ES2603553T3 - Virus PRRS, clones infecciosos, mutantes de los mismos, y métodos de uso - Google Patents
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Abstract
Un clon infeccioso que comprende un polinucleótido infeccioso que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 O SEQ ID NO: 13 y una secuencia vectorial que se replica en una célula huésped procariótica, en el que dicho polinucleótido tiene una deleción en la secuencia que codifica nsp2.
Description
PredictProtein como ha sido descrito por Rost et al. (Nucleic Acids Res., 32 (publicación del servidor de la Web): W321-326 (2004), o el algoritmo TMHMM descrito por Krogh et al. (J. Mol. Biol., 305:567-580 (2001)) y disponible en internet.
La deleción presente en los polinucleótidos infecciosos aquí descritos puede hallarse típicamente entre los
5 nucleótidos que codifican el dominio de cisteína-proteasa semejante a quimotripsina y los nucleótidos que codifican los dominios transmembranales, y no da como resultado un cambio de marco en el marco de lectura de ORF1. Como se ha expuesto anteriormente, la deleción no incluye típicamente todos los nucleótidos que codifican el dominio de cisteína-proteasa semejante a quimotripsina, todos los nucleótidos que codifican los dominios transmembranales, o la combinación de los mismos. En algunos aspectos, por ejemplo cuando el polinucleótido
10 infeccioso tiene semejanza estructural con SEQ ID NO:1, el límite 5' de una deleción se encuentra en el nucleótido 2305, el nucleótido 2205, el nucleótido 2105, o el nucleótido 2062, y el límite 3' de una deleción se encuentra en el nucleótido 3774, el nucleótido 3804, el nucleótido 3834, o el nucleótido 3864. En otros aspectos, por ejemplo cuando el polinucleótido infeccioso tiene semejanza estructural con SEQ ID NO:14, el límite 5' de una deleción se encuentra en el nucleótido 2304, el nucleótido 2204, el nucleótido 2104, o el nucleótido 2061, y el límite 3' de una deleción se
15 encuentra en el nucleótido 3455, el nucleótido 3495, el nucleótido 3525, o el nucleótido 3545. La deleción puede ser de al menos 39 nucleótidos, 48 nucleótidos, o 57 nucleótidos. En algunos aspectos, la deleción puede ser al menos 267 nucleótidos, al menos 276 nucleótidos, o al menos 285 nucleótidos. En algunos aspectos, la deleción no es > 489 nucleótidos, no > 459, no > 429, o no > 402 nucleótidos. Un polinucleótido infeccioso puede tener más de una deleción en la región nsp2.
20 Ejemplos de polinucleótidos infecciosos derivados de VR-V7 y que contienen una deleción se describen en la Tabla 2.
Tabla 2. Polinucleótidos infecciosos derivados de VR-V7 (SEQ ID NO:1).
- Polinucleótido*
- Nucleótidos delecionados de SEQ ID NO:1 Aminoácidos delecionados de ORF1 Títulos virales (PFU/ml) Sumario de fenotipo**
- nsp2 Δ0180-323
- 1876-2304 563-705 - no viable
- nsp2 Δ242-323
- 2056-2304 623-705 - no viable
- nsp2 Δ324-434
- 2305-2637 706-816 + (~105) tamaño de calva pequeño
- nsp2 Δ324-523
- 2305-2904 706-905 + (~105-106) intermedio
- nsp2 Δ543-632
- 2962-3231 925-1014 + (~105) tamaño de calva pequeño
- nsp2 Δ633-726
- 3232-3513 1015-1108 + (~105) tamaño de calva pequeño
- nsp2 Δ543-726
- 2962-3513 925-1108 + (~105) tamaño de calva pequeño
- nsp2 Δ727-813
- 3514-3774 1109-1195 + (~105) tamaño de calva pequeño
- nsp2 Δ324-726
- 2305-3513 706 -1108 + (~101-2) ND
- nsp2 Δ324-813
- 2305-3774 706-1195 - no viable
- nsp2 Δ727-845
- 3514-3870 1109-1227 - no viable
- nsp2 Δ324-845
- 2305-3870 706-1227 - no viable
* La deleción se refiere a los aminoácidos de nsp2 que se delecionan, v.g., en el virus nsp2 Δ 180-323, se han delecionado los aminoácidos 180-323 de nsp2.
