ES2603629T3 - Usos terapéuticos de Lactobacillus salivarius LS01 DSM 22775 - Google Patents

Usos terapéuticos de Lactobacillus salivarius LS01 DSM 22775 Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende un cultivo de bacterias probióticas Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, depositada el 23.07.2009 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, para su uso en el tratamiento preventivo y/o curativo de patologías seleccionadas del grupo que consiste en alergias, atopía, rinitis alérgica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atópica, eczema, asma o inmunodeficiencias.

Description

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DESCRIPCION
Usos terapeuticos de Lactobacillus salivarius LS01 DSM 22775 La presente invencion se describe en las reivindicaciones 1-12
La presente invencion se refiere a una composicion que comprende bacterias probioticas para el tratamiento de patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario. En particular, la presente invencion se refiere al uso de bacterias probioticas seleccionadas para la preparacion de una composicion para el tratamiento de alergias, tales como dermatitis atopica.
Es bien conocido que la dermatitis atopica (de aqu en adelante DA por razones de brevedad) es un trastorno cronico de la piel con recafdas que comienza en el periodo neonatal o en la infancia y puede continuar en la edad adulta. Por lo tanto, las fases de la DA se dividen en neonatal, infantil y adulta. La DA es una enfermedad inflamatoria de la piel que, como el asma y la rinitis alergica, se asocia con la infiltracion local de linfocitos T que producen interleucina-4 (IL-4) e interleucina-5 (IL-5).
La IL-4, como es bien conocido, regula el desarrollo del fenotipo T auxiliar 2 (Th2), con la consiguiente hiperproduccion de inmunoglobulina (Ig) y eosinofilia. Los niveles elevados en suero de Ig E y los ensayos positivos en la piel para los alergenos alimentarios e inhalados pueden demostrarse en el 80-90 % de los sujetos con dermatitis atopica.
La DA se basa tanto en factores geneticos como en factores inmunologicos, a pesar de que un gran numero de factores externos pueden modificar su expresion. En el 60 % de los casos de DA pueden demostrarse antecedentes familiares de atopfa; en otras palabras, si un progenitor tiene una diatesis atopica existe una probabilidad del 60 % de que el descendiente sea atopico.
La atopfa es la predisposicion genetica para el desarrollo de reacciones anafilacticas localizadas despues del contacto, ingestion, inoculacion o inhalacion de alergenos.
Los factores inmunologicos que se tienen en cuenta en la etiologfa de la DA son: alergia alimentaria, alergia inducida por contacto con alergenos e irritantes, alergia inducida por aeroalergenos y anomalfas inmunorreguladoras.
Entre la multitud de tratamientos dirigidos para la cura y/o prevencion de alergias o inflamaciones de la piel, en particular, para el tratamiento de la dermatitis atopica, destacan muchos tratamientos basados en farmacos.
Los tratamientos basados en farmacos tienen varias contraindicaciones que limitan su uso. Ademas, estos farmacos no parecen tolerarse bien por algunos tipos de pacientes.
Sin embargo, actualmente no existe un tratamiento que tenga una eficacia absoluta y definitiva. Solo es posible adoptar ciertas precauciones frente a la aparicion de alergias o, segun sea necesario, remedios para mitigar los smtomas molestos, tales como el prurito y el enrojecimiento de la piel.
Por lo tanto, persiste una necesidad de tener un tratamiento que no presente las limitaciones de los tratamientos basados en farmacos y que pueda administrarse a todo tipo de pacientes.
En particular, persiste una necesidad de tener un tratamiento que pueda servir para combatir la aparicion de alergias y el desarrollo de inflamaciones de la piel y/o reducir los smtomas molestos tales como enrojecimiento del tejido de la piel, prurito y eczema.
El solicitante ha proporcionado una respuesta a las necesidades mencionadas anteriormente ya que ha tenido exito, tras una actividad de investigacion intensa, en la seleccion de cepas bacterianas probioticas espedficas.
La materia objeto de la presente invencion es una composicion que comprende un cultivo de bacterias probioticas, tal como se reivindica en la reivindicacion independiente adjunta.
La materia de la presente invencion se refiere ademas al uso de un cultivo de bacterias probioticas, tal como se reivindica en la reivindicacion independiente adjunta.
El solicitante se ha fijado el objetivo de seleccionar cepas bacterianas espedficas con el fin de evaluar su efecto en el curso clmico y la calidad de vida de los pacientes con DA moderada o grave y con el fin de determinar su influencia en los parametros clmicos e inmunologicos.
Ademas, el solicitante se fijo el objetivo de seleccionar cepas bacterianas con actividad probiotica capaces de ser toleradas por pacientes y aptas para la colonizacion del aparato intestinal.
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El diagnostico de la DA moderada/grave se ha evaluado usando un mdice estandarizado de gravedad para la dermatitis atopica -de aqu en adelante indicada como DA- (mdice SCORAD = puntuacion de dermatitis atopica). Dicho mdice es conocido por los expertos en la materia.
Se ha encontrado que las cepas bacterianas de la presente invencion tienen un alto efecto inmunomodulador y de este modo son utiles para el tratamiento de patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario.
Despues de una actividad intensa de investigacion, el solicitante ha seleccionado, de entre muchas cepas ensayadas, las siguientes cepas bacterianas probioticas:
1) Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, depositada el 23.07.2009, por la comparMa Probiotical SpA de Novara - Italia;
2) Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604, depositada el 20.07.2004, por la comparMa Probiotical SpA de Novara - Italia;
3) Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, depositada el 14.11.2008, por la comparMa Probiotical SpA de Novara - Italia;
4) Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, depositada el 13.09.2006, por la comparMa Mofin Srl de Novara - Italia;
5) Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605, depositada el 20.07.2004, por la comparMa Probiotical SpA de Novara - Italia; y
6) Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717, depositada el 06.08.2008, por la comparMa Probiotical SpA de Novara - Italia.
Todos los cultivos indicados anteriormente se han depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, (DSMZ) en Alemania, de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Los cultivos de bacterias probioticas enumeradas anteriormente pueden estar en forma de bacterias vivas, bacterias muertas o componentes celulares, extractos celulares o sus lisados.
En una realizacion preferida, la composicion comprende al menos un cultivo bacteriano tal como se reivindica para su uso como una composicion inmunomoduladora con capacidad para modular el sistema inmunitario.
