ES2603589T3

ES2603589T3 - Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos quiméricos para la identificación sistemática de bibliotecas

Info

Publication number: ES2603589T3
Application number: ES12784580.8T
Authority: ES
Inventors: David CASAGOLDA VALLRIBERA; Frank KRONER; Michael Schraeml
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-11-08
Filing date: 2012-11-08
Publication date: 2017-02-28
Anticipated expiration: 2032-11-08
Also published as: WO2014071978A1; EP2917388B1; US20190292535A1; EP2917388A1; US12540318B2

Abstract

Una composición de moléculas de ácido nucleico (ARN y/o ADN) que codifican una población de especies de polipéptido quimérico, en la que cada molécula de ácido nucleico codifica una especie de polipéptido quimérico de acuerdo con la fórmula I NH2-S2-X-S1-COOH (fórmula I), en la que X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia variable, S2 y S1 son secuencias de aminoácidos no variables y no solapantes obtenidas a partir de (i) un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/trans-isomerasa (actividad de PPIasa) o a partir de (ii) un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP, - entre dos aminoácidos representa un enlace peptídico, y X está insertado en el lugar del dominio de inserción de Flap (dominio de IF) del polipéptido de (i) o del polipéptido de (ii).

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

En una realización específica adicional, en la etapa (3), el extremo N-terminal y el extremo C-terminal del polipéptido están conectados de forma covalente con un grupo de unión.

En una realización específica adicional, la secuencia de aminoácidos del polipéptido está libre de restos de cisteína.

En una realización específica adicional, ya sea en la etapa (2) o en la etapa (3), se añade un resto de cisteína a cada uno del extremo N-terminal y el extremo C-terminal del polipéptido, an y se forma un puente a disulfuro entre los dos restos de cisteína añadidos, produciendo de ese modo el polipéptido restringido, siendo el polipéptido restringido un aglutinante específico de la diana predeterminada.

En una realización específica adicional, se añade un resto de aminoácido adicional a un resto de cisteína añadido.

Además, en el presente documento se desvela un método para evaluar una diana predeterminada (diana) en una muestra de la que se sospecha que contiene la diana, comprendiendo el método las etapas de

(1): identificar, de acuerdo con un método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de todos los aspectos como se informa en el presente documento, una secuencia de aminoácidos de un dominio X que se une a la diana predeterminada, en la que el dominio X se identifica como un dominio que sustituye al dominio de IF en (i) un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/trans-isomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP;

(2): proporcionar un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de acuerdo con la fórmula I

NH2-S2-X-S1-COOH (fórmula I),

en la que

X es la secuencia de aminoácidos identificada en la etapa (1), S2 y S1 son secuencias de aminoácidos no variables y no solapantes obtenidas a partir (i) de un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/trans-isomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) a partir de un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP, -entre dos aminoácidos representa un enlace peptídico, y X está insertado en el lugar del dominio de inserción de Flap (dominio de IF) del polipéptido de (i) o del polipéptido de (ii);

(3): poner en contacto la muestra con el polipéptido quimérico de la etapa (2) en condiciones que permitan la unión específica del polipéptido quimérico a la diana, formando de ese modo una mezcla de polipéptido quimérico no unido y, si la diana estuviera presente, polipéptido quimérico unido, estando el polipéptido quimérico unido, unido a la diana, proporcionando de ese modo una muestra tratada;

(4): retirar, en condiciones que permitan la unión específica, el polipéptido quimérico no unido de la muestra tratada de la etapa 3, proporcionando de ese modo una muestra sondeada;

(5): detectar el polipéptido quimérico en la muestra sondeada de la etapa (4), en el que la presencia de polipéptido quimérico en la muestra sondeara es indicativa de que la diana está presente en la muestra;

evaluando de ese modo la diana predeterminada en la muestra de la que se sospecha que contiene la diana predeterminada.

En una realización específica, en la etapa (5) el polipéptido quimérico se detecta de forma cuantitativa en la muestra sondeada de la etapa (4).

(3): proporcionar un polipéptido restringido que es un conector específico de la diana predeterminada, siendo el polipéptido restringido producido con un método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de todos los aspectos como se informa en el presente documento;

(3): poner en contacto la muestra con el polipéptido restringido de la etapa (1) en condiciones que permitan la unión específica del polipéptido restringido a la diana, formando de ese modo una mezcla de polipéptido restringido no unido, y si la diana estuviera presente, polipéptido restringido unido, estando el polipéptido restringido unido, unido a la diana, proporcionando de ese modo una muestra tratada;

(3): retirar, en condiciones que permitan la unión específica, el polipéptido restringido no unido de la muestra tratada de la etapa 3, proporcionando de ese modo una muestra sondeada;

(4): detectar el polipéptido restringido en la muestra sondeada de la etapa (4), en el que la presencia de polipéptido restringido en la muestra sondeada es indicativa de que la diana está presente en la muestra;

imagen6

imagen7

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente similares" entre sí si son similares en entre sí en al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, o al menos un 55 %. Opcionalmente, esta similitud existe con respecto a la región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 aminoácidos, o más habitualmente con respecto a la región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 100 a 500 o 1000 o más aminoácidos. Para comparación de secuencias, por lo general una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se diseñan coordenadas de subsecuencias, si fuera necesario, y se diseñan parámetros de programa de algoritmo de secuencias. Normalmente se usan parámetros de programa por defecto, o se pueden diseñar parámetros alternativos. A continuación el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades o similitudes de las secuencias para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Como se usa en el presente documento, se entiende que "detectar", "detección" y similares se usan en un ensayo realizado para identificación de un analito específico en una muestra, un producto a partir de una construcción de indicador en una muestra, o una actividad de un agente en una muestra.

Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son notaciones para todos los valores dentro del intervalo. Esto incluye todas las secuencias individuales cuando se proporciona un intervalo de SEQ ID NOs. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números, o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50.

Los términos "un", "uno" y "el" por lo general incluyen referentes en plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Como se usa en el presente documento, se entiende que "pluralidad" se refiere a más de uno. Por ejemplo, una pluralidad se refiere a al menos dos, tres, cuatro, cinco, o más. A menos que se indique de forma específica o sea evidente a partir del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que el término "o" es inclusivo.

A menos que se indique de forma específica o sea evidente a partir del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que el término "aproximadamente" esta dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Aproximadamente se puede entender como dentro de un 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, o un 0,01% del valor indicado. A menos que sea evidente a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento se pueden modificar con el término aproximadamente.

Una "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a un material biológico que se aísla de su entorno (por ejemplo, sangre o tejido de un animal, células, o medio acondicionado a partir de cultivo tisular) y se sospecha que contiene, o se sabe que contiene un analito, tal como un virus, un anticuerpo, o un producto de una construcción de indicador. Una muestra también puede ser una fracción purificada parcialmente de un tejido o fluido corporal.

Un agente, polipéptido, ácido nucleico, u otro compuesto "se une de forma específica a" una diana, por ejemplo, antígeno, polipéptido, ácido nucleico, u otro compuesto, cuando la diana se une con una preferencia de al menos 50 veces, de forma específica al menos 100 veces, de forma específica al menos 500 veces, de forma específica al menos 1000 veces, de forma específica al menos 5000 veces, de forma específica al menos 10.000 veces en comparación con un compuesto no específico, o una combinación de compuestos no específicos. Que se une de forma específica se puede usar en relación con uno de dos o más compuestos relacionados que tienen estructuras físicamente relacionadas. Las preferencias y afinidades de unión, absolutas o relativas, se pueden determinar, por ejemplo, mediante la determinación de la afinidad para cada par por separado o mediante el uso de ensayos de competición u otros métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

La expresión "selección", como se usa en el presente documento, se refiere al proceso de una técnica de selección por afinidad que selecciona péptidos o polipéptidos, de forma específica polipéptidos quiméricos (también denominados de forma colectiva "aglutinantes") que se unen a una diana predeterminada (dada). El proceso de selección implica cuatro etapas principales para selección de aglutinantes. La primera etapa es proporcionar una biblioteca de presentación. En una realización específica, la biblioteca de presentación es una composición que comprende una población de complejos ternarios como se describe en cualquiera de las realizaciones que se desvelan en el presente documento. La segunda etapa es la etapa de captura. Esta implica poner en contacto la biblioteca de presentación con la diana deseada. En una realización específica, la diana está inmovilizada. A modo de interacción de unión específica, solamente los dominios de unión presentados específicos presentados por cualquiera de los péptidos, polipéptidos y polipéptidos quiméricos se unen a la diana. La tercera etapa es una etapa de separación, posterior a la etapa de captura, para separar los miembros unidos de la biblioteca de presentación de los miembros no unidos por medio de retirada de los miembros no unidos. En una realización específica, la separación se realiza como una etapa de lavado en la que una mezcla que comprende diana inmovilizada con miembros unidos de la biblioteca de presentación se lava, retirando de ese modo los miembros no unidos. Como

imagen9

imagen10

imagen11

5

15

25

35

45

55

65

En una realización más específica de la misma, X es GAGS-O-GSS, en el que O es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia variable a presentar por el polipéptido quimérico de SlyD de Thermus thermophilus.

Los polipéptidos quiméricos, como se informa en el presente documento, se basan en a polipéptidos a partir de la familia de proteínas del dominio FKBP (es decir, proteínas con actividad de PPIasa), tales como FKBP12 humano (Handschumacher, R.E., et al., Science 226 (1984) 544-547), o FKBP13 de Arabidopsis thaliana, o SlyD de E. coli, o SlyD de Thermus Thermophilus, o SlyD de Thermococcus gammatolerans. Los polipéptidos quiméricos, como se informa en el presente documento, son un armazón para la presentación de polipéptidos comprendidos en la secuencia de aminoácidos de X.

La secuencia de aminoácidos de X puede sustituir el dominio Flap (restos de aminoácidos A85 a A96) y en el dominio beta-contracción (restos de aminoácidos S39 a P46) en la parte de FKBP12 y/o el dominio de IF (restos de aminoácidos G69 a D120) en la parte de SlyD.

Cualquier secuencia de aminoácidos se puede insertar como dominio X, tal como hélices, he motivos de hélice-girohélice, estructuras superenrolladas, manojos de hélice, motivos de giro-bucle, estructuras de beta-horquilla, láminas beta, motivos de lámina-hélice, motivos de lámina-giro-lámina, etc. También es posible presentar estructuras terciarias nativas definidas, dominios individuales de un polipéptido de múltiples dominios o subdominios, dominios de unión, fragmentos de anticuerpo, enzimas, etc. Son particularmente adecuados los polipéptidos o dominios de origen natural que comprenden aproximadamente 100 aminoácidos o más que, en su estado nativo, se caracterizan por extremos N-terminales y C-terminales estrechamente localizados entre sí (en el intervalo de 4 x 10-10 m a aproximadamente 10 x 10-10 m).

Los polipéptidos quiméricos, como se informa en el presente documento, son armazones adecuados para imitar una pluralidad estructural de motivos de estructura secundaria péptica (incluyendo los dominios X y O).

El SlyD de Thermus Thermophilus (Loew, C., et al., J. Mol. Biol. 398 (2010) 375-390) se origina a partir de la bacteria arcaica Thermus Thermophilus. El SlyD de Thermococcus gammatolerans se origina a partir de las Arqueas Thermococcus gammatolerans. Ambas proteínas muestran una estabilidad termodinámica elevada en contraste con FKBP12 humano, FKBP13, FKBP12/13 quimérico, así como con SlyD de E. coli.

El SlyD de Thermus thermophilus así como el SlyD de Thermococcus gammadurans son proteínas altamente estables con la capacidad de plegarse de forma reversible incluso cuando su dominio Flap se está sustituyendo con una inserción X de aminoácido extraño. Estas moléculas se pueden usar en presentación ribosomas, básicamente de acuerdo con el método de Mattheakis, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (1994) 9022-9026) para presentar una secuencia de polipéptidos X en los marcos de of SlyD de Thermus thermophilus o SlyD de Thermococcus gammadurans. El denominado complejo ternario consiste en (1) las subunidades ribosómicas unirás al (2) ARNm que codifica la información genética del (3) polipéptido quimérico presentado de forma ribosómica o polipéptido quimérico emergente.

Los polipéptidos quiméricos, como se informa en el presente documento, se pueden usar para generar una multitud de secuencias variables. Las bibliotecas se pueden identificar sistemáticamente para seleccionar entre los polipéptidos quiméricos las especies de las que la secuencia de aminoácidos de (ii) es capaz de unirse de forma específica a una diana. En el aglutinante seleccionado resultante, la secuencia de aminoácidos se inserta en la una

o más partes obtenidas a partir del uno o más polipéptidos con actividad de PPIasa o que pertenecen a la familia de FKBP.

Una realización en particular desvelada en el presente documento es la identificación sistemática de biblioteca a modo de presentación de ribosomas. Un concepto importante de presentación de ribosomas es traducir una biblioteca de moléculas de ARNm con una cantidad de ribosomas funcionales. Si una molécula de ARNm no tiene codón de parada, el ribosoma frecuentemente se desplazará hacia el extremo de la molécula de ARNm. El polipéptido correspondiente emerge del ribosoma mientras que su extremo está todavía dentro del túnel ribosómico, y su último aminoácido todavía está conectado al peptidil-ARNt. La liberación del polipéptido del ribosoma normalmente está catalizada por los factores de liberación, que son proteínas que se unen a los codones de parada UGA, UGG y UAA, tomando el lugar de un ARNt en codones de "sentido" normales. En ausencia de codones de parada, esta unión de factores de liberación no se produce. Además, el ARNm solamente se puede liberar del ribosoma después de que la proteína recién sintetizada y el ARNt ya se hayan disociado, y esto está causado por el factor de reciclado ribosómico. Por lo tanto, los ribosomas que traducen el ARNm sin codones de parada quedarán atrapados en una forma en la que el polipéptido traducido ha emergido del ribosoma y el ARNm todavía está conectado al ribosoma, conectando de este modo el fenotipo (el polipéptido traducido) y el genotipo (el ARNm). Por lo tanto, la reacción real consiste en una breve reacción de traducción in vitro que se detiene en las condiciones apropiadas.