25 ** El tamaño de la calva se refiere a las calvas producidas por VR-2332 de tipo salvaje. 8
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infeccioso. Puede estár insertado un GGT entre el promotor y el primer nucleótido del polinucleótido infeccioso. Opcionalmente, el vector contiene también una ribozima del virus de la hepatitis delta aguas debajo de la región poliA.
Opcionalmente, el vector incluye una o más secuencias marcadoras de selección, que codifican típicamente una molécula que desactiva o detecta o es detectada de algún otro modo por un compuesto en el medio de crecimiento. Por ejemplo, la inclusión de una secuencia marcadora de selección puede hacer la célula transformada resistente a un antibiótico, o puede conferir metabolismo específico del compuesto a la célula transformada. Ejemplos de una secuencia marcadora de selección son secuencias que confieren resistencia a kanamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, y neomicina.
Cuando se produce una deleción de nucleótidos que codifican un polipéptido nsp2 en un clon infeccioso, pueden utilizarse métodos estándar de DNA recombinante conocidos en la técnica (véase, v.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Como reconocerán las personas expertas, es una práctica estándar durante la construcción de un clon infeccioso (y cuando se realizan deleciones de construcción en un clon infeccioso) verificar por análisis de la secuencia de nucleótidos la presencia de secuencias de nucleótidos esperadas, tales como deleciones u otras alteraciones y la ausencia de otras mutaciones. Análogamente, cuando se testa un polinucleótido infeccioso candidato para determinar si el mismo es infeccioso, es práctica estándar verificar por análisis de la secuencia de nucleótidos la ausencia de virus contaminante de tipo salvaje.
La presente descripción también incluye polinucleótidos infecciosos aisladosdescritos en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 así como polinucleótidos infecciosos que tienen semejanza estructural con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6. Métodos para determinación de la semejanza estructural se describen en esta memoria. Preferiblemente, un polinucleótido infeccioso de este aspecto puede tener semejanza estructural con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 de al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%. Se considera que un polipéptido que tiene semejanza estructural con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 es un polinucleótido infeccioso si, cuando está presente en una partícula viral y se expone a células permisivas, el polinucleótido se replica en la células permisivas y produce partículas infecciosas de virus .
La presente descripción también incluye partículas de virus aisladas. Como se utiliza en esta memoria, los términos "partícula de virus" y "partícula viral" se utilizan intercambiablemente y hacen referencia a un polinucleótido de la presente invención rodeado por una envoltura. Una partícula de virus de la presente descripción puede, cuando se añade a una célula permisiva cultivada, replicarse para dar como resultado la producción de más partículas virales.
Una partícula de virus puede hacerse crecer por pases in vivo o en cultivo de células. El sometimiento a pases in vivo incluye inocular un cerdo (Faaberg et al., Patente U.S. 7.041.443). El sometimiento a pases en cultivo de células incluye exponer células cultivadas a la partícula de virus e incubar las células en condiciones adecuadas para que el virus se reproduzca y produzca más partículas virales. Las células cultivadas no pueden ser una línea de células inmortalizada o transformada (es decir, las células no son capaces de dividirse indefinidamente). Se pueden utilizar macrófagos alveolares primarios de porcino para el sometimiento a pases en cultivo de células (Faaberg et al., Patente U.S. 7.041.443).
Un virus de la presente descripción puede estar desactivado, es decir, puede estar incapacitado para reproducirse in vivo y/o en cultivo de células. Métodos de desactivación se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, tratamiento de una partícula de virus de la invención con un agente químico desactivador estándar tal como un reactivo aldehídico que incluye formalina, acetaldehído y análogos; alcoholes reactivos ácidos que incluyen cresol, fenol y análogos; ácidos tales como ácido benzoico, ácido benceno-sulfónico y análogos; lactonas tales como betapropiolactona y caprolactona; y lactamas, carbodiimidas y compuestos carbonil-diheteroaromáticos activados(as) tales como carbonil-diimidazol. Puede utilizarse también irradiación tal como por ejemplo irradiación ultravioleta y gamma para desactivar el virus.
