Lite Technologies, n° de Catálogo 11619), la célula Pro-3, YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de mieloma de rata (también conocida como YB2/0), la célula de mieloma de ratón NSO, la célula de mieloma de ratón SP2f0-AgI4, la célula de hámster sirio BHK o HBT5637 (Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 000299/88) y similares.

Se puede usar cualquier método de introducción del vector recombinante, en tanto que sea un método para introducir ADN en una célula de animal, y los ejemplos incluyen electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990»), el método de fosfato de calcio (Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 227075190), el método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], Y similares.

El CD4 se puede producir cultivando el transforrnante derivado de un microorganismo, de una célula de animal, o similar que tiene un vector recombinante que comprende el ADN que codifica CD4 en un medio para fonnar y acumular CD4 en el cultivo, y recuperándolo del cultivo. El método para cultivar el transformante en el medio se lleva a cabo según el método habitual usado en el cultivo de hospedantes.

Cuando CD4 se expresa en una célula derivada de eucariota, se puede obtener CD4 a la que se unen azúcares o cadenas de azúcar.

Cuando se cultiva un microorganismo transfonnado con un vector recombinante que contiene un promotor inducible, se puede añadir al medio un inductor, si es necesario. Por ejemplo, se puede añadir al medio isopropil-¡3-Dtiogalactopiranósido o similar cuando se cultiva un microorganismo transfonnado con un vector recombinante que

usa el promotor lae; o se le puede añadir ácido indolacrilico o similar cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector recombinante que usa el promotor trp.

Cuando se cultiva un transfonnante obtenido usando como célula hospedante una célula de animal, el medio induye medio RPMI 1640 usado generalmente [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], medio MEM de Eagle [Science, 122, 501 (1952)], medio MEM modificado de Dulbecco {Virology, 8, 396 (1959)] Y medio 199 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), los medios a los que se añade suero fetal de ternera, etc., y similar. El cultivo se lleva a cabo generalmente a un pH de 6 a 8 y a 30 a 4QOC durante 1 a 7 dias en presencia de 5% de COz. Si es necesario, se puede añadir al medio un antibiótico, tal como kanamicina o penicilina, durante el cultivo.

Con respecto al método de expresión del gen que codifica CD4, además de la expresión directa, se puede llevar a cabo la producción secretora, la expresión de proteínas de fusión, y similar, según el método descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

El procedimiento para producir CD4 incluye un método de expresión intracelular en una célula hospedante, un método de secreción extracelular a partir de una célula hospedante, un método de producción en una cubierta exterior de la membrana de la célula hospedante, etc. El método apropiado se puede seleccionar cambiando la célula hospedante usada y la estructura de la CD4 producida.

Cuando el CD4 se produce en una célula hospedante o en una cubierta exterior de la membrana de la célula hospedante, CD4 se puede segregar de fonna positiva extracelularmente según el método de Paulson et al. (J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], el método de Lowe et al.lProc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], los métodos descritos en la Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar n° 336963f93 y el documento WO 94/23021, y similar.

También, la cantidad de producción de CD4 se puede incrementar según el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 227075190, que utiliza un sistema de amplificación génico que usa un gen de dihidrofolato reductasa.

El CD4 resultante se puede aislar y purificar, por ejemplo, como sigue.

Cuando CD4 se expresa intracelulannente en un estado disuelto, las células después del cultivo se recuperan mediante centrifugación, se suspenden en un amortiguador acuoso, y entonces se rompen usando un ultrasonicador, una prensa francesa, un homogeneizador Manton Gaulin, un molino de bolas dynomill, o similar, para obtener un extracto libre de células. El extracto libre de células se centrifuga para obtener un sobrenadante, y se puede obtener una preparación purificada sometiendo el sobrenadante a técnicas generales de aislamiento y purificación de enzimas tales como extracción con disolvente; precipitación salina con sulfato de amonio, etc.; desalado; precipitación con un disolvente orgánico; cromatografia de intercambio aniónico que usa una resina tal como dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa, DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi Chemical); cromatografía de intercambio catiónico que usa una resina tal como S-sefarosa FF (fabricada por Pharmacia); cromatografía hidrófoba que usa una resina tal como butil-Sefarosa o fenil-Sefarosa: filtración en gel usando un tamiz molecular; cromatografía de afinidad; cromatoenfoque; electroforesis tal como enfoque isoeléctrico; y similares, que se pueden usar solas o en combinación.

Cuando CD4 se expresa intracelularmente al fonnar un cuerpo de inclusión, las células se recuperan, se rompen y se centrifugan de la misma manera, y el cuerpo de inclusión de CD4 se recupera como una fracción de precipitación. El cuerpo de inclusión recuperado de la proteína se solubi liza con un agente desnaturalizante de la proteína. La proteina se obtiene en una estructura tridimensional normal diluyendo o dializando la disolución solubilizada, y entonces se obtiene una preparación purificada de CD4 mediante el mismo método de purificación y aislamiento como antes.

Cuando CD4 o el derivado tal como un producto glicosilado se segrega extracelularmente, CD4 o el derivado, tal como un producto glicosilado, se puede recuperar del sobrenadante de cultivo. Esto es, el cultivo se trata mediante un método, tal como centrifugación, de la misma manera que antes, para obtener un sobrenadante de cultivo, y se puede obtener una preparación purificada de CD4 a partir del sobrenadante de cultivo mediante el mismo método de aislamiento y purificación como antes.

También, el CD4 utilizado en la presente invención se puede producir mediante un método de sintesis quimica, tal como el método de Fmoc o método de tBoc. También, se puede sintetizar quimicamente usando un sintetizador de péptidos fabricado por Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Phannacia, Protein Technology Instrument, SynthecellVega, PerSeptive, Shimadzu Corporation, o similar.

(2) Inmunización de animal y preparación de célula productora de anticuerpo para la fusión

Se inmuniza un ratón, rata o hámster de 3 a 20 semanas con el antigeno preparado en el (1) anterior, y las células

productoras de anticuerpo se recogen del bazo, ganglio linfático o sangre periférica del animal. También, cuando se reconoce el incremento de un titulo suficiente en el animal anterior debido a una baja inmunogenicidad, se puede usar un ratón genosuprimido para CD4 como animal a inmunizar.

La inmunización se lleva a cabo administrando el antigeno al animal a través de inyección subcutánea, intravenosa o intraperitoneal junto con un adyuvante apropiado (por ejemplo, adyuvante completo de Freund, combinación de gel de hidróxido de aluminio con vacuna contra la tosferina, o similar). Cuando el antígeno es un péptido parcial, se produce un conjugado con una proteína portadora tal como BSA (seroalbúmina bovina), KLH (hemocianina de lapa californiana), o similar, que se usa como el antígeno.

La administración del antigeno se lleva a cabo 5 a 10 veces cada semana o cada dos semanas después de la primera administración. En el 3er a 7° día después de cada administración, se recoge una muestra de sangre del fondo del ojo, se evalúa la reactividad del suero con el antigeno, por ejemplo mediante inmunoensayo enzimático [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. o similar. Un animal que muestra un título suficiente de anticuerpo en sus sueros frente al antígeno usado para la inmunización se usa como la fuente de suministro de células productoras de anticuerpo para la fusión.

Tres a siete dias después de la administración final del antígeno, el tejido que contiene las células productoras de anticuerpo, tales como el bazo, del animal inmunizado se corta para recoger las células productoras de anticuerpo. Cuando se usan células del bazo, el bazo se corta y se ablanda, seguido de la centrifugación. Después, las células productoras de anticuerpo para la fusión se obtienen eliminando los eritrocitos.

(3) Preparación de célula de mieloma

Como células de mieloma, se usa una estirpe celular establecida obtenida de ratón. Los ejemplos incluyen la estirpe celular de mieloma de ratón (derivada de BALB/c) resistente a 8-azaguanina P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Mierobiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NS1 /1-Ag41 (NS-1) [European J Immunology, 6. 511 (1976)], SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276. 269 (1978)]. P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology, 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] Y similar.

Las células de mieloma se subcultivan en un medio nonnal [un medio en el que se añaden glutamina, 2mercaptoetanol, gentamicina, FBS y 8-azaguanina al medio RPMI1640] y se subculiivan en el medio nonnal 3 o 4 dias antes de la fusión celular para asegurar el número de células de 2 x 107 o más en el dia para la fusión.

(4) Fusión celular y preparación de hibridoma para producir anticuerpo mOllOclonal

Las células productoras de anticuerpo para la fusión obtenidas de (2) anterior y las células de mieloma obtenidas de

(3): anterior se lavan suficientemente con un medio esencial mínimo (MEM) o PBS (1,83 g de hidrogenofosfato disódico, 0,21 g de dihidrogenofosfato potásico. 7,65 g de cloruro de sodio, 1 litro de agua destilada, pH 7,2) Y se mezclan para dar una relación de las células productoras de anticuerpo:las células de mieloma = 5 a 10:1. seguida de la centrifugación, y después se descarta el sobrenadante. Después de que el grupo celular precipitado está suficientemente suelto. se añade la mezcla de polietilenglicol-1000 (PEG-1000). MEM y dimetilsulfóxido a la célula. con agitación a 3J<'C. Además, se añade 1 a 2 mi de medio MEM varias veces cada uno o dos minutos, y se añade MEM para dar una cantidad total de 50 mI. Después de la centrifugación. el sobrenadante se descarta. Después de que las células se disgregan suavemente, las células se suspenden suavemente en medio HAT [un medio en el que se añade hipoxantina, ümidina y aminopterina al medio nonnal]. La suspensión se cultiva en una incubadora con 5% de C02 durante 7 a 14 días a 37°C.

Después del cultivo, se muestrea una porción del sobrenadante del cultivo, y se selecciona un hibridoma que es reactivo contra un antigeno que contiene CD4 y que no es reactivo contra un antígeno que no contiene CD4, mediante ensayo de unión como se describe a continuación. Entonces, se lleva a cabo la clonación dos veces mediante el método de dilución limitante [en primer lugar, se usa medio HT (medio HAT del que se elimina la aminopterina), y en segundo lugar, se usa el medio normal], y se selecciona como el hibridoma productor de anticuerpo monodonal un hibridoma que muestra un titulo establemente elevado de anticuerpo.

(5): Preparación de anticuerpo monoclonal purificado

Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal obtenidas mediante el (4) anterior se administran por inyección intraperitoneal en ratones o ratones atimicos de 8 a 10 semanas tratados con 0,5 mi de pristano (se administra intraperitonealmente 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano), seguidO de la alimentación durante 2 semanas). El hibridoma desarrolla tumor ascítico en 10 a 21 dias. El fluido ascítico se recoge de los ratones, se centrifuga para eliminar los sólidos, se somete a precipitación salina con sulfato de amonio al 40 a 50%, y entonces se precipita mediante ácido caprílico, se hace pasar a través de una columna de DEAE-Sefarosa, una columna de proteina A o una columna de filtración en gel para recoger una fracción de IgG o IgM como un anticuerpo monoclonal purificado.

Además, un hibridoma productor de anticuerpo monoclonal obtenido mediante (4) anterior se cultiva en medio RPMI1640 que contiene FBS o similar, y el sobrenadante se elimina por filtración. Las células precipitadas se suspenden en medio SFM de hibridoma que contiene 5% de DIGO GF21, Y se cultivan durante 3 a 7 dias. El anticuerpo monodonal purificado se puede obtener centrifugando la suspensión celular obtenida, seguido de la purificación del sobrenadante resultante con una columna de Proteina A o una columna de Proteina G para recoger las fracciones de IgG.

La subclase del anticuerpo se puede determinar usando un kit de tipado de la subclase mediante inmunoensayo enzimático. La cantidad de la proteina se puede determinar mediante el método de Lowry, o a partir de la absorbancia a 280 nm.

(6) Selección de anticuerpo monoclonal

La selección del anticuerpo monoclonal se lleva a cabo mediante el siguiente ensayo de unión usando un método de inmunoensayo enzimático y análisis cinético con Siacore.

<6-a) Ensayo de unión

Como el antígeno, se usa una célula a la que se le ha introducido un gen o se usa una proteina recombinante obtenida introduciendo un vector de expresión que contiene un ADNc que codifica CD4 obtenido en (1) en Escherichia cOli, levadura, una célula de insecto, una célula de animal, o similar, o se usa un polipéptido purificado o un péptido parcial obtenido de un tejido humano. Cuando el antígeno es un péptido parcial, se prepara y se usa un conjugada con una proteina portadora tal como BSA O KLH.

Después de obtener estos antigenos en una capa sólida al dispensarlos en una placa de 96 pocillos, se dispensa en ella como anticuerpo primario una sustancia a ensayar, tal como suero, un sobrenadante de cultivo de un hibridoma

o un anticuerpo monodonal purificado, y se deja reaccionar. Tras el lavado a conciencia con PBS o PBS-Tween, se dispersa en ella como anticuerpo secundario un anticuerpo anti-inmunoglobulina marcado con biotina, una enzima, un material quimioluminiscente, un compuesto de radiación, o similar, y se deja reaccionar. Tras el lavado a conciencia con PBS-Tween, la reacción se lleva a cabo en respuesta al marcador del anticuerpo secundario para seleccionar un anticuerpo monoclonal que reacciona especificamente con el antígeno.

(6-b) Análisis cinético con Biacore

la cinética entre un antigeno y una sustancia de ensayo se mide usando Siacore T100, y entonces los resultados obtenidos se analizan usando software de análisis que acompaña al aparato. Después de que anticuerpo de ratón anti-lgG se inmoviliza sobre una matriz sensora CM 5 mediante un método de acoplamiento de ami na, se deja pasar una sustancia de ensayo tal como un sobrenadante de cultivo de un hibridoma, un anticuerpo purificado, se deja unir en una cantidad apropiada, y posteriormente se deja pasar un antigeno a varias concentraciones conocidas, seguido de la medida de la unión y disociación. Usando los datos obtenidos y el software que acompaña el aparato, se lleva a cabo el análisis cinético usando el modelo de unión 1: 1 para obtener los parámetros necesarios. De otro modo, después de que CD4 humana se inmovi liza sobre la matriz sensora mediante un método de acoplamiento de amino, se deja pasar un anticuerpo monoclonal purificado a varias concentraciones conocidas seguido de la medida de la unión y de la disociación. Usando los datos obtenidos y el software que acompaña el aparato, se lleva a cabo el análisis cinético usando el modelo de analito bivalente para obtener los parámetros necesarios.

2. Preparación de anticuerpo recombinante

Como ejemplos de producción de anticuerpos recombinantes, a continuación se muestran procedimientos para producir un anticuerpo hibrido humano y un anticuerpo humanizado.

(1) Construcción de vector para la expresión de anticuerpo recombinante

Un vector para la expresión de anticuerpo recombinante es un vector de expresión para célula de animal en el que se han insertado ADN que codifican CH y Cl de un anticuerpo humano, y se construye clonando cada uno de los ADN que codifican CH y Cl de un anticuerpo humano en un vector de expresión para la célula de animal.

la región C de un anticuerpo humano puede ser CH y el de cualquier anticuerpo humano. los ejemplos incluyen CH que pertenece a la subclase y1 , Cl que pertenece a la clase 1(, y similar. Como los ADN que codifican CH y Cl de un anticuerpo humano, generalmente se puede usar el ADNc, y también se puede usar un ADN cromosómico que comprende un exón y un intrón. Como el vector de expresión para la célula de animal, se puede usar cualquier vector de expresión, en tanto que se le pueda insertar en él y se pueda expresar en él un gen que codifica la región C de un anticuerpo humano. los ejemplos incluyen pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103 [J . Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981 )], pSG1 bd24 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)], pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)], y similares. los ejemplos de un promotor y potenciador usados para un vector de expresión para célula de animal induyen un promotor temprano de

SV40 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], una LTR del virus de la leucemia de ratón de Moloney [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], un promotor [Cell, 41, 479 (1985)] Y un potenciador [Cell, 33, 717 (1983)] de la cadena H de inmunoglobulina, y similar.

El vector para la expresión de anticuerpo recombinante puede ser de un tipo en el que un gen que codifica una cadena H del anticuerpo y un gen que codifica una cadena L del anticuerpo existen en vectores distintos, o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo de tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector para la expresión de anticuerpo recombinante, la facilidad de introducción en células de animal, y el balance entre las cantidades de expresión de las cadenas H y L del anticuerpo en células de animal, es más preferido un tipo de tándem del vector para la expresión de anticuerpo recombinante [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]. Los ejemplos del tipo de tándem del vector para la expresión de anticuerpo recombinante incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)], Ysimilar.

(2) Obtención de AONc que codifica la región V de anticuerpo derivada de animal no humano y análisis de la secuencia de aminoácidos

La obtención de los AONc que codifican VH y VL de un anticuerpo de animal no humano y el análisis de la secuencia de aminoácidos se llevan a cabo como sigue.

Se extrae ARNm de células de hibridoma que producen un anticuerpo derivado de un animal no humano para sintetizar AONc. El AONc sintetizado se clona en un vector, tal como un fago o un plásmido, para preparar una genoteca de AONc. Cada uno de un fago recombinante o plásmido recombinante que contiene AONc que codifica VH o VL se aisla de la genoteca usando como sonda AON que codifica una parte de la región C O región V de un anticuerpo de ratón. Se determina la longitud completa de las secuencias nucleotídicas de VH y VL de un anticuerpo de ratón derivado de un animal no humano de interés en el fago recombinante o plásmido recombinante, y se deduce la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL a partir de las secuencias nucleotidicas, respectivamente.

Los ejemplos del animal no humano para preparar una célula del hibridoma que produce un anticuerpo no humano incluyen ratón, rata, hámster, conejo, o similar. Se puede usar cualesquiera animales en tanto que se pueda producir a partir de ellos una célula de hibridoma.

Los ejemplos del método para preparar ARN total a partir de una célula de hibridoma incluyen un método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymol., 154,3 (1987)], el uso de un kit tal como el kit RNA easy (fabricado por Oiagen) , y similar.

Los ejemplos del método para preparar ARNm a partir de ARN total incluyen un método de columna de celulosa con oligo (dT) inmovilizado [Molecular Cloning, A laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor laboratory Press (1989)], un método que usa un kit de purificación de ARNm tal como Oligo-dT30 <Super> (fabricado por Takara Bio), y similar. También, ejemplos de un kit para preparar ARNm a partir de una célula de hibridoma incluyen el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia). y similar.

Los ejemplos del método para sintetizar AONc y preparar una genoteca de AONc incluyen métodos conocidos [Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbar Lab. Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 1, John Wiley & Sons (1987-1997)]; un método que usa un kit tal como el Sistema Plasmidico Super Script para la Sintesis de AONc y Clonación de Plásmidos (fabricado por GIBCO BRl), el kit ZAP-cONA (fabricado por Stratagene), elc.; y similar.

El vector en el que el AONc sintetizado, que usa como molde ARNm extraído de una célula de hibridoma, se inserta para preparar una genoteca de AONc puede ser cualquier vector, en tanto que se pueda insertar el AONc. Los ejemplos incluyen ZAP Express [Slrategies, 5, 58 (1992)]. pBluescript 11 SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]. Azapll (fabricado por Stratagene), Agtl0 y Agtl1 [ONA Cloning: A Practical Approach, 1, 49 (1985)], Lambda BlueMid (fabricado por Clontech), AExCell y pT7T3 18U (fabricado por Pharmacia), pc02 ¡Mol. Cell. Bici., 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)], Y similar.

Se puede usar cualquier Escherichia coli para introducir la genoteca de AONc construida mediante un vector fágico o plasmidico, en tanto que se pueda introducir, expresar y mantener la genoteca de ADNc. Los ejemplos incluyen XL 1Blue MRF' ¡Strategies, 5, 81 (1992)]. C600 ¡Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088 e Y1090 [Science, 222: 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], JM105 [Gene, 38, 275 (1985)], Y similar.

Para seleccionar clones de AONc que codifican VH y Vl de un anticuerpo no humano o similar a partir de la genoteca de AONc, se puede usar un método de hibridación en colonias o un método de hibridación en placa usando una sonda marcada isotópica o fluorescentemente (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].

También, los ADNc que codifican VH y VL se pueden preparar a través de reacción en cadena de la polimerasa (en adelante denominada "PCR"; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 1, John Wiley & Sons (1987-1997) al preparar cebadores y usar como molde ADNc preparado a partir de ARNm o una genoteca de ADNc.

La secuencia nucleotídica del ADNc se puede determinar digiriendo el ADNc seleccionado con enzimas de restricción apropiadas y similares, clonando los fragmentos en un plásmido tal como SK(-) (fabricado por Stratagene), llevando a cabo la reacción mediante un método de análisis nudeotídico usado habitualmente. Por ejemplo, un análisis nucleolidico se lleva a cabo usando un analizador de secuencias nucleolidicas automático, tal como ABI PRISM3700 (fabricado por PE Biosystems) y el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) tras una reacción tal como el método de didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)].

Si los ADNc obtenidos codifican las secuencias de aminoácidos completas de VL y VL del anticuerpo que contiene una secuencia señal secretora se puede confirmar estimando la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL a partir de la secuencia nucleotidica determinada, y comparándola con la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Depl. Health and Human Services (1991)]. la longitud de la secuencia señal secretora y de la secuencia de aminoácidos N-terminal se puede deducir comparando la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo que comprende una secuencia señal secretora con la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y Vl de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Depl. Health and Human Services (1991)], y también se puede conocer el subgrupo al que pertenecen. Además, las secuencias de aminoácidos de cada una de las CDRs de VH y VL se puede encontrar comparando las secuencias de aminoácidos obtenidas con las secuencias de aminoácidos de VH y Vl de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunologicallnterest, US Depl. Health and Human Services (1991 )].