La expresion “composicion inmunomoduladora” significa que la composicion tiene la capacidad de modular el sistema inmunitario en el sentido de que tiene la capacidad de estimular/inducir varias respuestas del sistema inmunitario, volviendolo mas reactivo, por ejemplo, interviniendo a traves de la produccion de citoquinas espedficas.
De manera ventajosa, dicha composicion inmunomoduladora induce al sistema inmunitario hacia la produccion de citoquinas tipo 1.
De manera ventajosa, las cepas bacterianas y los correspondientes cultivos bacterianos han demostrado tener la capacidad de mejorar los parametros clmicos e inmunologicos. En particular, se ha observado que tiene la capacidad de:
1) mejorar significativamente el mdice SCORAD y el DLQI;
2) reducir la translocacion microbiana (niveles de LPS en plasma) y activar los linfocitos T CD8+;
3) aumentar el porcentaje tanto de los linfocitos T reguladores (Treg) totales, como de los mismos que expresan los marcadores TLR2 y TLR4;
4) mejorar las relaciones Th1/Th2 y Th17/Treg.
Por lo tanto, la composicion de la presente invencion (composicion inmunomoduladora) tiene la capacidad de prevenir, reducir y/o curar las patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario, tales como alergias, atopfa, rinitis alergica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atopica, eczema, asma e inmunodeficiencias.
De acuerdo con una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende o, alternativamente, que consiste en un cultivo de bacterias probioticas de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775.
De acuerdo con otra realizacion preferida, la presente invencion se refiere al uso de al menos un cultivo de bacterias probioticas de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 para la preparacion de una composicion que tiene la
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capacidad de prevenir, reducir y/o curar las patolog^as seleccionadas del grupo que consiste en alergias, atopfa, rinitis alergica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atopica, eczema, asma e inmunodeficiencias.
De acuerdo con otra realizacion preferida, la presente invencion se refiere al uso de una composicion que comprende dicho cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775.
Preferentemente, la invencion se refiere al uso de dicho cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 para la preparacion de una composicion para el tratamiento preventivo y/o curativo de la dermatitis atopica.
De acuerdo con otra realizacion preferida, la presente invencion se refiere al uso de una composicion que comprende o, alternativamente, consiste en dicho cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775.
Los cultivos bacterianos de la presente invencion pueden considerarse como “ingredientes activos” que pueden mezclarse, en las proporciones debidas, con excipientes fisiologica y/o farmaceuticamente aceptables.
Para aumentar su actividad, los ingredientes activos pueden administrarse sistematicamente, de manera ventajosa via oral, en forma de composiciones en estado solido, preparadas de acuerdo con las tecnicas conocidas por los expertos en la materia.
En una realizacion preferida, las composiciones estan en forma de liofilizados, polvos, granulos, comprimidos, capsulas de gelatina blanda o suspensiones.
Las composiciones de la presente invencion pueden ser composiciones farmaceuticas, dieteticas, nutricionales o nutraceuticas.
Las composiciones de la presente invencion ademas pueden comprender fibras dieteticas con actividad prebiotica, tales como fructooligosacaridos (FOS), inulina y goma guar parcialmente hidrolizada (PHGG).
Las composiciones farmaceuticas, dieteticas, nutricionales o nutraceuticas de la presente invencion comprenden al menos un cultivo de bacterias probioticas, como se ha indicado anteriormente. La concentracion final de la
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composicion que comprende de 1x10 a 1x10 UFC/g de composicion, preferentemente de 1x10 a 1x10 UFC/g de composicion.
Las composiciones de la presente invencion, que comprenden bacterias probioticas seleccionadas, son utiles como composiciones inmunomoduladoras capaces de modular el sistema inmunitario.
Dichas composiciones son capaces de curar y/o prevenir las patologfas asociadas con alteraciones en las funciones de las siguientes citoquinas: Th1 (IFN-y e IL-12) y Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10).
Ademas, dichas composiciones son capaces de inducir el sistema inmunitario, induciendo a este ultimo hacia la produccion de citoquinas tipo 1.
Por lo tanto, las composiciones de la presente invencion tienen una aplicacion valida para el tratamiento preventivo y/o curativo de patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario, en particular para el tratamiento preventivo y/o curativo de alergias, atopfa, rinitis alergica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atopica, eczema, asma o inmunodeficiencias.
De manera ventajosa, las composiciones de la presente invencion tienen una aplicacion valida en el tratamiento preventivo y/o curativo de la dermatitis atopica.
De manera ventajosa, la ingesta, por pacientes afectados con dermatitis atopica DA, de una composicion probiotica que comprende el cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y el cultivo de Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 a una concentracion que comprende de 1x107 a 1x1011 UFC, preferentemente 1x109 UFC/g, determina un descenso en el mdice Scorad (un valor Scorad mas bajo indica una mejor calidad de vida).
Ademas, la administracion de dicha composicion probiotica durante un periodo que comprende de 12 a 24 semanas, preferentemente 16 semanas, puede reducir/bloquear la secrecion de la citoquina IL-4.
Parte experimental (I)
El solicitante ensayo la totalidad de las seis cepas mencionadas anteriormente.
Se llevo a cabo un primer estudio clmico para ensayar una composicion que comprendfa el cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y el cultivo de Bifidobacterium breve (BR03) DsM 16604.
Un grupo de 40 pacientes (hombres y mujeres, de edades de 18 a 55 anos) con DA moderada/grave se
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distribuyeron al azar (1:1) en dos grupos.
El diagnostico de DA moderada/grave, se evaluo usando un mdice de gravedad de DA estandarizado (mdice SCORAD = puntuacion de dermatitis atopica). Dicho mdice es conocido por los expertos en la materia.
T0 representa el tiempo cero, como el punto de comienzo del tratamiento, mientras que T16 representa la semana 16 del periodo de tratamiento. En el T16 se llevo a cabo un examen, con Scorad y muestreo.
El grupo A se trato con una composicion que comprendfa el cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y el cultivo de Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604, que teman una concentracion de 1x109 UFC (que corresponde a 0,01 g). Los dos cultivos se mezclaron con 1 g de almidon de mafz para proporcionar una composicion final de 1,01 g en sobres. Los 20 pacientes del grupo A recibieron 2 sobres por dfa durante 16 semanas.