Una realización en particular que se desvela en el presente documento es una composición de moléculas de ácido nucleico (ADN y/o ARN) de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de todos los aspectos como se informa en el presente documento, con las moléculas de ácido nucleico codificando una población de especies de polipéptidos

5

15

25

35

45

55

65

quiméricos, en la que, en cada molécula de ácido nucleico, la secuencia que codifica la especie en particular de polipéptido quimérico está fusionada con una secuencia adicional que codifica una unión C-terminal. En una realización específica, la unión es capaz de llenar un túnel ribosómico.

Los polipéptidos, como se informa en el presente documento, son particularmente útiles en diferentes realizaciones de presentación, incluyendo presentación de fagos, presentación de ARNm y presentación de ribosomas. De forma específica, la presente divulgación presenta una composición de moléculas de ácido nucleico que codifican una población de polipéptidos que, de forma más específica, son polipéptidos quiméricos. Estos se pueden usar para presentación de estructura peptídica, secundaria y terciaria incluyendo métodos para identificación sistemática/selección para unión a diana de un dominio variable comprendido en los polipéptidos quiméricos. Los polipéptidos, como se informa en el presente documento, se pueden producir de forma recombinante, son termodinámicamente estables, monoméricos y solubles en soluciones acuosas.

Un aspecto, como se divulga en el presente documento, es una composición de moléculas de ácido nucleico (ARN y/o ADN) que codifica una población de especies de polipéptido quimérico, en la que cada molécula de ácido nucleico codifica una especie de polipéptido quimérico de acuerdo con la fórmula I

NH2-S2-X-S1-COOH (fórmula I),

en la que

X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia variable, S2 y S1 son secuencias de aminoácidos no variables y no solapantes obtenidas a partir (i) de un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/trans-isomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) a partir de un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP, -entre dos aminoácidos representa un enlace peptídico, y X está insertado en el lugar del dominio de inserción de Flap (dominio de IF) del polipéptido de (i) o del polipéptido de (ii).

En una realización de todos los aspectos, como se informa en el presente documento, los ácidos nucleicos están en forma de ARNm, es decir, en la realización específica, los ácidos nucleicos son moléculas de ARN capaces de ser traducidas por ribosomas funcionales. Además, en una realización específica más, en cada uno de los ARNm, el marco de lectura que codifica el polipéptido quimérico carece de un codón de parada, en particular un codón de parada seleccionado entre el grupo que consiste en UGA, UGG, y UAA.

Los polipéptidos quiméricos codificados, como se informa en el presente documento, son polipéptidos quiméricos que comprenden (i) una o más partes obtenidas a partir de uno, es decir el mismo, o diferentes polipéptidos con actividad de PPIasa o que pertenecen a la familia de FKBP, y (ii) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia variable (indicada por "X" o "dominio X") insertada entre en la misma. De forma específica, una secuencia de aminoácidos variable de X está insertada en el lugar del dominio de inserción de Flap (dominio de IF) de la parte de SlyD del polipéptido quimérico, como se informa en el presente documento.

En una realización de todos los aspectos, como se informa en el presente documento, X se puede seleccionar entre un fragmento de un polipéptido de origen natural o X comprende una secuencia de aminoácidos aleatoria.

En una realización de todos los aspectos, como se informa en el presente documento, X comprende una secuencia de aminoácidos de 5 a 500 restos, en particular de 10 a 250 restos, en particular de 50 a 150 restos, en particular de 5 a 75 restos. En realizaciones específicas, X comprende una secuencia de aminoácidos de 12, 13, 14, 15 o 16 restos.

Además, en el presente documento se desvela el uso, en un sistema de traducción in vitro, de una composición de moléculas de ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos, estando la composición especificada de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de todos los aspectos como se informa en el presente documento, para presentar miembros o miembros emergentes de la población codificada de especies de polipéptidos quiméricos en complejos ternarios, en la que cada complejo ternario comprende una molécula de ARN de la composición de moléculas de ARN como ARNm, y un ribosoma funcional. Además, en el presente documento se desvela el uso, en un sistema de transcripción/traducción in vitro, de una composición de moléculas de ADN y ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos, estando la composición especificada de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de todos los aspectos como se informa en el presente documento, para presentar miembros o miembros emergentes de la población codificada de especies de polipéptidos quiméricos en complejos ternarios, en la que cada complejo ternario comprende una molécula de ARN de la composición de moléculas de ARN como ARNm, y un ribosoma funcional. Además, en el presente documento se desvela una composición que comprende una población de complejos ternarios, comprendiendo cada complejo ternario un ARNm y un ribosoma funcional, comprendiendo los ARNm de la población de complejos ternarios una composición de moléculas de ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de todos los aspectos como se informa en el presente documento, en la que cada

5

15

25

35

45

55

65

complejo ternario presenta un miembro de una especie codificada de polipéptidos quiméricos o un miembro emergente de una especie codificada de polipéptidos quiméricos. Los complejos ternarios, como se desvela en el presente documento, se pueden usar en procedimientos de selección con respecto a una diana predeterminada. En los procedimientos de selección, se selecciona una secuencia de aminoácidos de X que se une de forma específica a la diana.

Para que la presentación de ribosomas permita la selección de polipéptidos funcionales con propiedades deseadas tales como unión a una diana predeterminada, el polipéptido presentado se debe plegar en su estructura tridimensional correcta mientras que todavía está unido al ribosoma. Como se desvela en el presente documento, una especie de polipéptidos quiméricos de fórmula I es particularmente útil para este fin ya que él armazón obtenido a partir (i) de un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/trans-isomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) a partir de un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP limita la conformación del dominio X que se inserta en lugar del dominio de inserción de Flap (dominio de IF) del polipéptido de (i) o del polipéptido de (ii). Debido a esta limitación, se reducen los grados de libertad para que el dominio X se pliegue, y por lo tanto se reduce el número de posibles conformaciones de X. Dado que X comprende 5 o más aminoácidos, cuanto más corta sea la secuencia de aminoácidos de X, más fuerte es este efecto estabilizante en la conformación de X. Cuanto más fuerte es el efecto estabilizante en la conformación de X, menores son los grados de libertad para X a presentar en conformaciones sustancialmente diferentes. De forma específica, el efecto estabilizante es particularmente fuerte cuando la secuencia de aminoácidos de X comprende de 5 a 500 aminoácidos, de forma más específica de 10 a 250 aminoácidos, de forma más específica de 50 a 150 aminoácidos, de forma más específica de 5 a 75 aminoácidos, de forma más específica de 10 a 30 aminoácidos, de forma más específica de 10 a 20 aminoácidos.

Además, para que la presentación de ribosomas permita la selección de polipéptidos funcionales con propiedades deseadas tales como unión a una diana predeterminada, normalmente se añade una región de "unión" o "espaciadora" y se fusiona con el extremo C-terminal de una biblioteca de polipéptidos. Tal espaciador. Está codificado genéticamente como una fusión en la posición 3’ con respecto a la biblioteca de ADN de interés, que corresponde a una fusión C-terminal en el nivel de la secuencia de aminoácidos. Este espaciador polipeptídico fusionado en C-terminal llena el túnel ribosómico y proporciona una cierta flexibilidad extra, permitiendo de este modo que la proteína de interés se pliegue como una unidad independiente y segura a la diana. En realizaciones específicas, el espaciador puede comprender una secuencia de bloqueo de la traducción, tal como SecM.

En una realización específica adicional de acuerdo con la divulgación en el presente documento, el ARNm que codifican la biblioteca está protegido frente a la digestión nucleolítica, por ejemplo por la presencia de una estructura de horquilla de ARN en el extremo en la posición 3’ del ARNm.

Con respecto a la estabilidad de los complejos ternarios resultantes entre ARNm, ribosomas, y polipéptido traducido, en condiciones experimentales apropiadas, los complejos son estables y se pueden mantener durante más de 10 días permitiendo de ese modo selecciones de velocidad de disociación muy amplias. Esta estabilización es posible enfriando los complejos ternarios y añadiendo una concentración elevada de Mg2+ al tampón, que se cree que "reticula" los grupos fosfato en el ARN ribosómico, y de este modo se puede evitar la disociación de los complejos ribosómicos a temperaturas disminuidas. Una ventaja del mantenimiento de los complejos ternarios es que parece que los polipéptidos presentados en el ribosoma son menos propensos a la agregación. Aunque las selecciones se tienen que realizar a baja temperatura, las moléculas seleccionadas tienen las mismas afinidades elevadas a temperaturas elevadas.

A modo de ilustración no limitante, las etapas de presentación de ribosomas conocidas en la técnica, por ejemplo mediante la divulgación de Lipovsek D. y Plückthun A. J. Immunol. Methods 290 (2004) 51-67, se pueden resumir como sigue a continuación. (1) Una biblioteca de ADN que codifican polipéptido de interés se fusiona en marco con respecto a una región de unión C-terminal mediante ligación de ADN. Este ADN no porta un codón de parada y se transcribe en el ARNm. (2) El ARNm se usa como molde para traducción in vitro. Después de traducir toda la secuencia codificante, el ribosoma se detiene y el polipéptido traducido que ha emergido del ribosoma se pliega en una estructura tridimensional. Como resultado, se obtienen complejos ternarios. (3) La diana se añade, por ejemplo, en forma biotinilada, y los complejos ternarios se unen y capturan, por ejemplo, mediante perlas magnéticas revestidas con estreptavidina, y se lavan para retirar los miembros de la biblioteca que se unen débilmente o que no se unen de forma específica. (4) Para recuperar la biblioteca enriquecida para secuencias de unión a diana, se añade EDTA para desestabilizar los complejos ternarios y el ARNm se aísla de los complejos ternarios disociados. Como alternativa, se puede realizar una elución competitiva con la molécula diana antes de aislar el ARNm. (5) Una reacción de transcripción inversa seguida de PCR (RT/PCR) proporciona el molde de ADN para la siguiente ronda. En esta etapa, se puede usar opcionalmente PCR propensa a error para aumentar la diversidad centrada alrededor de las secuencias enriquecidas. Dependiendo de la complejidad de la biblioteca, el tipo de armazón de proteína y de la diana, pueden ser necesarias de dos a seis rondas de selección para seleccionar proteínas con baja afinidad nanomolar o subnanomolar para la diana.

Además, en el presente documento se desvela un método o de presentación de ribosomas para identificar una secuencia de aminoácidos de un dominio X que se une a una diana predeterminada, comprendiendo el método las etapas de

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

5

15

25

35

45

55

65

estuviera presente, cada uno de U y/o Z es una secuencia de aminoácidos no variable que comprende de 1 a 10 restos, y U, si estuviera presente, se une con un enlace peptídico a S2, y Z, si estuviera presente, se une con un enlace peptídico a S1.

7.: La composición de acuerdo con el punto 6, en la que cada uno de U y/o Z es una secuencia de aminoácidos de 1 a 5 restos, y en particular de 4 restos.

8.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 6 y 7, en la que U, si está presente, es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (GAGS), y Z, si está presente, es la secuencia de aminoácidos GSSG (SEQ ID NO: 2) o la secuencia de aminoácidos GSS (SEQ ID NO: 3).

9.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 6 a 8, en la que la secuencia de aminoácidos de O está formada por un subconjunto de los restos de aminoácidos de origen natural.

10.: La composición de acuerdo con el punto 9, en la que cada resto de la secuencia de aminoácidos de O se selecciona independientemente entre el listado de restos de aminoácidos que consiste en Y, F, L, P, D, V, R, Q, S, I, E, G, W, A, H, T, N, K, y M.

11.: La composición de acuerdo con el punto 10, en la que, en la población de especies de polipéptido quimérico, la frecuencia relativa media de aparición de un resto de aminoácido en particular en la secuencia de aminoácidos de O es de un 8,5% a un 11,5% paraY, de un 8,5% a un 11,5% para F, de un 8,5% a un 11,5% paraL, de un 5% a un 8% paraP, de un 4,5% a un 7,5% paraD, de un 4,5% a un 7,5% para V, de un 4,5% a un 7,5% para R, de un 4% a un 7% para Q, de un 4% a un 7% para S, de un 3,5% a un 6,5% para I, de un 3% a un 6 % para E, de un 3 % a un 6 % para G, de un 3 % a un 6 %paraW, de un 3 % a un 6% para A, de un 2,5% a un 5,5% paraH, de un 2% a un 5%para T, de un 1% a un 4% paraN, de un 0,5% a un 3,5% para K, y de un 0,5% a un 2,5%paraM.

12.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 11, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido de origen natural, en la que, en el polipéptido de origen natural, un dominio de IF está situado entre S2 y S1.

13.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 12, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido de origen natural que es (i) un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/trans-isomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP.

14.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 13, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido SlyD.

15.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 14, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido obtenido a partir de un termófilo.

16.: La composición de acuerdo con el punto 15, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido obtenido a partir de una bacteria termófila o una Arquea termófila.

17.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 15 y 16, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido obtenido a partir de un termófilo de la familia de Thermaceae.

18.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 15 a 17, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido obtenido a partir de Thermus thermophilus.

19.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 15 y 16, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido obtenido a partir de una Arquea hipertermofílica.

20.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 15, 16, y 19, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido obtenido a partir de un termófilo de la clase de Termococos.

21.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 15, 16, 19, y 20, en la que las secuencias de aminoácidos codificados de S2 y S1 son fragmentos de un polipéptido obtenido a partir de Thermococcus gammatolerans.

22.: Uso, en un sistema de traducción in vitro, de una composición de moléculas de ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos, estando la composición especificada de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 21, para presentar miembros o miembros emergentes de la población codificada de especies de polipéptidos quiméricos en complejos ternarios, en la que cada complejo ternario comprende una molécula de ARN de la composición de moléculas de ARN como ARNm, y un ribosoma funcional.