Además, la novedad de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de VH y Vl se puede examinar llevando a cabo una busqueda de homologia con secuencias en cualquier base de datos,

por ejemplo SWISS-PROT, PIR-Protein o similar, usando la longitud completa obtenida de las secuencias de aminoácidos de VH y Vl, por ejemplo segun el método de BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] o similar.

(3) Construcción de vector para expresión de anticuerpo híbrido humano

El ADNc que codifica cada una de VH y Vl del anticuerpo de animal no humano se clona en dirección 5' de los genes que codifican CH y Cl del anticuerpo humano del vector para la expresión de anticuerpo recombinante mencionado en (1) anterior, para construir de ese modo un vector para la expresión de anticuerpo hibrido humano.

Por ejemplo, a fin de ligar ADNc que comprende una secuencia nudeotídica de 3'-terminal de VH o Vl de anticuerpo de animal no humano y una secuencia nucleolidica de 5'-terminal de CH o CL de anticuerpo humano, cada ADNc que codifica VH y Vl de anticuerpo de animal no humano se prepara para que codifique aminoácidos apropiados codificados por una secuencia nucleotídica y una porción de enlazamiento, y se diseña para que tenga una secuencia de reconocimiento apropiada de una enzima de restricción. los ADNc obtenidos que codifican VH y Vl de anticuerpo se clonan respectivamente de manera que cada uno de ellos se expresa en una forma apropiada en la dirección 5' del gen que codifica CH o CL de anticuerpo humano del vector para la expresión de anticuerpo humanizado mencionado en (1) anteriormente, para construir un vector para la expresión de anticuerpo híbrido humano.

Además, el ADNc que codifica VH o Vl de un anticuerpo de animal no humano se amplifica mediante PCR usando un ADN sintético que tiene una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción apropiada en ambos extremos, y cada uno de ellos se clona al vector para la expresión de anticuerpo recombinante obtenido en (1) anteriormente.

(4) Construcción de ADNc que cod ifica la región V de anticuerpo humanizado

Los ADNc que codifican VH o VL de un anticuerpo humanizado se pueden obtener como sigue.

Las secuencias de aminoácidos de la región de estructura (en adelante denominada en la presente memoria ~FR') en VH o VL de un anticuerpo humano a la que secuencias de aminoácidos de CDRs en VH o VL de un anticuerpo derivado de un anticuerpo de animal no humano se trasplantan y se seleccionan respectivamente. Se pueden usar cualesquiera secuencias de aminoáCidos de FR de un anticuerpo humano, en tanto que deriven de ser humano. Los ejemplos incluyen secuencias de aminoácidos de FRs de anticuerpos humanos registrados en una base de datos tal como Protein Data Bank o similar, y las secuencias de aminoácidos comunes a subgrupos de FRs de anticuerpos humanos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Healih and Human Services (1991)], y similares. A fin de inhibir la reducción en la actividad de unión del anticuerpo, se seleccionan secuencias de aminoácidos que tienen una homología elevada (al menos 60% o más) con la secuencia de aminoácidos de FR en VH o Vl.

Después, las secuencias de aminoácidos de las CDRs del anticuerpo original se injertan en la secuencia de aminoácidos seleccionada de FR en VH o VL del anticuerpo humano, respectivamente, para diseñar cada secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de ADN considerando la frecuencia del uso de codones encontrada en secuencias nucleotídicas de genes de anticuerpos [Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], y se diseña la secuencia de AND que codifica la secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado.

Basándose en las secuencias nucleotidicas diseñadas, se sintetizan varios ADN sintéticos que tienen una longitud de alrededor de 100 nucleótidos, y se lleva a cabo la PCR usándolos. En este caso, a partir de la eficiencia de la reacción de PCR y de las longitudes de los ADN que se pueden sintetizar, se prefiere que se diseñen 6 ADN sintéticos por cada una de las cadenas H y L.

Además, el AONc que codifica VH o VL de un anticuerpo humanizado se puede clonar en el vector para la expresión de anticuerpo humanizado construido en (1) al introducir la secuenc ia de reconocimiento de una enzima de restricción apropiada en el término 5' de los ADN sintéticos que existen en ambos extremos.

También, se puede llevar a cabo usando un AON sintético como un AON que codifica cada una de la cadena H de longitud completa y de la cadena l de longitud completa en base a la secuencia de ADN diseñada.

Después de la PCR, un producto amplificado se clona en un plásmido tal como pBluescript SK (-) (fabricado por Stratagene) o similar, y la secuencia nucleotídica se determina según un métooo similar al método descrito en (2) para obtener un plásmido que tiene una secuencia de AON que codifica la secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado deseado.

(5) Modificación de la secuencia de aminoácidos de la región V de anticuerpo humanizado

Es conocido que cuando se produce un anticuerpo humanizado injertando simplemente solo las CDRs en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en las FRs de VH y VL de un anticuerpo humano, su actividad de unión al antígeno es menor que la del anticuerpo original derivado de un animal no humano [BIOITECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. En anticuerpos humanizados, entre las secuencias de aminoácidos de las FRs en VH y VL de un anticuerpo humano, un resto de aminoácido que está relacionado directamente con la unión a un antígeno, un resto de aminoácido que interacciona con un resto de aminoácido en CDR, y un resto de aminoácido que mantiene la estructura tridimensional de un anticuerpo y está relacionado indirectamente con un antígeno se identifican y modifican a un resto de aminoácido que se encuentra en el anticuerpo no humanizado original para incrementar de ese modo la actividad de unión al antígeno que se ha reducido.

A fin de identificar los restos de aminoácidos relacionados con la actividad de unión al antígeno en FR, la estructura tridimensional de un anticuerpo se construye y se analiza mediante cristalografía de rayos X [J. Mol. Biol. , 112, 535 (1977)]. modelado por ordenador [Protein Engineering, 7, 1501 (1994)], o similar. Además, actualmente deben ser necesarios varios intentos, por ejemplo se producen varios anticuerpos modificados de cada anticuerpo y se examina la correlación entre cada uno de los anticuerpos modificados y su actividad de unión del anticuerpo.

La modificación de la secuencia de aminoácidos de FR en VH y VL de un anticuerpo humano se puede lograr usando diversos ADN sintéticos para la modificación según PCR como se describe en (4). Con respecto al producto ampl ificado obten ido mediante la PCR, la secuencia nucleotídica se determina según el método como se describe en (2) de manera que se confirma el hecho de si se ha llevado a cabo la modificación objetivo.

(6) Construcción del vector para la expresión de anticuerpo humanizado

Un vector para la expresión de anticuerpo humanizado se puede construir clonando cada ADNc que codifica VH o VL de un anticuerpo recombinante construido en dirección 5' de cada gen que codifica CH o CL del anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpo recombinante como se describe en (1).

Por ejemplo, cuando se introducen secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción apropiadas en el término 5' de los ADN sintéticos situados en ambos extremos entre los ADN sintéticos usados en la construcción de VH o VL del anticuerpo humanizado en (4) y (5), se puede llevar a cabo la clonación de manera que se expresen en una forma apropiada en dirección 5' de cada gen que codifica CH o CL del anticuerpo humano en el vector para la expresión de un anticuerpo humanizado como se describe en (1).

(7) Expresión transitoria de anticuerpo recombinante

A fin de evaluar eficazmente la actividad de unión al antígeno de diversos anticuerpos humanizados producidos, los anticuerpos recombinantes se pueden expresar transitoriamente usando el vector para la expresión de anticuerpo humanizado como se describe en (3) y (6), o el vector de expresión modificado del mismo.

Como célula hospedante, se puede usar cualquier célula, en tanto que la célula hospedante pueda expresar un anticuerpo recombinante. En general, se usa la célula COS-7 (ATCC CRL1651) a la vista de su cantidad de expresión elevada [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991 )].

Los ejemplos del método para introducir el vector de expresión en célula COS-7 incluyen un método de DEAEdextrano [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)], un método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], Y similar.

Tras la introducción del vector de expresión, la cantidad de expresión y la actividad de unión al antígeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo se pueden determinar mediante el inmunoensayo enzimático Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Tercera edición, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbar Laboratory (1988),Monodonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] y similar.

(81 Obtención del transformante que expresa de forma estable anticuerpo recombinante y preparación de anticuerpo recombinante

Un transformante que expresa de forma estable un anticuerpo recombinanle se puede obtener introduciendo el vector para la expresión de anticuerpo recombinante descrito en (3) y (6) en una célula hospedante apropiada.

Los ejemplos del método para introducir el vector de expresión en una célula hospedante incluyen electroporación [Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 257891/90, Cylotechnology, 3, 133 (1990)] Y similar.

Como célula hospedante en la que se introduce un vector para la expresión de un anticuerpo recombinante, se puede usar cualquier célula, en tanto que sea una célula hospedante que pueda producir el anticuerpo recombinante. Los ejemplos incluyen CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUkXB11 (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC CCL1781), CHO-S (Life Technologies, nO de Catálogo 11619), célula de mieloma de rata YB2I3HL.P2.G11 .16Ag.20 (también denominada YB2IO), célula de mieloma de ratón NSO, célula de mieloma de ratón SP2I0-AgI4 (ATCC nO CRL1581), célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC nO CRL1580), célula CHO en la que un gen de dihidrofolato reductasa (en adelante denominado ~dhfr") es defectuoso [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216 (1980)], Lec13 con resistencia adquirida a lectina [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)]. célula CHO en la que el gen de ct1 ,6-fucosiltransaferasa es defectuoso (documentos WO 2005135586, WO 02131140), la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC nO CRL 1662), y similares.

Además, también se pueden usar células hospedantes en las que está reducida o suprimida la actividad de una proteina tal como una enzima relacionada con la sintesis de un nucle6tido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, una proteina tal como una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace ct en una cadena de azúcar enlazada mediante N-glic6sido de tipo complejo, o una proteína relacionada con el transporte de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, al cuerpo de Golgi, preferentemente una célula CHO en la que el gen de ct1,6-fucosiltransferasa está defectuoso, como se describe en los documentos W02005l35586, WOO2f31140

o similar.

Tras la introducción del vector de expresión, los transformantes que expresan de forma estable un anticuerpo recombinante se seleccionan cultivando en un medio para cultivo de células de animal que contiene un agente tal como sulfato de G418 (en adelante denominado en la presente memoria "G418") o similar (Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar nO 257891 /90) .

Los ejemplos del medio para cultivo de células de animal incluyen medio RPMI1640 (fabricado por Invitrogen), medio GIT (fabricado por Nihon Pharmaceutical), medio EX-CELL301 (fabricado por JRH), medio IMDM (fabricado por Invitrogen), medio Hybridoma-SFM (fabricado por Invitrogen), medios obtenidos añadiendo diversos aditivos tales como FBS a estos medios, y similares. El anticuerpo recombinante se puede producir y acumular en un sobrenadante de cultivo cultivando en un medio los transformantes seleccionados. La cantidad de expresión y la actividad de unión al antigeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo se pueden medir mediante ELlSA o similar. También, en el transformante, la cantidad de expresión del anticuerpo recombinante se puede incrementar usando el sistema de amplificación de DHFR o similar, según el método descrito en la solicitud de patente japonesa publicada sin examinar nO 257891/90.

El anticuerpo recombinante se puede purificar a partir del sobrenadante de cultivo del transforrnante usando una columna de proteina A [Monoclonal Antibodies-Principles and praelice, Tercera edición, Academic Press (1996),Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbar Laboratory (1988)]. Por ejemplo, el anticuerpo recombinante se puede purificar mediante una combinación de filtración en gel, cromatografia de intercambio iónico, ultrafiltración, y similar.

El peso molecular de la cadena H o de la cadena L del anticuerpo recombinante purificado o de la molécula de

anticuerpo como un todo se detennina mediante electroforesis en gel de poliaCfilamida INature, 227, 680 (1970)], transferencia Western ¡Monocional Antibodies-Principles and practice, Tercera edición, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbar Laboratory (1988)], y similar.

3. Evaluación de la actividad del anticuerpo monocional o del fragmento de anticuerpo

La actividad del anticuerpo monoclonal purificado o del fragmento de anticuerpo de la presente invención se puede evaluar de la siguiente manera.

La actividad de unión a una célula que expresa C04 se evalúa mediante el ensayo de unión descrito en el 1-(6a) anterior y un método de resonancia de plasmones superficiales usando el sistema de Biacore tal como se describe en el (6b) anterior. Además, se puede medir mediante una técnica de anticuerpo fluorescente ¡Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)], un método de resonancia de plasmones superficiales que usa un sistema tal como BIAcore o similar.

Además, la actividad COC o la actividad AOCC frente a una estirpe celular positiva para el antigeno se evalúa mediante un método conocido [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].

4. Método para controlar la actividad efectora de anticuerpo

Como método para controlar una actividad efectora del anticuerpo monoclonal anti-CD4 de la presente invención, se conoce un método para controlar una cantidad de fucosa (en adelante en la presente memoria denominada como "fucosa central") que está unida en enlazamiento «-1,6 a N-acetilglucosamina (GlcNAc) presente en un extremo reductor de una cadena de azúcar enlazada a través de N de tipo complejo que está unida a asparagina (Asn) en la posición 297 de una región Fc de un anticuerpo (documentos W02005f035586, W02002l31140 y WOOOf61739), un método para controlar una actividad efectora de un anticuerpo monocional modificando el grupo o grupos de aminoácidos de una región Fc del anticuerpo, y similares. La actividad efectora del anticuerpo monoclonal anli-CD4 de la presente invención se puede controlar usando cualesquiera de los métodos.

La "actividad efectora" significa una actividad dependiente del anticuerpo que es inducida vía una reg ión Fc de un anticuerpo. Como actividad efectora, se conoce la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad ADCC), la citotoxicidad dependiente del citocromo (actividad COC), la fagocitosis dependiente del anticuerpo (actividad ADP) por células fagociticas tales como macrófagos o células dendriticas, y similar.

Al controlar el contenido de fucosa central de una cadena de azúcar enlazada mediante N de tipo complejo de Fc de un anticuerpo, se puede incrementar o disminuir la actividad efectora del anticuerpo. Según un método para reducir el contenido de fucosa que está unida a una cadena de azúcar enlazada mediante N de tipo complejo unida a Fc del anticuerpo, un anticuerpo al que no está unida la fucosa se puede obtener mediante la expresión de un anticuerpo usando una célula CHO que es deficiente en un gen que codifica «1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que no está unida fucosa tiene una actividad ADCC elevada. Por otro lado, según un método para incrementar un contenido de fucosa que está unida a una cadena de azúcar enlazad mediante N de tipo complejo unida a FC de un anticuerpo, un anticuerpo al que está unida la fucosa se puede obtener mediante la expresión de un anticuerpo usando una célula hospedante en la que se introduce un gen que codifica «1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que está unida la fucosa tiene una actividad AOCC menor que el anticuerpo al que no está unida la fucosa.

Además, modificando el resto o restos de aminoácidos en una región Fc de un anticuerpo, se puede incrementar o disminuir la actividad ADCC o la actividad COCo La actividad ADCC se puede controlar incrementando o disminuyendo la actividad de unión a FcyR debido a la modificación o modificaciones del resto o restos de aminoácidos en una región Fc. Además, la actividad CDC se puede controlar incrementando o disminuyendo la actividad de unión del complemento debido a la modificación o modificaciones del resto o restos de aminoácidos en una región Fc. Por ejemplo, la actividad de unión a un anticuerpo se puede incrementar usando la secuencia de aminoácidos de la región Fc descrita en el documento US2007f0148165. Además, la actividad ADCC o la actividad CDC se puede incrementar o disminuir modificando el aminoácido como se describe en las patentes US nO 6.737.056, o n° 7.297.775 o en el documento W0200Sf070963.

Además, un anticuerpo en el que se controla la actividad efectora se puede obtener combinando el método anterior para controlar una cadena de azúcar y el método para modificar un aminoácido o aminoácidos en una región Fc.

5. Método oara tratar una enfermedad usando el anticuerpo monoclonal anti-C04 de la presente invención

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede usar para tratar un cáncer relacionado con CD4.

El agente terapéutiCO que comprende al anticuerpo de la invención o un conjugado del mismo puede comprender solamente el anticuerpo o un conjugado del mismo como principio activo, pero generalmente se proporciona como una preparación farmacéutica producida mezclándola con uno o más vehiculos fannacéuticamente aceptables, usando un método apropiado bien conocido en el campo técnico de la farmacia.

Los ejemplos de una vía de administración incluyen la administración oral y la administración parenteral, tal como la administración bucal, traqueal, rectal, subcutánea, intramuscular o intravenosa. En el caso de una fonnulación de anticuerpo o fonnulación peptldica, se prefiere la adminístración intravenosa. Los ejemplos de la fonna de dosificación incluyen pulverizaciones, cápsulas, comprimidos, polvo, gránulos, jarabes, emulsiones, supositorios, inyecciones, ungüentos, cintas, y similares.

La preparación fannacéutica adecuada para administración oral incluye emulsiones, jarabes, cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos, y similares.

Las preparaciones liquidas, tales como emulsiones y jarabes, se pueden producir usando, como aditivos, agua; azúcares tales como sacarosa, sorbitol y fructosa; glicoles tales como polietilenglicol y propilenglicol; aceites tales como aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de soja; antisépticos tales como ésteres del ácido p-hidroxibenzoico; sabores tales como sabor de fresa y menta piperita; y similares.

Las cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos, y similares, se pueden producir usando, como aditivos, excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa y manitol; agentes disgregantes tales como almidón y alginato de sodio; lubricantes tales como estearato de magnesio y talco; aglutinantes tales como polialcohol vinílico, hidroxipropilcelulosa y gelatina; tensioactivos tales como un éster de ácido graso; plastificantes tales como glicerina; y similares.

La preparación fannacéutica adecuada para administración parenteral incluye inyecciones, supositorios, pulverizaciones y similares.

Las inyecciones se pueden preparar usando un vehículo tal como una dísolución salina, una disolución de glucosa, o una mezcla de ambas.

Los supositorios se pueden preparar usando un vehiculo tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada o ácido carboxílico.

Las pulverizaciones se pueden preparar usando el anticuerpo como tal, o usándolo junto con un vehículo que no estimula la membrana mucosa bucal o de las vías respiratorias del paciente y puede facilitar la absorción del compuesto al dispersarlo como partículas finas. El vehículo incluye lactosa, glicerol y similar. Es posible producir preparaciones fannacéuticas tales como aerosoles y polvos secos.

Además, los componentes ejemplificados como aditivos para preparaciones orales también se pueden añadir a las preparaciones parenterales.

6. Método para diagnosticar cáncer usando el anticuerpo monoclonal anti-CD4 de la presente invención

Un cáncer relacionado con CD4 se puede diagnosticar detectando o detenninando CD4, o una célula que expresa CD4, usando el anticuerpo monoclonal de la presente invención.

Un diagnóstico del cáncer se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la detección o medida de CD4 según lo siguiente.

El diagnóstico del cáncer se puede llevar a cabo detectando CD4 que se expresa en la célula en un cuerpo del paciente medianle un mélodo inmunológico lal como un citómelro de flujo.

Un método inmunológico es un método en el que se detecta o se determina una cantidad de anticuerpo o una cantidad de antigeno usando un antigeno o anticuerpo marcados. Los ejemplos del método inmunológico incluyen un método de inmunoanticuerpo marcado con una sustancia radiactiva, un inmunoensayo enzimático, un inmunoensayo fluorescente, un inmunoensayo luminiscente, un método de transferencia Western, medios físicoquimicos, y similares.

Los ejemplos del método de inmunoanticuerpo marcado con sustancia radiactiva incluyen un métooo en el que el anticuerpo de la presente invención se deja reaccionar con un antígeno, una célula que expresa un antígeno, o similar, después el anticuerpo anti-inmunoglobulina sometido a un marcaje radioactivo o un fragmento de unión del mismo se deja reaccionar con él, seguido de la detenninaci6n usando un contador de centelleo o similar.

Los ejemplos del inmunoensayo enzimático incluyen un método en el que el anticuerpo de la presente invención se deja reaccionar con un antígeno, una célula que expresa un antígeno, o similar, después un anticuerpo antiinmunoglobulina o un fragmento de uniÓn del mismo sometido a marcaje del anticuerpo se deja reaccionar con él, y el pigmento coloreado se mide mediante un espectrofotómetro. Por ejemplo, se puede usar un ELlSA de sándwich. Como marcador usado en el ínmunoensayo enzimátíco, se puede usar cualquier marcador enzimático conocido (Enzyme Immunoassay, publicado por Igaku Shoin, 1987) como ya se describió. Los ejemplos incluyen marcaje con

fosfatasa alcalina, marcaje con peroxidasa, marcaje con luciferasa, marcaje con biotina, y similar. El ELlSA de sándwich es un método en el que un anticuerpo se une a una fase sólida, el anticuerpo a detectar o medir es atrapado, y se permite que otro anticuerpo reaccione con el antígeno atrapado. En el ELlSA, se preparan dos tipos de anticuerpo que reconocen el antigeno a detectar o medir, o el fragmento de anticuerpo del mismo en el que el sitio de reconocimiento del antígeno es diferente, y el primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo se adsorbe previamente en una placa (tal como una placa de 96 pocillOS) y el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo se marca con una sustancia fluorescente tal como FITC, una enzima tal como peroxidasa, o biotina. La placa a la que el anticuerpo anterior se adsorbe se deja reaccionar con la célula separada del organismo vivo o la suspensión celular disgregada del mismo, con tejido o disolución disgregada del mismo, células cultivadas, suero, efusión pleural, fluido ascitico, disolución ocular, etc., después se deja reaccionar con un anticuerpo monoclonal marcado o con un fragmento de anticuerpo, y se lleva a cabo una reacción de detección que corresponde a la sustancia marcada. La concentración de antigeno en la muestra a ensayar se puede calcular a partir de una curva de calibración preparada mediante una dilución por etapas de antigeno de concentración conocida. Como anticuerpo usado para ELlSA de sándwich, se puede usar cualquiera de anticuerpo policlonal y anticuerpo monoclonal, o se pueden usar fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fab' y F(ab)z. Como combinación de dos tipos de anticuerpos usados en ELlSA de sándwich, se puede usar una combinación de anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos que reconocen diferentes epítopos, o se puede usar una combinación de anticuerpo policlonal con anticuerpo monoclonal o fragmentos de anticuerpos.