El grupo B se trato con un placebo representado por 1 g de (solo) almidon de mafz. Los 20 pacientes del grupo B recibieron 2 sobres de placebo por dfa durante 16 semanas.
Se ensayaron las siguientes citoquinas: Th1 (IFN-y e IL-12) y Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10).
Todos los datos de los 40 pacientes se recogieron y analizaron minuciosamente.
La figura 1 muestra un histograma relativo al mdice Scorad en T0 y T16.
Los resultados obtenidos muestran que la ingesta, por los 20 pacientes del grupo A, de la composicion probiotica que comprendfa el cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y el cultivo de Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604, a una concentracion de 1x109 UFC, determino una disminucion en el Scorad en pacientes afectados por DA (un valor mas bajo de Scorad indica una mejor calidad de vida).
Ademas, la administracion de dicha composicion probiotica durante 16 semanas podfa bloquear la secrecion de la citoquina considerada, IL-4, cuyo valor medio era comparable con el obtenido en el momento de la inscripcion. Mientras que, por el contrario, la administracion del placebo no podfa bloquear la liberacion de la citoquina IL-4, que aumento significativamente despues de 16 semanas de tratamiento (evolucion de la enfermedad).
Se llevaron a cabo una serie de estudios pre-clmicos in vitro en un grupo de bacterias que comprendfa, entre otras, el cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y el cultivo de Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604.
Los estudios pre-clmicos in vitro comparando las capacidades inmunomoduladoras de las cepas bacterianas ensayadas demostraron que el cultivo de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y el cultivo de Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 muestran una capacidad superior en la induccion de la produccion de citoquinas tipo 1.
Tambien se ensayaron los cultivos de las bacterias Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) dSm 16605 y Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717.
El cultivo de la cepa L. pentosus (LPS01) DSM 21980 demostro in vitro inducir un perfil muy fuerte de citoquina pro- Th1.
Ademas, todos los cultivos de las cepas de Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605 y Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717 se ensayaron con respecto a su capacidad de inducir la smtesis de IL-12 mediante PBMC en un estudio in vivo. La IL-12 es una citoquina de tipo Th1 y representa un elemento clave en el tratamiento de alergias y otras patologfas atopicas.
Como ejemplo, se informa de los datos relativos a L. pentosus (LPS01) DSM 21980, ensayados en PBMC: Th-1 (pg/ml) = 1,754; Th-2 (pg/ml) = 326; Th1/Th2 = 5,38.
Parte experimental (II)
El solicitante llevo a cabo un primer estudio clmico usando una composicion que comprendfa los cultivos de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y Bifidobacterium breve (BR03) y un segundo estilo clmico usando una composicion que comprendfa los cultivos de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) y Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980. Por razones de simplificacion, solo se informa de los detalles de dicho primer estudio clmico, debido a que dicho segundo estudio clmico se llevo a cabo con los mismos procedimientos. Ambos estudios clmicos (primero y segundo) proporcionaron resultados comparables.
El solicitante llevo a cabo dicho primer estudio clmico (aleatorizado, con doble ocultacion, en pacientes afectados por
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dermatitis atopica grave o moderada), para evaluar la eficacia clmica de la administracion de dos cepas bacterianas probioticas, concretamente Lactobacillus salivarius (LS01), depositada en la DSMZ y que tiene el numero de deposito DSM 22775, y Bifidobacterium breve (BR03), depositada en la DSMZ y que tiene el numero de deposito DSM 16604.
Materiales y procedimientos
En el estudio participaron 48 pacientes afectados por dermatitis atopica (de aqu en adelante DA). Sus caractensticas se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
Pacientes con probioticos (n=31) Pacientes con placebo (n=15)
Sexo (M/F)
14/17 5/10
Edad (anos)
32,44 + 1,47 30,91 + 2,79
Alergia respiratoria
23/31 (74,2 %) 9/15 (60 %)
Alergia alimentaria
2/31 (6,4 %) 2/15 (13,3 %)
Otras alergias
7/31 (22,6 %) 2/15 (13,3 %)
No alergias
5/31 (16 %) 4/15 (26,6 %)
Anos de DA
19,36 + 2,38 15,08 + 3,04
El presente estudio clmico se llevo a cabo en el periodo de abril-septiembre de 2010.
Treinta y dos (32) pacientes (grupo de tratamiento) recibieron una preparacion que contema las dos cepas bacterianas probioticas, concretamente L. salivarius (LSoi) DSM 22775 y B. breve (BR03) DSM 16604, en una dosis de 1*109 UFC/g de cada cepa en maltodextrina.
Mientras tanto 16 pacientes (grupo placebo) recibieron una preparacion de maltodextrina solamente. Ambos grupos se trataron dos veces al dfa durante 12 semanas. Las composiciones en forma liofilizada se disolvieron en agua y se administraron por via oral a los pacientes.
Ninguno de los pacientes modifico su dieta y a todos se les pidio que no consumieran productos fermentados que contuvieran microorganismos vivos durante el estudio clmico. Los pacientes que estaban afectados por una enfermedad alergica activa (respiratoria o de la piel), o una enfermedad infecciosa durante el embarazo o la lactancia, se excluyeron del presente estudio. Los pacientes que habfan recibido un tratamiento con probioticos, antibioticos o inmunomoduladores durante los seis meses antes de la inscripcion o que habfan recibido un tratamiento con esteroides por via oral un mes antes de la inscripcion, se excluyeron del presente estudio. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado en el momento de la inscripcion.
La evaluacion clmica se baso en el mdice SCORAD (Puntuacion de dermatitis atopica) y en el DLQUI, (fodice de calidad de vida de dermatologfa) y en la translocacion microbiana y parametros inmunologicos. Para cada paciente individual, se hicieron todas las evaluaciones en el momento de la inscripcion (lmea de base), despues de 3 meses de tratamiento (3 meses) y dos meses despues del final de la terapia (3+2 meses).