23.: Uso, en un sistema de transcripción/traducción in vitro, de una composición de moléculas de ADN y ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos, estando la composición especificada de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 21, para presentar miembros o miembros emergentes de la población codificada de especies de polipéptidos quiméricos en complejos ternarios, en la que cada complejo ternario comprende una molécula de ARN de la composición de moléculas de ARN como ARNm, y un ribosoma funcional.

24.: Una composición que comprende una población de complejos ternarios, comprendiendo cada complejo ternario un ARNm y un ribosoma funcional, comprendiendo los ARNm de la población de complejos ternarios una composición de moléculas de ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos de

5

15

25

35

45

55

65

acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 21, en la que cada complejo ternario presenta un miembro o miembro emergente de una especie codificada de polipéptidos quiméricos.

25.: La composición de acuerdo con el punto 24, en la que, en un miembro emergente de una especie codificada de polipéptidos quiméricos, la distancia entre el enlace peptídico C-terminal de S2 y el enlace peptídico Nterminal de S1 imita la distancia de los enlace específicos correspondientes de S2 y S1 conectados por un dominio de IF en un polipéptido obtenido a partir (i) de un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/transisomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) a partir de un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP.

26.: La composición de acuerdo con cualquiera de los puntos 24 y 25, en la que en un miembro emergente de una especie codificada de polipéptidos quiméricos S2 y al menos la parte N-terminal traducida de S1 se pliegan como en el miembro de longitud completa correspondiente de la especie de polipéptidos quiméricos, teniendo el miembro un dominio de FKBP intacto.

27.: Un método para identificar una secuencia de aminoácidos de un dominio X que se une a una diana predeterminada, comprendiendo el método las etapas de

(1): proporcionar, como los ARNm, una composición de moléculas de ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 21;

(2): poner en contacto los ARNm de la etapa (1) con un sistema de traducción in vitro y traducir los ARNm, y formar una composición que comprende una población de complejos ternarios, comprendiendo cada complejo ternario un ARNm y un ribosoma funcional, en la que cada complejo ternario presenta un miembro emergente de una especie codificada de polipéptidos quiméricos;

(3): poner en contacto los complejos ternarios obtenidos en la etapa (2) con la diana predeterminada en condiciones de unión acuosas capaces de mantener intactos los complejos ternarios y adecuadas para la unión no covalente específica de miembros emergentes con respecto a la diana, formando de ese modo una mezcla de complejos ternarios no unidos y unidos, en el que los complejos ternarios unidos comprenden miembros emergentes de especies de polipéptidos quiméricos, estando los miembros emergentes unidos a la diana;

(4): separar los complejos ternarios intactos unidos a la diana de los complejos ternarios no unidos lavando los complejos ternarios intactos unidos con una solución de lavado y retirando los complejos ternarios no unidos;

(5): disociar los complejos ternarios unidos a diana obtenidos en la etapa (4), y sintetizar los ADNc a partir del ARNm de los complejos ternarios disociados;

(6): determinar, en un ADNc obtenido en la etapa (5), la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio X, y deducir a partir de la misma la secuencia de aminoácidos de X, identificando de ese modo la secuencia de aminoácidos de un dominio X que se une a la diana predeterminada.

28.: El método de acuerdo con el punto 27, en el que después de la etapa (5) realizada por primera vez y antes de realizar la etapa (6), las etapas (5a) y (5b) se realizan de forma consecutiva un número de veces deseado, en el que

(5a) comprende sintetizar los ARNm a partir de los ADNc obtenidos en la etapa realizada en último lugar (5), proporcionando de ese modo los ARNm recién sintetizados que comprenden una composición de moléculas de ARN que codifican una población de especies de polipéptidos quiméricos de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 21, seguido de (5b) comprende realizar las etapas 2 a 5 con los ARNm recién sintetizados, y la etapa (6) se realiza con el ADNc obtenido en la etapa realizada en último lugar (5).

29.: El método de acuerdo con el punto 28, en el que número de veces que las etapas (5a) y (5b) se realizan de forma consecutiva es de 1 a 12, de forma más específica el número de veces se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, y

6.

30.: El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 27 a 29, en el que la etapa (6) se realiza para una pluralidad de ADNc obtenidos en la etapa (5) o en la etapa realizada en último lugar (5), identificando de ese modo secuencias de aminoácidos de una pluralidad de especies de dominio X (especies de dominio X), en el que cada una de las especies del dominio X se obtiene a partir de una a especie de polipéptido quimérico, y en el que cada dominio especie de dominio X se une a la diana predeterminada.

31.: El método de acuerdo con el punto 30, en el que en la etapa (6) las secuencias de ácidos nucleicos de los ADNc se determinan en paralelo por medio de secuenciación de alto rendimiento.

32.: El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 30 y 31, en el que las secuencias de aminoácidos deducidas para las especies de dominio X se agrupan de acuerdo con secuencias consenso, proporcionando de ese modo uno o más grupos con miembros, obteniéndose cada miembro a partir de la secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc determinado por separado, en el que los miembros dentro del mismo grupo se caracterizan por una secuencia de aminoácidos consenso común, y la secuencia de aminoácidos consenso es una subsecuencia contigua de las secuencias de aminoácidos de la especie de dominio X dentro del grupo.

33.: El método de acuerdo con el punto 32, en el que se selecciona una secuencia de aminoácidos del dominio X en el grupo con el mayor número de miembros con, identificando de ese modo la secuencia de aminoácidos de

5

15

25

35

45

55

65

un dominio X que se une a la diana predeterminada.

34.: El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 30 y 31, en el que las secuencias de aminoácidos deducidas para la especie de dominio X se agruparon de acuerdo con identidad de secuencias, proporcionando de ese modo uno o más grupos con miembros, obteniéndose cada miembro a partir de la secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc determinado por separado, en el que los miembros dentro del mismo grupo se caracterizan por una secuencia de aminoácidos idéntica.

35.: El método de acuerdo con el punto 34, en el que se selecciona la secuencia de aminoácidos del dominio X del grupo con el mayor número de miembros, identificando de ese modo la secuencia de aminoácidos de un dominio X que se une a la diana predeterminada.

36.: Un método para producir un polipéptido restringido, siendo el polipéptido restringido un aglutinante específico de una diana predeterminada, comprendiendo el método las etapas de

(1): identificar, de acuerdo con un método de acuerdo con cualquiera de los puntos 27 a 35, una secuencia de aminoácidos de un dominio X que se une a la diana predeterminada, en la que el dominio X se identifica como un dominio que sustituye al dominio de IF en (i) un polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/transisomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) un polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP;

(2): proporcionar un polipéptido lineal que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio X identificada en la etapa (1);

(3): conectar el extremo N-terminal y el extremo C-terminal del polipéptido de la etapa (2), en el que la distancia del extremo N-terminal y el extremo C-terminal conectados del polipéptido imita la distancia del extremo N-terminal y el extremo C-terminal conectados del dominio de IF, de (i) el polipéptido con actividad de peptidil-prolil cis/trans-isomerasa (actividad de PPIasa) o (ii) el polipéptido de la familia del dominio de plegamiento de FKBP; produciendo de ese modo el polipéptido restringido, siendo el polipéptido restringido un aglutinante específico de la diana predeterminada.

37.: El método de acuerdo con el punto 36, en el que, en el polipéptido restringido, la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal conectados el polipéptido es de 4 x 10-10 m a 6 x 10-10 m.

38.: El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 36 y 37, en el que, en la etapa (3), l extremo N-terminal y el extremo C-terminal del polipéptido se conectan de forma covalente con un grupo de unión.

39.: El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 36 a 38, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido está libre de restos de cisteína.

40.: El método de acuerdo con cualquiera de los puntos 36 a 39, en el que, ya sea en la etapa (2) o en la etapa (3), se añade un resto de cisteína a la cada uno del extremo N-terminal y del extremo C-terminal del polipéptido, y se forma un puente disulfuro entre los dos restos de cisteína añadidos, produciendo de ese modo el polipéptido restringido, siendo el polipéptido restringido un aglutinante específico de la diana predeterminada.

41.: El método de acuerdo con el punto 40, en el que se añade un resto de aminoácido adicional a un resto de cisteína añadido.

42.: Un método para evaluar una diana predeterminada (diana) en una muestra de la que se sospecha que contiene la diana, comprendiendo el método las etapas de

(2): proporcionan un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido con la fórmula I

NH2-S2-X-S1-COOH (fórmula I),

en la que

(3): poner en contacto la muestra con el polipéptido quimérico de la etapa (2) en condiciones que permitan la unión específica del polipéptido quimérico a la diana, formando de ese modo una mezcla de un polipéptido quimérico no unido y, si la diana está presente, polipéptido quimérico unido, estando el polipéptido quimérico unido, unido a la diana, proporcionando de ese modo una muestra tratada;

(5): detectar el polipéptido quimérico en la muestra sondeada de la etapa (4), en el que la presencia de

imagen16

5: Figura 12 Figura 13 presencia y ausencia del detergente TWEEN 20. SDS-PAGE de tres polipéptidos mutantes de SlyD-FKBP de Thermus thermophilus seleccionados de forma aleatoria generados con respecto a diferentes dianas. M: Marcador de peso molecular; 1,3,4: Mutantes de SlyD-FKBP de T. t. antes de incubación a 37 ºC; 2,4,6: Mutantes de SlyD-FKBP de T. t. después de incubación a 37 ºC. Indicado con una línea de color negro a 15 kDa: la cantidad total de cada mutante de SlyD-FKBP de T. t. persiste, aunque algunas bandas de proteína del lisado de E. coli desaparecían después de incubación a 37 ºC. Geles de agarosa con color invertido. M: marcador de peso molecular de ADN de 100 pb. Lado

izquierdo: segundo ciclo de presentación de ribosomas después de RT-PCR: 1,2: con respecto a TNFα con TWEEN 20; 3, 4: con respecto a TNFα sin TWEEN 20. Lado derecho: tercer ciclo de presentación de ribosomas después de RT-PCR: 1,2: con respecto a TNFα con TWEEN 20. 3, 4: con respecto a TNFα sin TWEEN 20.

15: Figura 14 Figura 15 Resultados del Ejemplo 9 M: marcador de peso molecular de ADN. Tercer ciclo de presentación que muestra distintas bandas de ADN a 612 pb a partir de 4 experimentos independientes, con una línea de color negro. 1,2: presentación con respecto a un anticuerpo monoclonal humano de IgG. 3;4: presentación con respecto a un anticuerpo monoclonal humano de IgG incluyendo una etapa de selección previa con el mismo

25: Figura 16 Figura 17 Figura 18 anticuerpo. La caja oculta los datos experimentales no relacionados. SDS PAGE (tinción con Coomassie) y transferencia de Western anti-etiqueta de his (10 segundos de exposición) del polipéptido SlyD/FKBP12-ERCC1. M -Patrón de Novex Sharp; 1 -2,5 µg de polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1; 2 -5,0 µg de polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1; 3 -10 µg de polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1; M* -Magic Mark. Cromatograma de HPLC analítica del polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1. Después de purificación con Ni-NTA, el SlyD/FKBP12-ERCC1 se eluye como un pico monomérico. El barrido de longitud de onda de 300 nm -600 nm se realizó a una intensidad de emisión de

fluorescencia que registra 600 nm/min de polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1 a 25 ºC, 35 ºC, 45 ºC, 55 ºC, 85 ºC.

Figura 19: Esquema de ensayo de BIAcore para determinar la unión del polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1 a FK-506.

Figura 20: 300 nM de polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1 y 300 nM de FKBP12 de tipo silvestre como analitos en solución con respecto a ligando de bi-FK506 biotinilado presentado en la superficie del

sensor.

Figura 21: Cromatograma de HPLC analítica del polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ctrl. Después de

35: Figura 22 Figura 23 Figura 24 Figura 25 purificación con Ni-NTA, el SlyD/FKBP12-ctrl se eluye como un pico monomérico. Cromatograma de HPLC analítica de SlyD de polipéptido de fusión de Thermus thermophilus-IGF-1 (7490). Cromatograma de HPLC analítica del polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-IGF-1 (74-90). Esquema de identificación sistemática de cinética de ensayo de unión de BIAcore con polipéptido de fusión de SlyD/FKBP12-ERCC1 y 300 nM de SlyD/FKBP12-ctrl como analitos en solución. Sensor de CM5, RAMFCy de captura: anticuerpo de captura Fc gamma anti ratón de conejo. Representación de Estabilidad Tardía / Unión Tardía que muestra propiedades cinéticas de anticuerpos

45: Figura 26 anti-ERCC1 determinadas mediante identificación sistemática de cinética usando SlyD/FKBP12-ERCC1 como analito en solución. Todos los clones pueblan la línea de tendencia de 10-5 1/s a valores de Unión Tardía > 40 RU lo que indica una extraordinaria estabilidad del complejo de antígeno. No se detecta unión con respecto a SlyD/FKBP12-ctrl. Propiedades de anticuerpos anti-ERCC1 determinadas con identificación sistemática de cinética. La Representación del Nivel de Captura de Unión Tardía/ Anticuerpo indica la unión de pasillos de valencia de unión mediante líneas de tendencia. Todos los clones hermanos de 500X.35 (rodeados) pueblan el pasillo de valencia entre una Proporción Molar = 0,5 y Proporción Molar = 1 y se seleccionaron para procesamiento adicional.

55: Figura 27 Figura 28 Tabla con propiedades cinéticas de anticuerpos anti-ERCC1 determinadas mediante by identificación sistemática de cinética. BL: Unión Tardía, altura de la amplitud de la señal en unidades de respuesta relativa al final de la fase de asociación de SlyD/FKBP12-ERCC1. SL: Estabilidad tardía, altura de la amplitud de la señal en unidades de respuesta relativa al final de la fase de disociación de SlyD/FKBP12-ERCC1. kd: constante de la tasa de disociación (1/s) de acuerdo con un ajuste de Langmuir de la fase de disociación. t1/2 dis: semivida del complejo de anticuerpo-SlyD/FKBP12-ERCC1 en minutos, calculada de acuerdo con la fórmula t1/2 dis = ln(2)/(60*kd). Cinética de concentración de un solo anticuerpo anti-ERCC1 a modo de ejemplo del clon <ERCC1>M-

Figura 29: 5.3.35 usando SlyD/FKBP12-ERCC1 como analito en solución. Transferencia de Western usando el clon <ERCC1>M-5.1.35. Se cargaron 5 µg de lisados de células OVCAR-3 y HEK293 por calle en geles de NuPAGE SDS (Invitrogen). Una banda de ERCC1 específica se detecta a 37 kDa.

