RS55401B1 - Antitela protiv il-25 - Google Patents

Description

ANTITELA PROTIV IL-25

Opis

Oblast pronalaska

[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na antitela, usmerena na interleukin 25 (IL-25). Poželjna oielotvorena ovog pronalaska koriste VH i/ili VL domene antitela antitela 2C3. U drugom aspektu, pronalazak daje jedan ili više CDR od ovde prikazanih VH i VL domena, umetnute u ljudske VH i VL okvirne regije, respektivno.

Pozadina pronalaska

[0002]Astma je uobičajen hronični upalni poremećaj disajnih puteva. Broj obolelih dramatično se povećao tokom posljednjih nekoliko decenija, a Svetska zdravstvena organizacija procenjuje da otprilike 300 milijuna ljudi u svetu boluje od astme. Alergijsku astmu karakteriše nekontrolisana disajna hiperreaktivnost (AHR) indukovana različitim provokativnim stimulansima i povezana je sa tipom 2 upalnih infiltracija u pluća.

[0003]Tip-2 citokini imaju značajnu ulogu u posredovanju zaštitnog imuniteta na infekcije parazitske crevne gliste, reguliŠući efektorske funkcije, kao što je rast B ćelija i lučenje IgE, indukovanje hiperplazije peharastih ćelija i povezanu proizvodnju sluzi, eozinofiliju, mastocitozu i fibrozu (1). Središnje uloge koje ovi citokini imaju u regulaciji tih efektorskih funkcijama su ih učinili ključnim terapeutskim ciljevima kod astme. Zaista, mišji modeli u kojima su ti citokini eksprimirani pokazuju značajne karakteristike astme. Iznenađujuće tada, napori za ublažavanje eksperimentalne astme blokiraju specifični tip-2 citokina pokazali su se uspešnim, sa izuzetkom inhibiranja IL-13.

[0004]Inhibicija IL-13 smanjuje i AHR i upalu disajnih puteva, iako mehanizam ostaje nejasan (2, 3). Međutim, s obzirom na složenu patofiziologiju i slabo poznatu etiologiju astme, neizvesno je hoće li se ciljanje pojedinačnih puteva na kraju dokazati kao terapeutski uspešno.

[0005]Skorije, za prekomerno eksprimiranje IL-25/IL-17E, člana strukturno srodne IL-17 porodice citokinima (8), pokazalo se da indukuje tipa-2 odgovorein vivo(4-6) i da povećava reaktivnost na agoniste disajnih puteva (7). 1125"miševi nisu uspeli da izbace parazitske crevne gliste; ključni pokazatelj neuspešnog tip-2 odgovora (9,10).

[0006]Osnovna struktura antitela je dobro poznata u struci. Antitelo koje se javlja u prirodi obično ima četiri polipeptidna lanaca: dva identična teška lanca i dva identična laka lanca povezana disulfidnim vezama. Teški i laki lanci imaju po konstantnu regiju i varijabilnu regiju, (ili domen). Varijabilne regije su u prvom redu odgovorne za vezivanje antigena. Unutar svake varijabilne regije tri podregije, poznate kao komplementarno-determinišuće regije (CDR), u kontaktu su sa antigenom. CDR svakog varijabilnog domene su numerisane, od N-terminalne do C-terminalne, kao CDR1, CDR2 i CDR3. Između i N- i C-terminalne CRD su četiri takozvane okvirne regije, koje imaju malo ili nimalo kontakta sa antigenom. Više detalja u vezi strukturama antitela prikazano je u mnogim od niže navedenih dokumenata.

[0007]Angkawekwinai et al., Journal of Allergv and Clinical Immunologv 119(1):S134 (2007) ukazuju da IL-25 može igrati važnu ulogu u pokretanju alergijske reakcije i može biti važan u patogenezi alergijske bolesti kao stoje astma.

[0008]US 2003/008815 se odnosi na identifikaciju i izolaciju DNK i polipeptidnih sekvenci koje imaju sličnost sekvence sa IL-17 i IL-17 receptorskim proteinom i njihovu upotrebu u stimulisanju ili inhibiciji imunološkog odgovora.

Izlaganje pronalaska

[0009]Pronalazači su proizveli antitela protiv IL-25, i identifikovali molekule antitela koji se vezuju sa visokim afinitetom i specifičnošću za IL-25. S obzirom da mišji i čovečiji IL-25 dele 80% identičnosti sekvence, verovalo se da bi bilo malo verovatno da će biti moguće generisati korisna anti-IL-25 antitela konvencionalnom imunizacijom miševa ili pacova, s obzirom da bi stupanj sličnosti smanjio broj imunogenih epitopa. Dalje, receptor-ligand interfejs je najverovatniji da pokaže najveći stupanj konzervacije i time isključuje stvaranje antitela koja mogu blokirati interakciju [1,-25 sa njegovim receptorom. Za savladavanje tih problema, pronalazači su imunizovali miševe koji su stvoreni tako da im nedostaje IL-25 (IL-25-/-) eksprimiranje sa uverenjem da će ovaj pristup povećati verovatnoću razvoja antitela usmerenih protiv IL-25/IL-25R interfejsa.

[0010]Ovaj pristup je bio vrlo uspešan u stvaranju antitela protiv IL-25, verovatno zbog toga Što IL-25 sam jača humoralni imuni odgovor. Međutim, čak i koristeći ovaj pristup identifikovana su samo dva blokirajuća antitela od sedamdeset posmatranih, a samo jedno od njih je moglo da se povrati.

[0011]Nakon što je savladan problem sličnosti između mišjeg i humanog IL-25 za koji se verovalo da bi sprečili stvaranje efikasnih blokirajućih antitela putem uobičajenih sredstava, smatra se da ova sličnost sekvenci može omogućiti generisanje antitela koje je jednako delotvorno u blokiranju mišjeg i ljudskog IL-25 u interakciji sa njihovim receptorima. Ovaj pronalazak sada pokazuje da je to zaista tako.

[0012]Iako postoje i druga antitela za IL-25, za ovaj pronalazak se venije da prvi demonstrira da su takva antitela u stanju da blokiraju IL-25 bioaktivnost. Konkretno, ovaj pronalazak daje test koji je sproveden na mišjim modelima astme koji pokazuju da antitelo iz ovog pronalaska ima korisna i neočekivana svojstva, posebno njegovu sposobnost da spreči ili smanji preosetljivost disajnih putevain vivo,ključni simptom astme.

[0013]Iako je za primenu rastvorljivog IL-25R-Fc fuzijskog proteina takođe objavljeno da redukuje tip-2 upala disajnih puteva, efekti su manje dramatični u odnosu na one koji su ovde prikazani i kritični AHR nije procenjen (11). Sada pokazujemo da IL-25 ima kritičnu ulogu u upali disajnih puteva i AHR, delujući u početku da poboljšala upalu posredovanu tipa-2 citokinom, ali koji takođe ima važnu ulogu u indukciji AHR nezavisno od klasičnih tip-2 citokina. Identifikacija AHR zavisnog od IL-25 pruža mogućnost identifikovanja novih terapeutskih ciljeva koji se nalaze nizvodno od IL-25. Trenutno ne znamo da li IL-25 deiuje direktno na glatke mišiće disajnih puteva kako bi inđukovao bronhokonstrikciju ili su njegovi efekti posredovani putem indukcije poznatih bronhokonstriktora kao što su leukotrieni. Međutim, dvofazna aktivnost IL-25 predstavlja odličnu terapeutsku metu za suzbijanje upale disajnih puteva i za inhibiciju hiperreaktivnosti disajnih puteva in vivo.

[0014]U skladu s tim, ovaj pronalazak se odnosi na nova antitela, i opštije cilja vezujuće članove koji sadrže CDR sekvence antitela, kao što i koristi ciljane vezujuće članove u lečenju stanja kao što je astma.

[0015]Antitelo koje vezuje IL-25 i koje sadrži VH domen antitela ili njegov bitan deo sastoji se od VH CDR1 koja ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:5; VH CDR2 koja ima aminokiselinsku sekvencu kako što je dato u SEQ ID NO:6; i VH CDR3 koja ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:7, i koje dalje obuhvata VL domen ili njegov bitan dao koji sadrži CDR1 koja ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:8, CDR2 koja ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:9; i CDR3 koja ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO: 10.

[0016]Ove CDR regije mogu biti u VL domenu sa sa humanim okvirnim regijama, ili mogu biti VL domenu sa SEQ ID NO:4.

[0017]Prema tome, u jednom aspektu, ovaj pronalazak daje antitelo koje vezuje IL-25 i koje sadrži 2C3 VH domen u (SEQ ID NO:2) i/ili 2C3 VL domen (SEQ ID NO:4).

[0018]pronalazak takođe daje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitela iz ovog pronalaska, gde vektor obuhvata nukleinsku kiselinu i postupke eksprimiranja nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu, za proizvodnju antitela prema pronalasku.

[0019]Pronalazak dalje daje upotrebu antitela prema pronalasku, na primer u obliku farmaceutskog sastava, za lečenje bolesti, uključujući astmu.

[0020]Ovi i drugi aspekti ovog pronalaska opisani su detaljnije u nastavku i sa referencama na popratne primere.

Opis slika

[00211

Slika 1 prikazuje neutralizaciju IL-25 pre senzibilizacije i za vreme izazivanja astme. (A) Osetljivost na metakolin OVA-senzibilizovanih miševa određena je jedan dan nakon poslednjeg izazova aerosolizovanim antigenom. Podaci su kombinovani sa 2 eksperimenta i predstavljaju sredinu ± SEM od grupa sa 14-18 miševa. (<*>p<0,05 u poređenju sa kontrolnim antitelom jednakog izotipa,<**>p<0,01 u poređenju sa kontrolnim antitelom jednakog izotipa) (B) Delovi pluća su obojeni sa giemsa bojom i ocenjeni za perivaskulainu infiltraciju, n=8 po grupi. (C) Sluzni sadržaj određen je per-jodna kiselina Šif (PAS) bojanjem sekcija pluća, n--8 po grupi. (D) Antigen specifični serum IgE je meren pomoću ELISA, OD čitanja su pretvorena u arbitrarne jedinicama u poređenju sa standardnim serumom n=8 po grupi. (E) Udeo eozinofila u BAL-u je određen brojanjem diferencijalnih ćelija od citospina obojenog sa giemsa bojom, n=6 po grupi. (F) Antigenom indukovana proizvodnja citokina iz restimulisanih čvornih ćelija medijastinalne limfe. Nivo proteina određen je pomoću ELISA, n=6 po grupi. Simboli predstavljaju pojedinačne životinje i sredina je predstavljena pravougaonicima. Podaci su reprezentativni za najmanje 2 nezavisna eksperimenta. Sens=antitela data pre senzibilizacije, aero=antitela data 4 sata pre svakog izlaganja aerosolu.