También se incluyen en la presente descripción partículas de virus atenuadas (es decir, virus que tienen una capacidad reducida para causar los síntomas de la enfermedad misteriosa porcina en los cerdos), y métodos de producción de una partícula de virus atenuada. Métodos de producción de un virus atenuado se conocen en la técnica. Típicamente, un virus de la presente descripción se somete a pases, es decir se utiliza para infectar una célula en cultivo, se deja reproducir, y se cosecha finalmente. Este proceso se repite hasta que la virulencia del virus en los cerdos se reduce. Por ejemplo, el virus puede someterse a pases diez veces en cultivo de células, después de lo cual se mide la virulencia del virus. Si la virulencia no ha disminuido, el virus que no se inyectó en el animal se somete a pases diez veces más en cultivo de células. Este proceso se repite hasta que se reduce la virulencia. En general, la virulencia se mide por inoculación de cerdos con virus, y evaluación de la presencia de síntomas clínicos y/o DL50 (véase, por ejemplo, Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest., 8:11-20 (1996), Halbur et al., Vet. Pathol., 32:200204 (1995), y Park et al., Am. J. Vet. Res., 57:320-323 (1996)). La virulencia puede reducirse hasta que el virus atenuado no causa la muerte de los animales, y tampoco causa síntomas clínicos de la enfermedad.
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Típicamente, un cultivo de células útil para producir un virus atenuado de la presente descripción incluye células de origen mamífero no porcino. Ejemplos de cultivos de células de mamífero no porcinas incluyen, por ejemplo, la línea de células MA-104 (ATCC CRL-2378), la línea de células MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477-483 (1993)), y la línea de células CL-2621 (Baustita et al., J Vet. Diagn. Invest., 5:163-165 (1993)). Se puede utilizar un cultivo de células mixto para producir una partícula de virus atenuada de la presente descripción. En un cultivo de células mixto existen al menos dos tipos de células presentes. Un cultivo de células mixto puede incluir una línea de células inmortalizada o transformada y un cultivo de células primario. Un cultivo de células mixto es particularmente útil cuando un virus se reproduce lentamente, o no se reproduce en absoluto, en una línea de células inmortalizada o transformada. Ejemplos de una línea de células inmortalizada o transformada para uso en un cultivo de células mixto incluyen, por ejemplo, la línea de células MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477-483 (1993)), y la línea de células MA-104 (ATCC CRL-2378). Los cultivos de células primarias para uso en un cultivo de células mixto pueden ser de origen porcino. Un ejemplo preferido de un cultivo de células primario para uso en un cultivo de células mixto son macrófagos primarios alveolares de porcino.
Adicionalmente la presente descripción incluye los polipéptidos codificados por regiones codificantes de nsp2 presentes en los polinucleótidos descritos en la Tabla 2, con inclusión de aquéllos que son viables. Se incluyen también en la presente descripción anticuerpos, con inclusión de anticuerpos monoclonales y policlonales, que se fijan específicamente a un polipéptido codificado por las regiones codificantes de nsp2 presentes en los polinucleótidos descritos en la Tabla 2. El término "anticuerpo", a no ser que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos enteros que retienen su actividad de fijación para un antígeno diana. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2, así como anticuerpos monocatenarios (scFv). Como se utiliza en esta memoria, un anticuerpo que puede "fijarse específicamente" a un polipéptido es un anticuerpo que interacciona únicamente con el epítope del antígeno que indujo la síntesis del anticuerpo, o interacciona con un epítope estructuralmente afín. Un anticuerpo que "se fija específicamente" a un epítope interaccionará, en las condiciones apropiadas, con el epítope incluso en presencia de una diversidad de dianas de fijación posibles. Como se utiliza en esta memoria, el término "complejo polipéptido:anticuerpo" hace referencia al complejo que resulta cuando un anticuerpo se fija específicamente a un polipéptido, o una subunidad o análogo del mismo. En algunos aspectos, un anticuerpo de la presente descripción incluye aquéllos que no se fijan específicamente a un polipéptido nsp2 de longitud total codificado por VR-2332 (v.g., número de acceso a GenBank U87392, aminoácidos 384-1363 del ORF1 (véase también Allende et al. J. Gen. Virol., 80:307-315 (1999) o aminoácidos 384-1580 del ORF1 (véase también Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)). Tales anticuerpos pueden identificarse utilizando métodos de rutina conocidos en la técnica.