65: Figura 30 Detección inmunohistoquímica de ERCC1 en FFPE tejido de cáncer humano embebido de muestra de cáncer de SCLC. Las flechas de color blanco indican células con nivel elevado de ERCC1 que aparecen en color más oscuro.

Figura 31: Espectros de CD del UV cercano de polipéptido de tipo silvestre de SlyD de Thermus thermophilus,

polipéptido de fusión de SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus (FKBP) y polipéptido de fusión de SlyD de Thermus thermophilus-antígeno. A 20 ºC, todos los polipéptidos se pliegan en su estructura nativa.

Figura 32 Espectros de CD dependientes de la temperatura del polipéptido de fusión de SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus. El calentamiento y el enfriamiento repetido muestra que el dominio de SlyD FKBP de 5 Thermus thermophilus se pliega de forma reversible. El polipéptido de sus fusión de SlyD-ΔIF de

Thermus thermophilus es estable hasta 65 ºC y se despliega a 85 ºC. Figura 33 Cinética de 12 sobrenadantes de cultivo clonal para la unión de IGF-1. Figura 34 Titulaciones de suero, determinadas por ELISA después de 12 semanas de inmunización de ratones

Balb/C y RMNI. mE: mili Absorbancia, IGF-1: IGF-1 humano nativo (Peprotech).

Figura 35 Identificación sistemática con ELISA de sobrenadantes de cultivo de clon con respecto a IGF-1, polipéptido de fusión de SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus y polipéptido de tipo silvestre de SlyD de Thermus thermophilus. Las señales de absorción de unión elevadas eran detectables con respecto a IGF-1 y polipéptido de fusión de SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus.

Figura 36 Tabla con cinética de unión de anticuerpos anti IGF-1 desarrollados con polipéptido de fusión. mAb:

15 anticuerpo monoclonal; RU: Unidad de respuesta relativa de anticuerpo monoclonal capturado en el sensor; Antígeno: antígeno en solución; kDa: peso molecular de los antígenos inyectados como analitos en solución; ka: constante de la tasa de asociación; kd: constante de la tasa de disociación; t1/2 dis: semivida del complejo de anticuerpo-antígeno calculada de acuerdo con la fórmula t1/2dis = ln(2)/60*kd; KD: constante de disociación; RMÁX: Señal de unión al final de la fase de asociación de la inyección de analito a 90 nM; MR: Proporción Molar; Chi2: fallo de la medición; n.d.: no detectable.

Figura 37 Espectros de CD del UV cercano de polipéptido de tipo silvestre de SlyD de Thermus thermophilus, polipéptido de fusión de SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus (FKBP) y polipéptido de fusión de SlyD de Thermus thermophilus-antígeno. A 20 ºC, todos los polipéptidos se pliegan en su estructura nativa.

Figura 38 Espectros de CD dependientes de la temperatura del polipéptido de fusión de SlyD-ΔIF de Thermus

25 thermophilus. El calentamiento y el enfriamiento repetido muestra que el dominio de SlyD FKBP de Thermus thermophilus se pliega de forma reversible. El polipéptido de sus fusión de SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus es estable hasta 65 ºC y se despliega a 85 ºC. Figura 39 Espectros de CD dependientes de la temperatura del polipéptido de fusión de SlyD-antígeno de Thermococcus gammatolerans. A 100 ºC no se alcanza meseta de señal más baja, lo que indica que el polipéptido de fusión no se ha desplegado todavía completamente. Hasta 80 ºC, el polipéptido de fusión es estable y está plagado. Figura 40 El polipéptido de fusión de SlyD-antígeno de Thermococcus gammatolerans monomérico que comprende fracción se volvió a someter a cromatografía después de ciclos repetidos de congelación y descongelación y un ensayo de tensión de temperatura. Perfil de SUX 200 a 280 nm de 300 µg de

35 fracción de elución con Ni-NTA de polipéptido de fusión de SlyD-antígeno de Thermococcus gammatolerans en 100 µl de K2HPO4/KH2PO4 50 mM, pH 7,0, KCl 100 mM, EDTA 0,5 mM a 0,75 ml/min. Figura 41 SDS PAGE (tinción de Coomassie) y transferencia de Western (10 segundos de incubación con anticuerpo anti-octa-etiqueta de his) del polipéptido de tipo silvestre de SlyD de Thermus thermophilus. Figura 42 Cuantificación de este enfoque de identificación sistemática de cinética para anticuerpos anti-IGF-1. Las células vacías indican que el respectivo valor no era detectable/ no se podía determinar. Figura 43 Cinética de 12 sobrenadantes de cultivo clonal para la unión de IGF-1. Figura 44 Identificación sistemática de cinética de BIAcore a modo de ejemplo de cultivo primario <IGF1>M-11.0.15 con respecto a IGF-1, IGF-2, polipéptido de fusión de SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus

45 thermophilus y polipéptido de tipo silvestre de SlyD de Thermus thermophilus. Figura 45 SDS PAGE (izquierda) y transferencia de Western (derecha) de SlyD-FKBP12-CD81 purificado por vía cromatográfica con Ni-NTA. M: Patrón de Novex Sharp, 1: SlyD/FKBP12-CD81; 2,5 µg, PM: 36 kD, 2: SlyD/FKBP12-CD81; 5,0 µg, 3: SlyD/FKBP12-CD81; 10 µg M*: Magic Mark.

Ejemplo 1

Síntesis de una secuencia de ADN que codifica una secuencia variable con un subconjunto seleccionado de restos de aminoácidos de origen natural

55 Una biblioteca de fragmentos de ADN lineal monocatenario de 97 pb que comprendía una secuencia variable que codificaba una secuencia de aminoácidos de 13 aminoácidos se sintetizó haciendo uso de la química de fosforamidita establecida en el estado de la técnica. El fragmento de ADN era un fragmento con una secuencia de nucleótidos contigua de acuerdo con la fórmula III

5’-UD-OD-ZD-3’ (fórmula III),

en la que UD, OD, y ZD estarán unidos mediante enlaces de fosfodiéster.

UD era 5’-CGA CAG TGT GGC GCA GGA TCC-3’ que comprendía un sitio BamHI (SEQ ID NO: 18) y que servía 65 como un sitio de unión para un cebador directo complementario.

5

15

25

35

45

55

65

ZD era 5’-GGG AGC TCG CAG GAG ACG TAG C-3’ que comprendía un sitio SacI (SEQ ID NO: 19) y que servía como un sitio de unión para un cebador inverso complementario.

OD era una secuencia variable de acuerdo con la fórmula IV

5’-(Lib-Lib1)6-Lib-3’ (fórmula IV).

Lib era una primera mezcla de trinucleótidos, en la que cada trinucleótido correspondía a un codón que codificaba un aminoácido de acuerdo con el código genético. La composición de los codones estaba limitada en los codones solamente para un subconjunto de los aminoácidos de origen natural que estaban presentes. El panel en la parte izquierda de la Figura 1 indica los aminoácidos para los que los codones estaban presentes en Lib. El porcentaje indicado para un aminoácido codificado en particular refleja la concentración relativa del respectivo trinucleótido en la mezcla. Todos los trinucleótidos en la mezcla representan un 100 %. En la mezcla no estaban presentes codones que codificaran a C y ningún codón que representara codones de parada.

Lib1 era una segunda mezcla de trinucleótidos, en la que cada trinucleótido correspondía a un codón que codificaba un aminoácido de acuerdo con el código genético. La composición de los codones estaba limitada en los codones solamente para un subconjunto de los aminoácidos de origen natural que estaban presentes. El panel en la parte derecha de la Figura 1 indica los aminoácidos para los que los codones estaban presentes en Lib1. El porcentaje indicado para un aminoácido codificado en particular refleja la concentración relativa del respectivo trinucleótido en la mezcla. Todos los trinucleótidos en la mezcla representan un 100 %. En la mezcla no estaban presentes codones que codificaran a ninguno de C, I, y W y ningún codón que representara codones de parada.

Para ganar de forma ventajosa el control con respecto a la composición del aminoácido codificado en la secuencia de nucleótidos variable a preparar, se aplicó química de fosforamidita. La biblioteca de oligonucleótidos se sintetizó en una síntesis a escala 1 µmolar en un sintetizador de ADN ABI 394 usando procedimiento de síntesis de ADN en fase sólida automatizado convencional y aplicando química de fosforamidta. Un dC-CPG (Sigma Aldrich, Proligo, parte n.º C401010-C04), patrón dA(Bz), dC(Bz), dG(iBu) y fosforamiditas de dT (Sigma Aldrich, Proligo, parte n.º A111031, C111031, G111031, T111031) en una concentración 0,1 M así como las dos bibliotecas de fosforamidita de trímero diferente, Lib y Lib1, se usaron como componentes básicos. Los componentes básicos de fosforamidita de trímero se adquirieron en Glen Research, mezclados en distintas proporciones considerando diferentes pesos moleculares (PM) y factores de reacción (RF) tal como lo recomienda Glen Research y diluidos con acetonitrilo con calidad para ADN en una concentración de 0,1 M de acuerdo con el siguiente cálculo tal como se representa en la Figura 2. La Figura 2 también indica los trinucleótidos específicos que representan los codones en particular usados para codificar los aminoácidos.

El ciclo de ADN convencional se usó para acoplamiento de dA, dG, dC y dT, el ciclo de síntesis de ARN convencional se usó para acoplamiento de Lib y Lib1, y el programa de escisión convencional se usó para escisión de la biblioteca de oligonucleótidos protegidos con 5’-DMT a partir del soporte con amoniaco conc. Los grupos protectores se escindieron por tratamiento con amoniaco conc. (17 h a t.a. y 4 h a 56 ºC). La biblioteca de oligonucleótido protegido con DMT en bruto se evaporó y se purificó por RP HPLC (columna: PRP1 (Hamilton parte n.º 79352)) usando gradiente de acetato de trietiamonio 0,1 M a pH 7 / acetonitrilo. Las fracciones del producto se combinaron y se desalaron por diálisis (MWCO 1000, SpectraPor 6, parte n.º 132638) con respecto a agua durante 3 días también escindiendo de ese modo el grupo DMT. Por último la biblioteca de oligonucleótido se liofilizó. El rendimiento fue: 127,6 DO260 (146 nmoles).

Como resultado, se obtuvo una biblioteca de fragmentos de ADN lineal monocatenario de 97 pb de fórmula III.

De acuerdo con los segmentos de CDR-H3 de 4751 humano y 2170 murino en las bases de datos de Kabat e IMGT, la longitud media de un segmento de la secuencia de aminoácidos de CDR-H3 está entre 12 y 14 aminoácidos (Zemlin, M. et al., J Mol Biol 334 (2003). 733-749). Dado que 13 aminoácidos son el valor medio entre las longitudes habituales de CDR-H3 humano y murino, la longitud del fragmento de la biblioteca para la secuencia de aminoácidos variable codificada en el presente ejemplo se estableció en 13 aminoácidos.

Los trinucleótidos que codifican cisteína y los codones de parada se omitieron. Se calculó que la diversidad teórica de 13 posiciones clasificadas al azar con la diversidad de 19 aminoácidos por posición era de aproximadamente 4 x 1016. Esta diversidad supera la diversidad con la que se puede trabajar de forma razonable usando un enfoque de presentación de fagos. Pero se calcula que un enfoque de presentación de ribosomas es capaz de presentar al menos 10 x 1012 miembros en la biblioteca.

Ejemplo 2

Presentación de ribosoma con el experimento de control positivo, de dominio de SlyD FKBP de Thermus thermophilus

En primer lugar, se mostró la idoneidad básica del armazón de SlyD FKBP de Thermus thermophilus con el fin de

selecciones de presentación de ribosomas. Se diseñó y se sintetizó un fragmento de ADN de presentación de

ribosomas de 719 pb. La secuencia de SlyD FKBP de Thermus thermophilus de 360 pb está bajo el control de un

promotor T7 y secuencias reguladoras de RBS (sitio de unión a ribosoma) del gen 10. Una secuencia de 84 pb

5 sustituye el dominio de Inserción de Flap mediante un motivo de secuencia que codifica una horquilla del péptido,

que es un motivo de diana de anticuerpo. Cadena abajo de la secuencia de SlyD FKBP de Thermus thermophilus de

189 pb, se fusiona un espacial o representación de ribosomas sin codón de parada. El espaciador se diseña

básicamente de acuerdo con Mattheakis, L.C. et al., PNAS 91 (1994) 9022-9026, pero además contiene la secuencia

de bloqueo de la traducción SecM (Nakatogawa, H. y K. Ito Cell 108 (2002) 629-636; Gumbart, J. et al., Biophys J 10 103 (2012) 331-341). En el extremo en la posición 3’ de la construcción, se diseña una secuencia que codifica

horquilla de ARNm para estabilizar y proteger el ARNm de la digestión con nucleasa.

La secuencia de la construcción de ADN era

imagen17

En el nivel de la secuencia de aminoácidos, la construcción de presentación de ribosomas codifica una secuencia de aminoácidos sin codón de parada:

imagen18

5

15

25

35

45

55

La construcción de presentación de ribosomas incluía un segmento codificado de aminoácidos que generan flexibilidad (GAGS), e incluía motivos de ruptura de hélice alfa (PAAV) y también proporcionaba cargas negativas (GEGEGE) para proporcionar de forma óptima el dominio FKBP para presentación (Mattheakis, et al., mencionado anteriormente).

El dominio de IF se sustituyó por el dominio II de horquilla de heterodimerización de ECD, Her-3. Por lo general con esta secuencia de polipéptidos se pliega en una estructura denominada horquilla beta. La secuencia de aminoácidos de la horquilla beta, injertada en el dominio de SlyD FKBP de Thermus thermophilus era: NH2-PQPLVYNKLTFQLEPNPHTK-COOH (SEQ ID NO: 22).