Slika 2 prikazuje neutralizaciju IL-25 samo tokom izazivanja astme. (A) Osetljivost na metakolin OVA-senzibilisanih miševa određena je jedan dan nakon poslednjeg izazova aerosolizovanim antigenom. Podaci su kombinovani sa 2 eksperimenta i predstavljaju sredinu + SEM od grupa sa 14-18 miševa. (<*>p<0,05 u poređenju sa kontrolnim antitelom jednakog izotipa,<**>p<0,01 u poređenju sa kontrolnim antitelom jednakog izotipa) (B) Delovi pluća su obojeni sa giemsa bojom i ocenjeni za perivaskularnu infiltraciju, n=8 po grupi. (C) Sluzni sadržaj određen je per-jodna kiselina Šif (PAS) bojanjem sekcija pluća, n=8 po grupi. (D) Udeo eozinofila u BAL-u je određen brojanjem diferencijalnih ćelija od citospina obojenog sa giemsa bojom, n=6 po grupi. (E) Antigen specifični serum IgE je meren pomoću ELISA, OD čitanja su pretvorena u arbitrarne jedinicama u poređenju sa standardnim serumom n=8 po grupi. (F) Antigenom indukovana proizvodnja citokina iz restimulisanih čvornih ćelija medijastinalne limfe. Nivo proteina određen je pomoću ELISA, n=6 po grupi. Simboli predstavljaju pojedinačne životinje i sredina je predstavljena pravougaonicima. Podaci su reprezentativni za najmanje 2 nezavisna eksperimenta. Sens=antitela data pre senzibilizacije, aero=antitela data 4 sata pre svakog izlaganja aerosolu.

Slika 3 prikazuje primenu rmlL-25 na naivnim miševima. Divlji tip (A), i'/J3" (B) ili il-4"US'H9 " U13 "(C) miševima je dato 1,8 mg rIL-25 ili PBS intranazalno. Osetljivost na metakolin je određena 16 sati nakon izazivanjea.<*>p<0,05 u poređenju sa kontrolnim antitelom jednakog izotipa,<**>p<0,01 u poređenju sa kontrolnim antitelom jednakog izotipa, n=4-8 po grupi. Podaci su reprezentativni za najmanje 2 nezavisna eksperimenta.

Sekvence:

[00221Antitela ovog pronalaska su dalje opisana u odnosu na naredne identifikacione brojeve sekvenci:

SEQ ID NO. 1 2C3 VH kodirajuća nukleotidna sekvenca

SEQ ID NO. 2 2C3 VH aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO. 3 2C3 VL kodirajuća nukleotidna sekvenca

SEQ ID NO. 4 2C3 VL aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO. 5 2C3 VH CDR1 aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO. 6 2C3 VH CDR2 aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO. 7 2C3 VH CDR3 aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO. 8 2C3 VL CDR1 aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO. 9 2C3 VL CDR2 aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO. 10 2C3 VL CDR3 aminokiselinska sekvenca

[0023]Dalje sekvence su date u priloženom listingu sekvenci.

Detaljan opis pronalaska

Član za vezivanje mete

[0024]Ovde se opisuje član para molekula koji imaju specifičnost vezivanja jedan za drugog. Članovi specifičnog para za vezivanje mogu se, naravno, dobiti iz prirode iii potpuno ili delimično sintetički proizvesti. Jedan član para molekula ima predeo na svoj površini, ili Šupljinu, koja se specifično vezuje i stoga je komplementarna sa određenom prostornom i polarnom organizacijom drugog člana para molekula. Tako članovi para imaju svojstvo specifičnog vezanja jedni za drugog. Primeri vrsta specifičnih parova za vezivanje su antigen-antitelo, biotin-avidin, hormon-hormon receptora, receptor-ligand, enzims-supstrat.

[0025]Ova prijava se odnosi na reakcije tipa antigen-antitelo. Prema tome, antitela iz pronalaska će sadržati barem deo molekula antitela, poželjnije barem deo domena za vezivanje antitela takvog molekula.

[0026]Uglavnom, varijabilna regija teškog lanca (VH domen) antitela igra značajnu ulogu u vezivanju antitela na antigen. Za CDR3 regiju VH domena otkriveno je da je raznovrsnija od CDR1 i CDR2 regija, i stoga u većini antitela daje specifičnost za ciljano antitelo. Stoga su antitela pronalaska na taj način zasnovana oko VH CDR3 područja 2C3 antitela. Antitela prema pronalasku poželjnije obuhvataju sve tri CDR od VH regija 2C3 antitela.

[0027] Struktura antitela koja obuhvata CDR pronalaska će uglavnom biti sekvenca teškog ili lakog lanca molekula antitela ili njegov bitan deo u kom se CDR nalazi na položajima koji odgovaraju CDR kod prirodnih VH i VL varijabilnih domena antitela kodiranih od strane preuređenih imunoglobulinskih gena. Strukture i lokacije varijabilnog domena imunoglobulina mogu se odrediti prema Kabat, E.A. ei al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987 i njihovim ažuriranjima. Niz naučnih i komercijalnih on-line resursa je na raspolaganju za upite u ovoj bazi podataka. Na primer, pogledati Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibodv Sequcnce Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133 i pripadajuće on-line resurse, koji su trenutno na web adresi http://vww.bioinf.org.uk</>abs/simkab.html.

[0028]Uglavnom, član za vezivanje meta sadrži VH domen u paru sa VL domenom kako bi dao domen antitela za vezivanje antigena, ali kao što je objašnjeno u nastavku, VH domen sam može da se koristiti za vezivanje antigena. U jednom poželjnom otelotvorenju, 2C3 VH domenu (SEQ ID NO. 2) je u paru sa 2C3 VL domenom (SEQ ID NO. 4), tako da se mesto za vezivanje antigena na antitelu formira tako da obuhvata 2C3 VL i VH domene. U drugim otelotvorenjima, 2C3 VH je uparen sa VL domenom drugačijim od 2C3 VL.

[0029]Promiskuitet lakog lanca je dobro uspostavljene u struci, kao što je objašnjeno u nastavku.

[0030]Član za vezivanje mete može vezati IL-25 sa afinitetom značajno sličnim onom od 2C3, npr. ±10%. Član za vezivanje mete će uglavnom biti specifičan za IL-25. Stoga član za vezivanje mete neće pokazati značajno vezivanje za druge molekule osim svog partnera za specifično vezivanje. Na primer, otkriveno je da je 2C3 antitela ne reaguju unakrsno sa IL-4, IL-5 i IL-13 i stoga je izbegavanje takve unakrsne reaktivnosti sa ostalim citokinima uključenih u astmu i sliče procese poželjno svojstvo antitela pronalaska.

[0031] Tipično, specifičnost može biti određena pomoću testa vezivanja, kao što je ELISA koristeći panel antigena. Antitelo u skladu sa ovim pronalaskom može prepoznati IL-25, a ne druge članove IL-17 porodice, posebno bilo koji od IL-17A, IL-17B i IL-17C; poželjnije sva tri od IL-17A, IL-17B i 1L-17C. Vezivanje antitela prema ovom pronalasku sa IL-25 može biti ukinuto nadmetanjem sa rekombinantnim IL-25.

[0032]Afinitet vezanja i potentnost neutralizacije različitih članova za vezivanje meta mogu se poredili u odgovarajućim uslovima.

Molekul antitela

[0033]Ovde se opisuje imunoglobulin, bilo prirodan ili delimčno ili u potpunosti sintetički proizveden. Pokazalo se da fragmenti celog antitela mogu obavljati funkciju za vezivanje antigena. Stoga referenca na antitelo takođe obuhvata bilo koji polipeptid ili protein koji sadrži fragment za vezivanje antitela.

[0034|Primeri fragmenata za vezivanje su (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VII, CL i CH1 domena; (li) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (Iii) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog antitela; (Iv) DAB fragment (Ward, E.S. et al.. Nature 341, 544-546 (1989)) koji se sastoji od VH domena; (V) izolovane CDR regije; (Vi) F(ab'h fragmenti, dvovalentni fragment koji sadrži dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančani Fv molekul (scFv), gde su VH domen i VL domen povezani za peptidnim veznikom koji omogućuje da se dva domena spoje kako bi formirani mesto za vezivanje antigena (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (Viii) bisferna jednilančani Fv dimeri (PCTVUS92/09.965) i (ix) „dijatela", viševalentni ili multispecifični fragmenti izgrađeni genskom fuzijom (WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993). Fv, scFv ili dijatelo molekuli mogu biti stabilizovani ugradnjom disulfidnih mostova koji povezuju VH i VL domene (Y. Reiter et ai, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Minitela koja sadrže scFv pridružen za CH3 domen takođe se mogu napraviti (S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).

[0035]Kada treba da se koristite bispecifična antitela, ona mogu biti uobičajena bispecifična antitela, koji se mogu proizvesti na različite načine (Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), npr. proizvedena hemijski ili od hibridnih hibridoma, iii mogu biti bilo koji od gore navedenih fragmenata bispecifičnih antitela. Dijatela i scFv se mogu izgraditi bez Fc regije, koristeći samo varijabilne domene, potencijalno smanjujući efekte anti-idiotipske reakcije.

[0036]Bispecifična dijatela, za razliku od bispecifičnih celih antitela, mogu takođe biti posebno korisna, jer se mogu lako izgraditi i eksprimirati uE. coli.Dijatela (i mnogi drugi polipeptidi kao što su fragmenti antitela) odgovarajućih veznih specifičnosti mogu se lako odabrati pomoću prikaza faga (WO94/13804) iz biblioteka. Ako se jedan krak dijatela drži konstantnim, na primer, sa specifičnošću usmerenom protiv IL-25, potom se biblioteka može napraviti gde drugi krak varira i odabrano je antitelo odgovarajuće specifičnosti. Bispecifična cela antitela mogu se proizvesti glave-u-rupe inženjeringom (J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996). Moguće je uzeti monoklonska i druga antitela i koristiti tehnike rekombinantne DNK tehnologijezaproizvodnju drugih antitela ili himerne molekule koje zadržavaju specifičnost izvornog antitela. Takve tehnike mogu uključivati uvođenje DNK koja kodira varijabilnu regiju imunoglobulina, ili komplementarno određujuće regije (CDR) antitela za konstantne regije ili konstantne regije plus okvirne regije, od različitih imunoglobulina. Pogledati, na primer, EP-A-184187, GB 2188638A, ili EP-A-239400.