Los anticuerpos de la presente descripción se pueden preparar utilizando el polipéptido intacto. Opcionalmente, un polipéptido nsp2 descrito en esta memoria puede estar unido o conjugado covalentemente a un polipéptido portador para mejorar las propiedades inmunológicas del polipéptido. Polipéptidos portadores útiles se conocen en la técnica.
La preparación de anticuerpos policlonales es bien conocida. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse por inmunización con un inmunógeno de una diversidad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, hámster, cobayos y ratas así como animales transgénicos tales como ovejas, vacas, cabras o cerdos transgénicos. Los anticuerpos resultantes pueden aislarse de otras proteínas utilizando una columna de afinidad que tenga un resto de fijación Fc, tal como proteína A, o análogos.
Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse por diversos métodos familiares para los expertos en la técnica. Resumidamente, células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente por fusión con una célula de mieloma, (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse a partir de cultivos de hibridoma por métodos bien conocidos en la técnica.
El anticuerpo puede producirse recombinantemente, por ejemplo, por presentación de fago o por métodos combinatorios. La presentación de fago y los métodos combinatorios pueden utilizarse para aislar anticuerpos recombinantes que se fijan a un polipéptido descrito en esta memoria, o una subunidad biológicamente activa o análogo de la misma (véase, por ejemplo, Ladner et al., Patente EE.UU. nº. 5.223.409). Tales métodos pueden utilizarse para generar anticuerpos monoclonales humanos.
La presente descripción también proporciona composiciones que incluyen un polinucleótido infeccioso, polinucleótido PRRS, partícula de virus, o anticuerpo de la presente descripción. Tales composiciones incluyen típicamente un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en esta memoria, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solución salina, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y análogos, compatibles con administración farmacéutica. Compuestos activos adicionales pueden incorporarse también en las composiciones.
Una composición se puede preparar por métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. En general, una composición puede formularse de modo que sea compatible con su ruta de administración proyectada. Ejemplos de rutas de administración incluyen perfusión y ruta parenteral, v.g. intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (v.g. inhalación), transdérmica (tópica), y transmucosal. Las soluciones o suspensiones pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para administración, solución salina, aceites fijos, polietilen-glicoles,
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glicerina, propilen-glicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenes; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilenodiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; electrólitos, tales como ion sodio, ion cloruro, ion potasio, ion calcio, e ion magnesio, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio
o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Una composición puede confinarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones pueden incluir soluciones acuosas estériles (en el caso de ser solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles. Para administración intravenosa, portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una composición es típicamente estéril y, cuando es adecuada para uso inyectable, debe ser fluida en tal grado que exista susceptibilidad fácil de administración con jeringuilla. La composición debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y estar conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y análogos), y mixturas adecuadas de los mismos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y análogos. En muchos casos, se pueden incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse por inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse soluciones estériles por incorporación del compuesto activo (es decir, un polinucleótido infeccioso o virus PRRS de la presente invención) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, en caso requerido, seguido por esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan por incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los arriba enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación pueden ser secado a vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo o de los mismos previamente esterilizada por filtración.
Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas, trociscos, o cápsulas, v.g., cápsulas de gelatina. Estas composiciones pueden estar también conformadas en un polvo o suspendidas en una solución acuosa de tal modo que estos polvos y/o soluciones puedan añadirse al pienso animal o al agua de bebida de los animales. Estas composiciones pueden estar convenientemente edulcoradas o saborizadas por diversos agentes conocidos para promover la absorción de la vacuna oralmente por el cerdo.
Los compuestos activos se pueden administrar también por cualquier método adecuado para administración de agentes polinucleótidos, v.g., utilizando cañones de genes, bioinyectores, y parches dérmicos así como métodos sin aguja tales como la tecnología de vacunas de DNA de micropartículas descrita por Johnston et al (Patente EE.UU. nº. 6.194.389). Adicionalmente, es posible el suministro intranasal, como se describe, por ejemplo, en Hamajima et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 88:205-210 (1998). Pueden utilizarse también liposomas y microencapsulación.
Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, con inclusión de implantes. Pueden utilizarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Tales formulaciones se pueden preparar utilizando técnicas estándar. Los materiales pueden obtenerse también comercialmente de, por ejemplo, Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Pueden utilizarse también suspensiones de liposomas como portadores farmacéuticamente aceptables. Éstas se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica.