I En n este experimento de presentación de ribosomas, se usó un anticuerpo de horquilla anti-beta monoclonal murino como una diana de selección para el epítopo del péptido de horquilla beta ECD de SlyD de Her-3 de FKBP de Thermus thermophilus presentado de forma ribosómica.

No se pudo amplificar ninguna señal de unión a ADN de fondo, lo que indica que la quimera de horquilla del péptido de SlyD de Thermus thermophilus presentada de forma ribosómica, unida a través de un conector polipeptídico (Mattheakis, et al., mencionado anteriormente) al complejo de ribosoma-ARNm estaba correctamente plegada y presentada de forma cotraduccional. Cuando se procesa adicionalmente en un segundo ciclo de selección, no se desarrolló ninguna señal de unión de fondo. Cuando se usa trastuzumab y pertuzumab como dianas de selección de control, no se amplificaban ninguna señal de unión de fondo. En resumen, no se pudo detectar unión no específica. Esto hace que esta proteína de armazón sea ideal para su uso en tecnologías de presentación molecular, respectivamente en una selección de presentación de ribosomas.

Cebadores que se usan en el proceso de presentación de ribosomas:

Cebador R1: 5’-AACCCCCGCATAGGCTGGGG-3’ (SEQ ID NO: 23)

Cebador F1: 5’-GGTGATGTCGGCGATATAGGCGC -3’ (SEQ ID NO: 24)

Cebador F1A: 5’-CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC -3’ (SEQ ID NO: 25)

Cebador Frt:

imagen19

(SEQ ID NO: 26) Cebador R1A: 5’-AACCCCCGCATAGGCTGGGGGTTGGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACG-3’ (SEQ ID NO: 27) Cebador Rrt: 5’-GGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACGGATGCCCTGTGC -3’ (SEQ ID NO: 28)

Ejemplo 3

Amplificación a modo de ejemplo de la construcción de presentación de ribosomas, experimento de control positivo

La construcción de presentación de ribosomas del Ejemplo (mencionado anteriormente) se amplificó por PCR, sigue a continuación. 100 µl de reacción de PCR contenían dNTPs 0,2 mM (solución de reserva 10 mM, dNTPmix, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 2,5 unidades de PWO Polimerasa (100 unidades de solución de reserva, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), Cebador F1 0,25 µM y Cebador R1 0,25 µM; tampón de PWO PCR 1x (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y 25 ng de molde de ADN de fragmento. El perfil de PCR era el que sigue a continuación: 5 min a 95 ºC, (2 min a 94 ºC, 45 segundos a 57 ºC, 45 segundos a 72 ºC) x 25, 5 min a 72 ºC, ∞ a 4 ºC. La longitud apropiada de una alícuota de 3 µl del producto de reacción de PCR se confirmó por electroforesis en gel de agarosa analítica. A continuación, el producto de PCR se resolvió en un 3 % de gel de agarosa teñido con GelRed (Biotium) y la banda de ADN diana se extrajo del gel usando el Kit II de Extracción de Gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El sistema combinado de transcripción y traducción sin células Puresystem Classic II se usó para la producción de complejos ternarios. Se mezclaron 500 ng de producto de PCR purificado en 20 µl de tampón con 60 µl de Solución A, 24 µl de Solución B y 16 µl de H2O hasta un volumen total de 120 µl. La mezcla de traducción se incubó a 37 ºC a 550 rpm durante 30 min. La traducción se detuvo por adición de 500 µl de tampón de parada enfriado con hielo (Tris 50 mM; pH 7,5 (6 ºC) ajustado con AcOH, NaCl 150 mM, acetato de magnesio 50 mM, KCl 33 mM, GSSG 4 mM, solución de bloqueo de BSA al 10 % (Pierce), 5 µg/ml de ARNt, TWEEN 20 al 0,05 %). La mezcla de traducción parada se centrifugó a 1 ºC durante 15 min a 10000 g. El sobrenadante se transfirió en un vial el recién preparado. Se transfirieron 25 µl de una suspensión de perlas magnéticas revestida con proteína A en 500 µl de tampón de lavado (Tris 50 mM; pH 7,5 (6 ºC) ajustado con ácido acético, NaCl 150 mM, acetato de magnesio 50 mM, KCl 33 mM, solución de bloqueo de BSA al 10 % (Pierce), 5 µg/ml de ARNt, TWEEN 20 al 0,05 %). Las perlas se

5

15

25

35

45

55

65

mezclaron con cuidado y se precipitaron por vía magnética. El tampón de lavado se retiró. Esta etapa se repitió 4 veces. Por último las perlas se volvieron a suspender en 25 µl de tampón de lavado. El sobrenadante parado de la mezcla de traducción se transfirió a la suspensión de perlas preparada para la etapa de selección previa. La mezcla se incubó a 4 ºC con rotación de extremo a extremo durante 30 min y se centrifugó a 10000 g a 1 ºC durante 10 min. El sobrenadante se transfirió en un tubo Eppendorf de 2 ml bloqueado con BSA recién preparado. Se añadieron 20 µl de anticuerpo monoclonal de unión a péptido anti-horquilla 150 nM en 300 µl de la mezcla de traducción seleccionada previamente y se incubaron a 4 ºC con rotación de extremo a extremo durante 30 min. A continuación, se añadieron 10 µl de solución de perlas magnéticas lavadas y se incubaron a 4 ºC con rotación de extremo a extremo durante 20 min. Para capturar diana de anticuerpo unida a los complejos ternarios, las perlas paramagnéticas se precipitaron por vía magnética y el sobrenadante se retiró. Las perlas se lavaron 5 veces con 500 µl de tampón de lavado. En la última etapa de lavado, la solución que contenía perlas se transfirió en un tubo Eppendorf de 2 ml bloqueado con BSA recién preparado, las perlas se centraron por vía magnética y el sobrenadante se retiró. Se añadieron 100 µl de Tampón de Elución enfriado con hielo (Tris 50 mM; pH 7,5 (6 ºC) ajustado con AcOH, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, 50 µl de BSA de calidad para Biología Molecular (Roche Diagnostics,

Mannheim, Alemania), 5000 unidades de ARNr; 25 µg/ml de ARNt) y se incubó durante 10 min. La mezcla se centrifugó a 10000 g a 1 ºC en una centrifugadora de mesa durante 10 min. El aislamiento y la purificación del ARNm a partir de los complejos ternarios se realizaron usando el Kit 50 de Limpieza RNeasy MinElute de Qiagen tal como lo recomienda el proveedor. Se diluyeron 12 µl de la muestra de ARNm eluido con 38 µl de agua sin Rnasa hasta un volumen total de 50 µl. El ADN del molde de presentación de ribosomas residual potencial se retiró usando el sin ADN de Ambion tal como lo recomienda el proveedor. Para la transcripción inversa del ARNm, se usó el kit Transcriptor (Roche). Para una sola reacción, se pipetearon 4 µl de 5 x RT-Puffer junto con 1 µl de dNTP-Mix (Roche), 0,25 µl de Rrt de Cebador 100 µM, 0,5 µl de ARNsin (200 U/ml), 1,75 µl de H2O, 12 µl de muestra de ARNm. La mezcla se incubó durante para 45 min a 65 ºC. Se transfirieron 12 µl de la reacción de RT a la primera reacción de amplificación de PCR. 74 µl de H2O, 10 µl de tampón de PCR PWO 10x (Roche), 2 µl de mezcla de dNTP (Roche), 0,25 µl de de Cebador Frt y Rrt 100 µM cada uno, 2,5 unidades de PWO Polimerasa (100 unidades de solución de reserva, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El perfil de PCR era el que sigue a continuación: 5 min a 95ºC, (2 min a 94ºC, 45 segundos a 57ºC, 60 segundos a 72ºC)x25, 5 min a 72ºC, ∞ a 4ºC. Los productos de PCR se resolvieron en un 2,5 % de Agarosa NuSieve. La banda de ADN diana se extrajo a 576 pb a partir del gel usando el Kit II de Extracción de Gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cuantificaron 12 µl de ADN purificado de forma espectrofotométrica. Se realizó una segunda etapa de PCR para volver a amplificar la construcción para unir la secuencia codificante del promotor T7 y para producir suficientes fragmentos de ADN adecuados para presentación de ribosomas para ciclos adicionales. La segunda PCR fue como sigue a continuación: 74 µl de H2O, 10 µl de tampón de PWO PCR 10x (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 2 µl de mezcla de dNTP (Roche) 0,25 µl de Cebador F1A y R1A 100 µM cada uno, 2,5 unidades de PWO Polimerasa (100 unidades de solución de reserva, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El perfil de PCR era el que sigue a continuación: 5 min 95° C, (2 min 94 ºC, 45 sec 57 ºC, 60 sec 72 ºC) x 25, 5 min 72 ºC, ∞ 4 ºC. The PCR product se resolvió en a 2.5 % NuSieve Agarose. La banda de ADN diana se extrajo a 622 pb a partir del gel usando el Kit II de Extracción en Gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se cuantificó de forma espectrofotométrica.

En el proceso, diversos controles presentaban el éxito y la calidad del proceso. Como un control, el pertuzumab se presentó en la superficie de las partículas paramagnéticas revestidas con proteína A en lugar del anticuerpo de unión a horquilla de péptido. Otro control fue añadir 12 µl de muestra a partir de la etapa de digestión de ADN (kit de Ambion) en la primera PCR de amplificación, omitiendo la etapa de transcripción inversa. No se debería obtener banda de ADN, lo que indica que el molde de ADN inicial se había retirado completamente.

Los resultados se representan en la Figura 4.

Ejemplo 4

Producción de una biblioteca adecuada de presentación de ribosomas

Se usó la biblioteca producida como se ha descrito en el Ejemplo 1. El molde de la biblioteca de ADN sintetizado de forma química se amplificó por PCR como sigue a continuación:

100 µl de volumen de PCR que contenía dNTPs 0,2 mM (solución de reserva 10 mM, dNTPmix, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 2,5 unidades de PWO Polimerasa (100 unidades de solución de reserva, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 0,25 µM de lib1 Cebador (5’-CGTCACACGACAGTGTGGCGCAGGATCC-3’; SEQ ID NO: 29); 0,25 µM de lib 2 Cebador (5’-CGT-CACAAGCTACGTCTCCTGCGAGCTCCC-3’; SEQ ID NO: 30); tampón de PWO PCR 1x (Roche) y 25 ng del molde de ADN de la biblioteca (5’-CGACAGTGTGGCGCAGGATCCnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nG-GGAGCTCGCAGGAGACGTAGC-3’; SEQ ID NO: 31). Se combinaron diez PCR para deudas para producir una diversidad teórica de 5 x 1012 moléculas de la biblioteca diferentes. El perfil de PCR era el que sigue a

continuación: 5 min a 95 ºC, (2 min a 95 ºC, 45 segundos a 49 ºC, 45 segundos a 72 ºC) x 25, 5 min 72 ºC, ∞ a 4 ºC.

Los productos de PCR se resolvieron en un 3 % de gel de agarosa teñido con GelRed (Biotium). Las bandas de ADN 5 diana se extrajeron a 97 pb a partir del gel usando el Kit II de Extracción de Gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ambos, el fragmento de la biblioteca general ha mencionado anteriormente y el vector que contenía la construcción de presentación de ribosomas, se dirigieron doblemente como sigue a continuación: Una reacción contenía 400 ng 10 del fragmento de ADN de la biblioteca, 1 ml de cada una de las enzimas de restricción BamHI-HF y SacI-HF (ambos de NEB), 0,5 µl de BSA y 5 µl de tampón NEB4 10 x. La reacción de digestión del vector contenía 1,28 µg de vector (T7Pg10e_ttH3caspMA-T), 1,25 µl de cada una de las enzimas de restricción de BamHI-HF y SacI-HF, 0,5 µl de BSA y 5 µl de tampón NEB4 10 x. Ambas reacciones se realizaron siete veces en paralelo y se incubaron durante una noche a 37 ºC a 400 rpm. Los productos de digestión se resolvieron en un 3 % de gel de agarosa teñido con

15 GelRed (Biotium) para el fragmento de la biblioteca y un 1 % de gel de agarosa teñido con GelRed (Biotium) para el vector de corte. La banda de ADN del fragmento de la biblioteca se extrajo a 51 pb a partir del gel usando el Kit II de Extracción de Gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La banda de ADN del vector de corte se extrajo a partir del gel de agarosa usando el Kit II de Extracción de Gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

20 Para producir la the construcción de presentación de ribosomas, el fragmento de la biblioteca digerido se insertó en el vector de corte en una reacción de ligación como sigue a continuación: La ligación se realizó en un volumen total de 40 µl con 93 ng de fragmento de biblioteca cortado y purificado, 11 ng de vector cortado y purificado, 20 µl de tampón Quick Ligase 2 x (Stratagene) y 2 unidades de of Quick Ligase (Stratagene). La reacción se realizó diez

25 veces a temperatura ambiente durante una hora. Las ligaciones se combinaron y se purificaron con el kit extracción de Qiagen proporcionando 200 ng de producto de ligación.

El molde de ADN de la biblioteca ensamblado lineal, que proporciona el punto de partida para la transcripción y traducción acopladas, se generó por PCR con el siguiente sistema:

30 En total, seis reacciones de PCR de 50 µl produjeron 1,62 µg de la construcción de presentación de ribosomas lineal. Cada reacción contenía: 20 ng de producto de ligación como molde, 5 µl de tampón de reacción 10 x (Roche), dNTPs 0,4 mM (Roche) y 0,5 mM de cada cebador F1 (5’-GGTGATGTCGGCGATATAGGCGC-3’ ; SEQ ID NO: 32) y R1 (5’-CCCCAGCCTATGCG-GGGGTT-3’; SEQ ID NO: 33). El perfil de PCR era el que sigue

35 a continuación: 5 min a 94 ºC, (2 min a 94 ºC, 45 segundos a 57 ºC, 45 segundos a 72 ºC) x 25, 5 min 72 ºC, ∞ a 4 ºC. Los productos de PCR se resolvieron en un 1,5 % de gel de agarosa teñido con GelRed (Biotium). La banda de ADN diana se extrajo a 698 pb a partir del gel usando el Kit de Extracción de Gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

40 Para cada diana de la ronda de selección se usaron 520 ng de molde de ADN de la biblioteca lineal para transcripción/traducción acoplada con el Sistema PURE (Ueda T. et al., Methods Mol. Biol. 607 (2010) 219-225). Esto es igual a una diversidad teórica de 1,4 x 1012 moléculas.