Cuestionario de smtomas y calidad de vida
Los criterios diagnosticos para la DA se fijaron siguiendo la grna clmica publicada recientemente. La gravedad clmica se evaluo usando el mdice SCORAD desarrollado por el European Task Force for atopic dermatitis. En el curso del estudio, para medir las variaciones en los smtomas unidos a la patologfa, todos los pacientes inscritos completaron el cuestionario espedfico DLQI (mdice de calidad de vida de dermatologfa). La evaluacion SCORAD se llevo a cabo al inicio, al final y dos meses despues de la suspension del tratamiento (probioticos o placebo) por un operador que no sabfa en que grupo se escribio el paciente. El DLQI se completo por los pacientes en el momento de la inscripcion y a las 12 y 20 semanas.
Separacion del plasma y de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC)
Para la separacion del plasma y de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), se extrajeron las muestras de sangre venosa periferica de todos los sujetos de estudio en el momento de la inscripcion, despues de 3 meses de tratamiento y 2 meses tras la suspension de la terapia. El plasma se almaceno hasta el momento del analisis, en el que las PBMC se separaron mediante centrifugacion en gradiente de densidad. La viabilidad celular se determino usando un contador de celulas Adam-MC.
Estimulacion de las PBMC
Las PBMC se incubaron durante 18 horas en presencia o ausencia de estimulacion con lipopolisacarido (LPS)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
bacteriano. Se llevo a cabo un analisis de las citoquinas inducidas por el estfmulo antigenico mediante citometna de flujo, anadiendo brefeldina A como inhibidor del transporte celular en las ultimas horas del cultivo.
Analisis inmunofenotipico
Se calculo el porcentaje de linfocitos T CD8+ activados directamente en las muestras de sangre venosa periferica mediante analisis citofluorimetrico usando anticuerpos monoclonales (mAb) conjugados con fluorocromos (CD8, CD38, CD45RO). Tras la incubacion con el mAb, los eritrocitos se lisaron y las celulas se fijaron y analizaron con un citometro de flujo FC500 (Beckman Coulter).
Analisis de subpoblaciones de linfocitos
La identificacion de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T se llevo a cabo en cultivos de PBMC no estimuladas y cultivos de PBMC estimuladas durante 18 horas con LPS, en todo momento (lmea de base, 3 meses y 3+2 meses). El marcado de las celulas se hizo usando simultaneamente combinaciones de anticuerpos fluorescentes capaces de reconocer moleculas tanto en la superficie celular como en los componentes intracelulares. Espedficamente, se identificaron los linfocitos auxiliares T tipo 1, (Th1) como CD4+/IFN-y+/Tbet+; los linfocitos auxiliares T tipo 2 (Th2) como CD4+/IL-4+/GATA3+; los linfocitos axilares T tipo 17 (Th17) como CD4+/IL- 17+/RORyT+ y, finalmente, los linfocitos auxiliares T reguladores (Treg) como CD4+/CD25+/FoxP3+/IL-10+/TGF-p+.
Evaluacion de la expresion de los receptores tipo Toll (TLR) en los linfocitos T reguladores
El analisis se realizo en PBMC no estimuladas, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante del mAb. Espedficamente, se necesitaron los siguientes mAb: CD4, CD25, FoxP3, TLR-4, TLR-2.
Ensayo de LPS en plasma
Para determinar la concentracion del LPS presente en las muestras de plasma, se hizo uso del kit “LAL Chromogenic Endopoint Assay” vendido por la comparua Hycult biotechnology, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se llevo a cabo en una placa de 96 pocillos. Tras 45 minutos de incubacion a temperatura ambiente, se leyo la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm con un espectrofotometro y se calculo la concentracion de LPS, expresada en pg/ml, por interpolacion con una curva de concentracion conocida.
Recogida y almacenamiento de muestras fecales
Las muestras fecales se recogieron en el momento de la inscripcion, tras 3 meses de tratamiento y 2 meses despues del final del estudio. Las muestras se pusieron inmediatamente a 4 °C, se tomaron partes alfcuotas y se almacenaron a -80 °C hasta el momento del analisis.
Cuantificacion de las bacterias presentes en las muestras fecales
La cuantificacion se llevo a cabo en todas las bacterias aerobias y en los siguientes grupos bacterianos: Enterobacteria, Staphylococci, Lactobacilli (en particular L. salivarius LS01) y Bifidobacterias (en particular B. breve BR03). Las muestras fecales se diluyeron en soluciones fisiologicas y las diluciones apropiadas se incubaron de acuerdo con el siguiente esquema:
Todas las bacterias AEROBIAS: Agar de soja tnptico con sangre de oveja al 5 % (AS);
Enterobacteria: Agar MacConkey (MC);
Staphylococci: Agar Manitol Sal (MSA);
Lactobacilli: Agar de Man, Rogosa y Sharpe (MRS);
Bifidobacteria: Medio selectivo para Bifidobacterium (BSM).
Los medios MC y BSM se incubaron a 37 °C durante 24 y 48 horas, respectivamente. Los medios AS, MRS y BSM se incubaron a 37 °C, en presencia de dioxido de carbono al 10 %, durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente.
Todas las colonias se identificaron a traves del crecimiento en los medios selectivos, tincion Gram, morfologfa celular y ensayos de la catalasa y oxidasa.
La composicion de la microbiota intestinal se expreso como el recuento (media + desviacion estandar del logaritmo en base 10 (log 10) por gramo de heces) para cada grupo bacteriano. Los lfmites de deteccion eran 2 log10 UFC/g para todos los microorganismos con la excepcion de B. breve, cuyo lfmite era 5 log10 UFC/g. Las modificaciones de los recuentos de los diferentes grupos microbianos se calcularon como:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
[(Log10 UFC/g en T12 o T16) - (Log10 UFC/g en T0)]
Identificacion molecular de L. salivarius LS01 y de B. breve BR03
Las dos cepas bacterianas se identificaron inicialmente en base a sus peculiaridades morfologicas: L. salivarius LS01 cultivada en medio BSM agarizado forma colonias coloreadas en blanco-crema, redondeadas con una forma alargada y un diametro que comprendfa de 2 a 4 mm; B. breve BR03 en medio BSM agarizado forma colonias coloreadas fucsia, redondeadas con una forma alargada y un diametro que comprendfa de 1 a 2 mm.
En los cultivos en los que era posible asumir la presidencia de las cepas de L. salivarius y B. breve, se analizaron 10 colonias al azar mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de acuerdo con las grnas publicadas por el National Institute of Health. Todas las colonias clasificadas como L. salivarius o B. breve se caracterizaron adicionalmente mediante la ejecucion de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y comparando los perfiles con las referencias adecuadas.