Un inmunoensayo fluorescente incluye un método descrito en las bibliografías IMonoclonal Antibodies -Principies and practice, Tercera Edición, Academic Press (1996); Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific (1987)] y similar. Como marcador para el inmunoensayo fluorescente, se puede usar cualesquíera de los marcadores fluorescentes conocidos IFluorescent Immunoassay, Soft Science, (1983)]. Los ejemplos del marcador incluyen FITC, RITC, y similar.

El inmunoensayo luminiscente se puede llevar a cabo usando los métodos descritos en la bibliografía (Bioluminescence and Chemical Luminescence, Rinsho Kensa, 42, Hirokawa Shoten (1998)], Y similares. Como marcador usado para el inmunoensayo luminiscente, se puede incluir cualquiera de los marcadores luminiscentes conocidos, y los ejemplos incluyen éster de acridinio, lofina o similar.

La transferencia Western es un método en el que un antígeno o una célula que expresa un antígeno se fracciona mediante SDS (dodecilsulfato de sodio)-PAGE IAntibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)], el gel se transfiere sobre una membrana de PVDF o una membrana de nitrocelulosa, la membrana se deja reaccionar con anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce el antígeno, posteriormente se deja reaccionar con anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-lgG de ratón que está marcado con una sustancia fluorescente tal como FITC, un marcador enzimático tal como peroxidasa, un marcador biotinico, o similar, y el marcador se visualiza para confirmar la reacción. A continuación se describe un ejemplo de la mismo. Las células o tejidos en los que se expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 2 se disuelven en una disolución y, en condiciones reductoras, se someten a electroforesis 0,1 a 30 g como cantidad de proteína mediante un método de SDS-PAGE. La proteína sometida a electroforesis se transfiere a una membrana de PVDF y se deja reaccionar con PBS que contiene 1 a 10% de BSA (en adelante denominada en la presente memoria "BSA-PBS") a temperatura ambiente durante 30 minutos para el bloqueo. En la presente memoria, el anticuerpo monoclonal de la presente invención se deja reaccionar con ella, se lava con PBS que contiene 0,05 a 0,1% de Tween 20 en adelante denominada "Tween-PBS"), y se deja reaccionar con anti-lgG de ratón de cabra marcado con peroxidasa, a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lava con Tween-PBS, y se detecta una banda a la que está unida el anticuerpo monoclonal usando Reactivos de Detección de Transferencia Western ECL (fabricado por Amersham) o similar, para detectar de ese modo un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 2. Como anticuerpo usado para la detección de la transferencia Western, se usa un anticuerpo que se puede unir a un polipéptido que no tiene una estructura tridimensional de un tipo natural.

El método fisicoqu ímico se lleva a cabo específicamente haciendo reaccionar CD4 como el antígeno con el anticuerpo de la presente invención para formar un agregado, y detectando este agregado. Otros ejemplos de los métodos fisicoquímicos incluyen un método capilar, un mélodo de inmunodifusión monodimensional, una inmunoturbidimetría, una inmunoturbidimetría de látex IHandbook of Clinical Test Melhods, Kanehara Shuppan, (1988)] Y símílar. Por ejemplo, en un método de ínmunodífusíón de látex, se puede usar un portador tal como un látex de poliestireno que tiene un tamaño de partículas de alrededor de 0,1 a 1 ).1m sensibilizado con anticuerpo o antígeno, y cuando se lleva a cabo la reacción de antígeno-anticuerpo usando el antígeno o anticuerpo correspondiente, la luz dispersada en la disolución de la reacción aumenta mientras que disminuye la luz transmitida. Cuando se detecta tal cambio como absorbancia O turbidez de esfera integral, ahora es posible medir la concentración de antígeno, etc., en la muestra a ensayar.

Por otro lado, para la detección de la célula que expresa CD4, se pueden usar métodos de detección inmunológicos conocidos, y preferentemente se usa un método de inmunoprecipitación, un método de inmunotinción celular, un método de inmunotinción tisular, un método de linción de anticuerpo fluorescente, y similar.

Un método de inmunoprecipitación es un método en el que una célula que expresa CD4 se deja reaccionar con el

anticuerpo monodonal de la presente invención, y después se añade un portador que tiene capacidad de unión especifica a la inmunoglobulina, tal como proteina G-Sefarosa, de manera que precipita un complejo de antígenoanticuerpo. También, se puede llevar a cabo el siguiente método.

El anticuerpo descrito anteriormente de la presente invención se coloca en fase sólida sobre una placa de 96 pocillOS para ELlSA, y después se bloquea con BSA-PBS. Cuando el anticuerpo está en un estado no purificado, tal como un sobrenadante de cultivo de célula de hibridoma, una inmunoglobu lina anti-ratón o inmunoglobu lina de rata o una proteína A o una Proteína G, o similar, se adsorbe previamente sobre una placa de 96 pocillOS para ELlSA y se bloquea con BSA-PBS, y se le administra para la unión un sobrenadante de cultivo de célula de hibridoma. Después de que se desecha la BSA-PBS y el residuo se lava suficientemente con PBS, la reacción se lleva a cabo con una disolución disuelta de células o tejidos que expresan CD4. Se extrae un precipitado inmune de la placa con los pocillos lavados con un amortiguador de muestras para SD$-PAGE, y se detecta mediante la transferencia Western descrita anteriormente.

Un método de inmunotinción celular o un método de inmunotinción tisular es un método en el que las células o tejidos en los que se expresa el antígeno se tratan, si es necesario, con un tensioaclivo, metanol, o similar, para hacer que un anticuerpo permee fácilmente las célu las o tejidos, después el anticuerpo monoclonal de la presente invención se deja reaccionar con él, posteriormente entonces se deja reaccionar con un anticuerpo antiinmunoglobulina o fragmento de unión del mismo sometido a marcaje fluorescente tal como FITC, marcaje enzimático tal como peroxidasa, o marcaje con biotina, y el marcador se visualiza y observa bajo un microscopio. Además, las células o tejidos se pueden detectar mediante un método de tinción inmunofluorescente en el que las células se dejan reaccionar con un anticuerpo marcado fluorescentemente y se analizan mediante un citómetro de flujO [Monodonal Antibodies -Principies and practice, Tercera Edición, Academic Press (1996), Manual for Experiments of Monodonal Antibodies, Kodansha Scientific (1987)] en el que las células se dejan reaccionar con un anticuerpo marcado fluorescentemente y se analizan mediante un citómetro de flujo. Particularmente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención que se une a una región extracelular de la CD4 puede detectar una célula que expresa el polipéptido que mantiene una estructura tridimensional de tipo natural.

Además, en el caso de usar el sistema FMAT8100HTS (fabricado por Applied Biosystems), y similar, entre los métodos de linción de anticuerpo fluorescente, la cantidad de antigeno o la cantidad de anticuerpo se puede medír sin separar el complejo formado de anticuerpo-antígeno y el anticuerpo o antígeno libre que no esta ímplicado en la formación del complejo de anticuerpo-antígeno.

La presente invención se describe a continuación mediante los ejemplos; sin embargo, la presente invención no está limitada a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Construcción deltransfectante de CD4

(1) Construcción del vector de expresión de CD4

Un vector en el que se insertó una secuencia nudeotídica de CD4 humana se construyó como sigue, a partir de un vector (Clon nO 5226427, en adelante denominado en la presente memoria ·pCMV-CD4", fabricado por Open Biosystems) en el que se insertó un gen de CD4 humano en un vector pCMV-SPORT6.

El fragmento del gen de CD4 se ampl ificó usando como molde pCMV-CD4 y los cebadores que comprenden las secuencias nudeotídicas representadas por SEC ID NOs: 79 y 80, según un método de PCR convencional. El producto de la PCR se purificó mediante un Kit de Purificación por PCR (fabricado por Qiagen), y entonces se trató con enzimas de restricción EcoRI y Spel. De forma similar, un vector pBluescript 11 sk(-) (fabricado por Slratagene) (denominado en la presente memoria en adelante ·pBS") se trató con enzimas de restricción EcoRI y Spel. Los dos fragmentos resultantes se ligaron usando un Ligation high (fabricado por Toyobo) según las instrucciones adjuntas al mismo. Una cepa DH5a de Escherichia coli (fabricada por Toyabo) se transformó con la disolución de ADN plasmídico recombinante obtenida. Un ADN plasmídico se preparó a partir del clon del transformante y se confirmó mediante tratamiento con enzimas de restricción, y se obtuvo un plásmido pBS/CD4 en el que se insertó un gen de CD4. El pBS/CD4 resultante en el que se insertó un gen de CD4 y un vector de expresión pKANTEX93 (documento W097/10354) para una célula de animal se trataron con enzimas de restricción EcoRI y Spel. El líquido de la reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando de ese modo un fragmento de EcoRISpel de CD4 y un fragmento de EcoRI-Spel de pKANTEX93, respectivamente. Estos dos fragmentos se ligaron usando un Ligation high (fabricado por Toyobo) según las instrucciones adjuntas al mismo. Una cepa DH5o: de Escherichia coli (fabricada por Toyobo) se transformó con la disolución de ADN plasmídico recombinante resultante. Un ADN plasmídico se preparó a partir del clon del transformante y se confirmó mediante el tratamiento con enzimas de restricción, y se obtuvo un plásmido pKANTEXlCD4 en el que se insertó un gen de CD4. El plásmido obtenido se dejó reaccionar usando un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (fabricado por PE Biosystems) según las instrucciones adjuntas al mismo, y entonces se analizó su secuencia nucleotidica mediante un secuenciador de la misma compañía, ABI PRISM3700. Como resultado, se obtuvo un vector pKANTEXlCD4 en

el que se clonó un ADNc que codifica CD4 humana. La figura 1 ilustra un diagrama esquemático para la construcción del vector.

(2) Construcción de célula CHO/DG44 que expresa CD4

Según la electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], el vector de expresión de CD4 pKANTEXlCD4 construido en la Sección (1) en una célula CHO/DG44 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)] se introdujo de la siguiente manera. Las células usadas en la presente memoria son las subcultivadas en un medio en el que se añadió suplemento HT 1x (fabricado por Invitrogen) a IMDM (fabricado por Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (fabricado por Life Technologies) y gentamicina (50 ~g/ml, fabricada por Nacalai Tesque) (en adelante denominado en la presente memoria "medio A3"). Las células CHO/DG44 se suspendieron en un amortiguador que contiene cloruro potásico (137 nmolesl1), cloruro sódico (2,7 nmoles/l), hidrogenofosfato disódico (8,1 mmolesll), dihidrogenofosfato sódico (1,5 nmolesll) y cloruro magnésico (4 mmoles/l) (en adelante denominado en la presente memoria ~K-PBS") para dar una concentración final de 8 x 106 células/ml, y la suspensión celular resultante (200 ~J, 1,6 x 106 células en términos de recuento celular) se mezcló con el plásmido de expresión pKANTEXlCD4 (8 I1g). La mezcla se transfirió a una cubeta (distancia entre electrodos: 2 mm), seguido de la transferencia génica usando GenePulser 11 (fabricado por Bio-Rad) a un voltaje de pulso de 0,35 kV Y una capacidad eléctrica de 250 I1F. Después de que la cubeta se dejó reposar en hielo, la suspensión celular en la cubeta se suspendió en una vasija de cultivo celular que contiene medio A3, y se cultivó en una incubadora con 5% de C02 a 37°C. Después, las células se cultivaron en un medio que contiene G418 (fabricada por Invitrogen, 0,5 mg/ml), y entonces se obtuvo una estirpe celular transformada resistente a G418. Además, se seleccionó un clon que muestra un nivel elevado de expresión de CD4 añadiendo metotrexato al medio e incrementando la concentración de una manera por etapas. De esta manera, se obtuvo una estirpe celular CHO que expresa CD4 (en adelante denominada en la presente memoria "célula CHO/CD4" o "transfectante de CD4").

Ejemplo 2

Construcción de CD4-Fc

(1): Construcción del vector de expresión CD4-Fc

El vector pBSlCD4 construido en el Ejemplo 1(1), en el que se insertó un gen de CD4 humano. y un vector pKANTEX93 se mezclaron para uso como molde. La PCR se llevó a cabo usando la mezcla como molde, y cuatro oligonucle6tidos sintéticos representados por SEC ID NOs: 79, 80, 81, Y 82, respectivamente, como cebadores. Según esta reacción, se sintetizó una secuencia nucleotídica en la que un gen que codifica una región extracelular de una proteina CD4 se ligó con un gen de la región Fc (en adelante denominado en la presente memoria "gen CD4Fc"). El producto de la PCR resultante se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, y se escindió y pu rificó un gen CD4-Fc deseado (alrededor de 2 kpb) . Se llevó a cabo nuevamente la PCR usando como molde el producto purificado, y dos cebadores representados por SEC ID Nas: 79 y 82, respectivamente, de manera que se amplificó el gen CD4-Fc. El producto de la PCR resultante se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, y un gen deseado CD4-Fc (alrededor de 2 kpb) se escindió y se trató con enzimas de restricción EcoRI y Spel, obteniendo de ese modo un fragmento de EcoRI-Spel del gen CD4-Fc. De forma similar, el vector pKANTEX93 se trató con enzimas de restricción EcoRI y Spel. Los dos fragmentos resultantes se ligaron usando un Ligation High (fabricado por Toyobo) . Una cepa DH5a. de Escherichia coli (fabricada por Toyobo) se transformó con la disolución de ADN plasmídico reoombinante obtenida. Un ADN plasmidico se preparó a partir del clon del transformante y se confirmó mediante tratamiento con enzimas de restricción, y se obtuvo un pKANTEXlCD4-Fc plasmidico en el que se insertó el gen CD4-Fc. El plásmido obtenido se hizo reaccionar usando un BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (fabricado por PE Biosystems) según las instrucciones adjuntas al mismo, y entonces la secuencia nucleotidica se analizó mediante un secuenciador de la misma compañia, ABI PRISM3700. Como resultado, se obtuvo un vector pKANTEXlCD4-Fc en el que se clonó un ADNc que codifica CD4-Fc. La figura 2 ilustra un diagrama esquemático para la construcción del vector.

(2): Expresión de CD4-F c

Usando el pKANTEXlCD4-Fc construido en la Sección (1), se obtuvo una célula CHO que expresa CD4-Fc (en adelante denominada en la presente memoria "CHO/CD4-Fc") mediante un método convencional [Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company (1992)].

(3): PlJrificación de CD4-Fc sollJble

Tras cultivar la CHO/CD4-Fc construida en la Sección (2) en las mismas condiciones de cultivo como en el Ejemplo 1(2), la suspensión celular se recuperó y se centrifugó a 3000 rpm y 4°C durante 20 minutos para recuperar el sobrenadante de cultivo, y entonces el sobrenadante de cultivo se esterilizó mediante filtración usando un filtro Millex GV de 0,22 11m de tamaño de poros (fabricado por Millipore). La proteína CD4-Fc se purificó del sobrenadante de cultivo resultante, usando una columna de resina de capacidad elevada de Proteína A (fabricada por Millipore) según

las instrucciones anexas al mismo.

Ejemplo 3

Preparación de anticuerpo monoclonal anti-CD4

(1) Preparación de inmunÓQeno

A fin de obtener un anticuerpo monoclonal anti-CD4, se usó como inmunógeno un producto liofilizado de CD4 humana recombinante (número de catálogo: 514-CD/CF, fabricado por R&D Systems) disuelto en amortiguador de fosfato de Dulbecco (disolución salina amortiguada con fosfato: PBS), o una proteina de fusión CD4 humana-Fe en adelante denominada en la presente memoria "CD4-Fc") preparada en el Ejemplo 2(3).

(21 Inmunización de animal y preparación de célula productora de anticuerpo

Se administraron en ratas SO (fabricadas por Japan SLC) 20 I1g de la CD4 humana recombinante o de la CD4-Fc preparada en el Ejemplo 2(3), junto con 2 mg de un adyuvante de hidróxido de aluminio (Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 99, 1988) Y 1 x 109 células de una vacuna de tosferina (fabricada por Chiba Serum Institute). Dos semanas después de la administración, se administraron a las ratas 20 I1g de la CD4 y 2 mg de un adyuvante de hidróxido de aluminio solo una vez a la semana, cuatro veces en lotal. La sangre se recogió parcialmente de la vena del fondo de ojo de las ratas, y el titulo del anticuerpo del suero se confirmó mediante EUSA de unión a CD4. El bazo se extrajo de una rata que mostró un tilulo de anticuerpo suficiente tres dias después de la inmunización final. El bazo se troceó en trozos pequeños en Medio Esencial Minimo (MEM, fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ud.), se molió y se centrifugó (1200 rpm, 5 minutos). Se añadió amortiguador de cloruro de Tris-doruro de amonio (pH 7,6) para tratar la fracción de precipitación resultante durante 1 minuto a 37°C, mediante lo cual se eliminaron los glóbulos rojos. La fracción de precipitación resultante (fracción celular) se lavó tres veces con MEM, y se usó en la fusión celular.

(31 ELlSA de unión a CD4

Para el ensayo, se usó una placa de ELlSA de 96 pocillos (fabricada por Greiner). Para este fin, se dispensaron 2 Ilgfml de la CD4 humana recombinante preparada en el Ejemplo 1(1) a una concentración de 50 IllfpocillO a la placa, y se dejó reposar a 4°C toda la noche para la adsorción. Después de que la placa se lavó con PBS, se añadieron 100 Illl pocillO de seroalbúmina bovina al 1% (BSA)-PBS (en adelante denominada en la presente memoria "BSAPBS") a la placa, y la placa se dejó reposar entonces a temperatura ambiente durante 1 hora de manera que los grupos activos que quedan se bloquearon. Después, la BSA-PBS se desechó, y se dispensaron a la placa 50 flllpocillo de una dilución apropiada del suero de rata inmunizado como anticuerpo primario, y la placa se dejó reposar entonces durante 2 horas. La placa se lavó con monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán al 0,05% [(el equivalente del nombre comercial de ICI Tween 20, fabricado por Wako Pure Chemical)]fPBS (en adelante denominado en la presente memoria "Tween-PBS"), y se añadieron a la placa 50 IlJlpocillO de un anticuerpo de cabra anti-lgG (cadena H + L) de rata marcado con peroxidasa (fabricado por Zymed) como anticuerpo secundario, y la placa se dejó reposar entonces a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con Tween-PBS, y se desarrolló el color añadiendo 50 IlJlpocillo de una disolución de sustrato de 2,2-azinobis(ácido 3-elilbenzotiazol-6sulfónico)amónico (ABTS) [1 mmoi/l de ABTS, 0,1 mol/l de amortiguador de citrato (pH 4,2), 0.1% de HzÜ2]. La reacción se detuvo añadiendo 50 ¡.!l/pocillo de una disolución de laurilsulfato de sodio (SOS) al 5%, y entonces se midió una absorbancia (OD415nm) usando un lector de placas Emax (Molecular Devices).

(4) Preparación de célula de mieloma de ratón

La estirpe celular de mieloma de ratón resistente a 8-azaguanina P3X63Ag8U.1 (P3-U1, adqui rida de ATCC) se cultivó en medio RPMI 1640 Jfabricado por Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino, para asegurar un recuento celular de 2 x 10 o más necesario para la fusión celular, y se proporcionó como células progenitoras en la fusión celular.

(51 Medida del sobrenadante de cultivo mediante el método de FMAT

Los transfectantes de CD4 preparados en el Ejemplo 1, o las células CHO/DG44 como control negativo, se sembraron en una placa de FMAT de 96 pocillOS (fabricada por Applied Biosystems) a una densidad celular de 1 x 104 célulasl50 f.ll/pocillo, seguido del cultivo durante toda la noche en una incubadora con 5% de C02 a 37°C. A la placa, se añadieron 10 Illlpocillo del sobrenadante de cultivo del hibridoma, y entonces se le añadieron inmediatamente 50 IlJlpOCillO de un anticuerpo de cabra anti-lgG (H + L) de rata marcado con ALEXA 647 (fabricado por Invitrogen) diluido con BSA-PBS, dejándolo reposar después a temperatura ambiente en la sombra durante 3 horas. Posteriormente, se midió una longitud de onda de 650 a 685 nm, que se excitó con un láser de He/Ne a 633 nm, mediante un Sistema de Detección Celular 8200 (fabricado por Applied Biosystems). en adelante en la presente memoria, este método de medida se denomina método de FMAT.

(6) Construcción de hibridoma

Células de bazo de ratón obtenidas en la Sección del Ejemplo 3(2) y células de mieloma obtenidas en el Ejemplo 3(4) se mezclaron en una relación de 10:1 y se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 minutos. El grupo celular de la fracción de precipitación resultante estaba muy disgregado. Se añadió una mezcla de 1 g de polietileng licol-1000 (PEG-1000), 1 mi de Medio Esencial Minimo (en adelante denominado en la presente memoria "MEM") y 0,35 mi de dimelilsulfóxido (DMSO) a 0,5 ml11 x 108 células de bazo de ratón y a 37°C con agitación, y se añadió varias veces 1 mi de MEM a la suspensión cada 1 minuto. Después, se añadió MEM para dar un volumen total de 50 mI. La suspensión celular se centrifugó (900 rpm, 5 minutos), y las células de la precipitación resultante se disgregaron lentamente y entonces se suspendieron lentamente en 100 mi de medio HAT [se añadió HAT Media Supplement (fabricado por Invitrogen) a medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino]. La suspensión se dispersó en una placa de cultivo de 96 pocillos a 200 1.1Ilpocillo y se cultivó en una incubadora con 5% de COz a 37°C durante 10 a 14 dias. Después del cultivo, el sobrenadante de cultivo se midió según el método de FMAT descrito en el Ejemplo 3(5), y se seleccionó un pocillO que fue reactivo a la CHOIC04 preparada en el Ejemplo 1 y que no fue reactivo a la célula CHOIDG44. Después, las células seleccionadas que producen un anticuerpo especifico para CD4 se sometieron dos veces a donación mediante un método de dilución limitante para establecer los hibridomas KM4065, KM4066, KM4067, KM4068 Y KM4069 que producen anticuerpos monoclonales de rata anti-C04.