La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos activos pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, v.g., para determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La ratio de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico, y puede expresarse como la ratio DL50/DE50. Se pueden usar compuestos que exhiban índices terapéuticos altos.
Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo de células y estudios en animales pueden utilizarse en la formulación de una gama de dosificaciones para uso en el campo. La dosificación de tales compuestos puede estár basada preferiblemente en una gama de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con toxicidad escasa o nula. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada.
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- Cebador
- Posición en el genoma* Secuencia
- Clonación:
-
imagen10 imagen11
- VR1509/
- 1193811958 5'-GTGAGGACTGGGAGGATTACA (SEQ ID NO:24)
- /extremo 3'-FL
- 1540515411 5'-CTCTTTAATTAACTAG(T)30AATTTCG (SEQ ID NO:25)
- Mutagénesis:
-
imagen12 imagen13
- 5'pOK12HDV257/(SphI, PacI)
- pOK12HDV-PacI 257282 5'-GATGCATGCCATTAATTAAGGGTCGGC (SEQ ID NO:26)
- '3'/3'pOK12HDV257(SphI, PacI)
- pOK12 HDV-PacI 257-282 5'-GCCGACCCTTAATTAATGGCATGCATC (SEQ ID NO:27)
- T7leader-VR2G/
- 1-5 5'-ACATGCATGCTTAATACGACTCACTATAGGTATGAC (SEQ ID NO:28)
- 7475G2A/
- 7453-7477 5'-5Phos/CTGTGTGGACATGTCACCATTGAAA (SEQ ID NO:29)
- 13860C2T/
- 1384313867 5'-5Phos/GTGTATCGTGCCGTTCTGTTTTGCT (SEQ ID NO:30)
- 14979A2G/
- 1495814982 5'-5Phos/CAGATGCTGGGTAAGATCATCGCTC (SEQ ID NO:31)
- Análisis por transferencia Northern:
-
imagen14 imagen15
- /3'-UTR
- 1529815336 5'-GCACAATGTCAATCAGTGCCATTCACCACACATTCTTCC (SEQ ID NO:32)
- /1a-p222
- 221-261 5'-TAGACTTGGCCCTCCGCCATAAACACCCTGGCATTGGGGGT (SEQ ID NO:33)
- * La posición en el genoma está basada en la Presentación a GenBank U87392
Modificación y análisis de la secuencia de los clones de cDNA de longitud total. Se utilizó el Kit de Mutagénesis Dirigida Multisite QuikChange® (Stratagene) para modificar todos los clones de cDNA desde pVR-V4 a pVR-V6G7475A. Las inserciones completas de plásmidos de cDNA genómico se presentaron luego al Centro de Análisis
5 Genético Avanzado de la Universidad de Minnesota (AGAC) para análisis de la secuencia de nucleótidos con cebadores de secuenciación apropiados (Tabla 3). Las diferencias de secuencia entre pVR-V4 hasta pVR-V6G7475A, así como las de VR-2332 parental, su cepa de vacuna atenuada correspondiente, Ingelvac MLV, y pVR-HN, el primer clon infeccioso de VR-2332, se enumeran en la Tabla 4. (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999); Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001); Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)).
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Tabla 4. Diferencias de nucleótidos entre las cepas de PRRSV y los clones infecciosos VR-2332. Únicamente se muestran las posiciones enlas cuales se observaron diferencias de nucleótidos. Los nucleótidos que se representan en la cepa VR-2332 se muestran en recuadros sinsombrear. Los recuadros con sombreado claro representan diferencias de nucleótidos que son exclusivas para el clon infeccioso, los recuadros
con sombreado medio hacen resaltar aquellos nucleótidos que se observan también en Ingelvac® MLV, y los recuadros con sombreado
negro indican nucleótidos exclusivos de porcino. Las regiones que no se secuenciaron se indican por una barra oblicua
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Las bases negativas hacen referencia a aquellos nucleótidos presentes en el RNA después de transcripción y derivados del promotor de RNA* polimerasa inmediatamente aguas arriba del polinucleótido infeccioso. Estos nucleótidos derivados del promotor ya no están presentes típicamente enun polinucleótido infeccioso después que el mismo se ha sometido a pases 9 veces.