Analisis estadistico
Los resultados se analizaron usando ensayos estadfsticos apropiados. Los ensayos-T se usaron para comparar los pacientes durante los tratamientos. Las posibles relaciones se evaluaron usando el ensayo de correlacion de Pearson. Las variaciones en el recuento bacteriano se analizaron usando el ensayo de Wilcoxon-Mann-Whitney. El analisis estadistico se llevo a cabo usando el paquete estadistico SPSS.
Resultados
a) Eficacia clinica
46 pacientes afectados por DA completaron el estudio clmico; se excluyeron 2 pacientes (1 paciente por grupo). La evaluacion del SCORAD (mdice SCORAD) y el DLQI se hizo durante los examenes de seguimiento. Los pacientes tratados con los probioticos mostraron una reduccion significativa en el SCORAD al final del tratamiento (p=0,001) que tambien se mantuvo tras la suspension del tratamiento (p=0,006) (Tabla 2).
De manera analoga, el DLQI mostro una mejora en los pacientes tratados con la mezcla probiotica (inscripcion frente a 3 meses de tratamiento: p=0,021; inscripcion frente a 2 meses tras la suspension: p=0,001). En el grupo de los pacientes a los que se les administro el placebo, no se observo ninguna diferencia significativa ni en terminos de SCORAD ni de DLQI (Tabla 2).
b) Concentracion de LPS en plasma
La concentracion de LPS es un mdice de traslocacion microbiana; un aumento en la concentracion de LPS se asocia con alteraciones en la permeabilidad intestinal. El tratamiento con las dos cepas probioticas indujo una reduccion en la concentracion de LPS en plasma, que se mantuvo tras la interrupcion de la terapia (lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p=0,050; lmea de base frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p< 0,001; 3 meses de tratamiento frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p< 0,001), como se muestra a continuacion (Tabla 3).
Tabla 3
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
71,71 56,64
3 meses de tratamiento
53,17 76,7
2 meses tras la suspension
36 119,61
En los pacientes tratados con el placebo se observo un aumento significativo en los niveles de LPS en plasma durante el periodo de estudio (lmea de base frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,004; 3 meses de tratamiento frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,0160) (Tabla 3). Al final del estudio, la concentracion de LPS en plasma era significativamente mayor en el grupo control (placebo) en comparacion con el grupo de tratamiento (p<0,001).
c) Linfocitos T activados
Las celulas T CD8+ activadas se analizaron evaluando la expresion en las mismas de las moleculas CD38 y CD45. Se observo una reduccion progresiva en dichas celulas durante el periodo de estudio en los pacientes tratados con los dos probioticos (lmea de base frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p<0,001; 3 meses de tratamiento frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p<0,001) (Tabla 4). No se observo ninguna diferencia significativa en el grupo placebo.
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 4
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
2,51 1,8
3 meses de tratamiento
2,08 1,61
2 meses tras la suspension
1,19 1,3
d) Celulas T reguladoras (Treg)
Las celulas T reguladoras se evaluaron tanto en ausencia de estimulacion como tras la estimulacion con LPS. Tras el tratamiento con la mezcla probiotica, el porcentaje de linfocitos Treg no estimulados se aumento significativamente (lmea de base frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,002; 3 meses de tratamiento frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,034) (Tabla 5A y Tabla 5B). Se obtuvieron resultados similares del analisis tras la estimulacion con LPS.
Tabla 5A
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
18,57 33,22
3 meses de tratamiento
23,08 32,08
2 meses tras la suspension
39,12 27,22
Tabla 5B
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
19,85 16,77
3 meses de tratamiento
24,99 28,31
2 meses tras la suspension
31,8 22,38
e) Expresion de los receptores tipo Toll en linfocitos T reguladores
La expresion de los receptores tipo Toll 2 (TLR-2) y 4 (TLR-4) se evaluo directamente en sangre venosa periferica. Como se muestra en la Tabla 5C y la Tabla 5D, la expresion de ambas moleculas en los linfocitos Treg se aumento significativamente tras 3 meses de administracion de probioticos; este resultado tambien se mantuvo 2 meses tras la suspension del tratamiento (TLR-2: Lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p<0,001; lmea de base frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,010; TLR-4: lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p<0,001; lmea de base frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,011). En el grupo control (placebo), se observo una disminucion significativa en la expresion de la molecula TLR-2 por los linfocitos Treg al final del estudio (3 meses de tratamiento frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,009).
Tabla 5C
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
8,67 16,67
3 meses de tratamiento
30,89 23
2 meses tras la suspension
23,78 12,51
Tabla 5D
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
9,27 17,02
3 meses de tratamiento
31,17 22,97
2 meses tras la suspension
22,67 18,87
f) Subpoblaciones de linfocitos Th1, Th2 y Th17
Las subpoblaciones de linfocitos Th1, Th2 y Th17 se evaluaron en ausencia de estimulacion y tras la estimulacion con LPS en ambos grupos sometidos a analisis: el porcentaje de la subpoblacion Th1, identificada en base a la expresion de las moleculas CD4 y Tbet y que secreta la citoquina IFN-y, se aumento significativamente en los sujetos tratados con la mezcla probiotica, tanto en ausencia de estimulacion como tras la estimulacion con LPS (sin estimulacion: lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p=0,003; LPS: lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p=0,025; lmea de base frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,019) (Tabla 6A y Tabla 6B). En los pacientes tratados con los probioticos, se observo dos meses despues del final del tratamiento una disminucion adicional en las celulas Th1 (p<0,001).
Tabla 6A
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
0,11 0,18
3 meses de tratamiento
0,23 0,2
2 meses tras la suspension |__________0,16__________| 0,14
Tabla 6B
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
0,09 0,13
3 meses de tratamiento
0,19 0,21
2 meses tras la suspension
0,18 0,1
El porcentaje de la subpoblacion de celula Th2, identificadas en base a la expresion de las moleculas CD4 y GATA3 5 y que secreta la citoquina IL-4, se aumento significativamente durante la administracion de probioticos pero tras la suspension de la terapia disminuyo de nuevo (sin estimulacion: lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p=0,016; 3 meses de tratamiento frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,005; LPS: lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p=ns; 3 meses de tratamiento frente a 2 meses tras la suspension del tratamiento: p=0,0045) (Tabla 6C y Tabla 6D).