La construcción de FKBP-SlyD de Thermus thermophilus de presentación de ribosomas tiene la secuencia que sigue 45 a continuación:

imagen20

Cada N indica una de las 39 nucleobases de la biblioteca definidas.

5 Ejemplo 5

Confirmación de la diversidad de la biblioteca mediante un enfoque de secuenciación de alto rendimiento La diversidad de la biblioteca de la construcción de la biblioteca adecuada para presentación de ribosomas final se investigó usando un Instrumento 454 GS FLY+. Un enfoque de secuenciación profunda se realizó de acuerdo con el

10 manual rápido de preparación de biblioteca (Oct. de 2009, rev. Enero de 2010) para la Serie GS FLX Titanium usando el Kit de GS FLX + Series-XL+ (Mayo de 2011).

Se evaluaron 228210 lecturas de secuencias. Cada una mostraba una longitud de lectura lo suficientemente larga, de modo que se pudo evaluar el motivo de inserción en biblioteca. De 228210 lecturas satisfactorias, se encontraron 15 196725 como secuencias únicas, 24983 secuencias se produjeron dos veces, 5213 secuencias se produjeron tres veces, 1365 secuencias se produjeron cuatro veces, 346 secuencias se produjeron cinco veces, 116 secuencias se produjeron seis veces, 35 secuencias se produjeron siete veces, 17 secuencias se produjeron ocho veces, 3 secuencias se produjeron nueve veces, 1 secuencia se produjo 10 veces, 3 secuencias se produjeron 11 veces, 2 secuencias se produjeron 12 veces, 1 secuencia se produjo 16 veces. Dado que el fragmento de la biblioteca se 20 amplificó por PCR antes de su ligación en la construcción del vector, se supone que las copias por duplicado y múltiples de la secuencia también se podrían obtener a partir del proceso de amplificación de PCR De las 228210 lecturas, se encontraron 196725 únicas, que es un 86 % de la biblioteca de trabajo. Para cada nueva ronda de selección de diana, se usaron 520 ng de molde de ADN de biblioteca lineal, que es igual a una diversidad teórica de 1,4 x 1012 moléculas. La diversidad de la biblioteca práctica se puede calcular como 1,4 x 1012 x 0,86 = 1,2 x 1012

25 moléculas. La conclusión de tener 1,0 x 1012 miembros de biblioteca funcionales es un cálculo legal.

Los resultados a mí se representan en la Figura 5.

La composición del aminoácido de 228210 lecturas de longitud completa refleja el diseño del fragmento de la

30 biblioteca. En el nivel de traducción del aminoácido, las 228210 lecturas tienen una longitud de 13 aa y todas están correctamente flanqueadas por los motivos Nt-GAGS-Ct y Nt-GSSG-Ct. No se encontraron codones de parada. Tal como se deseaba, los aminoácidos Y, F y L estaban sobrerrepresentados. Metionina (1,09 %) cisteína (0,03 %), y lisina (1,99 %) están subrrepresentadas, como se deseaba. Debido al uso de química de fosforamidita de trinucleótidos, los desplazamientos del marco estaban en un intervalo insignificante.

35

5

15

25

35

45

55

65

Ejemplo 6

Selección de Presentación de Ribosoma en TNFα como una diana

De acuerdo con la presentación de ribosomas descrita en el presente documento (por ejemplo, análoga al Ejemplo 3) t se realizaron tres rondas de selección con aumento de rigurosidad de lavado en TNFα como una diana. Esto se realizó en presencia o ausencia de TWEEN 20. En el presente documento se describe la selección en presencia de TWEEN. El TNFα recombinante humano, sin etiquetar de células HEK293 (Roche) se biotiniló químicamente usando química de EDC/NHS tal como lo realiza una persona experta en la materia. La estequiometría de la biotinilación era de 1:6, TNFα : reactivo de biotinilación de bi-DDS. La concentración final de TNFα era de 0,44 mg/ml en NaH2PO4 50 mM, NaCl 150 mM, 6 % de sacarosa, pH 6,0. La unión del TNFα biotinilado se confirmó con un experimento de SPR de Biacore, en el que se confirmó la unión de bi-DDS-TNFα al sensor de Biacore SA revestido con estreptavidina. Para la primera ronda de selección, se transfirieron 520 ng de molde de ADN de biblioteca lineal de 719 pb en el sistema acoplado de transcripción y traducción sin células.

La reacción se detuvo con tampón de parada enfriado con hielo y se centrifugó como se ha descrito. La selección previa de los complejos ternarios con perlas magnéticas era similar para las tres rondas de presentación, con t la excepción de tipos de perlas. El primer y segundo ciclos se seleccionaron previamente con 25 µl de solución de perlas revestidas con estreptavidina, la tercera ronda de presentación se incubó previamente con 25 µl de solución de perlas revestidas con proteína G (Dynabeads, Invitrogen).

Se transfirieron 20 µl de partículas para magnéticas de estreptavidina en un tubo Eppendorf de 2 ml bloqueado previamente y se lavaron cinco veces con 500 µl de tampón de lavado de perla (NaH2PO4 0,1 M a pH 8,0, TWEEN 20 al 0,1 %) seguido de tres lavados con tampón de lavado como se ha descrito. Después de la etapa de lavado final, las perlas se volvieron a suspender en 25 µl de tampón de lavado.

La mezcla de traducción parada se añadió con cuidado a la suspensión de perlas preparada y se incubó a 4 ºC con rotación de extremo a extremo durante 30 min. Las perlas se recogieron y se retiraron por centrifugación a 13000 rpm a 1 ºC durante 10 min y el sobrenadante seleccionado previamente se transfirió en un tubo Eppendorf de 2 ml bloqueado nuevo.

A 300 µl de la mezcla de traducción seleccionada previamente, se añadió bi-DDS-TNFα biotinilado en 20 µl de tampón para alcanzar una concentración final de TNFα de 120 nM. La concentración de bi-DDS-TNFα era de 0,44 mg/ml (8,6 µM) y por lo tanto se diluyeron 4,5 µl en 15,5 µl de tampón de lavado que a continuación se añadieron en los 300 µl de mezcla de traducción parada. Incubación a 4 ºC con rotación de extremo a extremo durante 30 min. Los complejos ternarios unidos a bi-DDS-TNFα se capturaron mediante la adición de 10 µl de partículas de estreptavidina paramagnéticas lavadas con una incubación de 20 min a 4 ºC con rotación de extremo a extremo. Esto se realizó de maneras idénticas para la primera y la segunda ronda de presentación. En la tercera ronda, la concentración de la diana se redujo a 60 nM de bi-DDS-TNFα.

El lavado y la elución se realizó como se ha descrito en el protocolo de presentación (lavados rápidos con 500 µl de tampón de lavado 5x), excepto en la tercera ronda de presentación III, en la que la presión de la selección se aumentó a través de un lavado más riguroso. En el presente documento, después de la primera etapa de lavado rápido normal, la segunda etapa de lavado incluía un tiempo de incubación de 5 min (de extremo a extremo) y la tercera etapa de lavado un tiempo de incubación de 10 min, seguido de dos etapas de lavado rápido como es habitual (todas con 500 µl de tampón de lavado).

Para todos los ciclos de presentación de bi-DDS-TNFα, la elución del ARNm con 100 µl de tampón de elución y las etapas de RT-PCR posteriores, se realizaron de la misma manera que se ha descrito anteriormente.

Los resultados también se representan en la Figura 6.

Para introducir el ADN de combinación de selección en el vector de expresión de pQE80_ttSlyD, el vector y las combinaciones de ADN RD se sometieron a una doble digestión con BamHI-HF y SacI-HF. Cada diana se digirió de forma simultánea en dos reacciones y el vector en tres. Cada digestión de diana de 50 µl contenía 1 µg de combinación de ADN, 1,25 µl de BamHI-HF, 1,25 µl de SacI-HF, 5 µl de tampón NEB 4 10x, 0,25 µl de BSA y 5,75 µl de dH2O.

Cada digestión de vector de 50 µl contenía 1,2 µg de ADN plásmido, 1,25 µl de BamHI-HF, 1,25 µl de SacI-HF, 5 µl de tampón NEB 4 10x, 0,75 µl de BSA y 35,75 de µl de dH2O.

Las reacciones de digestión se incubaron a 37 grados C durante 3 h. El vector digerido se purificó y se extrajo de un gel de agarosa como se ha descrito anteriormente. El ADN de la combinación de selección digerido se purificó a través de un 3 % de gel de agarosa y la banda correspondiente se extrajo con el kit II de extracción de Qiagen, debido al pequeño tamaño del fragmento.

La ligación se realizó usando el Kit de Ligación Rápida y contenía, en un volumen de reacción total de 15 µl, 25 ng de vector de ADN digerido, 1,25 ng de ADN de combinación de selección digerido, 7,5 µl de Tampón de Ligasa Rápida 2x y dH2O. La incubación durante 1 h a temperatura ambiente fue seguida de transformación de 10 µl en células DH5a de E. coli químicamente competentes y sembradas en placas de agar de LB/Amp.

5 El casete de ADN de la biblioteca de 230 pb del tercer ciclo de presentación de ribosomas y el ADN del vector de expresión de pQE80_ttSlyD se digirieron con BamH1 y SacI. Cada digestión de casete de ADN de biblioteca de 50 µl contenía 1 µg de casete de ADN de biblioteca, 1,25 µl de BamHI-HF, 1,25 µl de SacI-HF, 5 µl de tampón NEB 4 10x, 0,75 µl de BSA y 5,75 µl de dH2O. Cada 50 µl de digestión de vector contenían 1,2 µg de ADN de plásmido,

10 1,25 µl de BamHI-HF, 1,25 µl de SacI-HF, 5 µl de tampón NEB 4 10x, 0,75 µl de BSA y 35,75 µl de dH2O.

La ligación se realizó usando el Kit de Ligación Rápida en 15 µl de volumen de reacción total en 25 ng de vector de ADN digerido, 1,25 ng de casete de ADN de biblioteca digerido, 7,5 µl de Tampón de Ligasa Rápida 2x y dH2O. La incubación durante 1 h a temperatura ambiente fue seguida de transformación de 10 µl de la mezcla de ligación en

15 células DH5a de E. coli químicamente competentes, sembradas en agar de LB con ampicilina como marcador de selección y con incubación durante una noche a 37 ºC.

El vector de expresión contenía la secuencia de ácidos nucleicos para la secuencia de SlyD-FKBP de Thermus thermophilus, idéntica a la construcción previa de presentación de ribosomas, pero flanqueada de forma c-terminal

20 con una Avitag (His)8 y secuencias de codón de parada. De este modo, a través de la subclonación del fragmento de casete de biblioteca, la secuencia de SlyD-FKBP de T. th. circundante, se restableció, de modo que las posibles mutaciones en el nivel del aminoácido obtenido a partir del proceso de identificación sistemática se volvieron a ajustar con la secuencia de tipo silvestre.

25 La secuencia de SlyD-FKBP de Thermus thermophilus en el vector de expresión de pQE80_ttSlyD:

imagen21

X indica la secuencia variable.

30 Se inóculo un bloque en pocillo profundo de 96 pocillos con 1200 µl por pocillo de medio LB/Amp, con colonias individuales de E. coli seleccionadas con una punta de pipeta estéril a partir de la placa de transformación. Se sellaron con un papel de aluminio transpirable y se incubaron a 37 ºC en un agitador de placas a 250 rpm durante una noche.

35 Se usaron 200 µl de cada pocillo para inocular 1800 µl de LB/Amp en un bloque de 96 pocillos profundos incubados a 37 ºC y 250 rpm durante 2 h antes de inducción de la expresión de proteína con IPTG 0,5 mM. Después de una incubación adicional durante para 3 h a 37 ºC y 250 rpm, los bloques se centrifugaron durante 15 min a 3000 x g y el sobrenadante se descartó.

40 A cada pocillo del bloque de 96 pocillos profundos, se añadieron 50 µl del agente de lisis BPER II (Pierce) y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Las células se volvieron a suspender y se lisaron mediante mezcla vigorosa. Por último, se añadieron 950 µl de tampón KPi a pH 7,4 / pocillo, se mezcló y el residuo celular se sedimento por centrifugación durante 15 min a 3000 x g. El sobrenadante se investigó para la presencia de

45 polipéptido SlyD-FKBP de Thermus thermophilus expresado de forma soluble por SDS-PAGE.

Una muestra de 65 µl del sobrenadante se mezcló con 10 µl de agente reductor 10x (Invitrogen) y 25 µl de tampón de muestra NuPAGE LDS (4x) hasta un volumen de muestra total de 100 µl.

50 Las muestras se incubaron a 95 ºC durante 5 min y a continuación se centrifugaron durante un periodo adicional de 10 min a 10000 g. Se cargaron 10 µl del sobrenadante por muestra sobre un 4-12 % de gel BisTres NUPAGE (Invitrogen) y se sometió a electroforesis a 150 V constante durante 1 h. A continuación, el gel se tiñó y se destiñó de acuerdo con el protocolo de fabricante. El patrón de proteína era el Color Dual de Patrón de Proteína Bio-Rad Precision Plus (5 µl).

55 Los ejemplos también se representan en la Figura 7.

imagen22

imagen23

5

15

25

35

45

55

65

El mutante TT10F7, no se produjo en la combinación secuenciada que omite el detergente. Esto refleja las diferentes condiciones de selección en la presentación sin detergente.