Ejemplo 4

Evaluación de la actividad para anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4

(1) Reactividad de anticuerpo monodonal de rata anti-CD4 para la estirpe celular positiva para CD4 humana mediante FCM

Las células se bloquearon añadiendo 1 mglml de IgG humana (fabricada por Sigma) a 1 a 5 x 105 células de la estirpe celular de linfoma de células T humano HPB-ALL. Los anticuerpos monoclonales de rata anti-CD4 KM4065 a KM4069 y un anticuerpo de ratón anti-CD4 OKT4 (fabricado por BioLegend) se diluyeron apropiadamente con BSAPBS, y se añadieron a aquellas para dar un volumen total de 50 jll. Estas suspensiones celulares se dejaron reaccionar en hielo durante 60 minutos, y las células se lavaron dos veces con 8SA-PBS. A las células se les añadieron 50 111 de anticuerpo de cabra anti-lgG (H + L) de rata marcado con Alexa-488 (fabricado por Invitrogen) diluido con BSA-PBS, seguido de la reacción en hielo durante 40 minutos. Las células se lavaron una vez con BSAPBS y se suspendieron en BSA-PBS, y la intensidad de la fluorescencia se midió mediante un citómetro de flujo (fabricado por 8eckman Coulter).

La figura 3 muestra la intensidad de fluorescencia media (valor de MFI) cuando el anticuerpo monoclonal se hizo reaccionar a una concentración de 5, 0,5 Y 0,05 jlglml. Se demostró que todos los anticuerpos monoclonales de rata anti-CD4 KM4065 a KM4069 y el anticuerpo de ratón anti-C04 OKT4 se unen a la estirpe celular positiva para C04 de una manera dependiente de la concentración del anticuerpo.

(2) Actividad de unión de anticuerpo monoclonal de rata anli-CD4 a CD4 humana recombinante mediante Biacore

Para analizar cinéticamente la actividad de unión de los anticuerpos monoclonales de rata anti-C04 KM4065 a KM4069 Y del anticuerpo de ratón anti-CD4 humana comercialmente disponible para CD4 humana recombinante, la actividad de unión se midió mediante el método de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Todas las si9uientes manipulaciones se llevaron a cabo usando el Biacore T100 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences). El anticuerpo anti-lgG de ratón se inmovilizó en una matriz sensora CM5 (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences) mediante un método de acoplamiento de amina usando un Kit de Captura de Anticuerpo de Ratón (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences) según los protocolos anexos al mismo. Los anticuerpos monoclonales de rata anti-C04 KM4065 a KM4069, Leu-3a (BO Biosciences), OKT4 (BioLegend) y 1388.2 (Beckman Coulter) se añadieron para ser capturados sobre la matriz que tenia inmovilizado al anticuerpo anti-lgG de ratón, para dar 100 RU (unidad de resonanCia), respectivamente. Después, la CD4 humana recombinante (fabricada por R&D), diluida desde 2500 nglml en cinco etapas, se dejó pasar a un caudal de 30 jlllmin. sobre la matriz, y se obtuvo el sensograma correspondiente a cada concentración. El análisis se llevó a cabo en el modelo de unión 1:1 usando un software de análisis incluido con el aparato, calculando de ese modo una constante de velocidad de asociación ka y una constante de velocidad de disociación kd de los anticuerpos individuales para la CD4 humana.

Como resultado, en la Tabla 2 se da una conslante de velocidad de asociación (en adelante denominada en la presente memoria "ka~), una constante de velocidad de disociación (en adelante denominada en la presente memoria "kd") y una constante de disociación Ko (kdlka) de los anticuerpos individuales asi obtenidos.

Como se muestra en la Tabla 2, los anticuerpos monodonales de rata anti-CD4 KM4065 y KM4066 mostraron una mayor afinidad que el anticuerpo convencional.

!Tabla 21

anticuerpo ka (1{Ms) kd (1{s) Ka (M) KM4065 3,57 E+05 1,52 E-06 4,26 E-12 KM4066 1,34 E+06 1,18E-04 8,82E-11 KM4067 8,75 E+05 4,73 E-04 5,41 E-10 KM4068 1,85 E+06 2,04 E-03 1,10 E-09 KM4069 1,21 E+06 5,84 E-04 4,82 E-10 Leu-3a' 1,10 E+06 1,29 E-04 1,17 E-10 OKT4" 1,05 E+06 3,06 E-03 2,90 E-09

1388.2'" 4,44 E+05 1,56 E-04 3,52 E-10 fabricado por BO Bioscience, ..: fabricado por Biolegend, "': fabricado por Beckman Coulter

(3) Evaluación de la citotoxicidad celular dependiente del complemento (actividad CDC) del anticuerpo monocional 5 de rata anti-CD4 sobre Iransfectante de C04

La actividad COC de los anticuerpos monoclonales de rata anti-C04 KM4066 a KM4068 y del anticuerpo de ratón anti-CD4 OKT4 sobre el transfectante de CD4 construido en el Ejemplo 1 se midió usando un sobrenadante de cultivo del hibridoma de rata, según el siguiente procedimiento.

El transfectante de C04 se lavó con PBS, se lavó con RPMI 1640 (fabricado por Wako Pure Chemical) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), y se preparó para dar una concentración óptima en el mismo medio, que entonces se usó como una suspensión celular diana. la suspensión celular diana se dispensó en una placa de fondo plano de 96 pocillos (fabricada por Sumitomo Bakelite) a 5 x 104 células/pocillo. Además, se le añadió, para dar un volumen 15 total de 100 IlllpocillO, una disolución de anticuerpo híbrido anti-CD4 preparada para dar una concentración apropiada y un complemento humano (fabricado por Sigma) a una concentración final de 25%. Además, se prepararon respectivamente, como control negativo, un pocillo de reacción que no contiene el anticuerpo (pocillo de citotoxicidad celular de 0%), y como control positivo, un pocillo de reacción que no contiene la célula (pocillO de citotoxicidad celular de 100%). La reacción se llevó a cabo en una incubadora con 5% de C02 a 37°C durante 3

20 horas. Después de que la reacción estuvo terminada, se añadieron 10 j.dlpocillo de un reactivo WST-1 (fabricado por Rache Oiagnostics) a los pocillos de reacción, seguido de la reacción a 37°C durante 3 horas. Se midió una absorbancia a 450 nm (00450) para cada pOCillO usando un lector de placas Emax (fabricado por Molecular Devices). A partir de la absorbancia de cada pocillo, la actividad celular COC (citotoxicidad celular [%]) se calculó según la siguiente fórmula.

(Fórmula)

Actividad COC (citotoxicidad celular [%]) = 100 x {1 -(absorbancia del pocillo de reacción -absorbancia del pocillo de lisis de 100%)/(absorbancia de pocillo de lisis de 0% -absorbancia de pocillo de lisis de 100%)}

30 En la figura 4 se muestran los resultados de la medida. Como se muestra en la figura 4, el anticuerpo de ratón antiC04 convencional OKT4 tuvo una actividad COC, y de forma similar todos los clones de los anticuerpos monoclonales de rata anti-CD4 KM4066 a KM4068 obtenidos en la presente invención también mostraron una actividad COCo

Ejemplo 5

Aislamiento y análisis de AONc que codifica regiones variables de anticuerpo monocional anti-CD4

40 (1) Preparación de ARNm a partir de célula de hibridoma que produce anticuerpo monoclonal anti-CD4

A partir de 5 x 107 a 1 x 108 células de los hibridomas respectivos KM4065 a KM4069 obtenidos en el Ejemplo 3, se preparó ARNm de los anticuerpos monodonales de rata anli-C04 respectivos usando RNAeasy Mini kit (fabricado por Oiagen) y 0 ligotexTM-dT30 <Super> mRNA Purification Kit (fabricado por Takara) según las instrucciones

45 adjuntas en los mismos.

(2) Clonación génica de regiones variables de la cadena H y de la cadena l de anticuerpo monodonal anti-C04

Usando un kit de amplificación de AONc SMART RACE (fabricado por Clontech) según las instrucciones adjuntas al

50 mismo, se obtuvo un ADNc a partir de 0,5 119 de ARNm del anticuerpo monoclonal obtenido en el Ejemplo 5(1). los fragmentos de ADNc de las regiones variables de cadena pesada (en adelante denominadas en la presente memoria "VH") de los anticuerpos respectivos se amplificaron llevando a cabo la PCR usando como molde el AONc asi obtenido, y usando un cebador universal Amix adjunto al kit y uno seleccionado de un cebador específico para IgGI de rata (SEC ID NO:3), un cebador específico para IgG2a de rata (SEC ID NO:4), y un cebador especifico para

55 IgG2b (SEC ID NO:5). También, los fragmentos de AONc de las regiones variables de cadena ligera (en adelante

denominadas en la presente memoria ~VL·) de los anticuerpos respectivos se amplificaron llevando a cabo la PCR usando un cebador especifico para Ig(K) de rata (SEC ID NO: 6) en lugar de los cebadores especificos para la subclase respectivos del anticuerpo. La PCR para cualquier subdase de anticuerpo se llevó a cabo calentando a 94°C durante 5 minutos; 5 ciclos que consisten cada uno en una reacción a 94°C durante 15 segundos y una reacción a 72°C durante 3 minutos; 5 ciclos que consisten cada uno en una reacción a 94°C durante 15 segundos, una reacción a 7C1'C durante 30 segundos, y una reacción a 72°C durante 3 minutos; y 30 ciclos que consisten cada uno en una reacción a 94°C durante 15 segundos, una reacción a 68°C durante 30 segundos, y una reacción a 72°C durante 3 minutos, seguido de una reacción a 72°C durante 10 minutos. La PCR se llevó a cabo usando el PTC-200 ONA Engine (fabricado por Bio-Rad).

A continuación, a fin de determinar la secuencia nucleotidica mediante clonación, el producto de la PCR obtenido se separó mediante electroforesis en gel de agarosa, y cada uno de un fragmento del gen de VH y un fragmento del gen de VL se extrajo usando un Kit de Extracción en Gel (fabricado por Qiagen). Después, al fragmento extra ido se añadió desoxiadenina (dA), usando un Target Clone Plus (fabricado por Toyoba) según las instrucciones adjuntas al mismo, y VH O VL de cada anticuerpo se incorporó en un vector pTA2. Una cepa OH5a de Escherichia coli se transformó con el vector obtenido según las instrucciones adjuntas a un Competent Quick (fabricado por Toyobo). Se extrajo un plásmido del transformante resultante usando un sistema de aislamiento de plásmido automatizado (fabricado por Kurabo). El plásmido extraido se dejó reaccionar usando un Big Oye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (fabricado por PE Biosystems) según las instrucciones anejas al mismo, y entonces la secuencia nucleotidica del producto de la PCR clonado se analizó usando un secuenciador de la misma compañia, ABI PRISM3700. Como resultado, se obtuvo un plásmido que contiene un AONc de VIH de longitud completa y un plásmido que contiene un ADNc de VL, en los que una secuencia ATG, que se supone que está en un codón de iniciación, estaba presente en el término 5' de ADNc. En la figura 5 se muestra un esquema de clonación.

(3) Análisis de la secuencia nucleotidica de la región variable del anticuerpo monoclonal anti-C04

Las secuencias nudeotidicas completas de VH de los anticuerpos monoclonales anti-C04 KM4065 a KM4069 comprendidas en el plásmido obtenido en el Ejemplo 5(2) se representan mediante SEC ID NOs: 7 a 11, respectivamente; las secuencias de aminoácidos completas de VH que incluyen una secuencia señal deducida a partir de estas secuencias nucleotidicas se representan mediante SEC ID NOs: 12 a 16, respectivamente; las secuencias nudeotídicas completas de VL se representan mediante SEC ID NOs: 17 a 21, respectivamente; y las secuencias de aminoácidos completas de VL que incluyen una secuencia señal deducida a partir de estas secuencias nucleotidicas se representan mediante SEC ID NOs:22 a 26, respectivamente. A partir de la comparación de los resultados del análisis obtenidos con los datos de secuencias [SECUENCES of Proteins of Immunological lnterest, US Oept. Health and Human Services (1991)] de anticuerpos de rata conocidos, está claro que cada uno de los ADNc aislados es un ANoc de longitud completa que codifica una región variable (en adelante denominada en la presente memoria ~región V") de anticuerpos monoclonales de rata anti-C04 KM4065 a KM4069 que contienen una secuencia señal secretora; en la cadena H de KM4065, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 19 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 12 es la secuencia señal secretora; en la cadena L de KM4065, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 20 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 22 es la secuencia señal secretora; en la cadena H de KM4066, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 19 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 13 es la secuencia señal secretora; en la cadena L de KM4066, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 19 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 23 es la secuencia señal secretora; en la cadena H de KM4067, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 18 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 14 es la secuencia señal secretora; en la cadena L de KM4067, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 20 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 24 es la secuencia señal secretora; en la cadena H de KM4068, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 19 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 15 es la secuencia señal secretora; en la cadena L de KM4068, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 20 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 25 es la secuencia señal secretora; en la cadena H de KM4069, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 19 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 16 es la secuencia señal secretora; y, en la cadena L de KM4069, la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1 a 20 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 26 es la secuencia señal secretora.

Entonces, se investigó la novedad de las secuencias de aminoácidos de VH y VL de los anticuerpos monoclonales anti-CD4 KM4065 a KM4069. Usando un paquete GCG (versión 9.1, fabricado por Genetics Computer Group) como sistema de análisis de secuencias, la base de datos de las secuencias de aminoácidos de proteinas convencionales se recuperó medianle el método de BLASTP [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997»). Como resultado, no se encontraron secuencias de aminoácidos que coinciden completamente tanto para la VH como para la VL, de manera que se confirmó que la VH y la VL de los anticuerpos monoclonales anti-C04 KM4065 a KM4069 tienen secuencias de aminoácidos nuevas.

Además, las CORs de VH y VL de los anticuerpos monoclonales respectivos se identificaron comparándolas con las secuencias de aminoácidos de anticuerpos conocidos. Las secuencias de aminoácidos de COR1 , CDR2 y CDR3 de VH del anticuerpo monodonal de rata anti-C04 KM4065 se representaron mediante SEC ID NOs: 27, 28 Y 29,

respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de COR1, COR2 y COR3 de VL del mismo se representan mediante SEC ID NOs: 30, 31 Y32, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de COR1, COR2 y COR3 de VH del anticuerpo monodonal de rata anti-C04 KM4066 se representaron mediante SEC ID NOs: 33, 34 Y 35, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de COR1, COR2 y COR3 de VL del mismo se representaron mediante SEC ID NOs: 36, 37 Y38, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de COR1 , COR2 y COR3 de VH del anticuerpo monodonal de rata anti-C04 KM4067 se representaron mediante SEC ID NOs: 39, 40 Y 41, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de COR1, COR2 y COR3 de VL del mismo se representan mediante SEC ID NOs: 42, 43 Y 44, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de COR1 , COR2 y COR3 de VH del anticuerpo monodonal de rata anti-C04 KM4068 se representaron mediante SEC ID NOs: 45, 46 Y 47, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de COR1 , COR2 y COR3 de VL del mismo se representaron mediante SEC ID NOs: 48, 49 Y 50, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de COR1, COR2 y COR3 de VH del anticuerpo monodonal de rata anti-C04 KM4069 se representaron mediante SEC ID NOs: 51, 52 Y 53, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de COR1, COR2 y COR3 de VL del mismo se representaron mediante SEC ID NOs: 54, 55 Y 56, respectivamente.

Ejemplo 6

Preparación de anticuerpo híbrido anti-C04

(1) Construcción del vector de expresión de anticuerpo híbrido anti-C04

El anticuerpo hibrido preparado en la presente invención es un anticuerpo híbrido en el que una región constante de cadena pesada (denominada en la presente memoria en adelante ~tipo 113F"), que tiene una actividad COC elevada y que comprende una secuencia de aminoácidos en la que una parte de una región Fc de un anticuerpo IgGI humano se sustituye por Fc de un anticuerpo IgG3 humano descrito en el documento US2007/0148165, y una región constante de cadena ligera de !( humana se ligaron a regiones variables de cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 obtenido en el Ejemplo 5(2), respectivamente. Para este fin, usando un vector de expresión de anticuerpo híbrido de tipo COC elevada PKTX93f113F (descrito en el documento US2007f014816S) que comprende una región variable de un anticuerpo anti-C020, y un vector pTA2 que comprende VH o VL de cada anticuerpo monodonal obtenido en el Ejemplo 5(2), se construyó un vector de expresión de anticuerpo híbrido antiC04 según el siguiente procedimiento (figuras 5 y 6).

Se preparó una disolución de reacción (50 111) que contiene 100 ng de un vector TA2 que contiene como molde VH o VL de cada anticuerpo monoclonal, 5 111 de amortiguador KOO Plus 10x, 5111 de 2 mmoles/l de dNTPs, 2 111 de 25 mmolesl1 de cloruro de magnesio, 2,5111 de OMSO, 1 111 de KOO Plus polimerasa (fabricada por Toyobo), y 1 111 de cada uno de 10 I1molesfl de cebadores específicos para VH y VL de cada anticuerpo monodonal de rata anti-C04. Usando la disolución así preparada, se llevó a cabo la PCR según lo siguiente: calentamiento a 94°C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos que consisten cada uno en una reacción a 94°C durante 15 segundos, una reacción a 6O,6°C durante 30 segundos, y una reacción a 6J3<'C durante 1 minuto. Los cebadores de VH de KM4065 se representan mediante SEC ID NOs: 57 y 58, y los cebadores de VL del mismo se representan mediante SEC ID NOs: 59 y 60; los cebadores de VH de KM4066 se representan mediante SEC ID NOs: 61 y 62, Y los cebadores de VL del mismo se representan mediante SEC ID NOs: 63 y 64; los cebadores de VH de KM4067 se representan mediante SEC ID NOs: 65 y 66, Y los cebadores de VL del mismo se representan mediante SEC ID NOs: 67 y 68; los cebadores de VH de KM4068 se representan mediante SEC ID NOs: 69 y 70, Y los cebadores de VL del mismo se representan mediante SEC ID NOs: 71 y 72; Y los cebadores de VH de KM4069 se representan mediante SEC ID NOs: 73 y 74, Y los cebadores de VL del mismo se representan mediante SEC ID NOs: 75 y 76, respectivamente.

Cada producto de la PCR se purificó usando un Kit de Purificación de PCR (fabricado por Qiagen). La VH obtenida de cada anticuerpo se trató con enzimas de restricción Apal (fabricada por New England Biolabs) y Notl (fabricada por New England Biolabs), obteniendo de ese modo un fragmento de Notl-Apal de VH. Además, VL de cada anticuerpo se trató con enzimas de restricción BsMlI (fabricada por New England Biolabs) y EcoRI (fabricada por New England Biolabs). obteniendo de ese modo un fragmento de EcoRI-BsMlI de VL. Además, el vector de expresión del anticuerpo híbrido de tipo CDC elevada PKTX93f113F también se sometió a tratamientos con enzimas de restricción Notl y Apal, o EcoRI y BsMlI. Al igual que con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1(1), se obtuvo un vector en el que se clonó un AONc que codifica VH de los anticuerpos monoclonales anti-C04 KM4065 a KM4069, y un vector en el que se clonó un ADNc que cod ifica VL de cada uno de los anticuerpos monoclonales de rata anti-C04 KM4065 a KM4069. Se añadieron enzimas de restricción EcoRI y Notl para tratar el vector PKTX93f113F obtenido en el que se incorporó VH o VL de cada anticuerpo, obteniendo de ese modo un fragmento de Notl-EcoRI del vector PKTX93/113F en el Que se incorporó un fragmento de EcoRI-Notl de VL y VH. Al igual Que con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1(1), se obtuvo un vector de expresión de un anticuerpo híbrido antiC04 en el que se clonó cada uno de los AONc Que codifican VH y VL de cada uno de los anticuerpos monodonales de rata anti-CD4 KM4065 a KM4069. En la figura 6 se muestra un esquema para la construcción del vector. Además, los anticuerpos híbridos anti-C04 preparados a partir de los anticuerpos monoclonales anti-CD4 KM4065 a KM4069 se definen como anticuerpos híbridos anti-C04 KM4045 a KM4049, respectivamente (Tabla 3).

!Tabla 31

Anticuerpo monoclonal de rata: Anticuerpo híbrido

KM4065: KM4045

KM4066: KM4046

KM4067: KM4047

KM4068: KM4048

KM4069: KM4049

(21 Expresión de anticuerpo híbrido anti-C04 usando células de animal

Usando el vector de expresión de anticuerpo hibrido anti-CD4 obtenido en el Ejemplo 6(1), el anticuerpo hibrido antiC04 en una célula de animal se expresó mediante un método convencional [Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman y Company (1992)1 para obtener transformantes KM4045 a KM4049 que producen anticuerpos hibridos anti-CD4. Como célula de animal para expresar el anticuerpo deseado, se usó una estirpe celular CHOIDG44 en la que se genosuprimió doblemente un gen de a.1,6-fucosiltransferasa (FUT8) (en adelante denominada en la presente memoria "célula CHO genosuprimida para FUT8"). Se sabe que la fucosa no se añade a una estructura central de una cadena de azúcar enlazada mediante N-glic6sido de tipo complejo del anticuerpo expresado en esta célula hospedante (documento W02002l31140).