10
Tabla 6C
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
0,85 0,45
T 1
0,26 0,19
T 2
0,9 0,41
Tabla 6D
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
0,81 0,61
T 1
0,45 0,3
T 2
1,69 0,07
15 El porcentaje de la subpoblacion de celula Th17, identificada en base a la expresion de las moleculas CD4 y RORyT y que secreta la citoquina IL-17, se disminuyo en los pacientes tratados con los probioticos tras 3 meses de tratamiento (sin estimulacion: lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p=0,037; LPS: lmea de base frente a 3 meses de tratamiento: p=0,046) (Tabla 6E y Tabla 6F). Dos meses despues de la suspension del tratamiento se observaron diferencias significativas entre los dos grupos sometidos a analisis en cuanto a las subpoblaciones de 20 linfocitos Th2 y Th17 (p=0,008 y p=0,031, respectivamente). No se encontro ninguna diferencia significativa en las poblaciones de celulas Th1, Th2 y Th17 en los sujetos del grupo control (placebo).
Tabla 6E
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
0,18 0,14
3 meses de tratamiento
0,1 0,18
2 meses tras la suspension
0,12 0,04
25 Tabla 6F
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
0,17 0,15
3 meses de tratamiento
0,1 0,12
2 meses tras la suspension
0,11 0,1
g) Relaciones Th1/Th2 y Th17/Treg
Tras 3 meses de administracion de probioticos, se observo un aumento significativo en la relacion Th1/Th2 (p= 30 0,028) (Tabla 7A). Este efecto se perdio tras la interrupcion del tratamiento (p=0,002). Por el contrario, en el grupo
tratado con la mezcla bacteriana, la relacion Th17/Treg disminuyo progresivamente y este resultado tambien se encontro 2 meses despues de la interrupcion de la terapia (p=0,029). Durante el estudio los sujetos inscritos en el grupo control (placebo) no mostraron ninguna variacion significativa en las relaciones Th1/Th2 y Th17/Treg. La relacion Th17/Treg era significativamente mayor en el grupo placebo en comparacion con el grupo probiotico tras 3 35 meses de tratamiento (p=0,037) (Tabla 7B).
Tabla 7A
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
0,48 0,74
3 meses de tratamiento
1,27 0,95
2 meses tras la suspension
0,49 0,95
Tabla 7B
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Pacientes con probioticos Placebo
Lmea de base
1,075 0,94
3 meses de tratamiento
0,57 1,19
2 meses tras la suspension
0,62 0,333
h) Correlaciones
En los pacientes a los que se les administraron los probioticos, al final del tratamiento se observo una correlacion negativa entre el SCORAD y el porcentaje de linfocitos Treg tras la estimulacion con LPS (p=0,020) y entre el porcentaje de linfocitos T CD8+ activados y el de las celulas T estimuladas con LPS (p=0,046).
Se observo una correlacion positiva significativa entre la concentracion de LPS en plasma y el porcentaje de celulas Th2 no estimuladas (p=0,0l6), entre la concentracion de LPS en plasma y el porcentaje de celulas Th17 estimuladas con LPS (p=0,04) y entre el porcentaje de linfocitos T CD8+ activados y el de las celulas Th17 estimuladas con LPS (p=0,037).
i) Modificaciones de la microbiota fecal y deteccion de las cepas de L. salivarius y B. breve
Los recuentos celulares en el momento de inscripcion, tras 3 meses de tratamiento y 2 meses despues del final de la administracion se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
Lmea de base 3 meses tratamiento 2 meses tras la suspension
Pacientes con probioticos
Aerobios totales
7,7 + 1,0 7,9 + 0,9 8,2 + 0,7
Enterobacteriaceae
6,8 + 1,3 7,3 + 1,2 6,7 + 2,6
Staphylococci
4,0 + 1,6 2,8 + 1,5 *◊ 2,3 + 1,6 *◊
Lactobacilli
5,4 + 2,0 5,1 + 1,8 5,5 + 0,4
Bifidobacteria
9,1 + 0,6 8,8 + 0,5 8,4 + 0,6
Pacientes con placebo
Aerobios totales
7,1 + 1,5 7,5 + 1,2 7,7 + 1,3
Enterobacteriaceae
5,8 + 1,7 6,7 + 1,6 6,2 + 1,5
Staphylococci
4,1 + 0,9 3,9 + 1,1 4,0 + 1,1
Lactobacilli
5,4 + 1,9 5,2 + 1,6 5,4 + 1,8
Bifidobacteria
8,5 + 1,1 8,6 + 0,6 8,6 + 0,9
* Disminucion de la significacion (P<0,05) en comparacion con la lmea de base ◊ diferencia significativa (P<0,05) en comparacion con el placebo en el mismo tiempo.
En el grupo control (placebo), no se encontraron alteraciones significativas en la flora fecal. En el grupo tratado con probioticos, tras 3 meses se detecto una disminucion significativa en staphylococci. Este descubrimiento tambien era significativo en comparacion con el grupo control tras 3 meses de tratamiento. La disminucion permanecio estadfsticamente significativa incluso dos meses despues de la suspension de los probioticos. No se encontraron modificaciones significativas en ningun otro grupo microbiano analizado.
Los descubrimientos relacionados con las cepas probioticas en las muestras fecales de los sujetos inscritos en el estudio se muestran en la Tabla 9. Todas las colonias con una morfologfa que correspondfa a las de las cepas consideradas, identificadas mediante analisis de PCR y PFGE, eran las correspondientes a las de las cepas previamente identificadas como L. salivarius LS01 o B. breve BR03.
La cepa de L. salivarius LS01 se encontro en todos los sujetos tras 3 meses de tratamiento, en una cantidad igual a 102-105 UFC/g. La cepa de B. breve BR03 se detecto en el 90 % de los sujetos, tras tres meses de tratamiento, en una cantidad igual a 106-108 UFC/g.
En algunos pacientes, ambas cepas tambien se aislaron 2 meses despues de la suspension del tratamiento pero en una cantidad menor comparada a las obtenidas inmediatamente tras el final de la administracion.