[0037]Poželjno je da su CDR regije uetnute u ljudsku okvirnu regiju. Ljudska okvirna regija može se odabrati nizom postupaka, na primer poređenjem sekvenci mišje okvirne regije ili mišje V regije sa sekvencama poznatih ljudskih okvira ili V regija i odabirom Ijudsei okvirne regije koja ima najviše, ili jedan od najviših stupnjeva sličnosti ili identičnosti aminokiselina. Modifikacije okvirnih regija prirodnih ljudskih sekvenci mogu biti izrađene kako bi se dodatno optimizovala nastala CDR-umetnuta antitela.

[0038]Iako su poželjni molekuli antitela koje sadrže par VH i VL domena, takođe su opisani jednostruko vezujući domeni na bazi bilo VH ili VL sekvenci domena. Poznato je da jedinični domeni imunoglobulina, posebno VH domeni, mogu vezati ciljane antigene na specifičan način.

[0039]U slučaju bilo kog jednolančanog domena za vezivanje, li domeni mogu se koristiti kako bi se pregledali komplementarni domeni sposobni za formiranje dvo-domenskog člana za vezivanje mete koji može da vezuje IL-25, kao Što je dalje diskutovano u nastavku.

[0040]Molekuli antitela ovog pronalaska mogu dalje sadržati konstantne regije antitela ili njihove delove. Na primer, VL domena može biti vezan na svom C-terminaJnom kraju za konstantne domene lakog lanca uključujući ljudskekili CA lance, poželjno CX lanace. Slično tome, Član za vezivanje domena zasnovan na VH domenu može biti vezan na C-terminalnom kraju na ceo ili deo imunoglobulinskog teškog lanca izvedenog iz bilo kog izotipa antitela, npr. IgG, IgA, IgE i IgM i bilo koji od potklasa izotipova, posebno IgGl i IgG4. IgG4 je poželjan. Fc regije kao što su Anab i Anac kao što je opisano u VV099/58572 mogu se upotrebiti.

[0041]Stoga su uključeni derivati molekula koji sadrže domen za vezivanje mete, ili ekvivalent, fuzionisan za drugi polipeptid. Kloniranje i eksprimiranje himernih antitela su opisani u EP-A-0120694 i EP-A-0125023.

[0042]Okvirne regije molekula antitela pronalaska mogu takođe uključivati sekvence glikolizacije koje uključuju jedno ili više glikozilacijskih mesta. U zavisnosti od ćelije domaćina u kojoj se eksprimira član za vezivanje, obrasci glikozilađje mogu varirati. Stoga konstrukti nukleinskih kiselina koji kodiraju mesta glikozilacije mogu da se modifikuju kako bi se uklonila mesta ili alternativno takva mesta se mogu uvesti na protein. Na primer, N-glikozilacijska mesta u eukariotskom proteinu karakteriše aminokiselinski triplet Asn-X-Y, gde je X bilo koja aminokiselina osim Pro, i Y je Ser ili Thr. Odgovarajuće supstitucije, adicija ili brisanja u nukleotidnoj sekvenci koja kodira ovaj triplet rezultovaće u sprečavanju vezivanja karbohidratnih ostataka na Asn bočnom lancu. Menjanje jednog nukleotida, izabranog tako da je Asn zamijenjen drugom aminokiselinom, na primer, je dovoljno za inaktivaciju N-glikozilacije. Poznati postupci za inaktivaciju N-glikozilacijskih mesta u proteinima uključuju one opisane u U.S. Pat. No. 5,071,972 and EP 276,846.

Domen za vezivanje antigena

[0043]Ovo opisuje deo molekula antitela, koji obuhvata površinu koja se specifično vezuje za i komplementarna je delu ili ćelom antigenu. Kada je antigen veliki, antitelo se vezuje samo na određeni deo antigena koji se naziva epitop. Domen za vezivanje antigena se može dati putem jednog ili više varijabilnih domena antitela (npr. tzv. Fd fragment antitela koji se sastoji od VH domena). Poželjno, domen za vezivanje antigena sadrži barem jedan značajan deo jedne varijabilne regije lakog lanca (VL) antitela, i najmanje jedan značajan deo jedne varijabilne regije teškog lanca fVH) antitela.

[0044]Značajan deo varijabilnog domena imunoglobulina ima najmanje tri CDR regije, zajedno sa interventnim okvirnim regijama. Poželjno, deo će takođe da uključuje najmanje oko 50% jedne ili obe od prve i četvrte okvirne regije, gde je 50% C-terminalnih 50% prve okvirne regije i N-terminalnih 50% četvrte okvirne regija. Dodatni ostaci na N-terminalnom ili C-terminalnom kraju značajanog dela varijabilnog domena mogu biti one koji nisu normalno povezani sa prirodnim regijama varijabilnog domena. Na primer, konstrukcija članova za vezivanja meta ovog pronalaska napravljena tehnikama rekombinantne DNK može dovesti do uvođenja N- ili C-terminalnih ostataka kodiranih pomoću veznika uvedenih da se olakša kloniranje ili drugi koraci manipulacije. Drugi koraci manipulacije uključuju uvođenje veznika za pridruživanje varijabilnim domenima pronalaska za dalje proteinske sekvence, uključujući imunoglobulinske teške lance, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji diatela) ili proteinske oznake kako je detaljnije diskutovano u nastavku.

Obuhvata

[0045]Ovo se uglavnom koristi u smislu da uključuje, to jest dopušta postojanje jedne ili više osobina ili komponenti.

Izolovan

[0046]Ovo se odnosi na stanje u kom će antitela pronalaska, ili nukleinske kiseline koje kodiraju navedena antitela, obično će biti u skladu s ovim pronalaskom. Antitela i nukleinske kiseline će biti slobodna ili značajno slobodan od materijala sa kojima su prirodno povezana kao Što su drugi polipeptid! ili nukleinske kiseline koje se nalaze u njihovom prirodnom okruženju, ili okruženju u kom su pripremljena (npr. kultura ćelija), kada je takva priprema tehnologijom rekombinantne DNK sprovedenain vicroiliin vivo.

[0047]Antitela i nukleinske kiseline se mogu formulirati sa razređivačima ili katalizatorima i dalje za praktične svrhe ostati izolovana - na primer članovi će obično biti pomešani sa želatinom ili drugim nosačima, ako se koriste za oblaganje mikrotitarskih ploča za upotrebu u imuno testovima ili će se mešati sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili rastvaračima, kada se koriste u dijagnozi ili terapiji. Antitela mogu biti glikozilirana, bilo prirodno ili sistemima heterolognih eukariotskih ćelija (npr. CHO ili NSO (ECACC 85110503) ćelije), ili mogu biti (na primer ako se proizvode eksprimiranjem u ćeliji prokariota) neglikolizirana.

Dodatne osobine članova za vezivanje meta

[00481Osim sekvenci antitela, član za vezivanje meta može sadržati i druge aminokiseline, npr. formirajući peptid ili polipeptid, kao što je presavijeni domen, ili kako bi dali molekulu još jednu funkcionalnu karakteristiku osim sposobnosti da vezuje antigen. Antitela prema pronalasku mogu nositi oznaku koja se detektuje, ili može biti konjugovana sa toksinom ili enzimom (na primer, preko peptidilne veze ili veznika).

[0049]Oznake koje se mogu detektovati uključuju radiološke oznake poput 1311 ili 99Tc, koji mogu biti povezane sa antitelima pronalaska koristeći konvencionalnu herniju poznatu u struci ispitivanja antitela. Oznake takođe uključuju enzimske oznake kao što je hren peroksidaza. Oznake dalje uključuju hemijske delove, kao što je biotin koji se mogu detektovati pomoću vezanja za specifične srodne delove koji se mogu detektovati, npr. označeni avidin.

[0050]Kada je dodatna osobina polipeptidni domene ili oznaka, antitelo se može proizvesti rekombinantnim tehnikama, tj. eksprimiranjem nukleinske kiseline koja kodira fuziju antitela i dalji domen.

Dalji članovi za vezivanje meta pronalaska

Varijante sekvenci

[0051]Varijante VH i VL domene i CDR od kojih su postavljene ovde navedene sekvence, i koji se mogu koristiti u antitelima za IL-25 mogu se dobiti pomoću postupaka za promenu sekvenci ili mutacije ili praćenja. Takvi postupci su takođe obuhvaćeni u ovom pronalasku.

[0052]Član za vezivanje meta može takođe biti onaj koji se nadmeće za vezivanje za antigen sa bilo kojim članom za vezivanje meta koji istovremeno vezuje antigen i sadrži član za vezivanje meta, VH i/ili VL domen kako je ovde opisano, ili VH CDR3, od 2C3, ili varijante bilo čega od navedenog čije su sekvence značajno kako je postavljeno ovde. Prema tome, takođe je opisan član za vezivanje meta koji sadrži mesto za vezivanje antigena za ljudsko antitelo koje se nadmeće sa 2C3 za vezivanje za IL-25. Suparništvo između članova za vezivanje može se lako analiziratiin vitro,na primer pomoću ELISA i/ili označavanjem specifičnog reporter molekula za jedan član za vezivanje koji se može detektovati u prisustvu drugog neoznačenog člana za vezivanje, kako bi se omogućilo identifikovanje člana za vezivanje molekula koji se vezuju na isti epitop ili preklapajući epitop.

[0053]U struci postoje različiti postupci za dobijanje Članova za vezivanje mete protiv IL-25 i koji mogu da se nadmeću sa 2C3 za vezivanje na IL-25.