(31 Obtención de anticuerpo hibrido purificada

Tras cu ltivar cada uno de los transformantes KM4045 a KM4049 obtenidos en la Sección (2) mediante un método de cultivo convencional, las suspensiones celulares se recuperaron y se centrifugaron a 3000 rpm y 4°C durante 20 minutos para recuperar el sobrenadante de cultivo. Después, los sobrenadantes de cultivo se esterilizaron mediante filtración usando un filtro Millex GV de 0,22 11m de tamaño de poros (fabricado por Míllipore). Los anticuerpos hibridos anti-CD4 KM4045 a KM4049 se pUrificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo obtenidos, usando una columna de resina de alta capacidad de Proteina A (fabricada por Millípore) según las instrucciones anejas a la misma.

(41 Preparación de anticuerpo tipo IqG1 Y anticuerpo tipo 113F de antiruerPO humano anti-CD4 6G5

A fin de comparar la actividad del anticuerpo monoclonal anti-C04 de la presente invención, se prepararon dos anticuerpos (denominados en la presente memoria en adelante ~6G5-1" y "6G5-113F") que comprenden una región variable del anticuerpo humano anti-CD4 convencional 6G5 y una región Fc de IgG humana convencional o una región Fc de tipo 113F de actividad CDC elevada.

Un gen que codifica VH y VL del anticuerpo humano anti-CD4 6G5 se construyó llevando a cabo la PCR usando los aligo ADN sintéticos representados mediante SEC ID NOs: 89 a 92, los oligo ADN sintéticos representados mediante SEC ID NOs:83 a 88, y un cebador T3 y un cebador T7 situados en ambos extremos de la región variable, en base a la información de secuencia descrita en el dorumento US20060183195. El fragmento génico de VH o VL amplificado mediante PCR del anticuerpo 6G5 se ligó en un vector pBluescript 11 sk(-) vector (fabricado por Stratagene) para la subclonación. Subsiguientemente, al igual que con el procedimiento en el Ejemplo 1 o en el Ejemplo 6(2), se construyó un vector de expresión 6G5.1-1 y un vector de expresión 6G5.1-113F (figura 7). El vector de expresión 6G5.1-1 construido se expresó tanto en la célula CHOf0G44 como en la célula CHO genosuprimida para FUT8 (documento W02002l31140), y el vector de expresión 6G5.1-113F se expresó en la célula CHO genosuprimida para FUT8. La introducción del vector de expresión, la obtención de la cepa celular de expresión, el cultivo celular, y la purificación de los anticuerpos se llevaron a cabo de la misma manera como en el Ejemplo 6(2) y (3). Como resultado, se obtuvo un anticuerpo 6G5-1 (en adelante denominado en la presente memoria "6G5-1") en el que la fucosa está unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena de azúcar enlazada mediante Nglic6sido de tipo complejo del antiruerpo a través del enlace 0.-1,6, y se obtuvo un anticuerpo 6G5-1 (en adelante denominado en la presente memoria "6G5-P") al que la fucosa no está unida a él, y se obtuvo un anticuerpo 6G5113F (en adelante denominado en la presente memoria ~6G5-113F") en el que la fucosa no está unida a una cadena de azúcar enlazada mediante N-glic6sido de tipo complejo de la región Fc del anticuerpo.

(51 Determinación del oontenido de fucosa en el anticuerpo hibrido anti-CD4

Según el método descrito en el documento W02002l31140, se examinó la relación de una cadena de azúcar en la Que la posición 1 de fucosa no está unida a la posidón 6 de N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar enlazada mediante N-glicósido de tipo complejo de la región Fc de cada anticuerpo hibrido antiC04 y anticuerpo 6G5-1 a través del enlace o. al todo. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

A partir de estos resultados, se demostró que la fucosa no se añadió al anticuerpo híbrido preparado en el Ejemplo 6(3).

!Tabla 41

Contenido de fucosa en anticuerpo h1brido anti-CD4 KM4045 0% KM4046 0% KM4047 0% KM4048 0% KM4049 0%

6G5-1 100%

Ejemplo 7

Evaluación de la actividad del anti9Jerpo híbrido anti-CD4

En las siguientes secciones (1) a (4), se llevó a cabo la evaluación de la actividad para los anticuerpos hibridos antiCD4 KM4045 a KM4049 obtenidos en el Ejemplo 6 y 6G5-1 , 6G5-P Y 6G5-113F preparados en el Ejemplo 6(5).

(1) Evaluación de la actividad de unión del anticuerpo híbrido anti-CD4 a CD4 humana recombinante mediante ELlSA de unión

El ELlSA de unión se llevó a cabo como en el mismo procedimiento como se describe en el Ejemplo 2(3). Como anticuerpo primario, se usaron los anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045 a KM4049 obtenidos en el Ejemplo 6, y 6G5-1, 6Gs-P y 6Gs-113F, que se díluyeron 5 veces en serie desde 1llgtml. Los resultados se muestran en la figura

8.

Como resultado, se encontró que todos los anticuerpos hibridos anti-CD4 KM4045 a KM4049, 6G5-1 , 6G5-P Y 6Gs113F se unen a la CD4 humana recombinante. Además, se encontró que los anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045, KM4046, KM4048 Y KM4049 se unen a la CD4 recombinante de forma más fuerte que 6G5-1, 6G5-P Y 6G5-113F.

(2) Evaluación a base de Biacore de la actividad de unión del anticuerpo híbrido anti-CD4 a CD4 humana recombínante

Para analizar cinéticamente la actividad de unión de anti9Jerpos hibridos anti-CD4 KM4045 a KM4049, 6G5-1 Y 6G5-P a CD4 humana recombinante, la actividad de unión se midió mediante el método de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Todas las manipulaciones siguientes se llevaron a cabo usando un Biacore T100 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences). El anticuerpo anti-lgG humana se inmovilizó sobre una matriz sensora CMs (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences) mediante un método de acoplamiento de amina usando un Kit de Captura de anticuerpo humano (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences) segun los protocolos adjuntos al mismo. Se añadió una muestra de ensayo (anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045 a KM4049) para ser capturada sobre la matriz que tiene inmovilizado el anticuerpo anti-lgG humana, para dar 100 RU (unidad de resonancia). Después, se dejó pasar CD4 humana recombinante (fabricada por R&D), diluida a partir de 2500 ng/ml en cinco etapas, a un caudal de 30 ¡..tl/min. sobre la matriz, y se obtuvo el sensograma correspondiente a cada concentración. El análisis se llevó a cabo en el modelo de unión 1:1 usando un software de análisis adjunto al aparato, software de evaluación de Biacore T100 (fabricado por Biacore), calculando de ese modo una constante de velocidad de asociación ka y una constante de velocidad de disociación kd de los anticuerpos respectivos para CD4 humana.

Como resultado, en la Tabla 5 se da una constante de velocidad de asociación ka, una constante de velocidad de disociación kd, y una constante de disociación Ko (kdlka) de anticuerpos individuales así obtenidos.

Como se muestra en la Tabla 5, todos los anticuerpos híbridos KM4045 a KM4049 mostraron una afinidad mayor que la del anticuerpo humano anti-CD4 convencional 6G5-1 .

!Tabla 51

Anticuerpo ka (1/Ms) kd (1/s) Ko (M)

KM4045 3,60 E+05 2,97 E-08· 8,24 E-14 KM4046 8,34 E+05 5,12 E-OS 6,14 E-11 KM4047 1,33 E+06 4,88 E-04 3,69 E-10 KM4Q48 5.85 E-+06 3.81 E-Q3 6.51 E-10 KM4049 5,77 E+06 1,16 E-03 2,00 E-10 6G5-1 5.95 E-+05 8.72 E-04 1,46 E-09 ·KM404s mostró una disociación lenta, y el valor superó un limite medible de una constante de velocidad de

disociación kd (1 x 10. 5) indicado por el marcador en este sistema.

(3) Evaluación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCCl de anticuerpo híbrido anti

CD4 en estirpes celulares de cáncer de la sangre humano

La actividad AOCC de los anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045 a KM4049, 6G5-1, 6G5-P, Y 6G5-113F, en las estirpes celulares de linfoma de células T humano, se midió de la siguiente manera.

(3)..1 Preparación de suspensión celular diana

Las estirpes celulares de linfoma de células T humano HPB-ALL y HUT78 y la estirpe celular de linfoma linfoblástico de células T SUP-T1 se lavaron con PBS, se lavaron con medio RPMI1640 libre de rojo de fenal (fabricado por Invitrogen) que contiene 5% de suero fetal bovino dializado (dFBS, fabricado por Invitrogen) (en adelante denominado en la presente memoria "medio AOCC"), y entonces se suspendieron en el mismo medio para dar una concentración óptima y se usaron como una suspenSión celular diana.

(3)..2 Preparación de suspensión de células efectoras

A partir de sangre periférica humana sana, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de la siguiente manera. A partir de voluntarios sanos, se recogieron 50 mi de sangre periférica humana sana usando una jeringuilla a la que se añadieron 0,5 mi de heparina sódica (fabricada por Shimizu Pharmaceutical). A la sangre periférica recogida se añadió un volumen igual de disolución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Pharmaceutical) para la dilución, seguido de la agitación a conciencia. Después, se dispensaron 4,7 mi de Lymphoprep (fabricado por Axis-Shield) en cada uno de tubos de 15 mi (fabricados por Greiner). La sangre periférica diluida (10 mi) se depositó suavemente en capas sobre el Lymphoprep. A continuación, la capa de células mononucleares se separó mediante centrifugación a 2000 rpm, ruptura, y temperatura ambiente durante 20 minutos. La fracción de células mononucleares así obtenida se lavó dos veces con un medio ADCC, y entonces se suspendió en el mismo medio para dar un recuento celular óptimo, y se usó como una suspensión de células efectoras.

(3)..3 Medida de la actividad ADCC

La actividad ADCC se midió mediante el siguiente procedimiento, usando un Ensayo de Citotoxicidad No Radiactivo CytoTox96 (fabricado por Promega) según las instrucciones adjuntas al mismo.

Se dispensó una disolución de anticuerpo (50 I.¡J/pocillo), en la que cada anticuerpo se diluyó 20 veces en serie a partir de 2 Jlg/ml o 1 Ilg/ml, a una placa de fondo en forma de U de 96 pocillos (fabricada por Falcon). A continuación, se le dispensaron 2,5 x 104 células/50 ¡..tI/pocillo de la suspensión celular diana preparada en la Sección (3)-1. Finalmente, se le dispensaron 2 x 105 célulasf50 IlI/pociIlO de la suspensión de células efectoras preparada en la Sección (3}-2 para dar un volumen total de 150 JlJ, seguido de la reacción a 37°C durante 4 horas. Por lo tanto, el experimento se llevó a cabo a una relación 8:1 de célula efectora (E):célula diana (T). La actividad ADCC se calculó mediante la siguiente fórmula. Los resultados se muestran en la FIG. 9.

(Fórmula)

Actividad ADCC (Ofo ) ={([absorbancia de la muestra] -[absorbancia de liberación espontánea de la célula diana] -[absorbancia de liberación espontánea de célula efectora])/([absorbancia de liberación total de célula diana] [absorbancia de liberación espontánea de célula diana])} x 100

Como resultado, el anticuerpo humano anti-C04 convencional 6G5-1 no mostró actividad ADCC sobre la estirpe celular de linfoma de células T humano HPB-ALL, mientras que 6G5-P y 6G5-113F, al que una fucosa central no estaba unida a la cadena de azúcar enlazada mediante N-glicósido de tipo complejo de la región Fe del anticuerpo, mostraron actividad AOCC elevada. Por otro lado, la actividad ADCC de 6G5-P y 6G5-113F fue casi la misma (figura 9A). Estos resultados son consistentes con los resultados descritos en el documento US 7.214.775 y en Cancer Res 2008; 68: (10): 3863-72.

Además, todos los anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045, KM4046, KM4047, KM4048 Y KM4049 de la presente invención exhibieron una actividad ADCC elevada igualo mayor que 6G5-P sobre las estirpes celulares de linfoma de células T humano HUT78 y la estirpe celular de linfoma linfoblástico de células T humano SUP-T1 (figuras 9B y C). Además, todos los anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045, KM4046, KM4048 Y KM4049 exhibieron una actividad ADCC mayor que 6G5-113F sobre la estirpe celular de linfoma de células T humano HPB-ALL (figura 90).

A partir de estos resultados, se demostró Que todos los anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045, KM4046, KM4047, KM4048 Y KM4049 de la presente invención exhibieron actividad ADCC elevada igual o mayor que el anticuerpo humano anti-CD4 convencional.

(4) Evaluación de la citotoxicidad celular dependiente del complemento (actividad CDC) del anticuerpo híbrido antiCD4 sobre transfectante de CD4 y sobre la estirpe celular de linfoma de células T humano

La actividad COC de los anticuerpos híbridos anti-CD4 KM4045 a KM4049 sobre el transfectante de CD4 construido en el Ejemplo 1 y sobre la estirpe celular de linfoma de células T humano HPB-ALL se midió de la misma manera como en el Ejemplo 4(3).

Como resultado, el anticuerpo humano anti-C04 convencional 6G5-1 y el anticuerpo humano anti-CD4 convencional 6G5-113F que tiene un Fc de tipo 113F con un intercambio de dominio parcial de Fc de IgG1 en Fc de IgG3 no mostraron actividad CDC sobre el transfectante de CD4, mientras que todos los anticuerpos híbridos anti-C04 KM4045, KM4046, KM4047, KM4048 Y KM4049 de la presente invención mostraron una actividad CDC (figura 10A). Por otro lado, el anticuerpo humano anti-C04 convencional 6G5-113F que tiene una Fc de tipo 113F con un intercambio de dominio parcial de Fc de IgG1 en Fc de IgG3, el anticuerpo de ratón anti-C04 convencional OKT4, y los anticuerpos híbridos anti-C04 KM4045 y KM4046 de la presente invención no mostraron actividad COC sobre la estirpe celular de linfoma de células T humano HPB-ALL, y solamente el anticuerpo híbrido anti-CD4 KM4049 de la presente invención mostró una actividad COC sobre la estirpe celular de linfoma de células T humano (figura 10B).

Ejemplo 8

Preparación de anticuerpo humanizado

(1) Diseño de secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpo humanizado anti-C04

Una secuencia de aminoácidos de VH de un anticuerpo humanizado anti-CD4 se diseñó de la siguiente manera. En primer lugar, a fin de injertar las secuencias de aminoácidos de CDR1 a COR3 de un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4065VH representadas por SEC ID NOs: 27 a 29, se seleccionó la secuencia de aminoácidos de FR de VH de un anticuerpo humano. Usando como sistema de análisis de secuencia el paquete GCG (fabricado por Genetics Computer Group), se recuperó mediante el método de BLASTP [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997)], en base a la base de datos de aminoácidos de proteínas convencionales, un anticuerpo humano que tiene una homología elevada con el anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4065. Cuando la puntuación de la homologia se comparó con la homologia de una secuencia de aminoácidos real, nO de acceso de base de datos SWISSPROT AAC18328, la autorreactividad y la expresión del gen VH de la inmunoglobulina en seres humanos envejecidos (en adelante denominada en la presente memoria "AAC18328") mostraron una homología de 84,2%. Puesto que fue un anticuerpo humano el que tuvo la homologia más elevada, se seleccionó la secuencia de aminoácidos de FR de este anticuerpo. Con respecto a la secuencia de aminoácidos de FR de AAC18328, mostró una supresión de un resto de aminoácido (el primer resto) en el término N del anticuerpo secretor dado a conocer por Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological lnterest, US Oepl. Healih and Human Services (1991)1. Para el resto en la primera posición, se seleccionó Glu, que es un resto de aminoácido exhibido por el anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4065. Además, con respecto a Val en la posición 11', Val se sustituyó por Leu, que fue un resto de aminoácido que apareció a una frecuencia elevada en la secuencia del anticuerpo humano y que se exhibía en el anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4065. Puesto que estos restos de aminoácidos se encuentran a una frecuencia elevada en cualquier secuencia de anticuerpo humano [Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Service (1991)], no se construyen como desviados de la secuencia de anticuerpo humano.

Las secuencias de aminoácidos de las CDRs de VH del anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4065 representadas por SEC ID NOs: 27 a 29, respectivamente, se injertaron en una poSición apropiada de la secuencia de aminoácidos asi determinada de FR del anticuerpo humano. De esta manera, se diseñó la secuencia de aminoácidos HVO de VH de un anticuerpo humanizado anti-CD4 representada por SEC ID NO: 77.

A continuación, se diseñó una secuencia de aminoácidos de VL de un anticuerpo humanizado anti-CD4 de la siguiente manera.

Se seleccionó una secuencia de aminoácidos de FR de VL de un anticuerpo humano para injertar las secuencias de aminoácidos de CDR1 a COR3 de un anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4065VL representadas por SEC ID NOs: 30 a 32, respectivamente. Kabat et al. han clasificado VL de diversos anticuerpos humanos convencionalmente conocidos en cuatro subgrupos (HSG I a IV) en base a la homologia de sus secuencias de aminoácidos, y dieron a conocer las secuencias de consenso para cada uno de los [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Oepl. Health and Human Services (1991)1. En consecuencia, se examinó la homologia entre la secuencia de aminoácidos de FR de las secuencias de consenso de los subgrupos I a IV de VL del anticuerpo humano y la secuencia de aminoácidos de FR de VL del anticuerpo de rata anti-CD4 KM4065.

Como resultado de recuperar la homología, la secuencia de aminoácidos de FR de KM4065VL tuvo una homología elevada de 72,2% con HSGI. En base a estos resultados, la secuencia de aminoácidos de COR de VL del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD4 KM4065 se injertó en una posición apropiada de una secuencia de aminoácidos de FR de la secuencia de consenso del subgrupo I de VL del anticuerpo humano. Sin embargo, puesto que Leu en la poSición 24 y Leu en la posición 128 en la secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo monoclonal de rata antiCD4 KM4065 representada por SEC ID NO: 22 no son los restos de aminoácidos que tienen la frecuencia de uso más elevada en la región que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la FR del anticuerpo humano citada

por Kabat et al., sino que son los restos de aminoácidos que se usan a una frecuencia relativamente elevada, se usaron los restos de aminoácidos mencionados anteriormente que se reconocen en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monocional de rata anti-CD4 KM4065. De esta manera, se diseñó la secuencia de aminoácidos lVO de Vl de un anticuerpo humanizado anti-CD4 representada por SEC ID NO: 78.

la secuencia de aminoácidos HVO de VH y la secuencia de aminoácidos lVO de Vl del anticuerpo humanizado antiC04 diseñado en lo anterior son secuencias en las que la secuencia de aminoácidos de COR del anticuerpo monocional de rata anti-C04 KM4065 sola se injertó en la secuencia de aminoácidos de FR del anticuerpo humano seleccionada, pero en general, cuando se prepara un anticuerpo humanizado, su actividad de unión se reduce frecuentemente en el caso de meramente un simple injerto de una secuencia de aminoácidos de CDR de un anticuerpo de ratón a una FR de anticuerpo humano. Por estas razones, a fin de evitar la disminución de la actividad de unión, se llevaron a cabo, junto con el injerto de las secuencias de aminoácidos de COR, modificaciones de los restos de aminoácidos que se consideran que tienen una influencia sobre la actividad de unión, entre los restos de aminoácidos de FR que son diferentes entre los anticuerpos humanos y los anticuerpos de ratón. De este modo, también en este ejemplo, los restos de aminoácidos de FR que se consideran que tienen una influencia sobre la actividad de unión se identificaron de la siguiente manera.

En primer lugar, usando una técnica de modelado por ordenador, se construyó una estructura tridimensional de una región V de anticuerpo (HVOLVO) que consiste en la secuencia de aminoácidos HVO de VH y la secuencia de aminoácidos LVO de Vl del anticuerpo humanizado anti-C04 diseñado en lo anterior. la preparación de las coordenadas de la estructura tridimensional se llevó a cabo usando un software AbM (fabricado por Oxford Molecular) segun las instrucciones adjuntas al mismo, y se llevó a cabo la presentación de la estructura tridimensional usando un software Pro-Explore (fabricado por Oxford Molecular) o Viewerlite (fabricado por Accelrys) segun las instrucciones adjuntas al mismo. Además, también se construyó de la misma manera un modelo por ordenador de la estructura tridimensional de la región V del anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4065. Además, construyendo de forma similar un modelo de estructura tridimensional que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que los restos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de FR de VH y VL de HVOLVO, que son diferentes de aquellos del anticuerpo de rata anti-C04 KM4065, se seleccionaron y modificaron en los restos de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4065, se compararon las estructuras tridimensionales de las regiones V del anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4065, de HVOLVO y del producto modificado, con lo que se identificaron los restos de aminoácidos que se predice que tienen una influencia sobre la actividad de unión del anticuerpo.

Como resultado, como los restos de aminoácidos entre los restos de aminoácidos de FR de HVOLVO , que se considera que cambian una estructura tridimensional de la región de unión al antígeno y por lo tanto tienen una influencia sobre la actividad de unión del anticuerpo, se seleccionaron respectivamente Leu en la posición 18, Val en la posición 93, Ala en la posición 97, y Thr en la posición 114 en la secuencia de HVO, y Ala en la posición 13, Val en la posición 15, Val en la posición 19, Ala en la posición 47, Val en la posición 62, y Leu en la posición 82 en la secuencia de LVO. Modificando al menos uno o más restos de aminoácidos de estos restos de aminoácidos seleccionados en los restos de aminoácidos que están presentes en las mismas posiciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de rata anti-C04 KM4065, se diseñaron VH y Vl de un anticuerpo humanizado que tiene diversas modificaciones. Específicamente. con respecto a la VH del anticuerpo. se introdujo al menos una modificación entre las modificaciones de aminoácidos para sustituir leu en la posición 18 por Met, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 114 por lIe, en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 77. Además, con respecto a la Vl del anticuerpo, se introdujo al menos una modificación entre las modificaciones de aminoácidos para sustituir Ala en la posición 13 por Val, Val en la posición 15 por Leu, Val en la posición 19 por Ala, Ala en la posición 47 por Gln, Val en la posición 62 por lIe, y Leu en la posición 82 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 78.