El solicitante fue capaz de verificar que las composiciones de la presente invencion, en particular las de dicho primer estudio clmico (Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604) y dicho segundo estudio clmico (Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 y Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 2l980), administradas durante 3 meses a sujetos adultos afectados por dermatitis atopica grave o moderada, demostraron ser capaces de mejorar los parametros clmicos e inmunologicos de los mismos. En particular, al final del tratamiento probiotico, se observo lo siguiente:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
1) una mejora significativa en el mdice SCORAD y DLQI;
2) una reduccion en la translocacion microbiana (niveles de LPS en plasma) y en la activacion de linfocitos T CD8+;
3) un aumento en el porcentaje tanto de los linfocitos T reguladores (Treg) totales, como de los mismos que expresan los marcadores TLR2 y TLR4;
4) una mejora en las relaciones Th1/Th2 y Th17/Treg.
De manera ventajosa, se demostro que las cepas probioticas usadas eran capaces de colonizar el aparato gastrointestinal de los pacientes y de reducir la carga de estafilococos en las heces.
De manera ventajosa, el efecto clmico de la administracion de los probioticos, en terminos de mejora de los smtomas de la patologfa y calidad de vida, se manifesto por sf mismo tras 3 meses de tratamiento. Dicho efecto mostro continuar incluso 2 meses despues de la suspension del tratamiento.
De manera ventajosa, tambien se observo la persistencia de las 3 cepas bacterianas probioticas (Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 y Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980) en el aparato gastrointestinal tras la suspension del tratamiento, sugiriendo la capacidad de las combinaciones bacterianas espedficas para colonizar el intestino.
Las alteraciones en la permeabilidad intestinal desempenan un papel clave en la patogenesis de la dermatitis atopica y en otras enfermedades caracterizadas por un componente inflamatorio. Los resultados obtenidos del estudio clmico demuestran un aspecto importante, que se representa por la presencia de una correlacion negativa entre los niveles de LPS en plasma y la atopfa. Espedficamente, la presencia de una mejora significativa en la translocacion microbiana tanto durante como despues del tratamiento probiotico demostro el efecto inmunomodulador que poseen las 3 cepas bacterianas, capaces de mejorar la barrera intestinal actuando tanto directa como indirectamente.
Los estudios en infecciones por VIH han mostrado una asociacion entre la translocacion microbiana y la activacion inmunologica con una perdida de celulas-T excesiva. La evaluacion del porcentaje de linfocitos T cD8+ activados, considerados un factor pronostico importante en las infecciones por VIH, es uno de los marcadores mas ampliamente aceptados de activacion mediada por LPS del sistema inmunitario. Como se esperaba, en los pacientes afectados por dermatitis atopica inscritos en el presente estudio, se observo una reduccion en los valores de LPS en plasma junto con un descenso en las celulas T CD8+ activadas. Estos datos demuestran que las cepas bacterianas ensayadas tienen una fuerte actividad inmunomoduladora como consecuencia de su capacidad para aumentar la barrera intestinal. En el grupo placebo no se observo esta correlacion.
Se identificaron cuatro subpoblaciones diferentes de linfocitos auxiliares T CD4+ en base a su capacidad para secretar citoquinas: Th1, principales productores de IFN-y e IL-2, que estan implicados en las respuestas inmunitarias mediadas por celulas; Th2, que secretan IL-4, que son responsables de la activacion de la respuesta humoral; Th17, que secretan IL-17, IL-21 e IL-22, que estan implicados en las respuestas inmunitarios dirigidas contra patogenos extracelulares y en enfermedades autoinmunes; celulas T reguladoras con una funcion inmunoreguladora que controlan la hiperactivacion de las respuestas inmunitarias.
Se ha informado de un descenso en las celulas Treg en pacientes con dermatitis atopica y asma, y su numero se correlaciona inversamente con la secrecion de IgE, eosinofilia, y los niveles de IFN-y.
La ingesta de las cepas probioticas indujo un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos Treg totales y un aumento significativo en los linfocitos Treg que expresan los receptores TLR-2 y TLR-4 tras el tratamiento. Estas subpoblaciones celulares realizan una actividad inmunosupresora como su funcion principal.
La colonizacion de S. aureus es una cuestion crucial para la progresion de la dermatitis atopica, al igual que es la correlacion positiva entre la gravedad de la enfermedad y la colonizacion por S. aureus. Los efectos beneficiosos de los probioticos pueden deberse a la recuperacion mediada por las celulas Treg de la tolerancia inmunologica hacia
S. aureus y bacterias Gram negativas. Ademas, se encontro una correlacion negativa entre el mdice SCORAD y las celulas Treg, sugiriendo un papel positivo de las ultimas en la evolucion de la dermatitis atopica.
El subtipo Th2 desempena un papel cntico en la patogenesis de las reacciones alergicas y es responsable de la fase aguda de la dermatitis atopica, mientras que la subpoblacion Th1 tiene una funcion protectora que se asocia con la fase cronica de la enfermedad. En los pacientes afectados por dermatitis atopica, las celulas Th17 estan aumentadas en las lesiones agudas de la piel pero no en las lesiones cronicas y se correlacionan positivamente con la gravedad de la enfermedad. Los datos obtenidos en este estudio han mostrado que esta nueva combinacion de probioticos aumenta la funcionalidad de las celulas Th1 en detrimento de las subpoblaciones de Th2 y Th17, por lo
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tanto aumentando las relaciones Th1/Th2 y Th17/Treg.
Los subtipos Th2 y Th17 se correlacionan positivamente con los niveles de LPS en plasma, sugiriendo una fuerte interaccion entre la translocacion microbiana y las modificaciones del sistema inmunitario. Este descubrimiento se confirma adicionalmente por la correlacion positiva entre Th17 y CD8+ activados. Ademas se ha demostrado ampliamente el papel realizado por la flora intestinal microbiana en el desarrollo de la tolerancia inmunologica y en la patogenesis de las enfermedades alergicas. La alteracion en la microflora intestinal desempena un papel en el comienzo de la dermatitis atopica y en el empeoramiento de los smtomas en la piel. Los mismos autores, cuando analizaron la composicion de la microbiota fecal de los ninos jadeantes y no jadeantes sensibilizados, observaron que las lactobacterias y las bifidobacterias eran similares en ambos grupos.