Ejemplo 10

Experimento de control de la especificidad de presentación de ribosomas

Una característica importante de un proceso de presentación de ribosomas que trabaja de forma funcional es mostrar que la selección de la diana se puede complementar con un excedente de su diana y en solución. Esto demuestra la presencia de aglutinantes de diana específicos en la mezcla. Normalmente, esto se puede mostrar en un ciclo de presentación más avanzado, por ejemplo en la tercera ronda de presentación. Cuando se hace de este modo, el rendimiento del ADN después de la etapa de RT-PCS debería ser considerablemente menor, cuando se compara con el ciclo de selección de no competencia.

En el siguiente ejemplo se realizó una selección de presentación de ribosomas para tres rondas con respecto a un anticuerpo monoclonal humano. La presentación se realizó tal como se describe. Se incubó IgG humana 120 nM en solución en la mezcla de traducción parada durante 30 min a 4º. Para capturar la IgG se usaron partículas paramagnéticas revestidas con proteína A, y de este modo los complejos ternarios unidos se adhieren a la misma, la superficie de la perla.

De ese modo, se realizaron dos ciclos. En el tercer ciclo de presentación, se realizó otra organización experimental. Se realizó una etapa de selección previa con IgG humana 1 µM. Las perlas se centraron de nuevo y el sobrenadante se volvió a usar en un segundo experimento de selección como se ha descrito anteriormente usando la misma IgG humana presentada a 120 nM. El gel de agarosa mencionado anteriormente muestra claramente una reducción de la intensidad de la banda de ADN cuando se ha aplicado la etapa de selección previa y de este modo se indica la especificidad de IgG de los aglutinantes ya enriquecidos en la tercera ronda de presentación.

Sumario de los experimentos de presentación

Por primera vez se pudo mostrar que SlyD-FKBP de Thermus thermophilus es un fuerte armazón de presentación para la presentación de una biblioteca de presentación de bucle peptídico grande y diversa.

El motivo del bucle se inserta en un sitio, en el que el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de la conexión rígida interdominio de FKBP-IF están alejados en aproximadamente 4,5 angstrom entre sí, que está en el intervalo de la distancia atómica de un enlace disulfuro. Por lo tanto, el dominio FKBP sujeta el péptido del bucle en una conformación pseudo restringida. El dominio FKBP es en cierto modo un sustituto para una limitación de enlace disulfuro. Dado que el armazón está libre de cisteínas, se resuelven la presentación y las dificultades en la presentación de péptidos restringidos cíclicos.

El sistema se sometió a ensayo de forma satisfactoria en un experimento en el que un motivo de horquilla de Her-3 se injertó en el dominio SlyD-FKBP de Thermus thermophilus. La construcción se presentó de forma ribosómica con respecto a un anticuerpo monoclonal de unión a horquilla de Her-3, con lo que de ese modo se demostraba la especificidad de unión y la idoneidad general para el proceso de presentación de ribosomas.

Se diseñó una biblioteca de presentación de acuerdo con los conocimientos con respecto a la composición de los aminoácidos en puntos de conflicto de interacción de proteína-péptido. Además, l se tuvieron en cuenta las longitudes habituales de las secuencias de CDR-H3 humano y su composición de aminoácidos. La biblioteca se adaptó a los requisitos específicos de tecnologías de presentación, por ejemplo, los restos de Cys se omitieron completamente.

Todas estas consideraciones llevaron al diseño de una biblioteca de bucles de 13-mer. El casete de biblioteca de ADN de 13-mer se produjo usando química de trinucleótidos. Usando un enfoque de secuenciación profunda se calculó que los miembros finales de la biblioteca de SlyD-FKBP de Thermus thermophilus estaban en el intervalo de 1,0 x 1012 miembros funcionales.

La biblioteca se usó en procedimientos de selección de presentación de ribosomas con respecto a diferentes dianas, mientras que el mutante TT10F7, procedente de un tercer ciclo de presentación de ribosomas con respecto a un TNFα recombinante humano, mostraba una unión dependiente de la concentración y específica de diana.

Todos los mutantes aislados se expresaron en una cantidad elevada soluble en E. coli. Todos eran termodinámicamente estables.

El sistema de presentación produce mutantes de SlyD-FKBP de Thermus thermophilus con especificidades de unión determinadas previamente con respecto a diferentes dianas en el intervalo de las afinidades esperadas para un enfoque de biblioteca de este tipo.

imagen24

imagen25

imagen26

5

15

25

35

45

55

65

de Ventana tal como lo recomienda el fabricante. Las flechas de color blanco indican células con nivel elevado de ERCC1, que aparece en color más oscuro.

Sumario

En contraste con el péptido ERCC1 de bajo peso molecular (2 kDa), el armazón tal como se usa en el presente documento es un analito de peso molecular elevado (36 kDa), que amplifica las señales en un enfoque de identificación sistemática de cinética basada en SPR.

Un reactivo de identificación sistemática basado en péptido asume el riesgo de seleccionar anticuerpos que reconocen los extremos del péptido, lo que se evita completamente usando el enfoque de armazón tal como se informa en el presente documento, en el que el péptido está embebido en un contexto polipeptídico N-terminal y Cterminal terminal. A pesar de ofrecer una pluralidad de inserciones de péptidos metaestables, el polipéptido quimérico del armazón como un todo es estable, soluble y monomérico. La cinética de Langmuir a 1:1 se puede medir fácilmente por medio de biosensores.

El uso del polipéptido quimérico en esta realización es muy adecuado para simular la situación de FFPE IHC y por lo tanto es un reactivo de identificación sistemática muy adecuado para el desarrollo de anticuerpos IHC adecuados.

Sin quedar ligado por la teoría, el polipéptido quimérico comprende una parte obtenida a partir de SlyD plegada y una parte obtenida a partir de FKBP12 humano desplegado o parcialmente desplegado, que ofrece al menos su resto de Trp de núcleo único para contacto disolvente, como se muestra para SlyD/FKBP12-ERCC1. SlyD se pliega de forma reversible y muestra estabilidad térmica suficiente para aplicaciones técnicas.

El armazón de SlyD/FKBP-12 es una plataforma adecuada para imitar una pluralidad de motivos de estructura secundaria peptídica, como los presentes en un tejido fijado con formalina, embebido en parafina en experimentos de inmunohistoquímica (véase Abe, et al., (2003) mencionado anteriormente).

El polipéptido quimérico es especialmente adecuado como inmunógeno en comparación con el polipéptido de longitud completa a partir del que se obtiene la secuencia de aminoácidos (inmunogénica) insertada, por ejemplo con respecto a solubilidad, plegamiento reversible (naturalización/desnaturalización) y la ausencia de enlaces disulfuro para su formación correctamente. El polipéptido quimérico tal como se informa en el presente documento proporciona el armazón en el que se inserta la secuencia de aminoácidos inmunogénica. Estabiliza la estructura de la secuencia de aminoácidos inmunogénica insertada (sin quedar limitado por la teoría al reducir la entropía conformacional). Sin quedar limitado por la teoría, se supone que el polipéptido quimérico SlyD N-terminal mantiene el polipéptido quimérico completo en una forma soluble y termodinámicamente estable, pero parcialmente desplegada.

Rebuzzini, G. (trabajo de PhD en la Universidad de Milano-Bicocca (Italia) (2009)) informa sobre un estudio del dominio de helicasa NS3 del virus de la hepatitis C para su aplicación en un inmunoensayo de quimioluminiscencia. En este trabajo Rebuzzini informa que FKBP12 el quimérico usado como un inmunógeno para la presentación del dominio de helicasa NS3 con las secuencias de inserción de acuerdo con Knappe, T.A., et al., (J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468) es termodinámicamente inestable. Esto se correlaciona con los hallazgos de los inventores, con respecto a que el resto de FKBP12 quimérico en el polipéptido quimérico de SlyD-FKBP12-antígeno está parcial o completamente sin plegar. Al contrario que con los hallazgos de Rebuzzini, en el presente documento se ha encontrado que el polipéptido quimérico de SlyD-FKBP12-antígeno es monomérico y estable.

Ejemplo 12

Producción de anticuerpos específicos de IGF-1 (74-90)

Los anticuerpos específicos de antígeno se obtuvieron por inmunización de ratones con polipéptido quimérico de SlyD-antígeno de Thermus Thermophilus. Una pluralidad de epítopos se pueden dirigir en la superficie del armazón, a partir del que se pueden identificar los anticuerpos que se unen al antígeno de diana q mediante identificación sistemática diferencial con respecto al SlyD de Thermus Thermophilus de tipo silvestre como un control negativo, o con respecto al antígeno recombinante nativo (IGF-1) como un control positivo. En lo sucesivo, un ejemplo demuestra las propiedades de los derivados de SlyD arcaicos en comparación con el FKBP12 humano potencialmente meta estable. El SlyD de Thermus Thermophilus permite la presentación de estructuras entálpicas, rígidas y estables y por lo tanto es adecuado para el desarrollo de anticuerpos monoclonales a con respecto a estructuras de proteína nativa.

Producción de polipéptidos quiméricos de SlyD de Thermus thermophilus

El clorhidrato de guanidinio (GdmCl) (calidad A) se adquirió en NIGU (Waldkraiburg, Alemania). Los comprimidos de inhibidores de proteasa sin EDTA Complete®, imidazol y EDTA eran de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania), todos los otros reactivos químicos eran de calidad analítica de Merck (Darmstadt, Alemania). Las

membranas de ultrafiltración (YM10, YM30) se adquirieron en Amicon (Danvers, MA, USA), las membranas de microdiálisis (VS/0,025 µm) y las unidades de ultrafiltración (dispositivos de filtro Biomax ultrafree) eran de Millipore (Bedford, MA, USA). Las membranas de nitrato de celulosa y de acetato de celulosa (1,2 µm, 0,45 µm y 0,2 µm del tamaño de poro) para la filtración de lisados en bruto eran de Sartorius (Goettingen, Alemania).

5 Clonación de casetes de expresión

La secuencia del polipéptido SlyD de Thermus thermophilus se recuperó de la base de datos de SwissProt (n.º de registro Q72H58). La secuencia del polipéptido SlyD de Thermococcus gammatolerans se recuperó de la base de 10 datos de Prosite (n.º de registro C5A738). Los genes sintéticos que codificaban SlyD de Thermus thermophilus, SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus, y SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus se adquirieron en Sloning Biotechnology GmbH (Alemania) y se clonaron en un vector de expresión pQE80L. El uso del codón se optimizó para expresión en células hospedadoras de E. coli. Los genes sintéticos que codificaban SlyD de Thermococcus gammatolerans, SlyD-IGF-2 (53-65) de Thermococcus gammatolerans, SlyD de Thermus thermophilus-antígeno y

15 and SlyD-antígeno de Thermococcus gammatolerans se adquirieron en Geneart (Alemania) y se clonaron en vectores de expresión pET24 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA). El uso del codón se optimizó para expresión en células hospedadoras de E. coli.

Además, un conector de GS (GGGS, SEQ ID NO: 42) y una etiqueta de His se fusionaron con el extremo carboxi

20 terminal para permitir una purificación por afinidad de los polipéptidos quiméricos mediante una cromatografía de intercambio iónico de metal inmovilizado.

Para generar anticuerpos monoclonales que se unen de forma específica al fragmento 74-90 de IGF-1 (secuencia de aminoácidos NKPTGYGSSSRRAPQTG, SEQ ID NO: 43) las respectivas secuencias de aminoácidos y péptidos se

25 fusionaron en el SlyD de la chaperona molecular obtenida a partir de Thermus thermophilus por deleción de los aminoácidos 68 -120 de la proteína original. Debido a una adaptación en ángulo de la inserción de IGF-1, la Asp en la posición 70 y la Leu en la posición 88 se sustituyeron por una a Gly (D70G y L88G). De este modo, el polipéptido quimérico tiene la secuencia de aminoácidos:

imagen27

Como un control, se usó el SlyD de tipo silvestre nativo de Thermus thermophilus:

imagen28

35 Para ensayo de identificación sistemática y de especificidad, se produjo un polipéptido quimérico SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus. El polipéptido quimérico SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus carece del dominio de IF, que se sustituyó por el motivo AGSGSS de la secuencia de aminoácidos, y comprende una etiqueta de secuencia de aminoácidos C-terminal:

40

imagen29

Como un control, se usó el SlyD nativo de Thermococcus gammatolerans que comprende una etiqueta de secuencia de aminoácidos C-terminal:

imagen30

5

15

25

35

45

55

65

Thermococcus gammatolerans 16 µM. Las señales de CD entre 250 nm y 330 nm con una resolución de 0,5 nm y barrido de 20 nm por minuto se registraron a 20 ºC. En una realización experimental posterior, las señales de CD se determinaron en Gradientes de temperatura (20 ºC -100 ºC) y (100 ºC -20 ºC) para derivados de SlyD de Thermococcus gammatolerans, respectivamente (20 ºC -85 ºC) y (85 ºC-20 ºC) para derivados de SlyD de Thermus thermophilus a una longitud de onda constante de 277 nm. El gradiente de temperatura se realizó a 1 ºC por minuto.

La Figura 31 muestra una representación de superposición de tres espectros de CD de los polipéptidos quiméricos de SlyD de Thermus thermophilus de tipo silvestre, SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus y SlyD-antígeno de Thermus thermophilus. Las firmas de CD muestran que a 20 ºC, todos los polipéptidos quiméricos se pliegan en su estructura nativa, incluso cuando el dominio de IF falta o se está sustituyendo por un injerto de aminoácido.

La Figura 32 muestra a un espectro de CD del UV cercano dependiente de la temperatura del polipéptido quimérico SlyD-antígeno de Thermus thermophilus en el gradiente de temperatura de 20 ºC a 85 ºC. El SlyD-antígeno de Thermus thermophilus se despliega y se vuelve a plegar de forma reversible.

En las condiciones físicas dadas no se pudo conseguir el desplegamiento completo de SlyD-antígeno de Thermococcus gammatolerans incluso a 100 ºC (véase la Figura 33). La extraordinaria estabilidad de los dominios de FKBP arcaicos permite el injerto de polipéptidos mediante la sustitución de sus dominios IF en los que al mismo tiempo se mantiene la estabilidad global de la proteína de armazón quimérica recién generada.