[0054]Varijante varijabilnog domena aminokiselinskih sekvenci bilo kog od VH i VL domena čije sekvence su specifično opisane ovde mogu se upotrebiti u skladu sa ovim pronalaskom, kao što je opisano. Pojedine varijante mogu uključivati jednu ili više promena aminokiselinske sekvence (dodavanjem, brisanjem, supstitucijom i/ili umetanjem aminokiselinskog ostatka), možda manje od oko 20 promena, manje od oko 15 promena, manje od oko 10 promena ili manje od oko 5 promena, 4, 3, 2 ili

1. Promene mogu biti u jednoj ili više okvirnih regija i/ili jednoj ili više CDR.

[0055] U jednom aspektu, a CDR aminokiseline sekvence je značajno kako je postavljeno ovde i izvodi se kao CDR u ljudskom varijabilnom dometu ili kao njen značajan deo. VH CDR3 sekvence značajno kako je postavljeno ovde predstavljaju poželjna otelotvorenja ovog pronalaska i poželjno je da je svaki od njih izveden kao VH CDR3 u ljudskom varijabilnom domenu teškog lanca ili njegovom značajnom delu.

[0056]Pod „značajno kako je postavljeno/navedeno" misli se da će relevantni CDR ili VH ili VL domeni pronalaska biti isti ili vrlo slični navedenim regijama sekvenci koje su ovde navedene. Pod „vrlo slično" smatra se da se od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3 ili 1 ili 2 ili 3 ili 4 aminokiselinskih supstitucija može napraviti u CDR i/ili VH ili VL domenu.

[0057]Varijante sekvenci antitela iz ovog pronalaska mogu se dobiti izvođenjem nasumične mutageneze jednog ili oba od 2C3 VH i/ili VL gena za stvaranje mutacija unutar celog varijabilnog domena. Takva tehnika je opisana u Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580), koji koristi PCR podložan greškama.

[0058]Još jedan postupak koji se može koristiti je usmeriti mutageneze da CDR regijama VH i VL gena. Takve tehnike su opisali Barbas et al, (1994, Proc Natl Acad Sci, USA, 91:.,.. 3809-3813) i Schier i sur (1996, J. Mol Biol 263: 551-567..).

[0059]Sve gore opisane tehnike su poznate kao takve u stanju tehnike, a same po sebi ne formiraju deo ovog pronalaska. Stručnjak će biti u mogućnosti da koristiti takve tehnike kako bi dobio antitela pronalaska koristeći rutinsku metodologiju u struci.

[0060]U skladu s tim, u sledećem aspektu pronalazak daje postupak za dobijanje antitela protiv IL-25 koji se sastoji od: dobijanja početne nukleinske kiseline koja kodira antitelo koje ima jednu ili više CDR sekvenci za SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4;

modifikovanja spomenutih nukleinske kiselina kako bi se promenila CDR sekvenca ili sekvence;

eksprimiranja spomenutog modifikovanog antitela; i ispitivanje se spomenuti modifikovani antitela za vezivanje na IL-25 i odabiranje modifikovanog antitela koja se vezuje na IL-25 da bi se dobio antitela protiv IL-25.

[0061]Poželjno je da se modifikacija izvede na više polaznih molekula nukleinskih kiselina kako bi se dobio repertoar modifikovanih sekvenci koje imaju raznolikost afiniteta vezivanja.

[0062]U jednom aspektu, polazne nukleinska kiselina sadrži sva tri teška lanca CDR SEQ ID NO:2, ili u obliku samog SEQ ID NO:2 ili izvedeni u drugoj okvirnoj sekvenci.

[0063]U jednom otelotvorenju, modifikacije mogu biti usmerene na jedan CDR, npr. CDR3, ili modifikacije mogu biti usmerene na dve ili tri CDR regije istovremeno.

Proizvodnja članova za vezivanja meta zasnovanih na CDR3

[0064]Varijabilni domeni se koji se upotrebljavaju u pronalasku mogu se dobiti iz bilo kojeg embrionske linije ili preuređenih ljudskih varijabilnih domena, ili mogu biti sintetički varijabilna domena na osnovu konsenzus sekvencama poznatih ljudskih varijabilnih domena. CDR sekvenca pronalaska (npr. CDR3) se može uvesti u repertoar varijabilnih domena kojima nedostaje CDR (posebno CDR 3), primenom rekombinantne DNK tehnologije.

[0065]Na primer, Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) opisali su postupke za proizvodnju repertoara varijabilnih domena antitela na koji se koriste konsenzus prajmeri usmereni na ili pored do 5' kraju područja varijabilnog domena, u kombinaciji sa konsenzus prajmerima za treću okvirnu regiju ljudskih VH gena kako bi se dobio repertoar VH varijabilnih domena kojima nedostaje CDR3. Marks et al dalje opisuju kako se ovaj repertoar može se kombinovati sa CDR3 određenog antitela. Koristeći analogne tehnike, CDR3-izvedene sekvence ovog pronalaska mogu da se mešaju sa repertoarima VH ili VL domena kojima nedostaje CDR3, i pomešani kompletni VH ili VL domeni u kombinaciji sa srodnim VL ili VH domenom kako bi dali članove za vezivanje meta pronalaska. Repertoar se tada može prikazati u odgovarajućem sastavu domaćina kao što su sastav za prikaz faga od VVO92/01047, tako da se mogu izabrati odgovarajući članovi za vezivanje meta. Repertoar se sastoji od od bilo čega od 10<J>individualnih članova na više, na primer, od IO<6>do 10<s>ili 10"' članova.

[0066]Analogno mešanje ili kombinatorne tehnike takođe su obelodanjene od strane Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), gde se opisuju tehnike u odnosu na gen |3-laktamaze, ali primećuje se da se taj

pristup može koristiti za stvaranje antitela.

[0067]takođe je opisan postupak za pripremu člana za vezivanje meta koji je specifičan za IL-25, koji se sastoji od: (a) dobijanja početnog repertoar nukleinskih kiselina koje kodiraju VH domen koje ili uključuju CDR3 koji treba da se zameni ili im nedostaje kodirajuća CDR3 regija; (b) spajanje navedenog repertoara sa donorskom nukleinskom kiselinom koja kodira aminokiselinsku sekvencu kako je značajno navedeno u ovom tekstu za VII CDR3, tako da je navedena donorska nukleinska kiselina umetnuta u CDR3 regiju u repertoaru, kako bi se dobio repertoar proizvoda nukleinskih kiseline koji kodira VH domen;

(c) eksprimiranje nukleinskih kiselina navedenog repertoara proizvoda:

(d) izbora člana za vezivanje meta specifičnog za IL-25; i

(e) izvlačenja navedenog člana za vezivanje meta ili nukleinske kiseline koja ga kodira.

[0068]Repertoar proizvoda može da se koeksprimira, od istog vektora ili različitog vektora, sa VL domenom. VL domen može biti VL domen ovog pronalaska ili može biti jedna ili vise različitih VL domena, kao stoje opisano u nastavku, u odnosu na lanac mesanja.

[0069]Može se koristiti analogan postupak u kom je VL CDR3 pronalaska u kombinaciji sa repertoarom nukleinskih kiselina koje kodiraju VL domenu koje ili uključuju CDR3 koji treba da se zameni ili im nedostaje kodirajuća CDR3 regija. Kao i kod gore navedenog postupka, VL repertoar proizvoda može se koeksprimirati sa istim vektorom ili različitim vektorima, sa VH domenom. VH domen može biti VH domena ovog pronalaska ili može biti jedan ili više različitih VH domena, kao što je opisano u nastavku, u odnosu na lanac mešanja.

[0070]Isto tako, jedan ili više, ili sva tri CDR mogu biti usađeni u repertoare VH i VL domena koji se zatim ispituju za član za vezivanje mete ili članove za vezivanje mete specifične za IL-25.

Mešanje lanaca

[0071]Sledeći aspekt ovog pronalaska daje postupak za dobijanje antitelo-antigen vezujućeg domena za 1L25, gde postupak sadrži kombinovanje VH domena antitela prema ovom pronalasku (uključujući i varijante kao što je opisano gore) sa jednim ili više VL domena, i testiranje VII/VL kombinacije ili kombinacija za antitelo-antigen vezujući domen za IL-25.

[0072]Navedeni VL domen može imati neku aminokiselinsku sekvencu koja je značajno kao što je navedeno u tekstu.

[0073]Može se koristiti analogan postupak u kom se jedna ili više varijanti sekvence VL domena kako je opisani ovde kombinuje sa jednim ili više VH domenom.

[0074]Ovo se može postići postupcima ispitivanja faga pomoću tzv hijerarhijskog dvojnog kombinatornog pristupa kako je opisano u WO92/01047, gde je pojedinačna kolonija koja sadrži H ili L klon lanca korišćena za infekciju cele biblioteke klonova koji kodiraju drugi lanac (L ili H), i rezultujući dvolančani Član za vezivanje meta je odabran u skladu sa tehnikama prikazivanja faga, kao što su one opisane u toj referenci.

[0075]Takođe je opisan postupak za izbor molekule antitela za IL-25, a navedeni postupak obuhvata: (a) dobijanje VH domena koji obuhvata član za vezivanje meta koji vezuje IL-25 i koji obuhvata antitelo VH domena koje obuhvata VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO. 7; (b) mešanje navedenog VH domena sa mnoštvom VL domena antitela kako bi se dobili molekuli antitela;

(c) selekciju navedenih molekula antitela za vezivanje na IL-25; i

(d) izbor molekule antitela koji vezuje IL-25.

[0076]VH i VL područja mogu se dobiti u obliku proteina eksprimiranih pomoću rekombinantne DNK, posebno pomoću faga ili fagemid DNK.

[0077]Mnoštvo VL domena može biti bilo šta od 104 pojedinih domena pa na gore, na primer 106 do 108 ili 1010 domena.

IL- 25

[0078]11-25, takođe poznat u struci kao 1L-1.7E, dostupan je iz komercijalnih izvora (na primer R & D Svstems, MN, USA) ili se može klonirati ili sintetizovati referencom na sekvence IL-25 dostupne u struci. Mišji IL-25 (NCBI Protein NP_542767) opisali su Hurst etal,2002 (Ref. 7 u nastavku). Humani IL-25 (NCBI Protein Q9H293) opisali su Fon et al (Ref. 4 u nastavku). Za proizvodnju antitela ili upotrebu u imuno ispitivanjima, mogu se koristiti fragmenti rekombinaninog IL-25, a posebno onih koji su skraćen na N-terminalu. Na primer, komercijalno dostupan rekombinantni humani IL-25 (IL-17E) sadrži zrelu protein sekvencu Tyr 33 - Gly 177 (prijemni broj Q9H293) i komercijalno dostupni mišji IL-25 obuhvata ostatke Val 17 - Ala 169 mišjeg IL 17E (prijemni broj NP.,542767).