Transcripción in vitro. El clon de cDNA de longitud total se linealizó por escisión con PacI, que corta aguas abajo de la cola poliA. Se produjeron transcritos de RNA protegidos terminalmente [análogo de la caperuza m7G(5')ppp(5')G] utilizando el Kit mMESSAGE MACHINE™ (Ambion) y una ratio optimizada 2:1 de análogo metilado de la caperuza a GTP. Se generaron aproximadamente 50 a 60 μg de RNA a partir de 2 μg de matriz de DNA en 20 μl de mixtura de
5 reacción. El aumento de la ratio de análogo de la caperuza a GTP reducía sustancialmente el rendimiento de RNA. Se purificó subsiguientemente el RNA con fenol ácido-cloroformo seguido por precipitación con isopropanol y se resuspendió en tampón TE exento de nucleasas (pH 8,0). El RNA se evaluó respecto a calidad por comparación de tamaños con RNA viral de VR-2332 de tipo salvaje en un gel de agarosa desnaturalizante con 1% de glioxal, y se cuantificó por espectrofotometría a DO260.
10 Transfección de las células MARC-145. Se generó un procedimiento de transfección modificado basado en el método descrito por Nielsen et al., (J. Virol., 77:3702-3711 (2003)). Para la transfección, se sembraron las células MARC-145 en placas de 6 pocillos (2-3 x 105 células/pocillo) en 3 ml de medio completo [EMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS)] y se incubaron luego a 37ºC, 5% CO2 durante 20-24 horas hasta aproximadamente 80% de confluencia (Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126 (1992)). Se combinaron 4 μg
15 de RNA transcrito in vitro diluido en 500 μl de Medio de Suero Reducido Opti-MEM® I (Invitrogen) y 2 μl de bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi-etil-amonio y colesterol (DMRIE-C; Invitrogen) diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM®, y se agitaron con brevedad enérgicamente. Las células MARC-145 se lavaron una sola vez con 2 ml de medio Opti-MEM® y se cubrieron inmediatamente después con la solución del complejo lípido:RNA. Se utilizó DMRIE-C sin RNA (2 μl) como control negativo y se empleó como control positivo DMRIE-C con 10-100 ng de RNA
20 viral purificado de la cepa (tipo salvaje) wt VR-2332. Después de 4 horas de exposición a los complejos lípido:RNA, se lavaron las monocapas y se añadió medio completo nuevo (EMEM con 10% FBS). Los sobrenadantes de las células transfectadas se monitorizaron diariamente respecto a la aparición de efecto citopático (CPE) y se sometieron a pases sobre MARC-145 nuevas 72-96 horas después de la transfección.
Detección del RNA viral de la progenie. Para testar el RNA viral de la progenie, se cosecharon sobrenadantes de
25 cultivo celular de células MARC-145 transfectadas e infectadas. Se aisló el RNA con el Kit de RNA viral QiaAmp (Qiagen). Se realizó la RT-PCR con pares de cebadores seleccionados, específicos para los nucleótidos de la cepa VR-2332 que eran indicativos de residuos mutados de clones infecciosos (Tabla 3). La confirmación de la progenie de clones infecciosos se obtuvo por verificación de la secuencia nucleotídica de nucleótidos específicos de clones presentes en los productos RT-PCR.
30 Detección de la proteína de la nucleocápsida viral de la progenie. Se utilizaron ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA) para detectar la expresión de proteínas virales en células MARC-145 transfectadas con RNA transcrito in vitro, o infectadas con el virus de la progenie, dispuestas en cubreobjetos. Las células infectadas se fijaron en paraformaldehído al 3,7% con solución salina tamponada con fosfato (PBS), de pH 7,5, a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células fijadas se lavaron con PBS, se incubaron a 37ºC durante 45 minutos en el
35 anticuerpo monoclonal SDOW17 específico de la proteína de la nucleocápsida del PRRSV (Magar et al., Can. J. Vet. Res., 59:232-234 (1995)) y se incubaron posteriormente con inmunoglobulina G (IgG) anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína a 37ºC durante 45 minutos más (dilución 1:100) (Sigma). Se lavaron los cubreobjetos con PBS, se montaron en portaobjetos utilizando aceite de soporte de gel, y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia.