En el presente estudio se observo una diferencia significativa en la composicion microbiana de los dos grupos analizados, con respecto a Staphylococci. Por lo tanto, es presumible que dicho genero pueda tener un papel crucial tanto a nivel de la piel como en los intestinos de los pacientes afectados por dermatitis atopica y que la administracion de la presente combinacion probiotica pueda requilibrarlo.
El presente estudio clmico ha mostrado que las cepas bacterianas de la presente invencion se toleran bien, y son capaces de colonizar el aparato intestinal y de inducir efectos clmicos beneficiosos en los sujetos afectados por dermatitis atopica a traves de la modulacion de algunas de las alteraciones inmunopatologicas mas importantes tfpicas de esta enfermedad inflamatoria de la piel.
La materia objeto de la presente invencion es el uso de las cepas bacterianas ensayadas anteriormente y una terapia adicional que apoye al tratamiento de la dermatitis atopica en sujetos adultos.
En el presente documento se describe
1. Una composicion que comprende al menos un cultivo de bacterias probioticas seleccionadas del grupo que comprende los siguientes cultivos bacterianos depositados en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, (DSMZ):
- Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, depositada el 23.07.2009;
- Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604, depositada el 20.07.2004;
- Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, depositada el 14.11.2008;
- Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, depositada el 13.09.2006;
- Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605, depositada el 20.07.2004; y
- Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717, depositada el 06.08.2008,
para su uso en el tratamiento de patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario.
2. La composicion para su uso de acuerdo con la realizacion 1, en el tratamiento preventivo y/o curativo de patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario seleccionadas del grupo que comprende alergias, atopfa, rinitis alergica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atopica, eczema, asma o inmunodeficiencias.
3. La composicion para su uso de acuerdo con las realizaciones 1 o 2, en el tratamiento preventivo y/o curativo de dermatitis atopica.
4. La composicion para su uso de acuerdo con una de las realizaciones 1-3, en la que dicha composicion comprende al menos un cultivo de bacterias prebioticas seleccionadas del grupo que comprende Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 y Lactobacillus pentosus (LPS 01) DSM 21980.
5. La composicion para su uso de acuerdo con la realizacion 4, en la que dicha composicion consiste en Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 y L. pentosus (LPS01) DSM 21980.
6. La composicion para su uso de acuerdo con la realizacion 4, en la que dicha composicion consiste en Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 y Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604. 7
7. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-6, en la que dichos cultivos bacterianos estan presentes en dichas composiciones en forma de bacterias vivas, bacterias muertas o componentes celulares, extractos celulares o sus lisados.
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8. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-7, en la que dicha composicion esta en forma solida para administracion oral.
9. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-8, en la que dichos cultivos de bacterias probioticas estan presentes a una concentracion que comprende de 1x107 a 1x1011 UFC/g de composicion, preferiblemente de 1x108 a 1x1010 UFC/g de composicion.
10. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-9, en la que dicha composicion comprende adicionalmente fibras dieteticas con actividad prebiotica seleccionadas de entre fructooligosacaridos (FOS), inulina y goma guar parcialmente hidrolizada (PHGG).
11. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-10, en la que dicha composicion es una composicion farmaceutica, dietetica, nutricional o nutraceutica.
12. Uso de al menos un cultivo de bacterias probioticas seleccionadas del grupo que comprende los siguientes cultivos de bacterias depositadas en la Deutsche Sammlung und Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, (DSMZ):
- Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, depositada el 23.07.2009;
- Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604, depositada el 20.07.2004;
- Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, depositada el 14.11.2008;
- Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, depositada el 13.09.2006;
- Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605, depositada el 20.07.2004; y
- Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717, depositada el 06.08.2008,
para su uso en el tratamiento de patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario.
13. El uso de acuerdo con la realizacion 12, en el que dicha composicion es para el tratamiento preventivo y/o curativo de patologfas asociadas con alteraciones del sistema inmunitario seleccionadas del grupo que comprende alergias, atopfa, rinitis alergica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atopica, eczema, asma o inmunodeficiencia.
14. El uso de acuerdo con la realizacion 13, en el que dicha composicion es para el tratamiento preventivo y/o curativo de dermatitis atopica.
15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 12-14, en el que dicha composicion es de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 4-11.

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende un cultivo de bacterias probioticas Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, depositada el 23.07.2009 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, para su uso en el tratamiento preventivo y/o curativo de patologfas seleccionadas del grupo que consiste en alergias, atopfa, rinitis alergica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atopica, eczema, asma o inmunodeficiencias.
  2. 2. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende un cultivo de bacterias probioticas, en la que el cultivo de bacterias probioticas es Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, depositada el 23.07.2009 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
  3. 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el tratamiento preventivo y/o curativo de la dermatitis atopica y/o eczema.
  4. 4. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el tratamiento preventivo y/o curativo de la dermatitis atopica.
  5. 5. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dichos cultivos bacterianos estan presentes en dichas composiciones en forma de bacterias vivas, bacterias muertas o componentes celulares, extractos celulares o lisados de las mismas.
  6. 6. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dicha composicion esta en forma solida para administracion oral.
  7. 7. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho cultivo de bacterias probioticas esta presente a una concentracion que comprende de 1x107 a 1x1011 UFC/g de composicion, preferentemente de 1x108 a 1x1010 UFC/g de composicion.
  8. 8. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha composicion comprende adicionalmente fibras dieteticas con actividad prebiotica seleccionadas de entre fructooligosacaridos (FOS), inulina y goma guar parcialmente hidrolizada (PHGG).
  9. 9. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que dicha composicion es una composicion farmaceutica, dietetica, nutricional o nutraceutica.
  10. 10. Un cultivo de bacterias probioticas de Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, depositada el 23.07.2009 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, para su uso en el tratamiento preventivo y/o curativo de patologfas seleccionadas del grupo que consiste en alergias, atopfa, rinitis alergica, hipersensibilidad alimentaria, dermatitis atopica, eczema, asma o inmunodeficiencias.
  11. 11. El cultivo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que dicho cultivo es para el uso en el tratamiento preventivo y/o curativo de la dermatitis atopica y/o eczema.
  12. 12. El cultivo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que dicho cultivo es para el uso el tratamiento preventivo y/o curativo de la dermatitis atopica.
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