Nukleinske kiseline i vektori

[0079]U daljim aspektima, pronalazak daje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira antitelo prema ovom pronalasku, i postupke za dobijanje antitela iz pronalaska, koji uključuju eksprimiranje nukleinske kiseline pod uslovima da dovede do proizvodnje navedenog antitela, i izoluje ga-

[0080]Još jedan aspekt ovog pronalaska daje nukleinsku kiselinu, obično izolovanu, koji kodira VH CDR i VL CDR sekvence koje su ovde opisane, posebno VH CDR odabran od SEQ ID NO:5, 6 i 7, VL CDR odabran od SEQ ID NO:8, 9 i 10, a najpoželjnije 2C3 VH CDR3 (SEQ ID NO. 7).

[0081]Nukleinske kiseline iz pronalaska mogu uključivati sekvence, ili njihove odgovarajuće delove (npr. CDR-kodirajuća regija) od SEQ ID NO: l ili SEQ ID NO:3. Međutim, upotreba kodona može varirati, npr. za optimizaciju eksprimiranja sekvence u željenu ćeliju domaćina.

[0082]Ovaj pronalazak se takođe odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ovog pronalaska. Nukleinska kiselina uključuje DNK i RNK. U poželjnom aspektu, ovaj pronalazak daje nukleinsku kiselinu koja kodira za CDR ili VH ili VL domen pronalaska kao što je gore definisano.

[0083|Nukleinska kiselina prema ovom pronalasku može obuhvatati DNK ili RNK, i može biti u potpunosti ili delimično sintetička. Reference na nukleotidnu sekvencu kao je dato ovde obuhvataju DNK molekul sa navedenom sekvencom i obuhvata RNK molekul sa navedenom sekvencom u kojoj U je supstituisan za T, osim ako kontekst ne zahteva drukčije.

[0084]Ovaj pronalazak takode daje vektore, na primer, u obliku plazmida, virusa, npr. fag ili fagemid, kosmide, transkripcijske i eksprimirajuće kasete koje sadrže najmanje jednu nukleinsku kiselinu kao što je gore.

[0085]Prikladni vektori mogu se odabrati ili izgraditi, i sadrže odgovarajuće regulatorne sekvence, uključujući promoter sekvencu, terminator sekvence, poliadenilacijske sekvence, pojačivaČ sekvence, marker gene i druge sekvence prema potrebi. Za dalje detalje pogledati, na primer, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[0086]Vektori iz pronalaska takode uključuju virusne vektore koji mogu zaraziti ljudske ćelijein vivo,na primer adenovirusne, retrovirusne ili adeno-povezane virusne vektore. Takvi vektori mogu biti korisni za eksprimiranje antitela ovog pronalaska u ćelijama ljudskog ili životinjskog pacijenta, kako bi omogućili proizvodnju i isporuku antitela navedenom pacijentu.

[0087]Sekvenca nukleinske kiseline koji kodira antitelo ovog pronalaska će u jednom aspektu biti funkcionalno povezana za promoter kako bi uticala na eksprimiranje Člana za vezivanje meta u ćeliji domaćinu. Sekvenca može uključivati na svom 5' kraju lider sekvence za olakšavanje eksprimiranja i/ili izlučivanje antitela u i/ili iz ćelije domaćina. Brojne prikladne lider sekvence su poznate kao takvi u struci i mogu biti odabrani od strane osobe koja je prosečno stručna u oblasti, uzimajući u obzir ćelije domaćina.

[0088]Mnoge poznate tehnike i protokoli za manipulaciju nukleinskim kiselinama, na primer u pripremi konstrukata nukleinskih kiselina, mutagenezi, sekvencionisanju, uvođenju DNK u ćelije i eksprimiranje gena i analizu proteina, su detaljno opisane u Current Protocols in Molecular Bioiogv, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Ćelije domaćini i proizvodnja članova za vezivanje meta

[0089]Sledeći aspekt daje ćelije domaćine transformisane sa nukleinskom kiselinom (npr. sekvenca nukleinske kiseline u obliku vektora) ovog pronalaska.

[0090]U jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina prema pronalasku je integrisana u genom (npr. hromosoma) ćelije domaćina. Integracija može biti potpomognuta uključivanjem sekvenci koje pomažu rekombinaciju sa genomom u skladu sa standardnim tehnikama.

[0091]Dalji aspekt daje postupak proizvodnje antitela iz ovog pronalaska, gde postupak uključuje izazivanje eksprimiranja kodirajuće nukleinske kiseline. Takav postupak može sadržati kulturu ćelija domaćina pod uslovima za proizvodnju navedenog antitela.

[0092]Nakon proizvodnje eksprimiranjem, VH ili VL domen ili antitelo, mogu se izolovati i/ili pročistiti upotrebom bilo koje pogodne tehnike, a zatim se koristi prema potrebi. Postupak proizvodnje može sadržati korak izolacije i/ili čišćenja proizvoda.

[0093]Nakon pročišćavanja proizvoda antitelo može da se modifikuje fizičkim ili hemijskim sredstvima, na primer, kako bi se uvele zaštitne grupe koje menjaju, npr. povećavaju, stabilnost ili biološki poluživot proteina. Na primer, PEGilacija proteina kako bi se postigli takvih efekti je poznata kao takava u struci i antitela ovog pronalaska mogu biti u PEGilovanom obliku.

[0094]Postupak proizvodnje može sadržati formulaciju proizvoda u sastavu koji sadrži barem jednu dodatnu komponentu, kao što je farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0095]Ovaj pronalazak takođe daje rekombinantne ćelije domaćina, koje obuhvataju jednu nukleinsku kiselinu ili vektor kao što je gore navedeno. Nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od CDR, VH i VL domena, ili antitelo kakvo je dato obrazuje aspekt ovog pronalaska, kao i postupak za proizvodnju kodiranog proizvoda, koji se obuhvata eksprimiranje od kodirane nukleinske kiseline.

[0096]sistemi za kloniranje i eksprimiranje polipeptida u različite ćelije domaćina su dobro poznati. Pogodne ćelije domaćina uključuju bakterije, ćelije sisara, kvasaca i bakulovirus sistema. Ćelijske linije sisara dostupne u struci za eksprimiranje heterolognog polipeptida uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka, HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka, NS0 mišje melanom ćelije, mijelomske ćelije YB2/0 pacova i mnoge druge. Uobičajen, poželjan bakterijski domaćin je E.coli,

[0097]Eksprimiranje antitela i fragmenata antitela u prokariotskim ćelijama kao što je £.colije dobro poznato je u struci. Za pregled, pogledati na primer Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Eksprimiranje u eukariotskim ćelijama u kulturi je takođe na raspolaganju stručnjacima u ovoj oblasti kao mogućnost za proizvodnju članova za vezivanje meta, pogledati skorije tekstove, na primer Ref, M.E.

(1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

Sastavi

[0098]Stoga farmaceutski sastavi prema ovom pronalasku, i za upotrebu u skladu s ovim pronalaskom, mogu sadržati, pored aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač, pufera, stabilizator ili druge materijale koji dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Ovakvi materijali bi trebalo da budu netoksični i ne smeju uticati na delotvornost aktivnog sastojka. Tačna priroda nosača ili nekog drugog materijala zavisiće od načina primene, koji može biti oralno, ili sa injekcijom, npr. intravenski.

[0099]Terapeutske formulacije antitela mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa opcionim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima, ili stabilizatorima (pogledati npr. „Remington: The Science and Practice of Pharmacv", 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & VVilkins.), u obliku liofiliziranog praška ili vodenog rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoca pri dozama i koncentracijama upotrebe i uključuju pufere kao Što je fosfat, citrat, i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptiđe niske molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je serumski albumin, želatine ili imunoglobuline; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide, i drugi karbohidrate uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; kelirajuća sredstva kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli kao Što je natrijum; i/ili nejonske surfakante kao Što su Tween, Pluronics ili polietilen glikol (PEG).

[0100]Da bi se antitelo koristilo zain vivodavanje ono mora biti sterilisano. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracijske membrane, pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Antitelo će se obično skladištiti u liofiliziranom obliku ili u rastvoru.

[0101]Farmaceutski sastavi za oralnu primenu mogu biti u obliku tablete, kapsule, praha ili u obliku tečnosti. Tableta može sadržati neki čvrsti nosač kao što je želatin ili katalizator. Tečni farmaceutski sastavi uglavnom sadrže tečni nosač kao što je voda, petrolej, životinjska ili biljna ulja, mineralna ulja ili sintetička ulja. Mogu biti uključeni fiziološki rastvor soli, dekstroza ili drugi rastvor saharida, ili glikoli kao što su etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol.

[0102]Za intravenoznu injekciju, ili injekcijom na mestu bola, aktivni sastojak će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora, koji je bez pirogena i ima odgovarajuće pH, izotoničnost i stabilnost. Relevantni stručnjaci u oblasti su sposobni za pripremu stabilnih pogodnih rešenja koristeći, na primer, izotonične agense kao što je injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, laktidna Ringerova injekcija. Konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidanti i/ili ostali dodaci mogu biti uključeni, po potrebi.

Terapijske primene pronalaska

[0103]Ovaj pronalazak po prvi put daje demonstraciju da su antitela protiv IL-25 delotvorna u prevenciji ili smanjenju hiperosetljivosti disajnih putevain vivo,što je ključni simptom astme. Tako, u jednom aspektu ovaj pronalazak daje antitelo kako je definisano u zahtevima za upotrebu u postupku prevencije ili smanjenja preosetljivost disajnih puteva kod pacijenta (na primer, kod čoveka) koji ima potrebu za lečenjem. U drugom aspektu ovaj pronalazak daje antitelo kao što je definisano u zahtevima za upotrebu u postupku prevencije, smanjenje ili lećenja astme kod pacijenta kom je lečenje potrebno, koje obuhvata davanje pacijentu molekulu antitela koje vezuje IL-25.

[0104]Gore navedeni postupci se mogu sprovesti sa antitelima (uključujući njihove sastave) prema ovom pronalasku, koji su korisni u vezivanju na i poželjno antagonizuju delovanje IL-25, sa terapijskim potencijalom u različitim bolestima i poremećajima u kojima IL-25 igra ulogu. Postupak se takođe može koristiti sa drugim članovima za vezivanje meta (uključujući njihove formulacije) koji vežu IL-25 koji se može dobiti kao što je opisano u priapdajućim primerima.