40 Ensayo de calvas virales. Monocapas de células MARC-145 en placas de 6 pocillos se infectaron con sobrenadante de células (en diluciones al décuplo) procedente de células MARC-145 transfectadas o infectadas por incubación a la temperatura ambiente durante 1 hora. Las monocapas infectadas se lavaron subsiguientemente una sola vez con EMEM nuevo/10% FBS, se cubrieron inmediatamente con Agarosa SeaPlaque estéril al 1% (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, Maine) en 1X MEM (Sigma M4144)/10% FBS/2% (p/v) NaHCO3/1X glutamina/1X
45 aminoácidos no esenciales/10 mM HEPES/2% (v/v) gentamicina, y se incubaron a 37ºC/5% CO2, invertidas, durante 5 días. Después de eliminación cuidadosa de la agarosa, las células se tiñeron con 5% de violeta cristal en etanol al 20% durante 10-30 minutos para visualización del tamaño de las calvas.
Curva de crecimiento viral. Monocapas MARC-145 en matraces T-75 se inocularon con PRRSV parental o recombinante diluido en EMEM exento de suero a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001. Después de 1 hora 50 de fijación a la temperatura ambiente con mezcladura cuidadosa, se eliminaron los inóculos y se lavaron 3 veces las monocapas con EMEM exento de suero. Después del lavado, se añadieron 4 ml de medio completo y los matraces se incubaron subsiguientemente durante hasta 5 días a 37ºC, 5% CO2. Se cosecharon inmediatamente partes alícuotas (0,5 ml) después de la adición de medio (momento puntual de 0 horas) y al cabo de 24, 48, 72, 96 y 120 horas, y se guardaron a -80ºC. Se utilizaron diluciones seriadas de las muestras para infectar células MARC-145
55 nuevas y las células se procesaron luego como se ha descrito arriba. Después de eliminar la agarosa, se visualizaron y contaron las calvas. Los resultados de la curva de crecimiento se expresaron como PFU/ml.
Inoculación in vivo del virus de la progenie. Diez cerdos de 4 semanas de edad de raza y sexo mixtos procedentes de una piara PRRSV-seronegativa se dividieron en 3 grupos, constituidos cada uno por dos animales. El primer grupo recibió 103,5 dosis infecciosas de cultivo de tejido al 50% (TCID50) de virus clonado (pVL-V5, tercer pase en 60 células MARC-145) por ml, el segundo grupo recibió 105,4 TCID50 por ml de la cepa del virus parental VR-2332 (cuarto pase en células MARC-145), y el tercer grupo se inoculó falsamente con EMEM. Todos los animales
19
recibieron 2 ml de inoculo por inyección intramuscular. Los animales se mantuvieron en salas separadas a lo largo del experimento y se observaron diariamente respecto a síntomas clínicos. Todos los cerdos se sacrificaron por eutanasia el día 28 después de la infección. Para recuperar el virus, las muestras individuales de suero se diluyeron 5 veces con EMEM incompleto y se pusieron sobre monocapas nuevas de MARC-145 durante 1 a 2 horas a la
5 temperatura ambiente con agitación cuidadosa. Se retiraron luego los inóculos y se añadió EMEM completo. Las células infectadas se incubaron a 37ºC, 5% de CO2 y se observaron diariamente. Una vez que fue evidente el CPE, los sobrenadantes de células infectados se congelaron a -80ºC hasta su caracterización posterior.
Análisis por Transferencia Northern. Transcritos de pVR-V6G7475A se transfectaron en células MA104 y se sometieron luego a pases sobre células nuevas durante varios pases. Para el análisis por transferencia Northern 10 subsiguiente, los sobrenadantes del pase 1 (P1), P3, P6, P8 y P10 se diluyeron en una ratio 1:50 y se utilizaron luego para infectar células (1 ml/matraz T75) el mismo día. Al mismo tiempo, se diluyó al décuplo suero de porcino infectado y se utilizó luego (1 ml) para infectar un matraz T75 separado. El efecto citopático se observó el día 3 p.i. para todos los matraces. El RNA intracelular se extrajo utilizando un Kit RNeasy Midi (Qiagen) y se sometió a electroforesis (15 μg/muestra) en un gel desnaturalizante de glioxal como se ha descrito previamente (Nelsen et al.,
15 J. Virol., 73:270-80 (1999)). Como control se corrió RNA transcrito de pVR-V6G7475A (100 ng). Después de transferencia del RNA a Membrana de Transferencia de Nailon Magnagraph de 0,45 micrómetros (Osmonics), se sondó la membrana con oligonucleótido marcado/1a-p222, marcado en un extremo con γ-32P-ATP (Amersham) utilizando polinucleótido-quinasa (Promega) como se ha descrito previamente (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)).