Diseñando las secuencias de aminoácidos de regiones variables de HV2LVO, HV3LVO, HV4lVO, y HV4lV6 con modificaciones de al menos uno de los restos de aminoácidos presentes en FR de HVOLVO, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena H HV2, HV3 Y HV4, y de la región variable de la cadena L lV6 se representaron mediante SEC ID Nas: 96, 98, 100 Y 102, respectivamente.

(2) Preparación y evaluación de anticuerpo humanizado anti-CD4

Se construyó en células de mamifero un AON que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo humanizado anti-C04 usando un codón que se usó a una frecuencia elevada, cuando se lleva a cabo una modificación o modificaciones de aminoácidos usando un codon que se usa como un AON que codifica la secuencia de aminoácidos de VH o VL del anticuerpo monodonal de rata anti-CD4 KM4065. las secuencias de AON que codifican la secuencia de aminoácidos de HVO y LVO del anticuerpo humanizado anti-C04 se representaron mediante SEC ID NOs:93 y 94, respectivamente, mientras que las secuencias de ADN que codifican las secuencia de aminoácidos de regiones variables HV2, HV3, HV4, Y LV6 en las que se introdujeron una modificación o modificaciones de aminoácidos se representaron mediante SEC ID Nas: 95, 97, 99 Y 101, respectivamente. Cada secuencia de ADN se construyó mediante la síntesis completa. Al igual que en el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 6, el ADN de la síntesis completa que codifica cada región variable se insertó en el vector de expresión del

anticuerpo humanizado pKANTEX93 para construir un vector de expresión de anticuerpo humanizado anti-CD4. El vector de expresión de anticuerpo humanizado anti-CD4 construido se introdujo en una célula de animal para expresar un anticuerpo humanizado, preparando de ese modo anticuerpos humanizados anti-CD4 HVOLVO, HV2LVO, HV3LVO, HV4LVO y HV4LV6.

Cuando la actividad de unión de los anticuerpos humanizados anti-CD4 obtenidos se midió usando un Biacore T100, todos los anticuerpos humanizados anti-CD4 preparados HV2LVO, HV3LVO, HV4LVO y HV4LV6 exhibieron una actividad de unión igual a o 112 o mayor que la del anticuerpo híbrido anti-CD4 KM4045. Por lo tanto, se preparó un anticuerpo humanizado anti-CD4 que tiene una actividad de unión elevada.

Ejemplo 9

Evaluación de la actividad de unión de anticuerpo humanizado

La evaluación de la actividad de unión se llevó a cabo para los anticuerpos humanizados antí-CD4 HVOLVO, HV2LVO, HV3LVO, HV4LVO y HV4LV6 preparados según el método descrito en el Ejemplo 8.

(1) Evaluación en base a Biacore de la actividad de unión de anticuerpo humanizado anti-CD4 a CD4 humana recombinante

La medida de la actividad de unión se llevó a cabo según el método descrito en el Ejemplo 7(2). En la Tabla 6 se mostraron la constante de velocidad de asociación ka, la constante de velocidad de disociación kd y la constante de disociación Ko (kdlka) de los anticuerpos respectivos así obtenidos.

Como resultado, los anticuerpos humanizados HVOLVO, HV2LVO, HV3LVO, HV4LVO, y HV4LV6 mantuvieron una actividad de unión muy fuerte de 1 x 10-10 M o mayor. Esta fue una actividad de unión equivalente a la del anticuerpo híbrido KM4045. Y la actividad de unión fue mayor que la de 6G5-1.

[Tabla 6J

anticuerpo: ka (1/Ms) kd (1/s) Ko (M)

KM4045: 5,41E+05 < 1E-OS" < 1,84E-11"

HVOLVO: 1,47E+06 2,86E-05 1,95E-11

HV2LVO: 1,14E+06 < 1E-OS" < 8,77E-12"

HV3LVO: 1,33E+06 < 1E-OS" < 7,52E-12"

HV4LVO: 7,91E+05 < 1 E-OS" < 1,26E-11"

HV4LV6: 4,03E+05 < 1E-OS" < 2,48E-11"

6G5-1: S,34E+OS 8,24E-04 1,54E-09

• Puesto que KM4045, HV2LVO, HV3LVO, HV4LVO, Y HV4LV6 exhibieron una disociación baja, los valores excedieron un limite medible de una constante de velocidad de disociación kd (1 x 10-5) indicado por el marcador en este sistema.

(2) Evaluación de la actividad de unión a estirpe celular de linfoma de células T positiva para CD4 usando citómetro de flujO

Se evaluó la reactividad de diversos anticuerpos anti-CD4 a células. Como anticuerpos para la evaluación, se usaron el anticuerpo híbrido KM4045, los anticuerpos humanizados HVOLVO, HV2LVO, HV3LVO, HV4LVO y HV4LV6, y los anticuerpos humanos 6G5-1 y 6G5-P.

Para inhibir la unión no específica de un anticuerpo de ensayo, se añadió una IgG humana (fabricada por Sigma) a una concentración final de 1 mglml a 1 a 5 x 105 células de la estirpe celular de linfoma de células T humano HPBALL. Además, se diluyeron apropiadamente diversos anticuerpos anti-CD4 con BSA-PBS y se añadieron para dar un volumen total de 50 111. la suspensión celular resultante se hizo reaccionar en hielo durante 90 minutos, y se lavó dos veces con BSA-PBS. A las células, se añadieron 50 111 de un anticuerpo anti-Fc de IgG humana marcado con F1TC (fabricado por Acris) diluido con BSA-PBS, seguido de la reacción en hielo durante 90 minutos. Las células se lavaron una vez con BSA-PBS y entonces se suspendieron en BSA-PBS. La intensidad de la fluorescencia se midió mediante un citómetro de flujo (fabricado por Beckman Coulter). La figura 11 muestra la intensidad de fluorescencia media (valor de MFI) cuando el anticuerpo se hizo reaccionar a una concentración de 6,7, 0,67 y 0,067Ilg/ml. Todos los anticuerpos humanizados anti-CD4 se unieron a la estirpe celular positiva para CD4 de una manera dependiente de la concentración del anticuerpo. Cada uno de los grados de unión fue equivalente al del anticuerpo híbrido KM4045.

Ejemplo 10

Evaluación de eficacia medicinal in vitro de anticuerpo humanizado HV2LVO

El anticuerpo humanizado anti-CD4 HV2LVO preparado en el Ejemplo 8 se denomina en la presente memoria en adelante como KM804-5. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) del anticuerpo humanizado anti-CD4 sobre una estirpe celular de cáncer de sangre humano se evaluó según el método descrito en el Ejemplo 7(3). Como célula diana, se usaron tres tipos de células, es decir, las estirpes celulares de linfoma de células T humano HPB-ALl, HUT78, y CCRF-CEM. Además, como anticuerpo, se usó el anticuerpo humanizado KM8045, el anticuerpo híbrido KM404-5, y los anticuerpos humanos 6G5-1 y 6G5-P.

Como resultado, el anticuerpo humanizado KM8045 exhibió, en cualquier estirpe celular, una actividad ADCC elevada equivalente a la del anticuerpo híbrido KM4045, y también exhibió una actividad ADCC igualo mayor que la de 6G5-P. 6G5-1 exhibió solamente una actividad ADCC débil sobre HPB-ALL y HUT78, y no exhibió actividad ADCC sobre CCRF-CEM (figura 12).

Ejemplo 11

Evaluación de eficacia medicinal in vivo de anticuerpo humano KM8045

(1) Modelo de cáncer de ratón de etapa temprana usando como diana la estirpe celular de linfoma de células T humano HH

La estirpe celular de linfoma de células T humano cultivada in vitro HH se suspendió a una densidad de 1 x 108 células/mi en medio RPMI1640 (Gibco BRL). Se trasplantaron subcutáneamente 100 ).11 (1 x 107 célulaslratón) de la suspensión en el abdomen derecho de ratones SCID (machos, 8 semanas, adquiridos de CLEA Japan). El anticuerpo humanizado anti-CD4 KM8045 o el anticuerpo humano anti-CD4 6G5P se diluyó para dar 1 Ilg/100 Illfcabeza, y se administró intravenosamente a los ratones en los Días O, 3 Y 5, tres veces en total. Al grupo de control negativo se le administró PBS sola. El día del trasplante del tumor se tomó como Día O, y el diámetro de la masa tumoral se midió día a día usando calibradores vernier. El volumen tumoral se calculó según la siguiente fónnula:

Volumen Tumoral = Anchura x Anchura x Longitud x 0,5

En la figura 13 se muestran los cambios a lo largo de los días en el valor medio del volumen tumoral de cada grupo. Como se muestra en la figura 13, el grupo al que se le administró 6G5-P mostró efectos antitumorales solamente débiles en comparación con el grupo de control negativo, mientras que el grupo al que se le administró KM8045 exhibió efectos antitumorales significativos.

A partir de estos resultados, se demostró que el anticuerpo humanizado anti-CD4 KM8045 tiene mayores efectos antitumorales que 6G5-P sobre el modelo de cáncer de ratón de etapa temprana en el que se usa como diana una célula HH.

(2) Modelo de metástasis de ratón usando como diana EL4 que expresa CD4

CD4/EL4, construida en el Ejemplo 1(3), se cultivó in vitro y se suspendió a una densidad de 1 x 106 células/mi en medio RPMI1640 (Gibco BRL). Se trasplantaron 100 Illfcabeza (1 x 105 célulasfcabeza) de la suspensión celular en la vena de la cola de ratones C57BU6 (machos, 8 semanas, adquiridos de CLEA Japan). El día del trasplante del tumor se definió como Dia O, y en el Dia 1. Cada uno del anticuerpo humanizado anti-CD4 KM8045 y de los anticuerpos humanos anti-CD4 6G5-P y 6G5-1 se preparó para que tuviesen 0,2 Ilgf100 Illfcabeza y 2 ).Igf100 Illfcabeza, y entonces se administraron intravenosamente a una dosis de 100 ).IJfcabeza a los ratones. Al grupo de control negativo se le administró PBS sola, o un anticuerpo de control de isotipo. En el Dia 14, se midió el peso corporal de todos los ratones, y los ratones se sacrificaron mediante exsanguinación bajo anestesia con éter, seguido de la dislocación cervical. Después, el hígado y el riñón se recogieron y se pesaron. Entonces, se calculó como porcentaje la relación del peso del hígado y del peso del riñón con respecto al peso corporal de los ratones individuales (en adelante denominada en la presente memoria "relación del peso del hígado' y "relación del peso del riñón"). La evaluación de los efectos antitumorales se llevó a cabo comparando las relaciones de los pesos del hígado y del riñón de cada grupo, que aumentó debido a la metástasis de las células tumorales, con las relaciones de los pesos del hígado y del riñón medidas al mismo tiempo (valor medio de tres ratones) de ratones sanos a los que no se les habia trasplantado el tumor. En las figuras 14A y 14B, respectivamente, se muestran la relación del peso del hígado y la relación del peso del riñón de cada grupo. Como se muestra en las figuras 14A y 14B, el grupo al que se le administró 6G5-1 no exhibió efectos antitumorales con respecto al grupo de control negativo, mientras que el grupo al que se le administró 6G5-P y el grupo al que se le administró KM8045 exhibieron efectos antitumorales. Además, se reconocieron efectos antitumorales más potentes en el grupo al que se le administró KM8045 que en el grupo al que se le administró 6G5-P.

A partir de estos resultados, se demostró que KM8045 tiene efectos antitumorales mayores que 6G5-1 y 6G5-P sobre el modelo de metástasis de ratón cuando se usa como diana CD4fEL4.

(3) ModelQ de cáncer progresivQ de ratón usandQ comQ diana la estirpe celular de linfoma de células T humanQ HH

Al igual que con el Ejemplo 11(3), la estirpe celular HH cultivada in vitro se suspend ió a una densidad de 1 x 108 células/mi en mediQ RPMI1640 (Gibco BRL). Se trasplantaron subcutáneamente 100 l1J1cabeza (1 x

107 células/cabeza) de la suspensión en el abdQmen derechQ de ratones SCIO (machos, 8 semanas, adquiridQs de CLEA Japan). En el Oia 6 en el que el volumen tumoral tuvo un promedio de 60 mm3, los ratones se agruparon. El anticuerpo humanizado anti-C04 KM8045 se diluyó con PBS para dar una dosis de 20,100, Y 200 119/100 l1J1cabeza, y se administró intravenosamente a los ratones dos veces a la semana, seis veces en total. Al grupo de control negativo se le administró PBS sola. El dia del trasplante del tumor se definió como Oia O, y el diámetro de la masa tumoral se midió día a día usandQ calibradores vernier. El volumen tumoral se calculó según la siguiente fórmula:

Volumen Tumoral = Anchura x Anchura x Longitud x 0,5

En la figura 15 se muestran los cambios a lo largo de los dias en el valor medio del volumen tumoral de cada grupo. Como se muestra en la figura 15, el grupo al que se le administró KM8045 exhibió efectos antitumorales. A partir de la observación de que el efecto antitumoral en el grupo de 200 Ilg/cabeza es mayor que en los grupos de 20 Ilg/cabeza 7100 I1g/cabeza, se confirmaron los efectos antitumorales dependientes de la dosis.

A partir de estos resultados, se demostró que el anticuerpo humanizado anti-C04 KM8045 también tuvo efectos antitumorales sobre el modelo de cáncer progresivo en el que se usó como diana una célula HH.

Aplicabilidad industrial

La presente invención puede proporcionar un anticuerpo monocional que se une a una región extracelular de C04 humana con afinidad elevada y también exhibe una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o citotQxícidad dependiente del complemento elevadas; un AON que codifica el anticuerpo; un vector que contiene el AON; un transforrnante obtenible mediante la introducción en el vector: un procedimiento para producir un anticuerpo usandQ el transformante: y el uso del anticuerpo para la fabricación de un agente terapéutico o un agente de diagnóstico.

Texto libre en el lisiado de secuencias

SEC ID NO:27 : HCDR1 de KM4065

SEC ID NO:28 : HCDR2 de KM4065

SEC ID NO:29 : HCDR3 de KM4065

SEC ID NO:30 : LCDR1 de KM4065

SEC ID NO:31 : LCDR2 de KM4065

SEC ID NO:32 : LCDR3 de KM4065

SEC ID NO:33 : HCDR1 de KM4066

SEC ID NO:34 : HCDR2 de KM4066

SEC ID NO:35 : HCDR3 de KM4066

SEC ID NO:36 : LCDR1 de KM4066

SEC ID NO:37 : l CDR2 de KM4066

SEC ID NO:38 : LCDR3 de KM4066

SEC ID NO:39 : HCDR1 de KM4067

SEC ID N0:40 : HCDR2 de KM4067

SEC ID NO:41 : HCDR3 de KM4067

SEC ID N0:42 : LCDR1 de KM4067

SEC ID NO:43 : LCDR2 de KM4067

SEC ID N0:44 : LCDR3 de KM4067

SEC ID NO:45 : HCDR1 de KM4068

SEC ID NO:46 : HCDR2 de KM4068

SEC ID N0:47 : HCDR3 de KM4068

SEC ID N0:48 : LCDR1 de KM4068

SEC ID NO:49 : l CDR2 de KM4068

SEC ID NO:50 : l CDR3 de KM4068

SEC ID NO:51 : HCDR1 de KM4069

SEC ID NO:52 : HCDR2 de KM4069

SEC ID NO:53 : HCDR3 de KM4069

SEC ID NO:54 : l CDR1 de KM4069

SEC ID NO:55 : LCDR2 de KM4069

SEC ID NO:56 : l CDR3 de KM4069

SEC ID NO:57 : cebadQr híbrido 1 de KM4065VH

SEC ID NO:58 : cebadQr híbridQ 2 de KM4065VH

SEC ID NO:59 : cebador híbrido 1 de KM4065VL

SEC ID NO:60 : cebadQr híbridQ 2 de KM4065VL

SEC ID NO:61 : cebador híbrido 1 de KM4066VH

SEC ID NO:62 : cebador hibrido 2 de KM4066VH SEC ID NO:63 : cebador hibrido 1 de KM4066VL SEC ID NO:64 : cebador hibrido 2 de KM4066VL SEC ID NO:65 : cebador hibrido 1 de KM4067VH

5 SEC ID NO:66 : cebador hibrido 2 de KM4067VH SEC ID NO:67 : cebador hibrido 1 de KM4067VL SEC ID NO:68 : cebador hibrido 2 de KM4067VL SEC ID NO:69 : cebador hibrido 1 de KM4068VH SEC ID NO:70 : cebador hibrido 2 de KM4068VH

10 SEC ID NO:71 : cebador hibrido 1 de KM4068VL SEC ID NO:72 : cebador hibrido 2 de KM4068VL SEC ID NO:73 : cebador hibrido 1 de KM4069VH SEC ID NO:74 : cebador hibrido 2 de KM4069VH SEC ID NO:75 : cebador hibrido 1 de KM4069VL

15 SEC ID NO:76: cebador hibrido 2 de KM4069VL SEC ID NO:77 : secuencia de aminoácidos de HVO de KM4065 SEC ID NO:78: secuencia de aminoácidos de l VO de KM4065 SEC ID NO:79 : Cebador 1 del vector de expresión de C04 SEC ID NO:80 : Cebador 2 del vector de expresión de C04

20 SEC ID NO:81 : Cebador 1 del vector de expresión de C04-Fc SEC ID NO:82 : Cebador 2 del vector de expresión de C04-Fc SEC ID NO:83 : Cebador 1 de 6G5Vl SEC ID NO:84 : Cebador 2 de 6G5Vl SEC ID NO:85 : Cebador 3 de 6G5Vl

25 SEC ID NO:86 : Cebador 4 de 6G5Vl SEC ID NO:87 : Cebador 5 de 6G5Vl SEC ID NO:88 : Cebador 6 de 6G5Vl SEC ID NO:89 : Cebador 1 de 6G5VH SEC ID NO:90 : Cebador 2 de 6G5VH

30 SEC ID NO:91 : Cebador 3 de 6G5VH SEC ID NO:92 : Cebador 4 de 6G5VH SEC ID NO:93 : secuencia de AON de HVO de KM4065 SEC ID NO:94: secuencia de AON de LVO de KM4065 SEC ID NO:95 : secuencia de AON de HV2

35 SEC ID NO:96 : secuencia de aminoácidos de HV2 SEC ID NO:97 : secuencia de AON de HV3 SEC ID NO:98 : secuencia de aminoácidos de HV3 SEC ID NO:99 : secuencia de AON de HV4 SEC ID NO:100: secuencia de aminoácidos de HV4

40 SEC ID NO:101 : secuencia de ADN de LV6 SEC ID NO:102: secuencia de aminoácidos de LV6

Listado de secuencias

45 <110> Kyowa Hakko Kirin Co. , Ud.