[01051Antitela (uključujući njihove sastave) prema ovom pronalasku mogu se upotrebiti u postupku lečenja (uključujući profilaktično lečenje) ili dijagnoze ljudskog ili životinjskog subjekta. Takav postupak lečenja ili dijagnoze (što može uključivati profilaktičko lečenje) može obuhvatati davanje navedenom pacijentu delotvorne količine antitela pronalaska. Primeri takvih bolesti i poremećaja su raspravljeni u nastavku.

[0106]Takođe je omogućena upotreba antitela (uključujući njegove sastave) prema ovom pronalasku u proizvodnji leka za primenu na ljudskom ili životinjskom pacijentu.

[0107]Kliničke indikacije u kojima se anti-IL-25 antitelo može koristiti kako bi se dobilo terapeutsko poboljšanje su bilo koja stanja od kojih IL-25 ima patološke posledice. Tako, uglavnom, antitelo prema ovom pronalasku može se upotrebiti u lečenju bilo kojeg stanja koje je povezano s neželjenim Th-2 odgovorom. Na primer, antitelo prema ovom pronalasku može se koristiti za lečenje alergija i astme, naročito astme.

[0108]Anti-IL-25 tretman može se dati injekcijom (intravenski) ili postupkom lokalne isporuke. Anti-IL-25 može se dostaviti tehnologijama posredovanjem genima. Alternativne strategije formulacije mogu dati sastave pogodne za oralni ili supozitorijumski put. Put primene može se odrediti fizikalnohemijskim svojstvima tretmana, posebnim razmatranjima bolesti, kako bi se optimizovala efikasnosti ili minimizovale nuspojave.

[0109]U skladu s ovim pronalaskom, dati sastavi se mogu davati pojedincima. Davanje je poželjno u „terapeutski delotvornoj količini", koja je dovoljan da pokaže korist za pacijenta. Takve koristi mogu biti barem ublažavanje najmanje jednog simptoma. Stvarna količina davanja, i brzinu i vremenski tok davanja zavisiće od prirodi i ozbiljnosti bolesti koja se leči. Prepisivanje tretmana, npr. odluka o doziranju itd., je odgovornost lekara. Odgovarajuće doze antitela su dobro poznate u struci; pogledati Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshavve K.D. et al. (1991) Antibodv, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.

[0110]Tačna doza će zavisiti od brojnih faktora, uključujući i da li je antitelo je za dijagnosdfikovanje ili lečenje, veličinu i položaj područja koje se leči, tačna prirode antitela (npr. celo antitelo, fragment ili dijatelo) i prirode svake detektabilne oznaka ili drugog molekula koji je vezuje za antitela. Tipična doza antitela će bili u rasponu od 0,5 mg - 1,0 g, i može se primeniti kao bolus intravenozno. Drugi načini primene uključuju intravenske infuzije tokom nekoliko sati, kako bi se postigla slična ukupna kumulativna dozu. To je doza za jedan tretman odraslog pacijenta, koja može biti srazmerno prilagođena za decu i odojčad, i prilagođena za druge oblike antitela u odnosu na molekulske težine. Tretmani se mogu ponavljati dnevno, dva puta nedeljno, u nedeljno ili mesečnim intervalima, prema odluci lekara.

[0111]Još jedan način davanja koristi obloge od, ili na drugi način ugrađeno u, unutrašnje uređaje za koje se optimalna količina antitela određuje pomoću odgovarajućih eksperimenata.

[0112]Molekuli antitela u nekim poželjnim otelotvorenjima pronalaska je monomerski fragment, kao što su F (ab) ili scFv. Takvi fragmenti antitela mogu imati prednost relativno kratkog poluživota i manji rizik od aktivacije trombocita, Što može izazvati grupisanje receptora. Grupisanje koje dovodi do aktivacije trombocita može biti bilo koji od IL-25 imolekule ili IL-25 sa FcvRII molekula, na primer.

[0113]Ako se koristi celo antitelo, poželjno je u obliku koji ne može da aktivira i/ili uništiti trombocite. IgG4 izotip ili alternativno „dizajner" izotipi izvedeni od JgGl okosnice (novi Fc genski konstrukti W099/58572, Clark, Armour, Williamson) su poželjniji izbor. Manji fragmenti antitela mogu se koristili, kao što su F(ab')2. Osim toga, cela antitela ili fragmenti (npr. F(ab'):ili dijatela) sa specifičnosti za dva epitopa (npr. za epitope koje prepoznaje scFv 2C3) mogu se koristiti. Iako takva celina može pospešivati grupisanje receptora, visoka stopa pridruživanja za pojedine receptore može isključiti ovaj problem.

[0114]Antitela iz ovog pronalaska obično se daju u obliku farmaceutskog sastava, koji može sadržati barem jednu komponentu osim antitela.

[0115]Antitelo ovog pronalaska može se primenjivati samo ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, bilo istovremeno ili uzastopno u zavisnosti od stanja koje se leci. Ostali tretmani mogu uključivati primenu prikladnih doza lekova protiv bolova kao što su nesteroidni protivupalni lekovi (npr. asprin, paracetamol, ibuprofen ili ketoprofen) ili opijati poput morfijuma; primenu antiemetika; ili primenu najmanje jednog drugog aktivnog jedinjenja protiv astme, obično bronhodilatacijskog agensa koji stvara upuštanje disajnih puteva ili pojačava klirens sluzi, npr. beta-agonist (npr. salbutamol, salmeterol), dinatrijum hromoglikat, steroidi ili inhibitor PDE,V.

Postupci testiranja

[0116]Takođe je opisan postupak koji obuhvata izazivanje ili omogućavanje vezivanja člana za vezivanje meta kako je ovde dato na IL-25. Kao što je navedeno, takvo vezivanje može se odvijatiin vivo,na primer nakon primene jednog člana za vezivanje mete, ili nukleinske kiseline koja kodira član za vezivanje mete ili se može odvijatiin vitro,na primer putem ELISA, VVestern blotting, imuno-citohemijom, imunotaloženjem ili hromatografijom afiniteta.

[0117]Količina vezanja člana za vezivanje meta za IL-25 može se odrediti. Kvantifikacija može biti povezana sa količinom antigena u uzorku za ispitivanje, koji može biti od dijagnostičkog interesa.

[0118]Reaktivnost antitela na uzorku može se odrediti bilo kojim odgovarajućim sredstvima.

Radioimunotest (RIA) je jedna od mogućnosti. Radioaktivno obeleženi antigen se pomeša sa neobeleženim antigenom (test uzorak), i ostavi da se vezuje za antitela. Vezani antigen je fizički odvojena od nevezanog antigena i količina radioaktivnog antigena vezanog za antitelo je određena. Što više antigena se nalazi u test uzorku, manje radioaktivnog antigena će se vezati za antitelo. Određivanje aktivnosti kompetitivnim vezivanjem takođe se može koristiti sa nereadioaktivnim antigenom, koristeći antigen ili analog povezan sa reporterskim molekulom. Reporterski molekula može biti fluorohrom, fosfor ili laserska boja sa spektralno izolovanim karakteristikama apsorpcije ili emisije. Prikladni fluorohromi su fluorescein, rodamin, fikoeritrin i Texas Red. Prikladne hromogene boje uključuju diaminobenzidin.

[0119]Drugi reporteri uključuju mahromolekularne koloidne čestica ili čestica materijala kao što su lateks kuglice koje su u obojene, magnetski ili para magnetski, i biološki ili hemijski aktivne agense koji mogu direktno ili indirektno da izazovu detektabilne signal koji mogu vizuelno da se posmatraju, elektronski detektuju ili na drugi način zabeleže. Ti molekuli mogu biti enzimi koji katalizuju reakcije koje razvijaju ili menjaju boje ili uzrokuju promene u elektronskim svojstvima, na primer. Oni mogu biti molekularno uzbudljivi, tako da elektronski prelazi između energetskih stanja dovode do karakterističnih spektralne apsorpcija ili emisija. Oni mogu uključivati hemijske entitete koji se koriste u kombinaciji sa biosenzorima. Mogu se koristiti biotin/avidin ili biotin/streptavidin i alkalni fosfataza sistemi za otkrivanje.

[0120]Signali koje stvaraju pojedinačni antitelo-reporter konjugati mogu se koristiti za dobijanje apsolutnih ili relativnih podataka koji mogu da se kvantifikuju o uzorcima vezivanja relevantnih antitela (normalna i test).

[0121]Takođe je opisana i upotreba člana za vezivanje meta kao što je gore navedeno za merenje nivoa antigena u kompetetivnom ispitivanju, to jest postupak merenja nivoa antigena u uzorku upotrebom člana za vezivanje meta kao što je navedeno u ovom pronalasku kompetetivnom ispitivanju. To može kada fizičko odvajanje vezanog i nevezanog antigena nije potrebno. Jedna mogućnost je vezivanje reporterskog molekula za član za vezivanje meta, tako da dođe do fizičke ili optičke promene. Reporterski molekula može direktno ili indirektno stvarati detektabilne, i poželjno merljive signale, vezivanje reporterskog molekula može biti direktno ili indirektno kovalentno, npr. preko peptidne veze ili nekovalentno. Vezivanje preko peptidne veze može biti kao rezultat rekombinantnog eksprimiranja fuzije gena koja kodira antitela i reporterski molekul.

[0122]Ovaj pronalazak takođe daje nivoe za merenje antigena direktno, korišćenjem jednog člana za vezivanje meta prema pronalasku, na primer u biosenzornom sistemu.

[0123]Način određivanja vezanja nije svojstvo ovog pronalaska, i oni koji su vešti u struci, su u mogućnosti da odaberu prikladan način u skladu sa svojim sklonostima i opštim znanjem.

[0124]Ovaj pronalazak se dalje odnosi na član za vezivanje mete koji se nadmeće za vezivanje za IL-25 sa bilo kojim članom za vezivanje mete koji vezuje antigen i obuhvata V domen uključujući CDR sa aminokiselinom značajno kako je dato ovde. Nadmetanje između članova za vezivanje može se analizirati jednostavnoin vitro,na primer, obeležavanjem određenog reporterskog molekula za jedan član za vezivanje koji se može detektovati u prisustvu drugih neobeleženih članova za vezivanje, kako bi se omogućila identifikacija članova za vezivanje koji vezuju isti epitop ili preklapajući epitop. Nadmetanje može da se odredi koristeći ELISA ili protočnu citomeiriju.