20 Análisis de la secuencia de ácido nucleico del virus de la progenie. Se realizó una amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos del cDNA (RACE) con el Kit de Amplificación de cDNA SMART™ RACE (BD Bioscience) o el Juego 5' ó 3'-Full Race Core (TaKaRa Bio Inc.) en RNA viral aislado con el Mini Kit de RNA Viral QIAmp® (Qiagen). La secuencia de nucleótidos remanente se determinó a partir de los productos RT-PCR de pares de cebadores desarrollados para cubrir el genoma entero de la cepa VR-2332 (Tabla 3), como se ha descrito previamente (Yuan et
25 al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). Los productos se presentaron para determinación de la secuencia de ácido nucleico en el Centro de Análisis Genético Avanzado en la Universidad de Minnesota. La secuencia viral completa con al menos recubrimiento triple se ensambló inicialmente con el paquete SeqMan del software de análisis de secuencias Lasergene® (DNASTAR, Inc.), y se analizó ulteriormente utilizando el software GCG Wisconsin Package versión 10.3 ((Accelrys Inc.). Se utilizaron la cepa VR-2332 (Acceso a GenBank U87392), la cepa Ingelvac® MLV
30 (Acceso a GenBank AF066183) y el clon de cDNA pVR-HN (Acceso a GenBank AY150564; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)) en todas las comparaciones de nucleótidos para cepas de virus recombinantes.
Resultados
Modificación del vector pOK12. pOK12 (Acceso a GenBank AF223639; Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), un vector de clonación de bajo número de copias, se modificó por digestión con SmaI (sitio de enzima en el par de 35 bases 263 en pOK12) y SalI (sitio en pb 307) e inserción del fragmento de 244 pb SmaI-SalI del vector 2.0 (7) que contenía la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV). El vector (pOK12HDV) se modificó ulteriormente por mutagénesis de un sitio KpnI existente (sitio pOK12 HDV en el pn 273) para insertar un sitio de enzima de restricción PacI mediante el uso del par de cebadores 5'-pOK12 HDV-257SphIPacI/3'-pOK12HDV-257SphIPacI. La ribozima de HDV Se añadió para proporcionar una escisión eficaz exactamente en el extremo 3' del tramo poliA. Los estudios
40 realizados revelaron que la modificación no era necesaria para obtener virus de progenie infeccioso.
Construcción de clones de cDNA de longitud total. La estrategia de clonación se representa en la Figura 2. Cuatro fragmentos de genoma solapantes se amplificaron a partir de RNA viral purificado de VR-2332 por RT-PCR utilizando los pares de cebadores indicados (Figura 2, Tabla 3). Cada fragmento se clonó individualmente en el vector pCR® 2.1-TOPO® para generar el clon intermedio pCR-SphI-FseI (segmento I), pCR-FseI-AvrII (segmento II), 45 pCR-AvrII-BsrGI (segmento III), y pCR-BsrGI-PacI (segmento IV). Los clones de cDNA se digirieron luego con dos enzimas de restricción singulares como se indica por el nombre del clon. Los cuatro fragmentos se purificaron en gel y se ligaron escalonadamente al vector pOK12HDV-PacI para generar un clon de cDNA de longitud total de PRRSV (pVR-V4). En el clon de cDNA de longitud total, la secuencia genómica viral estaba dirigida por el promotor de RNApolimerasa T7 y seguida por una cola de ácido poliadenílico de 50 nucleótidos. Los transcritos de RNA del clon pVR
50 V4 no exhibían la infectividad típica del PRRSV cuando se transfectaron en células permisivas, aunque pudo detectarse RNA viral a lo largo de varios pases. Cuando se comparó con la cepa VR-2332, se detectaron un total de 45 mutaciones de nucleótidos (Tabla 4) que conducían a 21 cambios de aminoácidos (Tabla 5), aunque varias mutaciones eran iguales que las identificadas previamente en Ingelvac® MLV (Yuan et al., Virus Res., 61:87-98 (1999)).
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