ES2604255T3 - Anticuerpos contra IL-25 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une a IL-25 y que comprende un dominio VH de anticuerpo o una parte sustancial del mismo con una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 5; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 6; y una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 7, y que comprende ademas un dominio VL o una parte sustancial del mismo con una CDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 8; una CDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 10.

Description

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las otras citocinas de tipo 2 contribuyen al genotipo de asma también se evaluó la respuesta de il4lil5lil9lil13la rmIL-25 administrada por vía intranasal. Incluso en ausencia de todas las citocinas de tipo 2 clásicas el tratamiento con IL-25 potenció AHR después de la provocación por metacolina (Fig. 3C). Estos datos apoyan un papel para IL25 en el agravamiento de AHR mediante una ruta independiente de citocinas de tipo 2.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos fueron como se ha descrito anteriormente para los ejemplos 2 y 3, con la adición de.

Ratones

Los ratones transgénicos il4lil5lil9lil13l(P. G. Fallon et al., 2002. Immunity 17, 7) y ratones il13/(G. J. McKenzie et al., 1998. Curr Biol. 8, 339) en un fondo de BALB/c fueron como se ha descrito. Los ratones IL25/en un fondo de C57BL/6 x 129 F2 fueron como se ha descrito (P. G. Fallon et al. 2006. J. Exp. Med. 203, 1105).

Administración de IL25 intranasal

Se administraron a los ratones 1,8 µg de rIL-25 (R&D Systems) o 1,8 µg de rIL-13 (Peprotech) en 40 µl PBS por ratón por vía intranasal el día 0. Los animales de control recibieron solamente PBS.

Ejemplo 5: Clonación de dominios variables de 2C3

Se aisló ARN de tres subclones de 2c3 y se preparó ADNc por una reacción de transcripción inversa.

El ADNc de cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) se amplificó por PCR usando un cebador de región VH 5’ conservado, MHV7 (SEQ ID NO: 11) en combinación con un cebador de región constante IgG1 MHCG1 (SEQ ID NO: 12).

De forma similar, se amplificó cadena ligera de inmunoglobulina (IgK) usando un cebador de región IgK 5’ conservado MKV9 (SEQ ID NO: 13) en combinación con el cebador de región constante kappa MKC (SEQ ID NO: 14).

La polimerasa termoestable Phusion (NEB F-531L) se usó durante el experimento para reacciones de PCR.

Los productos de amplificación de 2c3 de VH7 + MHCG1-iniciaron las reacciones de PCR a partir de tres ADNc independientes, se ligaron directamente en el vector pCRII®Blunt-TOPO® usando el kit de clonación TOPO-blunt® (Cat 45-0245), como lo hicieron los productos de amplificación de la reacción de amplificación de cadena ligera. Se clonaron bacterias E. coli TOP10 transformadas con las construcciones de vector pCRII-blunt ligado en placas de agar de LB-ampicilina-XGal, seleccionando colonias blancas en una rejilla de agar y en la mezcla de exploración de PCR. Los insertos de plásmido clonado se amplificaron por PCR. Los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en gel y se identificaron los productos predichos. Se procesaron cultivos de una noche (5 ml) de cada clon, produciendo el producto de amplificación por PCR del tamaño correcto, usando el Protocolo de Kit de Miniprep de Centrifugación QIAprep (cat 27106), para producir minipreps de plásmidos de ADN.

Los plásmidos se secuenciaron usando el Kit de Reacción Listo para Secuenciación en Ciclo BigDye® Terminator v3.0 (ABI cat. 4390242). Cada plásmido seleccionado se secuenció en ambas direcciones usando cebadores directo e inverso M13 sometidos a ciclos en una máquina de PCR GeneAmp9600. El análisis de secuencia electroforético se realizó en un secuenciador capilar ABI.

El ciclo completo de RT-PCR, clonación y análisis de secuencia de ADN se repitió para obtener tres conjuntos completamente independientes de información de secuencia para cada cadena de inmunoglobulina.

La secuencia de nucleótidos deducida completa de los genes de VH y Vkappa se muestran como SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. Estas secuencias incluyen las secuencias líderes al comienzo de cada segmento génico variable que codifica una secuencia señal que se usa para transportar las cadenas de anticuerpo de nueva síntesis al retículo endoplásmico; y no están presentes en las cadenas pesadas y ligeras finales.

Referencias

1.

P. G. Fallon et al., Immunity 17, 7 (Jul, 2002).

2.

G. Grunig et al., Science 282, 2261 (1998).

3.

M. Wills-Karp et al., Science 282, 2258 (1998).

4.

M. M. Fort et al., Immunity 15, 985 (Dec, 2001).

5.

M. R. Kim et al., Blood 100, 2330 (Oct 1, 2002).

6.

G. Pan et al., J Immunol 167, 6559 (Dic 1, 2001).

7.

S. D. Hurst et al., J Immunol 169, 443 (Jul 1, 2002).

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Claims (1)

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