Inmunización de ratones con SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus y desarrollo de anticuerpos monoclonales con respecto a un IGF-1

Ratones Balb/c y NMRI de 8-12 semanas de edad se sometieron a inmunizaciones intraperitoneales repetidas con 100 µg de SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus. Los ratones se inmunizaron tres veces, en los momentos de 6 semanas y 10 semanas después de la inmunización inicial. La primera inmunización se puede realizar usando adyuvante de Freud completo, la segunda y tercera inmunizaciones se realizaron usando el adyuvante de Freud incompleto. Los títulos de suero de ratones con respecto a IGF-1 y SlyD-IGF-1 de Thermus thermophilus recombinante nativo (74-90) se sometieron a ensayo después de 12 semanas con métodos de ELISA como se describe a continuación. Después de 12 semanas los títulos de suero se analizaron usando ELISA. El ELISA se realizó con un Tecan Sunrise bajo Firmware: V 3.15 19/03/01; XREAD PLUS Versión: V 4.20. Las placas de múltiples pocillos Nunc Maxisorb F se revistieron con SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus aplicando una solución que comprendía 0,5 µg de polipéptido por ml. El antígeno aislado IGF-1 se inmovilizó en los pocillos de placas de múltiples pocillos StreptaWell High Bind SA aplicando una solución que comprendía 90 ng/ml de IGF-1 biotinilado. A partir de ese momento, los sitios de unión libres se bloquearon aplicando una solución que comprendía un 1 % de RPLA en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con una solución que comprendía cloruro sódico al 0,9 % (p/v) y Tween al 0,05 % (p/v). Como muestras, el suero de ratón se usó diluido a 1:50 con PBS. La dilución adicional opcional se realizó en 1:4 etapas hasta una dilución final de

1:819.200. El tiempo de incubación fue de una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con una solución que comprendía cloruro sódico al 0,9 % (p/v) y Tween al 0,05 % (p/v). Como anticuerpo de detección se usó un anticuerpo policlonal frente al dominio constante de los anticuerpos diana conjugados con una peroxidasa (PAK<M-Fcγ>S-F(ab’)2-POD). El anticuerpo de detección se aplicó a una concentración de 80 ng/ml en PBS que comprendía RSA al 1 % (p/v). El tiempo de incubación fue de una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con una solución que comprendía cloruro sódico al 0,9 % (p/v) y Tween al 0,05 % (p/v). A continuación los pocillos se incubaron con una solución de ABTS durante 15 minutos a temperatura ambiente. La intensidad del color desarrollado se determinó por vía fotométrica. La Figura 34 muestra los títulos de suero de los ratones obtenidos. Tres días antes de la preparación de células del bazo y fusión con una línea celular de mieloma, la inmunización final de refuerzo se realizó mediante inyección i.v. de 100 µg del polipéptido quimérico SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus. La producción de cultivos primarios de hibridomas puede se realizar de acuerdo con el procedimiento de Koehler y Milstein (Koehler, G. y Milstein, C., Nature, 256 (1975) 495-497).

Identificación sistemática con ELISA

Los sobrenadantes de cultivo primario se sometieron a ensayo con ELISA para reactividad frente al inmunógeno SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus, IGF-1 biotinilado nativo y SlyD de Thermus thermophilus de tipo silvestre con respecto a una placa de blanco. El Elisa se realizó con un Tecan SUNRISE, Firmware: V 3.15 19/03/01; XREAD PLUS Versión: V 4.20. Las placas de ELISA de múltiples pocillos Nunc Maxisorb F se revistieron con 5 µg/ml polipéptidos quiméricos de SlyD. Las placas de múltiples pocillos StreptaWell High Bind SA m se revistieron con 125 ng/ml de antígeno de IGF-1 biotinilado recombinante. A partir de ese momento, los sitios de unión libres se bloquearon con un 1 % de RPLA en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con una solución que comprendía cloruro sódico al 0,9 % (p/v) y Tween al 0,05 % (p/v). Los sobrenadantes de hibridoma sin diluir en medio RPMI 1640 se usaron como muestras. El tiempo de incubación fue de una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con una solución que comprendía cloruro sódico al 0,9 % (p/v) y Tween al 0,05 % (p/v). Como anticuerpo de detección se usó un anticuerpo policlonal frente al dominio constante de los anticuerpos diana conjugados con una peroxidasa (PAK<M-Fcγ>S-F(ab’)2-POD). El anticuerpo de detección se aplicó a una concentración de 80 ng/ml en PBS que comprendía RSA al 1 % (p/v). El tiempo de

imagen31

5

15

25

35

45

55

65

Thermus thermophilus, SlyD de Thermus thermophilus recombinante de tipo silvestre, SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus recombinante, SlyD de Thermococcus gammatolerans recombinante de tipo silvestre, SlyD-IGF-2 (5365) de Thermococcus gammatolerans recombinante. SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus es únicamente el dominio de FKBP de SlyD de Thermus thermophilus que carece de dominio IF. SlyD-IGF-2 (53-65) de Thermococcus gammatolerans se usó para contraidentificación sistemática investiga la especificidad para la horquilla de IGF-1 contraste con la inserción de la horquilla de IGF-2. Los respectivos ámbitos se inyectaron en diferentes etapas de concentración de 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3,3 nM, 1,1 nM y 0 nM. La fase de asociación se controló durante 3 min. a un caudal de 100 µl/min. La constante de disociación se controló durante 10 min. a un caudal de 100 µl/min. El sistema se regeneró usando un tampón de glicina 10 mM (pH 1,7). Las cinéticas se evaluaron usando el software de evaluación de BIAcore.

En el presente documento se usan los siguientes términos: mAb: anticuerpo monoclonal; RU: unidad de respuesta relativa de anticuerpo monoclonal capturado en el sensor; Antígeno: antígeno en solución; kDa: peso molecular de los antígenos inyectados como analitos en solución; ka: constante de la tasa de asociación; kd: constante de la tasa de disociación; t1/2 dis: semivida del complejo de anticuerpo-antígeno calculada de acuerdo con the fórmula t1/2 dis = ln(2)/60*kd; KD: constante de disociación; RMÁX: señal de unión a fin la fase de asociación de la inyección de analito 90 nM; MR: Proporción Molar; Chi2: fallo de la medición; n.d.: no detectable.

La Figura 36 muestra que los anticuerpos monoclonales derivados de armazón, M-11.11.17 y M-10.7.9, se han desarrollado con afinidad picomolar con respecto a IGF-1. No se detectó reactividad cruzada con respecto a IGF-2, ni con respecto a SlyD de Thermus thermophilus de tipo silvestre, ni con respecto a SlyD de Thermococcus gammatolerans de tipo silvestre, ni con respecto a polipéptido quimérico SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus, ni con respecto a polipéptido quimérico SlyD-IGF-2 (53-65) de Thermococcus gammatolerans.

M-2.28.44 es un anticuerpo monoclonal obtenido por inmunización convencional de ratones con IGF-1 humano recombinante. A pesar del hecho de que el anticuerpo muestra una afinidad de 30 pM con respecto a IGF-1, una actividad cruzada de 500 pM se puede detectar con respecto a IGF-2. Usando SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus y SlyD-IGF-2 (53-65) de Thermococcus gammatolerans como analitos, se puede observar que el epítopo de IGF-2 de reacción cruzada en la región de horquilla de IGF.

Observaciones adicionales

Para el desarrollo de anticuerpos de unión a IGF-1 nativos se ha encontrado que se tiene que usar un armazón, que presenta la inserción polipeptídica en su conformación nativa. Por lo tanto, es necesario que el polipéptido quimérico de presentación sea un polipéptido plegado de forma estable. Se ha encontrado que esto se puede conseguir usando un dominio de FKPB a partir de un organismo extremófilo (es decir, termófilo), tal como SlyD de Thermus thermophilus, o SlyD de Thermococcus gammatolerans.

Para examinar si los polipéptidos quiméricos, como se informa en el presente documento, adoptan una conformación plegada, se determinaron espectros de CD en la región del UV cercano. El CD del UV cercano determina el entorno asimétrico de restos aromáticos en un polipéptido y por lo tanto es un ensayo sensible para estructura terciaria ordenada. El SlyD nativo tiene una firma de CD habitual en la región del UV cercano. Por lo tanto, las distorsiones estructurales o choques estéricos debido a una inserción en el dominio IF deberían ser visibles en el espectro de CD del UV cercano. En la Figura 37 se muestra una superposición de los espectros de SlyD de Thermus thermophilus de tipo silvestre, el dominio FKBP de SlyD de Thermus thermophilus de tipo silvestre que carece del dominio IF (polipéptido quimérico SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus) y polipéptido quimérico SlyD-antígeno de Thermus thermophilus, en la que se insertó una inserción de 22 aminoácidos a partir de un fragmento del receptor extracelular humano. Se ha encontrado que la sustitución del dominio IF de Thermus thermophilus como resultado un cambio de la estructura general del dominio IF restante. Se puede observar que la firma de los espectros es similar. Dado que el desplegamiento podría anular la señal de CD del UV cercano, este resultado proporciona evidencias de que en el polipéptido quimérico se retiene un pliegue de tipo nativo.

El polipéptido quimérico SlyD-antígeno de Thermus thermophilus es un polipéptido quimérico que comprende una inserción de estructura secundaria de horquilla beta de 22 aminoácidos de un dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento humano (ECD). Las firmas de CD demuestran que a 20 ºC todos los polipéptidos están bien plegados en su estructura nativa.

La Figura 38 muestra los espectros de CD dependientes de la temperatura del polipéptido quimérico SlyD-ΔIF de Thermus thermophilus. Después de desplegamiento inducido por la temperatura, el dominio FKBP de SlyD de Thermus thermophilus se puede volver a pegar cuando se enfría de nuevo. Debido a esto, los polipéptidos quiméricos se pueden purificar por afinidad mediante un replegamiento en columna y, además, en contraste con los hallazgos con el polipéptido quimérico SlyD-FKBP12-IGF-1, el polipéptido quimérico SlyD-IGF-1 (74-90) de Thermus thermophilus posee una estabilidad estructural para presentar el motivo de estructura secundaria de IGF-1 en el dominio FKBP en una conformación estable. Los espectros de CD del UV cercano dependientes de la temperatura del polipéptido quimérico SlyD-antígeno de Thermococcus gammatolerans muestran una estabilidad incluso más elevada cuando se compara con el polipéptido quimérico de antígeno de Thermus thermophilus (véase la Figura 39).

imagen32

imagen33

En la Figura 45 se muestra un SDS PAGE (izquierda) y transferencia de Western (derecha) de Ni-NTA SlyDFKBP12-CD81 purificado de forma cromatográfica.

Un Instrumento BIAcore 2000 (GE Healthcare) se usó a 25 ºC con un sensor CM5 de BIAcore montado en el

5 sistema. El sensor se acondicionó previamente para una inyección de 1 minuto a 100 µl/min de SDS al 0,1 %, NaOH 50 mM, HCl 10 mM y H3PO4 100 mM. Como tampón de desarrollo se usó un tampón HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, P20 al 0,05 % (p/v). El tampón de muestra fue el tampón del sistema. Cada ligando de proteína se inmovilizó mediante la química de EDC/NHS a 30 µg/ml en tampón de acetato sódico 10 mM (pH 4,0) en las celdas de flujo 2, 3 y 4. La celda de flujo 1 se usó como referencia. El sensor se desactivó con una solución de

10 etanolamina 1 M a pH 8,0. Se inmovilizaron las siguientes masas en unidades de respuesta (RU) en el sensor: celda de flujo 2: 1800 RU de SlyD-FKBP12ctrl (32,8 kDa), celda de flujo 3: SlyD-FKBP12-CD81 (35,8 kDa), celda de flujo

4: 900 RU de CD81LEL (10 kDa). 31 analitos de anticuerpo se inyectaron a 30 µl/min a 50 nM cada uno para una fase de asociación de 3 min. y fase de disociación de 3 min. 30 anticuerpos se obtuvieron a partir de una campaña de inmunización con la proteína CD81LEL de 10 kDa. La superficie del sensor se regeneró usando HCl 100 mM a

15 20 µl/min para 3 inyecciones consecutivas de 30 seg. Los sensogramas se controlaron como señales de referencia 2-1 (celda de flujo 2 menos celda de flujo 1), 3-1 y 4-1 y se evaluaron usando el software de evaluación BIAcore 4.1. Al final de la inyección del analito, se estableció un punto de informe para cuantificar la señal máxima de unión del analito. La señal de unión al analito más elevada se ajustó a un 100 % para normalizar los datos.

20 En la tabla que sigue a continuación se muestran las respuestas de unión de anticuerpo normalizado. A partir de los 30 anticuerpos <CD81-LEL>M sometidos a ensayo, solamente 6 (en negrita) muestran un epítopo preciso en el dominio director de CD81. El polipéptido de control negativo, SlyD-FKBP12ctrl, no estaba unido. El polipéptido de control positivo, CD81-LEL, que era el inmunógeno al mismo tiempo, era reconocido por todos los anticuerpos. SlydFKBP12-CD81 era el único que estaba unido, cuando el epítopo de anticuerpo se sitúa de forma precisa en el

25 dominio de hongo.

Tabla

Ligandos: Slyd-FKBP12-ctrl Slyd-FKBP12-CD81 CD81-LEL

Analitos: Señal de unión de ref. normalizada (%)

HBS-ET: 0 0 0

K01: 0 0 63

K02_1: 0 0 62

K02_2: 0 0 61

K03: 0 47 93

K04: 0 0 80

K05: 0 26 100

K06: 0 32 74

K07: 0 0 62

K08: 0 0 56

K10: 0 0 46

K21: 0 0 77

K22: 0 29 80

K23: 0 0 37

K24: 0 17 86

K25: 0 0 38

K27: 0 29 81

K28: 0 0 41

Claims

imagen1

imagen2