<120> Anticuerpo anti-C04

<130> 1001P12020

<150> JP 2008-331904

<151> 2008-12-26

55 <160::> 102

<170::> Patentln version 3.3

<210::> 1 60 <211::>458 <212::> PRT

<213> Homo sapiens

<400::> 1

Met Asn Arq Gly Val Pro Phe Arq His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15

Ala Leu Ley Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys

20 25 30

Lys Gly Asp Thr Val Glu Ley Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 35 40 45

Ile Gln Phe Bis Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 55 60

Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg ~a 65 70 75 80

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95

Lys Asn Ley Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105 110

Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125

Ser As? Thr Ris Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140

Ser Pro Pro Gly S..r Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Cly 145 150 155 160

Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu 165 170 175

Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr eys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys 180 185 190

Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser

'" '" '"

Ser 11. Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220

Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240

Gl n Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phs Asp Leu 245 250 255

Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu 260 265 270

Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu H~s Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu 275 280 285

Pro Gln Tyr Ala Gl y Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Gl u Ala Lys 290 295 300

Thr Gly Lys Leu Mis Gl n Glu Val Asn L.u Val Val Mat Arq Ala Thr 305 310 315 320

Gln Leu Gln Lys ASo Leu Thr eys Gl u val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Clu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350

Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Lau Asn Pro Glu Ala Gly Mat Trp 355 360 365

Gln eys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Cln V~l Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile 385 390 395 400

Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile 405 410 415

Phe Phe eys Val Arg ey. Arg His Arg Arg Arg Gln Al a Glu Arq Met 420 425 430

Ser Gln Ile Lys Arq Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr eys Gln CyS Pro 435 440 445

His Arq Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile

450 455

<210> 2

<211> 1377

<212> AON

<213> Horno sapiens

<400> 2

atgaaccggg gagtcccttt taggcacttg cttctggtgc tgcaactggc gctcctccca gcagccactc agggaaagaa agtggtgctg ggcaaaaaag gggatacagt ggaactgacc tgtacagctt cccagaagaa gagcatacaa ttccactgga aaaactccaa ccagataaag attctgggaa atcaggqctc cttcttaact aaaggtccat ccaagctgaa tgatcgcgct gactcaagaa gaagcctttg ggaccaagga aactttcccc tgatcatcaa gaatcttaag atagaagact cagatactta catctgtgaa gtggaggacc ag4agg4gga ggtgcaattg ctagtgttcg gattgactgc caactctga.c acccacctgc ttcaggggca gagcctgacc ctgaccttgg agagcccccc tggtagtagc ccctcagtgc aatgtaggag tccaaggggt aaaaacatac agggggqgaa gaccctctcc gtgtctcagc tggagctcca ggatagtggc acctggacat gcactgtctt gcagaaccag aagaaggtgq aqttcaaaat agacatcgtg gtgctagctt tccagaaggc ctccagcata gtctataaga aagaggggga acaggtggag ttctccttcc cactcgcctt tacagttgaa aagctgacgg gcagtggcga gctgtggtgg caggcqgaga gggcttcctc ctccaagtct tggatcacct ttgacctgaa gaacaaggaa gtgtctgtaa aacgggttac ccaggaccct aagctccaga tgggcaagaa gctcccgctc cacctcaccc tgccccaggc cttgcctcag tatgctggct ctggaaacct caccctggcc cttgaagcga aaacagqaaa qttgcatca.g gaagtgaacc tgqtqgtgat ga.gagccact

cagctccaga aaaatttgac ctgtgaggtg tggggaccca cctcccctaa gctgatgctg agcttgaaac tggagaacaa ggaggcaaag gtctcgaagc gggagaaggc ggtgtgggtg ctgaaccctq aqgcqqqgat qtqgca.gtgt ctqctqa.qtq a.ctcgqqaca. gqtcctqctq qa.atccaaca tcaaggttct gcccacatqq tccaccccgg tgcagccaat qgccctgatt gtgctggggg gcgtcgccgg cctcctgctt ttcattgggc taggcatctt cttctgtgtc aggtgccggc accqaaqgcg ccaagcagag cggatgtctc agatcaagag actcctcaqt qagaagaaga cctqccaqtg ccctcaccgg tttcagaaga catgta.gccc catttga

<210> 3

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador específico de IgG1 de rata

<400> 3 15 gtacatatac aaggcttgca atcacctcc

<210> 4

<211> 26

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador específico de IgG2a de rata

25 <400> 4 ccacaaggat tgcattccct tggcac

'00

"O

720 780

O"

960 1020 1080 1140 1200 1260

1:320 1377

29

26

5: <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artifidal: cebador específico de IgG2b de rata

10: <400> 5 gggcatgtag ggcatttgtg tccaatgc 28

15: <210> 6 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador específico de IgG kappa de rata <400> 6 cctgttgaag ctcttgacga cgggtgagg 29

25: <210> 7 <211> 417 <212> ADN <213> Rattus norvegicus

<400> 7 atggacatca ggctcaqctt qgctttcctt gtccttttca taaaaggtqt ccagtgtgag: 60

gtgcaactgg tagagtctgg gggcggttta gtgcagcctg gaaggtccat gaaactctcc: 120

tgtgcagcct caggattcac tttcagtaa.c ta.tggcatgq cctqggtccg ccaggctcca: lBO

acgaaggggc tggagtqqgt tqcaaccatt agttatqatq qaaqtatcac ttattatcga: 240

gactccqtga aggqccqatt cacti!ltctcc agaqatcAtg Ci!laAi!lagcac cctAtacctg: 300

caaatqaaca gtctgaggtc tgaqgacacg gccacttatt actgtacaag agaggaacaa: 360

30: tataqcaqct qqt"-ctttq"-ettetqqqqe eeaqqaat"-"-tqqteaeeqt qtcetea 417

35: <210> 8 <211> 429 <212> ADN <213> Raftus norvegicus

<400> 8 atgaatttea gcaaeacett qgtttteett ttgtttcttt taaaaqqtat ectgtgtgag: 60

qtqcaqctqq aqqagtctqq aqqaqqctta qtqcaqcctq qaaqqtccct qaaactctc:c:: 12.

tgtttaqc:c:t c:tqqattcac: tttcagtaac tatqqaatqa ac:tqqattcg ccaggctc:c:a: 1SO

gggaaqqqac tqgaqtqggt tgcatctatt agtqqtaqta qcacttacat ctactatgca: 240

gacacaqtga agggccgatt: caccatctec aqagaaaatg ccqagaacac cctttacctg 300

caaatgacca gtctgaggtc tgaagacact qccttgtatt actgtqctaq agaggqgtct: 360

tctacggatc gttacta.cga qgtttcgttt qccta.ctggg gccaaqqcac tctggtca.ct: 42'

qtctcttca: 429

40: <210> 9 <211> 417 <212> ADN

<213> Raftus norvegicus

<400> 9 atgggatgga tctgtatcat

aagctqctgc agtctggggc

aaagcttctg gttatacatt

aagagccttg agtqqattqq

aaattc.llagg gca.llggccac

ctcagc.llgat tgacatctga

5 10: tacgg.llttag gct.llctttga <210> 10 <211>414 <212> AON <213> Rattus norvegicus <400> 10 atggctgtcc tggtgctgtt

gtgcaactaa aggagtcagg

tgcactgtct ctgqgttatc

qqaaaqqgtc tgg.llgtqgat

gctatcaaat c:ccqactgaq

atgaacagtc: tgc:aaactga

tataacttcc cctttgatta

15: <210> 11 <211>414 <212> AON <213> Raftus norvegicus

<400> 11 atggctgtcc: tggtgctgtt

gtgc:a.llctaa agg.llqtcagg

tgcactgtct ctqqgtcatc:

ggaaaqggtc tggagtggat

gctatc.llaat cccgactgag

atqaacaqtc tgc.llaactqa

20: tattacttcc: cctttgatta

25: <210> 12 <211> 139 <212> PRT <213> Raftus norvegicus

ctttcttgtg gcaacagcta caggtgtcca tgc:ac:tggtg aagcctggag cctctgtgaa cac:tgactac tgggtgcact gggtgu.gca gqaaatttat cctaataata atactactaa attgactgt.a gac.llaattca ccagcacagc ggactctgca atctatt.llct qtacaagagg tcactggggc caaggaqtca tggtcacagt

gc:tctgcctg ttgatatttc caagctgtgt acctggtctg gtacagccat cacagaccct attaaccagc aatagtgt.lla qctqgattcg gqqaat.llata tggaqtaatg gaqacacaga catc:agcagg qac:ac:c:tcqa aqagccaaqt agacac:agcc: atgtac:ttct gtgccaatc:c: ctggggccaa ggagtcatgg tcacagtctc

gctctgcctg ttgatatttc caagctgtgt gcctggtctg qtacagcc.llt cacagacc:ct tttaac:c:agc: aatagtgtaa qc:tqqattc:q gggagtaatt tggagta.lltg gagacgcaga catcagcagg gac.llcctcga agagccaagt agacacagcc: atgtacttct gtqcc:aqtc:c: ctggggccaa ggagtcatgg tcacagtctc ctcccaggtc gatgtcttgc gagtcatqqa cttcaatqaa ctac.lltgg.llg a.llctqtat.llt ctcttca

cctgtcccaa gtctctcacc qcaqcctcca ttat.llattca tttctta.ll.llg ttattatggg

ctca

cctgtcc:caa qtctctc:.llCC qcaqc:c:tc:c:a ttataattca tttcttaa.llg ttac:tatqqg ctC.ll

60 120 180 240 300 360 417

60 120 180 240 300 360 414

<400> 12

Met Asp Ile A~g Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly 1 5 10 15

Val GI" Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Se~ Gly Gly Gly L8u Val Gln 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Asn Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala Tbr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Arg 65 70 75 80

Asp Se~ Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Se~ Arg Asp His Ala Lys Se~ 85 90 95

Thr Leu Ty~ Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110

Tyr Ty~ Cys Thr Arg Glu Glu Gln Ty~ Se~ Se~ T~p Ty~ Phe Asp Phe 115 120 125

Trp Gly Pro Gly Ile Met Val Thr Val Ser Ser 130 13S

<210> 13 5 <211>143

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 13

Met Asn Phe Ser Asn Thr Leu Val Phe Leu Leu Phe Leu Leu Lys Gly 1 5 10 15

Ile Leu Cys Glu v~l Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vd l Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Asn Tyr Gly Mot Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser 11e Ser Gly Ser Ser Thr Tyr 11e Tyr Tyr Ala 65 70 75 80

Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu As n Ala Glu Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Mét Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110

Tyr Tyr Cya Ala Arq Glu Gly Ser Ser Thr Aap Arq Tyr Tyr Glu Val 115 120 125

Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140

<210> 14 5 <211>139

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 14

Met Gly Trp 11e Cys 11e Ile Pha Leu Va l Ala Thr Ala Thr Gly Val 1 5 10 15

His Ser Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45

Asp Tyr Trp Val Hia Trp Val Lys Gln Ser Mis Gly Lys Ser Leu Gl u

10 50 55 60

Trp 1 le Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Asn Thr Thr Asn Phe Asn Glu U 70 75 W

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Phe Thr Ser Thr 85 90 95

Ala Tyr Het Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr 100 105 110

Tyr Cys Thr Arg Gly Thr Val Tyr Tyr Gly Leu Gly Tyr Phe Asp His 115 120 125

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 130 135

<210> 15

<211> 138 5 <212> PRT

<213> Raftus norvegicus

<400> 15

Met A.la Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Leu Ile Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu 3S 40 4S

Thr Ser Asn Ser val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 SS 60

Glu Trp Met Gly Ile Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser 65 70 75 80

Ala Ile Lys Ser Arg Leu Ser Ila Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln 85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110

Phe Cys Ala Asn Pro Tyr Tyr Gly Tyr Asn Phe Pro Phe Asp Tyr Trp 115 120 125

Gly Gln Gly val Met val Thr val Ser Ser 130 135 10

<210> 16

<211> 138

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 16

Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Leu Ile Pbe Pro Se~ Cys 1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys G~u Ser G~y Pro Gly Leu Va~ G~n 20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Tbr Val Ser Gly Ser Ser Leu 35 40 45

Thr Ser Asn Ser Val Ser Trp Ile Arq Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Met Gly Val lle Trp Ser Asn Gly Asp Ala Asp Tyr Asn Ser 65 70 75 80

A1a Ile Lys Se~ Arg Leu Se~ I~e Ser Arg Asp Th~ Ser Lys Se~ G~n 85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110

Phe Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr G~y Tyr Tyr Phe Pro Phe Asp 'i'yr Trp 115 120 ~25

G~y Gln Gly Va~ Mot Val Thr Va~ Ser Ser 130 135

<210> 17 5 <211> 390

<212> AON

<213> Rattus norvegicus

<400> 17

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacattgtgc tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc tagggcagag ggccacaatc 120

tcctgtagag ccagccaaag tgtcagtata tctagccatg atctcatgca gtggtaccaa 180

cagaaaccag gacagcaacc caaactcete atctatgatg eatteaaeet ageatetggg 240

atccctgtca ggttcaqtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcac cattgatcct 300

gtgeaggetg atgatattgc aacetattae tgtcagcaga gtaaggatga tccgtaeacg 360

tttggagctg ggaccaagct ggaactgaaa 390

<210> 18

<211> 393

<212> AON 15 <213> Rattusnorvegicus

<400> 18

atgaaagtgc ctggtaggct gctggtgctg gttgtqttga cacaaactcc agtttccctg tct tgcaggt ctagtcagag cctggaata.t ctacaqaagc caggccagtc tccacaggtc qqqgtcccaq acaqgtt cat tqqcaqtqqq agagtagagc ctgaggactt gggagtttat acgtttgggg ctgggaccag gctggaactg

<210> 19 5 <211> 384

<212> AON

<213> Raftus norvegicus

<400> 19

atgggtgtgc ctactcatct cctgggtttg qatatccqqa tgacacagtc tccagcttcc atcgaatgtc tagcaagtga ggacqttta.c gggaaa.tctc ctcagctcct gatctataa.t cgqtttagtg gcagtggatc tqgcacacgg qall.qatgtcg cqacttattt ctgtclI.i!lcaa gctgggacca agctggaact gaaa

<210> 20

<211> 381

<212> AON

15 <213> Raftus norvegicus

<400> 20

atgaacgtgc ccactcaact ccttgggttg gacatccaga tgacacagtc tcctqcctcc atcacctgca aggcaagcca gggcattga.t gqqaaa.tctc: ctcagctc:ct gatc:tatga.t cggttcagcq gcaqtagatc tqqcacaca.g gatgattctg gaatctatta c:tgtctacag gggacgaagt tggaaataaa a

20 <210> 21

<211> 381

<212> AON

<213> Raftus norvegicus

ttgttttgga ttccagcttc caggagtgat: .0

tctgtcacac ttggagatca agcttctata: 120

agtgatqqat acactt attt ggaatgqtac: 180

ctcatctatg gagtttccaa ccgattttct: 240

t caqqqaca.q a.tttcaccct ca.aqatcaqc: 300

tactgcttcc aagctacaca tgatccgtac: 3.0

•••: 393

ttgctgctct ggattacaca tgccatatgt: .0

ctgtctqcat ctctgqqaga aactqtcaac: 120

agtgatttag catggtatca gcagaagcca: 180

gcaaataatt tacaaagtgg ggtcccttca: 240

tattctctaa aaataaacaq cctgcaatct: 300

tataacaatt atcctccgtll. cacgtttgga: 3.0

384

ctgctactct ggcttacagg tggtaaatgt: .0

ctgtctgctt ctctggaaga aattgtcacc: 120

aatta.cttat catggtatca gcagaaacca: 180

gc:aacc:agc:t tggc:agatgg ggtc:c:c:atc:a: 240

tattctctta aqatcagcag accacaggtt: 300

agttacagta ctc:cattcac: gttc:ggc:tca: 3.0

381

<400> 21 atgaacgtgc ccactcaact: ccttgggttg ctgctactct ggcttacagg tggtaaatgt 60

gacatccaga tgacacagtc tcctgcetec ctgtctgctt ctctggaaga aattgtcacc: 120

atcacetgca aggeaaqcca: ggceattgat gcttacttat catggtatca geagaaacca 180

gggaaatctc ctcagctcct gatctatgat gcaaccagct: tggcagatgg ggtcccatca 240

cggttcagcg gcaqtagatc tggcacacag tattctctta agatcagcag accacaggtt: ~OO

gatgattctg gaatctatta ctgtctacag agttacagta: ctccattcac qttcggctca ~60

gggacgaagt tggaaataaa: a 38 1

5: <210> 22 <211>130 <212> PRT <213> Raftus norvegicus

<400> 22 Met Glu Thr Asp 1: Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu 5 10 Leu Leu Trp Val 15 Pro

Gly Ser Thr Gly Asp 20: rle Val Leu Thr Gln 25 Ser Pro Ala Leu Ala Val 30

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr 35: lle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 40 45

Ser lle Ser Ser 50: Hi s Asp Leu Met 55 Gln T~ Tyr Gln Gln Lys 60 Pro Gly

Gln Gln Pro Lys 65: Leu Leu 70 lle Tyr Asp Ala Phe Asn 75 Leu Ala Ser Gly 80

lle Pro Val Arg Phe Ser Gly 85: Ser Gly Ser Gly 90 Thr Asp Phe Thr Leu 95

Thr: lle Asp pro Val 100 Gln Ala Asp Asp 105 lle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gl n 110

Gln Ser Lys Asp Asp 115: pro Tyr Thr phe Gly Ala Gly Thr Lys 120 125 Leu Gl u

10: Leu Lys 130

15: <210> 23 <211> 131 <212> PRT <213> Raftusnorvegicus

<400> 23

Met Lys Val P~o Gly Axg Leu Leu Val Leu Leu Phe Trp Ile P~o Ala 1 5 10 15

Ser Arg Ser Asp ViSl ViSl Leu Thr Gln Thr Pro ViSl Ser Leu Ser Val 20 25 30

Thr Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser eys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45

Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Léu Glu Trp Tyr Léu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu ASp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110

Phe Gln Ala Thr Mia Aap Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arq Leu 115 120 125

Glu Leu Lys 130

<210> 24 5 <211>128

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 24

Met Gly val Pro Thr Bis Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr 1 5 10 15

Bis Ala Ile Cys Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Aan Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp 35 40 45

Val Tyr Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lya Ser Pro 50 55 60

Gln Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Asn Le u Gln Ser Gly Val Pro Ser 10 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ser Leu Lya Ile Asn 85 90 95

Ser Leu Glo Ser Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Glo eln Tyr Asn 100 105 110

Asn Tyr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys LeU Glu Leu Lys 115 120 125

<210> 25

<211> 127

<212> PRT 5 <213> Rattus norvegicus

<400> 25

Met Asn Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Gly Gly Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Glu Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly 35 40 45

Ile Asp Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60

G1n Leu Leu Ile Tyr Asp Al a Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser 85 90 95

Arg Pro Gl" Val Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Lau Gln Ser Tyr 100 105 110

Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu G1u Ile Lys 115 120 125

10 <210> 26

<211> 127

<212> PRT

<213> Raftus norvegicus

15 <400> 26

Met Asn Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Gly Gly Lys Cys Asp I le Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

~a Ser Leu Glu Glu 11e Val Thr 11e Thr Cys Lys ~a Ser Gln ~a 35 40 45

lle Asp Ala Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gl n Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60

Gln Leu Leu lle Tyr Asp Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 SO

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys lle Ser SS 90 95

Arg Pro Gln Val Asp Asp Ser Gly lle Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Tyr 100 105 110

Ser Thr Pr o Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lle Lys 115 120 125

<210> 27

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR1 de KM4065

<400> 27

Atn Tyr Gly Het Ala I 5

<210> 28 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR2 de KM4065

<400> 28

Thr IIe Ser Tyr Asp G1y Ser lle Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gl y

25 <210>29

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR3 de KM4065

<400> 29

Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Phe I 5 lO 35

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR1 de KM4065

<400> 30

Arg Ala Ser Gln Ser val Ser 11e Ser Ser His Asp Leu Met Gln 5 1 5 10 15

<210> 31

<211> 7

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR2 de KM4065

15 <400> 31

Asp Ala Phe Asn L.u Ala Ser

1 5

<210> 32

<21 1>9 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR3 de KM4065

<400> 32

Gln Gln Ser Lys Asp Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 33 30 <211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR1 de KM4066

<400> 33

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

40 <210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR2 de KM4066

<400> 34

Ser Ile Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15

Gly 50

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR3 de KM4066

<400> 35

G1u Gly Ser Ser Thr Asp Arg Tyr Tyr G1u val Ser Phe Ala Tyr 1 5 10 15

<210> 36 5 <211>16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR1 de KM4066

<400> 36

Arg Ser Ser Gln S.r Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15

15 <210>37

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR2 de KM4066

<400> 37

Gly val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 25

<210> 38 <211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR3 de KM4066

<400> 38 Phe Gln Ala Thr Hi$ A$p Pro Tyr Thr

35 1 5

<210> 39

<211> 5

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR1 de KM4067

45 <400> 39

Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5

<210> 40

<211> 17 50 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR2 de KM4067

<400> 40 G1u I1e Tyr Pro Asn Asn Asn Thr Thr Asn Phe Asn G1u Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR3 de KM4067

<400> 41

Arg Gl y rhr val Tyr Tyr Gly ~u Gly Tyr Phe Asp His 10 1 5 10

<210> 42

<21 1> 11

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: lCDR1 de KM4067

20 <400> 42

Leu Ala Ser Glu Asp Val Tyr Ser Asp Leu Ala 1 5 10

<210> 43

<211> 7 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artifidal: l CDR2 de KM4067

<400> 43

Asn Ala Asn Asn Leu Gl n Ser 1 5

<210> 44 35 <211>10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Descripción de la secuencia artificial: l CDR3 de KM4067

<400> 44

Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro Tyr Thr 1 5 10

45 <210> 45

<21 1> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR1 de KM4068

<400> 45

Ser Asn Ser Val Ser 1 5 55

<210> 46

<21 1> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR2 de KM4068

<400> 46

11. 11. Trp S.r Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn S.r Ala 11. Lys S.r 5 1 5 10 15

<210> 47

<211> 13

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR3 de KM4068

15 <400> 47

Ala Asn Pro Tyr Tyr Gly Tyr Asn Phe Pro Phe Asp Tyr 1 5 la

<210> 48

<211>11 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR1 de KM4068

<400> 48

Lys Ala S.r Gln Gly 11. Asp Asn Tyr Leu S.r 1 5 10

<210> 49 30 <211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR2 de KM4068

<400> 49

Asp Ala Thr S.r Leu Ala Asp 1 5

40 <210> 50 <211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: LCDR3 de KM4068

<400> 50

Leu Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 50

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR1 de KM4069

<400> 51

S.r Asn S.r Val Ser

60 1 5

5: <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artifidal: HCDR2 de KM4069

10: <400> 52 val 11. Trp S.r Asn Gly Asp Ala Asp Tyr Asn 1 5 10 S.r Ala ¡l. Lys 15 S.r

15: <210> 53 <211> 13 <212>PRT <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: HCDR3 de KM4069 <400> 53 Ala Asn 1 Pro Tyr Tyr Gly Tyr Tyr ph. Pro ph. Asp Tyr 5 10

25: <210> 54 <211>11 <212> PRT <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: lCDR1 de KM4069

<400> 54 Lys Ala S.r Gln Ala 11. Asp Ala Tyr Leu S.r 1 5 10

35: <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

40: <220> <223> Descripción de la secuencia artifidal: lCDR2 de KM4069

45 50: <400> 55 Asp Ala Thr S.r Leu Ala Asp 1 5 <210> 56 <211>9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artifidal: lCDR3 de KM4069

55: <400> 56 L.u Gln S.r Tyr 1 Ser Thr 5 Pro Phe Thr

60: <210> 57 <211> 132 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 1 de KM4065VH

<400> 57

ccaattaacc ctcactaaaq qggcggccgc gacccctcac catqaacctc qggctcagtt tqattttc:c:t tgc:c:c:tc:att ttaaaaggt.g tc:c:agtgtga qgtqc:aac:tg qtagagtc:tg gqggc:ggttt ag

<210> 58

<211> 80

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 2 de KM4065VH

<400> 58

Q99t.aataC:9 ac:tc:ac:t.ata 999C:999C:C:C: tt.Qgt:Q9a9Q c:tqa9qac:ac: 9Qtqac:c:att attc:c:tggtc: c:c:c:agaagtc:

<210> 59 <211>116

<212> AON

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 1 de KM4065VL

<400> 59

ccaattaacc ctcactaaaq 9ggaattcqc ctcttcaaaa tgaagttgcc tgtta9gct9 ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc agcagtgaca ttgtgctgac ccagtc

<210> 60

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> DescripCión de la secuencia artificial: cebador híbrido 2 de KM4065VL

<400> 60 gggtaatacg actcactata gggccgtacg tttcagttcc agcttggtcc

<210> 61 <211>118

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrído 1 de KM4066

<400> 61

ccaattaacc ctcactaaag 999c9gcc9c gacc:cctc:ac catgaacctc 999ctcagtt tgattttc:ct tgccctcatt ttaaaagqtg tccagtgtga gqtgcagc:tg gaggaqtc:

<210> 62 <211>61

<212> AON

<213> Secuencia artificial

60 120 132

"

60 116

60 118

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 2 de KM4066VH

<400> 62 gggt aatacg: actcactat a 99gC99gccc tt99t99ag9 ctgaa9agac agtgaccaga 60

g: Si

<210> 63 <211> 11 8 <212> ADN <213> Secuencia artifi cial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 1 de KM4066

<400> 63 ccaattaacc: ctcacta aaq g9gaattcgc ct cttcaaaa t9aagtt gcc tqttaggctg 60

ttg9tgctga tgtt ctqgat: t cctgcttcc agcagtgat g t t gtgtt qac ac aaactc 118

<210> 64 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artifi cial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 2 de KM4066VL

<400> 64 gggtaatacg actcactata gggccgtacg ntcagncc agcctggtcc: 50

<210> 65 <211>1 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artifi cial: cebador híbrido 1 de KM4067VH

<400> 65 ccaattaacc: ctcact aaag qqqcqqccgc go1l.cccctcac catqaqaqtg ctt attttat 60

tgtggc tqtt: cacagccttt cctggtattc ttaqtcaggt caagctgctg cagtc 115

<210>66 <211> 62 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrído 2 de KM4067VH

<400> 66 gggtaatacg actcactata: 99gc99gcoc ttqqtggagg ctgaagagac tgtgaccatg 60

ac: 62

<210> 67 <211> 125 <212> ADN <213> Secuencia artifi cial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 1 de KM4067VL

63

<400> 67 ccaattaacc ctcactaaaq qqqaattcqc ctcctcaaaa tqcattttca agtgcaqatt: 60

ttcagcttcc tgcttatttc ggcctcaqtc ataatgtcca gaggagatat ccggatgaca: 120

cagtc: 125

5: <210> 68 <211> 50 <212> AON <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador hibrido 2 de KM4067VL

<400> 68 gggtaatacg actcactata gggccgtacg tttcagttcc agcttggtcc: 50

15: <210> 69 <211>115 <212> AON <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador hibrido 1 de KM4068VH

<400> 69 ccaattaacc ctcactaaag gggcggccgc gacccctcac catgagagtg cttattttat: 60

25: tgtggctqtt cacagccttt cctgqtattc ttaqtcaaqt gcaactaaag gaqtc <210> 70 <211> 60 <212> AON <213> Secuencia artificial 115

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador hibrido 2 de KM4068VH

35: <400> 70 gggtaatacg actcactata gggcgggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgaccatg 60

<210> 71 <211> 125 <212> AON <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador hibrido 1 de KM4068VL

45: <400> 71 ccaattaacc ctcactaaag gggaattcgc ctcctcaaaa tgcattttca agtgcaqatt 60

ttcagcttcc tgcttatttc ggcctcaqtc ataatgtcca gagqagacat ccagatqaca: 120

cagtc: 125

<210> 72 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia artificial

55: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador hibrido 2 de KM4068VL

<400> 72 gggtaatacg actcactata gggccgtacg ttttatttcc aacttcgtcc c 51

<210> 73 <211>115

<212> AON

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 1 de KM4069

<400> 73

ccaattaacc ctcactaaaq qqqcqqccqc qacccctcac catqaqaqtq cttattttat 60 tqtggctqtt cacagccttt cctgqtattc ttaqtcaaqt gcaactaaag gaqtc 115

<210>74 <211>61

<212> AON

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 2 de KM4069VH

<400> 74

gggtaatacg actcactata gggcgggccc ttgqtggagg ctgaggagac tgtgaccatg 60

• 6'

<210> 75

<211> 125

<212> AON

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 1 de KM4069VL

<400> 75

ccaattaacc ctcactaaag gggaattcgc ctcctcaaaa tgcattttca agtgcagatt 60 ttcagcttcc tgcttatttc ggcctcaqtc ataatqtcca gaggagacat ccagatgaca 120 caqtc 125

<210> 76

<211> 51

<212> AON

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador híbrido 2 de KM4069VL

<400> 76 gggtaatacg actcactata gggccgtacg ttttatttcc aacttcgtcc c 51

<210>77

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de KM4065 HVO

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Glu Se..: Gly Gly Gly Leu Val Gln P..:o Gly Ax"g 1 5 10 1.5

Ser Leu Arg Leu S&r Cys Ala AJa Ser Gly Phe Thr Phe Ser ASn Tyr 20 25 30

Gly Met Ala Trp Val AIg Gln AJa Pro Gly Lya Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 SS 60

Lys Gly Arg Phe Th r Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ax"g A1~ Glu Asp Thr Ala V~l Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe As p Phe Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Th", Leu Val Tnr Val Ser Ser 115 120

<210> 78 5 <211> 111

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de KM4065 LVO

<400> 78

Asp 1 le Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ax"g Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Ser His Asp Leu Net Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ly. Ala Pro 3S 40 4S

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Pha Asn Leu Ala Sar Gly Val Pro Ser SO SS 60

Arg phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Aap Phe Ala Thr Tyr Tyr Cya Gln Gln Ser Lys 85 90 95

Asp Aap Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu I1e Lys 100 105 110

15 <210> 79

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 1 del vector de expresión de CD4

<400> 79 ccaattaacc ctcactaaag gggaaltcga cccctcacca tgaaccgggg agtccctttt 60

<210> 80

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 2 del vector de expresión de CD4

<400> 80 gggtaatacg actcactala gggcactagt glcgcactca aatggggcta catglctlc 59

<210> 81 <211>41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 1 de la expresión de CD4-Fc vector

<400> 81 tclgcccaca tggtccaccg agcccaaatc ttgtgacaaa a 41

<210> 82

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 2 de la expresión de CD4-Fc vector

<400> 82 gggtaatacg actcactala gggcactagt ggalccgtcg cacl 44

<210> 83 <211>92

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 1 de 6G5VL

<400> 83

ccaattaacc ctcactaaaq qqqaattcqa cccctcacca tqat qqtccc aqctcaqctc 60

ete gqtetee t getgetetq gtteeeagqt t e 92

<210>84

<211> 93

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 2 de 6G5VL

<400> 84 aqtgatggtg actctgtctc ctacagatgc agacacggaa gatggagact qggtcatctg: 60

gatgtcgcat ctggaacctg ggaaccagag cag: 93

<210> 85 <211>93 <212> AON <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 3 de 6G5VL

<400> 85 qqaqacaqaq tcaccatcac ttqtcqqqcq aqtcaqqata ttaqcaqctq qttaqcctqq: 60

tatcaqcata aaccaqgtaa agcacctaag ctc: 93

<210>86 <211> 101 <212> AON <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 4 de 6G5VL

<400> 86 agaqtgaaat ctqtcccaga tccacttccg ctgaaccttg atgggacacc actttgcaaa: 150

ctggatgcag catagatcaq gagcttagqt gctttacctg 9: 101

<210> 87 <211> 94 <212> AON <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 5 de 6GSVL

<400> 87 gatctgggac agatttcact ctcactatca gcagcctgca qcctqaaqat tttgcaactt: 150

actattqtca acaqgctaat aqtttcccqt acac: 94

<210> 88 <211> 89 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 6 de 6G5VL

<400> 88 gqqtaatacg actcactata qggcqgatcc cqtacqtttq atctccagct tgqttccctg: 60

accaaaaqtg tacgggaaac tattagcct: 89

<210> 89 <211> 148 <212> AON <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 1 de 6G5VH

<400> 89 ccaattaacc: ctcactaaaq qqqaatt clJc qgccgcqacc cctcaccatg aaacacctgt 60

gqttetteet eeteetqqtq geageteeta gatggqteet qteteaggtg eagetaeage: 120

aqtggggcgc: aggactqttg aagccttc 148

5: <210> 90 <211> 129 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 2 de 6G5VH

<400> 90 gattteacca atccactcca: gacccttacc: tgqtggctgg cggatccagc tc:c:aqtagta 60

accactgaag gaaccaccat agacagcgca ggtgagggac aggqtctccg aaggcttcaa: 120

15: eaqtectgc 12'

20: <210> 91 <211> 156 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 3 de 6G5VH

25: <400> 91 ctggagtgga t tggtgaaat caatcataqt ggaagcacca act acaaccc gtctctcaag 60

agtcgagtc:a c:catatc:agt agac:acgtc:c aagaaccagt tc:tctc:tgaa: ac:tgagc:tc:t 120

gtgaccgctg cggacacggc tgtgtattac tgtgcg: 156

30: <210> 92 <211> 124 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Un cebador 4 de 6G5VH <400> 92 gggtaatacg actcactata gggcggatcc gggcccttgg ttgaggctga ggagacggtg 60

aceagqqttc: cctqgcccca agggtcgaac caattaatta ctetcgeaca gtaatacaca 120

geeg: 12.

40: <210> 93 <211> 360 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de ADN de KM4065 HVO

<400> 93 gaggtgeage tggtggagtc tgggggegge ttggtaeage etgggeggte ectgeggcte: 60

tcctgtgeag ectctgggtt cacetttagt aactatggea tggeetgggt ccgceagget: 120

ccaggqaagg ggctggagtg ggtcgcllacc attagttatg atggcagtat cllcttattat: 180

egagactecq tgallqggecg gtteaccatc tcccgggaea atteeaagaa eacqetgtae: 240

etgeallatga acagcctgcg aqcegagqac acgqeegtllt attactgtgc 9C999a9glla: 300

eaatatagell getggtaett tgaettetgg ggeeagggga: eeetggteae egteteetea 360

5: <210> 94 <211>333 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de ADN de KM4065 l VO

<400> 94 gaeatceage tgaeeeagtc tccatcctcc etgtetgcat ctgtaggtga ecgggtcace: 60

atcaettgte gggccaqeea aagtgtcagt atctctllgcc atgatcteat gcagtggtat: 120

eageagaaae eagggaa.age eeetaagete etgatetatg atgeatteaa eetggeatct: 180

ggggtcccat cacggttcllg cggcaqt.ggt t.ctgggacag at.t.tcactct.: caccat.cagc 240

agectqcage: ctgaagattt t.geaaet t.a.t t.act.gccagc aqagtaagga t.qa.tcegtae 300

acgttcggcc aggggaccaa gctqgagatc: aaa 333

15: <210> 95 <211> 360 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de ADN de HV2

25: <220> <221> CDS <222> ( 1) ..(360)

<400> 95

..

gag gtg oag ctg gtg gag t ct ggg ggc ggc ttg gta cag cct 999 cgg

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 S 10 15

toc ctg ogg etc tcc tgt 9c• goc tot 999 tto aoc ttt a9t a.o t.t Ser Leu Arg Leu Ser ey. Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser A.n Tyr " 20 25 30

ggc atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc ,.4 Gl y Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ly. Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

gca .cc .tt agt t.t g.t ggc .gt .tc .ct t.t t.t cg. g.c tcc gtg " 2 Ala Thr ne Ser Tyr Aap Gly Ser ne Thr Tyr Tyr Arg Aap Ser V.l 50 SS 60

••g ggc cgg ttc .cc atc tcc cgg gac ae< tcc eeg eec acg ctg tec 24. Ly. Oly Arg Phe Thr n e Se r Arg Aap Aan Ser Ly. Aan Thr Leu Tyr 6S 7. 75 80

ctg c .. atg eec agc ctg cga gcc gag gac acg gcc gta tat tae tgt 268 Leu Gln Met Aan Ser Leu Arg Ala Glu A.p Thr Ala Val Tyr Tyr Cy.

85 .5

"

acg c90 gao gee coa te< agc aoc tgg tec ttt gac ttc t90 90c cag 336 Thr Arg Glu Glu GI . Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe Phe Tr. Gly GI. 100 105 '" no

ogg atc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 96 5 <211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de HV2

<400> 96 Glu Val Gln 1: Leu Val Glu Se..: 5 Gly Gly Gly Leu 10 Val Gln P..:o Gly Ax"g 1.5

Ser Leu Ax"g: Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser G1.y 25 Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 30

Gly Met Ala 35: Trp Val Arq Gln Ala Pro 40 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ala: Thr 11e Ser 50 Tyr Asp Gly 55 Ser Ile Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 60

Lys 65: Gly Ax"g Phe Thr rle Ser Arg Asp Asn Ser Lys 70 75 Asn Thr Leu Tyr 80

Leu Gln Net: Asn Ser 85 Leu Ax"g Ala G1u Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Thr Axg: Glu Glu 100 Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe 105 As p Phe Trp Gly Gln 110

Gly rle Leu Val 115: Thr Val Ser Ser 120

5: <210> 97 <211> 360 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de ADN de HV3

15: <220> <221> CDS <222> (1 )..(360) <400> 97 gag gtg cag Glu Val Gln 1 c tg gtg gag Leu Val Glu 5 t ct ggg ggc Ser Gly Gly ggc ttg gta cag cct Gly Leu Val Gln Pro 10 ggg cgg Gly Arg 15 48

tcc ctg cgg Ser Leu Arg: et c tcc t gt gca gcc tct Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 2S ggg Gly ttc Phe acc ttt agt Thr Phe Ser 30 aac tat Asn Tyr "

ggc atg gcc Gly Met Ala 3S: tgg gtc cgc cag gct Trp Val Arg Gln Ala 40 cea Pro ggg aag ggg ctg gag Gly Lys Gly Leu Glu 45 tgg gtc Tr. Val 14.

oca acc Ala Thr 50: att aot no So< tat oat Ooc aot atc act tat tat coa Tyr A.? Gly Sor nO Thr Tyr Tyr ArO 55 60 oac tcc oto A.? Sor Val 192

aao Ooc cO' ttc Lya Oly ArO Pha 65: acc Thr atc tcc c•• oac aat tcc aao aac aco cto tac na Sar Aro Aa? Aan Sar Lya Aan Thr Lau Tyr 70 75 80 2.0

cto caa ato aac aoc cto coa occ oao oac aco occ acc tat tac tot Lau Gl n Met Aan Ser Leu ArO Al. Glu Aap Thr Al. Thr Tyr Tyr Cy. 85 90 95: 288

acc coo oao Thr ArO Glu: oa. caa tat aoc aoc too tac ttt oac ttc too ,oc cao Glu Gln Tyr Sar Sar Trp Tyr Pha Aap Phe T<p Gly Gln 100 105 110 33.

000 atc cto otc Gly ne Leu Val 115: acc otc tcc tc. Thr Val Ser Ser 120 360

5: <210> 98 <211>120 <212> PRT <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoacidos de HV3 <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArO 1 5 10 15

Ser: Leu Arq LeU 20 Ser Cys Al a Ala Ser Gly Phe 25 Thr Pho Sar Asn 30 Tyr

Gly Met: Ala 35 Trp Val Arq Gl n Ala Pro Gly Lys Gly LeU 40 45 Glu Trp Val

Ala Thr 50: 1 le Ser Tyr Asp Gly 55 Se:r: rle Thr Tyr Tyr Arq Asp 60 Ser Val

Lya Gly Arq 65: Phe Thr ne Ser Arg Asp Asn Ser Lys 70 75 Asn Thr Leu Tyr 80

Leu Gln Het: Asn Ser Leu as Arq Ala Glu Aap Thr 90 Ala Thr Tyr Tyr Cya 95

Thr Arg Glu: Glu 100 Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr lOS Phe Asp Phe Trp Gly Gln 110

Gl y: Ile Leu Val 115 Thr Val Ser Ser 120

15: <210> 99 <211> 360 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de ADN de HV4

<220> <221> CDS

73

<222> (1) ..(360)

<400> 99

gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg ggc ggc ttg gta cag cct ggg cgg

..

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 S 10 15

tcc atg cgg ctc tcc tgt gca gcc tct ggg ttc acc ttt agt aac tat Ser Het Arg Leu Ser ey. Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Aan Tyr " 20 25 30

ggc atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lya Gly Leu Glu Trp Val 3S 40 45

gca acc att agt tat gat ggc agt atc act tat tat cga gac t cc gtg 192 Ala Thr ne Ser Tyr Aap Gly Ser ne Thr Tyr Tyr Arg Aap Ser Val 50 55 60

aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgg gac aat tcc aag aac acg ctg tac 2.0 Ly. Gly Arg Phe Thr ne Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 7S SO

ctg coa <tg aac agc ctg cga gcc gag gac acg gcc acc tat tac tgt "8 Leu Gln Met Asn Ser Leu Ar. Ala Glu Aap Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 'S

"

acc cgg ga. gaa caa tat agc a.c tgg <Oc <tt gac ttc tgg g.c cag 336 Thr Ar. Olu Glu G'n Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 lOS llO

.gg atc ctg gtc acc gtc tcc tce 360 Gly l1e Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 5

<210> 100

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de HV4

<400> 100

Glu Val. Gl.n Leu Val Gl.u Ser G1y G1y Gly Léu Va1 Gl.n Pro Gly Ar. 1 5 10 15

Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Ala Trp Va.l Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 35 40 45

A.la Thr Ile Ser Tyr Asp Oly Ser Ile Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60

Ly. Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Aap Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Het Asn Ser Leu Arg Ala Glu A.p Thr Ala. Thr Tyr Tyr Cy. 85 90 .5

Thr Arg Gh.l Olu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 lOS 110

Gly lle Leu Val Thr Val Ser Ser 11S 120

<210> 101

<211> 333 5 <212> AON

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de ADN de LV6

<220>

<221> CDS

<222> (1 )..(333)

15 <400> 101 gac ate cag ctg acc cag tct cea tcc tcc ctg tct gtc tct ctt ggt 48 Mp 1 le Gln Lou Thr Oln Ser Pro Ser Ser Leu Sor Val Sor Lou Oly 1 S 10 15

gac cgg gcc acc atc act tgt ego gcc aoc caa aot otc agt ate tct Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cy. Aro A.la Ser Oln Ser Val Ser Ile Ser " 20 25 30

agc c.t g.t ctc .tg c'g tgg t.t c'g c'g ••• cc. ggg ••• c'g cct ",

Sor His bp Lou Mot Oln Trp Tyc Ol. Oln Ly. Pro Oly Ly. Gl. Pro 35 40 45

aag ctc ctg atc t.t gat gca ttc a.c ctg gca tct ggg atc cca tca 192 Ly. Lou Lou Ilo Tyr Mp Ala ph. Asn Lou Ala Ser Oly no Pro Ser 50 55 60

cgg ttc agc ggc .gt ggt tct g90 .ca gat ttc act ctc acc atc agc 240 Arg Phe Ser Oly Ser Oly Ser Oly Thr Mp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

.gc gtg cag cct gaa gat ttt • ca act tat tac tgc ca• ca. agt aa. 288 Ser Val 01. Pro Glu "p Phe Ala Thr Tyr Tyr Cy. Oln Oln Ser Ly. 8S 90 .5

gat gat cc. tac acg ttc ggc cao ggg acc aa. ctg gag .tc .aa 333 Mp Aap Pro Tyr Thr Phe Ol y Oln Oly Thr Ly. Lou Olu Ile Ly. 100 105 llO

<210> 102

<211> 111 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de LV6

<400> 102

Asp 1 le Gln Leu Th:.:-Gln Se:.:-P:.:-o Se:.:-Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Aap Arg ~~ To:.:-ILe Th:.:-Cya Arg Ala Ser Gln Se:.:-V~l Se:.:-Ile Ser 20 25 30

Se:.:-His ~p Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro 3S 40 4S

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 8S 90 95

Asp Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo monodonal frente a CD4 humano, presentando dicho anticuerpo una constante de disociación (Ko) inferior a 1 x 10-9 M, se une a una región extracelular de CD4 humano, y es:

(i)

un anticuerpo hibrido humano recombinante en el que la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 12 pero que excluye la secuencia señal secretora de aminoácidos 1 a 19 en SEC ID nO: 12, y la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 22 pero que excluye la secuencia señal secretora de aminoácidos 1 a 20 en SEC ID nO: 22; o

(ii)

un anticuerpo humanizado recombinante en el que:

(a)

la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 96 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 78;

(b)

la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 98 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 78;

(c)

la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 77 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 78;

(d)

la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 100 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 78; o

(e)

la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 100 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 102.
2.

Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nO: 96, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC tO nO: 78.
3.

Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 o 2, que se une a C04 con una Ko inferior a 7 x 10. 10 M.
4.

Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 o 2, que se une a C04 con una Ko inferior a 2 x 10. 10 M.
5.

Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo presenta una actividad COC sobre una estirpe celular de cáncer humano que expresa C04 humano.
6.

AON que codifica el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7.

Vector recombinante que comprende el AON según la reivindicación 6.
8.

Transformante que puede obtenerse introduciendo el vector recombinante según la reivindicación 7 en una célula hospedante.
9.

Procedimiento para producir el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende cu ltivar el Iransformante definido en la reivindicación 8 en un medio para producir y acumular el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el cultivo, y recoger el anticuerpo del mismo a partir del cu ltivo.
10.

Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un agente diagnóstico o agente terapéutico para un cáncer positivo para C04 humano.
11.Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la utilización en el tratamiento del cáncer positivo para CD4; detección o medición inmunitaria de CD4 in vivo; o diagnóstico del cáncer poSitivo para CD4 in vivo.