[0125]Reakcija nadmetanja može se koristiti za odabir jednog ili više članova za vezivanje meta, kao što su derivati 2C3, koji mogu imati jedno ili više dodatnih ili poboljšana svojstava. To je analogno postupku odabira za 2C3 u skladu s ovim pronalaskom, s tim Što se IL-25 ne ispira od svog mini Uganda, već od molekula antitela. To može biti važno jer treba da da veći udeo naslednika antitela koja se direktno nadmeću sa roditeljem. Zaista, takva nasiednici antitela su kako su izabrana mogu imali veći afinitet za antigen od roditelja (što omogućava poboljšanja u afinitetu koja mogu nastati iz izlaganja više od jednog molekula antitela po fagu). Sadašnji postupci selekcije „naslednik" faga andtela za poboljšan afinitet uključuju: koristeći koncentracije (obeleženih) ciljanih antigena niže od konstante disocijacije i prvobitnog roditeljskog antitela; koristeći višak neobeleženog ciljanog antigena kao konkurenta kako je pokazano u Havvkins et al (1992). Međutim, oni ne moraju nužno da navedu da „poboljšano" antitelo mora ukloniti/zauzeti isti epitop kao roditelj. Uključivanje koraka ispiranja treba da da veći udeo naslednik antitela koje uklanjaju roditelja. Naslednik antitela odabrana na takav način mogu vezati vrlo sličan epitop kao roditeljsko antitelo, ali sa većim afinitetom.

[0126]Kod testiranja nadmetanja može se koristiti peptidni fragment antigena, naročito peptida koji uključuje epitop od interesa. Može se koristiti peptida koji ima sekvencu epitop plus jedna ili više aminokiselina na svakom kraju. Za takav peptid može se reći da se „značajno sastoji" od specifične sekvence. Članovi za vezivanje mete prema ovom pronalasku mogu biti takvi da se njihovo vezivanje za antigen inhibira peptidom koji ima ili uključuje datu sekvencu. U testiranju za to, može se koristiti peptid sa bilo kojom od tih sekvenci plus jedna ili više aminokiselina.

[0127]Članovi za vezivanje meta koji vezuju specifični peptid mogu se izolovati, na primer iz biblioteke za prikaz faga ispiranjem sa peptidima.

Primeri

[0128]Aspekti i otelotvorenja ovog pronalaska će sada biti ilustrovana putem primera sa referencama na naredne eksperimente.

Primer 1: Generisanje antitela protiv IL- 25

[0129]Testirana je velika ploča sa antitelima, generisantm u //" miševima imunizovanim protiv mišjeg IL-25 (R&D Systems). Za jedno od tih anti-IL-25 antitela (2C3) je otkriveno da inhibira interakciju između rmIL-25 i rastvorljivog mIL-25R-Fc fuzionog proteina u zavisnosti od dozi i od IL-25 zavisnu proizvodnju IL-13 od strane primarnih mišjih ne-B i ne-T ćelija uin vitrobioanalizi. Antitelo takođe inhibira interakciju između hIL-25 i rastvorljive hIL-25RFc fuzije. Kombinacija ovih svojstava je dalje ispitana uin vivosistemima da demonstrira korisnost u lečenju astme.

Primer 2: Eksperimentalni modelu alergijske astme

[0130]BALB/c miševi su senzibilisani sa ovalbumin antigenom (OVA), pre nego što su izazvani sa aerosolizovanim OVA. Senzibilisani i izazvani BALB/c miševi su razvili prepoznatljiv fenotip astme. To se karakteriše povećanim AHR nakon izlaganja provokativnom agensu metakolinu, eozinofilskoj infiltraciji disajnih puteva, hiperplazijom peharastih ćelija i sekređjom serumskog IgE, u poređenju sa kontrolnim BALB/c miševa izazvanim sa PBS (SI. 1).

[0131]Za razliku od toga davanje anti-IL-25 mAb pre svake senzibilizacije i aerosolizacije sa OVA rezultovalo je značajnim ukinućem AHR nakon izazivanja sa aerosolizovanim metakolinom, gde su vrednosti otpora uporedive sa PBS kontrolnih miševima (SI. 1A). Davanje izotipom-prilagođenje kontrolemAb ne smanjuje AHR (SI. 1A).

[0132]Anti-IL-25 mAb takođe značajno smanjuje nivoe ćelijske infiltracije oko krvnih žila pluća (SI. 1B i 3A), hiperplaziju peharastih ćelija u disajnim putevima (SI. 1C i 3B) i nivoe antigen-specifičnog serumskog IgE (si. ID).

[0133]Analiza bronhoalveolarnim ispiranjem (BAL) je pokazala da je eozinofilna infiltracija takođe značajno suzbijena nakon anti-IL-25 mAb primene u poređenju sa miševima tretiranim sa izotip kontrolom (SI. 1E). Budući da je tip2 citokine poznato da regulišu ove efektorske funkcije, odredili smo nivo citokina koji luče iz ćelija izolovanih iz drenažnih medijastialnih limfnih čvorova nakon restimulacije antigena. Za razliku od povišenih nivoa tip2 citokina, IL-4, IL-5 i IL-13, indukovani OVA senzibilisanjemi izazivanjem kod BALB/c miševa, davanje anti-IL-25 mAb je rezultovalo značajnim smanjenjem nivoa tih citokina (SI. 1F).

[0134]Ovi podaci podupiru hipotezu da smo blokiranjem IL-25 signaliziranja ograničili proizvodnju tip2 citokina koji dovode do ukidanja tip-2 efektorskih funkcija, uključujući upalu i AHR. Prema tome, antagonisti IL-25 uspešno suzbijaju tip-2 upalu ako se primenjuje od početka odgovora.

Materijali i postupci:

Miševi

[0135]BALB/c miševi su nabavljeni od Harlan UK i održavani u SABU/CBS ili prostorijama Nacionalnog instituta za srce i pluća u specifičnom okruženju bez patogena. Svi eksperimenti na životinjama navedene u ovom izveštaju su vršeni uz odobrenje UK Home Office.

Senzibilizacija i izlaganje alergenu

[0136]BALB/c miševi (6 - 12 nedelja) su senzibilisani intraperitonealnim davanjem ovalbumina (20 mg/injekcija) u kompleksu sa alumom, ili samim alumom (kontrola), na dane 0 i 12. Aerosolsko davanje 1% ovalbumina sprovedeno je na dane 19, 20 i 21 u trajanju od 20 minuta dnevno. 22. dana životinje su analizirane korišćenjem pleiizmografije kako bi se procenio AHR.

Davanje anti- rmIL- monoktonskih antitela

[0137]Hiperreaktivnost disajnih puteva (AHR) je indukovana kao Što je opisano i anti-IL-25 mAb (500 mg/dozi) davano je intraperitonealno dan pre svakog intraperitonealnog OVA senzibilisanja, dan pre prvog OVA izazivanja u plućima, i 4 sata pre svake OVA aerosolizacije. U daljim eksperimentima anti-IL-25 mAb (500 mg/dozi) davano je samo intraperitonealno na dan, ali pre svake aerosolizacije. Kontrolni miševi su dobili fiziološki rastvor ili izotipsku kontrolu (500 mg/dozi) umesto anti-IL25 mAb. lzotipska kontrola bila je anti-c-myc (mišji IgGl, klon 9E10.2).

Merenje reakcije disajnih puteva

[0138]Životinje su anestezirane, traheostomirane i stavljene na ventilator (SAR-830 series, CWE Ine) pri brzini od 150 udisaja/minut, sa zapreminom talasa od 0,2 mL. Miševi su praćeni u pletizmografu celog tela (EMKA Technologies, Pariš) i transpulmonarni pritisak je procenjen putem dužinske sonde. Nakon snimanja stabilne osnovice plućnog otpora, rastuće koncentracije acetil-p-metilholin hlorida (meiakolina)

(Sigma, Dorset, UK) su davane aerosolom tokom 15 sekundi za svaku koncentraciju sa ultrazvučnim raspršivaČem, i plućna otpornost je zabeležena tokom perioda od 5 minuta. IOX softvvare je koriŠćen za analizu otpora disajnih puteva, usklađenost i uobičajene plućne parametre.

Bronhoalveolarno ispiranje ( BAL)

[0139]Miševi su ubijeni cervikalnom dislokacijom i 4 x 500 ml alikvota PBS je ubrizgano kroz traheostomija i izvučeno. Diferencijalno brojanje ćelija na 150 ćelija je sprovedeno na citospinima obojenim sa giemsa bojom.

Primer 3: Primena pre izazivanja

[0140]Takođe smo procenili da li je anti-IL-25 mAb delotvorno kada se primenjuje samo pre izazivanja OVA aerosolizacijom. lečenje sa anti-IL-25 mAb je dramatično smanjilo otpor disajnih puteva indukovan metakolinskom provokacijom, čak i kada je dat kasnije u odgovoru (SI. 2A). Sa druge strane, primena kontrolnog mAb sa odgovarajućim izotipomne ukida AHR.

[0141]Značajno, analiza histologije pluća nije pokazala značajne promene u nivou ćelijskih infiltrata oko krvnih žila (SI. 2B) ili hiperplaziju peharastih ćelija disajnih puteva (SI. 2C) između anti-IL-25 mAb tretirani miševa i sa OVA zaraženih BALB/c kontrola ili izoiipski usklađenih mAb tretiranih kontrole.

[0142]Nadalje, nije bilo vidljivog smanjenja u udelu eozinofila u BAL tečnosti (SI. 2D) ili nivoima antigen-specifičnog serumskog IgE (SI. 2E) nakon primene anti-IL-25 mAb. Očigledno, nivoi tip-2 citokina IL-5 i IL-13 i ostali su uporedivi sa onima kod sa OVA izazvanih BALB/c kontrola ili izotipski usklađenih mAb tretiranih kontrola nakon restimulacije antigena (SI. 2F) i IL-13 nivoi u BAL su takođe bili nepromenjeni. Stoga, anti-IL-25 primena tokom faze izazivanja odgovora može specifično ukinuti AHR čak i kada tip-2 citokini i njihovih silaznih efektora nisu regulisani na dole. Ovi rezultati ukazuju da IL-25 može pokrenuti AHR uz pomoć puta koji je nezavisan od klasičnog tipa-2 odgovora.

Materijali i postupci

[0143]Materijali i postupci su kao što je gore opisano za primer 2, uz dodatak:

Prikupljanje i histologija tkivu pluća

[0144] Pluća su fiksirana u formalinu (10% formaldehid u 0,9% fiziološkom ratvoru) za histološku analizu. Delovi pluća su bili obojeni sa giemsa bojom za upalne infiltrate i perodnom kiselinom-Šif (PAS) za peharaste ćelije. PAS-obojene peharaste ćelije u epitelu disajnih puteva su merene na slepo pomoću numeričkog sistema ocenjivanja (0: <5% peharaste ćelija; 1: 5-25%; 2: 25-50%; 3: 50-75%; 4:> 75 %). Zbir bodova disajnih puteva iz svake pluća je podeljen brojem ispitanih disajnih puteva, 20-40 disajnih puteva/mišu, a izražavan kao PAS rezultat u arbitrarnim jedinicama. Upala je procenjena pomoću numeričkog sistema ocenjivanja kako bi se procenio broj infiltrirajući!!ćelija oko krvnih sudova (0: sloj infiltracije upalnih ćelija <2ćelija debeo oko sudova, 1: 2-4 ćelija debeo, 2: 5-8 ćelija debeo, 3: >8 ćelija debeo). Zbir bodova disajnih puteva iz svakog pluća podeljen je sa brojem ispitivanih sudova, 20-40 disajnih puteva/mišu, a izražen u arbitrarnim jedinicama.

Primer 4: IL deluje preko tipa- 2 nezavisnog puta

[0145] Procenili smo da li egzogeno primenjen rmlL-25 može izazvati pojačanu AHR i bez senzibilisanja antigena ili izazova. Već 16 sata nakon intranazalnog davanja rmIL-25 BALB/c miševima otkrili smo značajno povišen otpor disajnih puteva (SI. 3A). Raniji izveštaji ukazuju na središnju ulogu FL-13 u fenotipu astme, a posebno AHR. Da bi se utvrdilo da li je IL-25 posredovao u svoju ulogu u AHR kroz IL-13, primenili smo rmlL-25 naH13- I-miševe. Još jednom smo uočili povišen AHR nakon rmIL-25 tretmana (SI. 3B). Budući da se za ostale tip-2 ciiokine takođe pokazalo da doprinose fenotipu astme takođe je procenjen odgovorIil4''' il5'' i! 9'! Hl3"'~na intranazalno primenjen rmIL-25. Čak i u odsustvu svih klasičnih tip-2 citokina, IL-25 tretman poboljšava AHR nakon provokacije metakolina (SI. 3C). Ovi podaci podupiru ulogu IL-25 u pogoršavanju AHR kroz put nezavisan od tip-2 citokina.

Materijali i postupci

[0146] Materijali i postupci su kao što je opisano gore za primere 2 i 3, uz dodatak:

Miševi

[0147] Opisani su transgeniiH' ilS' iB' iin1-miševi (P. G. Fallon et al., 2002. Immunitv 17, 7) i ill3" miševi (G. J. McKenzie et al., 1998. Curr Biol. 8, 339) na BALB/c pozadini. II"miševi na C57BL/6 x 129 F2 pozadini su kako je opisano (PP. G. Fallon et al. 2006. J. Exp. Med. 203, 1105).

Intranazalna IL- primena

[0148] Miševima je dato 1,8 mg rIL-25 (R&D Svstems) ili 1,8 mg rIL-13 (Peprotech) u 40 ml PBS-po mišuu intranazalno na dan 0. Kontrolne životinje primale su samo PBS.

Primer 5: Kloniranje 2C3 varijabilnih domena

[0149] RNK od tri pod klona 2c3 se izoluje i cDNK se priprema reakcijom reverzne transkripcije.

[0150] cDNK teškog lanca imunoglobulina (IgH) je amplifikovana PCR-om upotrebom konzersvisanog prajmera 5' VH regije, MHV7 (SEQ ID NO: 11) u kombinaciji sa MHCG1 prajmerom IgGl konstantne regije (SEQ ID NO: 12).

[0151] Na sličan način, lak lanac imunoglobulina (IgK) je amplifikovana korištenjem konzervisanih prajmera 5' IgK regije, MKV9 (SEQ ID NO: 13), u kombinaciji sa prajmerom MKC kapa konstantne regije (SEQ ID NO: 14).

[0152] Termostabilna polimeraza Phusion (NEB F-531L) je korišćena kroz sve PCR reakcije.

[0153] 2c3 amplifikacija proizvoda VH7 + MHCGl-prajmerovane PCR reakcije od tri nezavisna cDNK, direktno su legirani u pCRII®Blunt-TOPO® vektor koristeći TOPO-blunt đoning® komplet (Cal 45-0245), kao što su proizvodi za amplifikaciju reakcije amplifikacije lakog lanca.E. coliTOPIO bakterije transformisana sa ligiranim pCRIIblunt vektorskim konstrukatima klonirane su na LB-ampicilin-XGal agarnim pločama, odabirom belih kolonija na agar rešetki i u PCR smesu za ispitivanje. Klonirani plazmiđ umetci su PCR-amplifikovani. Umnoženi proizvodi su želaunasto elektroforezovani i očekivani proizvodi su identifikovani. Preko noći ostavljene kulture (5 ml) svakog klona, proizvodeći proizvod PCR amplifikacije ispravne veličine obrađene su pomoću OJAprep Spin Miniprep Kit Protoco (Cat 27106), kako bi se dobili minipreparati DNK plazmida.

[0154]Plazmidi su sekvencirani pomoću BigDve® Terminator v3.0 Cvđe Sequencing Readv Reaction Kit (AB1 cat. 4390242). Svaki odabrani plazmid je sekvenciran u oba smera pomoću M13 prednjeg i zadnjeg prajmera cikliranog na GeneAmp9600 PCR mašini. Elektroforetska analiza sekvenci je obavljena na ABI kapilarnom sekvenceru.

[0155]Potpuni ciklus RT-PCR, kloniranja i analize DNK sekvence je ponovljen kako bi se dobila tri potpuno nezavisna seta podataka o sekvencama za svaki od imunoglobulinskih lanaca.

[0156]Kompletne izvedene nukleotidne sekvence VH i Vkapa gena su prikazane kao SEQ iD NO: 15 i SEQ ID NO:16, respektivno. Te sekvence su lider sekvence na početku svakog varijabilnog segmenta gena koji kodira signalnu sekvencu koja se koristi za transport novo sintetizovanih lanaca antitela u endoplazmatski retikulum; oni nisu prisutni u konačnim teškim i lakim lancima.

References

[0157]

1. P. G. Fallon et al., Immunity 17, 7 (Jul, 2002).

2. G. Grunig et al., Science 282, 2261 (1998).

3. M. Wills-Karp et al., Science 282, 2258 (1998).

4. M. M. Fon et al., Immunity 15, 985 (Dec. 2001).

5. M. R. Kim et al., Blood 100, 2330 (Oct 1, 2002).

6. G. Pan et al., J lmmunol 167, 6559 (Dec 1, 2001).

7. S. D. Hurst et al., J lmmunol 169,443 (Jul 1, 2002).

8. T. A. Moselev, D. R. Haudenschild, L. Rose, A. II Reddi, Cytokine Grovvth Factor Rev 14, 155 (Apr, 2003).

9. P. G. Fallon et al, J Exp Med 203, 1105 (Apr 17, 2006).

10. A. M. Owyang et a)., J Exp Med 203, 843 (Apr 17, 2006).

11. T. Tamachi et al., J Allergy Clin lmmunol 118, 606 (Sep, 2006).

Claims (12)

1. Antitelo koje vezuje IL-25 i koje obuhvata VH domen antitela ili njegov značajan deo koji obuhvata VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:5; VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:6; i VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:7, i koji dalje obuhvata VL domen ili njegov značajni deo koji obuhvata CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:8, CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:9; i CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO: 10.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 gde: (a) VH domen ili njegov značajni deo obuhvata ljudsku okvirnu regiju; (b) VH domen ili njegov značajni deo obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO:2; ili (c) VH domen ili njegov značajni deo obuhvata ljudsku okvirnu regiju i antitelo dalje obuhvata VL domen koji obuhvata ljudsku okvirnu regiju.

3. Antitelo prema patentnim zahtevima 1 ili 2 gde VL domen obuhvata: (a) ljudsku okvirnu regiju; ili (b) aminokiselinsku sekvencu kako je dato u SEQ ID NO;4.

4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koje je Fab, F(ab'):, ili scFv fragment antitelo.

5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koje obuhvata konstantnu regiju antitela, gde opciono (a) konstantna regija je IgGl ili IgG4 konstantna regija; ili (b) antitelo obuhvata celo antitelo.

6. Izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo bilo kog od prethodnih patentnih zahteva.

7. Vektor eksprimiranja koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 6 operativno vezanu za promoter.

8. Ćelija domaćin koja nosi vektor eksprimiranja prema patentnom zahtevu 7.

9. Postupak proizvodnje antitela, koji obuhvata: uzgajanje ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 8 pod uslovima za proizvodnju navedenog antitela, postupak dalje opciono obuhvata izolovanje navedenog antitela; i postupak dalje opciono obuhvata formulisanje antitela u sastav uključujući makar jednu dodatnu komponentu.

10.Postupak dobijanja antitela protiv IL-25 koji obuhvata: a) kombinovanje VH domena od antitela patentnog zahteva 1 sa jednim ili više VL domena kako bi proizveli jednu ili više VH/VL kombinacija; testiranje jedne ili više VH/VL kombinacije za vezivanje za IL-25. i odabir jedne ili više kombinacija koje vezuju IL-25 kako bi se dobilo antitelo protiv IL-25; ili b) dobijanje početnog molekula nukleinske kiseline koji kodira antitelo prema patentnom zahtevu 1; modifikovanje navedene nukleinske kiseline kako bi se izmenila CDR sekvenca ili sekvence; eksprimiranje navedenog modifikovanog antitela; testiranje navedenog modifikovanog antitela za vezivanje protiv IL-25; i odabir navedenog modifikovanog antitela koje vezuje IL-25 kako bi se dobilo antitelo protiv IL-25.

11. Sastav koji obuhvata antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač, koji je opciono u obliku liofilizovanog praška.

12. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili sastav patentnog zahteva 11 za primenu u tretmanu ili prevenciji astme.